DE19951824A1 - Humanes zirkulierendes Insulin-like Growth Factor Binding Protein-3 Fragment und seine Verwendung - Google Patents

Abstract

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Polypeptid(Eiweißstoff) mit zellproliferativen und zellprotektiven Eigenschaften: Humanes zirkulierendes N-IGFBP-3 (N-terminales Fragment des Insulin-like growth factor binding protein-3) und seine Verwendung. DOLLAR A Die Erfindung umfaßt weiterhin von dem N-IGFBP-3 abgeleitete Fragmente und/oder Derivate sowie die Kombination dieser Peptidwirkstoffe mit IGF-I oder IGF-II (Insulin-like growth factor) schließlich ein Arzneimittel, enthaltend die natürlichen, rekombinanten und synthetischen Peptide zur Verwendung für medizinische Indikationen und zur Verwendung als ein Diagnosemittel. Des weiteren eine Nukleinsäuresonde hybridisierend für N-IGFBP-3 oder eines seiner Fragmente und Antikörper bzw. Antagonisten gerichtet gegen N-IGFBP-3 oder eines seiner Fragmente zu diagnostischen oder therapeutischen Zwecken.

Description

Das N-IGFBP-3 konnte mit Hilfe eines biologischen Assays und mit Hilfe eines Immunoassays aus humanem Hämofiltrat isoliert werden. Das N-IGFBP-3 besitzt eine hohe Identität zu den N-terminalen Aminosäuren des Insulin-like Growth Factor Binding Protein-3 und besitzt je nach Grad der Glykosilierung eine Molekularmasse von 10, 12 oder von 15 kDa. Die gefundene Aminosäuresequenz N-IGFBP-3 weicht überraschenderweise von der bislang bekannten Sequenz des humanen IGFBP-3 ab. Das IGFBP-3 wurde bisher als ein 40 kDa großes Bindungsprotein beschrieben, seine vollständige Sequenzanalyse erfolgte durch Sequenzanalyse der dazugehörigen cDNA (Wood W.I. et al., 1988, Mol. Endocrinol., Vol. 2, Seiten 1176-1185). IGFBP-3 stellt das wichtigste Bindeprotein für IGF-I und auch IGF-II und somit ein Reservoir für diese wichtigen Wachstumsfaktoren im Plasma dar. IGF-I und auch IGF-II wurden in ihrer Struktur auf Protein- und DNA-Sequenzebene schon umfangreich beschrieben (als Review siehe: Rechler, M. M., & Nissley, S. P. (1990) Insulin-like growth factors. In: Peptide growth factors and their receptors (Spori, M. B., Roberts, A. B. eds.), pp. 263-367, Springer-Verlag, Berlin). Die vorliegende Erfindung beschreibt erstmalig die Isolierung und exakte Analyse eines in der Zirkulation vorkommenden IGFBP-3 Peptid-Fagmentes aus einer Körperflüssigkeit wie dem Blut. Das erfindungsgemäße N-IGFBP-3 besitz im Unterschied zum gesamten IGFBP-3 eine spezielle Bindungskapazität für IGF-I und auch IGF-II und beeinflußt besonders die Plasmahalbwertszeit von IGF-I und IGF-II, was für die Therapie mit diesen Wachstumsfaktoren von außerordentlichem Vorteil ist. Aufgrund der im Vergleich zum gesamten IGFBP- 3 geringeren Größe vermag das N-IGFBP-3 auch zusammen mit den IGF- Wachstumsfaktoren das Blutgefäßsystem zu verlassen um daraufhin wachstumsmodulierende Funktionen in Organen und Geweben auszuüben. Darüberhinaus besitzt das erfindungsgemäße N-IGFBP-3 auch IGF-unabhängige Wirkungen auf das Wachstum von Zellen und Geweben.

Das erfindungsgemäße Peptid ist durch ein Reinigungsverfahren ausgehend von humanem Hämofiltrat erhältlich. Hämofiltrat fällt bei der Ultrafiltration des Blutes von Nierenkranken in großen Mengen an.

Für die Präparation von Peptiden wird das humane Hämofiltrat dabei mit Wasser verdünnt und angesäuert. Der pH-Wert beträgt vorzugsweise 1.5 bis 3.5, insbesondere 2.5 bis 3.0. Danach wird das Hämofiltrat über einen Kationenaustauscher geleitet, beispielsweise einem mit Sulfonsäuregruppen modifizierenden Trägermaterial (Fraktogel SP - 650 (M), Merck, Darmstadt). Die an den Kationenaustauscher gebundenen Peptide werden mit einer relativ hoch konzentrierten Salzlösung eluiert. Die Ionenstärke der Elutionslösung entspricht dabei ungefähr einer 0.5 bis 1 molaren Ammoniumacetatlösung.

Das aufgefangene Eluat wird einer weiteren Kationenaustauscher- Chromatographie unterzogen. Diese Chromatographie ist vorzugsweise eine Stufenelution mit Puffern von ansteigenden pH-Werten.

Die das erfindungsgemäße Peptid enthaltenen Fraktionen werden mittels präparativer Umkehrphasen-Chromatographie und nachfolgender semipräparativer Umkehrphasen-Chromatographie beispielsweise an mit C18 modifizierten Trägermaterialien weitergereinigt. Der Aufreinigungsgrad wird vorzugsweise mittels analytischer Umkehrphasen-Chromatographie beispielsweise an mit C18 modifizierten Trägermaterialien überprüft.

Die durch die chromatographische Reinigung erhaltene Substanz wurde der Strukturaufklärung zugeführt. Die Bestimmung der Molekülmassen des nativen Peptids sowie seiner deglykosilierten Formen und chemisch modifizierten Derivate erfolgte mittels eines ESI-Massenspektrometers. Die Sequenzanalyse erfolgte über einen Edman-Abbau der Peptide sowie von chemisch modifizierten Derivaten mit einem ABI 473 A Sequenzer.

Neben der gentechnischen Herstellung des Peptids ist auch die aufbauende Totalsynthese an üblichen Festphasen im Sinne der Merrifield-Synthese oder einer Flüssigphasensynthese möglich. Die Synthesestrategie und der Aufbau des Peptids und von ihm abgeleiteten Derivaten mit den entsprechend geschützten Aminosäuren sind dem Fachmann bekannt.

Der erfindungsgemäße N-IGFBP-3 allein, sowie seine cDNA, sein Gen und Analoga, Fragmente und Derivate zu dem Peptid, der cDNA und dem Gen sowie Antikörper, welche die Wirkung von N-IGFBP-3 aufheben, können als Arzneimittel Verwendung finden. Seine biologische Aktivität entspricht der zellproliferativen Substanzen, ähnlich der bekannter Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktoren. Das N-IGFBP-3 reguliert die Freisetzung von IGF-I und IGF-II an ihrem Wirkort. Die Co-Administration von N-IGFBP-3 mit IGF-I oder IGF-II verlängert die biologische Halbwertszeit und damit Verfügbarkeit der letztgenannten. Die durch eine Injektion von freiem IGF-I oder IGF-II induzierte Hypoglykämie wird durch die Co-Administration von N-IGFBP-3 verhindert. Insbesondere für die Therapie von Insulin-resistenten Diabetikern ist die Gabe von N-IGFBP-3 zusammen mit IGF-I oder IGF-II erfolgversprechend. Das erfindungsgemäße Peptid N-IGFBP-3 ist daher geeignet, als Arzneimittel bei den in Anspruch 24 bis 25 genannten Indikationen eingesetzt zu werden.

Für das N-IGFBP-3 allein ist desweiteren von einer wachstumsförderndern Wirkung auf Körperzellen und von einer Verstärkung oder Modulation der Wirkung von Wachstumshormon (Growth Hormone, GH, Somatotropin) auszugehen.

Das erfindungsgemäße Peptid kann dabei in für Peptide üblicher Weise parenteral, intravenös, intramuskulär, intranasal, lokal-topisch oder bukal verabreicht werden. Dabei kann es sinnvoll sein, das erfindungsgemäße Peptid gebunden an einen geeigneten Carner zu verabreichen. Die Menge an zu verabreichendem Peptid beträgt 1g bis 1 g pro Darreichungseinheit pro Tag. Die Wirkung des erfindungsgemäßen Peptids kann durch Gabe geeigneter Inhibitoren/Antagonisten gehemmt werden.

Das erfindungsgemäße Diagnostikmittel enthält poly- oder monoklonale Antikörper gegen das erfindungsgemäße Peptid gegebenenfalls in fluoreszenz- oder radioaktiv-markierter Form, um in einem an sich bekannten ELISA oder RIA eingesetzt zu werden. Das erfindungsgemäße Diagnostikmittel enthält DNA, RNA und/oder PNA gegebenenfalls in modifizierter und/oder markierter Form zum Einsatz in dem Fachmann bekannten Testsystemen wie PCR oder Fingerprinting.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher beschrieben:

Beispiel 1 Chromatographische Isolierung von N-IGFBP-3 1. Schritt: Hämofiltrat-Batch-Extraktion

800 bis 1.000 L Hämofiltrat werden mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 2.7 eingestellt und mit Wasser auf eine Leitfähigkeit von 5.5 mS/cm verdünnt und mit einer Flußrate von 3 L/min auf einen starken Kationenaustauscher aufgetragen.
Chromatographiebedingungen:
Säule: Vantage VA 250 (Amicon, Witten)
Säulenmaterial: Fractogel TSK SP 650 (M), 25 cm × 20 cm
Fluß: 3 L/min
Detektion: 280 nm,
Auftrag: Hämofiltrat pH 2.7, Leitfähigkeit 5.5 mS/cm
Elutions-Puffer: 0.5 M Ammoniumacetat
Anlage: Autopilot Chromatographiesystem, (PerSeptive Biosystems)

Nach Auftrag der insgesamt 1.000 L Flüssigkeit über Nacht wird mit mehreren Säulenvolumina 5 mM HCl gespült. Die Elution der gebundenen Peptide erfolgt als Batch-Elution mit 0.5 M Ammoniumacetat. Hierbei wird eine komplette Elution der Peptide über steigenden pH-Wert (6.8-7.2) und steigende Leitfähigkeit (56 mS/cm) in etwa 5 L Eluat erreicht.

2. Schritt: Erste präparative Auftrennung

Die Ammoniumacetat-Eluate der Batch-Extraktion werden in Mengen von 5.000 bis 10.000 L Hämofiltrat-Peptid vereinigt. Nach pH-Einstellung auf 2.7 wird das Peptidextrakt unter Zumischung von deionisiertem Wasser mit einer Leitfähigkeit von 5.5 mS/cm auf den präparativen Kationenaustauscher aufgetragen.
Chromatographiebedingungen:
Säule: Vantage 250 VA
Säulenmaterial: Fractogel TSK SP 650 (M), 25 cm × 20 cm
Fluß: bis zu 3 L/min während des Auftrages
0.5 bis 1 L während der Elution
Detektion: 280 nm, pH, Leitfähigkeit
Probe: Hämofiltrat pH 2.7, Leitfähigkeit 5.5 mS/cm
Anlage: Autopilot Chromatographiesystem, (PerSeptive Biosystems)

Nach Auftrag des Rohextraktes über 240 min wird die Säule mit 0.01 M HCl gespült, bis die Leitfähigkeit unter 1 mS/cm ist. Die Elution erfolgt dabei in mehreren Stufen mit den im folgenden angegebenen Puffern

Die Eluate 1-7 werden als ph-Pool I-VII bezeichnet. Die Elution erfolgt bis zum Erreichen einer neuen Basislinie, wobei für die einzelnen pH-Pools I bis VII Elutionsvolumina von 10 bis 25 L erreicht werden.

3. Schritt: Zweite präparative Auftrennung

Die einzelnen pH-Pools werden zur Fraktionierung und gleichzeitigen Entsalzung über eine Reversed Phase Chromatographie getrennt.
Chromatographiebedingungen:
Säule: FineLine 100 (Pharmacia, Freiburg)
Säulenmaterial: Source RPC, 15 µm
10 × 12.5 cm
Fluß: 150 ml/min
Detektion: 280 nm, 214 nm
Puffer A: 10 mM HCl
Puffer B: 80% Acetonitril in 10 mM HCl
Gradient: 0-60% Puffer B in 5 Säulenvolumen
Chromatographieanlage: BioCad 250, Perseptive Biosystems

Nach Auftrag der pH-Pools wird die Säule mit Puffer A gespült. Während der Elution werden Fraktionen zu 200 ml gesammelt. Die Fraktionen werden gefriergetrocknet und bei -20°C gelagert. Aliquots der Fraktionen werden im Bioassay und Immunoassay getestet. Die Fraktion 25 aus dem pH-Pool Eluat 2 erhielten die erfindungsgemäße Substanz.

4. Schritt: Semipräparative Reverse-Phase C18-Chromatographie

Die in den Assays aktive Fraktion 25 aus pH-Pool 2 wurde über eine semipräparative Reverse-Phase Säule aufgetrennt. Die Fraktionen 15-27 enthielten die erfindungsgemäße Substanz.
Chromatographiebedingungen:
Säule: 4,7 cm × 30 cm, Kartuschensystem
Füllmaterial: YMC ODS AQ, RP-C18, 15-20 µm, 300 Å
Puffer A: 0,1% TFA/20% MeOH
Puffer B: 0,1% TFA, 100% MeOH
Gradient: 35-60% B in 41.7 min
Fluß: 50 ml/min
Detektion: 214 nm und 280 nm
Chromatographieanlage: BioCad 250, Perseptive Biosystems
Fraktionen: à 50 ml ab Start des Gradienten

5. Schritt: Größenausschluß-Chromatographie

Die aktiven Fraktionen 15-27 aus der vorhergehenden Chromatographie wurden über eine Gelfiltrations-Säule aufgetrennt. Die Fraktionen 32-35 enthielten die erfindungsgemäße Substanz.
Chromatographiebedingungen:
Säule: 14 × 76 cm Kunststoffsäule (11 L)
Füllmaterial: Superdex 75 prep grade, Pharmacia
Puffer: 200 mM Ammoniumformiat pH 7.4
Gradient: isokratisch
Fluß: 100 ml/min
Detektion: 214 nm und 280 nm
Chromatographieanlage: BioCad 250, Perseptive Biosystems
Fraktionen: à 1 min ab 35 min nach Start

6. Schritt: Semipräparative Kationen-Austausch Chromatographie

Die aktiven Fraktionen 32-35 aus der vorhergehenden Chromatographie wurde über eine semipräparative Kationen-Austausch Chromatographie-Säule aufgetrennt. Die Fraktion 12 enthielt die erfindungsgemäße Substanz.
Chromatographiebedingungen:
Säule: 3 cm × 15 cm Stahlsäule
Füllmaterial: Merck Fractogel TSK SP 650 S
Puffer A: 20 mM NaH₂PO₄ pH 5.0
Puffer B: 20 mM NaH₂PO₄ pH 5.0 + 1 M NaCl
Gradient: 0-50% B in 40 min
Fluß: 10 ml/min
Detektion: 214 nm
Chromatographieanlage: BioCAD Sprint, Perseptive Biosystems
Fraktionen à 7 ml

7. Schritt: Analytische Reverse-Phase Chromatographie

Die aktive Fraktion 12 aus der vorhergehenden Chromatographie wurde über eine analytische Reverse Phase - Säule aufgetrennt. Die Fraktion 15 enthielt die erfindungsgemäße Substanz in hochreiner Form.
Chromatographiebedingungen:
Säule: 0,4 cm × 25 cm Stahlsäule
Füllmaterial: YMC ODS AQ; RP-C18, 5 µm, 300 Å
Puffer A: 0,1% TFA
Puffer B: 0,1% TFA, 80% Acetonitril
Gradient: 30-50% B in 60 min
Fluß: 0,7 ml/min
Detektion: 214/280 nm
Chromatographieanlage: Kontron
Fraktionierung: Sammlung einzelner Peaks

Beispiel 2 Deglycosilierung des gereinigten Peptids N-IGFBP-3

Das aus der aktiven Fraktion 15 des letzten Aufreinigungsschrittes in Beispiel 1 erhaltene Peptid wurde mit Glykosidasen (Neuraminidasen und N-Glykosidasen) behandelt, um so die Molekularmasse des nicht-glykosilierten Peptids bestimmen zu können. Aus dieser Masse des vollständig deglykosilierten Peptids und der ermittelten Sequenz ließ sich dann aus dem Vergleich mit den aus der cDNA hergeleiteten Sequenzen des humanen IGFBP-3 die C-terminale Aminosäure des erfindungsgemäßen N-IGFBP-3 Fragments bestimmen.

Beispiel 3 Massenbestimmungen

Alle Massenbestimmungen des glycosilierten, und der deglycosilierten und cystein-modifizierten Peptide wurden auf einem ESI-Massenspektrometer durchgeführt. Cysteine lassen sich nach vorheriger chemischer Derivatisierung, zum Beispiel nach Reduktion mit β-Mercaptoethanol und Carboxamidomethylierung mit Iodacetamid, in der Peptid-Sequenzierung nachweisen. Nach der Derivatisierung schließt sich eine Entsalzung vorzugsweise über eine analytische Reverse-Phase Chromatographie mit einer Vydac RP-C18 Säule (4,6 mm × 25 cm) an. Ein Teil der so modifizierten Peptide werden der Sequenzanalyse zugeführt, mit dem anderen Teil ergeben die Massenbestimmungen ein entsprechendes Molekulargewicht. Aus der Massendifferenz zum nativen Peptid wurde geschlossen, daß das N-IGFBP-3 aus Hämofiltrat zwölf Cysteine enthält, welche zudem mit sechs Disulfidbrücken untereinder verbunden sind. Die Molekülmassen von N-IGFBP-3 wurden entsprechend hier aufgelisteten Massenzahlen (MW) bestimmt.
N-IGFBP-3 - natives, einfach N-glykosiliertes Peptid - Kettenlänge 98 Aminosäuren: 12,266 Da
N-IGFBP-3 - deglykosiliertes Peptid - Kettenlänge 98 Aminosäuren: 9,916 Da
N-IGFBP-3 - carboxymethyliertes und deglycosiliertes Peptid - Kettenlänge 98 Aminosäuren: 10,606 Da

Sequenzbestimmung

Sowohl die aufgereinigten nativen als auch die deglycosilierten Peptide werden mittels Edman-Abbau auf einem ABI 473 A Sequenzer unter Verwendung des Standard-Programms analysiert. Die Proben werden auf eine Polybyrene- Membran in Mengen zwischen 100 und 400 pmol aufgetragen. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Massenbestimmungen ergab sich folgende N-terminale Sequenz:
N-IGFBP-3
Aminosäuren
GASSAGLGPVVRXEPXDARALAQ...

Datenbankvergleich

Ein Datenbankvergleich wurde mit Hilfe des HUSAR-Programmpakets an den SwissProt und EMBL-Nukleinsäure Datenbanken durchgeführt. Die Peptidsequenzen besitzt eine hohe Identität zu den aus der cDNA abgeleiteten Aminosäuren des humanen IGFBP-3.

Beispiel 4 Bestimmung der biologischen Aktivität des N-IGFBP-3

Die Isolierung des IGF/IBP-2-13 erfolgte anhand seiner biologischen Aktivität, nämlich des Bindungsvermögens für IGF-I. Dazu wurden jeweils Aliquots der unter Beispiel 1 beschriebenen einzelnen Chromatographiestufen gefriergetrocknet und anschließend dem IGF-Bindungs-Assay zugeführt. Der Assay mißt die spezifische Bindung bzw. die Verdrängung von radioaktiv­ markiertem IGF-I an das N-IGFBP-3 bzw an Fraktionen, die N-IGFBP-3 enthalten. Die gebundene Radioaktivität wird in einem gamma-Counter gemessen.

Der Bindungs-Assay wurde routinegemäß durchgeführt, wie in der Literatur beschrieben (Mark, S. et al., 1999 J. Chrom. A 852, 197-205.). Parallel zum Bindungs-Assay wurde mit Hilfe von spezifischen IGFBP-3 Antikörpern ein Western-Immuno-blot durchgeführt, wie in der Literatur beschrieben (Hossenlopp, P. et al. 1986, Anal. Biochem. 154, 138-143). In den Hämofiltrat Fraktionen konnten so die verschiedenen immmunreaktiven Formen des N- IGFBP-3 detektiert werden. Die Fraktionen, die jeweils ein positives Signal ergaben, wurden der weiteren Aufreinigung unterzogen.

Das N-IGFBP-3 besitzt in dosisabhängigerweise eine spezifische IGF- Bindekapazität, sowohl für IGF-I als auch für IGF-II.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (24)

1. Das Peptid N-IGFBP-3 mit nachfolgender Aminosäuresequenz:
sowie deren biologisch aktive Fragmente, Analoga und/oder Derivate, insbesondere Formen mit dem Austausch einzelner Aminosäuren sowie glykosylierte, amidierte, acetylierte, sulfatierte, phosphorylierte sowie die durch multiple Synthese darstellbaren Peptide,
dabei stellt Z eine Anzahl von 0-5 Aminosäureresten dar,
und die Komplexe von N-IGFBP-3 mit hIGF-I (humaner Insulin-like growth factor -I) sowie dessen biologisch aktive Fragmente und/oder Derivate, insbesondere amidierte, acetylierte, sulfatierte, phosphorylierte und/oder glykosylierte Derivate, sowie die durch multiple Synthese darstellbaren Peptide,
und die Komplexe von N-IGFBP-3 mit hIGF-II (humaner Insulin-like growth factor -II) sowie deren biologisch aktive Fragmente und/oder Derivate, insbesondere amidierte, acetylierte, sulfatierte, phosphorylierte und/oder glykosylierte Derivate, sowie die durch multiple Synthese darstellbaren Peptide.

2. Isoliertes Polynukleotide kodierend N-IGFBP-3 nach Anspruch 1 und/oder dessen Fragmente, Derivate und Analoga.

3. Polynukleotide nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Polynukleotid aus DNA aufgebaut ist.

4. Polynukleotide nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Polynukleotid aus RNA aufgebaut ist.

5. Polynukleotide nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Polynukleotid aus genomischer DNA aufgebaut ist.

6. Polynukleotide nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Polynukleotid aus PNA aufgebaut ist.

7. Polynukleotide nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Polynukleotid für die Peptide aus Anspruch 1 kodiert.

8. Ein Vektor enthaltend die DNA aus Anspruch 3.

9. Eine gentechnisch manipulierte Wirtszelle enthaltend den Vektor nach Anspruch 8.

10. DNA hybridisierend mit der DNA aus Anspruch 2, die für ein Polypeptid mit N- IGFBP-3-Aktivität kodiert.

11. Antikörper gerichtet gegen die Polypeptide und Polypeptid-Komplexe aus Anspruch 1.

12. Antagonist/Inhibitor gerichtet gegen die Polypeptide und Polypeptid-Komplexe aus Anspruch 1.

13. Ein Behandlungsschema zur Behandlung von Patienten, die N-IGFBP-3 oder deren Komplexe mit IGF-I oder mit IGF-II benötigen durch Gabe therapeutischer Mengen der Polypeptide aus Anspruch 1.

14. Ein Behandlungsschema zur Behandlung von Patienten, die eine Inhibition des N-IGFBP-3 oder derer Komplexe mit IGF-I oder mit IGF-II benötigen durch Gabe therapeutischer Mengen eines Antagonisten/Inhibitors.

15. Eine galenische Formulierung bestehend aus Polypeptiden nach Anspruch 1 und einem verträglichen Carrier.

16. Die Methode aus Anspruch 7, wobei eine therapeutische Wirkung des Polypeptids durch die Gabe von DNA kodierend für das Polypeptid und seine Expression in vivo beim Patienten erreicht wird.

17. Verfahren zur Herstellung von N-IGFBP-3 gemäß Anspruch 1 durch Extraktion von Hämofiltrat durch Kationenaustauscher-Extraktion mit nachfolgender Elution der adsorbierten Substanzen, eine erneute Kationenaustauscher-Chromatographie des die Peptide enthaltenden Extraktes sowie mehrstufige Umkehrphasen- Chromatographie.

18. Verfahren zur Herstellung von N-IGFBP-3 gemäß Anspruch 1 durch Festphasensynthese im Sinne der Merrifield-Synthese sowie Flüssigphasensynthese nach dem Fachmann bekannten Methoden mit geschützten Aminosäuren und dessen Aufreinigung.

19. Verfahren zur Herstellung von N-IGFBP-3 gemäß Anspruch 1 durch dem Fachmann bekannte Verfahren der heterologen Expression mittels gängiger biotechnologischer Vektoren.

20. Diagnostikmittel der Stoffe nach Anspruch 1 enthaltend poly- oder monoklonale Antikörper gegen N-IGFBP-3 oder deren Komplexe nach Anspruch 1 oder mit der für N-IGFBP-3 kodierenden Nukleinsäure oder mRNA.

21. Diagnostikmittel enthaltend die Stoffe nach Anspruch 1 für Testsysteme zur Kontrolle von Gewebe-, Plasma-, Urin- und Liquor cerebrospinalis-Spiegeln dieser Substanz.

22. Diagnostikmittel enthaltend die Stoffe nach Anspruch 1 als Marker für Funktionsstörungen des Knochens, der Muskeln, des Nervensystems, der Lymphorgane, des Magen-Darmtraktes, des Immunsystems und von Diabetes sowie inflammatorischen und neoplastischen Prozessen sowie als Marker bei Krebs.

23. Arzneimittel enthaltend die Stoffe nach Anspruch 1 als wirksamen Bestandteil von galenischen Formen und in Verbindung mit einem geeigneten Carner zur oralen, intravenösen, intramuskulären, intracutanen, intrathekalen Anwendung sowie als Aerosol zur transpulmonalen Applikation.

24. Verwendung der Stoffe aus Anspruch 1 bis 12 sowie 17 bis 19 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung bei Muskelschwund, Osteoporose, Knochenbrüchen dabei insbesondere Brüchen der Hüfte, Diabetes dabei insbesondere Diabetes Typ 1 und Diabetes Typ 2, amyloidaler lateraler Sklerose, entzündlichen und neoplastischen Erkrankungen peripheren und zentralen Neuropathien, entzündlichen Prozessen, gestörten Entzündungsreaktionen, Tumorerkrankungen, Erkrankungen des Herzens, zur Behandlung von schweren Verbrennungen, zur Behandlung von Erkrankungen der Muskulatur und des Knochenapparates, sowie zur Wund- und Knochenheilung.