KR100227453B1

KR100227453B1 - 개선된 혈액 대용품

Info

Publication number: KR100227453B1
Application number: KR1019930702403A
Authority: KR
Inventors: 마리오 페올라; 잔 에스. 시모니
Original assignee: 스위지 로버트 엠.; 텍사스 테크 유니버시티 헬쓰 사이언시스 센터
Priority date: 1991-02-12
Filing date: 1991-12-13
Publication date: 1999-11-01
Also published as: EP0586381A1; JP3437572B2; AU1270492A; AU656763B2; NO932857D0; EP0586381B1; WO1992013875A1; EP0586381A4; CA2103680C; FI933550A; NO932857L; DE69130483D1; NO308934B1; FI106362B; DE69130483T2; JP2002507185A; CA2103680A1; ATE173273T1; FI933550A0

Abstract

본 발명은 정제된 헤모글로빈, 바람직하게는 소 헤모글로빈을 과요오드산염으로 산화된 ATP(o-ATP) 및 과요오드산염으로 산화된 아데노신(o-아데노신)과 분자내 가교 결합시키고, 환원 글루타티온(GSH)과 결합시키고, 임의로 만니톨, 비전해질 및(또는) 전해질을 첨가함으로써 얻어지는 개선된 혈액 대용품을 제공한다. 이 혈액 대용품은 연장된 맥관내 지속성을 가지고, 혈장 용적을 유지할 수 있으며, 낮은 산소 친화성을 가지고, 생리학적 산소 운반체로서 작용할 수 있으며, 혈관 확장 작용을 가지고, 출혈을 수반하는 혈관 수축을 감소시킨다. 급성 실혈 및(또는) 겸상 적혈구화 발증으로 인한 겸상 적혈구 빈혈을 앓는 사람에게 유효량의 혈액 대용품을 정맥내 투여하는 것으로 이루어지는 그의 치료 방법을 제공한다.

Description

[발명의 명칭]

개선된 혈액 대용품

[발명의 배경]

본 출원은 1989년 12월 29일자로 출원되어 현재 계류 중인 미합중국 특허 출원 제07/459,071호의 일부 계속 출원이다.

[발명의 분야]

본 발명은 혈액 대용품 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 좀 더 상세하게는, 인간을 포함한 각종 동물에 있어서 심한 출혈 후에 생명을 유지하는 데 효과적이며 혈액 전염성 질환이 없고 무독성인 신규한 헤모글로빈 조성물에 관한 것이다.

[발명의 배경에 대한 설명]

혈액은 생명 유지에 필요한 많은 기능을 수행한다. 그러나, 심한 출혈 또는 실혈(失血)은 두 가지 주요 이유로 인해 생명을 위태롭게 만든다:(1) 순환 혈액 양의 감소는 조직 관류를 감소시켜 허혈을 일으키고; (2) 산소 전달량의 감소는 조직 산소화에 손상을 주어서 저산소증을 일으킨다.

순환계는 허혈 및 저산소증을 더욱 악화시키는 혈관 수축을 일으킴으로써 이러한 변화에 대해 감응한다. 결국은, 세포 대사 및 기능의 변화가 일어나고, 쇼크 및 죽음에 이르게 한다.

본 명세서에서, "혈액 대용품"은 혈액의 모든 기능을 대신할 수 있는 제제가 아니라, 다음과 같은 기능, 즉 혈액 양의 복원, 산소 전달 및 혈관 수축의 감소를 가능케 하는 비상용 소생 유체를 의미한다.

그러나, 이러한 유체는 박테리아 및 바이러스와 같은 발병원 뿐만 아니라 독성 부작용도 없어야 한다.

50여년 동안 혈액 대용품의 개발에 대한 노력이 헤모글로빈(Hb)에 집중되어 왔는데, 그 이유는 헤모글로빈이 대기 공기로부터 충분한 산소를 추출해내어 생리학적 산소 운반체로서 작용할 수 있는 유일한 물질이기 때문이다. 또한, 헤모글로빈은 혈청 알부민과 동일한 콜로이드-삼투압을 발휘하므로 혈장 용적 팽창기로서 제공된다. 그러나, 현재까지 이러한 노력은 인식하고 해결하기 어려운 많은 문제로 인해 성공적이지 못했다. 이러한 문제는 (1) 환경 박테리아 내독소, 기질(stroma) 인지질 및 무헴(non-heme) 단백질 및 펩티드로 인한 헤모글로빈의 감염에 의한 독성; (2) 조직으로의 산소 방출을 방해하는 용액 중의 헤모글로빈의 고 산소 친화력; (3) Hb 분자의 불안정성 및 일혈(extravasation) 및 고속 신장 분비 경향; (4) 헤모글로빈의 자기 산화 경향 및 비기능성 met-Hb 및 독성 산소 유리 라디칼의 생성 및 (5) 간염 및 AIDS와 같은 혈액 관련 질병의 천연 Hb에 의한 전염이다.

지금까지 가장 먼저 인식된 문제는 독성의 문제, 즉 혈액의 혈관내 응고를 활성화시키고 신장에 대한 손상을 일으키는 Hb 용액의 능력이다. 1960년대에 라비네르(Rabiner)는 그러한 독성이 Hb에 의한 것이라기 보다는 적혈구의 기질(적혈구막의 단편)에 의한 것이라는 개념을 보급시켰다. 그는 기질이 없는 헤모글로빈의 필요성을 강조했다. 그러나, 이 용어는 수년 동안 모든 기질 성분이 하나도 없는 헤모글로빈이 생산되지 않았다는 사실을 잘못 나타낸 것이다. 본 발명자 및 공동 연구자들은 적혈구막의 독성 인자는 그의 세포질에 정상적으로 잔류하는 아미노인지질 포스파티딜에탄올아민(PE) 및 포스파티딜세린(PS)으로서 동정하였다. 이러한 화합물은 Hb에 대해 고유의 친화력을 가지고 있으며, 그들은 다른 기질 성분보다 Hb 용액으로부터 제거하기가 좀 더 어렵다. PE 및 PS로 감염된 Hb의 상당한 양(동물의 계산된 혈액 양의 ⅓이상)이 실험용 동물(토끼 및 원숭이)에 주입될 때, 혈관내 응고 및 보체 활성 작용, 백혈구 및 혈소판 활성 작용 및 생체 기관 내의 허혈성 염증 병변의 발달에 의해 특징지어지는 전신 염증성 반응(systemic inflammatory reaction)을 일으킨다.

최근까지 인식되어 온 문제는 Hb 용액이 환경 박테리아 내독소에 의하여 쉽게 감염된다는 사실이다. 리물러스(limulus) 변형 세포 용해질 시험법이 개발되기까지, 미합중국 약전은 내독소의 검출을 위한 분석법으로서 토끼 발열원 시험법에 의존해왔다. 그러나, 내독소의 독성 성분은 사실상 지질, "지질 A"이기 때문에, 발열원 농도 미만의 농도의 내독소로 감염된 헤모글로빈은 아미노인지질로 감염된 헤모글로빈이 나타내는 독성과 같은 종류의 독성을 일으키는 것으로 보고되어 있다. 박테리아 내독소는 데톡시-겔(Detoxi-gel) 컬럼(Pierce Chemical Co. 제품)과 같은 친화성 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 생물학적 용액으로부터 제거될 수 있다. 그러나, 출발 물질이 밀리리터 당 내독소 2단위 이상을 함유한다면, 이러한 컬럼은 내독소를 모두 제거할 수는 없다(정량적 색소 생성 리물러스 시험(quantitative chromogenic limulus test; QCL-1000, Whittaker M. D. Bioproducts, 1EU=박테리아 리포폴리사카라이드 0.1 나노그람)을 이용하여 측정함).

헤모글로빈은 무헴 단백질 및 펩티드로부터 정제되어야 한다. 독성은 임의의 특정 단백질의 존재와 관련이 없지만, 정제는 천연 Hb 용액의 면역원성을 감소시킬 필요성에 의해 이루어진다. 또한, 펩티드가 분리된 기관(심장 및 신장) 및 분리된 동맥에서 발견되는 Hb 용액의 혈관 수축 작용의 원인인 것으로 추측되었다. 그러한 정제를 위한 각종 방법이 당 업계에 공지되어 있다. 이러한 방법의 예로서는 (1) 원심 분리 및 여과법(Coczi, 미합중국 특허 제3,991,181호); (2) 톨루엔 추출법(Bonsen 등, 미합중국 특허 제4,001,200 및 동 제4,001,401호); (3) 한외여과법(Kothe 등, 미합중국 특허 제4,526,715호); (4) 한외여과 및 산 침전법(Bonhard 등, 미합중국 특허 제4,136,093호 및 동 제4,336,248호); (5) 이온 교환 크로마토그래피법(Meiller, 미합중국 특허 제4,100,149호); (6) 아연 침전법(Tye, 미합중국 특허 제4,473,494호 및 동 제4,529,719호); 및 (7) 결정화법 [DeVenuto 등, Journal of Laboratory and Clinical Medicine, 89권:제509-514 페이지(1977년)].

이들 방법 중 어느 것도 완전히 만족스럽지는 않다. 방법(1) 내지 (4)는 다른 단백질로부터 Hb를 완전히 분리할 수 없다는 것과 관련하여 제한이 있으며, 방법(5) 내지 (7)은 대규모 정제에는 적합하지 않다.

1970년대에 인식되었던 문제점은 용액 중의 Hb의 고 산소 친화력이다. 이것은 폐내의 공기로부터 산소를 분리해내고 그것을 조직으로 방출하는 헤모글로빈의 능력을 조절하는 특성이다. 이러한 특성은 P₅₀값(Hb가 50포화되는 산소의 부분 장력)으로 표현된다. P₅₀값이 낮아지면, 산소와 결합하는 헤모글로빈의 능력이 더 커지며, 산소를 조직에 비부하(unload)시키는 능력이 더 감소된다. 인체 혈액의 P₅₀값은 28mmHg이며, 용액 중의 인체 Hb의 P₅₀값은 약 13mmHg이다. 이러한 차이는 적혈구내에서 Hb가 2,3-디포스포글리세레이트(2,3-DPG)와 반응하고, 그것이 산소에 대한 Hb의 친화력을 감소시킨다는 사실에 기인한 것이다. 적혈구 외부에서는 이러한 작용이 상실되고, 그 결과, Hb가 O₂와 너무 세게 결합하여 O₂운반체로서의 기능이 상실되는 것이다. 이러한 문제점을 해결하기 위해, 베네쉬(Benesch) 등은 Hb와 피리독살-5'-포스페이트(2,3-DPG 동족체)와의 공유 결합반응을 개발하였다. 첫째로 기대되는 것은 이러한 반응이 산소 친화력을 감소시키고 Hb 분자를 테트라머 형태로 안정화시킬 것이라는 것이었다. 그러나, 이것은 실현되지 않았다. 본 발명자 및 공동 연구자들은 용액 중의 소 헤모글로빈이 인간 혈액 과 동일한 P₅₀값을 가지며, 그의 산소 친화력이 2,3-DPG에 의해 조절되는 것이 아니라 염화물에 의해 조절된다는 것을 발견하였다. 이러한 바람직한 특성, 소 RBC의 대규모 이용성과 포유 동물의 순수한 헤모글로빈의 저항원성을 고려하면, 소 헤모글로빈을 혈액 대용품의 기재로서 사용할 수 있다.

1970년대에 인식되었던 또 다른 문제점은 혈관내에 잠시 지속되는 헤모글로빈의 신속한 일혈이다. 이것은 일반적으로 Hb 테트라머 ₂ ₂가 이량체 2 로 해리되는 경향에 기인한 것이며 모세 혈관을 더욱 용이하게 통과한다. 단백질의 표면 전하는 또한 전기 음성도 및 저등전점으로 혈관내 지속을 유리하게 하는 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 헤모글로빈 일혈은 몇가지 바람직하지 못한 영향을 미친다:(1) 혈장 용적 팽창 효과가 단시간 지속된다; (2) 신사구체로의 Hb의 통과는 혈장 용적을 유지하기 보다는 감소시키는 삼투 이뇨 효과를 발생시킨다; (3) 신소관 내의 Hb의 재흡착은 관상 세포를 손상시킨다; 및 (4) 간질 유체로의 Hb의 통과는 수종 및 세포 손상의 원인이 된다.

선행 기술은 Hb 이량체화의 방지에만 집중되었다. 이러한 목적을 위해, 세가지 유형의 Hb 변형이 개발되었다:(a) 분자간 가교 결합(중합 작용); (b) Hb와 다른 분자와의 접합; 및 (c)또는사슬의 분자내 가교 결합.

가장 널리 사용되는 방법은 Hb와 글루타르알데히드와의 분자간 가교 결합이다(Bonsen 등, 미합중국 특허 제4,001,200호, 동 제4,001,401호 및 동 제4,053,590호; Morris 등, 미합중국 특허 제4,061,736호; Bonhard 등, 미합중국 특허 제4,136,093호 참조). 본 명세서에서는 이들 문헌을 참고로 인용한다. 분자간 가교 결합에는 몇가지 문제점이 있다:(1) 글루타르알데히드가 고유의 독성이 있으며, 그의 대사 부산물의 잠재적 독성이 알려지지 않았다; (2) 글루타르알데히드가 반응성이 매우 높으며, Hb 분자의 여러 부위(- 및-아미노기 및 설프히드릴기)와 다중브리지를 형성하는 경향이 있다. 그 결과 예측할 수 없는 많은 종류의 분자를 형성한다; (3) 중합 과정이 조절하기가 어려우며, 그 과정이 4에서의 저장기간 동안 계속되어 점도 및 산소 친화력이 증가된 더 큰 중합체를 형성한다; (4) 가교 결합의 비특이적 성질이 용액 중의 Hb 이량체의 존재를 여전히 가능케할 수 있다.

별법으로서, Hb를 덱스트란 및 히드록시에틸 전분(미합중국 특허 제4,064,118호), 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌 글리콜(미합중국 특허 제4,412,986호), 이눌린(미합중국 특허 제4,377,512호) 및 폴리-알킬렌 옥시드(미합중국 특허 제4,670,417호)와 같은 거대 분자와 커플링시킨다. 그러나, 이렇게 결합된 헤모글로빈은 산소 친화력이 증가하며 커플링 물질의 특유한 바람직하지 못한 성질을 갖는 경향이 있다. 분자내 가교 결합은 "디아스피린" 에스테르의 사용(Tye, 미합중국 특허 제4,529,719호; Walder, 미합중국 특허 제4,598,004호 참조) 및 "과요오드산염으로 산화된 아데노신 트리포스페이트(o-ATP)"의 사용에 의해 달성된다[F. J. Scannon, "Molecular modification of hemoglobin," Critical Care Medicine, 10권:제261-265페이지(1982년); A. G. Greenburg 및 P. W. Maffuid, "Modification of hemoglobin-Ring opened diols," Advances in Blood Substitute Research, Alan R. Liss, New York:제9-17페이지(1983년) 참조]. 그러나, 디아스피린-헤모글로빈은 여전히 단시간 동안 혈관내에서 지속되고(반감기:3-4 시간), ATP-헤모글로빈은 고농도의 met-Hb, 고 산소 친화력 및 짧은 반감기로 인해 만족할 만하지 못한 것으로 나타났다.

인체 Hb와 피리독살-5'-포스페이트 및 글루타르알데히드를 반응시켜 중합된 피리독살화 Hb("폴리-PLP-헤모글로빈"), 즉, 저 산소 친화력 및 연장된 혈관내 지속능을 가진 헤모글로빈을 생성시킴으로써 상당한 진전이 있음이 보고되었다[G. S. Moss 등, "Hemoglobin solution-From tetramer to polymer," Biomaterials, Artificial Cells and Artificial Organs, 16(1-3)권:제57-69 페이지(1988년); F. DeVenuto 및 A. Zegna, "Preparation and evaluation of pyridoxalated-polymerized human hemoglobin." Journal of Surgical Research, 34권:제205-212페이지(1983년) 참조]. 그러나, 피리독살화는 중합을 방해하여 피리독살화된 많은 Hb가 중합화되지 않도록 하는 반면에, 중합화된 Hb는 피리독살화되지 않는다는 점을 발견하였다. 이 결과, 용액 주입후 O₂운반 기능이 양호한 Hb가 신장에 의해 신속히 분비되고, 순환에 잔류하는 Hb는 높은 산소 친화력을 갖는다.

과거 수년 동안, 헤모글로빈의 고유 독성에 관한 문제가 제기되어 왔다. 한편, 실험적 관찰은 Hb의 혈관 수축 작용을 보고하였다. 다른 한편, Hb는 met-Hb로 자기 산화되는 경향이 있기 때문에 (즉, 헴 철이 제일철 +2로부터 제이철 +3 상태로 산화하여, 독성 산소 유리 라디칼을 생성), 혈행에 융합될 때 프로-옥시던트로서 작용할 수 있는 것으로 추측되어 왔다. 이러한 작용은 세포막의 지질 과산화를 일으키며 세포 구조의 손상을 일으킬 것이다. 이러한 두 효과, 즉 혈관 수축 작용 및 산소 유리 라디칼의 생성은 출혈에 의한 허혈-저산소증 손상을 경감시키기보다는 오히려 악화시킬 것이다. 본 발명자 및 공동 연구자들에 의한 실험적 연구로부터, 혈관 수축 작용 및 라디칼의 생성이 모두 (1) Hb의 완전한 정제; (2) 저농도의 met-Hb 형성하는 Hb 분자의 제조 및 안정화; 및 (3) 산소 라디칼 스캐빈저의 첨가의 세 단계를 수행함으로써 조절될 수 있다는 것을 알 수 있다.

마지막으로, 천연 Hb 용액의 투여는 혈액 생성물 전염성 질병을 전염시킬 위험이 있다. 박테리아 및 기생충은 여과 또는 한외여과에 의해 쉽게 제거될 수 있는 반면에, 바이러스는 좀 더 심각한 문제점을 나타낸다. 바이러스 불활성화의 2가지 방법이 당 업계에 공지되어 있다. 한가지는 데옥시 형태의 헤모글로빈을 pH 7.5에서 60로 10시간 동안 저온 살균하는 것으로 이루어진 물리적 방법이다. 이 방법은 인간 면역 결핍증 바이러스(HIV) 뿐만 아니라 모델 바이러스(sindbis, polio, pseudorabies)를 불활성화시키는 것으로 밝혀졌다. 다른 방법은 클로로포름으로 처리하는 것으로 이루어진 화학적 방법이다. 그러나, 두 방법 모두 특별한 처리를 하지 않으면 헤모글로빈에 대해 상당한 변성을 일으킨다.

따라서, 안정하고 산소 친화력이 낮으며 독성이 없고 혈액 전염성 질병원이 없는 개선된 혈액 대용품이 요구된다.

[발명의 요약]

본 발명은 정제된 포유 동물 헤모글로빈(Hb), 바람직하게는 소 Hb를 ATP(o-ATP), 예를 들면 과요오드산염으로 산화된 ATP를 써서 분자내 가교 결합시키고, 아데노신(o-아데노신), 예를 들면 과요오드산염으로 산화된 아데노신을 써서 분자간 가교 결합시킨 후, 환원 글루타티온(GHS)과 반응시키고, 임의로 비전해질 수용액 중에 용해시키고, 사용 직전에 예를 들면 만니톨, 전해질 및 임의의 다른 제약학적으로 허용되는 첨가제를 첨가함으로써 이루어지는 혈액 대용품에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 박테리아 내독소, 기질 인지질 및(또는) 비-Hb 단백질 및 펩티드로부터 Hb를 분리시키고; 용액 중에서 헤모글로빈을 카르복시 헤모글로빈으로 전환시키고; o-ATP를 써서 카르복시 헤모글로빈을 주로 분자내 가교 결합시키고; o-아데노신을 써서 카르복시 헤모글로빈을 주로 분자간 가교 결합시키고; 이 용액에 글루타티온, 예를 들면 환원 글루타티온을 첨가해서 o-아데노신 가교 결합반응을 중단시키고 Hb의 등전점을 낮추고; 가교 결합된 카르복시 헤모글로빈을 가교 결합된 옥시 헤모글로빈으로 전환시키고; 임의로, 제약학적으로 허용되는 가교 결합된 헤모글로빈 용액을 제조하는 것을 포함하는 혈액 대용품으로서 적당한 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

이와 같이 하여 얻어진 조성물은 안정하고, 순환 반감기가 약 24시간이며, 산소 친화력이 낮고, P₅₀값이 혈액의 P₅₀값과 유사하며, 독성 및 혈액 전염성 질환이 없다.

또한, 본 발명은 겸상 적혈구화 발증으로 인한 겸상 적혈구 빈혈을 앓고 있는 사람에게 겸상 적혈구화 증상을 호전시키는데 유효한 양으로 본 발명의 혈액 대용품을 정맥내 투여하는 것으로 이루어지는 겸상 적혈구 빈혈 치료 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 혈액 대체를 필요로 하는 사람에게 혈액 양 및(또는) 기능을 보충하는데 유효한 양으로 본 발명의 혈액 대용품을 정맥내 투여하는 것으로 이루어지는 혈액 대체를 필요로 하는 사람을 치료하는 방법에 관한 것이다.

다음 상세한 설명을 도면과 결부시켜 고려함으로써 본 발명이 더 잘 이해되므로 본 발명을 더 잘 인식되고 본 발명의 많은 잇점을 쉽게 인지하게 될 것이다.

[도면의 간단한 설명]

제1도는 크기 배제 컬럼을 이용한 HPLC에 의해 얻어지는 순수한 소 헤모글로빈의 스펙트럼 분석 결과를 나타낸다. 크로마토그램은 9.4분에서 단일 피크가 존재함을 나타내는데, 이는 테트라머 형태(64,000 달톤)의 헤모글로빈을 동정하는 것이다.

제2도는 DEAE 컬럼을 이용한 HPLC에 의해 얻어지는 순수한 소 헤모글로빈의 스펙트럼 분석 결과를 나타낸다. 크로마토그램은 20분과 36분 사이에서 수 개의 피크가 존재함을 나타내는데, 이 피크들은 다양한 Hb 성분의 다른 등전점에 해당한다.

제3(a)도 내지 제3(b)도는 저온 살균에 의한 정재 전(3A) 및 후(3B)의 소 헤모글로빈의 스펙트럼 인덱스를 나타낸다(DEAE 컬럼을 사용한 HPLC, 스펙트럼 파장 230-599nm). 제3(a)도에서는 무-Hb 단백질이 체류 시간 17분 및 51분에서 존재한다는 것을 나타내고, 제3(b)도에서는 무-Hb 단백질이 존재하지 않음을 나타낸다.

제4도는 o-ATP를 써서 분자내적으로 가교 결합시키고 o-아데노신을 써서 분자간 가교 결합시키며 환원된 글루타티온과 결합시킨 소 Hb의 HPLC 크기 배제에 의한 스펙트럼 분석 결과를 나타낸다. 크로마토그램은 6개의 피크를 함유하는 Hb 분자 응집체를 나타낸다.

제5도는 제4도와 같이 변형된 소 Hb의 HPLC-DEAE 컬럼에 의한 스펙트럼 분석 결과를 나타낸다. 크로마토그램은 체류 시간 51분에서 단일 피크를 나타낸다. 표면 음전하의 증가로 인해, 비변형된 Hb와 비교해 볼 때 Hb의 등전점이 이동되었다.

제6도는 등전 집속(IEF-Pharmacia)에 의한 시험 결과를 나타낸다.

제7도는 세파덱스(Sephadex) 컬럼으로부터 물에 의해 용출된 o-ATP 및 과요오드산 나트륨 반응 혼합물의 연속 분획물의 258nm에서의 흡광도를 나타낸다.

제8도는 음이온 교환 컬럼으로부터 용출제 A에 의해 용출된 o-아데노신 및 과요오드산 나트륨 반응 혼합물의 연속 분획물의 258 및 232nm에서의 흡광도를 나타낸다.

본 발명의 다른 목적, 잇점 및 특징은 당업계 숙련자에게는 하기 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.

[바람직한 실시 태양의 설명]

본 발명은 사람의 혈액을 대체하는 것과 관련이 있는 종래의 치료 방법을 개선하고자 하는 본 발명자들의 요망에서 유래하였다. 본 발명은 급성 실혈의 경우에 혈액을 대체할 뿐만 아니라 증상성 발증을 예방 및(또는) 경감시키기 위해 혈액 양의 적어도 일부를 신속하고 효과적으로 대체하는 것을 필요로 하는 혈액 질환을 앓고 있는 환자를 치료하기 위한 안전하고 효과적인 방법을 제공한다. 이러한 상황의 한 예는, 겸상 적혈구 빈혈을 앓고 있는 환자의 경우이다. 이 환자가 겸상 적혈구화 발증을 나타낼 때, 이들에게 본 발명의 혈액 대용품을 정맥내 투여하면, 발증에 의해 야기되는 증상을 예상외로 우수하게 경감시킬 수 있다.

본 발명은 실질적으로 발열 물질 및 미생물이 없는 활성 헤모글로빈을 o-ATP 및 o-아데노신과 반응시켜 가교 결합된 헤모글로빈을 형성시킨 것을 함유하는 조성물을 제공한다.

특히 바람직한 실시 태양에서, 본 발명의 조성물은 소 헤모글로빈을 이용한다. 그러나, 기타 다른 헤모글로빈 공급원도 이용할 수 있다.

또다른 바람직한 실시 태양에서는, o-아데노신을 사용한 가교 결합 반응을 중단시키기 위하여 후속해서 본 발명의 가교 결합된 헤모글로빈을 환원 글루타티온과 반응시키는데, 이것은 또한 Hb의 등전점을 낮추는 효과도 있다. 또다른 훨씬 바람직한 실시 태양에서, o-ATP는 과요오드산염으로 산화된 ATP로 이루어지고, o-아데노신은 과요오드산염으로 산화된 아데노신으로 이루어지고, 헤모글로빈은 과요오드산염으로 산화시킨 ATP를 써서 분자내 가교 결합시키고 또한 과요오드산염으로 산화시킨 아데노신을 써서 분자간 가교 결합시켜 폴리헤모글로빈을 형성한다.

o-ATP 및 o-아데노신은 둘다 푸린(P) 유도체이므로, 본 명세서에서는 이 생성물을 Hb-PP-GSH로 표시한다.

본 발명의 또다른 바람직한 실시 태양에서, 본 발명의 조성물은 헤모글로빈, o-ATP, o-아데노신 및 글루타티온을 약 1:3:10:20의 몰비로 함유한다. 본 발명의 가교 결합된 헤모글로빈의 분자량은 바람직하게는 약 130 내지 390 킬로달톤, 더 바람직하게는 약 190 내지 260 킬로달톤인 것이 좋다. 본 발명의 조성물 중 훨씬 더 바람직한 것은 헤모글로빈이 약 5미만의 met-헤모글로빈을 함유하는 것이다.

가장 바람직한 실시 태양에서, 본 발명의 헤모글로빈은 소 헤모글로빈으로 이루어진다.

헤모글로빈 제제는 하기의 바람직한 특성들을 갖는다:(1) 효율적인 산소 운반체이며, 특히 소 Hb는 여러 화학 반응에 의해 영향받지 않는 본질적으로 낮은 산소 친화력(P₅₀값:28mmHg)을 갖는다; (2) 효율적인 혈장 용적 팽창기로서 작용하며, Hb는 분자내 및 분자간 가교 결합되어 연장된 혈관내 지속능(반감기:24시간)을 갖는다. (3) 혈관 확장 특성을 가지며, Hb와 결합된 두 푸린 유도체는 노르에피네프린-유발성 혈관 수축 작용을 완화시킨다; (4) 환원 글루타티온 및 만니톨의 존재로 의해 프로-옥시던트 효과를 발휘하지 않는다.

소 헤모글로빈의 바람직한 특성은 증명되었다[M. Feola 등, "Development of a bovine stroma-free hemoglobin solution as a blood substitute," Surgery, Gynecology and Obstetrics, 157권:제399-408페이지(1983년) 참조]. 소 Hb는 대량 입수가 가능할 뿐만 아니라 인체 혈액에 특이적인 전염성 질병(특히, AIDS)을 피할수 있다는 점 이외에, 염수에 용해시킨 소 Hb는 인체 Hb P₅₀값의 2배 이상의 P₅₀값을 갖고(28:13 mmHg) 2,3-DPG 변성을 필요로 하지 않는다.

또한, 본 발명은 o-ATP 및 o-아데노신을 써서 가교 결합시킨 본 발명의 실질적으로 발열 물질 및 미생물이 없는 활성 헤모글로빈(Hb) 및 제약학적으로 허용되는 액상 담체로 이루어지는 혈액 대용품을 제공한다. 가장 바람직한 실시 태양에서, 이 담체는 제약학적으로 허용되는 담체, 더 바람직하게는 수용액이다. 본 발명에서는 Hb의 기능적 특성을 방해하지 않는 용액이라면 어떠한 것이라도 이용하기에 적당하다. 이 수용액은 비전해질 및(또는) 전해질을 더 함유할 수 있다.

본 발명의 한 실시 태양은 비전해질 수용액인 용액을 제공한다. 이 실시태양은 실시예 1에 기재하였다. 본 발명의 가교 결합된 헤모글로빈의 수용액에 첨가할 수 있는 비전해질의 예는 인체 알부민, 다른 혈장 성분 및 혈장이다. 그러나, 덱스트란 및 히드록시에틸 전분과 같이 본 발명의 가교 결합된 헤모글로빈의 산소 운반 기능을 방해하지 않으며 제약학적으로 허용되는 비전해질이라면 어떠한 것이라도 이용할 수 있다.

또 다른 실시 태양에서, 담체는 전해질을 함유하는 제약학적으로 허용되는 수용액이다. 이것은 실시예 2내지 4에 기재되어 있다. 일반적으로, 본 발명의 혈액 대용품에 이용할 수 있는 전해질은 나트륨, 칼륨, 칼슘 및 마그네슘 양이온, 및 클로라이드, 비카르보네이트, 글루코네이트 및 술포네이트 음이온이다. 후술하는 것들은 단지 예시적인 것에 지나지 않으며, 다른 것들도 이용할 수 있다:발열 물질이 없는 무균 완충액인 탐(THAM) 용액(주사 가능한 트로메타민; 미합중국 일리노이주 노쓰 시카고 소재 Abbott Laboratories 제품)을 첨가하여 pH를 약 8.1 내지 8.2로 조정한 주사 가능한(무균이며 발열 물질이 없는) 물; 염화나트륨 113 meq/l, 중탄산나트륨 27 meq/l, 염화칼륨 4 meq/l, 글루콘산칼슘 5 meq/l, 황산마그네슘 3.5 meq/l와 같은 전해질을 첨가한 주사가능한 물-탐 용액; 전해질로 균형화시킨 염수 용액(노르모솔 R; pH 7.4; 나트륨 140 meq/l, 칼륨 meq/l, 마그네슘 3 meq/l, 클로라이드 음이온 98 meq/l, 아세테이트 음이온 27 meq/l 및 글루코네이트 음이온 23 meq/l을 함유함; Abbott Laboratories 제품); 및 나트륨 130 meq/l, 칼륨 4 meq/l, 칼슘 3 meq/l, 클로라이드 음이온 109 meq/l 및 락테이트 음이온 28 meq/l을 함유하는 락트산염 함유 링거액(Abbott Laboratories 제품).

본 발명의 한 실시 태양에 따르면, 소 Hb의 산소 친화력은 혈액 대용품에서 클로라이드 이온의 농도 증가에 의해 더욱 저하될 수 있다. 이것은 혈액 대용품 1 l당 클로라이드 이온 약 10 내지 25 meq/l, 더 바람직하게는 혈액 대용품 1 l당 클로라이드 이온 약 15 meq을 첨가함으로써 달성될 수 있다.

잠재적 면역학적 문제에 관하여, 다른 포유 동물 종에 대한 Hb 수주법의 가능성은 당업계에 잘 증명되었다. 순수한 소 헤모글로빈은 반응의 임상학적 증거없이 아우크테르로니(Ouchterlony's) 시험에 의해 검출가능한 항체를 형성함이 없이 이론적 혈액 양의 1/3-1/2에 해당하는 양으로 토끼 및 원숭이에게 반복(6회 이하) 투여되었다[M. Feola 등, "Immunologic biocompatibility of hemoglobin solutions," Trasfusione del sangue(Italian), 33권:제121-128페이지(1988년) 참조].

박테리아 내독소가 없는 Hb 용액을 생성하기 위해, 본 발명의 제조 방법에 사용되는 방법은 감염을 치료하기보다는 방지하기 위한 것이다. 헤모글로빈에 대한 내독소의 친화력이 상기한 바와 같다면, 일단 상당한 감염이 발생되면, 정제를 수행하기가 불가능하지는 않지만 극히 어렵다. 실질적인 감염 방지법은 다음 조건을 필요로 한다:(1) 출발 물질은 최소 한도로 감염되어 있어야 한다; (2) 제조 단계는 폐쇄된 시스템으로 수행되어야 한다; (3) Hb와 접촉하게 될 모든 표면은 무균 상태이고 발열 물질이 없어야 한다; (4) 모든 화학물질은 순수해야 한다; (5) 모든 용액은 무균 상태이고, 발열 물질이 없어야 한다; 및 (6) 품질 조절은 모든 단계에서 실시되어야 한다.

내독소 검출을 위한 가장 민감한 방법은 "정량적 색소 생성 리물러스 시험법"이다(quantitative chromogenic limulus test, QCL-1000, Whittaker Bioproducts 참조). 출발 물질 또는 임의의 제조 단계에서의 헤모글로빈이 2 EU/ml 이상을 함유하는 것으로 밝혀지면, 그것은 폐기되어야 한다. 과정 전체에 걸쳐 낮은 감염도를 유지함으로써, 완전한 정제는 용액이 최종적으로 데톡시-겔(Detoxi-Gel, Pierce Chemical Company사 제품)과 같은 친화성 크로마토그래피 컬럼을 통과함으로써 이루어질 수 있다.

최종 정제와 관련되는 과도한 감염의 회피의 원리와 동일한 원리가 기질인지질(특히, 아미노인지질)의 제거에도 적용된다. 기질 감염을 피하기 위해, 본 발명의 방법은 문헌[J. R. DeLoach 등, Analytical Biochemistry, 157권:제191-198페이지(1986년)]에서 밝혀진 적혈구(RBC) 투석 및 한외여과를 위한 공지 방법을 포함한다. 이 방법에 따라서, RBC 현탁액이 약 150 내지 200 mOsm/l, 더 바람직하게는 약 160 mOsm/l의 삼투압에 도달할 때까지 RBC를 저장성 인산염 용액에 대해 트래베놀(Travenol) 인공 신장을 이용하여 투석시킨다. 이때, RBC는 구형을 나타내며 세포막의 기공은 신장된다. 그 후에, 세포를 약 5 내지 15 psi, 더 바람직하게는 10 psi 컬럼 압력 하에 약 0.1기공 아미콘 필터(Amicon filter)를 통해 한회 여과시킨다. 이렇게 하여 헤모글로빈은 세포막을 파괴시키지 않고 세포를 빠져 나온다. 본 발명에 따라서, 단일 폐쇄-시스템 과정은 RBC 투석 및 한외여과에 유용하다. 이 단계는 무균성이며, 발열 물질이 없으며, 일회성이다. 투석 유체는 인산염 용액 대신에 예를 들면, 헤모글로빈 산화를 감소시키는 탐 용액으로 pH 약 8.0 내지 8.4, 바람직하게는 약 8.2로 조절된 무균 상태이고 발열 물질이 없는 상태의 탈이온수로 이루어진다. 그러나, 기타 다른 비전해질도 이용될 수 있다. 이러한 과정의 결과는 극미량의 아미노인지질 PE 및 PS가 존재하는(박층 크로마토그래피에 의해 측정) 3-5 mg/dl의 인지질('Phospholipid test set"에 의해 측정됨, Boeringer-Manheim Diagnostics사 제품, Indiana주 Indianapolis 소재)을 함유하는 Hb 용액이다. 이러한 잔류하는 인지질은 예를 들면 클로로포름 추출에 의해 제거된다. 저농도의 인지질이 존재하기 때문에, 이의 제거 단계는 저농도의 클로로포름을 사용하여 단시간 원심분리에 의해 수행될 수 있다. 이렇게 하여, 헤모글로빈의 변성은 방지된다. 그러나, 인지질의 제거는 단백질 변성을 피하거나 또는 최소화하는데 주의한다면 당업계 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다.

무헴 단백질 및 펩티드로부터 헤모글로빈을 정제하는 경우에도 같은 원리가 적용된다. 이러한 경우에, 제1단계는 적혈구의 "정제" 기간 동안의 모든 혈장 단백질의 제거를 포함한다. 여기에서는 적혈구막의 대규모 파괴없이 RBC로부터 Hb를 추출할 수 있으며, 따라서 기질 단백질에 의한 감염을 방지한다. 이어서, Hb 정제는 선택적 열 침전법(selective thermal precipitation)에 의해 이루어진다 [P. A. Belter, E. L. Cussler, W. S. Hu, editors, Bioseparations, John Wiley & Sons, New York:제227-229페이지(1988년) 참조]. 이러한 방법에서 단백질의 변성 및 침전은 온도를 약 56 내지 72, 더 바람직하게는 약 60 내지 70로 증가시킴으로써 달성된다. 단백질에 대한 이러한 처리는 다음과 같은 아레니우스 온도 의존성이 있는 1차 화학 반응 속도론에 따른다.

여기서, P는 용해된 단백질 농도이다. 비례상수 k는 다음과 같이 구해진다:

여기서, ko는 특정 상수이며, E/R은 변성의 활성화 에너지이며, T는 온도이다. 변성 에너지는 단백질마다 다르다. 식에서 E는 지수로 나타내기 때문에, 온도가 약간 변화될 때에도 그것은 큰 영향을 받는다. 이 에너지는 pH 변화에 의해서도 영향을 받는다. 일산화탄소로 포화된 헤모글로빈(HbCO)은 pH 약 7.6-7.8에서 온도 유발성 침전에 대해 저항성이 있다. HbCO 용액을 약 56 내지 64, 더 바람직하게는 60에서 9시간 동안 저온 살균하고, 이어서 약 68 내지 74, 바람직하게는 약 70에서 약 0.45 내지 1.15시간, 더 바람직하게는 약 1시간동안 pH 약 7.6-7.8에서 약 8 내지 12 g/dl, 더 바람직하게는 약 10 g/dl의 HbCO 농도에서 저온 살균한다. 이러한 조건하에서 헤모글로빈은 거의 변성되지 않고 모든 무헴 단백질이 침전된다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 바와 같은 용액 중의 무-헤모글로빈 단백질의 존재는 등전 집속법(IEF) 및 크기 배제법(size-exclusion) 및 음이온 교환 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 증명되었다. 회수된 헤모글로빈의 비변성 상태는 IEF 상의 집속된 밴드의 "얼룩(smudging)"의 부재 및 산소 전달 기능의 보존에 의해 증명된다(산소 해리 곡선, P₅₀, Bohr 효과).

정제 과정의 부산물은 바이러스의 불활성화이다. 사실상, 클로로포름 추출은 혈장 및 혈청에서 B형 간염, 비 A형, 비 B형 간염, 종두증 및 천연두 바이러스와 같은 지질로 엔벨럽된 다수의 바이러스를 불활성화시키는 것으로 밝혀졌다(Feinston 등, "클로로포름에 의한 B형, 비A형, 비B형 간염 바이러스의 불활성화", Infection and Immunity 제41권 제816-821페이지(1983)). 지질이 없는 몇가지 바이러스(레오바이러스)는 클로로포름으로 부분적으로 불활성화될 수도 있다. 한편, 약 56 내지 64, 더 바람직하게는 60에서 약 9 내지 12시간, 더 바람직하게는 약 10시간 동안의 저온 살균은 인간 면역결핍증 바이러스(HIV) 뿐만 아니라 다수의 비-지질 엔벨럽 바이러스를 불활성화시키는 것으로 증명되었다(T. N. Estep 등, "열에 의한 헤모글로빈 용액의 바이러스 불활성화", Biomaterials, Artificial Cells, and Artificial Organs 16(1-3); 129-1343 (1988)).

글루타르알데히드 중합 반응의 공지의 바람직하지 않은 효과 때문에, 본 발명의 방법은 아데노신 5'-트리포스페이트(o-ATP)의 디알데히드 유도체를 사용하여 테트라머 형태의 Hb 분자를 안정화시킨다. ATP 분자는 세가지 기본 성분, 즉 푸린 염기 아데노신, 당 D-리보스 및 트리포스페이트 사슬을 갖는다.

아데노신 트리포스페이트(ATP)

과요오드산 나트륨으로 ATP를 산화시키면 2',3'-시스 부위에서 리보스 고리가 개환되어 2',3'-디올이 대응하는 디알데히드로 변형된다[P. N. Lowe 등, "Prepara-tion and chemical properties of periodate-oxidized adenosine triphosphate and some related compounds, "Biochemical Society Transsactions, 7권:제1131-1133페이지(1979년) 참조].

o-ATP 분자의 각 알데히드기는 리신의-아미노기와 반응하여 쉬프(Schiff) 염기 부가물을 형성한다.

헤모글로빈의 2,3-DPG 포켓은 2,3-DPG와 결합하는 Hb 분자 내의 영역이다. 이 영역은 2개의 리신을 함유하기 때문에, o-ATP를 사용하여 이러한 기를 가교 결합시키는 것이 가능하며, 이렇게 하여 테트라머 형태의 분자를 안정화시킨다. 트리포스페이트 사슬의 존재는 이러한 반응의 특이성을 증가시키며, 이러한 특이성은 피리독살-5'-인산염과 같은 다른 폴리인산염에 대해 증명되었다. 다른 화합물에 대한 ATP의 잇점은 아데닌 잔기에 의해 제공된다. 생체 내에서 ATP는 ADP, AMP 및 마지막으로 아데노신으로 가수분해한다. 이 가수분해는 전신 및 폐동맥 혈행에서 모두 유익한 약리학적 효과, 주로 혈관 확장 작용을 하는 것으로 밝혀졌다. 출혈 쇼크시에 ATP가 염화 마그네슘(MgCl₂)과 혼합될 경우 또 다른 유익한 효과가 나타났다. 이것은 미세 혈행의 개선, 세포막 기능의 개선 및 세포내 아데닌 뉴클레오티드의 회복에 대한 "프라이밍(priming)" 효과를 포함한다[I. H. Chaudry 및 A. E. Baue, "Overview of hemorrhagic shock," Phathophysiology of shock, anoxia 및 ischemia, R. A. Cowley 및 B. F. Trump, editors, Williams and Wilkins, Baltimore, Maryland:제203-219페이지(1982년) 참조].

상기한 바와 같이, 화학 반응으로 인해 허용될 수 없는 농도(30이하)의 met-Hb가 생성되며 o-ATP로 변형된 Hb가 단시간의 혈관내 지속능을 갖기 때문에, Hb를 O-ATP를 써서 가교 결합시키는 이전의 시도는 성공적이지 못했다.

그러나, o-ATP의 산화제 효과는 화합물 중에 존재하는 미량의 요오드산 음이온(IO₄ ^-및 IO₃ ^-)에 의한 것이다. 사실상, o-ATP의 완전한 정제(실시예 10 참고)는 그러한 문제를 실질적으로 해결한다. 또한, 이전에 행해진 바와 같이 met-Hb 형성은 o-ATP와 데옥시-Hb와의 반응에 의해서가 아니라 카르복시-Hb와의 반응에 의해서 최소화될 수 있다. 용액의 pH가 약 7.25 내지 7.15, 더 바람직하게는 약 7.20으로 감소될 때 o-ATP와 HbCO와의 반응이 일어날 수 있다.

그러나, 단시간의 혈관내 지속능의 문제점이 남아있다. 테트라머 형태의 분자내 가교 결합된 Hb는 신사구체를 통해 여과되며 신소관을 손상시킨다. 그러므로, 적절한 혈관내 지속 시간이 달성되고 신장 손상을 피할 수 있다면 헤모글로빈을 분자내 뿐만 아니라 분자간 가교 결합시킬 필요가 있다.

본 발명은 제2가교 결합제로서 제2푸린 유도체, 즉 아데노신 또는 과요오드산염으로 산화된 아데노신(o-아데노신)의 디알데히드 유도체를 이용한다. Hb 분자가 그의 표면상에 44개의 리신 아미노기를 가지고 있기 때문에, 이들기중 2개이상을 브리지하여 2개 이상의 Hb 테트라머를 결합시키는데 o-아데노신을 이용하는 것이 가능하다. 다른 화합물에 대한 아데노신의 잇점은 몇가지가 있다. 먼저, 아데닌의 존재로 인해 아데노신은 ATP와 유사한 혈관 확장 작용을 갖는다[C. Su, "Extracellular functions of nucleotides in heart and blood vessels," Annual Review of Physiology, 47권:제665-676페이지(1985년) 참조]. 또한, 아데노신은 혈소판 응고를 방해하며 신장에서의 사구체 여과를 개선시키는데, 두 작용 모두 출혈 및 재환류 후에 잇점이 있다[R. M. Berne:Regulatory Functions of Adenosine, Martin Nijhoff Publisher, Boston, Massachusetts(1983년) 참조].

헤모글로빈과 o-아데노신과의 반응은 당업계에 알려져 있지 않다. met-Hb 형성을 감소시키기 위하여 카르복시 형태의 헤모글로빈(HbCO)과의 반응을 수행하는 것이 중요하다. 마지막으로, 반응은 예를 들면 약 25 내지 10의 저온에서는 서서히 진행되고, 약 4에서는 매우 서서히 진행된다. 이러한 조건은 반응이 바람직한 분자 응집체 형성 후에 임의의 시간에서 반응을 중지시킬 수 있기 때문에 바람직하다. 이러한 특징은 계획되고 재생가능한 방식으로 다른 분자 크기의 Hb 중합체의 제조를 가능케한다(글루타르알데히드와 같은 다른 가교 결합제의 사용으로는 수행될 수 없다). o-아데노신을 사용한 헤모글로빈의 가교 결합은 리신과 같이-아미노기를 갖는 환원 글루타티온(GSH)의 첨가에 의해 중지된다. 이 반응에 참여함으로써 GSH는 Hb 조성물의 일부가 된다.

적혈구에서 GSH의 주요 기능은 산화 스트레스로부터 헤모글로빈을 보호하는 "산화제 트랩"으로서 작용하는 것이며, 적혈구에 GSH가 풍부하기 때문에 GSH는 바람직한 중지제이다[A. Larson:Functions of Glutathione:Biochemical, Physiological, Toxicological and Clinical Aspects, Raven Press, New York (1983년) 참조]. GSH는 적혈구 환경 내에서 뿐만 아니라 용액 중의 헤모글로빈을 보호한다. Hb의 o-아데노신과의 가교 결합에 이은 GSH와의 반응은 Hb의 등전점을 약 6.8에서 6.1 - 6.2로 저하시켜 Hb 분자 표면 상의 음전하를 증가시킨다. 이것은 헤모글로빈의 안정화에 기여하며, 신장을 통한 여과를 방지함으로써 혈관내 지속능을 연장시킨다.

o-ATP 및 O-아데노신은 시판 제품(Sigma Chemical Co.사 제품, 미주리주 세인트루이스 소재)으로 수득할 수 있거나 또는 이하의 실시예 10 및 실시예 11에 기재한 방법에 따라 제조될 수 있다. 환원 글루타티온은 시판 제품으로서 얻을 수 있다.

이 반응들을 수행하고 카르복시 헤모글로빈을 옥시 헤모글로빈으로 재전환시킨 후, 얻어진 화합물(Hb-PP-GSH)을 저장 필요성에 따라 여러 가지 매질에 용해시킬 수 있다. 용액을 수개월 동안 또는 심지어 수년동안 저장하고자 한다면, 20mM 탐 용액을 첨가함으로써 pH를 약 8.1 내지 8.2로 조정한 "주사 가능한" 발열 물질이 없는 무균의 물에 용해시킬 수 있다. 본 발명자들은 알칼리성 pH, 즉 pH 8.1 내지 8.2의 물에 용해된 Hb가 자기 산화성이 감소되어 pH 약 7.4의 전해질 용액에 용해된 Hb보다 더 오랜 기간 동안 저장할 수 있다는 것을 발견하였다. 이 경우, 전해질은 사용 직전에 용액에 첨가할 수 있다(상기 예 참조). 다른 한편, 용액을 수시간 또는 수일 내에 사용하고자 한다면, Hb-PP-GSH를 노르말 R(상기 예 참조)과 같은 전해질로 균형화된 염수 용액에 직접 용해시킬 수 있다. 별법으로, 이 화합물은 기타 다른 것들 중에서도 락트산염이 함유된 링거액(상기 예 참조) 또는 저장성 또는 등장성 염화나트륨 용액에 용해시킬 수 있다. 본 발명의 혈액 대용품을 출혈성 쇼크의 치료에 이용하고자 한다면, 이 용액에, 바람직하게는 사용 직전에, 염화마그네슘(MgCl₂)을 조성물 중의 ATP의 양과 거의 등몰량으로 첨가할 수 있다. 이것은 ATP가 소순환에 유익한 효과를 보충하고, Hb의 산소 친화력을 감소시켜 더 양호한 조직 산소화를 제공하는 과량의 클로라이드 이온을 제공한다는 점을 발견하였다.

만니톨은 다른 라디칼 뿐만 아니라 OH 라디칼(가장 독성인 산소 유래 유리 라디칼)의 스캐빈저로서 작용하기 때문에 사용 직전에 첨가하는 것이 바람직하다. [B. A. Freeman and J. D. Crapo, "Free radicals and tissue injury," Laboratory Investigation, 47권:제412-426페이지(1982년) 참조]. 일반적으로, 만니톨은 용액중의 약 0.5 내지 2.0 mg/ml, 바람직하게는 약 0.8 mg/ml의 양으로 첨가될 수 있다.

본 발명은 (a) 혈장 양을 복원해서 유지하고, (b) 생체 기관에 산소를 공급하고, (c) 출혈 후의 혈관 수축 작용을 완화시킬 수 있는 혈액 대용품으로서 유용한 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 사람을 포함한 포유 동물에 투여할 때 독성이 없으며, 혈액 전염성 질병 입자가 없는 혈액 대용품을 제공한다.

본 발명의 다른 목적, 특징 및 잇점은 본 발명에 따른 이하의 바람직한 실시 태양의 상세한 설명에 의해 명백해질 것이다.

[실시예]

본 발명에 따른 복합 생성물을 제조하기 위한 바람직한 방법은 다음 5가지 단계로 이루어진다:(A) 적혈구의 정제; (B) 헤모글로빈의 추출; (C) 헤모글로빈의 정제; (D) 헤모글로빈의 변형(o-ATP, o-아데노신 및 글루타티온과의 반응); 및 (E) 최종 생성물(Hb-PP-GSH)n의 제조.

[실시예 1]

[적혈구(RBC)의 정제]

상기한 바와 같은 이유로 본 발명의 조성물의 바람직한 출발 물질은 소 혈액이다. 그러나, 본 발명의 조성물의 제조 방법은 인간의 혈액을 포함한 다른 포유 동물의 혈액으로부터 출발하는 경우에도 적용될 수 있다. 소 혈액은 다수의 건강한 공여체로부터 또는 도살장에서 희생된 개별적인 동물로부터 얻을 수 있다. 첫 번째 경우에서는, 성숙한 소를 감금시켜 목을 베고 가죽을 방부제로 처리하였다. 혈액은 무균 조건하에 외측 경정맥에 구멍을 뚫어 채취하였다. 혈액 약 1,500ml를 한 동물로부터 얻어, ACD 항응고제(Virbac, Inc.사 제품 Kansas주 Lenexa 소재) 200ml를 함유한 배기되고 무균 상태인 발열 물질이 없는 2리터 용량의 병에 모았다. 두 번째 경우에서는, 동물을 도살시키기 전에 기절시킨 후에, 목의 한쪽을 신속히 준비하여 투관침을 경동맥에 경피적으로 삽입하였다. 성숙한 소 각각으로부터 혈액 약 10 리터를 채혈하였다. 다른 동물로부터 얻은 혈액은 혼합하지 않았다. 병을 실험실로 이동시키기 위해 얼음에서 유지시켰다.

특히 소 혈액을 출발 물질로 사용하였을 경우에는 RCB(적혈구)를 백혈구, 혈소판 및 혈장으로부터 완전히 분리하는 것이 중요하다. 이러한 단계는 무-헴 단백질 및 결국은 헤모글로빈이 정제되어야 할 필요가 있는 다른 물질의 부하를 감소시킨다. 또한, 모든 백혈구를 제거함으로써 이러한 세포에 관련된 바이러스(사이토 메갈로바이러스, 인간 면역결핍증 바이러스 등)를 제거하게 된다.

RBC는 "스핀-냉각-필터(spin-cool-filter)"법에 의해 정제한다. "스핀" 단계는 다음과 같이 DIDECO 시스템(Electromedics, Inc., Colorade주 Englewood 소재)과 같은 보존혈(blood bank) 세포 분리기의 사용에 의해 폐쇄 시스템 방식으로 수행되는 반복 원심분리로 이루어진다:15에서 20분 동안 1,100 rpm으로 원심 분리시켜 혈소판 및 혈장을 제거한다; 15에서 10분 동안 4,500 rpm으로 원심 분리시켜 혈장을 더욱 완전히 제거한다; 등장성 식염수(RBC/염수 1:4)로 세척하고(4회), 이어서 4에서 10분 동안 4,100rpm으로 원심분리시킨다; pH 8.1-8.2의 등장 탐(Tham) 용액(Tham USP, Abbott Laboratories, Illinois주 North Chicago 소재)으로 최종 세척한다; 이러한 과정은 세척된 RBC의 현탁액을 전해질이 없는 고 pH 용액으로 만들어 헤모글로빈을 산화로부터 보호한다.

"냉각" 과정에서는, RBC를 "전달 팩(transfer packs)" (Illinois주 Deerfield 소재, Fenwal Laboratories사 제품인 무균 상태이고 발열 물질이 없는 플라스틱 용기)내에서 4에서 철야 또는 18시간 동안 저장한다. 저온에서, 백혈구는 소형 응집괴로 응집되는 경향이 있다. "필터" 단계에서는, 세포를 백혈구 응집체를 제거하는 "고용량 수주 필터(Fenwal사 제품)"와 같은 20μ셀룰로오스 필터에 통과시켰다.

백혈구 및 혈소판의 부재를 확인하기 위해 코울터(Coulter) 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수하고 현탄액 중의 단백질의 부재를 통상적인 화학적 방법에 의해 증명하였다. 박테리아 내독소의 존재는 "정량적 색소생성 리물러스 시험법(quantitative chromogenic limulus test)" (QCL-1000, Whittaker Bioproducts, Maryland주 Walkersville 소재)을 이용하여 확인하였다.

[실시예 2]

[헤모글로빈의 추출]

RBC로부터의 헤모글로빈 추출은 2단계로 실시되었다. 먼저, pH 8.1-8.2의 등장성 탐 용액에 농도 20(헤마토크릿 0.20)로 현탁된 RBC 1리터를 "표면적이 10 Ft2인 크로스플로Ⅱ필트레이션 모듈"과 같은 0.20μ의 다공도를 가진 인공 신장을 이용하여 저장성 탐 용액 10 리터(230 mOsm/L)에 대해 투석하였다. 투석은 투석물이 붉은 색조(헤모글로빈 색조)를 띨 때까지 실시된다. 이 시점에서, RBC는 구형으로 팽창되며, 신장된 세포막은 Hb에 대해 투과성이 된다. 제2단계에서, 10 psi의 압력을 인공 신장에 가해 세포막을 파괴시키지 않고 세포밖으로 Hb를 추출해 낸다. 한번 통과시킨 후에 막 "고스트(ghost)"를 폐기시킨다. 헤모글로빈이 저장성 용액 저장기에 유입될 때, 탐 용액 230 mOsm/L를 첨가하여 RBC저장기내의 용적을 유지하였다. 추출된 헤모글로빈을 "포시딘 I. V. 필터"(PALL Biomedical Inc., Puerto Rico, Fajardo 소재)와 같은 0.20μ필터에 통과시켜 여과시켜 잔류하는 특별한 찌꺼기 또는 미생물 오염 물질을 제거하고 "전달 팩"에서 4로 저장하였다.

이러한 과정의 결과는 극미량의 아미노인지질 PE 및 PS(박층 크로마토그래피에 의해 측정됨)를 갖는 인지질 3-5mg/dl("phospholipid test set"를 이용하여 측정, Boeringer-Manheim Diagnostis, Indiana주 Indianapolis 소재)를 함유하는 Hb 용액이다.

[헤모글로빈의 정제]

헤모글로빈의 정제는 다음 4단계로 이루어진다:

[실시예 3]

[카르복시 형태의 헤모글로빈(HbCO)의 저온살균]

저온살균은 "NBS 모델 ML-4100 조절 시스템을 가진 마이크로리프트-15리터 살균 처리용 생물학적 반응기(sterilizable-in-place bioreactor)"(New Brunswick Scientific Co., New Jersey주 Edison 소재)와 같이 예비 살균되고 발열 물질이 없는 생물학적 반응기 내에서 수행된다. 이 반응기는 가스 및 액체를 위한 다수의 유입 부위, 샘플 주입구, 교반을 위한 교반기 및 온도 조절기가 부착된 폐쇄된 용기이다. 생물학적 반응기는 배기 "가스 후드" 밑에 설치되어 있다. 헤모글로빈은 4에서 서서히 교반시키며 760mmHg의 무균 가스로 연속적으로 플러쉬시켜 일산화탄소(99.99순도, Criogenic Rare Cas Co.사 제품, South Carolina주 Hanahan 소재)로 포화시켰다. 총 포화도는 쿡시메터(cooximeter)(Model 282, Instrumentation Laboratories, Massachusetts주 Lexington 소재)를 사용하여 증명하였다. 이 과정은 약 15분이 소요되었다. 이 용액을 760mmHg에서 CO하에 방치해 두었다. 생물학적 반응기 내의 온도를 4에서 60로 점차적으로 상승시켜 저온 살균을 실시하고, 9시간 동안 그 상태로 둔 다음 1시간 동안 70로 상승시켰다. 이러한 간격으로, 온도를 다시 점차적으로 4로 저하시켰다.

[실시예 4]

[클로로포름을 이용한 원심분리]

이 단계에서는, 생물학적 반응기로부터 제거한 Hb 용액을 적당한 캡으로 밀봉된 250ml 용량의 무균 상태의 발열 물질이 없는 원심분리용 병(클로로포름, 단백질 및 알콜에 대해 내성이 있는 "폴리알로머"병, Sorvall Division, Du Pont Co., Delaware주 Wilmington 소재)에서 0.20μ필터를 통하여 여과시켰다.

소르발(Sorvall) 원심분리기(로터 TFA 20.250이 장착된 Model OTD75B)를 사용하여 다음과 같은 방법으로 3회의 원심분리를 실시하였다:15:1의 비율로 헤모글로빈과 혼합된 클로로포름(각 병 당 Hb 232ml; 클로로포름 18ml)을 4에서 30분 동안 760x g로 원심분리시켰다. 층흐름 후드 아래에서 무균 상태의 발열 물질이 없는 튜브 및 연동 펌프를 사용하여 상징액을 제2분류 병에 옮겼다; 16:1의 비율로 헤모글로빈과 혼합된 클로로포름을 4에서 15분동안 1,600 x g로, 15분 동안 3,800 x g로 원심 분리시켰다. 상징액을 제3분류 병에 옮겼다; 클로로포름없이 Hb를 60분 동안 61,400 x g로 원심 분리시켰다.

세 번째 원심 분리시킨 후에, Hb 용액을 1000ml 용량의 무균 상태이고 발열 물질이 없으며 배기된 상태의 교반 막대가 장치된 병(Abbott Laboratories)에 옮기고, 용액을 4에서 2시간 동안 서서히 교반시키며 무균 CO 가스로 플러쉬시켜 용액으로부터 잔류하는 미량의 클로로포름으르 제거하였다.

이 단계에서 사용된 클로로포름은 UV 컷오프(cutoff) 244nm의 HPLC 등급이다(Fisher Scientific Co., New Jersey주 Fair Lawn 소재). 병은 (a) E-TOXA-클린 솝(Clean soap)(Sigma Chemicals), (b) 에탄올 190 프루프(proof) 및 (c) 120에서 80분 동안의 멸균 처리에 의해 재사용 가능하다.

이러한 연속적인 원심분리는 모든 인지질을 제거할 뿐만 아니라 이전의 저온살균 단계에서 변성되고 침전된 무헴 단백질을 제거한다.

[실시예 5]

[내독소 친화성 크로마토그래피 컬럼을 통한 여과]

Hb 용액을 유입 및 배출 "전달 팩" 및 연동 펌프를 사용하여 패쇄된 시스템을 형성하는 데톡시-겔 컬럼(Pierce Chemical Co., Illinois주 Rockford 소재)과 같은 친화성 크로마토그래피 칼럼에 통과시켰다. 상기 절차는 클래스(Class) 100층 흐름 후드 아래에서 실시되었다.

이러한 단계에 의해, 내독소의 농도는 2.0-2.5 EU/ml에서 < 0.10 EU/ml로 감소될 수 있다.

[실시예 6]

[투석]

Hb 용액을 탐 용액의 첨가에 의하여 pH 7.20으로 조절된 무균 상태의 발열물질이 없는 탈이온수에 대해 1:10의 비율로 투석시켰다. 이러한 투석은 "90SCE-인공 신장"(C-DAK CO., Florida주 Miami Lakes 소재)과 같은 6000 달톤의 다공도를 가진 인공 신장을 사용하여 실시되었다. 이 단계는 소형 분자를 제거하고, 헤모글로빈을 10 g/dl로 농축시키고, Hb 용액의 pH를 약 8.2에서 약 7.2로 저하시킨다.

과정의 이 시점에서, "순수한" 헤모글로빈, 즉, 박테리아 내독소, 기질 지질 및 인지질, 및 무-헴 단백질이 완전히 제거된 헤모글로빈이 생산되었다. 또한, 과정의 여러 시점에서 0.20μ필터를 통한 반복된 여과가 모든 미생물 감염 물질을 제거하는 것으로 기대되는 반면, 저온 살균 및 클로로포름 처리는 비지질 및 지질엔벨럽 바이러스를 활성화시키는 것으로 기대된다. 또한, 카르복시-형태의 헤모글로빈의 사용은 그의 정제 과정을 낮은 산화도로 가능케한다(1-2.5met-헤모글로빈 형성).

[실시예 7]

[헤모글로빈의 변형]

헤모글로빈과 o-ATP, o-아데노신 및 환원 글루타티온과의 반응은 다음과 같이 생물학적 반응기 내에서 수행된다. Tham 용액으로 pH 7.20으로 조절한 물 중의 카르복시 상태의 헤모글로빈 10g/dl를 생물학적 반응기에 재도입하여, 일산화탄소 1기압하에 서서히 교반시키며, 4로 유지하였다.

실시예 10에 따라 제조되고 분말 형태로 저장된 o-ATP를 pH 7.20으로 조절된 무균 상태의 발열 물질이 없는 물에 용해시키고, 즉시 Hb/o-ATP=1:3의 몰비로 Hb 용액에 첨가하였다. CO 하에 24시간 동안 150rpm으로 교반시키며 4에서 반응이 진행하도록 하였다. 용액 시료를 6시간마다 채취하고, 크기 배제 컬럼을 사용한 HPLC로 시험하여 헤모글로빈의 분자량 증가를 측정하고 음이온 교환 컬럼을 사용한 HPLC로 시험하여 전하 변화를 측정하였다. 워터스 600E 시스템 콘트롤러, 워터스 712 인젝터, 워터스 990 포토다이오드 디텍터 및 NEC 파우어 Mate2 컴퓨터로 이루어진 워터스 HPLC 시스템을 사용하였다. 크기 배제 컬럼(Protein Pak 300 SW) 및 음이온 교환 컬럼(DEAE-5 PW)도 또한 워터스사(Waters Chromatography Division, Millipore Co., Massachusetts주 Milford 소재)로부터 구입하였다. 음이온 교환 HPLC에 의한 시험 결과 o-ATP의 90-95가 화학 반응에 사용되었다는 것을 나타낼 경우, 이상적인 가교 결합 조건은 약 24시간에서 일어난다. 그 결과, 하기 표의 성분으로 이루어진 분자 응집체가 생성되었다.

[표 1]

즉, 반응 조건하에 o-ATP는 주로 분자내 가교 결합을 형성하지만, 또한 약간의 분자간 가교 결합도 형성한다. 그러나, 이것은 다음 반응을 방해하지는 않는다.

24시간 후에, 실시예 11에 따라서 제조되어 분말 형태로 저장된 o-아데노신을 에탄올 몇 방울과 함께 탐 용액을 첨가하여 pH 7.20으로 조절한 멸균수에 용해하였다. 이 화합물을 Hb:o-아데노신=1:5의 몰비로 Hb 용액에 첨가하고, 동일 조건에서 24시간 동안 계속 반응시켰다. 이때 o-아데노신의 2번째 투여량을 같은 1:5의 몰비로 첨가하여 24시간 더 반응시켰다. 시료를 HPLC로 시험하고 Hb 테트라머의 농도가 70에서 30로 감소되었을 때 화학 반응을 중지시켰다. 반응이 이 시점 이상으로 진행되면 과도한 크기의 중합체가 생성된다. pH 7.20의 물과 탐 용액의 혼합물에 용해된 GSH를 Hb/GSH 1:20의 몰비로 Hb 용액에 첨가하고, 16시간 동안 반응시킨다. 이때, 헤모글로빈 분자 응집체는 하기 표의 성분들을 포함한다.

[표 2]

이 응집체는 50-51분에서 HPLC-DEAE에 의해 단일 피크를 나타내었다.

이러한 화학 반응의 종결시에, 헤모글로빈은 4에서 온화하게 교반시키며 "type 4051 molequartz(Mole-Richardson Co., California Hollywood 소재)에 연결된 석영 수은등(quartzline lamp), DWY, 120 V, 650 W(General Electric Co., Ohio주 Cleveland 소재)"에 의해 제공된 강한 빛에 20초 동안 노출시켜 35psi에서 무균 산소로 반복 플러쉬함으로써 카르복시 형태에서 옥시 형태로 재전환되었다. 헤모글로빈의 재산소화는 IL 쿡시메터의 사용으로 증명되었다.

[실시예 8]

[본 발명의 조성물의 제조 및 저장]

최종 단계에서, Hb 용액을 Hb 테트라머 백분율이 30에서 약 5로 감소될 때까지 약 65 내지 85 킬로달톤의 분자량 컷오프를 갖는 인공 신장("Duo-Flux"; C-DAK, 미합중국 플로리다주 마이애미 레이크스 소재)을 이용하여 pH 8.1의 50mM 탐 용액에 대해 투석시켰다. 최종 Hb 응집체의 분자 크기 프로필은 다음과 같다:

[표 3]

이렇게, 가장 큰 비율의 분자 종류는 분자량이 260,000달톤인 4개의 Hb 테트라머로 이루어진다. 응집체는 등전점이 6.8에서 6.1로 변화되는 50-51분에서 HPLC-DEAE에 의해 단일 피크를 나타내었다.

폐기된 헤모글로빈을 함유하는 투석물은 6,000달톤의 인공 신장(90 SCE 인공 신장(90 SCE 인공신장, C-DAK Co.)으로 투석시킴으로써 Hb 10g/dl로 농축될 수 있으며, o-아데노신과 분자간 가교 결합하기 위해 재사용되었다.

헤모글로빈 용액을 수시간 또는 수일 내에 이용하고자 하는 경우, 먼저 50mM 탐 용액에 대해 투석시킨 후, 전해질로 균형화시킨 염수 용액(노르모솔 R; pH 7.4; 나트륨 140 meq/l, 칼륨 5 meq/l, 마그네슘 3 meq/l, 클로라이드 음이온 98 meq/l, 아세테이트 음이온 27 meq/l 및 글루코네이트 음이온 23 meq/l 함유함; Abbott Laboratories 제품)에 대해 투석시킬 수 있다.

따라서, 최종 형태로, 본 발명의 변형된 헤모글로빈(Hb-PP-GSH)은 장기간 동안 보관하기 위해서는 물-탐 용액(pH 약 8.1 내지 8.2)에 또는 그다지 지체하지 않고 사용하기 위해서는 균형화시킨 전해질 용액(pH 약 7.4)에 약 10 g/dl의 농도로 용해시킬 수 있다.

장기간 저장하는 경우, 물-탐 용액에 용해시킨 Hb는 600ml 펜월 플라스틱백(발열 물질이 없는 무균 백; 미합중국 일리노이주 디어필드 소재 Baxter Healthcare Co.(펜월사의 자회사))에 넣어서 약 -90에서 냉동 보관할 수 있다. 이러한 조건 하에서, 약 1년까지는 헤모글로빈의 자기 산화가 일어나지 않는 것으로 발견되었다. 이 기간 동안, Hb의 중합화 프로필은 변하지 않았다(HPLC 및 등전 집속법으로 측정). 1내지 6개월의 중간 정도의 가간 동안 보관하는 경우에는, 물-탐 용액 중에 용해시킨 헤모글로빈을 액체 형태로 약 4에서 유리병(발열물질이 없는 무균의 "배기된 빈 용기"; Abbott Laboratories)에 보관할 수 있다. 이러한 조건하에서, Hb의 자기 산화가 약 1/개월의 속도로 일어나는 것을 발견하였다. 6개월에 걸친 기간 동안, 중합화 프로필은 거의 변하지 않으며, 옥타머 및 테트라머의 증가에 따라 거대 중합체가 약 5 내지 7감소하였다.

단기간, 예를 들면 1개월 미만 동안 보관하는 경우, Hb는 전해질로 균형화된 용액에 용해해서 4에서 액체 형태로 유리병("배기된 빈 병"; Abbott Laboratories 제품)에 보관하였다. 이 조건하에서, Hb의 자기 산화는 약 3 내지 5/1개월의 속도로 일어났다.

[실시예 9]

[본 발명의 조성물의 특성화]

다음의 방법들은 신규 생성물의 특성화를 위해 사용되었다. 헤모글로빈, met-Hb 및 카르복시-Hb 농도를 쿡시메터(Model 282 Cooximeter, Instrumentation Laboratories, Massachusetts주 Lexington 소재)로 측정하였다. 용액의 전해질 농도 및 삼투압은 아스트라(ASTRA) 장치(Beckman Co., California주 Palo Alto 소재)에 의해 측정하였다. 웨일(Weil) 장기 용적계(Instrumentation Laboratories)를 사용하여 교질 삼투압을 측정하였다. 브룩필드(Brookfield) 점도계(Brookfield Engineering Laboratories, Massachusetts주 Stoughton 소재)를 사용하여 37및 100/초의 전단율에서 점도를 측정하였다.

다른 단백질, 인지질 및 박테리아 내독소로부터의 Hb의 순도를 상기한 바와 같이 측정하였다. 산소 결합 용량은 쿡시메터로 측정한 Hb 농도 및 산소 양으로부터 계산하였다. Hb 산소 해리 곡선은 헴-O-스캔(Hem-O-Scan) 장치(SLM Aminco, American Instruments, Maryland주 Silver Spring 소재)으로 구하였다. 37, pH 7.40 및 pCO₂40 토르의 표준 조건하에 이 곡선 상에서 P₅₀값을 읽었다.

인산염 함량의 분석은 피스크와 서바로우법(Fiske and Subbarow)에 의해 실시하였다[Journal of Biological Chemistry, 66권:제375-380페이지(1925년) 참조]. GSH 함량의 측정은 리드(Reed) 등의 방법에 따라 실시하였다[Analytical Biochemistry, 106권:제55-62페이지(1980년) 참조].

258nm에서 흡광도를 측정하는 HPLC 및 사용된 양 및 헤모글로빈에 혼입된 양을 계산하여 아데노신을 검출하였다. ATP는 인산염을 측정함으로써 결정하였다.

특성화된 생성물은 (Hb-PP-GSH)n (여기서, Hb는 정제된 소 헤모글로빈, PP는 푸린 유도체 o-ATP 및 o-아데노신, GSH는 환원된 글루타티온)임이 동정되었다. 기본 분자는 제1도 및 2도에 나타낸 테트라머 형태의 Hb이다. 다른 단백질로부터의 정제는 제3도에 예시하였다. 헤모글로빈 각 밀리몰(mM)에 대해서, 화합물은 ATP 약 3mM, 아데노신 약 10 mM 및 GSH 약 20 mM을 함유하였다. 이러한 화학 조성, 및 제조 기간 중에 다양한 간격으로 실시된 HPLC 분석은 o-ATP가 Hb의 분자내 가교 결합에 주로 관여하는 반면, o-아데노신이 분자간 가교 결합을 형성함을 나타낸다. 또한, o-아데노신은 GSH 분자를 Hb에 앵커링(anchoring)시켰다. 이 화합물은 제4도 및 5도에 예시하였다. HPLC-크기 배제에 의한 스펙트럼 분석(제4도)은 그 화합물이 하기 표에 기재한 6종류의 분자로 이루어졌음을 나타낸다.

[표 4]

이 중에서, (Hb)₄, 즉, 4개의 테트라머의 응집체가 우세한 종으로 나타났다. HPLC-DEAE 컬럼에 의한 분석(제5도)은 50-51분에서 단일 피크를 나타냈는데, 이 피크는 이 화합물이 (비변형된 Hb에 비해) 감소된 균일한 등전점을 가진다는 것을 나타낸다. 등전 집속법(IEF)에 의한 분석(제6도)은 다른 배경으로부터 Hb의 이러한 변형을 나타낸다.

이 화합물(Hb-PP-GSH)를 물-탐 용액에 보관할 때, 다음과 같은 전해질을 사용 전에 첨가할 수 있다.

이밖에, 만니톨을 약 0.8 mg/1 ml 용액의 양으로 첨가할 수 있다. 이 용액을 이용하는 경우, 최종 헤모글로빈 용액은 하기 표에 나타낸 조성을 가질 수 있다.

[표 5]

이 화합물 (Hb-PP-GSH)를 노르모솔 R 중에 용해시켜서 보관하는 경우에는, 사용전에 만니톨만을 상기와 동일한 양으로 첨가한다. 이 최종 생성물의 특성은 노르모솔 R이 글루콘산칼슘을 전혀 함유하지 않는다는 점을 제외하고는 상기 표에 나타낸 것과 유사하다.

10 g/dl 농도에서, 대기 공기에 노출된 Hb 용액은 산소 13 용적를 전달하고, 이것은 산소 결합 용량이 100에 가깝다는 것을 나타낸다(Hb 1 gm 당 산소 1.3 용적). 고농도의 클로라이드로 인한 중합화에도 불구하고 용액의 P₅₀값은 높다(~28 mmHg). 그의 삼투압 농도는 혈장의 것보다 높지만, 점도는 백혈구의 것보다 낮다. 콜로이드 삼투압은 헤모글로빈이 중합화되어 "Hb 입자"의 수가 감소된다는 사실로 인해 헤모글로빈이 (알부민에 비해) 고농도임에도 불구하고 혈장의 것보다 더 낮다.

[실시예 10]

[o-ATP의 대규모 제조]

o-ATP의 기본적인 제조 방법은 당 업계에 공지되어 있다[S. B. Easterbrook-Smith 등, "Pyruvate Carboxylase:Affinity labeling of the magnesium adenosine triphosphate binding site," European Journal of Biochemistry, 62권:제125-130페이지(1976년) 참조].

대량의 물질을 생산하고 헤모글로빈과의 만족할 만한 화학 반응이 일어나도록 변형이 이루어졌다.

아데노신 5'-트리포스페이트 이나트륨염 수화물(ATP), F. W. 551.15 및 순도 99의 과요오드산 나트륨(NaIO₄) F. W. 213.89를 알드리치 케미칼 캄파니(Aldrich Chemical Company, Wisconsin주 Milwaukee 소재)로부터 구입하였다. 120-ml 세파덱스 G-10 컬럼 10개를 파마시아 파인 케미칼스(Phamacia Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey주 Piscataway 소재)로부터 구입하였다. 각 컬럼에 대해서, ATP 550mg을 0에서 탐 용액으로 pH 7.0으로 조절한 무균 상태의 발열 물질이 없는 물(주사용 증류수, Abbott Laboratories) 15ml에 용해시켰다. 과요오드산나트륨을 ATP/NaIO₄1:1.1의 몰비로 첨가하고 용액을 어둠속에서 4로 1시간 동안 방치해 두었다. ATP/에틸렌 글리콜 2:1의 몰비로 에틸렌 글리콜을 15분에 걸쳐 첨가하여 반응을 중지시켰다. 4에서 "주사용 증류수"로 미리 평형화시킨 세파덱스 G-10 컬럼에 반응 혼합물을 적재하였다. 컬럼을 물 200ml로 용출시켰다. 제7도에 나타낸 바와 같이 뉴클레오티드 피크의 앞쪽 절반, 즉 분획물 번호 20 내지 30을 한데 모으고, 즉시 <10μ Hg의 진공 상태로 -40에서 랩콘코 동결 건조 시스템(Labconco Freeze-Dry System, Stoppering Tray Dryer가 부착됨, Missouri주 Kansas City에 소재하는 Labconco Co.,사 제품)으로 즉시 동결 건조시켰다. 분말은 사용할 때까지 -90에서 빛이 차단된 병에 저장하였다.

258nm에서 흡광도를 측정함으로써 o-TAP의 농도가 검측되는데 반해, 과요오드산염의 존재는 232nm에서 흡광도를 측정함으로써 확인된다. 컬럼을 재사용하기 전에 용출액이 232nm에서의 흡광도가 0.043미만을 나타낼 때까지, 즉 모든 과용오드산염이 세척될 때까지 4에서 30분동안 주사용 증류수로 세척하였다.

본 발명의 목적을 위해서 두 가지 과정이 중요하다:(1) 과요오드산염이 조금도 없이 o-ATP를 함유한 분획물만을 모아야 한다:(2) 이러한 분획물을 즉시 동결건조시키고 -90에서 냉동시켜야 한다. 이러한 과정은 화학 반응시에 헤모글로빈의 산화를 방지할 것이다.

[실시예 11]

[o-아데노신의 대규모 제조]

o-아데노신의 기본적인 제조 방법은 당 업계에 공지되어 있다(J. X. Khym 및 W. E. Cohn, "Characterizations and some chemical reactions of periodate-oxidized nucleotides," Journal of American Chemical Society, 82권:제6380-6386페이지(1960년) 참조]. 대량의 물질을 생산하고 헤모글로빈과 만족할 만한 화학 반응이 일어나도록 변형이 이루어졌다.

98순도의 아데노신은 시그마 케미칼 코.(Sigma Chemical Co.)에서 구입하고, 과요오드산 나트륨은 알드리치 케미칼 코.에서 구입하였다. 아데노신 6g을 실온에서 30분 동안 물 중의 150 mM NaIO4 200ml에 용해시켰다. 용액을 피셔 사이언티픽 코.(Fisher Scientific Co.)에서 구입한 20 mM 아세트산(용출제 A)으로 미리 평형화시킨 음이온 교환 수지 AG 1-X-8, 100-200 메쉬 아세테이트 형태(Bio-Rad Laboratories, California주 Richmond 소재)의 300ml 컬럼에 통과시켰다. 컬럼을 4의 온도에서 15ml/분의 유속으로 용출제 A 2 리터로 용출시켜 분획물 150ml를 얻었다. 분획물 번호 2 내지 15만을 모아(제8도에 나타낸 바와 같음), o-ATP에 대해서 실시한 바와 같이 즉시 동결 건조시키고 냉동시켰다.

재사용하기 전에, 100mM 염화 암모늄(용출제 B) 6 리터를 컬럼에 넣어 모든 과요오드산염을 방출시켰다. 분획물 중의 과요오드산염의 농도는 232nm에서 흡광도를 측정함으로써 검측되었다. 이 후에, 컬럼을 "주사용 증류수" 6 리터로 세척하고 아세트산 20mM로 다시 평형화시켰다.

본 발명의 목적을 위해서 두가지 과정이 중요하다:과요오드산염이 조금도 없이 o-아데노신을 함유한 분획물만을 모아야 하고, 이러한 분획물을 즉시 동결건조시키고 -90에서 냉동시켜야 한다. 이러한 과정은 화학 반응 시에 헤모글로빈의 산화를 방지할 것이다.

[발명의 이용에 대한 설명]

[실시예 12]

[토끼에 대한 독성 시험]

과학 참고 문헌[M. Feola 등, "Toxicity of polymerized hemoglobin solutions," Surgery, Gynecology 및 Obstetrics, 166권:제211-222페이지(1988년)]에 이미 보고된 방법에 따라 본 발명의 신규 조성물(Hb-PP-GSH)의 독성을 토끼에 대해 시험하였다.

체중 4.0kg의 뉴질랜드산 토끼 12 마리를 1리도카인으로 국소 마취시켜 멸균 카뉼라를 한쪽 귀의 중심 동맥 및 다른쪽 귀의 말단 정맥에 주입하였다. 멸균 카테테르를 방광에 주입하였다. 국소 마취시켜 더미스터 프로브 및 ECG 침전극을 손과 발에 삽입하였다. 심전도(ECG), 혈압, 체온 및 뇨 배출량을 3시간 동안 계속적으로 모니터하고, 그 후에 카테테르와 침전극을 제거하고 동물을 그들의 우리로 되돌려 보냈다. 정상 상태(기저선)의 30분 후에, 혈액 양(토끼의 계산된 혈액 양=체중(kg 단위)의 6)의 1/3에 해당하는 혈액 80ml를 5분에 걸쳐 동맥으로부터 채혈하였다. 전해질 용액에 용해시킨 동량의 Hb-PP-GSH를 30분에 결쳐 정맥을 통하여 주입하였다. 이것은 헤모글로빈 약 2g과 동일하였다. 혈액의 제거는 심박도수의 증가로 인한 혈압 저하의 원인이 된다. 이러한 변화는 신속히 수정되었다. 또한, 맥박압(수축기 혈압 및 확장기 혈압 사이의 차이)는 출혈 후 좁아졌다가 처음에 정상으로 회복되고 그 후에 기저선에서 보다 더 커지게 되는데, 이는 Hb 용액의 혈관 확장의 효과를 나타낸다. 이 효과는 3시간의 전체 관찰 기간 동안 지속되었다. ECG는 심장 부정맥을 나타내지 않았다. 뇨 배출량은 뇨으로의 헤모글로빈의 일혈없이 정상으로 유지되었다.

혈액 대체 후 30분, 1시간, 3시간 및 24시간 만에 채혈한 혈액 시료는 다음과 같은 현상을 나타내었다:(1) 혈액 희석 효과를 초과하는 백혈구 및 혈소판의 감소가 일어나지 않음; (2) 혈청 피브리노겐, 프로트롬빈 시간 및 피브린 스플릿 생성물의 측정에 의해 검측되는 바와 같이 혈관내 응고 및 섬유소 용해가 활성화되지 않음; (3) 대뇌 또는 심근 손상을 암시하는 크레아틴 포스포키나제 뇌 이소엔자임(CPK-BB) 또는 심근 이소엔자임(CPK-MB)의 상승이 일어나지 않음; (4) 간 손상을 암시하는 혈청 글루탐산-피루브산 트랜스아미나제(SGPT)의 상승이 일어나지 않음; (5) 정상 폐동맥 기능의 지표가 되는 정상 동맥 혈액 기체; (6) 정상 신장 기능을 암시하는 정상 혈청 크레아티닌.

3시간 및 24시간만에 얻은 혈액 및 뇨 혼합 시료는 정상적인 크레아티닌 정화치를 나타내었으며, 이는 신장 기능이 정상임을 나타낸다. 전혈 산소 해리 곡선은 P₅₀값의 변화를 나타내지 않았다. 즉, 헤모글로빈에 의한 산소 친화력의 증가가 나타나지 않았다. 24시간에서의 혈장 Hb의 농도는 초기 농도의 약 50이며, 이는 헤모글로빈 반감기가 24시간임을 암시한다.

동물은 24시간 동안 정상으로 보였고 행동하였다. 이 때, 동물들을 희생시키고 생체 기관을 조직학적으로 시험하였다. 이전에 과학 참고 문헌에 보고 되었던 병리학적 변화가 (a) 심장, (b) 폐, (c) 간 및 (d) 신장에서 발견되지 않았다. 글루타르알데히드와 가교 결합된 비순수 헤모글로빈을 사용하는 이전의 보고(상기 참고 문헌 참조)와 매우 대조적이었다.

[실시예 13]

[토끼에서의 효능]

혈액 대용품으로서의 생성물의 효능을 토끼에서 시험하였다. 상기 실시예에 기재된 방법과 유사한 방법을 사용하여, 체중 4.0kg의 뉴질랜드산 토끼 10마리로 구성된 대조군에 대해 계산된 혈액 양(혈액 양=체중(kg 단위)의 6)의 1/3을 채혈하고, 이어서 15분 후에 1/3을 더 채혈하였다. 아무런 처리도 하지 않자, 모든 동물들은 1시간 내에 사망하였다. 10마리의 토끼로 구성된 실험군에 대해 상기 절차를 반복하지만, 전해질 용액에 용해시킨 Hb-PP-GSH를 총 혈액 손실량과 같은 양만큼 주입하였다. 모든 동물들은 생존하고, 7일 내에 그의 기저선 헤마토크릿(적혈구의 농도)을 재구성하였다.

[실시예 14]

[쥐에서 혈액 대체 후의 혈관 확장]

체중 350-450gm의 스프라그-다울리(Sprague-Dawley) 쥐 12마리에 소듐 펜토바르비탈 45mg/kg을 복강내 주사하여 마취시키고 앙와위로 수술대 위에 놓아두었다. 우대퇴 동맥, 경동맥 및 외부 경정맥을 수술적으로 노출시켜 폴리에틸렌 카테테르(Model PE 50; Intramedic, New York 소재)로 관류시켰다. 외부 경정맥 카테테르를 우심방에 도입하고 더미스터 프로브(Model If, Columbus Instruments, Ohio주 Columbus 소재)를 경동맥을 통해 상행 대동맥으로 도입하였다. 각각의 카테테르를 소 헤파린 5 IU/ml를 함유한 식염수로 채웠다. 우대퇴 동맥 및 경정맥을 압력 변환기에 연결하였다. 침전극을 손과 발에 피하적으로 삽입하여 심전도(ECG)를 모니터하였다. 가열 램프는 일정 체온을 유지하도록 조절되었다.

심박도수는 ECG 추적으로 측정하고, 실온으로 유지된 식염수 200μl를 우심방에 주입하고 대동맥 더미스터로부터 열희석 곡선을 기록하여 심장 혈액 박출량을 열희석 곡선에 의해 측정하였다. 체혈관 저항성은 평균 동맥압에서 우심방압을 빼고 심장 혈액 박출량으로 나누어 계산하였다.

기저선 혈압 동력학 데이터의 기록에 이어서, 계산된 혈액 양(쥐의 혈액 양=체중(kg 단위)의 7)의 ⅓을 5분에 걸쳐 대동맥에서 채혈하였다. 15분 후에, 동일 부피의 전해질 용액에 용해시킨 Hb-PP-GSH를 정맥을 통하여 주입하였다. 심박도수, 평균 동맥압 및 심장 혈액 박출량을 측정하고, 체혈관 저항성을 기저선(T₁), 혈액 제거후 15분(T₂) 및 헤모글로빈 주입 후 15분(T₃)만에 계산하였다. 페어드(paired) 데이터를 위해 스튜던트 t-시험법(Student's t-test)을 사용하여 데이터의 통계학적 분석을 실시하였다.

이하에 요약된 결과는 혈액 제거 후에 체혈관 저항성이 증가되고, 이어서 혈액 대체 후에 기저선에서 조차도 정상으로 감소되고 혈관 확장된다는 것을 나타낸다.

[표 6]

수=평균값표준편차;

*=이전의 시간 간격과의 통계학적 차이(P＜0.05)

[실시예 15]

[토끼에서의 산소 유리 라디칼 생성]

체중 4.0kg의 뉴질랜드산 토끼 12마리를 클로르프로마진(5mg/kg, 근육내 주입)으로 진정시키고 정의한 방법으로 처리하였다. 멸균 플라스틱 카뉼라를 한쪽귀의 중심 동맥 및 말단 정맥에 삽입하고, 더미스터 프로브 및 침전극을 손과 발에 피하적으로 삽입하였다. 계산된 혈액 용적의 ⅓(체중(kg)의 2)을 5분에 걸쳐 동맥으로부터 제거하고 동일 용적의 Hb용액을 30분에 걸쳐 정맥을 통하여 주입하였다. 토끼 6마리로 구성된 대조군에는 비변형된 Hb를 주입하고, 토끼 6마리로 구성된 실험군에는 전해질 용액에 용해시킨 Hb-PP-GSH를 주입하였다. 그 효과는 기저선, Hb주입 후 15분, 1시간, 3시간 및 24시간에서 측정한 과산화수소(H₂O₂) 및 과산화 지질의 혈장 농도로 연구하였다. 혈장 Hb 및 met-Hb도 또한 같은 시간간격으로 측정하였다.

비변형된 Hb를 주입한 군에서는, H₂O₂가 1시간 후에 22에서 705 마이크로몰/밀리리터(μmol/ml)로 증가되고, 3시간 후에는 505μmol/ml로 감소되고 24시간 후에는 105μmol/ml로 감소되었다. 실험군에서는, H₂O₂가 1시간후에 22에서 불과 102μmol/ml로 증가되고, 3시간 후에는 기저선으로 복귀되었다. 마찬가지로, 대조군에서 과산화 지질은 기저선에서 1.50.9nmol/ml이었다가 1시간 후에 4.01.0nmol/ml로 증가되었다. 실험군에서는 유의한 증가가 나타나지 않았다. 비변형된 Hb를 주입한 군에서 혈장 met-Hb는 1시간 안에 0에서 15로 증가되었다. Hb-PP-GSH를 주입한 군에서는 0에서 5로 증가되었다. 통계학적 분석, 언페어드(unpaired) 및 페어드 시료에 대한 스튜던트 t-시험 및 아노바(ANOVA)에 의해 두 군 사이의 변화의 차이가 유의한 것으로 나타났다.

본 발명이 상기 특정 실시태양과 함께 기재되어 있지만, 많은 별법, 변화 및 변형이 이루어질 수 있음은 당 업계의 숙련자에게 명백할 것이다. 그러한 별법, 변화 및 변형은 첨부된 청구 범위의 정신 및 영역 내에 포함되는 것이어야 한다.

[실시예 16]

[전해질 부재 하에서의 Hb-PP-GSH 생성]

실시예 1 내지 9에 기재된 바에 따라서 Hb-PP-GSH를 제조하였다. 변형된 헤모글로빈을 50mM 탐 용액(pH 8,1; 트로메타민, 주사 가능함; 미합중국 일리노이주 시카고 소재 Abbott laboratories 제품)에 대해서만 투석시켰다. 최종 형태에서, Hb-PP-GSH 생성물은 10g/dl의 농도로 물-탐 용액(pH 8.1)에 잔류하였다. 이 조성물에는 전해질이 함유되어 있지 않지만, 0.8mg/용액 1ml의 양으로 상기한 바와 같이 첨가한 만니톨을 함유하였다. 일반적으로, 이 용액은 물 100ml에 대하여 탐 용액 6.66ml를 함유하였다.

[실시예 17]

[전해질을 함유하지 않은 Hb-PP-GSH 조성물의 특성]

시험관내 관찰로부터, Hb-PP-GSH는 염수 용액에 용해시킨 경우보다 탐 용액과 같은 비전해질 용액에 용해시킨 경우가 더 오랜 기간 동안 냉장고(4)에 보존할 수 있다는 점을 알 수 있었다.

3개월에 걸쳐 관찰했을 때, 헤모글로빈의 met-Hb로의 자기 산화는 전해질 함유 조성물을 이용하는 경우에는 3 내지 5/1개월의 속도로 일어나는 반면, 전해질을 함유하지 않은 용액을 이용하는 경우에는 1/1개월의 속도로 일어났다. 이러한 현상은 염수 용액에 존재하는 클로라이드 이온이 헤모글로빈의 산소 친화력을 감소시켜서 산소 방출을 촉진시키고 자기 산화를 촉진시킨다는 점을 토대로 하여 설명될 수 있다.

[실시예 18]

[비전해질 Hb-PP-GSH의 생체내 효과]

Hb-PP-GSH를 탐 용액에 10농도로 용해시켰다. 만니톨을 0.8mg/ml의 양으로 첨가하였지만, 전해질은 첨가하지 않았다. 계산된 혈액 양의 1/3과 동일한 양을 30분에 걸쳐 9마리의 쥐로 이루어진 군(체중 350 내지 400g)에 정맥내 주사하였다. 실험 전에는 동물들에게 정상적으로 사료와 물을 공급하였으며, 소듐 펜토바르비탈(45mg/kg)을 복강내 주사하여 마취시켰으며, 상기 실시예 14에 기재된 바와 같이 처리하였다.

2시간 동안 체온, 호흡, 심전도, 동맥 혈압 및 심장 혈액 박출량을 모니터하였다. 헤모글로빈 용액 투여전 1시간 동안 및 투여 후 2시간 동안 뇨의 양을 기록하고, 이 뇨에 대해 혈구소뇨증을 검사하였다. 혈청 중의 이온화된 칼슘 수준 및 전체 칼슘 수준을 측정하기 위하여, Hb-PP-GSH 투여 전에 혈액 시료를 채취하고, 또한 투여 후 2시간 동안 15분 간격으로 혈액 시료를 채취하였다.

이 동물들은 급성 독성에 대한 어떠한 증후도 나타내지 않았다. 일시적인 심박도수의 감소가 나타났지만, 부정맥, 즉 심전도 패턴에는 변화가 없었다. 호흡속도, 혈압 및 심장 혈액 박출량은 상당히 일정하게 유지되었다. 동물의 뇨 양은 약 0.60.3ml/시간에서 약 1.60.3ml/시간(P는 0.05 미만임)으로 증가하였으며, 혈구소뇨증은 없었다. 전체 혈청 칼슘 수준은 실질적으로 일정하게 유지되는 반면, 이온화된 칼슘 수준은 약 0.850.05mM에서 약 0.620.03mM로 감소하였다. 그러나, 이 현상은 통계적으로 의미가 있는 것은 아니며, 불과 수분동안 지속되었다. 이온화된 칼슘 수준의 변화는 2분에 걸쳐 2mg 칼슘/100g 체중의 양으로 주입된 글루콘산칼슘(주사용 10글루콘산칼슘:미합중국 오하이오주 신시내티 소재 W. A. Butler 제품)을 정맥내 투여함으로써 역전되었다.

이 실험은, 예를 들면 주입되는 양이 계산된 혈액 양의 1/3 미만에 해당할 때, 전해질을 첨가하지 않고도 Hb-GSH를 투여할 수 있다는 것을 입증하였다.

[실시예 19]

[Hb-PP-GSH의 임상 실험]

아프리카의 자이르 공화국의 교육 과학 연구부의 승인을 얻어 킨사사 지방 사람들에게 Hb-PP-GSH를 시험하였다. 1990년 8월 15일부터 9월 15일까지, 킨사사 지역의 겸상 적혈구 빈혈 치료 센터에서 환자 9명을 처치하였다. 이들은 4세에서 13세 사이의 남자 어린이 5명과 여자 어린이 4명으로 이루어졌다. 이 어린이들 중 5명은 혈중 헤모글로빈 수준이 5g/dL 이하로서 심한 빈혈을 나타내었다. 이 어린이들 중 4명은 헤모글로빈 수준이 약 8g/dL으로서 덜 심한 빈혈을 나타내었지만, "겸상 적혈구화 발증" 즉, 급성 미소혈관 차단 현상이 손과 발(2명의 환자), 좌측 폐(1명의 환자) 및 비장(1명의 환자)에게 나타났다. 이 환자들은 통증, 발열 및 전신 권태 및 쇠약 증를 나타내었다.

심한 빈혈 증세를 나타내는 환자 그룹은 혈액 수주를 필요로 하는 것으로 의학적으로 판단되었으며, 반면에 또다른 그룹은 정맥내 유체, 혈관 확장제 및 진통성 소염제를 사용하여 치료할 수 있었다. 헤모글로빈(Hb-PP-GSH)이 이들 두 그룹의 치료를 위해 필요하다고 생각하였다. 헤모글로빈은 적혈구(RBC) 대용품을 제공하고, 다음과 같은 두 종류 메카니즘 즉, 순환 혈액 양의 증가 및 산소 전달 증가에 의해 순환 및 조직 산소화를 개선시키는 것으로 예상되었다.

이밖에, 헤모글로빈이 혈관 확장제인 ATP의 유도체 및 혈관 확장제이면서 소염제인 아데노신의 유도체와 가교 결합하기 때문에, 이 용액은 "겸상 적혈구화" 발증을 나타내는 환자들이 경험하게 되는 미소 혈관 차단 현상을 경감시키는 것으로 예상되었다.

혈액 수주법에 비해 또다른 잇점으로서, 본 발명의 Hb-PP-GSH 용액을 사용한 치료는 말라리아, 세균성 질환 및 AIDS와 같은 혈액 전염성 질환을 일으킬 위험이 없다.

본 발명의 Hb-PP-GSH는 펜월(Fenwal) 백에 보관하며, 이 백들은 각각 물-탐 용액 중의 10헤모글로빈 250ml를 함유한다. 이 백들은 사용할때까지 냉동 상태(겔 아이스로 포장됨)를 유지시켰다. 투여하기 2시간 전에, 펜월 백을 실온에 노출시켰으며, 헤모글로빈 용액을 해동시켰다. 전해질 및 만니톨을 상기한 바와 같이 첨가하였다. 각 백의 전체 양을 약 30 방울/분의 속도로 정맥내 투여하였다. 이 양은 각 환자에 대해서 체중(kg)의 7로서 계산된 약 12 내지 23의 혈액 양에 대응한다.

헤모글로빈 수준이 4.5g/dl인 심한 빈혈 증세를 나타내는 한 환자에게는 연속해서 2일에 걸쳐 2회 주입하였다.

헤모글로빈을 투여하는 동안 및 투여후 2시간 동안 15분 간격으로 생체 증후, 체온, 맥박, 호흡 및 혈압을 측정하였다. 이 기간 동안, 담마진, 피진, 기관지 경련 및 구토와 같은 알레르기 반응의 출현 가능성에 대해서도 관심을 두었다. 뇨 양은 Hb-PP-GSH 투여전 2시간 동안 및 투여후 2시간 동안 측정하였다. 이 뇨에 대해 헤모글로빈 존재 여부를 시험하였으며, 현미경으로 침강 물질을 관찰하였다. 혈액 시료는 Hb-PP-GSH 투여 전, 투여 직후 및 투여 후 2시간 경과했을 때 및 5일 동안 매일 채취하였다. 이 환자의 혈액을 혈장 헤모글로빈(주입된 헤모글로빈), 전체 헤모글로빈(주입된 헤모글로빈+RBC중에 함유된 헤모글로빈) 및 망상 적혈구(어린 RBC)에 대해 시험하였다.

환자 모두가 알레르기 반응을 나타내지 않았으며, 일반적으로 모두 호전되었다. "겸상 적혈구화" 발증을 나타내는 환자들은 진통제를 사용하지 않았는데도 통증이 감소되었다고 보고하였다. 열은 내리고, 맥박은 덜 빨라지고, 혈압은 안정되었으며, 맥압은 약간 증가하였는데 이러한 맥압의 증가는 혈관 확장을 나타내며, 호흡이 일정하였다. 그룹 전체에 대해 뇨 양은 Hb-PP-GSH 투여 2시간 전에는 약 507ml의 평균값을 나타내었으나, Hb-PP-GSH 투여 2시간 후에는 약 13015ml로 증가하였다. 이 뇨는 혈구소뇨증을 전혀 나타내지 않았으며 침강 물질에서도 원주가 전혀 발견되지 않았다. 가장 인상적인 것은 5일 동안에 전체 헤모글로빈이 약 6.392.12의 그룹 전체의 평균값에서 약 10.51.13g/dl로 점진적으로 개선되었으며, 망상 적혈구가 약 11.27.6에서 약 62.212/1000으로 상당히 증가되었다는 점이다.

이것은 헤모글로빈 용액이 직접적인 RBC 대용품을 제공할 뿐만 아니라 환자의 골수를 자극하여 새로운 RBC를 생성한다는 점을 암시한다. 이러한 자극은 5일 동안에 대해서만 기록하였지만, 아마도 이보다 더 오랫동안 지속될 것이다.

결론적으로 말해서, 겸상 적혈구 빈혈을 앓고 있는 9명의 어린이에게 유효량의 Hb-PP-GSH를 투여하면, 독성 또는 알레르기 반응을 나타내지 않으면서 그들의 일반적인 증세를 호전시켰으며 골수에 대해 연장된 유효 효과를 미쳐서 새로운 적혈구를 생성하였다.

본 발명을 충분히 상세하게 기재하였으므로, 본 명세서에 기재된 본 발명의 정신 및 범위에서 벗어나지 않는 한, 본 발명에 대해 여러 가지 변화 및 변경을 가할 수 있다는 점이 당업계 숙련자에게 명백해질 것이다.

Claims

실질적으로 발열 물질이 없고 미생물이 없는 활성 헤모글로빈을 o-ATP 및 o-아데노신과 반응시켜 가교 결합된 헤모글로빈을 형성시키고 이를 환원 글루타티온과 더 반응시켜 얻어지는 것으로서, 상기 o-ATP가 과요오드산염으로 산화된 ATP로 이루어지고 상기 o-아데노신이 과요오드산염으로 산화된 아데노신으로 이루어지며, o-ATP를 써서 상기 헤모글로빈을 분자내 가교 결합시키고 또한 o-아데노신을 써서 분자간 가교 결합시키며, 상기 헤모글로빈, o-ATP, o-아데노신 및 글루타티온을 1:3:10:20의 몰비로 반응시킨 것인 조성물.
제1항에 있어서, 비전해질을 더 함유하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 가교 결합된 헤모글로빈의 분자량이 130 내지 390 킬로달톤인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 헤모글로빈의 5미만이 met-헤모글로빈으로 이루어지는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 헤모글로빈이 소 헤모글로빈으로 이루어지는 조성물.
제1항에 있어서, 용액 중의 헤모글로빈을 카르복시 헤모글로빈으로 전환시키고; 이 헤모글로빈 용액을 저온 살균시켜서 무헴(non-heme) 단백질을 변성 및 침전시키고; 이 용액으로부터 인지질 및 침전된 무헴 단백질을 제거하고; 이 헤모글로빈 용액으로부터 내독소를 제거하고; 용액을 농축시키고; o-ATP를 써서 농축 용액 중의 카르복시 헤모글로빈을 주로 분자내 가교 결합시키고; o-아데노신을 써서 이 카르복시 헤모글로빈을 주로 분자간 가교 결합시키고; 이 가교 결합 중인 헤모글로빈 용액에 글루타티온을 첨가해서 o-아데노신 가교 결합 반응을 중단시키고; 이 용액 중의 가교 결합된 카르복시 헤모글로빈을 가교 결합된 옥시 헤모글로빈으로 전환시키는 것을 포함하는 방법으로 제조된 조성물.
제6항에 있어서, 상기 헤모글로빈 용액이 전혈을 백혈구-적혈구 혼합물, 혈소판 및 혈장으로 분리시키고; 이와 같이 하여 얻은 백혈구-적혈구 혼합물을 수용액 중에 현탁시키고; 이 백혈구-적혈구 용액을 냉각시켜 백혈구를 응집시켜 이 백혈구 응집체를 제거하고; 실질적으로 백혈구가 제거된 적혈구 현탁액을 저장성 용액에 대해 투석시켜 적혈구로부터 헤모글로빈을 추출하여 헤모글로빈 용액을 얻고; 이 헤모글로빈 용액을 증가된 수압하에서 한외여과시켜 적혈구를 분리시킴으로써 얻어지는 조성물.
제1항의 조성물 및 제약학적으로 허용되는 수용액을 함유하는 혈액 대용품.
제8항에 있어서, 상기 용액이 비전해질 수용액인 혈액 대용품.
제8항에 있어서, 상기 가교 결합된 헤모글로빈을 수용액에 용해시킨 혈액 대용품.
제8항에 있어서, 용액 1리터 당 제1항의 조성물 7.5 내지 15g을 함유하는 혈액 대용품.
용액 중의 헤모글로빈을 카르복시 헤모글로빈으로 전환시키고; 이 카르복시 헤모글로빈 용액을 농축시키고; o-ATP를 써서 이 농축 용액 중의 카르복시 헤모글로빈을 주로 분자내 가교 결합시키고; o-아데노신을 써서 이 용액 중의 카르복시 헤모글로빈을 주로 분자간 가교 결합시키고; 이 카르복시 헤모글로빈/o-아데노신 용액에 글루타티온을 첨가해서 o-아데노신 가교 결합 반응을 중단시키고; 이 가교 결합된 카르복시 헤모글로빈을 가교 결합된 옥시 헤모글로빈으로 전환시키고; 전해질 없이 가교 결합된 옥시 헤모글로빈의 제약학적으로 허용되는 수용액을 형성하는 것을 포함하는, 혈액 대용품으로 사용하기에 적당한 조성물의 제조 방법.
제12항에 있어서, 상기 수용액을 형성하는 동안 또는 그 후에 수용액에 전해질 및(또는) 만니톨을 첨가하는 것을 더 포함하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 헤모글로빈이 전혈을 백혈구-적혈구 혼합물, 혈소판 및 혈장으로 분리시키고; 이와 같이 하여 얻은 백혈구-적혈구 혼합물을 수용액 중에 현탁시키고; 이 백혈구-적혈구 용액을 냉각시켜 백혈구를 응집시키고; 이 백혈구 응집체를 제거하고; 실질적으로 백혈구가 없는 적혈구 현탁액을 저장성 용액에 대해 투석시켜 적혈구로부터 헤모글로빈을 추출하여 헤모글로빈 용액을 얻고; 이 헤모글로빈 용액을 증가된 수압 하에서 한외여과시켜서 적혈구를 분리시키고; 이 용액 중의 추출된 헤모글로빈을 카르복시 헤모글로빈으로 전환시키고; 이 헤모글로빈 용액을 저온 살균시켜서 무헴 단백질을 변성 및 침전시키고; 이 용액으로부터 인지질 및 침전된 무헴 단백질을 제거하고; 친화성 크로마토그래피로 이 헤모글로빈 용액으로부터 내독소를 제거함으로써 전혈로부터 얻어진 정제된 헤모글로빈인 방법.
제14항에 있어서, 상기 헤모글로빈이 얻어지는 전혈이 소 혈액으로 이루어지는 방법.
헤모글로빈, o-ATP, o-아데노신 및 글루타티온을 1:3:10:20의 몰비로 반응시키는 제15항의 방법으로 제조된 정제된 헤모글로빈 조성물.
제9항에 있어서, 혈액 대체용으로 사용되는 혈액 대용품.
제17항에 있어서, 혈액 대체를 필요로 하는 사람의 총 혈액 양의 33 내지 100의 양으로 사용되는 혈액 대용품.
제9항에 있어서, 사람의 혈액량을 복원하는 데 사용되는 혈액 대용품.
제17항 또는 19항에 있어서, 급성 실혈 치료용으로 사용되는 혈액 대용품.
제17항 또는 19항에 있어서, 겸상 적혈구화 발증으로 인한 겸상 적혈구 빈혈 치료용으로 사용되는 혈액 대용품.
제8항에 있어서, 상기 조성물이 제6항에 정의된 조성물인 혈액 대용품.
제22항에 있어서, 겸상 적혈구화 발증으로 인한 적혈구 빈혈 치료용으로 사용되는 혈액 대용품.