JPH04502328A - シクロスポリンaの新規誘導体、それに対する抗体及びその使用 - Google Patents
シクロスポリンaの新規誘導体、それに対する抗体及びその使用Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
シクロスポリンAの新規誘−導む本、それに対する 体及びa便月
本発明は、補助金番号ROI NS−15581及びPOI IIL−3658
1の政府補助並びにNational In5titute or Healt
h、U、S。
Department of ’tlealth and )Iuman Re
5ourcesによる補助2−Ta2−^1−07161−11及びTa2−C
^−09503を得てなされた。従って、米国政府は本発明に所定の権利を有す
る。
1脈五1遣
本明細書中、かっこ内の数字は種々の出版物の参照を表わす。これらの出版物の
詳細は本明細書の最後の請求の範囲の直前に列挙する。これらの出版物の開示内
容全部は、本明細書において説明及び特許請求する本発明の時点における当業者
には公知の当該技術分野の現状を説明するために、参照により本明細書に包含さ
れるものとする。
シクロスポリンA (Cyclosporine A )(Cs^)は、移植患
者における臓器の拒絶反応を防止する上で有効な免疫抑制剤であり、真菌由来の
環状ウンデカペプチドである(1〜3)。
Cs^の治療係数は狭いので、Ca^で治療した患者の血清のシクロスポリンレ
ベルを測定することは重要である(4)。
これは、高速液体クロマトグラフィーまたはRIAによって行なうことができる
が、R1^の方法はより簡便である。
CsA自体は非免疫原性であることが報告されており(5)、本発明者らもこの
ことを確認した(未発表)、従って抗体を得るためには、Cs^をタンパク質担
体に結合することが必要である。しかしながらCs^の側鎖は、一般にはハプテ
ンを担体に結合するのに使用される官能基を含まない脂肪族基のみからなる。従
来の研究者は、シクロスポリンC(CsC)は2位にトレオニン残基を有するの
で、免疫原性CsC−タンパク質抱合体を製造した(5)、タンパク質への結合
は、カップリング剤として水溶性カルボジイミドを使用し、ヘミスクシニエート
(henisueciniate)を介して行われる。ポリクローナル抗血清は
このようにしてうまく調達され、患者の血清中のCs^を測定するために日常的
に使用される(5)。
より最近では、リシル−Cs^誘導体の活性化エステルを使用してモノクローナ
ル抗体が製造された(6)。
本発明者らは、光化学反応によってCs^を反応性カルボキシル含有ペプチドに
変換することにより、C8^自体をハプテンとして使用することを選択した。こ
の誘導体がタンパク質へ結合すると、C5^で治療中の移植患者の血清中のCs
^レベルを測定するのに使用され得るCs^特異的ウサギ抗体がうまく産生され
る。
l匪座l力
本発明は、構造:
〔構造中、各Rは、少なくとも1つのRはXであるという条件で独立にHまたは
X(但しXは、光化学的に活性化可能な基を含むXの前駆体とシクロスポリンA
の水素との光化学反応の結果生成され、且つ反応性基を含むリガンドである)で
あり得る〕
を有する分子を提供する。
更に本発明では、前記反応性基は高分子に反応性を示す基とすることができる0
本発明の好ましい実施態様においでは、この高分子はポリペプチドとすることが
できる。更に本発明の極めて好ましい実施i様においては、ポリペプチドはタン
パク質とすることができる。好ましい実8!態様においては前記反応性基はカル
ボキシルとすることができる。 Xの特定の例としては、非限定的ではあるが、
H
を挙げることができる。
本発明の好ましい実施態様では、前述の分子においてただ1つのRがXである確
率は0,75より大きい、極めて好ましい実施態様においてはこの確率は約1.
0である。
本発明は更に、1つ以上の水素原子が、各々が反応性基を含み、且つ光化学的に
活性化可能な基を含むリガンドの前駆体と置換されるべき水素原子との光化学反
応の結果水素原子が置換された位置で、シクロスポリンAの構造主鎖に結合して
いる1つ以上のリガンドによって置換されているシクロスポリンAの構造主鎖に
より特徴づけられるシクロスポリンAの同種体(eongener)からなる分
子を提供する。
更に本発明は、移植患者において臓器拒絶反応を阻害するのに有効な量の前述の
分子と医薬的に許容可能な担体とを含有する、移植患者における臓器拒絶反応を
防止する(prevent)のに有効な免疫抑制剤を提供する。
更に本発明は、化合物と前述の分子との抱合体を含有する合成物(compos
ition of 5atter)であって、該化合物が前述の分子に前記リガ
ンドXの反応性基によって結合している合成物を提供する。
更に本発明は、高分子と前述の分子との抱合体を含有する合成物であって、該高
分子が前述の分子に前記リガンドXの反応性基によって結合している合成物を提
供する。
同様に本発明は、ポリペプチドと前述の分子との抱合体を含有する合成物であっ
て、該ポリペプチドが前述の分子に前記リガンドXの反応性基によ−って結合し
ている合成物を提供する。
更に本発明は、タンパク質と前述の分子との抱合体を含有する合成物であって、
該タンパク質が前述の分子に前記リガンドXの反応性基によって結合している合
成物を提供する。このタンパク質の特定の例としては、ウシ血清アルブミン、ウ
サギ血清アルブミン、笠貝(keyhole limpet)ヘモシアニン、オ
ボアルブミン、またはチログロブリン(これに限定されない)を含む任意のグロ
ブリンを挙げることができる。
更に本発明は、患者に、移植患者における臓器拒絶反応を阻害するのに有効な量
の前述の分子を投与することからなる、移植患者における拒絶反応を防止する方
法を提供する。
更に本発明は、シクロスポリンAまなはシクロスポリンAの同種体に特異的な前
述の合成物に対する抗体を提供する。本発明の教示によれば、この抗体は更にポ
リクローナルまたはモノクローナルであることを特徴とし得る。これらの抗体は
検出可能なように標識され得る。
更に本発明は、生物学的組織試料中のシクロスポリンAまたはシクロスポリンA
の同種体の存在を検出する方法であって、生物学的組織試料を前述の検出可能な
形に標識された抗体で、この抗体がシクロスポリンAまたはその同種体に結合し
て一体となって複合体を形成し得る条件下に処理し、シクロスポリンAtたはそ
の同種体に結合しながった標識抗体を除去し、シクロスポリンAまたはその同種
体に結合した標識抗体の存在を検出し、それによって該生物学的組織試料中のシ
クロスポリンAまたはその同種体の存在を検出することからなる方法を提供する
。
更に本発明は、生物学的組織試料中のシクロスポリンAまたはシクロスポリンA
の同種体の存在を検出する他の方法であって、生物学的組織試料を前述の非標識
抗体で、この抗体がシクロスポリンAまたはその同種体に結合して一体となって
複合体を形成し得る条件下に処理し、シクロスポリンAまなはその同種体に結合
しなかった抗体を除去し、この複合体を非標識抗体に対する標識抗体で、該標識
抗体が複合体の非標識抗体に結合するような条件下に処理し、複合体に結合しな
かった標識抗体を除去し、複合体に結合した標識抗体の存在を検出し、それによ
って該生物学的組織試料中のシクロスポリンAまたはその同種体の存在を検出す
ることからなる方法を提供する。
更に本発明は、生物学的流体試料中のシクロスポリンAまたはシクロスポリンA
の同種体の濃度を決定する方法であって、固体支持体を過剰の前述の合成物と、
この合成物が固体支持体の表面に結合し得る条件下に接触させ、所定容積の生物
学的流体試料を所定量の前述の標識抗体と、試料中のシクロスポリンAまたはそ
の同種体が該標識抗体に結合して一緒に複合体を形成するような条件下に接触さ
せ、得られた複合体をその表面に合成物が結合している前記固体支持体と、複合
体の標識抗体が合成物に結合し得る条件下に接触させ、この固体支持体を、前記
合成物とそれに結合している複合体の標識抗体のみが残るように処理し、前記合
成物に結合している複合体の標識抗体の量を定量的に決定し、それによって該生
物学的流体試料中のシクロスポリンAまたはその同種体の濃度を決定することか
らなる方丈に本発明は、生物学的流体試料中のシクロスポリンAまたはシクロス
ポリンAの同種体の濃度を決定する他の方法であって、固体支持体を過剰量の前
述の合成物と、この合成物が固体支持体の表面に結合し得る条件下に接触させ、
所定容積の生物学的流体試料を所定量の前述の抗体と、試料中のシクロスポリン
Aまたはその同種体が該抗体に結合して一緒に複合体を形成するような条件下に
接触させ、この複合体を前記非標識抗体に対する所定量の前述の標識抗体と、該
標識抗体が前ステップの非標識抗体複合体に結合して一緒に標識複合体を形成す
る条件下に接触させ、得られた標識複合体をその表面に合成物が結合している前
記固体支持体に、複合体の標識抗体に結合している非標識抗体が合成物に結合し
得る条件下に接触させ、合成物とそれに結合している標識複合体のみが残るよう
にこの固体支持体を処理し、更に合成物に結合している非標識抗体に結合してい
る標識複合体の標識抗体の量を定量的に決定し、それによって該生物学的流体試
料中のシクロスポリンAまたはその同種体の濃度を決定することからなる方法を
提供する。
シクロスポリンAまたはその同種体の濃度を決定する上記2つの方法においては
、前記合成物はプレート表面に共有結合または非共有結合によって結合すること
ができる。
本発明は更に、ラジオイムノアッセイによって生物学的流体試料中のシクロスポ
リンAまたはシクロスポリンAの同種体の濃度を決定する方法であって、シクロ
スポリンA、シクロスポリンAの同種体または前述の合成物を含有する所定量の
物質を放射性同位体で標識し、前記所定量の放射性同位体標識物質を生物学的流
体試料に加え、この混合物を所定量の前述の非標識抗体と、この抗体が生物学的
流体試料中のシクロスポリンAまたはその同種体及び標識物質に結合し得るのに
適した条件下に接触させ、結合しなかった放射性同位体標識物質を除去し、抗体
に結合している標識物質の量を定量的に決定し、それによって該生物学的流体試
料中のシクロスポリンAまたはその同種体の濃度を決定することからなる方法を
提供する。
更に本発明は、患者におけるシクロスポリンAまたはシクロスポリンAの同種体
のレベルをモニターする方法であって、所定の時間間隔で患者から生物学的流体
試料を採取し、前述のアッセイ方法に従って各生物学的流体試料中のシクロスポ
リンAまたはその同種体の量を決定することからなる方法を提供する。
上記生物学的流体試料は、限定的ではないが、血液、尿、大便または組織抽出物
とすることができる。
更に本発明は、モノクローナル自己抗イデイオタイプ抗体(monoclona
l auto−anti−idiotypic antibody)を生産する
方法であって、動物のリンパ球を有効抗体産生量の前述の合成物と適当な条件下
に接触させ、接触後の適当な時期にリンパ球を回収し、回収したリンパ球を適当
な骨髄IIIMl胞と融合させ、各々がモノクローナル抗体を産生する一連のハ
イブリドーマ細胞を生産し、このように生産した一連のハイブリドーマ細胞を適
当な条件下にスクリーニングして、前述の合成物に対する抗体に結合し得るモノ
クローナル抗体を分泌するものを同定し、このように同定したハイブリドーマ細
胞を適当な培地中で別々に培養し、ハイブリドーマ細胞が産生じたモノクローナ
ル抗イデイオタイプ抗体を適当な条件下に別々に回収することからなる方法を提
供する。
更に本発明は、前記モノクローナル自己抗イデイオタイプ抗体に対する抗体を提
供する。更に本発明は、前記抗体に対する抗体をも提供する。これらの他の抗体
に対する抗体は、移M!@者における臓器拒絶反応を阻害するのに有効な量で医
薬的に許容可能な担体と一緒に、移植患者における臓器拒絶反応を防止するのに
有効な免疫調整物質(immunoregulatory 5ubstance
)中で使用することができる。
更に本発明は、患者におけるシクロスポリンAまたはその同種体の量を低下させ
る方法であって、患者にシクロスポリンAの量を低下させるのに有効な量の前述
の抗体を胆管内投与し、この抗体を過剰なシクロスポリンAと結合させ、それに
よって過剰なシクロスポリンAを無効にする方法を提供する。
更に本発明は、患者におけるシクロスポリンAまたはシクロスポリンAの同種体
とエピトープを共有する、内在性免疫調整物質または内在性の他の生物学的活性
物質の量を低下させる方法であって、患者に前記内在性物質の量を低下させるの
に有効な量の前述の抗体またはそのフラグメントを胆管内投与し、この抗体また
はそのフラグメントを過剰の内在性物質と結合させ、それによって過剰の内在性
物質を無効にする方法を提供する。
最後に本発明は、免疫活性剤としての薬理学的物質の能力を試験する方法であっ
て、薬理学的物質と、既知量の前述の抗体で標識したシクロスポリンAまたはシ
クロスポリンAの同種体とを、前記抗体が薬理学的物質及びシクロスポリンAま
たはその同種体と複合体を形成する条件下に競合させる免疫化学的アッセイを実
施し、標識されたシクロスポリンAまたはその同種体の抗体からの、該薬理学的
物質での置換率を決定することからなる方法を提供する。
図面の簡単な説明
第1図はCs式とBB^との光化学反応を示す図である。
第2図は結合データのスキャッチャードプロットを示すグラフである。
第3図は、種々のシクロスポリン誘導体によるCs式のR575への結合の阻害
率を示すグラフである。
第4図は、R575及び5andoz抗体を使用し、RI八によって決定される
患者の血清の力価(ny/ml)を示すグラフである。
ルコm朋
本発明は、構造・
〔構造中、各Rは、少なくとも1つのRはXであるという条件の下に、独立にH
またはX(但しXは、光化学的に活性化可能な基を含むXの前駆体とシクロスポ
リンAの水素との光化学反応の結果生成され、且つ反応性基を含むリガンドであ
る)であり得る〕
を有する分子を提供する。
更に本発明では、前記反応性基は高分子に反応性を示す基とすることができる。
このような高分子の例としては、限定的ではないが、多糖類、複合糖質、及び限
定的ではないがポリアクリルイミド、ポリニトロセルロース及びポリスチレンを
含む任意の有機ポリマーを挙げることができる。
本発明の好ましい実施態様においては、高分子はポリペプチドとすることができ
る。更に本発明の極めて好ましい実施態様においては、ポリペプチドはタンパク
質とすることができる。
本発明の他の実施態様においては、前記反応性基はエステル、カルバニル、アミ
ンまたはホスホンアミドとすることができる。好ましい実施態様においては反応
性基はカルボキシルとすることができる。
光化学反応は当業者には良く知られており(7)、Xは、光化学的に活性化可能
な基を含むXの前駆体とシクロスポリンAの水素との光化学反応の結果生成され
、且つ反応性基を含む任意のリガンドとすることができる。Xの特定の例として
は、限定的ではないが、
を挙げることができる。
本発明の好ましい実施B様では、前述の分子においてただ1つのRがXである確
率は0.75より大きい。極めて好ましい実施g様においてはこの確率は約1.
0である。
本発明は更に、各々が反応性基を含み且つ光化学的に活性化可能な基を含むリガ
ンドの前駆体と置換されるべき水素原子との光化学反応の結果水素原子が置換さ
れた位置で、シクロスポリンAの構造主鎖に結合している1つ以上のリガンドに
よって、1つ以上の水素原子が置換されているシクロスポリンAの精造主鎖によ
り特徴づけられるシクロスポリンAの同種体からなる分子を提供する。
シクロスポリンAの同種体は最近文献(5,8)中に見られ、ロスボリンAに適
用可能な本発明の新規部分(novelties)はこのような同種体にも適用
可能となり得ることが予測される。シクロスポリンAの基本構造を以下に示す。
このような同種体の例としては、限定的ではないが、(a)2位にアラニン、
(b)2位にトレオニン、
(c)2位にバニリン、
(d)2位及び5位にノルバリン、及び(e)7位にα−アミノ酪酸
を有するシクロスポリンAを挙げることができる。
更に本発明は、移植患者において臓器拒絶反応を阻害するのに有効な量の前述の
分子と医薬的に許容可能な担体とを含有する、移植患者における臓器拒絶反応を
防止するのに有効な免疫抑制剤を提供する。
本明細書中、「医薬的に許容可能な担体Jなる用語は任意の標準的な医薬担体を
包含する、このような担体は当業者には公知であり、限定的ではないが、リン酸
M衝生理食塩水、水、油/水エマルジョンのようなエマルジョン及び種々のタイ
プの湿潤剤といった任意の標準的な医薬担体を挙げることができる。
前述の免疫抑制組成物はシクロスポリンAより幾つかの点で優れていると言える
。第1に、この組成物はシクロスポリンAに固有の毒性問題、特に腎臓損傷を回
避し得る。
第2に、上記組成物は可溶性となり得、従って投与量調整の上で好ましい。
更に本発明は、化合物と前述の分子との抱合体を含有する合成物であって、該化
合物が前述の分子に前記リガンドXの反応性基によって結合している合成物を提
供する。抗原性ハプテン−担体抱合体の一般的な生産方法は当業者には公知であ
る(9)。
更に本発明は、高分子と前述の分子との抱合体を含有する合成物であって、該高
分子が前述の分子に前記リガンドXの反応性基によって結合している合成物を提
供する。
同様に本発明は、ポリペプチドと前述の分子との抱合体を含有する合成物であっ
て、該ポリペプチドが前述の分子に前記リガンドXの反応性基によって結合して
いる合成物を提供する。
更に本発明は、タンパク質と前述の分子との抱合体を含有する合成物であって、
該タンパク質が前述の分子に前記リガンドXの反応性基によって結合している合
成物を提供する。ここでも前述の分子に結合し得る任意のタンパク質が本発明の
範囲に包含されることを理解されたい、このタンパク質の特定の例としては、ウ
シ血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、笠貝ヘモシアニン、オボアルブミン
、または千ログロブリン(但し、これに限定されない)を含む任意のグロブリン
を挙げることができる。
更に本発明は、患者に、移植患者における臓器拒絶反応を阻害するのに有効な量
の前述の分子を投与することからなる、移植患者における拒絶反応を防止する方
法を提供する。
更に本発明は、シクロスポリンAまたはシクロスポリンAの同種体に特異的な前
述の合成物に対する抗体を提供する0本発明の教示によれば、この抗体は更にポ
リクローナルまたはモノクローナルであることを特徴とし得る。
これらの抗体は検出可能なように標識することができる。
このような標識は当業者には公知であり、限定的ではないが、酵素標識、蛍光物
質のような放射性同位体標識またはビオチニル化標識(biotinylate
d 1abel)を挙げることができる。
更に本発明は、生物学的組織試料中のシクロスポリンAまたはシクロスポリンA
の同種体の存在を検出する方法であって、生物学的゛組織試料を前述の検出可能
なように標識した抗体で、この抗体がシクロスポリンAまたはその同種体に結合
して一体となって複合体を形成し得る条件下に処理し、シクロスポリンAまたは
その同種体に結合しなかった標識抗体を除去し、シクロスポリンAまたはその同
種体に結合した標識抗体の存在を検出し、それによって該生物学的組織試料中の
シクロスポリンAまたはその同種体の存在を検出することからなる方法を提供す
る。
更に本発明は、生物学的組織試料中のシクロスポリンAまたはシクロスポリンA
の同種体の存在を検出する他の方法であって、生物学的組織試料を前述の非標識
抗体で、この抗体がシクロスポリンAまたはその同種体に結合して一体となって
複合体を形成し得る条件下に処理し、シクロスポリンAまたはその同種体に結合
しなかった抗体を除去し、この複合体を該非標識抗体に対する標識抗体で、この
標識抗体が前記複合体の非標識抗体に結合するような条件下に処理し、複合体に
結合しなかった標識抗体を除去し、複合体に結合した標識抗体の存在を検出し、
それによって該生物学的組織試料中のシクロスポリンAまたはその同種体の存在
を検出することからなる方法を提供する。
シクロスポリンAの毒作用により組織、特に腎臓に対する損傷をもたらすので、
生物学的組織試料中のシクロスボリンAまたはその同種体の存在を検出すること
は有用である。従って、シクロスポリンAまたはその同種体の存在を検出する方
法の好ましい実施態様においては、生物学的組織試料は腎臓である。
更に本発明は、生物学的流体試料中のシクロスポリンAまたはシクロスポリンA
の同種体の濃度を決定する方法であって、固体支持体を過剰量の前述の合成物と
、この合成物が固体支持体の表面に結合し得る条件下に接触させ、所定容積の生
物学的流体試料を所定量の前述の標識抗体と、試料中のシクロスポリンAまたは
その同種体が標識抗体に結合して一体となって複合体を形成するような条件下に
接触させ、得られた複合体をその表面に合成物が結合している前記固支持体に、
複合体の標識抗体が合成物に結合し得る条件下に接触させ、前記固体支持体を合
成物とそれに結合している複合体の標識抗体のみが残るように処理し、合成物に
結合している複合体の標識抗体の量を定量的に決定し、それによって該生物学的
流体試料中のシクロスポリンAまたはその同種体の濃度を決定することからなる
方法を提供する。
更に本発明は、生物学的流体試料中のシクロスポリンAまたはシクロスポリンA
の同種体の濃度を決定する他の方法であって、固体支持体を過剰量の前述の合成
物と、この合成物が固体支持体の表面に結合し得る条件下に接触させ、所定容積
の生物学的流体試料を所定量の前述の抗体と、試料中のシクロスポリンAまたは
その同種体が抗体に結合して一体となって複合体を形成するような条件下に接触
させ、この複合体を非標識抗体に対する所定量の前述の標識抗体と、標識抗体が
前ステップの複合体の非標識抗体に結合して一緒に標識複合体を形成する条件下
に接触させ、得られた標識複合体をその表面に合成物が結合している前記固体支
持体に、標識複合体の標識抗体に結合している非標識抗体が合成物に結合し得る
条件下に接触させ、前記固体支持体を、合成物及びそれに結合している標識複合
体のみが残るように処理し、更に合成物に結合している非標識抗体に結合してい
る標識複合体の標識抗体の量を定量的に決定し、それによって該生物学的流体試
料中のシクロスポリンAまたはその同種体の濃度を決定することからなる方法を
提供する。
シクロスポリンAまたはその同種体の濃度を決定する上記2つの方法においては
、合成物はプレート表面に共有結合または非共有結合によって結合することがで
きる。
本発明は更に、ラジオイムノアッセイによって生物学的流体試料中のシクロスポ
リンAまたはシクロスポリンAの同種体の濃度を決定する方法であって、シクロ
スポリンA、シクロスポリンAの同種体または前述の合成物を含有する所定量の
物質を放射性同位体で標識し、所定量の放射性同位体標識物質を生物学的流体試
料に加え、この混合物を所定量の前述の非標識抗体と、この抗体が生物学的流体
試料中のシクロスポリンAまたはその同種体及び標識物質に結合し得るのに適し
た条件下に接触させ、結合しなかった放射性同位体標識物質を除去し、抗体に結
合している標識物質の量を定量的に決定し、それによって生物学的流体試料中の
シクロスポリンAまたはその同種体の濃度を決定することからなる方法を提供す
る。
標識複合体に間するデータから生物学的流体試料中のシクロスポリンAtたはそ
の同種体の濃度を決定する方法は当業者には良く知られている。この例の一つと
して、データを標準曲線と比較することが挙げられる。
生物学的流体試料中のシクロスポリンAの濃度を決定するための前述の抗体を用
いる他の種想のアッセイを使用することも本発明の範囲内であることを理解され
たい。
更に本発明は、患者におけるシクロスポリンAまたはシクロスポリンAの同種体
のレベルをモニターする方法であって、所定の時間間隔で患者から生物学的流体
試料を採取し、前述のアッセイ方法に従って各生物学的流体試料中のシクロスポ
リンAまたはその同種体の量を決定することからなる方法を提供する。
上記生物学的流体試料は、限定的ではないが、血液、尿、大便または組織抽出物
とすることができる。
更に本発明は、モノクローナル自己抗イデイオタイプ抗体を生産する方法であっ
て、動物のリンパ球を有効抗体産生量の前述の合成物と適当な条件下に接触させ
、接触後の適当な時期にリンパ球を回収し、回収したリンパ球を適当な骨髄腫細
胞と融合させ、各々がモノクローナル抗体を産生ずる一連のハイブリドーマ細胞
を生産し、このように生産した一連のハイブリドーマ細胞を適当な条件下にスゲ
リーニングして、前述の合成物に対する抗体に結合し得るモノクローナル抗体を
分泌するものを同定し、このように同定したハイブリドーマ細胞を適当な培地中
で別々に培養し、ハイブリドーマ細胞が産生じたモノクローナル抗イデイオタイ
プ抗体を適当な条件下に別々に回収することからなる方法を提供する。モノクロ
ーナル自己抗イデイオタイプ抗体を生産する方法は、1985年8月20日出願
の米国特許第767゜56号の係属出願である1988年11月18日出願の同
時係属米国特許出願第 号に記載のように当業者には既に公知である。
更に本発明は、前記モノクローナル自己抗イデイオタイプ抗体に対する抗体を提
供する。更に本発明は、前述の抗体に対する抗体も提供する。これらの他の抗体
に対する抗体は、移植患者における臓器拒絶反応を阻害するのに有効な量で、医
薬的に許容可能な担体と一緒に、移植患者における臓器拒絶反応を防止するのに
有効な免疫調整物質中に使用することができる。
更に本発明は、患者におけるシクロスポリンAまたはその同種体の量を低下させ
る方法であって、患者にシクロスポリンAの量を低下させるのに有効な量の前述
の抗体を血管内投与し、抗体を過剰なシクロスポリンAと結合させ、それによっ
て過剰なシクロスポリンAを無効にする方法を提供する。
更に本発明は、患者におけるシクロスポリンAまたはシクロスポリンAの同種体
とエピトープを共有する、内在性免疫調整物質または内在性の他の生物学的活性
物質の量を低下させる方法であって、患者に、前記内在性物質の量を低下させる
のに有効な量の前述の抗体またはそのフラグメントを血管内投与し、この抗体ま
たはそのフラグメントに過剰な前記内在性物質と結合させ、それによって過剰な
内在性物質を無効にする方法を提供する。
fi後に本発明は、免疫活性剤としての薬理学的物質の能力を試験する方法であ
って、薬理学的物質と、既知量の前述の抗体で標識したシクロスポリンAまたは
シクロスポリンAの同種体とを、該抗体が薬理学的物質及びシクロスポリンAま
たはその同種体と複合体を形成するような条件下に競合させる免疫化学的アッセ
イを実施し、標識シクロスポリンAまたはその同種体の抗体の、該薬理学的物質
による置換率を決定することからなる方法を提供する。
以下、本発明を実験的考察セクションにおいて説明する。
このセクションは、本発明の理解のために記載されており、本発明を限定するも
のではなく、本発明は後述の請求の範囲以外にはいかようにも制限されない。
K駁町考!
実施例I
彬什反U方羞
4−ベンゾイル安息香′#!1(BBa)はΔIdrieh Chemical
sから購入し、ウシ及びウサギの血清アルブミン(RSA及びRSA)とN−ヒ
ドロキシスクシンイミドはSigma Chemicalから、ジシクロへキシ
ルカルボジイミドはFlukaから購入した。シクロスポリンA (Cs^)、
[コHコCs^(50Ci/nunole)、シクロスポリン“RT^キット”
及び種々の改質誘導体は、5andoz Ltd、、Ba5et。
スイスから厚意により寄贈された。[’H]Cs^(17Ci/mmole)は
^mershamから購入し、Kieselgel(シリカゲル60 F254
)はE、Merck(カタログ番号576B)から購入した。
L九鼠尺L
Cs^(104B、83μmoles)をベンゼン0.6ml中にBBa 36
my(1601moles)を溶解した溶液と混合した。この溶液を窒素ガスで
パージし、5peetroline B100 UVランプ(Speetron
ics 。
Westbury、L、1.)を用いて320r+n 、距離8cm 、室温で
7時間光分解した。Uvに露光する前に約1マイクロキユーリーの[3H]ジヒ
ドロCs^をトレーサーとして加えた。光分解後、回転蒸留器内で真空下にベン
ゼンを蒸発させ、乾燥した生成物をメタノール1.5ml中に溶解した。この生
成物を、 CHCl3/メタノール(85/15)溶剤系中でシリカゲル分取薄
層クロマトグラフィーにかけて単離すると、2つの主バンド、即ちRf=0.5
8及び0.72が認められた。動きのより遅いバンド(即ち反応生成物、 Cs
^−BBa)をメタノールで希釈し、放射能を測定した。
ハプーンータンパク 4
Cs^−BB^(5,5B、約411moles)を、N−ヒドロキシスクシン
イミド(NFIS)552μg(4,811moles>及びジシクロへキシル
カルボジイミド82511y(41Imoles)をメタノール1m/中に溶解
した溶液1+a1に加えた。室温で一晩反応させ、中性Fe−ヒドロキサメート
試験によってエステルの形成を検出した(10−11>。
担体タンパク質(RSAまたはRSA) (10my;0.14umole)を
蒸留水H201,0ml中に溶解し、M Na2CO,を用いてpHを9.0に
調整した。このタンパク質溶液に、Cs^−BBa−NHS(5,2B;3.6
pmoles)をメタノール1.0ml中に溶解した溶液を滴下して加えた。全
てを加えてから、pl(を9,0に調整し、室温で一晩反応させた。次いで反応
混合物をPBSで24時間透析し、放射能を測定して結合効率を決定した。約6
〜7個のシクロスポリンがRSAまたはRSAの各分子に結合していた。抱合体
を更にゲル濾過ITPLc(LKB TSK 3000)G:よッテ精製Lり、
CsAのタンパク質への結合は、R1^阻害実験から確認された。
拮抗阻害剤としての抱合体の価数、即ちタンパク質に結合したハブテンがいくつ
阻害反応に参加したかを決定する方法はないので、この方法では定量は不可能で
ある。
た交盟泄
ニューシーラント産の白色ウサギの雌2羽に、完全フロインドアジュバント中の
C8^−BBa−BSへの1:Hn:v)混合物(抗原1m1F/mf)を背中
に皮下注射して免疫感作した。更にこれらのウサギに不完全フロインドアジュバ
ント中のCs式−BBa−BS^で3〜4週間の間隔で追加免疫し、各追加免疫
の後、週毎に採血した。両方のウサギは、シクロスポリン特異的抗体を産生ずる
ことによって応答した。一方のウサギの血清R575を更に特性決定した。
一部 イムノアッセイ
文献に記載のラジオイムノアッセイ<5.12)の変形方法によって血清抗体を
検出した。5andozii衝液A(50mM Tris、pH8,5>で希釈
した血清(100,1)を、2%ウマ血清を含有する5andoz WimM
B (50mM 丁ris、pH8,5;0.1%Tu+een 20)中の[
3H]CsA 2001.11に加え、室温で2時間または4℃で一部インキユ
ベートした。希釈した前免疫血清による結合はコントロールとして使用した。遊
離及び結合リガンドを、5andoz提供のチャーコールを用いてその手順に従
って分離した。
1朱豊lユ辺迭遣
異なるアミノ酸位置で改質した6種のCsA1似体を使用し、阻害1八によって
抗体特異性を決定した。シクロスポリン誘導体を100%エタノール中に濃度5
.0mg/mlで溶解し、−20℃で保管し、阻害実験のためにSandozM
衝液Bで最終濃度0.27nM〜2.7LIMに希釈した。ウサギ抗体を緩衝液
Aで一定に希釈した溶液を、[3H]ジヒドロCs^と種々の量の阻害剤とを含
有する緩衝液8200−に加え、4℃で一部インキユベートした。各Cs^誘導
体に対する阻害曲線を形成した。
東 の ゞにお(C5^
25人の移植患者の血清中のシクロスポリンレベルを、1:600に希釈した本
発明者らのウサギ抗シクロスポリン抗体かまたは5andoz提供のキットの一
部であるポリクローナル抗体調製剤のいずれかを使用し、阻害R1^によって決
定した。希釈ウサギ抗シクロスポリン抗血清(100μg)または5andoz
ポリクロ一ナル抗体を、100パの[コH]Cs^を緩衝液Bに溶解した溶液と
、予め2%ウマ血清を含有するM清液Bで1 :5 (Sandoz抗体に対し
て)または1:15(本発明者らのウサギ抗体に対して)に希釈した患者の血清
100μlとに加えた。
3人の異なる患者からシクロスポリン処置を開始する前に採取した血清をコント
ロールとして使用した。試料を4℃で一部インキユベートし、既知量のシクロス
ポリンを用いて得られた標準曲線と阻害レベルを比較することにより、Cs八リ
レベル算出した。
ス ヤッ ヤード
ウサギ抗体の結合定数をスキャッチャード解析によって決定しな。10nMから
0.InHの種々の濃度の[3H]ジヒドロCs^を一定量の抗体に加え、4℃
で一部インキユベートし、前述のRT^によって結合リガンドを決定した。
C5層よ、タンパク質への抱合に使用され得る化学的に活性な基を欠いている6
従つそ、カルボキシル基を分子中に導入するための新規な方法が開発された。実
際には光化学的なこの方法は、カルボキシル含有分子(BBa)をCs式のアル
キル側鎖に、確定的ではないが恐らくはランダムに挿入する(第1図)。
ウサギにおいてCs式−BBa−BSA抱合体を用いて生産された抗体の特異性
及び親和性をR1^によって調査した。スキャッチャード解析(第2図)によっ
て、Kd=9.8±2.8xlO−IIMを有する高い親和性抗体の比較的均質
な集団が明らかとなった。
種々のシクロスポリン誘導体に対する抗体の特異性は、阻害Rr^によって決定
した。この結果は第3図及び表Iに示しである。誘導体は、それらの親和性に従
っておおよそ3つのグループに分割することができる。即ちCs式、CsD、6
65.243及び032は親和性の高いグループに属し、CsC1582及び0
39は並の親和性を示し、717は極めて乏しい阻害を示す。
表■には、心臓移植に続いてCs^処置を施された患者の血清におけるシクロス
ポリンレベルの分析結果を示している。力価は、本発明の抗体及び5andoz
キツト内のポリクローナル抗体を使用して決定した。表■には、the Dep
artmentof Surgeryの実験室提供のデータも掲載しである。第
4区に示したように、本発明者らが行なった実験におし)ては本発明の抗体を用
いて決定されたレベルは市販のキットを使用した結果と一致した。このデータの
線形回帰解析において傾斜0.88及び相関係数0.84であった。
艮」
Cs式の種々の類似体のICs −
” ICs。−50%阻害のための濃度艮1
患者の血清中のシクロスポリン方価<nlF/W11)10U R575” l
! !2LJすLし01 51 検出不可能 3゜
8本明細書の詳細に従って調製した抗体b s・・d・・Ltd 、製のキット
内の抗体。本発明者らの実験室にて実施した分析結果。
cSan+(ozキットを使用した病院実験室がちの報告結果旌尉
α、β不飽和ケトン、 BBaは特に、U、V、光による光活性化に際して脂肪
族倒錯に挿入し得る試薬である(7)。その光活性中間生成物はペプチド結合を
切断しないので、この実験に選択した(13)。この点を考慮すると、NOシフ
トによってペプチド結合が失われたイソ−Cs^におけるように、Cs式のペプ
チド結合における単一の切断は、イソ−Cs^の場合に環状構造が保存されてい
るにもかかわらず活性の損失につながるので重要である。明らかに、立体配座の
変更は生物学的に不活性な分子への変換につながる。
本発明者らは種々の生成物を同定してはいないが、BBaのCs式への挿入は恐
らくランダムなプロセスであろう、もしランダムであれば、本発明者らは、Cs
^分子の種々の残基を認識する抗体の集団を生産している。本発明者らは、一連
のシクロスポリン誘導体を用いて阻害実験を行なうことによりこれらの抗体につ
いて何らかの知見を得ようと試みた(第3図、表1)、第1に、傾斜が比較的小
さい曲線は、免疫応答がオリゴ丈たはポリクローナル、恐らくは前者であること
を示す、もしこれがモノクローナルであれば、10%阻害よりも10倍の濃度で
90%阻害が生じるであろう、2番目に重要なことは、717を除く全ての拮抗
シクロスポリン誘導体を用いて[’)l]Cs^結合の100%阻害が得られた
ことである。しかしながら、717も確かに50%以上の阻害の能力がある。こ
れらの結果は、全てのシクロスポリン誘導体が、C3^に特異的な抗体の全集団
に対して拮抗することを示す。
表1及び第3図の阻害データは、種々のシクロスポリン誘導体が、免疫血清中の
抗体集団に対するそれらの親和性に関して3つのグループに分割され得ることを
示す。Cs式、CsD、665.243及び032は最高に結合する。 CsC
1582及び039は並の親和性を示す。717を用いた結果は親和性が低いこ
とを示している。誘導体717は、8位にD−アラニンの代わりに大きな0−1
−ブチル−D−セリンを有する点でCs式とは異なる。このことは、8位が優性
エピトープであることを示唆している。また、小型の基D−アラニンに代えて8
位に大きな基を導入すると、シクロスポリン分子を著しく変形し得る(6)。
並の親和性を示す誘導体CsC1582及び039はそれぞれZ、3及び6位が
置換されているが、いずれの置換基も大きくない、しかしながら、3位にサルコ
シンに代えてプロリンが置換されると、582の3位及び4位の立体配座を妨害
することが公知である(14)。
Cs式と同様の親和性を有する上記誘導体は1.2及び11位が置換されており
、全てが環状ペプチドの1つの「面(face)」上にクラスタ形成している。
しかしながら置換基は、側鎖の大きさの相違の点でそれ程大差はない。抗血清の
特異性並びに立体配座及び生物学的活性の相関を明確に決定するには、入手可能
な大量のシクロスポリン類似体を用いて試験する必要がある(14)。
患者の血清中のシクロスポリンレベルのアッセイは、この抗体調製物を用いて可
能である。本発明者らの結果(第4図及び表■)は、CsCのタンパク質抱合体
で免疫感作することにより生産された市販(Sabdoz)の抗血清を使用して
決定されたレベルとよく一致した。はどほどの相違は恐らく、シクロスポリンの
代謝物に対する抗体の交差特異性(crossspecif 1ties) (
5)における差を示すものと考えられ、これは、本発明者らの抗原は市販の抗血
清を生産するのに使用された抗原とは異なることから当然予期されるものである
。
実施例■
C^−BS^ ム びC^−セフ ロース −ムの1゛口cy^の側鎖の特性(
即ちアミノ基またはカルボキシル基の不存在)は、例外的な1位の“C−9−ア
ミノ酸”(N−メチル−(4R)−4−ブテニル−(L)−)レオニン)に対し
て以外は、通常の結合方法の使用を妨げた(15−17)、 Lかしながら、こ
のアミノ酸の改質は、この残基はcy^の生物学的活性に重要であるので望まし
くない。CyCは、第2アミノ酸の位置(^^2)にγ−アミノ酪酸の代わりに
トレオニンを有する。この類似体は生物学的に活性であり、ヘミスクシネート誘
導体を使用してシクロスポリン−タンパク質抱合体を生産するのに使用されてき
た(15.5)、 LかしながらKahanが記載したように、この残基への結
合は分子の「活性」部分への立体障害をもならし易い(18) 、この結論は、
アミノ酸11.1.2及び3は免疫抑制活性のために重要であることを示した置
換研究に基づいている(17) 、このために、本発明者らは、露光した種々の
Cy^のメチルまたはメチレン基へのランダムな結合を提供する光化学的方法を
使用した。結合部位に関して異なるCy^誘導体の集団を有することにより、活
性アミ・酸が埋もれることなく、分子の一部がタンパク質に結合され得ることが
保証された。
まず本発明者らは、p−ニトロフェニル−2−ジアゾ−3,3,3−トリフルオ
ロプロピオネ−) (19,20>を大−呵のアミノヘキサン酸の無水ジメチル
ホルミアミド溶液と反応させた。
この反応混合物を暗所に置き室温で18時間インキュベートし、次いでSamu
elsら(21)が記載したのと同様の方法を実施した1分取TLC(21)に
より生成物を単離すると、この生成物は式:
%式%
次に、ヘキサン以外の全ての有機溶剤に極めて可溶性のCy^(17)を前記生
成物とベンゼン溶剤中で混合し、光分解した。シクロスポリンA1モルに対して
カルベン前駆体2モルを使用した。この混合物に水銀アークからのUv光(主に
254na+>を照射した。反応条件は、Cy^分子の複数置換を避けるように
実験的に選択した、誘導されたcy^(Cy^−1(ex)を丁LCによって分
離した。アミノ基と反応する官能基を提供するために、cy^−Hexのカルボ
キシル基をジシクロへキシルカルボジイミドの存在下にトヒドロキシスクシンイ
ミド(NHS)エステルに変換することにより活性化した。次いで、Cy^−H
ex−NHSを無水ジメチルホルムアミド中に溶解し、これを少量、pH=8.
8の重炭酸塩緩衝液中のウシアルブミン及び笠貝ヘモシアニンに加え、4℃で一
部インキユベートした。前記条件は、他のNH5誘導体を用いてもうまく作用す
ることが判っている(22.23)。タンパク質アミノ酸基がcy^−Hexに
よって置換された程度を決定するために、本発明者らはHabeebのトリニト
ロベンゼンスルホン酸法(24)を使用しな9本発明者らの過去の研究において
、BS^及びKLl(抱合体はいずれも固相イムノアッセイにおける免疫原及び
抗原としてうまく作用することが判っている。上記試薬の調製に必要な全ての化
学物質は市販されており入手可能である。
CyA親和性カラムを作製するために、無水ジメチルホルムアミド中の過剰量の
Cy^−Hex−NHSをアミノヘキシル−セファ0−ス4B(^H−5eph
arose 4B”)と反応させ、懸濁させ、同量の溶剤で膨潤させた。カルボ
ニルジイミダール結合法によって製造されたこのマトリックスは、しばしば使用
される臭化シアン結合法に伴なうイオン交換基の導入を回避し、架橋アガロース
及び安定なカルボニルジイミダール結合の故に漏出を少なくする(25)、 )
リニトリベンゼンスルホン酸は、セファロースビーズにおける残留アミノ基の半
定量的試算を行なうのに使用される。
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国際調査報告
PCT/US89105484
PCT 5ule 13.2 1ndicates セhaセ しhis 5h
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ncerning jhis co+nmunication 5hould
be direcI−ed 煤B
ChrisセLne M、Nucker aセ telephone numb
er 703−557−0765゜
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.構造: ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔構造中、各Rは、少なくとも1つのRはXであるという条件で独立にHまたは X(但しXは、光化学的に活性化可能な基を含むXの前駆体とシクロスポリンA の水素との光化学反応の結果生成され、且つ反応性基を含むリガンドである)で あり得る〕 を有する分子。 2.前記反応性基が高分子に反応性を示す基である請求項1に記載の分子。 3.前記高分子がポリペプチドである請求項2に記載の分子。 4.前記ポリペプチドがタンパク質である請求項3に記載の分子。 5.前記反応性基がカルボキシル基である請求項3に記載の分子。 6.前記Xが、 ▲数式、化学式、表等があります▼ である請求項1に記載の分子。 7.前記Xが、 ▲数式、化学式、表等があります▼ である請求項1に記載の分子。 8,前記Xが、 ▲数式、化学式、表等があります▼ である請求項1に記載の分子。 9.前記Xが、 ▲数式、化学式、表等があります▼ である請求項1に記載の分子。 10.ただ1つのRがXである確率が0.75より大きい請求項1に記載の分子 。 11.ただ1つのRがXである確率が約1.0である請求項1に記載の分子。 12.1つ以上の水素原子が、各々が、(a)光化学的に活性化可能な基を含む リガンドの前駆体と置換されるべき水素原子との光化学反応の結果水素原子が置 換された位置で、シクロスポリンAの構造主鎖に結合しており、且つ (b)反応性基を含む 1つ以上のリガンドによって置換されているシクロスリンAの構造主鎖を特徴と するシクロスポリンAの同種体からなる分子。 13.移植患者において臓器拒絶反応を阻害するのに有効な量の請求項1、3及 び12のいずれか一項に記載の分子と医薬的に許容可能な担体とを含有する、移 植患者における臓器拒絶反応を防止するのに有効な免疫抑制組成物。 14.化合物と請求項1または12のいずれか一項に記載の分子との抱合体を含 有する合成物であって、該化合物が該分子に前記リガンドXの反応性基によって 結合している合成物。 15.高分子と請求項2に記載の分子との抱合体を含有する合成物であって、該 高分子が該分子に前記リガンドXの反応性基によって結合している合成物。 16.ポリペプチドと請求項3に記載の分子との抱合体を含有する合成物であっ て、該ポリペプチドが該分子に前記リガンドXの反応性基によって結合している 合成物。 17.タンパク質と請求項4に記載の分子との抱合体を含有する合成物であって 、該タンパク質が該分子に前記リガンドXの反応性基によって結合している合成 物。 18.前記タンパク質がウシ血清アルブミンである請求項17に記載の合成物。 19.前記タンパク質がウサギ血清アルブミンである請求項17に記載の合成物 。 20.前記タンパク質が笠貝ヘモシアニンである請求項17に記載の合成物。 21.前記タンパク質がチログロブリンである請求項17に記載の合成物。 22.前記タンパク質がオボアルブミンである請求項17に記載の合成物。 23.患者に、移植患者における臓器拒絶反応を阻害するのに有効な量の請求項 1、3または12のいずれか一項に記載の分子を投与することからなる、移植患 者における拒絶反応を防止する方法。 24.シクロスポリンAまたはシクロスポリンAの同種体に特異的な請求項14 に記載の合成物に対する抗体。 25.請求項24に記載のポリクローナル抗体。 26.請求項24に記載のモノクローナル抗体。 27.請求項24から26のいずれか一項に記載の検出可能なように標識された 抗体。 28.生物学的組織試料中のシクロスポリンAまたはシクロスポリンAの同種体 の存在を検出する方法であって、生物学的組織試料を請求項27に記載の検出可 能なように標識された抗体で、該抗体がシクロスポリンAまたはその同種体に結 合して一体となって複合体を形成し得る条件下に処理し、シクロスポリンAまた はその同種体に結合しなかった前記標識抗体を除去し、シクロスポリンAまたは その同種体に結合した前記標識抗体の存在を検出し、それによって該生物学的組 織試料中のシクロスポリンAまたはその同種体の存在を検出することを特徴とす る方法。 29.前記生物学的組織試料が腎臓である請求項28に記載の方法。 30.生物学的組織試料中のシクロスポリンAまたはシクロスポリンAの同種体 の存在を検出する方法であって、生物学的組織試料を請求項24から26のいず れか一項に記載の抗体で、該抗体がシクロスポリンAまたはその同種体に結合し て一体となって複合体を形成し得る条件下に処理し、シクロスポリンAまたはそ の同種体に結合しなかった前記抗体を除去し、前記複合体を前記非標識抗体に対 する標識抗体で、該標識抗体が該複合体の非標識抗体に結合するような条件下に 処理し、前記複合体に結合しなかった前記標識抗体を除去し、前記複合体に結合 した前記標識抗体の存在を検出し、それによって該生物学的組織試料中のシクロ スポリンAまたはその同種体の存在を検出することを特徴とする方法。 31.前記生物学的組織試料が腎臓である請求項30に記載の方法。 32.生物学的流体試料中のシクロスポリンAまたはシクロスポリンAの同種体 の濃度を決定する方法であって、(a)固体支持体を過剰量の請求項14に記載 の合成物と、該合成物が該固体支持体の表面に結合し得る条件下に接触させ、 (b)所定容積の生物学的流体試料を所定量の請求項21に記載の標識抗体と、 該試料中のシクロスポリンAまたはその同種体が該標識抗体に結合して一体とな って複合体を形成するような条件下に接触させ、 (c)得られた複合体をその表面に前記合成物が結合している前記固体支持体と 、該複合体の標識抗体が該合成物に結合し得る条件下に接触させ、 (d)前記固体支持体を、前記合成物とそれに結合している前記複合体の標識抗 体のみが残るように処理し、(e)前記合成物に結合している複合体の標識抗体 の量を定量的に決定し、 (f)それによって該生物学的流体試料中のシクロスポリンAまたはその同種体 の濃度を決定する ことを特徴とする方法。 33.生物学的流体試料中のシクロスポリンAまたはシクロスポリンAの同種体 の濃度を決定する方法であって、(a)固体支持体を過剰量の請求項14に記載 の合成物と、該合成物が該固体支持体の表面に結合し得る条件下に接触させ、 (b)所定容積の生物学的流体試料を所定量の請求項24から26のいずれか一 項に記載の抗体と、該試料中のシクロスポリンAまたはその同種体が該抗体に結 合して一体となって複合体を形成するような条件下に接触させ、(c)この複合 体を所定量の前記非標識抗体に対する標識抗体と、該標識抗体が前記ステップ( b)の非標識抗体複合体に結合して一体となって標識複合体を形成する条件下に 接触させ、 (d)得られた標識複合体をその表面に前記合成物が結合している前記固体支持 体と、該標識複合体の標識抗体に結合している非標識抗体が前記合成物に結合し 得る条件下に接触させ、 (e)前記固体支持体を、前記合成物とそれに結合している前記標識複合体のみ が残るように処理し、(f)更に前記合成物に結合している非標識抗体に結合し ている標識複合体の標識抗体の量を定量的に決定し、(g)それによって該生物 学的流体試料中のシクロスポリンAまたはその同種体の濃度を決定する ことを特徴とする方法。 34.前記合成物がプレート表面に非共有結合によって結合している請求項32 または33に記載の方法。 35.前記合成物がプレート表面に共有待合によって結合している請求項32ま たは33に記載の方法。 36.ラジオイムノアッセイによって生物学的流体試料中のシクロスポリンAま たはシクロスポリンAの同種体の濃度を決定する方法であって、 (a)シクロスポリンA、シクロスポリンAの同種体または請求項14に記載の 合成物を含有する所定量の物質を放射性同位体で標識し、 (b)前記所定量の放射性同位体標識物質を生物学的流体試料に加え、 (c)この混合物を所定量の請求項24から26のいずれか一項に記載の抗体と 、該抗体が前記生物学的流体試料中のシクロスポリンAまたはその同種体及び前 記標識物質に結合し得るのに適した条件下に接触させ、 (d)結合しなかった前記放射性同位体標識物質を除去し、(e)前記抗体に結 合している前記標識物質の量を定量的に決定し、 (f)それによって該生物学的流体試料中のシクロスポリンAまたはその同種体 の濃度を決定する ことを特徴とする方法。 37.患者におけるシクロスポリンAまたはシクロスポリンAの同種体のレベル をモニターする方法であって、(8)所定の時間間隔で患者から生物学的流体試 料を採取し、(h)請求項32、33または36のいずれか一項に記載の方法に 従って各生物学的流体試料中のシクロスポリンAまたはその同種体の量を決定す る ことを特徴とする方法。 38.前記生物学的流体が血液である請求項32、33、36または37のいず れか一項に記載の方法。 39.前記生物学的流体が尿である請求項32、33、36または37のいずれ か一項に記載の方法。 40.前記生物学的流体が大便である請求項32、33、36または37のいず れか一項に記載の方法。 41.前記生物学的流体が組織抽出物である請求項32、33、36または37 のいずれか一項に記載の方法。 42.モノクローナル自己抗イディオタイプ抗体を生産する方法であって、 (a)動物のリンパ球を有効抗体産生量の請求項14に記載の合成物と適当な条 件下に接触させ、 (b)接触後の適当な時期にリンパ球を回収し、(c)回収したリンパ球を適切 な骨髄腫細胞と融合させ、各々がモノクローナル抗体を産生する一連のハイブリ ドーマ細胞を生産し、 (d)このように生産した一連のハイブリドーマ細胞を適当な条件下にスクリー ニングし、請求項14に記載の合成物に対する抗体に結合し得るモノクローナル 抗体を分泌するものを同定し、 (e)このように同定したハイブリドーマ細胞を適当な培地中で別々に培養し、 (f)ハイブリドーマ細胞が産生したモノクローナル抗イディオタイプ抗体を適 当な条件下に別々に回収することを特徴とする方法。 43.請求項42に記載のモノクローナル自己抗イディオタイプ抗体に対する抗 体。 44.請求項24の抗体に対する抗体。 45.請求項25の抗体に対する抗体。 46.請求項26の抗体に対する抗体。 47.移植患者における臓器拒絶反応を阻害するのに有効な量の請求項43から 46のいずれか一項に記載の抗体と医薬的に許容可能な担体とを含有する、移植 患者における臓器拒絶反応を防止するのに有効な免疫調整物質。 48.患者におけるシクロスポリンAまたはシクロスポリンAの同種体の量を低 下させる方法であっても、患者にシクロスポリンAまたはその同種体の量を低下 させるのに有効な量の請求項24から26のいずれか一項に記載の抗体またはそ のフラグメントを血管内投与し、前記抗体またはそのフラグメントを過剰のシク ロスポリンAまたはその同種体と結合させ、それによって過剰のシクロスポリン Aまたはその同種体を無効とすることを特徴とする方法。 49.患者におけるシクロスポリンAまたはシクロスポリンAの同種体とエピト ープを共有する、内在性免疫調整物質または内在性の他の生物学的活性物質の量 を低下させる方法であって、患者に、前記内在性物質の量を低下させるのに有効 な量の請求項43から46のいずれか一項に記載の抗体またはそのフラグメント を血管内投与し、前記抗体またはそのフラグメントを過剰の前記内在性物質と結 合させ、それによって過剰の内在性物質を無効とすることを特徴とする方法。 50.免疫活性剤としての薬理学的物質の能力を試験する方法であって、薬理学 的物質と、既知量の請求項24から26のいずれか一項に記載の抗体で標識した シクロスポリンAまたはシクロスポリンAの同種体とを、該抗体が該薬理学的物 質及びシクロスポリンAまたはその同種体と複合体を形成する条件下に競合させ る免疫化学的アッセイを実施し、標識されたシクロスポリンAまたはその同種体 の抗体の、該薬理学的物質による置換率を決定することを特徴とする方法。
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