DE69130483T2

DE69130483T2 - Verbesserter blutersatz

Info

Publication number: DE69130483T2
Application number: DE69130483T
Authority: DE
Inventors: Mario Lubbock Tx 79416 Feola; Jan S. Lubbock Tx 79415 Simoni
Original assignee: Texas Tech University Health Sciences Center; Texas Tech University TTU
Current assignee: Texas Tech University Health Sciences Center; Texas Tech University TTU
Priority date: 1991-02-12
Filing date: 1991-12-13
Publication date: 1999-06-10
Anticipated expiration: 2011-12-14
Also published as: NO308934B1; FI933550A; AU1270492A; CA2103680A1; AU656763B2; NO932857L; EP0586381B1; JP2002507185A; JP3437572B2; NO932857D0; KR100227453B1; EP0586381A4; ATE173273T1; CA2103680C; DE69130483D1; FI106362B; EP0586381A1; FI933550A0; WO1992013875A1

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf einen Blutersatz und auf ein Verfahren zu seiner Herstellung. Insbesondere bezieht sie sich auf eine neue Hämoglobinzusammensetzung, welche wirksam beim Aufrechterhalten von Leben nach schwerer Hämorrhagie in Lebewesen verschiedener Arten, einschließlich Menschen, die frei von Toxizität und durch Blut übertragbare Krankheiten ist.
Blut übt viele Funktionen aus, welche alle lebenswichtig sind. Schwere Hämorrhagie oder Verlust von Blut gefährdet Leben aus den folgenden zwei Hauptgründen: 1) das Fallen von zirkulierendem Blutvolumen reduziert Gewebeperfusion und erzeugt Ischämie, und 2) die Reduzierung an Sauerstofftransport beeinträchtigt Gewebeoxygenierung und erzeugt Hypoxie.
Das Zirkulationssystem reagiert gegenüber diesen Änderungen durch Erzeugen von Vasokonstriktion, welches ferner Ischämie und Hypoxie verschlimmert. Letztendlich entwickeln sich Veränderungen des Zellmetabolismus und der -funktion, welches zu Schock und Tod führt.
Im Zusammenhang mit diesem Patent ist ein "Blutersatz" nicht eine Präparation, die Blut in allen ihren Funktionen ersetzen kann, sondern eine Notfall-Reanimations- Flüssigkeit, die sich dazu eignet, die folgenden Funktionen durchzuführen
Wiederherstellen von Blutvolumen
Transportieren von Sauerstoff
Reduzieren von Vasokonstriktion.
Diese Flüssigkeit muß jedoch frei von toxischen Nebenwirkungen wie auch von Krankheitsmitteln wie beispielsweise Bakterien und Viren sein.
Über 50 Jahre lang haben sich Bemühungen, gerichtet auf die Entwicklung eines Blutersatzes, auf Hämoglobin (Hb) fokussiert, weil dieses die einzige Substanz ist, die sich dazu eignet, genug Sauerstoff aus atmosphärischer Luft aufzunehmen, um als ein physiologischer Sauerstoffträger zu dienen. Zusätzlich übt Hämoglobin den gleichen kolloid-osmotischen Druck wie Serumalbumin aus und kann deshalb als ein Plasmavolumenausdehner dienen. Jedoch sind bis zur gegenwärtigen Zeit diese Bemühungen aufgrund einer Anzahl von Problemen nicht erfolgreich gewesen, die im nachfolgenden angegeben sind, die langsam zu erkennen und schwierig zu lösen gewesen sind.
(1) Toxizität, zuwegegebracht durch Kontamination von Hämoglobin mit Endotoxinen von Umweltbakterien, Stromaphospholipiden und Nicht-Häm-Proteinen und Peptiden.
(2) Hohe Sauerstoffaffinität von Hämoglobin in Lösung, in Wechselwirkung tretend mit Freisetzung von Sauerstoff zu den Geweben,
(3) Instabilität von Nb Molekül und Tendenz zur Extravasation und schnellen Nierenausscheidung.
(4) Tendenz von Hb zur Autoxidation und Erzeugung von nicht funktionellem Met-Hb und toxischen freien Sauerstoff-Radikalen.
(5) Übermittlung durch natürliches Hb von blutverwandten Krankheiten wie beispielsweise Hepatitis und AIDS.
Das Problem der Toxizität, d. h. die Fähigkeit von Hb Lösungen die intravaskuläre Koagulation von Blut zu aktivieren und Schaden an der Niere zu erzeugen, war als erstes zu erkennen. Rabiner in den 1960ern machte die Meinung populär, daß derartige Toxizität eher auf dem Stroma von roten Blutzellen (Fragmente von roten Zellmembranen) als auf Hb beruht. Er betonte die Notwendigkeit eines stromafreien Hämoglobins. Jedoch hat dieser Begriff über Jahre die Tatsache Lügen gestraft, daß ein Hb, welches wirklich frei von allen stromalen Elementen ist, nicht erzeugt worden ist. Die toxischen Faktoren der roten Zellmembran wurden durch den gegenwärtigen Erfinder und Mitarbeiter als die Aminophospholipide Phosphatidylethanolamin (PE) und Phosphatidylserin (PS) identifiziert. welche normalerweise auf deren zytoplasmatischen Seite liegen. Diese Verbindungen haben eine besondere Affinität in Bezug auf Hb, und sie sind schwieriger aus einer Hb Lösung zu entfernen als andere Stromakomponenten. Wenn mit PE und PS kontaminiertes Hb in Versuchstiere wie beispielsweise Kaninchen und Affen in beträchtlichen Volumen mittels Infusion eingeführt ist, beispielsweise mindestens 1/3 des berechneten Blutvolumens der Tiere, erzeugt es eine systemische Entzündungsreaktion, gekennzeichnet durch Aktivierung von intravaskulärer Koagulation und Komplement, Aktivierung von Leukozyten und Thrombozyten und Entwicklung von ischämischen-entzündlichen Verletzungen in den vitalen Organen.
Ein Problem, das erst kürzlich erkannt worden ist, ist die leichte Kontamination von Hb Lösungen mit Endotoxinen von Umweltbakterien. Bis zur Entwicklung des Limulus- Amoebozyten-lysattests beruhte die U. S. Pharmakopoe auf dem Kaninchen-Pyrogenizitätstest als Analyse für den Nachweis von Endotoxinen. Jedoch wurde von mit Endotoxinen kontaminiertem Hb bei Konzentrationen gut unterhalb dessen Pyrogenizitätsspiegel berichtet, daß es die gleiche Art von Toxizität erzeugte wie mit Aminophospholipiden kontaminiertes Hb, weil die toxischen Komponenten von Endotoxin tatsächlich ein Lipid sind (Lipid A). Bakterielle Endotoxine können aus biologischen Lösungen durch die Verwendung von Affinitätschromatographiesäulen wie beispielsweise Detoxi-Gel-Säulen (Pierce Chemical Co.) entfernt werden. Jedoch können diese Säulen nicht alles vorhandene Endotoxin entfernen, wenn das Ausgangsmaterial mehr als 2 Endotoxineinheiten pro Milliliter enthält, wie bestimmt durch die Verwendung des "quantitativen chromogenen Limulustests" (QCL-1000, Whittaker M. D. Bioproducts), gemäß dem 1 EU gleich 0,1 Nanogramm bakterielles Lipopolysaccharid ist.
Hb muß aus Nicht-Häm-Proteinen und Peptiden gereinigt werden. Während keine Toxizität mit dem Vorhandensein von irgendeinem bestimmten Protein verbunden ist, wird Reinigung durch die Notwendigkeit des Reduzierens der Immunogenizität von natürlichen Hb Lösungen unterstellt. Es ist auch die Hypothese aufgestellt worden, daß ein Peptid verantwortlich für die Vasokonstriktorwirkung von Hb Lösungen ist, die in isolierten Organen wie beispielsweise dem Herz und der Niere und isolierten Arterien beobachtet werden. Eine Vielzahl von Verfahren für derartige Reinigung sind in der Technik bekannt, die die folgenden umfassen.
(1) Zentrifugation und Filtration. U. S. Patent Nr. 3 991 181 von Coczi.
(2) Toluolextraktion. U. S. Patente Nr. 4 001 200 und Nr. 4 001 401 von Bonsen.
(3) Ultrafiltration, U. S. Patent Nr. 4 526 715 von Kothe et al.
(4) Ultrafiltration plus Säurefällung. U. S. Patente Nr. 4 136 093 und Nr. 4 336 248 von Bonhard et al.
(5) Ionenaustauschchromatographie, U. S. Patent Nr. 4 100 149 von Meiller.
(6) Zinkfällung, U. S. Patente Nr. 4 473 494 und 4 529 719 von Tye.
(7) Kristallisation, DeVenuto et al.. Journal of Laboratory and Clinical Medicine 89: Seiten 509-514 (1977).
Keines der Verfahren ist vollständig zufriedenstellend. Die zuvor angegebenen Verfahren (1)-(4) intrinsische Beschränkungen, was das Unvermögen für vollständiges Abtrennen des Hb von anderen Proteinen anbelangt, während die Verfahren (5)-(7) sich nicht für Reinigung in großem Umfang eignen.
Ein Problem, das in den 1970ern erkannt war, war die hohe Sauerstoffaffinität von Hb in Lösung. Dieses ist die Eigenschaft, die die Fähigkeit von Hämoglobin reguliert. Sauerstoff aus Luft in die Lungen aufzunehmen und sie an die Gewebe abzugeben. Ein Ausdruck dieser Eigenschaft ist der P&sub5;&sub0; Wert oder Partialdruck von Sauerstoff, bei dem Hb zu 50% gesättigt ist. Je niedriger der P&sub5;&sub0; Wert, desto größer die Fähigkeit von Hämoglobin, Sauerstoff zu binden, und desto reduzierter dessen Fähigkeit. Sauerstoff in Geweben auszuladen. Der P&sub5;&sub0; Wert von menschlichem Blut beträgt annähernd 28 mm Hg, wohingegen der P&sub5;&sub0; von Human Hb in Lösung annähernd 13 mm Hg beträgt. Der Unterschied beruht auf der Tatsache, daß innerhalb der roten Blutzelle Hb mit 2,3-Diphosphoglycerat (2,3-DPG) reagiert, welches die Affinität von Hb für Sauerstoff reduziert. Außerhalb der roten Blutzelle ist jene Wechselwirkung verloren und somit bindet Hb O&sub2; so fest, daß es aufhört, als ein O&sub2; Träger zu funktionieren. Um dieses Problem zu lösen, entwickelten Benesch et al. eine kovalente Reaktion von Hb mit Pyridoxal-5'-phosphat, einem 2,3-DPG Analogen. Es wurde zuerst gehofft, daß eine derartige Reaktion sowohl die Sauerstoffaffinität reduzieren wie das Hb Molekül in tetramerer Form stabilisieren würde. Dieses liess sich jedoch nicht verwirklichen. Der gegenwärtige Erfinder und Mitarbeiter zeigten, daß Rinder Hb in Lösung denselben P&sub5;&sub0; Wert wie menschliches Blut hat, und daß seine Affinität für O&sub2; eher durch Chloride als durch 2,3-DPG reguliert wurde. Unter Beachten dieser günstigen Eigenschaft, der Verfügbarkeit von Rinder RBCs in großem Umfang und der geringen Antigenizität von reinem Hämoglobin unter Säugern gibt es Vorteile für die Verwendung von Rinderhämoglobin als Basis für einen Blutersatz.
Ein weiters in den 1970ern erkanntes Problem war die schnelle Extravasation von Hämoglobin mit kurzer intravaskulärer Persistenz. Dieses ist allgemein einer Tendenz von Hb Tetrameren, α&sub2;ß&sub2; zuzuschreiben, in Dimere, 2αβ, zu dissoziieren, welche mit größerer Leichtigkeit durch die Blutkapillaren passieren. Es scheint jetzt, daß die elektrische Oberflächenladung des Proteins auch eine wichtige Rolle bei Elektronegativität und geringem isoelektrischem Punkt spielt, was intravaskuläre Persistenz begünstigt. Hämoglobinextravasation hat die folgenden verschiedenen unerwünschten Wirkungen.
(1) Die Plasmavolumenausdehnungswirkung ist von kurzer Dauer.
(2) Hb Passage durch die Nierenglomeruli erzeugt einen osmotischen diuretischen Effekt, welcher das Plasmavolumen eher reduziert als aufrechterhält.
(3) Hb Reabsorption in den Nierenkanälen erzeugt Verletzung gegenüber den Tubuluszellen.
(4) Hb Passage in die Interstitialflüssigkeiten erzeugt Ödem und Zellverletzung.
Der Stand der Technik hat sich exklusiv auf die Verhütung von Hb Dimerisierung fokussiert. Zu diesem Zweck haben sich die folgenden drei Typen von Hb Modifikation insofern entwickelt.
(a) Intermolekulares Vernetzen oder Polymerisation.
(b) Konjugation von Hb mit anderen Molekülen.
(c) Intramolekulares Vernetzen von α oder β Ketten.
Das am verbreitetsten verwendete der zuvor angegebenen Verfahren ist das intermolekulare Vernetzen von Hb mit Glutaraldehyd, offenbart in dem U. S. Patent 4001200. Nr. 4001401 und 4053590 von Bonsen et al. U. S. Patent 4061736 von Morris et al.; U. S. Patent 4136093 von Bonhard et al., deren Gesamtinhalte hier durch Referenz eingefügt sind. Intermolekulares Vernetzen durch sich selbst leidet an den verschiedenen im nachfolgenden aufgeführten Nachteilen.
(1) Glutaraldehyd ist intrinsisch toxisch und die potentielle Toxizität seiner metabolischen Nebenprodukte ist unbekannt.
(2) Glutaraldehyd ist sehr reaktiv und neigt dazu, Mehrfachbrücken mit verschiedenen Hb Stellen zu bilden, wie beispielsweise α- und -Aminogruppen und Sulfhydrylgruppen. Dieses führt zu der Bildung von nicht vorhersagbaren Zahlen von Molekülarten.
(3) Polymerisation ist schwierig zu kontrollieren und scheint sich während Lagerung bei 4ºC fortzusetzen, was zur Bildung von fortschreitend größeren Polymeren von erhöhter Viskosität und Sauerstoffaffinität führt.
(4) Die nicht-spezifische Natur des Vernetzens kann noch das Vorhandensein von Hb Dimeren in Lösung erlauben.
Als eine Alternative ist Hb mit Molekülen großer Größe gekoppelt worden, wie beispielsweise Dextran und Hydroxyethylstärke (U. S. Patent Nr. 4 064 118), Polyethylen- oder Polypropylenglykole (U. S. Patent Nr. 4 412 986). Insulin (U. S. Patent Nr. 4 377 512) und Polyalkylenoxid (U, S. Patent Nr. 4 670 417). Diese konjugierten Hämoglobine haben jedoch erhöhte Sauerstoffaffinität und neigen dazu, ungünstige Eigenschaften, die den Kopplungssubstanzen eigen sind, zu erwerben. Intramolekulares Venetzen ist durch die Verwendung von "Diaspirin" Estern (U. S. Patent 4529719 von Tye: U. S. Patent 4598004 von Walder) und "Perjodat-oxydiertes Adenosintriphophat" (o-ATP) (Scannon. F. J., "Molecular modification of hemoglobin". Critical Care Medicine 10 : 261-265 (1982); Greenburg, A. G., und Maffuid, P. W., "Modification of hemoglobin -Ring opened diols", Advances in Blood Substitute Research. Liss. Alan R., New York, Seiten 9-17 (1983)) erzielt worden. Jedoch haben die Diaspirin-Hämoglobine noch kurze intravaskuläre Persistenz mit einer Halbwertszeit von 3-4 Stunden, und es ist festgestellt worden, daß die ATP Hämoglobine unzufriedenstellend aufgrund der hohen Spiegel von met-Hb, hohen Sauerstoffaffinität und kurzen Halbwertszeit sind.
Signifikanter Fortschritt ist berichtet worden durch Umsetzen von Human Hb mit Pyridoxal-5'-phosphat und Glutaraldehyd unter Erhalten von polymerisiertem pyridoxyliertem Hb ("poly-PLP-Hämoglobin"). d. h. einem Hämoglobin behaupteterweise sowohl mit geringer Sauerstoffaffinität wie verlängerter intravaskulärer Persistenz (Moss. G. S.. et al., Hemoglobin solution - From tetramer to polymer". Biomaterials, Artificial Cells and Artificial Organs 16(1-3): 57-69(1988): DeVenuto, F. und Zegna, A., "Preparation and evaluation of pyridoxalated-polymerized human hemoglobin". J. Surgical Research 34: 205-212 (1983)). Es wurde jedoch festgestellt, daß Pyridoxylierung mit Polymerisation in Wechselwirkung tritt, so daß viel des pyridoxylierten Hb unpolymerisiert bleiben würde, wohingegen das polymerisierte Hb nicht pyridoxyliert sein würde. Als Konsequenz davon würde nach Infusion der Lösung das Hb mit guter O&sub2; Transportfunktion rasch über die Niere ausgeschieden werden, wohingegen das in der Zirkulation verbleibende Hb von hoher O&sub2; Affinität sein würde.
Über die letzten paar Jahre sind Fragen aufgeworfen worden, die eine intrinsiche Toxizität von Hämoglobin betreffen. Einerseits sind experimentelle Beobachtungen einer Vasokonstriktorwirkung von Hb berichtet worden. Andererseits tendiert Hb dazu, met-Hb zu autooxydieren, d. h. das Häm-Eisen oxdiert aus dem Eisen +2 zu dem Eisen +3 Zustand, was toxische freie Sauerstoff-Radikale erzeugt. Im Hinblick hierauf ist spekuliert worden, daß Hb als ein Prooxydans wirken kann, wenn in die Zirkulation infundiert. Dieses würde die Lipoperoxydation von Zellmembranen erzeugen und Verletzung von Zellstrukturen hervorrufen. Diese beiden Wirkungen. Vasokonstriktion und Erzeugung von freien Sauerstoff-Radikalen würden die ischämisch-hypoxischen Verletzungen, erzeugt durch Hämorrhagie, eher verschlimmern als erleichtern. Vorhergehende experimentelle Untersuchungen durch den gegenwärtigen Erfinder und Mitarbeiter zeigen, daß sowohl Vasokonstriktion wie die Erzeugung von Radikalen kontrolliert werden können durch die Durchführung der folgenden drei Schritte.
(1) Vollständige Reinigung von Hb
(2) Herstellung und Stabilisierung von einem Hb mit geringen Spiegeln von met-Hb Bildung.
(3) Zufügen von Sauerstoffradikalfängern
Letztendlich trägt die Verabreichung von nativen Hb Lösungen das Risiko, produktübertragbare Blutkrankheiten zu übertragen. Während Bakterien und Parasiten leicht mittels Filtration oder Ultrafiltration entfernt werden können, stellen Viren ein ernsthafteres Problem dar. Zwei Verfahren von Virusinaktivierung sind in der Technik bekannt. Eines ist ein physikalisches Verfahren, welches darin besteht, Hämoglobin in dessen Deoxy-Form bei 60% und pH 7,5 10 Stunden lang zu pasteurisieren. Es ist festgestellt worden, daß dieses Verfahren Modellviren wie Sindbis-, Polio- und Pseudorabiesviren so wie das Humane Immunodefizienz Virus (HIV) inaktiviert. Das andere ist ein chemisches Verfahren, das aus Chloroformbehandlung besteht. Beide Verfahren erzeugen jedoch beträchtliche Denaturierung von Hb, sofern nicht besondere Maßnahmen unternommen werden.
Somit besteht noch eine Notwendigkeit für einen verbesserten Blutersatz, welcher stabil ist, geringe Sauerstoffaffinität hat, dem es an Toxizität fehlt, und der frei von blutübertragbaren Krankheitsteilchen ist.
Diese vorliegende Erfindung liefert eine Zusammensetzung für die Verwendung als Blutersatz, umfassend pyrogenfreies, pathogenfreies, aktives Hämoglobin, welches mit o-ATP und o-Adenosin umgesetzt worden ist um ein vernetztes Produkte zu bilden, und ferner mit reduziertem Glutathion umgesetzt worden ist, wobei das Hämoglobin intramolekular mit dem o-ATP und intermolekular mit dem o-Adenosin vernetzt ist, und wobei das Molverhältnis Hämoglobin: o-ATP: o-Adenosin: reduziertes Glutathion der Zusammensetzung im wesentlichen 1 : 3 : 10 : 20 beträgt. Vorzugsweise wird die Zusammensetzung in einer nicht elektrolytischen wäßrigen Lösung gelöst und unmittelbar vor Verwendung mit beispielsweise Manitol, Elektrolyten und wahlweise anderen pharmazeutisch verträglichen Additiven angereichert.
Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Verfahren zum Herstellen einer Zusammensetzung, die geeignet für die Verwendung als ein Blutersatz ist, umfassend Trennen von Vollblut in eine Leukozyten-Erythrozyten-Mischung und Thrombozyten und Plasma und Suspendieren der auf diese Weise erhaltenen Mischung in eine wäßrige Lösung; Abkühlen der wäßrigen Lösung, die die Leukozyten- Erythrozytenmischung umfaßt unter Aggregieren der Leukozyten und Entfernen des Leukozytenaggregats unter Erhalten einer im wesentlichen leukozytenfreien Lösung;
Dialysieren der im wesentlichen leukozytenfreien Lösung gegen eine hypotonische Lösung unter Extrahieren von Hämoglobin aus Erythrozyten in der im wesentlichen leukozytenfreien Lösung und Heraustrennen der Erythrozyten von dem extrahierten Hämoglobin in der im wesentlichen leukozytenfreien Lösung durch Ultrafiltration unter erhöhtem hydrostatischen Druck, wodurch eine extrahierte Hämoglobinlösung erhalten wird;
Umwandeln des extrahierten Hämoglobins in der extrahierten Hämoglobinlösung zu Carboxy-Hämoglobin, wodurch eine Carboxy-Hämoglobinlösung erhalten wird: Pasteurisieren der Carboxy-Hämoglobin-Lösung unter Denaturieren und Fällen von Nicht-Häm Proteinen;
Entfernen von Phospholipiden und gefällten Nicht-Häm-Proteinen aus der Carboxy- Hämoglobin-Lösung; Entfernen von Endotoxinen aus der Carboxy-Hämoglobinlösung durch Affinitätschromatographie;
Konzentrieren des Carboxy-Hämoglobins in der Carboxy-Hämoglobinlösung zu einer Konzentration von etwa 10 g/dl zum Erhalten einer konzentrierten Carboxy-Hämoglobin-Lösung;
Umsetzen des Carboxyhämoglobins in der konzentrierten Carboxy-Hämoglobinlösung mit o-ATP unter Bewirken von vorwiegend intramolekularem Vernetzen von Carboxy-Hämoglobin, wobei auf diese Weise eine Lösung von intramolekular vernetztem Carboxy-Hämoglobin erhalten wird;
Umsetzen des o-ATP Carboxyhämoglobins mit o-Adenosin in einer Menge, die wirksam ist, vorwiegend intermolekulares Vernetzen von Carboxyhämoglobin zu bewirken, wodurch eine Lösung von intermolekular und intramolekular vernetztem Carboxy-Hämoglobin erhalten wird, und Hinzufügen von reduziertem Glutathion zu der Lösung von intermolekular und intramolekular vernetztem Carboxy-Hämoglobin, wodurch die o-Adenosin Vernetzungsreaktion gestillt wird und ferner der isoelektrische Punkt der Hämoglobin-Moleküle verringert wird;
Umwandeln des vernetzten Carboxy-Hämoglobins in der Lösung von intermolekular und intramolekular vernetztem Hämoglobin zu einer Lösung von vernetztem Oxy-Hämoglobin in der Abwesenheit von Elektrolyten, und Bilden einer Lösung von pharmazeutisch verträglichem vernetztem Oxyhämoglobin.
Das sich ergebende Produkt ist stabil, hat eine Zirkulationshalbwertszeit von etwa 24 Stunden, hat eine geringe Sauerstoffaffinität und einen P&sub5;&sub0; Wert ähnlich zu demjenigen von Blut und ist frei von Toxizität und durch Blut übertragbare Krankheiten.
Diese Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung einer Zusammensetzung oder eines Blutersatzes, wie hier beschrieben, bei der Herstellung eines Medikaments für die Verwendung beim Behandeln eines Menschen mit Sichelzellenanämie, befallen mit einer Sichelzellenbildungskrise, umfassend intravenöses Verabreichen an den Menschen eines Volumen des Blutersatzes der Erfindung, wirksam zum Verbessern von Sichelzellbildungssymptomen.
Diese Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung einer Zusammensetzung oder Blutersatzes, wie hier beschrieben, bei der Herstellung eines Medikaments für die Verwendung beim Behandeln eines Menschen, der Blutersatz benötigt, umfassend intravenöses Verabreichen eines Volumens des Blutersatzes der Erfindung an den Menschen, welches wirksam ist, Blutvolumen und/oder Funktion wieder zu ergänzen.
Eine vollständigere Würdigung der Erfindung und viele der begleitenden Vorteile davon können leicht wahrgenommen werden, wenn dieselbe unter Bezugnahme auf die nachfolgende detaillierte Beschreibung der Ausführungsformen der Erfindung besser verstanden wird, und wenn in Verbindung mit den folgenden Zeichnungen betrachtet.
Fig. 1 zeigt eine Spektrumanalyse von reinem Rinder Hb, erhalten durch HPLC mit einer Größenausschlußsäule. Das Chromatogramm zeigt einen einzelnen Peak, angeordnet bei 9,4 Minuten, der Hb in tetramerer Form (64 000 Dalton) identifiziert.
Fig. 2 zeigt eine Spektrumanalyse von reinem Rinderhämoglobin, erhalten durch HPLC mit DEAE Säule. Das Chromatogramm zeigt verschiedene Peaks, angeordnet zwischen 20 und 36 Minuten, welche unterschiedlichen isoelektrischen Punkten von verschiedenen Hb Komponenten entsprechen.
Fig. 3A und 3B zeigen den Spektrumindex von Rinderhämoglobin vor (3A) und nach (3B) Reinigung durch Pasteurisierung (HPLC mit DEAE Säule, Spektrumwellenlänge 230-599 nm). In Fig. 3A sind Nicht-Hb Proteine sichtbar, angeordnet bei Retentionszeiten von 17 und 51 Minuten. In Fig. 3B sind nicht-Hb Proteine nicht länger sichtbar.
Fig. 4 zeigt eine Spektrumanalyse durch HPLC-Größenausschluß von Rinder Hb, intramolekular vernetzt mit o-ATP und intermolekular mit o-Adenosin, und kombiniert mit reduziertem Glutathion. Das Chromatogramm zeigt ein Hb Molekülaggregat, welches sechs Peaks enthält.
Fig. 5 zeigt eine Spektrumanalyse durch HPLC-DEAE Säule von Rinder Hb, modifiziert wie in Fig. 4. Das Chromatogramm zeigt einen einzelnen Peak bei einer Retentionszeit von 51 Minuten. Der isoelektrische Punkt von Hb wird verschoben im Vergleich zu unmodifiziertem Hb aufgrund eines Anstiegs an elektronegativen Oberflächenladungen.
Fig. 6 zeigt Untersuchung durch isoelektrisches Fokussieren (IEF-Pharmacia).
Fig. 7 zeigt die 258 nm Extinktion von aufeinanderfolgenden Fraktionen der o-ATP und Natriumperjodatreaktionsmischung, eluiert von einer Sephadexsäule mit Wasser.
Fig. 8 zeigt die 258 nm und 232 nm Extinktionen von aufeinanderfolgenden Fraktionen der o-Adenosin- und Natriumperjodat-Reaktionsmischung, eluiert von einer Anionenaustauschersäule mit Eluat A.
Andere Ziele, Vorteile und Merkmale der Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden den Fachleuten aus der nachfolgenden Diskussion offensichtlich.
Diese Erfindung entstand aus einem Wunsch der Erfinder, Behandlungen des Standes der Technik, welche den Ersatz von menschlichem Blut betreffen, zu verbessern. Die vorliegende Technologie liefert eine sichere und wirksame Maßnahme für Blutersatz in Fällen von akutem Blutverlust wie zum Behandeln von Patienten, welche an Blutkrankheiten leiden, die einen schnellen und wirksamen Ersatz von mindestens einem Teil ihres Blutvolumens benötigen, um symptomatische Krisen zu verhindern und/oder zu mildern. Ein Beispiel einer derartigen Situation ist diejenige von Patienten, die an Sichelzellenanämie leiden. Wenn diese Patienten in eine Sichelzellbildungskrise eintreten, kann ihnen intravenös der Blutersatz dieser Erfindung verabreicht werden, welches eine unerwartet überlegene Milderung der Symptome erzeugt, die von der Krise hervorgebracht werden.
Die vorliegende Erfindung liefert eine Zusammensetzung, die im wesentlichen pyrogenfreies, mikrobenfreies, aktives Hämoglobin umfaßt, das mit o-ATP und o-Adenosin unter Bilden eines vernetzten Hämoglobins umgesetzt ist.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform verwendet die vorliegende Zusammensetzung Rinder-Hämoglobin. Es können jedoch andere Quellen von Hämoglobin auch hier verwendet werden.
Das vernetzte Hämoglobin der Erfindung wird ferner mit reduziertem Glutathion umgesetzt, um die Vernetzungsreaktion mit o-Adenosin zu beenden, welches auch die Wirkung des Herabsetzens des isoelektrischen Punktes von Hb hat.
Das o-ATP kann ein Perjodat-oxydiertes ATP sein, und das o-Adenosin kann perjodat- oxydiertes Adenosin sein. Somit kann das Hämoglobin intramolekular mit dem perjodat- oxydierten ATP vernetzt sein und intermolekular mit dem perjodatoxydierten Adenosin vernetzt sein, wodurch ein Polyhämoglobin gebildet wird.
Weil o-ATP und o-Adenosin zwei Purin (P) Derivate sind, wird das Produkt hier als Hb-PP-GSH bezeichnet.
Die Zusammensetzung umfaßt Hämoglobin, o-ATP, o-Adenosin und Glutathion in molaren Verhältnissen von etwa 1 : 3 : 10 : 20. Das vernetzte Hämoglobin der Erfindung hat vorzugsweise ein Molekulargewicht von etwa 130 bis 390 Kilodalton und bevorzugter etwa 190 bis 260 Kilodalton Molekulargewicht. Eine noch bevorzugtere Form der Zusammensetzung ist diejenige, wo das Hämoglobin weniger als etwa 5% Met-Hämoglobin umfaßt.
In einer äußerst bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Hämoglobin der Erfindung Rinderhämoglobin.
Die Hämoglobin (Hb) Herstellung dieser Erfindung kombiniert die folgenden günstigen Eigenschaften ihrer Bestandteile.
(1) Wirksamer Sauerstoffträger. Rinder Hb insbesondere hat eine natürlich niedrige Sauerstoffaffinität (P&sub5;&sub0; Wert von 28 mm Hg), die nicht durch die verschiedenen chemischen Reaktionen beeinflußt wird.
(2) Wirksames Plasmavolumen. Hb ist sowohl intra- wie intermolekular vernetzt und hat somit verlängerte intravaskuläre Persistenz (Halbwertszeit 24 Stunden).
(3) Gefäßerweiternde Eigenschaften. Beide Purinderivate kombiniert mit Hb entspannen Norepinephrin-induzierte Vasokonstriktion.
(4) Bewirkt nicht einen Pro-Oxidans Effekt aufgrund des Vorhandenseins von reduziertem Glutathion und Mannitol.
Die günstigen Eigenschaften von Rinder Hb sind gezeigt worden (Feola. M., et al., "Development of a bovine stroma-free hemoglobin solution as a blood substitute", Surgery, Gynecology and Obstetrics 157: 399-408 (1983)). Neben seiner Verfügbarkeit im großen Umfang und dem Vermeiden von übertragbaren Krankheiten, die dem menschlichen Blut eigen sind, insbesondere AIDS, hat Rinder Hb, gelöst in einer physiologischen Kochsalzlösung, einen P&sub5;&sub0; Wert von mehr als doppelt demjenigen von Human Hb (28 gegenüber 13 mm Hg) und benötigt keine 2,3-DPG Modulation.
Diese Erfindung liefert auch einen Blutersatz, der das im wesentlichen pyrogenfreie, mikrobenfreie, aktive Hämoglobin (Hb) der Erfindung, vernetzt mit o-ATP und o-Adenosin, gelöst in einem pharmazeutisch verträglichen flüssigen Träger umfaßt. In einer äußerst bevorzugten Ausführungsform ist der Träger eine pharmazeutisch verträgliche Lösung und bevorzugter eine wäßrige Lösung. Jedwege Lösung, welche nicht mit den funktionellen Eigenschaften von Hb in Wechselwirkung tritt, ist für die Verwendung hier geeignet. Die wäßrige Lösung kann ferner Nicht-Elektrolyten und/oder Elektrolyten umfassen.
Eine Ausführungsform der Erfindung liefert eine Lösung, welche eine nicht- elektrolytische wäßrige Lösung ist. Diese Ausführungsform ist in Beispiel 1 gezeigt. Beispiele von Nicht-Elektrolyten, die zu der wäßrigen Lösung des vernetzten Hämoglobins der Erfindung hinzugefügt werden können, sind Humanalbumin, unterschiedliche Plasmafraktionen und Plasma. Jedoch kann irgendein Nicht-Elektrolyt, der pharmazeutisch verträglich ist und nicht mit der sauerstoff-tragenden Funktion ...des vernetzten Hämoglobins der Erfindung in Wechselwirkung tritt, auch verwendet werden, wie beispielsweise Dextran und Hydroxyethylstärke.
In einer anderen Ausführungsform ist der Träger eine pharmazeutisch verträgliche wäßrige Lösung, die Elektrolyte enthält. Dieses ist in Beispielen 2-4 dargestellt. Typischerweise sind Elektrolyten, die in dem Blutersatz der Erfindung verwendet werden können, Natrium-, Kalium-, Calcium- und Magnesiumkationen und Chlorid-, Bicarbonat-, Gluconat- und Sulfatanionen. Die folgenden sind nur Beispiele, obwohl andere auch verwendet werden können. Injizierbares (steriles, pyrogen-freies) Wasser, pH etwa 8,1-8,2, eingestellt durch die Zugabe von sterilem pyrogen-freiem Puffer, THAM Lösung (Tromethamine Injectable; Abbott Laboratories, North Chicago, 11); injizierbare Wasser-THAM Lösung plus hinzugefügte Elektrolyten wie beispielsweise 113 meq/l Natriumchlorid, 27 meq/l Natriumbicarbonat, 4 meq/l Kaliumchlorid, 5 meq/l Calciumgluconat, 3,5 meq/l Magnesiumsulfat; elektrolyten-balanzierte physiologische Kochsalzlösung (Normosol R, pH 7,4, enthaltend 140 meq/l Natrium, 5 meq/l Kalium, 3 meq/l Magnesium, 98 meq/l Chlorid, 27 meq/l Acetat und 23 meq/l Gluconat; Abbot Laboratories); und laktatisierte Ringer Lösung, enthaltend 130 meq/l Natrium, 4 meq/l Kalium, 3 meq/l Calcium, 109 meq/l Chlorid und 28 meq/l Lactat (Abbott Laboratories) unter anderem.
In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Sauerstoffaffinität von Rinder Hb ferner erniedrigt werden, indem die Konzentration von Chloridionen in dem Blutersatz erhöht wird. Dieses kann erreicht werden, indem etwa 10 bis 25 meq/l Chlorid/l Blutersatz und bevorzugter etwa 15 meq Chlorid/l Blutersatz hinzugefügt werden.
Im Hinblick auf potentielle immunologische Probleme ist die Durchführbarkeit von Hb Transfusionen über unterschiedliche Säugerarten gut in der Technik dargestellt worden. Reines Rinderhämoglobin ist wiederholt verabreicht worden, bis zu 6mal an Kaninchen und Affen in Volumen, die 1/3 bis 1/2 von berechneten Blutvolumen ohne klinischen Nachweis einer Reaktion und ohne Bildung von durch den Ouchterlony's Test nachweisbaren Antikörpern entsprechen (Feola, M. et al., "Immunologic biocompatibility of hemoglobin solutions", Transfusione del sangue (Italian) 33: 121-128 (1988)).
Um eine Hb Lösung frei von bakteriellen Endotoxinen herzustellen, ist die bei dem vorliegenden Verfahren der Herstellung verwendete Strategie im allgemeinen eher eine des Verhinderns als des Korrigierens von Kontamination. Wenn die Affinität von Endotoxin für Hämoglobin gegeben ist, ist, sowie einmal signifikante Kontamination aufgetreten ist.
Reinigung äußerst schwierig, wenn nicht unmöglich zu erzielen. Die wesentliche Verhinderung der Kontamination benötigt das folgende:
(1) Das Ausgangsmaterial ist minimal kontaminiert.
(2) Die Herstellungsschritte sind in einem geschlossenen System durchzuführen.
(3) Alle Oberflächen, die in Kontakt mit Hb kommen, müssen steril und pyrogenfrei sein.
(4) Alle Chemikalien müssen rein sein.
(5) Alle Lösungen müssen steril und pyrogenfrei sein.
(6) Qualitätskontrolle muß bei jedem Schritt angeordnet sein.
Das empfindlicheste Verfahren für den Nachweis von Endotoxin ist der "quantitative chromogene Limulus Test" (QCL-1000. Whittaker Bioproducts). Wenn festgestellt wird, daß das Ausgangsmaterial oder das Hämoglobin bei irgendeinem präparativen Schritt mehr als 2 EU/ml enthält, wird es verworfen. Durch Aufrechterhalten eines niedrigen Spiegels von Kontamination während des Verfahrens kann vollständige Reinigung durch Endpassage der Lösung durch eine Affinitätschromatographiesäule erzielt werden, wie beispielsweise das Detoxi-Gel (Pierce Chemical Company).
Das gleiche Prinzip der Vermeidung von grober Kontamination, gekoppelt mit Endreinigung, wird auf die Entfernung von Stromaphospholipiden und insbesondere Aminophospholipiden angewendet. Um Stromakontamination abzuhelfen, führt das vorliegende Verfahren bekannte Technologie für Dialyse von roten Blutzellen (RBC) und Ultrafiltration (DeLoach, J. R., et al., Analytical Biochemistry 157: 191-198 (1986)) ein. Gemäß dem DeLoach Verfahren werden die RBCs zuerst analysiert, wobei eine künstliche Travenol Niere gegenüber einer hypotonischen Phosphatlösung verwendet wird, bis die RBC Suspension eine Osmolarität von etwa 150 bis 200 mOsm/l, und bevorzugter etwa 160 mOsm/l erzielt.
An diesem Punkt nehmen die RBCs eine sphärische Form an, und die Poren der Zellmembran werden gedehnt. Die Zellen werden dann Ultrafiltration durch ein etwa 0,1 um Porenamiconfilter unter einem Säulendruck von etwa 3,55-10,53 · 10³ kg/m² (5 bis 15 psi) und bevorzugter etwa 7,031 · 10³ kg/m² (10 psi) ausgesetzt. Somit wird Hb aus den Zellen ohne Zerstörung der Zellmembranen gedrückt. In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird ein einzelnes geschlossenes System sowohl für die Dialyse wie die Ultrafiltration der RBCs verwendet. Dieser Schritt ist steril, pyrogen-frei und verfügbar. Die Dialysenflüssigkeit umfaßt beispielsweise steriles, pyrogen-freies entionisiertes Wasser, eingestellt auf einen pH Wert von etwa 8,0 bis 8,4 und bevorzugter etwa 8,2 mit beispielsweise einer Tham Lösung anstelle einer Phosphatlösung, welche Hämoglobinoxidation reduziert. Es können jedoch auch andere Nicht-Elektrolyten verwendet werden. Das Ergebnis dieses Verfahrens ist eine Hb Lösung, umfassend 3 bis 5 mg/dl Phospholipid, gemessen durch den "Phospholipid Test Satz" (Boehringer-Manheim Diagnostics, Indianapolis, IN), mit nur Spuren der Aminophospholipide PE und PS, wie mittels Dünnschichtchromatographie bestimmt. Das restliche Phospholipid kann beispielsweise durch Chloroform-Extraktion entfernt werden. Wegen des geringen Spiegels von vorhandenem Phospholipid kann dieser Schritt mit geringen Konzentrationen von Chloroform für Kurzzeit-Zentrifugationen durchgeführt werden. Die Denaturierung von Hb kann auf diese Weise verhindert werden. Die Entfernung von Phospholipid kann jedoch mithilfe anderer in der Technik bekannter Mittel durchgeführt werden, solange wie Sorgfalt angewendet wird, um Proteindenaturierung zu vermeiden oder zu minimieren.
Die gleichen Prinzipien gelten für die Reinigung von Hb aus Nicht-Häm Proteinen und Peptiden. In diesem Fall umfaßt ein erster Schritt die Entfernung aller Plasmaproteine während der "Reinigung" von roten Blutzellen. Die Extraktion des Hb von RBCs kann hier ohne Zerstörung von roten Zellmembranen im großen Umfang durchgeführt werden, wodurch somit auch Kontamination mit Stromaproteinen verhindert wird. Hb Reinigung kann dann durch selektive Wärmefällung erzielt werden (Belter. P. A., Cussler. E. L., Hu, W. S., Herausgeber, Bioseparations, John Wiley & Sons, New York, Seiten 227-229 (1988). Bei diesem Verfahren wird die Denaturierung und die Fällung von Proteinen durch Erhöhen der Temperatur auf etwa 56 bis 72ºC und bevorzugter etwa 60 bis 70ºC erzielt. Dieser Behandlung der Proteine folgt chemischer Kinetik erster Ordnung mit einer Arrhenius-Temperatur-Abhängigkeit. Somit
wobei P die gelöste Proteinkonzentration ist. Die Geschwindigkeitskonstante K ist durch die Formel gegeben:
K = K&sub0;EE/RT
wobei K&sub0; eine charakteristische Konstante ist. E/R ist die Aktivierungsenergie der Denaturierung, und T ist die Temperatur. Die Denaturierungsenergie variiert von einem Protein zum anderen. Weil E exponentiell in der Gleichung erscheint, hat es eine große Wirkung, wenn die Temperatur gerade leicht verändert wird. Diese Energie wird auch durch Änderungen im pH beeinflußt. Bei Sättigung mit Kohlenmonoxid widersteht das Hb (HbCO) durch Temperatur induzierter Fällung bei einem pH Wert von etwa 7,6 bis 7,8. Somit kann die Pasteurisierung einer HbCO Lösung bei einer Temperatur von etwa 56 bis 64ºC und bevorzugter bei 60ºC 9 Stunden lang durchgeführt werden, gefolgt von Pasteurisierung bei einer Temperatur von etwa 68 bis 74ºC und bevorzugter etwa 70ºC für etwa 0,45 bis 1,15 Stunden, und bevorzugter etwa 1 Stunde bei einem pH Wert von etwa 7,6 bis 7,8 bei einer Konzentration von etwa 8 bis 12 g/dl HbCO, und bevorzugter etwa 10 g/dl. Diese Bedingungen fällen alle Nicht-Häm Proteine mit geringer Denaturierung von Hb. Das Fehlen von Nicht- Hämoglobin-Proteinen in der Lösung, wie mit Hilfe des vorliegenden Verfahrens hergestellt, ist durch isoelektrisches Fokussieren (IEF) und durch Größenausschluß- und Anionenaustauschhochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) verifiziert worden. Die Nicht-Denaturierung von gewonnenem Hämoglobin wurde durch das Fehlen von "Beschmutzen" von fokussierten Banden auf IEF und durch die Erhaltung seiner Sauerstofftransport-Funktion (Sauerstoff-Dissoziationskurven, P&sub5;&sub0;, Bohreffekt) gezeigt.
Ein Nebenprodukt der vorliegenden Reinigung ist die Inaktivierung von Viren. Tatsächlich ist festgestellt worden, daß Chloroformextraktion eine Anzahl von lipidumhüllten Viren, wie beispielsweise Hepatitis B, Nicht-A Nicht-B Hepatitis. Vaccinia- und Poxviren sowohl in Plasma wie in Serum inaktiviert (Feinston, S. M. et al., "Inactivation of Hepatitis B virus, and non-A, non-B hepatitis by chloroform", Infection and Immunity 41 : 816-821 (1983)). Einige Viren, denen Lipide fehlen, wie beispielsweise Reoviren, können auch teilweise mit Chloroform inaktiviert werden. Andererseits inaktiviert Pasteurisierung bei einer Temperatur von etwa 56 bis 64ºC, und bevorzugter etwa 60ºC etwa 9 bis 12 Stunden lang, und bevorzugter etwa 10 Stunden lang ei ne Anzahl von Nicht-Lipid verhüllten Viren wie den humanen Immuno Defizienz Virus (HIV)(Estep, T. N., et al., "Virus Inactivation in Hemoglobin Solutions by Heat", Biomaterials, Artificial Cells, and Artificial Organs 16 (1-3): 129-1343 (1988).
Wegen der bekannten unerwünschten Wirkungen von Glutaraldehydpolymerisation stabilisiert das vorliegende Verfahren das Hb Molekül in tetramerer Form durch Verwenden eines Dialdehydderivats von Adenosin 5'-triphosphat (o-ATP). Das ATP Molekül hat drei Grundkomponenten: die Purinbase Adenin, den Zucker D-Ribose und eine Triphosphatkette, wie gesehen werden kann, wie im nachfolgenden gezeigt. ATP (Adenosintriphosphat)
Die Oxydation von ATP mit Natriumperjodat öffnet den Ribosering an der 2',3'-cis Stelle und transformiert das 2',3'-Diol in das entsprechende Dialdehyd (Lowe, P. N., et al., "Preparation and chemical properties of periodate-oxidized adenosine triphosphate and some related compounds", Biochem. Soc. Transact. 7: 1131-1133 (1979)), wie im nachfolgenden dargestellt.
Jede Aldehydgruppe des o-ATP Moleküls kann mit der -Aminogruppe von Lysin unter Bilden eines Schiffschen Basen Addukts der folgenden chemischen Formel reagieren.
(HB)-NH&sub2; + OCH-ATP → (HB)- N = CH-ATP
Die 2,3-DPG Tasche von Hb ist die Region innerhalb des Hb Moleküls, die 2,3-DPG bindet. Weil diese Region zwei Lysine enthält, ist es möglich, o-ATP zu verwenden, um diese Gruppen unter Stabilisieren des Molekül sin seiner tetrameren Form zu vernetzen. Das Vorhandensein der Triphosphatkette erhöht die Spezifität dieser Reaktion. Diese Spezifität ist für andere Polyphosphate wie Pyridoxal-5'-phosphat gezeigt worden. Der Vorteil von ATP über andere Verbindungen wird durch den Adenin Anteil geliefert. In vivo hydrolysiert ATP zu ADP, AMP und letztendlich zu Adenosin. Es ist festgestellt worden, daß diese Hydrolyse günstige pharmakologische Wirkungen wie Vasodilatation sowohl in den systemischen wie Pulmonalzirkulationen erzeugt. Zusätzliche günstige Wirkungen sind gezeigt worden, wenn ATP in Kombination mit Magnesiumchlorid (MgCl&sub2;) in Hämorrhagieschock gegeben wird. Diese günstigen Wirkungen umfassen eine Verbesserung der Mikrozirkulation, eine Verbesserung der Zellmembranfunktion und eine "primernde" Wirkung auf die Wiederherstellung von intrazellulären Adeninnucleotiden (Chaudry, I. H. and Baue, A. E., "Overview of hemorrhagic shock", Pathophysiology of Shock, Anoxia and Ischemia, Cowley, R. A., und Trump, B. F., Herausgeber, Williams und Wilkins, Baltimore, MD, Seiten 203-219 (1982)).
Wie zuvor bemerkt, waren vorhergehende Versuche zum Vernetzen von Hb mit o-ATP nicht erfolgreich, weil die chemische Reaktion unakzeptable Spiegel von met-Hb (bis zu 30%) erzeugt, und das o-ATP modifizierte Hb noch eine kurze intravaskuläre Persistenz hat.
Jedoch beruht die Oxydationsmittelwirkung von o-ATP auf Spuren von in der Verbindung vorhandenem Jodat (IO&sub4;&supmin; und IO&sub3;&supmin;). Tatsächlich korrigiert eine vollständige Reinigung von o-ATP (siehe Beispiel 10) im wesentlichen jenes Problem. Zusätzlich kann die Bildung von met-Hb eher durch Reaktion von o-ATP mit Carboxy-Hb als mit Deoxy-Hb minimiert werden, wie zuvor durchgeführt worden ist. Die Reaktion von o-ATP mit HbCO findet statt, wenn der pH der Lösung auf etwa 7,25 bis 7,15 reduziert wird, und insbesondere wenn auf etwa 7,20 reduziert wird.
Es bleibt jedoch das Problem der kurzen intravaskulären Persistenz. Die gegenwärtigen Erfinder haben festgestellt, daß intramolekular vernetztes tetrameres Hb noch durch die Nierenglomeruli filtriert wird und den Nierenkanälen Schaden zufügt. Deshalb ist es notwendig, Hämoglobin sowohl inter- wie intramolekular zu vernetzen, wenn angemessene intravaskuläre Retentionszeiten zu erzielen und Nierenschaden zu vermeiden ist.
Die vorliegende Erfindung verwendet ein zweites Purinderivat, ein Dialdehydderivat von Adenosin oder perjodat-oxydiertem Adenosin (o-Adenosin) als ein zweites Vernetzungsmittel. Das Hb Molekül trägt 44 Lysinaminogruppen auf seiner Oberfläche. Somit ist es möglich, o-Adenosin zu verwenden, zwei oder mehrere dieser Gruppen zu überbrücken, wodurch zwei oder mehrere der Hb Tetrameren gebunden werden. Die Vorteile von Adenosin über andere Verbindungen sind mehrere. Aufgrund des Vorhandenseins von Adenin hat Adenosin Vasodilatatorwirkung ähnlich zu derjenigen von ATP (Su, C., "Extracellular functions of nucleotides in heart and blood vessels". Annual Review of Physiology 47: 665-676 (1985). Zusätzlich inhibiert Adenosin Thrombozytenaggregation und verbessert Glomerulusfiltration in der Niere. Beide dieser Wirkungen sind günstig nach Hämorrhagie und Reperfusion (Berne, R. M., Regulatory Functions of Adenosine, Martin Nijhoff Publisher. Boston. MA (1983)).
Die Reaktion von Hb mit o-Adenosin war vor dieser Erfindung unbekannt. Es ist wichtig, daß die Reaktion mit Hämoglobin in dessen Carboxy (HbCO) Form durchgeführt wird, um met-Hb Bildung zu reduzieren. Letztendlich schreitet die Reaktion langsamer bei niedrigeren Temperaturen voran, beispielsweise bei etwa 25 bis 10%, und sehr langsam bei etwa 4ºC. Diese Bedingungen sind wünschenswert, weil sie ermöglichen, daß die Reaktion zu jeder Zeit nach der Bildung des gewünschten Molekülaggregats beendet werden kann. Dieses ermöglicht die Herstellung von Hb Polymeren von unterschiedlichen Molekülgrößen in einer geplanten und reproduzierbaren Weise, welche nicht mit anderen Vernetzungsmitteln wie beispielsweise Glutaraldehyd erzielt werden kann. Das Vernetzen von Hb mit o-Adenosin kann beendet werden durch Hinzufügen von reduziertem Glutathion (GSH), welches ähnlich zu Lysin eine -Aminogruppe trägt. Durch Eintreten dieser Reaktion wird GSH Teil der Hb Zusammensetzung.
GSH ist das Beendigungsmittel, weil es reichlich in den roten Blutzellen vorhanden ist, wo dessen primäre Funktion darin besteht, als eine "Oxydationsmittelfalle" zu arbeiten, die Hämoglobin vor Oxidationsmittelbeanspruchung schützt (Larson, A., Functions of Glutathione: Biochemical, Physiological, Toxicological and Clinical Aspects, Raven Press. New York (1983)). GSH schützt Hämoglobin in Lösung wie in der Erythrozytenumgebung. Das Vernetzen von Hb mit o-Adenosin, gefolgt durch Reaktion mit GSH, erzeugt einen Anstieg an elektronegativen Ladungen auf der Oberfläche des Hb Moleküls mt einer Reduzierung des isoelektrischen Punkts von Hb von etwa 6,8 auf 6,1-6,2. Dieses thägt zu der Stabilisierung von Hämoglobin bei und verlängert dessen intravaskuäre Persistenz durch Verhindern von dessen Filtration durch die Niere.
o-ATP und o-Adenosin können aus kommerziellen Quellen erhalten (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) oder gemäß den Verfahren hergestellt werden, die im nachfolgenden als Beispiele 10 und 11 beschrieben sind. Reduziertes Glutathion kann aus einer kommerziellen Quelle erhalten werden.
Im Anschluß an diese Reaktionen und die Rückwandlung von Carboxyhämoglobin in Oxy- Hämoglobin können die erhaltenen Verbindungen (Hb-PP-GSH) in verschiedenen Medien gelöst werden, was von den Lagerbedingungen abhängt. Wenn die Lösung mehrere Monate oder sogar Jahre zu lagern ist, kann das (Hb-PP-GSH) gelöst in "injizierbarem", sterilem, pyrogenfreiem Wasser, pH etwa 8,1-8,2, eingestellt durch Zugabe von 20 mM THAM Lösung. gelassen werden. Die vorliegenden Erfinder haben festgestellt, daß Hb. gelöst in Wasser bei einem alkalischen pH von 8,1-8,2, weniger Autooxidation unterliegt und längere Zeitperioden als Hb gelöst in einer Elektrolytlösung bei etwa pH 7,4, gelagert werden kann. In diesem Fall können Elektrolyten zu der Lösung unmittelbar vor Verwendung (siehe zuvor angegebene Beispiele) hinzugegeben werden. Wenn andererseits die Lösung innerhalb von Stunden oder Tagen zu verwenden ist, kann das (Hb-PP-GSH) direkt in einer elektrolyten-balancierten physiologischen Kochsalzlösung wie Normal R (siehe zuvor angegebene Beispiele) gelöst werden. Die Verbindung kann alternativ in einer laktatisierten Ringer Lösung (siehe zuvor angegebene Beispiele) oder in einer hypotonischen oder isotonischen Natriumchloridlösung unter anderem gelöst werden. Wenn der Blutersatz der Erfindung für die Behandlung von Hämorrhagieschock zu verwenden ist, kann Magnesiumchlorid (MgCl&sub2;) zu der Lösung hinzugefügt werden: vorzugsweise unmittelbar vor Anwendung in einer Menge, die etwa äquimolar zu dem Gehalt von ATP in der Zusammensetzung ist. Es ist festgestellt worden, daß dieses die günstigen Wirkungen von ATP in Bezug auf die Mikrozirkulation ergänzt und Überschuß von Chloridionen liefert, welche die Affinität von Hb in Bezug auf Sauerstoff herabregulieren und bessere Gewebeoxygenierung liefern. Manitol kann vorzugsweise unmittelbar vor Verwendung hinzugegeben werden, weil bekannt ist, daß es als ein Radikalfänger von OH Radikalen wirkt (die am meisten toxischen von Sauerstoff abstammenden freien Radikale, und vielleicht von anderen Radikalen ebenso (Freeman. B. A. und Crapo, J. D., "Free radicals and tissue injury," Laboratory Investigation 47: 412-426 (1982)). Typischerweise kann Manitol in einer Menge von etwa 0,5 bis 2,0 mg/ml, vorzugsweise etwa 0,8 mg/ml Lösung hinzugegeben werden.
Die vorliegende Erfindung liefert somit eine Zusammensetzung, geeignet als ein Blutersatz, der dazu fähig ist
(a) Plasmavolumen wiederherzustellen und aufrechtzuerhalten
(b) vitale Organe mit Sauerstoff zu versorgen und
(c) Vasokonstriktion nach Hämorrhagie abzuhelfen.
Die Zusammensetzung der Erfindung liefert einen Blutersatz, der frei von Toxizität ist, wenn an Säuger einschließlich Menschen verabreicht, und frei von durch Blut übertragbaren Krankheitsteilchen ist.
Andere Ziele, Merkmale und Vorteile der Erfindung werden im Licht der nachfolgenden detaillierten Beschreibung von bevorzugten beispielhaften Ausführungsformen gemäß der vorliegenden Erfindung einleuchtend.

BEISPIELE

Ein bevorzugtes Verfahren zum Herstellen des komplexen Produktes gemäß dieser Erfindung umfaßt die folgenden fünf Schritte:
(A) Reinigung von roten Blutzellen.
(B) Extraktion von Hämoglobin.
(C) Reinigung von Hämoglobin,
(D) Modifikation von Hämoglobin durch Reaktion mit o-ATP, o-Adenosin und Glutathion.
(E) Herstellung des Endproduktes (Hb-PP-GSH)n.

BEISPIEL 1: Reinigung von Roten Blutzellen (RBCs)

Ein bevorzugtes Ausgangsmaterial der Zusammensetzung der Erfindung ist Rinderblut, wie zuvor diskutiert. Jedoch kann das erfindungsgmäße Verfahren für die Herstellung der Zusammensetzung auf andere Arten von Säugerblut, einschließlich menschliches Blut, als das Ausgangsmaterial angewendet werden. Rinderblut kann von vielfachen gesunden Donatoren oder von individuellen Tieren, die für das Schlachthaus freigegeben sind, erhalten werden. Im ersten Fall wird eine erwachsene Kuh in Schranken gehalten, der Hals wird rasiert und die Haut mit antiseptischer Seife präpariert. Blut wird mittels Punktur der äußeren Halsadervene unter aseptischen Bedingungen abgezogen. Annähernd 1500 ml Blut können von einem Tier, gesammelt in eine 2 l evakuierte, sterile pyrogenfreie Flasche, erhalten werden, die 200 ml ACD Antikoagulans (Virbac, Inc.. Lenexa, Kansas) enthält. In dem zweiten Fall wird, nachdem das Tier vor dem Schlachten betäubt worden ist, eine Seite des Halses schnell "präpariert", und ein Trokar wird perkutan in die Karotisarterie eingeführt. Annähernd 10 l Blut können von jeder erwachsenen Kuh entfernt werden. Blut von unterschiedlichen Tieren wird nicht gemischt. Die Flaschen werden beim Übergang zum Labor auf Eis gehalten.
Es ist wichtig, besonders, wenn von Rinderblut ausgegangen wird, daß die RBCs (Erythrozyten) vollständig von weißen Blutzellen (Leukozyten), Thrombozyten und Plasma abgetrennt werden. Diese Stufe reduziert die Last von Nicht-Häm Proteinen und anderen Substanzen, aus denen Hämoglobin letztendlich gereinigt werden muß. Auch entfernt die Entfernung von allen Leukozyten irgendwelche Viren, die mit diesen Zellen verbunden sind, wie beispielsweise Cytomegalovirus, humanes Immunodefizienz Virus und andere.
Die RBCs werden mittels eines "Spin-Kühl-Filter" Verfahren gereinigt. Der "Spin"- Schritt besteht aus mehrfachen Zentrifugationen, die in geschlossener System-Weise durch Verwendung eines Blutbankzellseparators wie beispielsweise des DIDECO Systems (Electromedics Inc., Englewood, Colorado) auf folgende Weise durchgeführt werden.
Zentrifugation bei 1100 UPM bei 15ºC 20 Minuten lang zum Entfernen von Thrombozyten und Plasma.
Zentrifugation bei 4500 UPM bei 15ºC 10 Minuten lang in Bezug auf vollständigere Plasmaentfernung.
Waschen (x 4) mit isotonischer physiologischer Kochsalzlösung (RBCs/physiologische Kochsalzlösung 1 : 4) durch Zentrifugation bei 4100 UPM bei 4ºC 10 Minuten lang.
Letztendliches Waschen mit isotonischer Tham Lösung, pH 8,1-8,2 (Tham USP, Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois). Dieses ermöglicht die Suspension von gewaschenen RBCs in eine elektrolytfreie Lösung von hohem pH, welche das Hämoglobin vor Oxydation schützt.
Für den "kalten" Teil des Verfahrens werden die RBCs in "Transferpackungen" (sterile, pyrogen-freie Kunststoffbehälter, hergestellt von Fenwal Laboratories, Deerfield, Illinois) bei 4ºC über Nacht oder 18 Stunden lang gelagert. Bei niedrigerer Temperatur tendieren die weißen Blutzellen dazu, in kleinen Klumpen zu aggregieren. Für den "Filter"-Schritt werden die Zellen durch ein 20 u Cellulosefilter, wie beispielsweise das "Hochkapazitäts-Transfusions-Filter", hergestellt von Fenwal, geleitet, welches die Leukozytenaggregate entfernt.
Um das Fehlen von Leukozyten und Thrombozyten festzustellen, werden Zellzählungen unter Verwendung eines Coulter-Zell-Zählers durchgeführt, und das Fehlen von Proteinen in der Suspension wird durch chemische Routineverfahren verifiziert. Das Vorhandensein von bakteriellen Endotoxinen wird durch die Verwendung des "quantitativen chromogenen Limulustests" (QCL-1000, Whittaker Bioproducts, Walkersville, Maryland) bestimmt.

BEISPIEL 2: Extraktion von Hämoglobin

Die Extraktion von Hämoglobin aus RBCs wird in zwei Schritten durchgeführt. Zuerst wird ein Liter von RBCs, suspendiert in isotonischer Tham Lösung, pH 8,1-8,2, bei der Konzentration von 20% (Hämatokrit 0,20) gegen 10 l hypotonische (230 mOsm/l) Tham Lösung mithilfe einer künstlichen Niere mit 0,2 u Porösität wie beispielsweise dem "Krosflo II Filtration Module with 0.93 m² (10 Ft²) Surface Area" (Microgon Inc., Lagung Hills, CA) dialysiert. Die Dialyse wird durchgeführt, bis das Dialysat rötlich an Farbe (Hämoglobin getönt) ist. An diesem Punkt sind die RBCs zu einer sphärischen Form geschwollen, und die gedehnten Zellmembranen werden gegenüber Hb durchlässig. Als zweiter Schritt wird ein 7,06 · 10³ kg/m² (10 psi) Druck auf die künstliche Niere gelegt, wodurch das Hb aus den Zellen ohne Zerstörung der Zellmembranen gedrückt wird. Die Membran "Geister" werden nach einem Durchgang verworfen. Wenn Hämoglobin in das hypotonische Lösungsreservoir eintritt, wird Volumen in dem RBC Reservoir durch die Zugabe von Tham Lösung, 230 mOsm/l aufrechterhalten. Das extrahierte Hämoglobin wird durch ein 0.20 um Filter wie beispielsweise das "Posidyne I. V. Filter" (PALL Biomedical Inc., Fajardo, Puerto Rico) filtriert, wobei aus restlichen Teilchen bestehende Trümmer oder mikrobielle Kontaminanten entfernt und in "Transfer-Packungen" bei 4ºC gelagert werden.
Das Ergebnis dieses Verfahrens ist eine Hb Lösung, die 3-5 mg/dl Phospholipide (gemessen durch Verwendung des "Phospholipid-Testsatzes". Boehringer-Manheim Diagnostics. Indianapolis, Indiana) mit nur Spuren von Aminophospholipiden PE und PS enthält (bestimmt durch Dünnschichtchromatographie).

REINIGUNG VON HÄMOGLOBIN

Diese Reinigung wurde in den folgenden vier Schritten durchgeführt.

BEISPIEL 3: Pasteurisierung von Hämoglobin in Carboxy-Form (HbCO)

Dieser Schritt wird in einem vorsterilisierten, pyrogenfreien biologischen Reaktor wie beispielsweise dem "Microlift-15 Liter vor Ort sterilisierbaren Bioreaktor mit NBS Modell ML-4100 Kontrollsystem" (New Brunswick Scientific Co., Edison. New Jersey) durchgeführt. Dieser ist ein geschlossener Behälter mit mehrfachen Eintrittstellen für Gase und Flüssigkeiten, Öffnungen zum Probenentnehmen, einem Rührer zum Rühren und Temperaturkontrolleinrichtungen. Der Bioreaktor wird unter einer Abgas Abzugshaube installiert. Das Hämoglobin wird mit Kohlenmonoxid (99,99% Reinheit, Criogenic Rare Cas Co., Hanahan, South Carolina) durch aufeinandefolgendes Spülen mit sterilisiertem Gas bei 760 mm Hg, 4ºC bei langsamer Rührung gesättigt. Gesamtsättigung wird durch Verwendung eines Cooximeters (Modell 282, Instrumentation Laboratories, Lexington, Massachusetts) verifiziert. Dieses Verfahren dauert annähernd 15 Minuten. Die Lösung wird unter CO bei 760 mm Hg belassen. Pasteurisierung wird dann durch allmähliches Erhöhen der Temperatur in dem Bioreaktor von 4 auf 60ºC und Belassen dieser auf jenem Spiegel für 9 Stunden, dann Erhöhen dieser auf 70ºC für 1 Stunde durchgeführt. Nach diesen Intervallen wird die Temperatur allmählich zurück auf 4ºC erniedrigt.

BEISPIEL 4: Zentrifugation mit Chloroform

Für diesen Schritt wird die aus dem Bioreaktor entfernte Hb Lösung durch ein 0,20 u Filter in 250 ml sterile, pyrogen-freie Zentrifugenflaschen, verschlossen mit entsprechenden Kappen ("Polyallomer" Flaschen beständig gegenüber Chloroform, Proteinen und Alkohol, erhalten von Sorvall Division, Du Pont Co., Wilmington, Delaware) filtriert.
Eine Serie von drei Zentrifugationen wird unter Verwenden einer Sorvall Zentrifuge (Modell OTD75B mit Rotor TFA 20,250) auf die folgende Weise durchgeführt.
Zentrifugation von Hb gemischt mit Chloroform in einem Verhältnis von 15 : 1 (für jede Flasche: Hb, 232 ml: Chloroform, 18 ml) bei 760 x g und 4ºC 30 Minuten lang. Der Überstand wird in eine zweite Reihe von Flaschen bei Verwenden einer sterilen pyrogenfreien Röhre und einer peristaltischen Pumpe unter einer Laminar-Strömungs Haube, geleitet.
Zentrifugation von mit Chloroform gemischtem Hb in dem Verhältnis von 16 : 1 bei 1600 x g und 4ºC 15 Minuten lang und bei 3800 · g 15 Minuten lang. Der Überstand wird in eine dritte Reihe von Flaschen übertragen.
Zentrifugation ohne Chloroform bei 61400 · g 60 Minuten lang.
Nach der dritten Zentrifugation wird die Hb Lösung in 1000 ml sterile, pyrogenfreie, evakuierte Flaschen (Abbott Laboratories) mit Rührstäben übertragen. Verbleibende Spuren von Chloroform werden davon durch Spülen mit einem sterilisiertem CO Gas entfernt, wobei langsam bei 4ºC 2 Stunden lang gerührt wird.
Das für diesen Schritt verwendete Chloroform ist von HPLC Grad mit UV Abschnitt 244 nm (Fisher Scientific Co., Fair Lawn, New Jersey). Die Flaschen sind wiederverwendbar, wobei Behandlung mit (a) E-TOXA Clean Seife (Sigma Chemicals). (b) Ethanol 190 Proof und (c) Sterilisation bei 120ºC 80 Minuten lang verfolgt wird.
Diese Reihe von Zentrifugationen entfernt nicht nur alle Phospholipide sondern auch die Nicht-Häm Proteine, die in dem vorhergehenden Pasteurisierungsschritt denaturierten und prezipitierten.

BEISPIEL 5: Filtration durch Endotoxin-Affinitäts-Chromatographie-Säule

Die Hb Lösung wird durch eine Affinitätschromatographiesäule wie beispielsweise die Detoxi-Gel-säule (Pierce Chemical Co.. Rockford. Illinois) geleitet, unter Verwenden von Einlaß- und Auslaß-"Transferpackungen" und einer peristaltischen Pumpe geleitet, wodurch somit ein geschlossenes System erzeugt wird. Das Verfahren wird unter einer Laminar Strömungshaube der Klasse 100 durchgeführt.
Durch diese Stufe kann die Endotoxinkonzentration von 2,0 -2,5 EU/ml auf < 0,10 EU/ml reduziert werden.

BEISPIEL 6: Dialyse

Die Hb Lösung wird in einem Verhältnis von 1 : 10 gegen steriles, pyrogen-freies, entionisiertes Wasser, eingestellt auf einen pH Wert von 7,2 durch die Zugabe von Tham Lösung dialysiert. Die Dialyse wird durch Verwendung einer künstlichen Niere mit 6000 Dalton Porösität wie beispielsweise der "90 SCE - Künstlichen Niere" (C-Dak Co.; Miami Lakes, FL) durchgeführt. Diese Stufe eliminiert kleine Moleküle, konzentriert Hämoglobin auf 10 g/dl und senkt den pH der Hb Lösung von annähernd 8,2 auf annähernd 7,2.
An diesem Punkt in dem Verfahren ist "reines" Hämoglobin hergestellt worden, d. h. Hämoglobin vollständig frei von bakteriellen Endotoxinen, Stromalipiden und Phospholipiden und Nicht-Häm-Proteinen. Es wird auch erwartet, daß wiederholte Filtrationen durch 0,2 u Filter an verschiedenen Punkten in dem Verfahren alle mikrobiellen Kontaminanten eliminiert haben, während von Pasteurisierung und Chloroformbehandlung erwartet wird. daß sie sowohl Nicht-Lipid- wie Lipid-umhüllte Viren inaktiviert haben. Ferner ermöglicht die Verwendung von Hämoglobin in der Carboxy-Form dessen Reinigung mit einem geringen Oxydationsgrad (1-2,5% Met-Hämoglobin-Bildung).

BEISPIEL 7: Modifikation von Hämoglobin

Die Reaktion von Hämoglobin mit o-ATP, o-Adenosin und reduziertem Glutathion wird in dem biologischen Reaktor folgendermaßen durchgeführt. Hämoglobin in dem Carboxy- Zustand, 10 g/ dl in Wasser, eingestellt mit Tham auf einen pH von 7,20 wird in den Bioreaktor wieder eingeführt und bei 4ºC unter langsamen Rühren unter einer Atmosphäre von Kohlenmonoxid gehalten.
o-ATP wird gemäß Beispiel 10 hergestellt und in Pulverform gelagert. Es wird jetzt in steriles, pyrogen-freies Wasser, eingestellt auf einen pH von 7,2 gelöst und unmittelbar zu der Hb Lösung in einem Molverhältnis von Hb : o-ATP 1 : 3 hinzugefügt. Man läßt die Reaktion bei 4ºC unter Rühren bei 150 UPM unter CO 24 Stunden lang voranschreiten. Proben der Lösung werden alle sechs Stunden genommen und durch HPLC mit einer Größenausschlußsäule untersucht, wodurch der Anstieg an Molekulargewicht von Hämoglobin untersucht und mit einer Anionenaustauschsäule die Änderung an elektrischer Ladung geprüft wird. Es wird ein Waters HPLC System verwendet, welches ein Waters 600 E System Kontrollgerät, einen Waters 712 Injektor, einen Waters 990 Photodioden Detektor und einen NEC Power Mate 2 Computer umfaßt. Die Größenausschlußsäule (Protein Pak 300 SW) und die Anionenaustauschersäule (DEAE-5 PW) werden auch von Waters (Waters Chromatography Division, Millipore Co., Milford, MA) erhalten. Eine ideale Vernetzungsbedingung tritt bei etwa 24 Stunden auf, wenn Untersuchung durch Anionenaustausch-HPLC zeigt, daß 90-95% o-ATP bei der chemischen Reaktion verwendet worden sind. Als ein Ergebnis davon wird ein molekulares Aggregat hergestellt, das aus den folgenden in der Tabelle gezeigten Komponenten besteht. TABELLE: Hb KOMPONENTEN
In anderen Worten ausgedrückt, unter den Reaktionsbedingungen erzeugt o-ATP größtenteils intramolekulares Vernetzen aber auch etwas intermolekulares Vernetzen. Dieses tritt jedoch nicht mit der folgenden Reaktion in Wechselwirkung.
Nach 24 Stunden wird o-Adenosin, hergestellt gemäß Beispiel 11 und gelagert in Pulverform, in sterilem Wasser, pH 7,20 durch die Zugabe von Tham mit einigen Tropfen von Ethanol gelöst. Diese Verbindung wird zu der Hb Lösung in einem Molverhältnis von Hb zu o-Adenosin von 1 : 5 hinzugegeben, und man läßt die Reaktion unter den gleichen Bedingungen 24 Stunden lang fortfahren. Zu diesem Zeitpunkt wird eine zweite Dosis von o-Adenosin in dem gleichen Molverhältnis von 1 : 5 hinzugefügt und ermöglicht, zusätzliche 24 Stunden lang zu reagieren. Proben werden mittels HPLC untersucht, und die chemische Reaktion wird gelöscht, wenn der Spiegel von Hb Tetrameren sich von 70 auf 30% verringert hat. Wenn die Reaktion sehr jenseits dieses Punktes voranschreitet, werden Polymere von übermäßiger Größe hergestellt. GSH, gelöst in Wasser + Tham, pH 7,20 wird dann zu der Hb Lösung in einem Molverhältnis Hb/GSH 1 : 20 hinzugegeben und 16 Stunden lang reagieren gelassen. An diesem Punkt umfaßt das Hämoglobinmolekülaggregat die folgenden in der nachfolgenden Tabelle gezeigten Formen. TABELLE: Hb FORMEN
Dieses Aggregat zeigt einen einzelnen Peak durch HPLC-DEAE bei 50-51 Minuten.
Am Ende dieser chemischen Reaktionen wird Hämoglobin von der Carboxy- in die Oxy- Form durch wiederholtes Spülen mit sterilisiertem Sauerstoff bei 35 psi unter leichtem Rühren bei 4ºC und 20 Sekunden Pulsen von starkem Licht ausgesetzt, die von einer Quartz Lampe, DWY 120 V 650 W (General Electric Co., Cleveland, Ohio) geliefert werden, die mit einem "Typ 4051 Molquartz" (Mole-Richardson Co., Hollywood, CA) verbunden ist. Die Reoxygenierung von Hämoglobin kann durch die Verwendung eines IL Cooximeters verifiziert werden.

BEISPIEL 8: Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung und Lagerung

In der Endstufe wird die Hb Lösung gegen 50 mM Tham Lösung pH 8,1 dialysiert, wobei eine künstliche Niere mit einem Molekulargewichts-abscheidungsgrenze von etwa 65-85 Kdalton ("Duo-Flux": C-DAK, Miami Lakes, FL) verwendet wird, bis der Prozentsatz von Hb Tetrameren von 30 auf etwa 5% reduziert worden ist. Das Molekülgrößenprofil des End Hb Aggregats war wie in der Tabelle im nachfolgenden dargestellt. TABELLE: MOLEKÜLGRÖSSENPROFIL VON Hb AGGREGATEN
Somit wird der größte Prozentsatz von Molekülarten aus vier Hb Tetrameren hergestellt, bei einem Molekulargewicht von 260 000 Daltons. Das Aggregat stellt einen einzelnen Peak durch HPLC-DEAE bei 50-51 Minuten dar, was eine Änderung in dem isolelektrischen Punkt von 6,8 bis 6,1 wiederspiegelt.
Das Dialysat, das das verworfene Hämoglobin enthält, kann bis zu Hb 10 g/dl durch Dialyse mit einer 6000 Dalton künstlichen Niere (90 SCE künstliche Niere, C-DAK Co.) konzentriert werden und für intermolekulares Vernetzen mit o-Adenosin wiederverwendet werden.
Wenn die Hämoglobinlösung innerhalb von Stunden oder Tagen wiederzuverwenden ist, kann die erste Dialyse gegen 50 mM THAM Lösung verfolgt werden durch Dialyse gegen eine elektrolyten-balanzierte physiologische Kochsalzlösung (Normosol R, pH 7,4, enthaltend 140 meq/l Natrium. 5 meq/l Kalium, 3 meq/l Magnesium, 98 meq/l Chlorid, 27 meq/l Acetat und 23 meq/l Gluconat; Abbott Laboratories).
Somit kann das gegenwärtige modifizierte Hämoglobin (Hb-PP-GSH) in seiner endgültigen Form bei einer Konzentration von etwa 10 g/dl entweder in Wasser-THAM Lösung, pH etwa 8,1-8,2 gelöst werden, über lange Zeitperioden gelagert zu werden, oder in einer balanzierte Elektrolytlösung, pH etwa 7,4, um ohne größere Verzögerung verwendet zu werden.
Für verlängerte Lagerung kann Hb gelöst in Wasser-THAM Lösung in 600 ml Fenwal Kunststoffbeutel gebracht werden (sterile, pyrogen-freie Beutel; Baxter Healthcare Co., Fenwal Division, Deerfield, IL) und gefroren bei etwa -90ºC gelagert werden. Es wurde festgestellt, daß unter diesen Bedingungen keine Autoxidation von Hämoglobin für Zeitdauern bis zu etwa einem Jahr auftritt. Während dieser Zeit blieb das Polymerisationsprofil von Hb, wie durch HPLC und isoelektrisches Fokussieren bestimmt, unverändert. Für die Lagerung von mittlerer Dauer, wie beispielsweise 1 bis 6 Monate, kann Hämoglobin gelöst in Wasser-THAM Lösung in Glasfalschen (steriler, pyrogen-freier "Empty evacuated container"; Abbott Laboratories) in flüssiger Form bei etwa 4ºC gelagert werden. Es wurde festgestellt, daß unter diesen Bedingungen die Autoxidation von Hb mit einer Rate von etwa 1% pro Monat auftritt. Es wurde festgestellt, daß sich das Polymerisationsprofil über eine Dauer von sechs Monaten sehr wenig bei einer etwa 5-7% Abnahme an großen Polymeren ändert, was von einer Zunahme an Octameren und Tetrameren begleitet wird.
Für Lagerung von kurzer Dauer, beispielsweise weniger als 1 Monat, kann Hb in elektolyten-balancierter Lösung gelöst und in Glasflaschen ("Empty evacuated container"; Abbott Laboratories) in flüssiger Form bei 4ºC gelagert werden. Es wurde festgestellt, daß unter diesen Bedingungen die Autoxidation von Hb mit einer Rate von etwa 3-5% pro Monat auftritt.

BEISPIEL 9: Charakterisierung der Zusammensetzung der Erfindung

Die folgenden Verfahren wurden für die Charakterisierung des neuen Produktes verwendet. Hämoglobin, met-Hb und Carboxy-Hb Konzentrationen wurden mit einem Cooximeter (Model 282, Cooximeter, Instrumentation Laboratories, Lexington, MA) gemessen. Elektrolytenkonzentrationen und Osmolarität der Lösung wurden mithilfe eines ASTRA Gerätes (Beckmann Co., Palo Alto, California) bestimmt. Onkotischer Drck wurde durch die Verwendung eines Weil Oncometers (Instrumentation Laboratories) untersucht. Viskosität wurde bei 37ºC bestimmt und die Scherrate von 100/Sekunde durch die Verwendung eines Brookfield Viskometers (Brookfield Engineering Laboratories, Stoughton, MA).
Die Reinheit des Hb von anderen Proteinen. Phospholipiden und bakteriellen Endotoxinen wurde, wie zuvor beschrieben, untersucht. Sauerstoff-bindende Kapazität wurde aus der Messung der Hb Konzentration und des Sauerstoff-Volumengehalts, erhalten mit dem Cooximeter, bestimmt. Hb Sauerstoff-Dissoziationskurven wurden auf einem Hem-O-Scan Apparat (SLM Aminco, American Instruments, Silver Spring, Maryland) erhalten. P&sub5;&sub0; Werte wurden auf diesen Kurven unter Temperaturstandardbedingungen 37ºC, pH 7,40 und pCO&sub2; 40 Torr abgelesen.
Analyse in Bezug auf den Phosphatgehalt wurde mithilfe des Verfahrens von Fiske und Subbarow (Journal of Biological Chemistry, 66: 375-380 (1925)) durchgeführt. Bestimmung von GSH Gehalt wurde mithilfe des Verfahrens von Reed et al. (Analytical Biochemistry, 106: 55-62 (1980)) durchgeführt.
Adenosin wurde mittels HPLC bestimmt, wobei die Extinktion bei 258 nm gemessen wurde, und die eingeführte Menge und in Hämoglobin eingebrachte Menge berechnet wurden. ATP wurde aus der Phosphatbestimmung berechnet.
Das hier charakterisierte Produkt wurde als (Hb-PP-GSH)n identifiziert, wobei Hb=gereinigtes Rinderhämoglobin, PP=Purinderivate o-ATP und o-Adenosin und GSH = reduziertes Glutathion. Das Grundmolekül ist Hb in tetramerer Form, wie in Fig. 1 und 2 dargestellt. Dessen Reinigung von anderen Proteinen ist in Fig. 3 veranschaulicht. Für jedes Millimol (mM) Hämoglobin enthält die Verbindung etwa 3 mM ATP, etwa 10 mM Adenosin und etwa 20 mM GSH. Diese chemische Zusammensetzung plus HPLC-Analyse, durchgeführt bei verschiedenen Intervallen während der Herstellung, zeigt, daß o-ATP in erster Linie in das intramolekulare Vernetzen von Hb verwickelt ist, wohingegen o-Adenosin das intermolekulare Vernetzen erzeugt. Zusätzlich verankert o-Adenosin das GSH Molekül zu Hb. Die Verbindung ist in Fig. 4 und 5 veranschaulicht. Die Spektrumanalyse durch HPLC-Größenausschluß, gezeigt in Fig. 4, zeigt, daß die Verbindung aus den sechs Molekülspecies, die in der Tabelle im nachfolgenden gezeigt sind, besteht.

TABELLE: MOLEKÜLSPECIES VON HB

Form Prozentsatz
1. Hb (Tetramer) 5
2. (Hb)2 18
3. (Hb)3 20
4. (Hb)4 30
5. (Hb)5 16
6. (Hb)6 10
Unter diesen scheint (Hb)4, d. h. das Aggregat aus vier Tetrameren, die vorherrschende Species zu sein. Analyse durch HPLC-DEAE Säule (Fig. 5) zeigt einen einzelnen Peak bei 50-51 Minuten, was angibt, daß die Verbindung einen einheitlichen, reduzierten (im Hinblick auf unmodifiziertes Hb) isoelektrischen Punkt besitzt. Analyse durch isoelektrisches Fokussieren (IEF) (Fig. 6) zeigt diese Modifikationen von Hb aus einer anderen Perspektive.
Wenn die Verbindung (Hb-PP-GSH) in einer Wasser-THAM Lösung gelagert wird, können die folgenden Elektrolyten vor Anwendung hinzugefügt werden.
Natriumchlorid, beispielsweise 25 meq/ml 113 meq/l
Inj. USP NaCl (Abbott Lab.)
Natriumbicarbonat, beispielsweise 1,0 meq/ml 27 meq/l
Inj. USP NaHCO&sub3; (Abbott Lab.)
Kaliumchlorid, beispielsweise 20 meq/ml 4 meq/l
Inj. USP KCl (Abbott Lab.)
Calciumgluconat, beispielsweise 0,465 meq/ml 5 meq/l
Inj. USP (American Regent Lab.)
Magnesiumsulfat, beispielsweise 0,8 meq/ml 3,5 meq/l
Inj. USP MgSO&sub4; (ANTRA Pharmaceutical)
Zusätzlich kann Manitol in einer Menge von etwa 0.8 mg/ ml Lösung hinzugefügt werden. Mit diesen Lösungen kann die Endhämoglobinlösung die in der folgenden Tabelle gezeigte Zusammensetzung haben.

TABELLE: CHARAKTERISTISCHE EIGENSCHAFTEN DER HÄMOGLOBINLÖSUNG

(ENDPRODUKT)

Lösungskomponente Menge

Hämoglobin g/dl 10,0
Met-Hb (% Hämoglobin) 3,5 ± 0,05
Carboxy-Hb (% Hämoglobin) 1,5 ± 0,05
ph, Einheiten 7,4 ± 0,05
THAM Lös. ml/dl 6.66
Natrium meq/l 140
Kalium meq/l 4
Calcium meq/l 5
Magnesium meq/l 3,5
Chlorid meq/l 117
Bikarbonat meq/l 27
Gluconat meq/l 5
Sulfat meq/l 3,5
Mannitol mg/dl 80
kolloid osmotischer Druck mm Hg 22 ± 2
Viskosität cP 1,74 ± 0,04
Osmolarität mOsm/l 325 ± 10
Nicht Hb Proteine nicht nachweisbar
Stromaphospholipide und Lipide nicht nachweisbar
Bakterielle Endotoxine < 0,10 EU/ml
Sterilität Steril
Stabilität bei -90ºC undefiniert
Wenn die Verbindung (Hb-PP-GSH) ungelöst in Normosol R gelagert wird, wird nur Manitol vor Verwendung in der gleichen Dosierung, wie zuvor angegeben, hinzugefügt. Die charakteristischen Eigenschaften dieses Endproduktes sind ähnlich zu denjenigen, die in der vorhergehenden Tabelle gezeigt sind, mit der Ausnahme jedoch, daß Normosol R nicht irgendein Calciumgluconat enthält.
Bei der Konzentration von 10 g/dl transportiert diese Hb Lösung, die atmosphärischer Luft ausgesetzt ist, 13 Volumenprozent Sauerstoff, welches eine Sauerstoff-bindende Kapazität nahe 100% (1,3 Volumen Sauerstoff pro 1 g Hb) anzeigt. Der P&sub5;&sub0; Wert der Lösung ist hoch (~ 28 mm Hg) trotz Polymerisation aufgrund der hohen Konzentration von Chlorid. Die Osmolarität ist höher als diejenige von Plasma, aber die Viskosität ist niedriger als diejenige von Vollblut.
Der kolloid-osmotische Druck ist niedriger als derjenige von Plasma trotz der hohen Konzentration von Hämoglobin (im Vergleich zu Albumin) aufgrund der Tatsache, daß Hämoglobin polymerisiert wird, so daß die Anzahl von "Hb Teilchen" reduziert wird.

BEISPIEL 10: Herstellung von o-ATP in großem Umfang

Das Grundverfahren der Herstellung von o-ATP ist in der Technik bekannt (siehe S. B. Easterbrook-Smith et al., "Pyruvate Carboxylase: Affinity Labeling of the magnesium adenosine triphosphate binding site." European Journal of Biochemistry. 62: 125-130 (1976).
Modifikationen wurden gemacht, um größere Mengen von Material herzustellen und eine zufriedenstellende chemische Reaktion mit Hämoglobin zu gewährleisten.
Adenosin 5'-Triphosphat-dinatrium-salzhydrat (ATP). F. W. 551,15 und Natriumperjodat (NaIO&sub4;) 99% Reinheit, F. W. 213,89 wurden von Aldrich Chemical Company, Milwaukee, Wisconsin erhalten. Zehn 120 ml Sephadex G-10 Säulen wurden von Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey erhalten. Für jede Säule wurden 550 mg ATP in 15 ml sterilem pyrogen-freiem Wasser (Wasser für Injektion. Abbott Laboratories), eingestellt mit Tham Lösung auf einen pH Wert von 7,0 bei 0ºC gelöst. Natriumperjodat wurde in einem Molverhältnis (ATP/NaIO&sub4;) von 1 : 1,1 hinzugefügt, und man ließ die Lösung eine Stunde lang in der Dunkelheit bei 4ºC stehen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von Ethylenglykol in einem Molverhältnis (ATP/Ethylenglykol) 2 : 1 15 Minuten lang beendet. Die Reaktionsmischung wurde auf die Sephadex G-10 Säule, die zuvor mit "Wasser für Injektion" bei 4ºC äquilibriert worden war, geladen. Die Säule wurde mit 200 ml Wasser eluiert. Die führende Hälfte der Nucleotidpeaks, Fraktionen 20 bis 30, wie in Fig. 7 dargestellt, wurde zusammengegeben und unmittelbar mit einem Labconco Gefriertrocknersystem mit 'Stoppering Tray Dryer' (Labconco Co., Kansas City, MO) mit Vakuum < 10 u Hg bei -40% lyophylisiert. Das Pulver wurde in dunklen Flaschen bei -90ºC bis Anwendung gelagert.
Die Konzentration von o-ATP wird bestimmt, indem die Extinktion bei 258 nm gemessen wird, wohingegen das Vorhandensein von Perjodat untersucht wird, indem die Extinktion bei 232 nm gemessen wird. Die Säulen werden mit Wasser für die Einspritzung 30 Stunden lang bei 4ºC gewaschen, bis das Eluat weniger als 0,043 Extinktion bei 232 nm darstellt, d. h. bis alles Perjodat vor Wiederverwendung herausgewaschen worden ist.
Zwei Maßnahmen sind wichtig für den Zweck dieser Erfindung: (1) daß nur Fraktionen, die o-ATP ohne irgendeine Spur von Perjodat enthalten, gesammelt werden; und (2) daß diese Fraktionen unmittelbar lyophylisiert und bei -90% gefroren werden. Diese Maßnahmen verhindern die Oxydation von Hämoglobin bei chemischer Reaktion.

BEISPIEL 11: Herstellung von o-Adenosin in großem Umfang

Das Grundverfahren der Herstellung von o-Adenosin ist in der Technik bekannt (Khym, J. X. und Cohn, W. E., "Characterizations and some chemical reactions of periodate-oxidized nucleotides." Journal of American Chemical Society 82: 6380-6386 (1960)). Modifikationen wurden unter Herstellen größerer Materialmengen und unter Gewährleisten einer zufriedenstellenden chemischen Reaktion mit Hämoglobin durchgeführt.
Adenosin 98% Reinheit wurde von Sigma Chemical Co., erhalten, wohingegen Natriumperjodat von Aldrich Chemical Co. erhalten wurde. Adenosin. 6 g, wurde in 200 ml 150 mM NaIO&sub4; in Wasser bei Raumtemperatur 30 Minuten lang gelöst. Die Lösung wurde durch eine 300 ml Säule von Anionenaustauscherharz AG 1-X-8, 100-200 Mesh Acetatform (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA), welche zuvor mit 20 mM Essigsäure (Eluat A), erhalten von Fisher Scientific Co., äquilibriert worden war, geleitet. Die Säule wurde mit zwei Litern Eluat A bei der Fließgeschwindigkeit von 15 ml/Minute, Temperatur 4ºC unter Erhalten von 150 ml Fraktionen eluiert. Nur Fraktionen 2 bis 15 wurden gesammelt (wie in Fig. 8 dargestellt), welche unmittelbar lyophylisiert und eingefroren wurden, wie für o-ATP durchgeführt.
Vor Wiederverwendung wurden sechs Liter 100 mM Ammoniumchlorid (Eluat B) auf die Säule gebracht, um alles Perjodat freizusetzen. Die Konzentration von Perjodat in den Fraktionen wurde bestimmt, indem die Extinktion bei 232 nm gemessen wurde. Danach wurde die Säule mit sechs Litern "Wasser für Injektionszwecke" gewaschen und dann wiederum mit 20 mM Essigsäure äquilibriert.
Zwei Maßnahmen sind wichtig zum Zwecke dieser Erfindung, daß nur Fraktionen, die o-Adenosin ohne irgendeine Spur von Perjodat enthalten, gesammelt werden, und daß diese Fraktionen unmittelbar bei -90ºC lyophylisiert und gefroren werden. Diese Maßnahmen verhindern die Oxydation von Hämoglobin bei chemischer Reaktion.

BESCHREIBUNG DER ANWENDUNGEN DER ERFINDUNG

BEISPIEL 12: Toxizität in Kaninchen

Die Toxizität der Zusammensetzung dieser Erfindung (Hb-PP-GSH) wurde in Kaninchen gemäß einem Verfahren untersucht, über das zuvor in der wissenschaftlichen Literatur berichtet worden ist (Feola, M., et al., "Toxicity of Polymerized Hemoglobin Solutions". Surgery, Gynecology and Obstetrics 166: 211-222 (1988).
Zwölf Neuseeland Kaninchen von 4,0 kg Körpergewicht wurden unter lokaler Anästhesie mit 1% Lidocain sterile Kanülen in die Zentralarterie eines Ohres und die Randvene des anderen Ohres eingeführt. Ein steriler Katheter wurde in die Harnblase eingeführt. Eine Thermistorsonde und ECG Nadelelektroden wurden unter lokaler Anästhesie in die Extremitäten eingeführt. Elektrokardiogramme(ECG), Blutdruck, Körpertemperatur und Harnausscheidung wurden kontinuierlich drei Stunden lang angezeigt, wonach Katheter und Elektroden entfernt und die Tiere zurück in ihre Käfige gebracht wurden. Nach 30 Minuten stetigem Zustand (Grundlinie) wurden 80 ml Blut entsprechend 1/3 Blutvolumen (berechnetes Blutvolumen in dem Kaninchen = 6% Körpergewicht in kg) aus der Arterienleitung über eine Dauer von 5 Minuten entfernt. Ein gleiches Volumen Hb-PP-GSH, gelöst in einer Elektrolytenlösung, wurde durch die venöse Leitung über eine Dauer von 30 Minuten durch Infusion eingeführt. Dieses entsprach annähernd 2 g Hämoglobin. Die Entfernung von Blut erzeugte ein Fallen an Blutdruck mit einem Anstieg an Herzgeschwindigkeit. Diese Änderungen wurden schnell korrigiert. Darüber hinaus ging der Pulsdruck (Unterschied zwischen systolischem und diastolischem Druck), welcher eng nach der Hämorrhagie wurde, zuerst auf normal zurück, wurde dann grösser las an der Grundlinie, was eine Vasolidatorwirkung der Hb Lösung anzeigte. Diese Wirkung dauerte die gesamte akute Beobachtungsdauer von drei Stunden. Das ECG zeigte keine Herzrythmusstörung. Der Harnauslaß blieb normal ohne Extravasation von Hämoglobin in den Urin.
Blutproben, genommen 30 Minuten. 1, 3 und 24 Stunden nach Blutersatz, zeigten das folgende.
(1) keine Reduzierung von weißen Blutzellen und Thrombozyten im Überschuß von der Blut vedünnenden Wirkung.
(2) Keine Aktivierung von intravaskulärer Koagulation und Fibrinolyse, wie bestimmt durch Messung von Serum-Fibrinogen, Prothrombin-Zeit und Fibrin-Spalt-Produkten.
(3) keine Erhöhung von Kreatin-Phosphokinase-Gehirn-Isoenzym (CPK-BB) oder myokardinalem Isoenzym (CPK-MB), das cerebralen oder myokardinalen Schaden vorschlagen würde.
(4) keine Erhöhung von Serumglutamin-Pyruvat-Transaminase (SGPT), Leberverletzung andeutend;
(5) normale arterielle Blutgase, normale Lungenfunktion anzeigend.
(6) normales Serum-Kreatinin, normale Nierenfunktion anzeigend.
Kombinierte Blut- und Urinproben bei 3 und 24 Stunden zeigten normale Kreatinin- Clearance, was wiederum normale Nierenfunktion anzeigt. Vollblut-Sauerstoff- Dissoziationskurven zeigten keine Änderung in dem P&sub5;&sub0; Wert, d. h. keinen Anstieg von Sauerstoffaffinität aufgrund von Hämoglobin. Der Spiegel von Plasma Hb bei 24 Stunden betrug annähernd 50% des anfänglichen Spiegels, was eine Hämoglobin-Halbwertszeit von 24 Stunden vorschlug.
Die Tiere erschienen und verhielten sich 24 Stunden lang normal. Zu diesem Zeitpunkt wurden sie getötet, und die lebenswichtigen Organe wurden histologisch untersucht. Es wurden keine der pathologischen Änderungen, über die zuvor in der wissenschaftlichen Literatur berichtet worden war, im Herz, (b) Lungen. (c) Leber und (d) Nieren festgestellt. Diese Feststellungen stehen scharf im Gegensatz zu jenen, über die zuvor berichtet worden war (siehe zuvor angegebene Referenz), wobei die Verwendung von nicht-reinem Hämoglobin, vernetzt mit Glutaraldehyd, verfolgt wurde.

BEISPIEL 13: Wirksamkeit in Kaninchen

Die Wirksamkeit des Produktes als ein Blutersatz wurde in Kaninchen getestet. Im Anschluß an die Instrumentierung ähnlich zu derjenigen, die in dem vorhergehenden Beispiel beschrieben war, wurde eine Kontrollgruppe von 10 Neuseeland Kaninchen von 4,0 kg Körpergewicht der Entfernung von 1/3 des berechneten Blutvolumens (Blutvolumen = 6% Körpergewicht in kg) ausgesetzt, gefolgt von der Entfernung von weiteren 1/3 nach 15 Minuten. Ohne Behandlung starben alle diese Tiere innerhalb einer Stunde. Eine experimentelle Gruppe von 10 Kaninchen wurde dem gleichen Verfahren ausgesetzt, erhielt aber eine Infusion von Hb-PP-GSH, gelöst in einer Elektrolytenlösung in dem gleichen Volumen wie der Gesamtblutverlust. Alle diese Tiere überlebten und stellten ihr Grundlinien-Hämatokrit (Konzentration von roten Blutzellen) innerhalb von sieben Tagen wieder her.

BEISPIEL 14: Vasodilatation nach Blutersatz in Ratten

Zwölf Sprague- Dawley-Ratten, die 350-450 g wogen, wurden durch intraperitoneale Injektion von Natriumpentobarbital, 45 mg/kg anästhesiert und auf ein chirurgisches Brett in der Supinumposition gesetzt. Die rechte Femoralarterie, Karotisarterie und äußere Jugularvene wurden chirurgisch exponiert und mit Polyethylenkathetern (Modell PE 50; Intramedic. New York) kanüliert. Der äußere Jugularkatheter wurde in das rechte Atrium vorgerückt, wohingegen eine Thermistorsonde (Modell IF, Columbus Instruments. Columbus. Ohio) durch die Karotisarterie in die aufsteigende Aorta vorgerückt wurde. Jeder der Katheter wurde mit physiologischer Kochsalzlösung gefüllt, welche Rinder-Heparin 5 IU/ml enthielt. Die femoralen arteriellen und die Jugularvenen-Leitungen wurden mit Druckwandlern verbunden. Nadelelektroden wurden subkutan in die Extremitäten eingeführt und dazu verwendet, das Elektrokardiogramm (ECG) anzuzeigen. Heizlampen wurden eingestellt, konstante Körpertemperatur aufrechtzuerhalten.
Die Herzgeschwindigkeit wurde aus der ECG Aufzeichnung bestimmt, das Herzzeitvolumen wurde mittels Thermodilution durch Einspritzen von 200 ul physiologischer Kochsalzlösung, die auf Raumtemperatur (20-22ºC) gehalten wurde, in das rechte Atrium und Aufzeichnen einer Thermodilutionskurve aus dem Aortathermistor gemessen. Systemische Gefäßresistenz wurde als der arterielle Durchschnittsdruck minus dem rechten Atriumdruck dividiert durch das Herzzeitvolumen berechnet.
Im Anschluß an das Aufzeichnen der hämodynamischen Grundliniendaten wurde 1/3 des berechneten Blutvolumens (Blutvolumen in der Ratte = 7% Körpergewicht in kg) aus der Arterienleitung über eine Dauer von Minuten entfernt. Nach 15 Minuten wurde Hb-PP-GSH; gelöst in einer Elektrolytenlösung in dem gleichen Volumen, durch die venöse Leitung infundiert, Herzgeschwindigkeit, arterieller Durchschnittsdruck und Herzzeitvolumen wurden gemessen, und die systemische Gefäßresistenz wurde an der Grundlinie (T&sub1;) 15 Minuten nach Blutentfernung (T&sub2;) und 15 Minuten nach Hämoglobininfusion (T&sub3;) gemessen. Statistische Analyse der Daten wurde unter Verwenden des Student's t-Tests für gepaarte Daten durchgeführt.
Die Ergebnisse, im nachfolgenden zusammengefaßt, zeigen erhöhte systemische Gefäßresistenz nach Blutentfernung, gefolgt von Reduzierung auf normal und Vasodilatation, selbst im Hinblick auf die Grundlinie nach Blutersatz. TABELLE: HÄMODYNAMISCHE PROFILE NACH BLUTERSATZ MIT HB-PP-GSH
Zahlen = Durchschnitt ± Standardabweichung
* statistisch bedeutender Unterschied (P < 0,05) von vorhergehendem Zeitintervall

BEISPIEL 15: Erzeugung von freien Sauerstoff-Radikalen in Kaninchen

Zwölf Neuseeland Kaninchen von 4,0 kg Körpergewicht wurden mit Chlorpromazin (5 mg/kg, intramuskulär) sediert und begrenzter Instrumentierung ausgesetzt. Sterile Kunststoffkanülen wurden in die Zentralarterie und die Randvene eines Ohres eingeführt, und eine Thermistorsonde und Nadelelektroden wurden subkutan in die Extremitäten eingeführt. Ein Drittel des berechneten Blutvolumens (2% Körpergewicht in kg) wurde aus der Artenenleitung über eine Dauer von fünf Minuten entfernt und das gleiche Volumen von Hb Lösung wurde durch die Vene über eine Dauer von 30 Minuten mittels Infusion eingeführt. Eine Kontrollgruppe von sechs Kaninchen erhielt unmodifiziertes Hb, wohingegen die experimentelle Gruppe (sechs Kaninchen) Hb-PP-GSH, gelöst in einer Elektrolytlösung, erhielt. Die Wirkungen wurden in bezug auf Plasmaspiegel des Wasserstoffperoxids (H&sub2;O&sub2;) und Lipidperoxidasen, bestimmt an der Grundlinie, und 15 Minuten. 1 Stunde. 3 Stunden und 24 Stunden nach Hb Infusion untersucht. Plasma Hb und met-Hb wurden auch zu den gleichen Zeitintervallen gemessen.
H&sub2;O&sub2; stieg in der Gruppe an, die unmodifiziertes Hb von 2 ± 2 bis 70 ± 5 Mikromol/Milliliter nach einer Stunde erhielt, verringerte sich dann auf 50 ± 5 uMol/ml bei 3 Stunden und auf 10 ± 5 uMol bei 24 Stunden. In der experimentellen Gruppe erhöhte sich H&sub2;O&sub2; nur von 2 ± 2 bis 10 ± 2 uMol/ml bei einer Stunde und kehrte zur Grundlinie nach drei Stunden zurück. In ähnlicher Weise erhöhten sich Lipidperoxide von 1,5 ± 0,9 Nanomol/Milliliter bei der Grundlinie auf 4,0 ± 1,0 nMol/ml nach einer Stunde in der Kontrollgruppe. Kein signifikanter Anstieg trat in der experimentellen Gruppe auf. Plasma met-Hb erhöhte sich von 0 auf 15% in einer Stunde in der Gruppe, die unmodifiziertes Hb erhielt. Es erhöhte sich von 0 auf 5% in der Gruppe, die Hb-PP-GSH erhielt. Der Unterschied in diesen Variablen zwischen den zwei Gruppen wurde als signifikant befunden durch statistische Analyse, Student's t-Tests für nicht gepaarte und gepaarte Proben plus ANOVA.
Obwohl die Erfindung in Verbindung mit der vorhergehenden spezifischen Ausführungsform beschrieben worden ist, sind viele Alternativen. Variationen und Modifikationen für die Fachleute offensichtlich. Es ist beabsichtigt, daß jene Alternativen, Variationen und Modifikationen unter den Sinn und Umfang der angefügten Ansprüche fallen.

BEISPIEL 16: Formulierung von Hb-PP-GSH in der Abwesenheit von Elektrolyten

Die Herstellung von Hb-PP-GSH wurde, wie in Beispielen 1 bis 9 gezeigt, durchgeführt. Das modifizierte Hämoglobin wurde allein gegen eine 50 mM Tham Lösung dialysiert (Tromethamin, injizierbar, Abbott Laboratories, N, Chicago, IL), pH 8,1). In ihrer Endform wurde die Hb-PP-GSH Präparation in Wasser plus Tham Lösung, pH 8,1 bei einer Konzentration von 40 g/dl belassen. Der Formulierung fehlte es an Elektrolyten, aber sie enthielt Manitol, welches, wie zuvor, in einer Dosis von 0,8 mg/ml der Lösung hinzugefügt war. Typischerweise enthielt die Lösung 6,66 ml Tham für jede 100 ml Wasser.

BEISPIEL 17: Charakteristische Eigenschaften der Hb-PP-GSH Herstellung, der es an Elektrolyten fehlte

In vitro Beobachtung zeigte, daß Hb-PP-GSH in dem Gefrierschrank bei 4ºC für längere Zeitperioden aufbewahrt werden kann, wenn in einer nicht elektrolytischen Lösung wie beispielsweise Tham Lösung gelöst, als wenn in einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst.
Es wurde beobachtet, daß über eine Dauer von 3 Monaten die Autoxidation von Hämoglobin zu met-Hb mit einer Geschwindigkeit von 3-5% pro Monat bei der Formulierung auftrat, die Elektrolyten enthielt, wohingegen sie mit einer Geschwindigkeit von 1% pro Monat mit der Lösung ohne Elektrolyten auftrat. Dieses kann auf der Basis erklärt werden, daß Chloridionen, die in der physiologischen Kochsalzlösung vorhanden sind, die Sauerstoff-Affinität von Hämoglobin reduzieren, wodurch die Sauerstoff-Freisetzung und Autoxidation erleichtert werden.

BEISPIEL 18: In vivo Effekt von nicht eiektrolytischem Hb-PP-GSH

Das Hb-PP-GSH wurde gelöst in Tham Lösung bei einer Konzentration von 10% gelassen. Manitol wurde in einer Menge von 0,8 mg/ml hinzugefügt, aber Elektrolyten wurden nicht hinzugegeben. Ein Volumen gleich zu einem Drittel des berechneten Blutvolumens wurde intravenös über eine Dauer von 30 Minuten einer Gruppe von 9 Ratten (350-400 g Körpergewicht) injiziert. Die Tiere hatten normalen Zugang zu Nahrung und Wasser vor dem Experiment und wurden durch intraperitoneale Injektion von Natriumpentobarbital, 45 mg/kg, anästhetisiert und, wie in Beispiel 14 zuvor angegeben, behandelt.
Körpertemperatur. Atmung, Elektrokardiogramm, Arterienblutdruck und Herzzeitvolumen wurden für eine Dauer von 2 Stunden kontrolliert. Harnauslaß wurde eine Stunde lang vor und zwei Stunden lang nach Verabreichung der Hämoglobinlösung überwacht, und der Urin wurde im Hinblick auf Hämoglobinurie untersucht. Blutproben wurden vor und bei 15 Minuten Intervallen 2 Stunden lang nach der Verabreichung von Hb-PP-GSH für die Messung von ionisierten und Gesamtcalciumspiegeln im Serum genommen.
Keines der Tiere entwickelte irgendein Zeichen von akuter Toxizität. Es trat eine vorübergehende Verringerung in der Herzfrequenz auf, aber ohne Arrhythmien oder Änderung in den Elektrokardiogramm-Mustern. Die Atmungsgeschwindigkeit. Blutdruck und Herzzeitvolumen blieben signifikant konstant. Die Harnausscheidung der Tiere erhöhte sich von etwa 0,6 ± 0,3 ml/h auf etwa 1,6 ± 0,3 ml/h (P weniger als 0,05), und es gab keine Hämoglobinurie. Gesamtserum-Calcium blieb im wesentlichen konstant, wohingegen ionisiertes Calcium sich von etwa 0,85 ± 0,05 auf etwa 0,62 ± 0,03 mM verringerte. Dieses war jedoch statistisch nicht signifikant und dauerte nur einige wenige Minuten. Die Änderung an ionisiertem Calciumspiegel wurde durch die intravenöse Verabreichung von Calciumgluconat (10% Calciumgluconat für Injektion, W. A. Butler, Cincinnati, OH), infundiert mit der Dosis von 2 mg Calcium/100 g Körpergewicht über ein 2 Minuten-Intervall umgekehrt.
Dieses Experiment beweist, daß Hb-GSH sogar ohne die Zugabe von Elektrolyten verabreicht werden kann, d. h. wenn das zu infundierende Volumen weniger als einem Drittel des berechneten Blutvolumens entspricht.

BEISPIEL 19: Klinisches Testen von Hb-PP-GSH

Hb-PP-GSH wurde in Menschen, in Kinshasa, Republik von Zaire, Afrika nach Genehmigung von dem Department of Education and Scientific Research jener Regierung untersucht. Während der Dauer von August 15 bis September 15, 1990 wurde eine Gruppe von 9 Patienten in dem Zentrum für Sichelzellenanämie in Kinshasa behandelt. Es gab 5 männliche und vier weibliche Personen. 4-13 Jahre alt. Fünf der Kinder zeigten schwere Anämie mit Bluthämoglobinspiegeln von 5 g/dl oder weniger. Vier der Kinder hatten einen geringeren Anämiegrad mit Hämoglobinspiegeln von etwa 8 g/dl, aber litten an einer "Sichelzellkrise", d. h. akuter microvaskulärer Blockade in den Händen und Füßen (2 Patienten), in der linken Lunge (1 Patient) und in der Milz (1 Patient). Die Patienten litten an Schmerz. Fieber und generalisierter Unpäßlichkeit und Schwäche.
Die Gruppe von Patienten mit schwerer Anämie wurde medizinisch als eine Bluttransfusion benötigend beurteilt, wohingegen die zweite Gruppe mit intravenösen Flüssigkeiten, Vasodilatatoren und analgetischen entzündungshemmenden Mitteln zu behandeln war. Hämoglobin (Hb-PP-GSH) wurde für die Behandlung beider Gruppen als angebracht in Betracht gezogen. Es wurde erwartet, daß Hämoglobin einen Ersatz für rote Blutzellen (RBCs) liefert und die Zirkulation und Gewebeoxygenierung durch die folgenden zwei Mechanismen verbessert.
Erhöht das zirkulierendem Blutvolumen.

Erhöhte Lieferung von Sauerstoff.

Zusätzlich weil das Hämoglobin mit Derivaten von ATP vernetzt ist, das ein Vasodilatator ist, und Adenosin, das auch ein Vasodilatator ist, und einem entzündungshemmenden Mittel, wurde erwartet, daß die Lösung irgendeine mikrovaskuläre Blockade erleichtert, was die Patienten mit einer "Sichelzellbildungskrise" beeinträchtigt.
Als ein weiterer Vorteil gegenüber einer Bluttransfusion trägt eine Behandlung mit der Hb-PP-GSH Lösung der Erfindung nicht das Risiko von Blut übertragbaren Krankheiten wie beispielsweise Malaria, bakteriellen Krankheiten und AIDS:
Das Hb-PP-GSH dieser Erfindung wurde in Fenwal Beuteln gelagert, wobei jeder 250 ml 10% Hämoglobin in einer Wasser-THAM Lösung enthielt. Die Beutel wurden in gefrorenem Zustand (gepackt in Geleis) bis zur Verwendung gehalten. Zwei Stunden vor Verabreichung wurden die Fenwal Beutel Raumtemperatur ausgesetzt, und die Hämoglobinlösung wurde aufgetaut. Elektrolyten und Manitol wurden, wie zuvor beschrieben, hinzugegeben. Das Gesamtvolumen jedes Beutels wurde intravenös mit der Geschwindigkeit von etwa 30 Tropfen pro Minute gegeben. Dieses Volumen entspricht etwa 12-23% Blutvolumen, berechnet für jeden Patienten als 7% Körpergewicht in kg.
Ein Patient mit schwerer Anämie, Hämoglobin 4,5 g/dl, erhielt zwei Infusionen an zwei aufeinanderfolgendne Tagen.
Die Lebenszeichen, Temperatur, Puls, Atmung und Blutdruck wurden alle 15 Minuten während der Verabreichung von Hämoglobin und alle zwei Stunden danach genommen. Während dieser Dauer wurde Aufmerksamkeit auch auf die mögliche Entwicklung allergischer Reaktionen wie beispielsweise Urtikaria, Hautausschläge, Bronchospasmus und Übelkeit und Erbrechen gerichtet. Harnausscheidung wurde über eine zwei Stunden Dauer vor und eine zwei Stunden Dauer nach der Verabreichung von Hb-PP-GSH gemessen. Der Urin wurde im Hinblick auf das Vorhandensein von Hämoglobin untersucht, und das Sediment wurde mikroskopisch untersucht. Blutproben wurden vor, bald nach Hb-PP-GSH Verabreichung, zwei Stunden danach und täglich 5 Tage lang genommen. Das Patientenblut wurde in Bezug auf Plasmahämoglobin (das infundierte Hämoglobin). Gesamthämoglobin (infundiertes Hämoglobin plus dasjenige, das in RBCs enthalten war) und in Bezug auf Retikulozyten (junge RBCs) untersucht.
Keiner der Patienten entwickelte eine allergische Reaktion, und alle fühlten sich allgemein verbessert. Diejenigen mit "Sichelzellbildungs" Krise berichteten ein Vermindern des Schmerzes ohne Verwendung von Analgetika. Das Fieber nahm ab, der Puls wurde weniger schnell, der Blutdruck blieb stabil mit etwas Anstieg an Pulsdruck, was Vasodilatation anzeigt, und die Atmung blieb unverändert. Die Harnausscheidung erhöhte sich für die gesamte Gruppe von einem Durchschnittswert von etwa 50 ± 7 ml/zwei Stunden vor Verabreichung von Hb-PP-GSG auf etwa 130 ± 15 ml zwei Stunden nach Verabreichung von Hb- PP-GSH. Der Urin zeigte keine Hämoglobinausscheidung, und keine Formen wurden in dem Sediment gefunden. Die beeindruckendste Tatsache wurde durch eine fortschreitende Verbesserung in dem Gesamthämoglobin über eine Dauer von 5 Tagen von einem Durchschnittswert für die gesamte Gruppe von etwa 6,39 ± 2,12 auf etwa 10,5 ± 1,13 g/dl und eine beträchtliche Zunahme an Retikulozyten von etwa 11,2 ± 7,6 auf etwa 62,6 ± 12/1000 festgestellt.
Dieses schlägt vor, daß die Hämoglobinlösung nicht nur einen unmittelbaren Ersatz für RBCs lieferte, sondern das Patientenknochenmark stimuliert neue eigene RBCs zu erzeugen. Diese Stimulierung wurde nur 5 Tage lang dokumentiert, dauerte aber wahrscheinlich länger als das.
Als Schlußfolgerung erzeugte die Verabreichung von Hb-PP-GSB in beträchtlichen Volumen an 9 Kinder, die an Sichhelzellenanämie litten, keine toxischen oder allergischen Reaktionen, verbesserte ihren Allgemeinzustand und hatte eine anhaltende günstige Wirkung auf das Knochenmark bei der Herstellung neuer roter Blutzellen.
Die Erfindung ist jetzt vollständig beschrieben, es ist für den Fachmann offensichtlich, daß viele Änderungen und Modifikationen daran gemacht werden können, ohne vom Umfang der Erfindung, wie hier beschrieben, abzuweichen.

Claims

1. Zusammensetzung für die Verwendung als Blutersatz, umfassend pyrogenfreies, pathogenfreies, aktives Hämoglobin, welches mit o-ATP und o-Adenosin unter Bilden eines vernetzten Produktes umgesetzt worden ist, und ferner mit reduziertem Glutathion umgesetzt worden ist; wobei das Hämoglobin intramolekular mit dem o-ATP vernetzt ist und intermolekular mit dem o-Adenosin vernetzt ist; und wobei das Molverhältnis Hämoglobin : o-ATP : o-Adenosin : reduziertes Glutathion der Zusammensetzung im wesentlichen 1 : 3 : 10 : 20 beträgt.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung in einer pharmazeutisch verträglichen wäßrigen Lösung gelöst ist.

3. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die vernetzten Hämoglobinmoleküle ein Molekulargewicht im Bereich von etwa 130 bis etwa 390 Kilodalton haben.

4. Zusammensetzung nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei weniger als 5% des im wesentlichen pyrogenfreien, pathogenfreien Hämoglobins zu Met-Hämoglobin oxydiert ist.

5. Zusammensetzung nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das Hämoglobin von Rinderursprung ist.

6. Zusammensetzung nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Lösung ferner Mannitol als einen Radikalfänger von freiem Sauerstoff vor Verwendung der Zusammensetzung enthält.

7. Zusammensetzung nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Lösung Magnesiumchlorid bei einer mit dem o-ATP etwa äquimolaren Konzentration enthält.

8. Blutersatz, welcher die Zusammensetzung nach einem vorhergehenden Anspruch enthält, enthaltend etwa 7,5 g bis 15 g Hämoglobin pro dl Lösung.

9. Blutersatz nach Anspruch 8, wobei die Zusammensetzung in einer pharmazeutisch verträglichen wäßrigen elektrolytfreien Lösung gelöst ist, welche nicht mit der Sauerstoff tragenden Funktion des vernetzten Polyhämoglobins in Wechselwirkung tritt.

10. Blutersatz nach Anspruch 9, welcher ferner Nichtelektrolyten, ausgewählt aus der Gruppe aus Humanalbumin, unterschiedlichen Plasmafraktionen, Plasma, Dextran und Hydroxymethylstärke enthält.

11. Blutersatz nach einem der Ansprüche 9 oder 10, wobei die elektrolytfreie Lösung eine injizierbare Wasser-THAM Lösung ist.

12, Blutersatz, umfassend eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 7, wobei der Blutersatz Elektrolyten, ausgewählt aus der Gruppe aus Natrium-, Kalium-, Calcium- und Magnesiumkationen und Chlorid-, Bicarbonat-, Gluconat- und Sulfatanionen, in einer elektrolytbalancierten physiologischen Kochsalzlösung - NORMOSOL R pH 7,4, laktatisierten Ringerlösung und/oder physiologischen Kochsalzlösung enthält, welche nicht mit der Sauerstoff tragenden Funktion des vernetzten Polyhämoglobins in Wechselwirkung tritt.

13. Verfahren zum Herstellen einer Zusammensetzung nach Anspruch 1, geeignet für die Verwendung als ein Blutersatz, welches umfaßt Trennung von Vollblut in eine Leukozyten- Erythrozytenmischung und Blutplättchen und Plasma. Suspendieren der auf diese Weise erhaltenen Mischung in einer wäßrigen Lösung;

Kühlen der wäßrigen Lösung, die die Leukozyten-Erythrozytenmischung enthält, unter Aggregieren der Leukozyten und Entfernen des Leukozytenaggregats unter Erhalten einer im wesentlichen leukozytenfreien Lösung;

Dialysieren der im wesentlichen leukozytenfreien Lösung gegen eine hypotonische Lösung unter Extrahieren von Hämoglobin von Erythrozyten in der im wesentlichen leukozytenfreien Lösung und Heraustrennen der Erythrozyten aus dem extrahierten Hämoglobin in der im wesentlichen leukozytenfreien Lösung durch Ultrafiltration unter erhöhtem hydrostatischen Druck, wobei eine extrahierte Hämoglobinlösung erhalten wird;

Umwandeln des extrahierten Hämoglobins in der extrahierten Hämoglobinlösung zu Carboxy-Hämoglobin unter Erhalten einer Carboxy-Hämoglobinlösung; Pasteurisieren der Carboxy-Hämoglobinlösung unter Denaturieren und Fällen von Nicht-Häm-Proteinen;

Entfernen von Phospholipiden und gefällten Nicht-Häm-Proteinen aus der Carboxy- Hämoglobin-Lösung;

Entfernen von Endotoxinen aus der Carboxy-Hämoglobin-Lösung mittels Affinitätschromatographie;

Konzentrieren des Carboxy-Hämoglobins in der Carboxy-Hämoglobinlösung auf eine Konzentration von etwa 10 g/dl unter Erhalten einer konzentrierten Carboxy- Hämoglobinlösung;

Umsetzen des Carboxy-Hämoglobins in der konzentrierten Carboxy-Hämoglobinlösung mit o-ATP unter Bewirken von vorwiegend intramolekularem Vernetzen des Carboxy- Hämoglobins, wobei somit eine Lösung von intramolekular vernetztem Carboxy-Hämoglobin erhalten wird;

Umsetzen des o-ATP Carboxy-Hämoglobins mit o-Adenosin in einer Menge, die wirksam ist, vorwiegend intermolekulares Vernetzen von Carboxy-Hämoglobin zu bewirken, wodurch somit eine intermolekular und intramolekular vernetzte Lösung von Carboxy-Hämoglobin erhalten wird, und Hinzufügen von reduziertem Glutathion zu der Lösung von intermolekular und intramolekular vernetztem Carboxy-Hämoglobin unter Quenchen der o-Adenosin- Vernetzungsreaktion und weiterem Verringern des isoelektrischen Punktes der Hämoglobinmoleküle;

Umwandeln des vernetzten Carboxy-Hämoglobins in der Lösung von intermolekular und intramolekular vernetztem Hämoglobin in eine Lösung von vernetztem Oxy-Hämoglobin in der Abwesenheit von Elektrolyten; und

Bilden einer pharmazeutisch verträglichen Lösung von vernetztem Oxy-Hämoglobin.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Vollblut Rinderblut ist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 oder 14, wobei das Hämoglobin in Carboxy- Hämoglobin durch Spülen von Kohlenstoffmonoxid in die Lösung umgewandelt wird.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, wobei Phospholipide und gefällte Nicht-Häm-Proteine aus der Carboxy-Hämoglobinlösung durch Lösungsmittelextraktion entfernt werden.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 16, wobei das o-ATP und o-Adenosin durch Periodatoxidation von ATP und Adenosin hergestellt werden; und das Periodat und Iodat aus dem o-ATP und o-Adenosin vor Umsetzen des o-ATP und o-Adenosins mit dem Carboxy-Hämoglobin entfernt werden.

18. Verwendung einer Zusammensetzung oder Blutersatzes nach einem der Ansprüche 1 bis 12 bei der Herstellung eines Arzneimittels für die Verabreichung an Menschen, die Therapie benötigen.

19. Verwendung einer Zusammensetzung oder Blutersatzes nach einem der Ansprüche 1 bis 12 bei der Herstellung eines Arzneimittels für die Verwendung beim Wiederherstellen und Aufrechterhalten von Plasmavolumen. Versorgen von lebenswichtigen Organen mit Sauerstoff und/oder Abhelfen von Vasokonstriktion nach Hämorrhagie oder akutem Blutverlust.

20. Verwendung einer Zusammensetzung oder Blutersatz nach einem der Ansprüche 1 bis 12 bei der Herstellung eines Arzneimittels für die Verabreichung an einen Menschen, der mit einer Sichelzellbildungskrise von Sichelzellenanämie und/oder anderen Blutkrankheiten geplagt ist.