DE69131393T2

DE69131393T2 - Menschlicher Rezeptor für luteinisierendes Hormon und Choriongonadotropin

Info

Publication number: DE69131393T2
Application number: DE69131393T
Authority: DE
Inventors: Masao Igarashi; Takashi Minegishi; Kazuto Nakamura
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1990-09-10
Filing date: 1991-09-06
Publication date: 1999-11-04
Anticipated expiration: 2011-09-07
Also published as: ATE181746T1; CA2051010A1; DE69131393D1; CA2051010C; US6218509B1; EP0475292B1; EP0475292A2; EP0475292A3; US6635445B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine DNA, die eine cDNA-Sequenz enthält, die für ein Human-Luteinisierungshormon- Human-Choriongonadotropin-Rezeptorprotein (Human-LH/hCG-Rezeptorprotein), das Human-LH/hCG-Rezeptorprotein, kodiert und auf ein Verfahren zum Herstellen des Proteins.
Die Human-Luteinisierungshormon-Human-Choriongonadotropin-Rezeptorproteine (Human-LH/hCG-Rezeptorproteine) kommen in den Leydig-Zellen in den Hoden, den Theca-Zellen im Eierstock, den Granulosazellen, den Gelbkörperzellen und den interstitiellen Zellen vor und spielen bei der Vermehrungsphysiologie eine zentrale Rolle. Beim Mann und der Frau, die nicht schwanger ist, wirkt auf die LH/hCG-Rezeptorproteine nur das im Hypophysenvorderlappen produzierte und daraus ausgeschiedene Luteinisierungshormon (LH) ein. Bei der schwangeren Frau wirkt auf die LH/hCG-Rezeptorproteine im Eierstock jedoch auch das von der Plazenta produzierte Human-Choriongonadotropin (hCG) ein.
LH und hCG sind Mitglieder einer Familie von Glykoproteinhormonen, die auch das Thyroidstimulierungshormon (TSH) und Follikelstimulierungshormon (FSH) einschließt. Jedes dieser vier Hormone weist ein Molekulargewicht von 28 bis 38 kD auf und ist ein Heterodimer-Glykoprotein, bei dem eine spezifische β- Untereinheit, die sich auf die Rezeptorbindungsspezifität bezieht, an eine diesen Hormonen gemeinsame α-Untereinheit gebunden ist. Die Glykosyl-Struktureinheit dieser Hormone scheint bei der Signaleinführung eine wichtige Rolle zu spielen. Die β-Untereinheiten sowohl von LH als auch von hCG sind in ihrer Struktur nahe miteinander verwandt. Diese zwei Hormone binden an denselben Rezeptor und lösen dieselbe biologische Reaktion aus. Die Ähnlichkeit zwischen diesen Glykoproteinhormonen und die Wirkung durch diese Hormone auf die Rezeptoren unter Verstärken der durch G-Proteine vermittelten Aktivität von Adenylatcyclase zeigt, daß diese Rezeptoren einen gemeinsamen Mechanismus der hormoninduzierten Aktivierung aufweisen. Die Zunahme von Adenosin-3',5'-monophosphat (cyclisches AMP) führt notwendigerweise zur Synthese und Ausscheidung von Steroiden. Eine Familie G-Protein-gekuppelter Rezeptoren wurde ermittelt, deren Mitglieder durch das gemeinsame Strukturmerkmal des Aufweisens von sieben Transmembrandomänen gekennzeichnet sind, von denen bekannt ist, daß sie sich auf die Signaleinführung und das Binden an kleine Liganden beziehen. Zum anderen sind TSH- und FSH-Rezeptoren mit den LH/hCG-Rezeptoren verglichen worden. Als Ergebnis sind von diesen G-Proteingekuppelten Rezeptoren diese Rezeptoren der Hypophysenglykoproteinhormone durch die Anwesenheit einer großen glykosylierten Domäne gekennzeichnet, die auf eine sieben Transmembranabschnitte enthaltende Struktur gepfropft ist und als vermutlich auf der Zellaußenseite gelegen angesehen wird.
Die Struktur der LH/hCG-Rezeptoren ist noch nicht so gut aufgeklärt, da die Rezeptoren in sehr geringen Mengen vorliegen und gegenüber einer Proteolyse empfindlich sind. Bei Ratten- und Schweine-LH/hCG-Rezeptoren wurde die komplementären DNAs (cDNAs) dieser Rezeptoren jedoch isoliert und ferner wurde die Aminosäuresequenz davon aus dieser DNA abgeleitet [Science 245 494 (1989) bei Ratten und Science 245 525 (1989) bei Schweinen].
Bei den Ratten- und Schweine-LH/hCG-Rezeptoren ist deren Struktur auf diese Weise aufgeklärt worden. Bei den Human- LH/hCG-Rezeptoren ist deren Struktur jedoch nicht aufgeklärt worden. Im Hinblick auf die Verwendung der Human-LH/hCG- Rezeptoren als therapeutische Wirkstoffe und analytische Rea genzien für Menschen ist es notwendig, deren Struktur und Eigenschaften aufzuklären.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfinder haben erkannt, daß zu künftigen Untersuchungen und medizinischen Behandlungen ein wichtiger Beitrag geleistet wird, wenn ein Human-LH/hCG-Rezeptor aus Menschen gesammelt werden kann und weiter durch eine rekombinante Technologie hergestellt werden kann. Als Ergebnis waren die Erfinder zuerst beim Klonieren von cDNA, die für einen Human-LH/hCG- Rezeptor aus einer cDNA-Bibliothek des menschlichen Eierstocks kodiert, durch Verwenden der komplementären DNA eines Ratten- LH/hCG-Rezeptors als Sonde und beim Aufklären der vollständigen Nukleotidsequenz davon erfolgreich. Weiter waren die Erfinder auch beim Aufklären der Aminosäuresequenz des Human- LH/hCG-Rezeptors aus dieser cDNA und bei der Wegbereitung für die Massenproduktion dieses Rezeptors durch eine rekombinante Technologie erfolgreich. Dieser Rezeptor ist dem Ratten- und Schweinerezeptor sehr ähnlich. Die Unterschiede sind jedoch derart, daß jeder Rezeptor als unterschiedlich erkannt werden kann.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden bereitgestellt:
(1) ein Human-Luteinisierungshormon-Human-Choriongonadotropin- Rezeptorprotein, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch den 1. bis 699. Aminosäurerest der SEQ ID Nr. 1 oder eine Aminosäuresequenz, der der 227. bis 289. Aminosäurerest davon fehlt, oder eine Aminosäuresequenz, die durch den 26. bis 699. Aminosäurerest der SEQ ID Nr. 1 oder eine Aminosäuresequenz dargestellt wird, der der 227. bis 289. Aminosäurerest davon fehlt;
(2) eine DNA, die eine cDNA-Sequenz umfaßt, die für ein vorstehend in (1) definiertes Human-Luteinisierungshormon-Human- Choriongonadotropin-Rezeptorprotein kodiert;
(3) eine Transformante, die eine vorstehend in (2) definierte DNA trägt;
(4) ein Verfahren zum Herstellen eines vorstehend in (1) definierten Human-Luteinisierungshormon-Human-Choriongonadotropin- Rezeptorproteins, wobei das Verfahren das Kultivieren einer Transformanten, die eine vorstehend in (2) definierte DNA trägt, Anreichern des Proteins in einer Kulturbrühe und Sammeln desselben umfaßt;
(5) eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge eines vorstehend in (1) definierten Human-Luteinisierungshormon-Human-Choriongonadotropin-Rezeptorproteins und einen pharmazeutischen Träger oder ein Vehikel umfaßt, und
(6) die Verwendung eines vorstehend in (1) definierten Proteins zum Herstellen eines Arzneimittels zur Diagnose und Behandlung von Eierstock- und Hodenkrankheiten.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt sowohl eine Nukleotidsequenz eines Human-LH/hCG- Rezeptorprotein-DNA-Abschnitts als auch eine daraus abgeleitete Aminosäuresequenz und
Fig. 2 zeigt die Aminosäuresequenz des Human-LH/hCG- Rezeptorproteins und Aminosäuresequenzen anderer bekannter LH/hCG-Rezeptorproteine und Proteine mit ähnlicher Wirkung, wobei sie miteinander verglichen werden.
Fig. 3 und 4 sind SDS-PAGE-Diagramme, die die Expression des HLHR-Proteins in Beispiel 2 zeigen.
Fig. 5 ist eine graphische Darstellung, die zeigt, daß das gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltene Protein die Fähigkeit zum Ansprechen auf hCG aufweist.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Die Erfinder klonierten zwei Arten cDNA des Human-Luteinisierungshormon-Human-Choriongonadotropin-Rezeptorproteins unter Ableiten der Primärstruktur des vollständigen Proteins (Fig. 1). Das erste Methionin in dieser Sequenz wird als Startkodon angesehen. Auf dieses folgt eine Aminosäuresequenz mit den Eigenschaften eines Signalpeptids mit einer vorhandenen Spaltungsstelle. Ein mögliches Modell zum Aufbau des Proteins wurde durch Hydropathieanalyse und Vergleich mit dem Ratten- und Schweine-LH/hCG-Rezeptor (Fig. 2) nahegelegt. Eine vermeintliche extrazelluläre Domäne aus 335 Aminosäuren geht einer Region von 267 Aminosäuren voran, die sieben mögliche Transmembranabschnitte (von Rechtecken umgebene und I bis II benannte Bereiche in Fig. 2) zeigt. Es gibt eine COOH-terminale intrazelluläre Domäne von 72 Aminosäuren. Das reife Protein kann aus 674 Aminosäuren (75632 Dalton) bestehen. Außer diesem Protein gibt es 25 Signalpeptide (die 1. bis 25. Aminosäure in Fig. 1 und 2). Diese Peptide werden jedoch während der Rezeptorsynthese abgeschnitten und deshalb wird das reife Rezeptorprotein als aus 674 Aminosäuren (die 26. bis 699. Aminosäure) bestehend erachtet. Auf Primärstrukturebene weist diese extrazelluläre Domäne etwa 85% Homologie mit dem Ratten- und Schweine-LH/hCG-Rezeptor und 45% Homologie mit dem TSH- und FSH-Rezeptor auf (in Fig. 2 bezeichnet hLH/hCGR den Human- LH/hCG-Rezeptor; rLH/hCGR bezeichnet den Ratten-LH/hCG- Rezeptor; pLH/hCGR bezeichnet den Schweine-LH/hCG-Rezeptor; hTSHR bezeichnet den Human-TSH-Rezeptor [Biochem. Biophys. Res. Comm. 166 394 (1990)] und rFSHR bezeichnet den Ratten- FSH-Rezeptor [Mol. Endo. 4 525 (1990)]). Sechs mögliche Glykosylierungsstellen werden in der vermeintlichen extrazellulären Domäne (unterstrichene Abschnitte in Fig. 1) angetroffen. Cluster von Cysteinresten befinden sich im NH&sub2;-terminalen Abschnitt und zwischen den vermeintlichen extrazellulären und Transmembrandomänen des vorstehenden Proteins. Da diese Cysteinreste im LH-, FSH- und TSH-Rezeptor erhalten bleiben, kann, obschon nicht gewünscht wird, an eine Theorie gebunden zu sein, gesagt werden, daß die Bildung von Disulfidbindungen für die konformative Unversehrtheit der großen extrazellulären Domänen von Glykoproteinhormonrezeptoren entscheidend ist.
Die Domäne, die als die Transmembrandomänen enthaltend angesehen wird, weist etwa 90% Homologie mit dem Ratten- und Schweine-LH/hCG-Rezeptor und 70% Homologie mit dem TSH- und FSH- Rezeptor auf. Serin- und Threoninreste werden mit großer Häufigkeit in einer mutmaßlichen interzellulären Domäne mit drei Stellen angetroffen, die möglicherweise durch Proteinkinase C phosphoryliert ist (Fig. 1). Da die gegenüber den Rezeptoren spezifische Phosphorylierung durch Proteinkinase eine Rolle bei der agonistenspezifischen Entkupplung adrenerger Rezeptoren von den G-Proteinen spielt, ist es wichtig zu wissen, ob die Phosphorylierung an wenigstens einer dieser Stellen irgendeine funktionelle Änderung der LH/hCG-Rezeptoren bewirkt.
Bei der vorliegenden Erfindung wurde außer einem Klon mit einem großen offenen Leserahmen ein für ein kürzeres Protein kodierender Klon erhalten. Der große Klon ist der 1. bis 699. Aminosäurerest in Fig. 1 (SEQ ID Nr. 1), der verkürzte Typ ist einer, bei dem die Region des 227. bis 289., von einem Rechteck umgebenen Aminosäurerestes fehlt. Dieses Muster legt nahe, daß der zum Vervollständigen der mRNA notwendige Spaltungsmechanismus eine Selektivität aufweist. Diese Ergebnisse sind den Daten des Schweine-LH/hCG-Rezeptors sehr ähnlich. Die Rolle dieses Rezeptors vom verkürzten Typ wird nicht gut verstanden und es ist nicht bekannt, ob dieser LH/hCG-Rezeptor entweder als Monomer oder als Oligomer physiologisch aktiv ist.
Beim Menschen kann dieser TSH-Rezeptor Ziel einer Autoimmunreaktion sein, die zur Über- oder Unterstimulierung der Schilddrüse durch Autoantikörper bei der Grave-Krankheit und idiopathischem Myxödem führt. Somit ist es nicht nur als Beitrag zur Diagnose und Behandlung von Eierstockerkrankungen, sondern auch zu einem besseren Verständnis der Physiologie des Eierstocks notwendig, den Human-LH/hCG-Rezeptor zu isolieren und seine Eigenschaften zu kennen.
Fig. 2 zeigt die Aminosäuresequenz des in der vorliegenden Erfindung erhaltenen Human-Luteinisierungshormon-Human-Choriongonadotropin-Rezeptorproteins und vergleicht diese Aminosäuresequenz mit den Aminosäuresequenzen des Ratten- und Schweine- Luteinisierungshormon-Human-Choriongonadotropin-Rezeptorproteins und dem FSH- und TSH-Rezeptor mit ähnlicher Wirkung. Wenn derselbe Aminosäurerest in dem Human-Luteinisierungshormon- Human-Choriongonadotropin-Rezeptorprotein der vorliegenden Erfindung auftritt, wird er durch "." dargestellt und ein von dem des Human-LH/hCG-Rezeptors verschiedener Aminosäurerest wird durch das hierin definierte, entsprechende Symbol dargestellt. In Fig. 2 dargestelltes CONSENSUS bezeichnet Aminosäurereste, die allen in Fig. 2 dargestellten Glykoproteinen gemeinsam sind. Die Veranschaulichung von CONSENSUS führt zum Einführen fehlender Bereiche "-" in die Formeln in Fig. 2. Dementsprechend wird die die Aminosäuren darstellende Zahl unter Ausschließen dieser fehlenden Bereiche gezählt.
Bei einer DNA-Sequenz enthält die für den Human-LH/hCG-Rezeptor der vorliegenden Erfindung kodierende DNA die in Fig. 1 dargestellte Nukleotidsequenz oder einen Teil davon.
Als für den Human-LH/hCG-Rezeptor der vorliegenden Erfindung kodierende cDNA kann jede cDNA verwendet werden, solange sie eine Nukleotidsequenz enthält, die für eine Aminosäuresequenz des humanen LH/hCG-Rezeptors kodiert. Zum Beispiel wird vor zugsweise eine die in Fig. 1 dargestellte Nukleotidsequenz oder einen Teil davon enthaltende DNA verwendet.
Die in Fig. 1 dargestellte Nukleotidsequenz ist ein Beispiel von cDNA-Sequenzen, die für den in der vorliegenden Erfindung erhaltenen Human-LH/hCG-Rezeptor kodieren.
In der vorliegenden Erfindung kann zum Beispiel ein Expressionsvektor mit der cDNA, die die für den Human-LH/hCG-Rezeptor kodierende Nukleotidsequenz enthält, durch das folgende Verfahren hergestellt werden:
(a) Boten-RNA (mRNA) wird aus den Human-LH/hCG-Rezeptor produzierenden Zellen isoliert.
(b) Einzelsträngige, komplementäre DNA (cDNA) wird aus der mRNA synthetisiert, gefolgt von der Synthese doppelsträngiger DNA.
(c) Die komplementäre DNA wird in einen Phagen oder ein Plasmid eingeführt.
(d) Wirtszellen werden mit dem auf diese Weise erhaltenen rekombinanten Phagen oder Plasmid transformiert.
(e) Nach der Kultivierung der auf diese Weise erhaltenen Transformanten werden durch ein geeignetes Verfahren wie etwa Hybridisierung mit einer DNA-Sonde, die für einen Teil des Ratten-LH/hCG-Rezeptors kodiert, oder Immuntest mittels eines Anti-LH/hCG-Rezeptor-Antikörpers die gewünschte DNA enthaltende Plasmide oder Phagen aus den Transformanten isoliert.
(f) Die gewünschte klonierte DNA wird aus der rekombinanten DNA ausgeschnitten.
(g) Die klonierte DNA oder ein Teil davon wird stromabwärts eines Promotors in dem Expressionsvektor ligiert.
Die für den Human-LH/hCG-Rezeptor kodierende mRNA kann aus verschiedenen, den Human-LH/hCG-Rezeptor produzierenden Zellen, zum Beispiel Keimzellen wie etwa den Leydig-Zellen in den Hoden, den Kapselzellen im Eierstock, den Granulosazellen, den Gelbkörperzellen und den interstitiellen Zellen erhalten werden.
Verfahren zum Herstellen der mRNA aus den den Human-LH/hCG- Rezeptor produzierenden Zellen schließen das Guanidinthiocyanatverfahren [J. M. Chirgwin et al., Biochemistry 18 5294 (1979)] ein.
Unter Verwenden der auf diese Weise erhaltenen mRNA als Matrize wird durch Verwendung reverser Transkriptase zum Beispiel gemäß dem Verfahren von H. Okayama et al. [Molecular and Cellular Biology 2 161 (1979), und ibid. 3 280 (1983)] cDNA synthetisiert. Die auf diese Weise erhaltene cDNA wird in das Plasmid eingeführt.
Die Plasmide, in die die cDNA eingeführt werden kann, schließen zum Beispiel pBR322 [Gene 2 95 (1977)], pBR325 [Gene 4 121 (1978)], pUC12 [Gene 19 259 (1982)] und pUC13 [Gene 19 259], die jeweils aus Escherichia coli stammen, und aus Bacillus subtilis stammendes pUB110 [Biochemical and Biophysical Research Communication 112 678 (1983)] ein. Es kann jedoch jedes andere Plasmid verwendet werden, solange es in der Wirtszelle replizierbar und lebensfähig ist. Beispiele der Phagenvektoren, in die die cDNA eingeführt werden kann, schließen λgt11 [R. Young und R. Davis, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80 1194 (1983)] ein. Jeder andere Phagenvektor kann jedoch verwendet werden, solange er in der Wirtszelle lebensfähig ist.
Verfahren zum Einführen der cDNA in das Plasmid schließen zum Beispiel das in T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 239 (1982), beschriebene Verfahren ein. Verfahren zum Einführen der cDNA in den Phagenvektor schließen zum Beispiel das Verfahren von T. V. Hyunh et al. [DNA Cloning, A Practical Approach 1 49 (1985)] ein.
Das auf diese Weise erhaltene Plasmid wird in eine geeignete Wirtszelle wie etwa Escherichia und Bacillus eingeführt.
Beispiele der vorstehend beschriebenen Escherichia schließen E. coli K12DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 60 160 (1968)], M103 [Nucleic Acids Research 9 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology 120 517 (1978)], HB101 [Journal of Molecular Biology 41 459 (1969)] und C600 [Genetics 39 440 (1954)] ein.
Beispiele des vorstehend beschriebenen Bacillus schließen Bacillus subtilis MI114 [Gene 24 255 (1983)] und 207-21 [Journal of Biochemistry 95 87 (1984)] ein.
Verfahren zum Transformieren der Wirtszelle mit dem Plasmid schließen zum Beispiel das in T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 249 (1982), beschriebene Calciumchloridverfahren oder Calciumchlorid/Rubidiumchloridverfahren ein.
Wenn ein Phagenvektor verwendet wird, kann er zum Beispiel unter Verwenden des In-vitro-Verpackungsverfahrens in vermehrte E. coli transduziert werden.
Human-LH/hCG-Rezeptor-cDNA enthaltende Human-LH/hCG-Rezeptor- cDNA-Bibliotheken können am Markt erworben werden, obschon sie durch die vorstehend beschriebenen Verfahren erhältlich sind.
Zum Beispiel ist eine cDNA-Bibliothek des LH/CG-Rezeptors von Clontech Laboratories, Inc., USA, erhältlich.
Verfahren zum Klonieren von Human-LH/hCG-Rezeptor-cDNA aus der Human-DNA-Bibliothek schließen zum Beispiel das Plaquehybridisierungsverfahren unter Verwenden des Phagenvektors λCharon 28A und Ratten-LH/hCG-Rezeptor-cDNA als Sonde [T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, (1982)] ein.
Die auf diese Weise klonierte Human-LH/hCG-Rezeptor-cDNA kann nötigenfalls zum Beispiel in pBR322, pUC12, pUC13, pUC18, pUC19, pUC118 und pUC119 unter Erhalten der Human-LH/hCG- Rezeptor-cDNA subkloniert werden.
Die Nukleotidsequenz der auf diese Weise erhaltenen cDNA wird zum Beispiel durch das Maxam-Gilbert-Verfahren [A. M. Maxam und W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74 560 (1977)] oder das Didesoxyverfahren [J. Messing et al., Nucleic Acids Research 9 309 (1981)] bestimmt und das Vorliegen der Human- LH/hCG-Rezeptor-cDNA wird im Vergleich mit der bekannten Aminosäuresequenz bestimmt.
Wie vorstehend beschrieben wird die für das Human-LH/hCG- Rezeptorprotein kodierende cDNA erhalten.
Fig. 1 zeigt die durch das Desoxyverfahren bestimmte Nukleotidsequenz der cDNA, die für das im nachstehend beschriebenen Beispiel erhaltene Human-LH/hCG-Rezeptorprotein kodiert und die aus der Nukleotidsequenz bewiesene Aminosäuresequenz.
Die für das Human-LH/hCG-Rezeptorprotein kodierende cDNA, die wie vorstehend beschrieben kloniert wurde, kann in Abhängigkeit von der beabsichtigten Verwendung so wie sie ist oder gewünschtenfalls nach Verdauung mit einem Restriktionsenzym verwendet werden.
Eine zum Exprimieren bestimmte Region wird aus der klonierten cDNA ausgeschnitten und stromabwärts von einem Promotor in einem zur Expression geeigneten Träger (Vektor) ligiert, wodurch der Expressionsvektor erhalten werden kann.
Die cDNA weist ATG als Translationsstartkodon an deren 5'- Terminus auf und kann TAA, TGA oder TAG als Translationsabbruchkodon am 3'-Terminus aufweisen. Das Translationsstartkodon und Translationsabbruchkodon kann durch Verwenden eines geeigneten synthetischen cDNA-Adaptors angefügt werden. Weiter ist zum Zwecke des Exprimierens der cDNA ein Promotor stromabwärts davon ligiert.
Beispiele der Vektoren schließen die vorstehenden, aus E. coli stammenden Plasmide wie etwa pBR322, pBR325, pUC12 und pUC13, die aus Bacillus subtilis stammenden Plasmide wie etwa pUB110, pTP5 und pC194, aus Hefe stammende Plasmide wie etwa pSH19 und pSH15, Bakteriophagen wie etwa den λ-Phagen und tierische Viren wie etwa Retroviren und Vakziniaviren ein.
Als in der vorliegenden Erfindung verwendeter Promotor steht jeder Promotor zur Verfügung, solange er zur Expression in der für die Genexpression gewählten Wirtszelle geeignet ist.
Wenn die zur Transformation verwendete Wirtszelle Escherichia ist, ist es bevorzugt, daß ein trp-Promotor, lac-Promotor, ein recA-Promotor, ein λPL-Promotor oder ein lpp-Promotor verwendet wird. Wenn die Wirtszelle Bacillus ist, ist es bevorzugt, daß ein SPO1-Promotor, ein SPO2-Promotor oder ein penP-Promotor verwendet wird. Wenn die Wirtszelle Hefe ist, ist es bevorzugt, daß ein PHO5-Promotor, ein PGK-Promotor, ein GAP- Promotor oder ein ADH-Promotor verwendet wird. Insbesondere ist es bevorzugt, daß die Wirtszelle Escherichia ist und der Promotor der trp-Promotor oder der λPL-Promotor ist.
Wenn die Wirtszelle eine tierische Zelle ist, ist ein aus SV-40 stammender Promotor, ein Retrovirus-Promotor, ein Metallothionein-Promotor oder ein Hitzeschock-Promotor verwendbar.
Ein Verstärker wird ebenfalls wirkungsvoll zur Expression verwendet.
Unter Verwenden eines Vektors, der die auf diese Weise aufgebaute, für das reife Peptid des Human-LH/hCG-Rezeptorproteins kodierende cDNA enthält, werden Transformanten hergestellt.
Die Wirtszellen schließen zum Beispiel Escherichia, Bacillus, Hefe und tierische Zellen ein.
Spezifische Beispiele der vorstehenden Escherichia und Bacillus schließen zu den vorstehend beschriebenen ähnliche Stämme ein.
Beispiele der vorstehenden Hefe schließen Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R&supmin;, NA87-11A und DKD-5D ein.
Beispiele der tierischen Zellen schließen Affenzellen COS-7, Vero, Zellen des chinesischen Hamsters (CHO), Maus-L-Zellen und menschliche FL-Zellen ein.
Die Transformation der vorstehenden Escherichia wird zum Beispiel gemäß dem in Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 69 2110 (1972) oder Gene 17 107 (1982) beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Die Transformation des vorstehenden Bacillus wird zum Beispiel gemäß dem in Molecular & General Genetics 168 111 (1979) beschriebenen Verfahren ausgeführt.
Die Transformation der Hefe wird zum Beispiel gemäß dem in Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 75 1929 (1978) beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Die Transformation der tierischen Zellen wird zum Beispiel gemäß dem in Virology 52 456 (1973) beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Auf diese Weise werden Transformanten erhalten, die mit dem Expressionsvektor transformiert wurden, der die für den Human- LH/hCG-Rezeptor kodierende cDNA enthält.
Wenn Bakterien-Transformanten kultiviert werden, ist ein flüssiges Medium besonders als zur Kultur verwendetes Medium geeignet. Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische und andere für das Transformantenwachstum notwendige Verbindungen sind darin enthalten. Beispiele der Kohlenstoffquellen schließen Glucose, Dextrin, lösliche Stärke und Sucrose ein. Beispiele der Stickstoffquellen schließen anorganische oder organische Materialien wie etwa Ammoniumsalz, Nitrate, Maisquellwasser, Pepton, Casein, Fleischextrakte, Sojabohnenmehl und Kartoffelextraktlösung ein. Die anorganischen Verbindungen schließen zum Beispiel Calciumchlorid, Natriumdihydrogenphosphat und Magnesiumchlorid ein. Hefe, Vitamine, wachstumsfördernde Faktoren und so weiter können weiter hinzugesetzt werden.
Der pH des Mediums ist vorzugsweise 5 bis 8.
Als Medium zur Kultivierung von Escherichia wird zum Beispiel vorzugsweise Glucose und Casaminosäuren enthaltendes M9-Medium verwendet (Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972). Um den Promotor wirkungsvoll tätig werden zu lassen, kann nötigenfalls ein Wirkstoff wie etwa 3-β-Indolylacrylsäure hinzugesetzt werden.
Wenn die Wirtszelle Escherichia ist, wird die Kultivierung üblicherweise 3 bis 24 Stunden bei 15 bis 43ºC, nötigenfalls unter Belüften oder Rühren durchgeführt.
Wenn die Wirtszelle Bacillus ist, wird die Kultivierung üblicherweise 6 bis 24 Stunden bei 30 bis 40ºC, nötigenfalls unter Belüften oder Rühren durchgeführt.
Wenn Hefetransformanten kultiviert werden, wird zum Beispiel Burkholder-Minimalmedium [K. L. Bostian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77 4505 (1980)] als Medium verwendet. Der pH des Mediums wird vorzugsweise auf 5 bis 8 eingestellt. Die Kultivierung wird üblicherweise 24 bis 72 Stunden bei 20 bis 35ºC, nötigenfalls unter Belüftung oder Rühren durchgeführt.
Wenn Tierzellentransformanten kultiviert werden, schließen Beispiele des Mediums 5 bis 20% fetales Kälberserum enthaltendes MEM-Medium [Science 122 501 (1952)], DMEM-Medium [Virology 8 396 (1959)], RMPI1640-Medium (The Journal of the American Medical Association 199 519 (1967)] und 199-Medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine 73 1 (1950)] ein. Der pH ist vorzugsweise 6 bis 8. Die Kultivierung wird üblicherweise 15 bis 60 Stunden bei 30 bis 40ºC, nötigenfalls unter Belüftung oder Rühren durchgeführt.
Das Human-LH/hCG-Rezeptorprotein kann aus der vorstehend beschriebenen Kultur zum Beispiel durch das folgende Verfahren isoliert und gereinigt werden.
Wenn das Human-LH/hCG-Rezeptorprotein aus den kultivierten Zellen extrahiert wird, werden die Zellen nach der Kultivierung durch in der Technik bekannte Verfahren gesammelt. Anschließend werden die gesammelten Zellen in einer geeigneten Pufferlösung suspendiert und durch Ultraschallbehandlung, Lysozym und/oder Gefrieren-Auftauen aufgebrochen. Danach wird durch Zentrifugieren oder Filtration eine rohe Extraktlösung des reifen Human-LH/hCG-Rezeptorpeptids erhalten. Die Pufferlösung kann ein Proteindenaturierungsmittel wie etwa Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid oder ein oberflächenaktives Mittel wie etwa Triton® X-100 enthalten.
Wenn das Human-LH/hCG-Rezeptorprotein in die Kulturlösung ausgeschieden wird, wird nach dem Abschluß der Kultivierung durch in der Technik bekannte Verfahren ein Überstand von den Zellen abgetrennt und anschließend gesammelt.
Die Trennung und Reinigung des im Kulturüberstand oder in der auf diese Weise erhaltenen extrahierten Lösung enthaltenen Human-LH/hCG-Rezeptors kann durch eine geeignete Kombination bekannter Trenn- und Reinigungsverfahren ausgeführt werden. Die bekannten Trenn- und Reinigungsverfahren schließen die Löslichkeit nutzende Verfahren, wie etwa Salzfällung und Lösungsmittelfällung, hauptsächlich einen Molekulargewichtsunterschied nutzende Verfahren wie etwa Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltration und SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, einen elektrischen Ladungsunterschied nutzende Verfahren, wie etwa Ionenaustausch-Säulenchromatographie, eine spezifische Affinität ausnutzende Verfahren, wie etwa Affinitätschromatographie, einen Hydrophobieunterschied nutzende Verfahren, wie etwa Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, und einen Unterschied des isoelektrischen Punkts nutzende Verfahren, wie etwa Isoelektrofokussierungselektrophorese, ein. Ein Verfahren kann auch verwendet werden, bei dem ein Antikörper gegen ein fusioniertes Protein, das durch Fusionieren der komplementären DNA des Human-LH/hCG-Rezeptors mit aus E. coli stammendem DNA- lacZ exprimiert wurde, als Immunaffinitätssäule verwendet wird.
Die Aktivität des auf diese Weise gebildeten Human-LH/hCG- Rezeptorproteins kann durch einen Enzymimmuntest unter Verwenden eines spezifischen Antikörpers gemessen werden.
Die mit der cDNA der vorliegenden Erfindung transfizierten oder transformierten Zellen erlauben das Herstellen des Human- LH/hCG-Rezeptorproteins in großen Mengen.
Das hier hergestellte Human-LH/hCG-Rezeptorprotein wird der Untersuchung der Physiologie des Eierstocks, der Zufuhr von Antikörpern an den Rezeptor, der Diagnose und Behandlung von Eierstock- oder Hodenkrankheiten wie etwa Ovulationsaberration der Oligosermieund der Entwicklung von Kontrazeptiva zugeleitet. Beim Menschen kann dieser TSH-Rezeptor das Ziel von Autoimmunreaktionen sein, was zu einer Über- oder Unterstimulation der Schilddrüse durch Autoantikörper bei der Grave- Krankheit und idiopathischem Myxödem führt. Der LH/hCG- Rezeptor kann deshalb die LH-Wirkung in vivo unterdrücken oder kann eine Überstimulation ausführen, anstatt bei dem menschlichen Genitalsystem LH eine Erkrankung zu verursachen. Der Anti-Rezeptor-Antikörper kann durch Erzeugen des Rezeptors durch jedes vorstehend beschriebene Verfahren, sein Markieren und Untersuchen, ob ein daran bindender (Antikörper) in vivo vorhanden ist oder nicht, nachgewiesen werden. Außerdem wird angenommen, daß die Hemmung der LH-Wirkung durch einen Antikörper, der durch Exprimieren eines Teils oder aller RezeptorcDNA erhalten wurde, nämlich die Anwendung des Antikörpers als Kontrazeptivum möglich ist.
Vorstehend ist im Einzelnen das Klonieren der für das Human- LH/hCG-Rezeptorprotein kodierenden cDNA, die Herstellung der Expressionsvektoren für das Human-LH/hCG-Rezeptorprotein, die Herstellung der Transformanten damit, die Herstellung des Human-LH/hCG-Rezeptorproteins durch Verwenden der Transformanten und dessen Verwendung beschrieben worden.
Wenn Nukleotide, Aminosäuren und so weiter in dieser Beschreibung und den Zeichnungen durch Abkürzungen bezeichnet werden, werden die von der IUPAC-IUB-Kommission für biochemische Nomenklatur angenommenen oder gemeinhin in der Technik verwendeten eingesetzt. Es werden zum Beispiel die folgenden Abkürzungen verwendet. Wenn die Aminosäuren als optische Isomere vorliegen können, versteht es sich, solange nicht anders angegeben, daß die L-Formen dargestellt sind.
DNA: Desoxyribonukleinsäure
cDNA: komplementäre Desoxyribonukleinsäure
A: Adenin
T: Thymin
G: Guanin
C: Cytosin
RNA: Ribonukleinsäure
mRNA: Boten-Ribonukleinsäure
dATP: Desoxyadenosintriphosphat
dTTP: Desoxythymidintriphosphat
dGTP: Desoxyguanosintriphosphat
dCTP: Desoxycytidintriphosphat
ATP: Adenosintriphosphat
EDTA: Ethylendiamintetraessigsäure
SDS: Natriumdodecylsulfat
Gly oder G: Glycin
Ala oder A: Alanin
Val oder V: Valin
Leu oder L: Leucin
Ile oder I: Isoleucin
Ser oder S: Serin
Thr oder T: Threonin
Cys oder C: Cystein
Met oder M: Methionin
Glu oder E: Glutaminsäure
Asp oder D: Asparaginsäure
Lys oder K: Lysin
Arg oder R: Arginin
His oder H: Histidin
Phe oder F: Phenylalanin
Tyr oder Y: Tyrosin
Trp oder W: Tryptophan
Pro oder P: Prolin
Asn oder N: Asparagin
Gln oder Q: Glutamin
Die genaue chemische Struktur der Human-Luteinisierungshormon- Human-Choriongonadotropin-Rezeptorproteine der vorliegenden Erfindung hängt von einer Anzahl Faktoren ab. Da in diesen Proteinen ionisierbare Amino- und Carboxylgruppen vorliegen, kann ein bestimmtes Protein als saures oder basisches Salz oder in neutraler Form erhalten werden. Alle derartigen Zubereitungen, die ihre Bioaktivität behalten, wenn sie in geeignete Umgebungsbedingungen verbracht werden, sind von der Definition der Rezeptorproteine der vorliegenden Erfindung umfaßt. Die primäre Aminosäuresequenz derartiger Proteine kann weiter durch Derivatisierung unter Verwendung von Zuckerstruktureinheiten oder durch andere ergänzende Moleküle wie etwa Lipide, Phosphat- und Acetylgruppen bewiesen werden. Derartige Abänderungen sind von der Definition der Rezeptorproteine der vorliegenden Erfindung solange umfaßt, wie die Bioaktivität des Proteins nicht zerstört wird. Es wird selbstverständlich erwartet, daß derartige Abänderungen die Bioaktivität entweder durch Verstärken oder Erniedrigen der Aktivität des Proteins quantitativ oder qualitativ beeinflussen können.
Weiter können einzelne Aminosäurereste in der Kette durch Oxidation, Reduktion oder eine andere Derivatisierung abgeändert werden und die Rezeptorproteine der vorliegenden Erfindung können unter Erhalten von Fragmenten, die die Bioaktivität behalten, gespalten werden. Derartige Änderungen, die die Bioaktivität nicht zerstören, nehmen derartige Rezeptorproteine nicht von der Definition aus.
Schließlich können Änderungen an der Primärstruktur selbst durch Weglassen, Hinzufügen oder Ändern der in die Sequenz eingebauten Aminosäuren während der Translation durchgeführt werden, ohne die Aktivität der Rezeptorproteine der vorliegenden Erfindung zu zerstören.
Die vorliegende Erfindung wird hierin nachstehend durch die folgenden Beispiele genauer beschrieben.
Die im nachstehend beschriebenen Beispiel 1 erhaltene Transformante E. coli JM109/pUC18 wurde am 9. Oktober 1990 beim Fermentationsforschungsinstitut, Amt für industrielle Wissenschaft und Technology, Ministerium für internationalen Handel und Industrie, Japan (FRI), unter der Zugangsnummer FERM BP- 3127 hinterlegt. Dieser Mikroorganismus wurde am 11. Oktober 1990 beim Fermentationsinstitut, Osaka, Japan (IFO), unter der Zugangsnummer IFO 15096 hinterlegt.
Die im nachstehend beschriebenen Beispiel 2 erhaltenen Transformanten E. coli DH1/pHLHR(UEX2) und E. coli JM109/pHLHR(GEX- 3X) wurden am 29. August 1991 beim Fermentationsforschungsinstitut, Amt für industrielle Wissenschaft und Technology, Ministerium für internationalen Handel und Industrie, Japan (FRI), unter der Zugangsnummer FERM BP-3545 und FERM BP-3544 hinterlegt.

Beispiel 1

(1) Herstellung einer aus dem menschlichen Eierstock stammenden cDNA-Bibliothek

Die gesamte RNA wurde durch das Guanidinthiocyanatverfahren aus dem menschlichen Eierstock extrahiert und anschließend wurde die mRNA durch Verwendung einer Oligo(dt)-Cellulosesäule (Typ 7, Pharmacia) gereinigt. Unter Verwenden eines cDNA- Synthesekits (Pharmacia) wurde aus etwa 2 ug gereinigter mRNA cDNA synthetisiert. Der Terminus dieser cDNA wurde mit T4-DNA- Polymerase stumpf gemacht, gefolgt von der Zugabe eines EcoRI- Adapters. Diese cDNA wurde an einen λgt10-Vektor gebunden und durch Verwendung eines Verpackungskits (Gigapack Gold, Stratagene) wurde eine In-vitro-Verpackung durchgeführt. Diese Bibliothek enthielt 1 · 10&sup6; unabhängige Rekombinanten und wurde vermehrt.

(2) Reinigung einer Sonde

Eine cDNA-Bibliothek wurde in einer zu der vorstehend beschriebenen ähnlichen Weise aus einem Ratten-Eierstock hergestellt und in einen λZaPII-Vektor (Stratagene) eingeführt. Ein Ratten-LH/hCG-Rezeptor wurde daraus unter Isolieren der Klone Zap3-5-1 (2,8 kb) kloniert. Die Klone wurden unter Anwenden des Zufallprimerverfahrens (Amersham) markiert und als Sonde verwendet.

(3) Durchmustern

Eine λgt10-cDNA-Bibliothek-Phagenlösung von 5 · 10&sup4; plaquebildenden Einheiten (pfu) wurde mit 500 ul C600hf1 (über Nacht kultiviert) gemischt und das Gemisch wurde 15 Minuten bei 37ºC inkubiert. Anschließend wurden 8 ml 0,75%ige Agarose (Nippon Gene) LB hinzugesetzt und mit dem Gemisch wurde eine 1,5% Ag ar-LB-Platte (15 cm-Schale) beimpft. Ein Nitrocellulosefilter (Hybond-N, Amersham) wurde auf die Platte, auf der Plaques gebildet wurden, gelegt und die DNA wurde fixiert. Nachfolgend wurde das Filter in einer Lösung, die durch Zusetzen von 0,1% Rinderserumalbumin (BSA), Polyvinylpyrrolidon, Ficoll® 400 (Pharmacia), 5% Pyrophosphorsäure und 0,1% SDS zu 6 · SSC (0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0) hergestellt wurde, 1 bis 2 Stunden bei 65ºC vorhybridisiert. Bei der Hybridisierung wurde die Sonde als Leitsubstanz zu 200 000 cpm/ml zugesetzt. Das Filter wurde 15 Minuten bei 42ºC mit 6 · SSC und nachfolgend 10 Minuten bei 65ºC mit 0,1 · SSC gewaschen. Anschließend wurde das Filter der Autoradiographie bei -70ºC unterzogen.

(4) DNA-Sequenzanalyse

Einige Klone wurden identifiziert und der längste wurde aus diesen Klonen zur Sequenzanalyse ausgewählt. Dieser Klon wurde in pUC18 (Takara) subkloniert und E. coli JM109 wurde mit dem sich daraus ergebenden Plasmid unter Liefern der Transformante E. coli JM109/pUC18 (FERM BP-3127) transformiert. Diese Transformante wurde durch Exonukleaseverdauung unter Herstellen langer bis kurzer einzelsträngiger DNA-Fragmente schrittweise weiter verkürzt. Eine Sequenzanalyse wurde durch das Didesoxykettenabbruchverfahren mittels eines 7DEAZA-Sequenzierkits durchgeführt. Die Elektrophorese wurde durch die Verwendung eines LKB2010 Macrophor-Sequenzierungssystems durchgeführt. Die SDC Genetyx-Software wurde zur Datenanalyse verwendet.
Fig. 1 zeigt sowohl die Nukleotidsequenz der DNA des Human- LH/hCG-Rezeptorproteins als auch die davon abgeleitete Aminosäuresequenz. Die in der vorliegenden Erfindung erhaltene Nukleotidsequenz weist weitere 8 DNA (-8 bis -1) vor dem N- Terminus der Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 1 auf.

Beispiel 2 Expression des Human-LH/hCG-Rezeptorproteins (kurz als HLHR-Protein bezeichnet)

(1) Die in Beispiel 1 erhaltenen HLHR-cDNA-Klone wurden verwendet. Das lac Z-HLHR-Fusionsgen wurde durch Klonieren des für den extrazellulären Abschnitt des HLHR kodierenden EcoRI- Xba-Fragments mit 1400 bp in die BamHI-Stelle von pUEX2 erhalten. Der lac Z-HLHR-Fusionsaufbau wurde unter Liefern der Transformante E. coli DH1/pHLHR(UEX2) (FERM BP-3545) in den E. coli DH1-Wirt transformiert.
Zur Herstellung des lacZ-HLHR-Fusionsproteins wurde die Transformante über Nacht bei 30ºC in LB kultiviert. 5 ml LB-Medium wurden mit 50 ul der Übernacht-Kultur beimpft. Nach 2 h Inkubation bei 30ºC unter Belüftung und weiteren 2 h Inkubation bei 42ºC wurden die Zellen pelletiert.
Die Pellets wurden in einem Probenpuffer für die SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) gelöst. Die Lösung wurde der 5% SDS-PAGE unterzogen. Mit dem pUEX2-Vektor transformierte E. coli wurde ähnlich der 5% SDS-PAGE unterzogen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Coomassieblau angefärbt. Das Ergebnis wird in Fig. 3 dargestellt. Bahn 1 zeigt einen Molekulargewichtsmarker, Bahn 2 zeigt den Fall des pUEX2- Vektors und Bahn 3 zeigt die vorliegende Transformante. Eine Bande bei 110 kda von Bahn 2 verschwindet und eine neue Bande tritt bei 159 kda auf. Das Ergebnis der Elektrophorese und die Nukleotidsequenzanalyse zeigen die Expression des HLHR- Proteins.
(2) Das GST-HLHR-Fusionsgen (Glutathion-S-Transferase) wurde durch Klonieren des für den extrazellulären Abschnitt von HLHR kodierenden EcoRI-Xba-Fragments mit 1400 bp in die BamHI- Stelle von pGEX-3X (Pharmacia) erhalten. Der GST-HLHR- Fusionsaufbau wurde unter Liefern von E. coli JM109/pHLHR(GEX- 3X) (FERM BP-3544) in den E. coli JM 109-Wirt transformiert.
Die Transformante wurde über Nacht bei 30ºC in LB kultiviert. Die Übernacht-Kultur von JM 109 wurde in 500 ml frischem Medium 1 : 10 verdünnt und 1 h bei 37ºC kultiviert, bevor IPT6 bis 0,1 M zugesetzt wurde. Nach weiteren 7 h Kultur wurden die Zellen pelletiert.
Die Zellen wurden in einem Probenpuffer zur SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese (PAGE) gelöst. Die Lösung wurde der 10% SDS- PAGE unterzogen. Mit pGEX-3X-Vektor transformierte E. coli wurde ähnlich der 10% SDS-PAGE unterzogen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Coomassieblau angefärbt. Das Ergebnis wird in Fig. 4 dargestellt. Bahn 1 zeigt einen Molekulargewichtsmarker, Bahn 2 zeigt den Fall des pGEX-3X-Vektors und Bahn 3 zeigt die vorliegende Transformante. Eine Bande bei 26 kda von Bahn 2 verschwindet und eine neue Bande bei 75 kda erscheint. Das Ergebnis der Elektrophorese und die Nukleotidsequenzanalyse zeigen die Expression des HLHR-Proteins.

(3) Funktionelle Expression von HLHR

Der Expressionsvektor pCHLHR wurde durch Einführen der gesamten Kodierungsregion der klonierten cDNA und weiterer, auf einem RcoRI-Fragment (2995 bp) enthaltener flankierender Regionen in den pCDNA 1-Vektor aufgebaut. Menschliche Nieren-293- Zellen (ATCC CRL 1573) wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, das 10% fetales Kälberserum enthielt, in einer 5% CO&sub2; enthaltenden, befeuchteten Atmosphäre aufrecht erhalten. Diese Zellen wurden gemäß dem Verfahren der Calciumphosphatvermittelten Transfizierung vorübergehend mit pCHLHR, ein für den Human-LH/hCG-Rezeptor in voller Länge kodierender Expressionsvektor, transfiziert. Diese Zellen wurden auf ihre Fähigkeit zum Ansprechen auf hCG bei einer Zunahme der cAMP-Werte getestet. Das Ergebnis wird in Fig. 5 dargestellt. In Fig. 5 zeigen die Punkte das Mittel und zeigen die Balken den Bereich der Daten an.

Claims

1. Human-Luteinisierungshormon-Human-Choriongonadotropin- Rezeptorprotein, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch den 1. bis 699. Aminosäurerest der SEQ ID Nr. 1 oder eine Aminosäuresequenz, der der 227. bis 289. Aminosäurerest davon fehlt, oder eine Aminosäuresequenz, die durch den 26. bis 699. Aminosäurerest der SEQ ID Nr. 1 oder eine Aminosäuresequenz dargestellt wird, der der 227. bis 289. Aminosäurerest davon fehlt.

2. DNA umfassend eine cDNA-Sequenz, die für ein vorstehend in Anspruch 1 definiertes Human-Luteinisierungshormon-Human- Choriongonadotropin-Rezeptorprotein kodiert.

3. DNA wie in Anspruch 2 beansprucht, wobei die cDNA-Sequenz eine Nukleotidsequenz enthält, die durch das 1. bis 2987. Nukleotid von SEQ ID Nr. 1 oder eine Nukleotidsequenz, der das 679. bis 866. Nukleotid davon fehlt, oder eine durch das 76. bis 2987. Nukleotid von SEQ ID Nr. 1 oder eine Nukleotidsequenz dargestellt wird, der das 679. bis 866. Nukleotid davon fehlt.

4. Eine Transformante, die eine wie in Anspruch 2 definierte DNA trägt.

5. Transformante gemäß Anspruch 4, die E. coli JM 109/pUC1B (FERM BP-3127) ist, wobei die wie in Anspruch 4 beanspruchte DNA in den Vektor pUC18 subkloniert ist.

6. Transformante gemäß Anspruch 4, die E. coli DH1/pHLHR(UEX2) (FERM BP-3545) ist.

7. Transformante gemäß Anspruch 4, die E. coli JM109/pHLHR(GEX-3X) (FERM BP-3544) ist.

8. Verfahren zum Herstellen eines in Anspruch 1 definierten Human-Luteinisierungshormon-Human-Choriongonadotropin-Rezeptorproteins, wobei das Verfahren das Kultivieren einer Transformanten, die eine vorstehend in (2) definierte DNA trägt, Anreichern des Proteins in einer Kulturbrühe und Sammeln desselben umfaßt.

9. Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge eines in Anspruch 1 definierten Human-Luteinisierungshormon- Human-Choriongonadotropin-Rezeptorproteins und einen pharmazeutischen Träger oder Vehikel umfaßt.

10. Verwendung eines Proteins gemäß Anspruch 1 zum Herstellen eines Arzneimittels zur Diagnose und Behandlung von Eierstock- und Hodenkrankheiten.

Sequenzliste

SEQ ID Nr. 1

SEQUENZLÄNGE: 2987

SEQUENZTYP: Nukleotid

STRÄNGIGKEIT: doppel

TOPOLOGIE: linear

MOLEKÜLTYP: cDNA bis genomische DNA

URSPRUNG: menschlicher Eierstock

SEQUENZBESCHREIBUNG: