DE3877811T2

DE3877811T2 - Pasteurisierbares, lyophilisierbares blutsurrogat auf haemoglobinbasis.

Info

Publication number: DE3877811T2
Application number: DE8888304059T
Authority: DE
Inventors: Jen-Chang Hsia
Original assignee: UK Government
Current assignee: UK Government
Priority date: 1987-05-05
Filing date: 1988-05-05
Publication date: 1993-05-27
Anticipated expiration: 2008-05-06
Also published as: ATE84970T1; CN1032471C; EP0290252B1; NZ224479A; JPS63297330A; DK242888D0; DE3877811D1; KR880013571A; DK174286B1; IL86258A0; IL86258A; GB8710598D0; DK242888A; AU610883B2; CA1306583C; AU1563588A; JPH0532372B2; EP0290252A3; ZA883171B; KR910009343B1

Description

Die Erfindung betrifft allgemein die Stabilisierung von Biomakromolekülen in einzigartigen Konformationszuständen und die Nutzung ihrer damit verbundenen Aktivitäten und Funktionen für biomedizinische und biotechnische Anwendungen. Genauer gesagt wird Hämoglobin (Hb) in jeder seiner natürlichen Konformationen [gespanntes Hb(T) oder relaxiertes Hb(R)] stabilisiert und/oder vernetzt, um eine Dissoziation zu verhindern und die gewünschte Ligandenbindungsaffinität zu erreichen. Es sind Verfahren und Reagentien für die Herstellung einer neuen Familie von tierischem Hämoglobin, menschlichem Hämoglobin und von durch Gentechnik hergestellten Hämoglobinsubstituten für die Funktion als Sauerstoffträger der roten Blutzellen oder von "Blutersatzstoffen", sowie für die Umwandlung von Oxyhämoglobinderivaten in met-Hämoglobinderivate für die Behandlung von Cyanidvergiftungen entwickelt worden.
Es gibt starke Einschränkungen beim Einsatz von Blut als Transfusionsfluid. Dieses hängt hauptsächlich mit den natürlichen Eigenschaften der roten Blutzellen (RBC) und der Gefahr der Übertragung von Krankheiten zusammen.
Die Übertragung von viralen Krankheiten bei Blut und Blutprodukten ist ein Hauptproblem in der Transfusionsmedizin. Das Screening zur Feststellung von viralen Blutinfektionen ist kostspielig und noch nicht völlig zuverlässig. Eine der möglichen Methoden für die Inaktivierung viraler Infektionen in pharmazeutischen Blutderivaten ist die in der Industrie übliche Pasteurisierung durch feuchtes Erhitzen. RBC's sind jedoch nicht pasteurisierbar.
Andere Beschränkungen beim Einsatz von Gesamtblut in der Transfusion schließen die sehr strengen Lagerungserfordernisse, geringe Lagerstabilität und die komplexen immunologischen Eigenschaften des RBC ein. Deshalb sind umfangreiche Forschungsarbeiten zur Entwicklung zellfreier, auf Hämoglobin basierender Blutersatzstoffe durch chemische Modifikation von stromafreiem Hämoglobin durchgeführt worden.
Es ist allgemein bekannt, daß natürliches Hämoglobin ein Tetramer von vier Untereinheiten, bestehend aus zwei alpha(α-) und zwei beta- (β-) -Globinketten, umfaßt. Das Molekulargewicht dieses Tetrameren beträgt ca. 64 Kilodalton, und jede dieser Untereinheiten hat ungefähr das gleiche Molekulargewicht. In verdünnten Lösungen dissoziiert tetrameres Hämoglobin leicht in zwei molekulare Hälften von αβ-Dimeren. Das relativ niedrige Molekulargewicht dieser Dimeren ist so, daß sie aus dem Kreislauf durch die Niere schnell filtriert und über den Urin ausgeschieden werden können. Dies führt zu einer unannehmbar kurzen Halbwertzeit (T 1/2) von ca. 2-3 Stunden.
Weiterhin verliert Hämoglobin ohne den Schutz seiner roten Zellmembran den natürlichen Liganden Diphosphoglycerat (DPG). Normalerweise verringert DPG die Sauerstoffaffinität des Hämoglobins, so daß das lösliche Hämoglobin nach seinem Verlust den Sauerstoff viel fester bindet und ihn nicht so effektiv an das Zellgewebe abgibt wie die roten Blutzellen. Aus diesen Gründen ist stromafreies Hämoglobin für den Einsatz als Blutersatzstoff nicht geeignet.
Diese Nachteile wurden in der Vergangenheit durch kovalentes Verknüpfen von DPG-Analoga wie Pyridoxal-5'-phosphat (PLP) mit Hämoglobin in seinem Deoxyzustand Hb(T) beseitigt, wobei PLP-Hb, das eine niedrigere Sauerstoffaffinität ähnlich von RBC hat, erhalten wurde. Entsprechend untersuchte Greenburg (Greenburg et al., Surgery, Bd. 86 (1979), Seiten 13-16) den Einsatz von PLP-Hb mit physiologischer Sauerstoffaffinität als Blutersatzstoff. Ohne intramolekulare Vernetzung dissoziiert PLP-Hb jedoch wie SFH in Molekülhälften und wird schnell über die Niere ausgeschieden. Weiterhin haben Hsia und Mitarbeiter (McGarrity et al., Journal of Chromatography, Bd. 419 (1987), Seiten 37-50) gezeigt, daß PLP-Hb ein komplexes Gemisch von modifizierten Hämoglobinen ist, die zwischen 0 und 6 mol PLP pro mol Hämoglobin enthalten, wobei jede dieser Unterarten unterschiedliche Sauerstoffaffinitäten aufweist.
Es wurde gezeigt, daß DPG-Analoga Hb intramolekular vernetzen. Diese Vernetzer sollen spezifisch an die DPG-bindende Stelle des menschlichen Hämoglobins binden. Sie schließen für β-Untereinheiten spezifische Reagentien ein (Benesch et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 63, Nr. 4 (1975), Seiten 1123-1129; Benesch et al. in Methods in Enzymology, Bd. 76, Hemoglobins (1981), Seiten 147-159, Academic Press) oder α-Untereinheiten (Chatterjee et al., Journal of Biol. Chem., Bd. 261, 25. Juli 1986, Seiten 9929-9937).
Vernetzungen durch diese spezifischen Liganden ergeben generell niedrige Ausbeuten (< 70%) und erfordern eine weitere Reinigung der Produkte. Aktivierte Triphosphatnukleotide sind gleichzeitig zur Vernetzung von Hämoglobin und zur Besetzung der DPG-bindenden Stelle benutzt worden, wobei gefunden wurde, daß das gebildete ATP-Hb eine geringere Sauerstoffaffinität als PLP-Hb und eine längere Plasmaretentionszeit aufweist. (Greenburg et al., Progress in Clinical and Biological Research, Bd. 122, Advances in Blood Substitute Research (1983), Seiten 9-17, Alan R. Liss, New York; McGarrity et al., Journal of Chromatography, Bd. 415 (1987), Seiten 136-142). Bei 80-90% Blutersatz wird ATP-Hb an die Pleural- und Pentonealräume abgegeben, so daß es möglicherweise zur Verwendung als Blutersatz auf einem höheren Niveau nicht sicher ist.
Die intramolekulare Vernetzung (Polymerisation) von PLP-Hb mit einem nichtspezifischen Vernetzer [z.B. Glutaraldehyd (GA)] wurde eingeführt, um die Plasmaretentionszeit zu verlängern (Bonhard et al., United States Patent 4,136,093, 23. Jan. 1979). Das erhaltene polymere PLP-Hb (14 g Hb/dl) wies eine physiologische Sauerstoffträgerkapazität (bis zu 20 cc O&sub2; pro dl) und einen iso-onkotischen Druck auf. Die Polymerisation ist jedoch unvollständig, und die Komponenten weisen eine heterogene Sauerstoffaffinität auf.
Andere Gruppen haben versucht, die Plasmahalbwertzeit durch Konjugieren von PLP-Hb mit Polyethylenglykol (Iwasaki et al., Artificial Organs, Bd. 10, Nr. 5 (1986), Seiten 411-416), Inulin (Iwasaki et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 113, Nr. 2 (1983), Seiten 513-518) und von Hb mit Dextran (Tam et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci., USA, Bd. 73 (1976), Seiten 2128-2131) zu verlängern. Die Heterogenität der Produkte und ihre hohe Sauerstoffaffinität sind jedoch wiederum nachteilig.
Die Polymerisation von Hb unter Verwendung von verschiedenen zweibindigen Netzbildnern unter Bildung von Poly-Hb als Blutersatzstoff ist beschrieben worden. Der Nachteil dieser Methode ist die übermäßige Polymerisation (90% des Produkts ist größer als 150 Kilodalton), eine variable Sauerstoffaffinität, komplexe Reaktionsschemata und die biologische Unverträglichkeit der eingesetzten Vernetzer (z.B. Divinylsulfon, ein potentielles Carcinogen - U.S.-Patent 4,001,300; 4,001,401; 4,053,590). Das US-Patent Nr. 4,061,736 betrifft intramolekular vernetztes stromafreies Hb zum Einsatz als Blutersatz für den Sauerstofftransport, als einen Blutplasmaexpander und als Sauerstofflieferant. Das Patent beschreibt die Verwendung von intramolekular vernetzenden Mitteln, die eine Aldehyd- oder Dialdehydfunktionalität aufweisen. Ein Beispiel ist Glutaraldehyd (GA).
Eine Aufgabe der Erfindung ist es, neue Blutersatzstoffe und Verfahren zu ihrer Herstellung zu schaffen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, stabilisiertes und pasteurisiertes Hämoglobin zu liefern, das als therapeutisches Mittel in der Transfusionsmedizin einsetzbar ist, wobei die genannte Pasteurisierung das Hämoglobin im wesentlichen frei von übertragbaren Infektionsstoffen liefert.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist das zur Verfügungstellen von Vernetzungsmitteln und Verfahren, durch die Hämoglobin intramolekular vernetzt wird, und zwar in beiden seiner natürlichen molekularen Konformationen, (gespanntes (T) oder relaxiertes (R)), so daß in dem Vernetzungsprodukt die Konformation erhalten bleibt, von der dann gesagt wird, daß sie konformationsmäßig stabilisiert ist. Eine solche Konformationsstabilisierung ist allgemein auf Biomakromoleküle anwendbar.
Die vorliegende Erfindung basiert auf einem neuen Weg zur Stabilisierung von Hämoglobin in seiner tetrameren Form; dies ergibt ein Hämoglobintetramer, das nicht nur gegen Dissoziation in Dimere oder Monomere stabilisiert ist, sondern auch in seinen beiden natürlichen Konformationen des Hb's stabilisiert ist, nämlich gespannt (T), das normalerweise bei Deoxyhämoglobin vorkommt, oder relaxiert (R), das normalerweise bei Oxyhämoglobin vorkommt. Anders als bei der Benutzung von DPG-Analoga zum Stabilisieren und Vernetzen von Hb(T) sind die Produkte der Erfindung sowohl gegen Dissoziation als auch gegen Konformationswechsel durch kovalente chemische sekundäre Aminobindungen zwischen Globinketten der jeweiligen Untereinheiten stabilisiert, wobei die Bindungen durch Reaktion des Hämoglobins mit einem Polyaldehyd unter Bildung von Schiff'schen Basen erfolgt, die anschließend reduziert werden. Wie auch immer die Konformation des tetrameren Hämoglobins als Ausgangsmaterial ist, T oder R, diese Konformation wird in dem stabilisierten Produkt gemäß der Erfindung bewahrt.
Die Fähigkeit des Hb, zwischen Konformationen zu shiften, wird durch den Hill-Koeffizienten (n) wiedergegeben. Ein Koeffizient von 2 oder mehr zeigt die kooperative Sauerstoffbindung zwischen Untereinheiten durch einen Konformationswechsel an, während ein Koeffizient, der sich 1 nähert, anzeigt, daß Hb in der T- oder R-Konformation arretiert ist. Ein Hill-Koeffizient, der sich 1-1,5 annähert und eine vollständige Stabilisierung sowie die Abwesenheit einer kooperativen Bindung mit Sauerstoff anzeigt, ist ein wesentliches Merkmal der vorliegenden Erfindung.
Eine weitere Unterscheidung der vorliegenden Erfindung gegenüber dem Stand der Technik ist, daß in diesem die Stabilisierung von Hämoglobin durch die Bindung von Globinketten der Untereinheiten an spezifische Orten erreicht wird, um das tetramere Hämoglobin zu ergeben. Diese Produkte sind nur gegen die Dissoziation der tetrameren Einheit in die dimeren Untereinheiten stabilisiert, d.h. die kooperative Sauerstoffbindung bleibt erhalten (Hill-Koeffizient n ca. 3). Die vorliegende Erfindung stabilisiert im Gegensatz dazu das tetramere Hämoglobin nicht nur gegen Dissoziation, sondern auch gegen einen Konformationswechsel, d.h. keine kooperative Sauerstoffbindung (Hill-Koeffizient n ca. 1-1,5). Dieses Merkmal der Konformationsstabilität ist einmalig bei den Produkten dieser Erfindung.
Das konformationsmäßig stabilisierte tetramere Hämoglobin der vorliegenden Erfindung zeigt eine Anzahl von signifikanten Vorteilen. Bereits die Tatsache, daß es in der T-Konformation stabilisiert ist und in Lösung diese Konformation beibehält, verleiht z.B. dem Produkt eine Sauerstoffaffinität vergleichbar derjenigen der natürlichen roten Blutzellen. Die Produkte der Erfindung sind daher hinsichtlich ihrer Sauerstoffaufnahme in der Lunge im wesentlichen äquivalent mit roten Blutzellen. Ein weiteres wichtiges Merkmal ist ihre Fähigkeit, Sauerstoff an das Körpergewebe zu liefern. Unter dem Sauerstoffpartialdruck, der im Körpergewebe vorherrscht, geben die T-konformationsstabilisierten Produkte der Erfindung eine erheblich größere Menge von Sauerstoff an das Gewebe als allosterisch kooperative, nicht konformativ stabilisierte Hämoglobinprodukte. Diese hohe Sauerstoffabgabe an das Gewebe wird z.B. sehr wichtig bei einer Transfusion eines gewebeverletzten Traumapatienten, wie man es gewöhnlich in der Notfallmedizin antrifft.
Ein sehr signifikanter Unterschied der vorliegenden Erfindung gegenüber dem Stand der Technik ist, daß das stabilisierte Hämoglobin (HemoSafe I) sich gemäß der Erfindung ohne weiteres in hohen Ausbeuten (bis zu 95 %) in einem einzigen Reaktionsschritt, im wesentlichen von nichtstabilisierten Hämoglobinrückständen, herstellen läßt. Es erfordert keine weitere Reinigung, da es nur eine sehr geringe prozentuale Bildung des dimeren Produkts mit dem niedrigeren Molekulargewicht in der Lösung gibt, selbst ohne anschließende Reinigung zur Entfernung nichtreagierter Materialreste. Demgemäß hat das konformationsstabilisierte monomere Hb (im nachfolgenden gelegentlich als HemoSafe I bezeichnet) eine ca. dreimal so hohe Plasmahalbwertzeit wie die von stromafreiem Hämoglobin und ist daher gut für den Gebrauch als Blutersatzstoff in Notfallsituationen geeignet. Zusätzlich ist das stabilisierte Hb(T) hervorragend für die Herstellung von anderen neuen auf Hämoglobin basierenden Produkten geeignet. Hb(T) kann mit sich selbst zu einem polymerisierten Hämoglobin verbunden werden (poly Hb(T) oder HemoSafe II), das als Blutersatz einsetzbar ist und meist wegen seines erhöhten Molekulargewichts, das längere Plasmahalbwertzeiten bedingt, dem stalisierten tetrameren Produkt vorgezogen wird. Es kann kovalent an ein zweites Biopolymer gebunden werden, um ein Konjugat (HemoSafe I-Konjugat) zu erhalten, das als Blutersatzstoff verwendbar ist. In all diesen Umwandlungen behalten die tetrameren Hämoglobine ihre spezifische Konformation (e.g. Hb(T)). Für eine längere Lagerung kann das Produkt lyophilisiert werden.
Es ist weiterhin von großer praktischer Bedeutung, daß die konformationsstabilisierten hämhaltigen Tetramere der Erfindung zur Vermeidung der Oxidation des Eisens vom Ferro- zum Ferri-Zustand behandelt werden können, z.B. in Gegenwart von Sauerstoffverdrängern wie Kohlenmonoxid oder Stickoxid oder Sauerstoffängern wie Natriumdithionit, und anschließend pasteurisiert werden können, um etwaige kontaminierende Viren zu zerstören. Die Produkte der Erfindung sind hinreichend stabil, um der erforderlichen Hitze von bis zu 60ºC für mindestens zehn Stunden lang zu widerstehen und eine Pasteurisierung ohne Denaturierung des Proteins oder Zersetzung des Produkts zu gewährleisten. Dieses Verfahren kann zur Pasteurisierung des tetrameren, wie z.B. CO-HemoSafe I, des polymerisierten, z.B. CO-HemoSafe II, und des konjugierten CO-HemoSafe I-Konjugats angewendet werden. Dann können diese CO-HemoSafe leicht zu Oxy-HemoSafes zurückgewandelt werden, welche als Blutersatz für die Transfusion geeignet sind; dies geschieht ohne signifikanten Verlust der konformativen Funktionalität und strukturellen Integrität.
Ferner kann das Produkt mit oder ohne Polymerisation oder Konjugation zu met-Hämoglobin-Produkten (d.h. met-HemoSafe) oxidiert werden, die als Cyanidfänger wirksam sind und prophylaktisch für solche Zwecke verwendet werden können.
Somit wird im weiteren Sinne gemäß der vorliegenden Erfindung ein Hämoglobinprodukt zur Verfügung gestellt, das im wesentlichen aus tetrameren Hämoglobineinheiten besteht, die gegen eine Dissoziation in Dimere und gegen Konformationswechsel zwischen der T- und der R-Konformation stabilisiert sind, wenn wäßrige Zubereitungen derselben gebildet werden; die genannten tetrameren Einheiten weisen sekundäre kovalente chemische Aminobindungen zwischen den Globinketten der Untereinheiten auf, um die Stabilisierung zu bewirken; die Bindungen werden durch Reaktion des Hämoglobins mit einem Polyaldehyd unter Bildung von Schiff schen Basen geknüpft, welche anschließend reduziert werden.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Bei der Herstellung der Produkte der Erfindung sind neue Reagentien, Reaktionsbedingungen und Prozesse zur Stabilisierung einer einheitlichen Zusammensetzung des Deoxy-Hb (Hb(T)), als auch zum Schutz desselben vor Instabilität bei Gefriertemperaturen oder bis zu 60ºC entwickelt worden, um die Pasteurisierung, Lyophilisierung und eine gleichförmige physiologische Sauerstoffaffinität für das fertiggestellte Produkt zu erlangen.

Konformationsspezifische Stabilisatoren und Vernetzer (CSSC):

Die bevorzugte Methode zum Erreichen der gewünschten konformativen und intramolekularen Stabilisation der tetrameren Hämoglobineinheit der Erfindung erfolgt durch Reaktion mit einer Klasse von Reaktionsgruppen oder mehreren, die als konformationsspezifische Stabilisatoren und Vernetzer (CSSC) bezeichnet werden. Diese sind Polyaldehyde. Sie reagieren mit primären Aminogruppen an den Globinketten, unter Bildung von Schiff'schen Basen, die anschließend zu sekundären Aminobindungen reduziert werden können. Im tetrameren Hämoglobin gibt es geeignet angeordnete primäre Aminogruppen auf den α-Ketten und den β-Ketten, die bevorzugt und wie vorgesehen selektiv mit Polyaldehyden unter Bildung der gewünschten kovalenten Bindungen zur Stabilisierung reagieren.
Die Reaktion von Hämoglobinen mit GA ist oben beschrieben worden. Diese bekannten Verfahren sind jedoch unter Bedingungen durchgeführt worden, die nicht zu einer im wesentlichen vollständigen Stabilisierung der Konformation der tetrameren Einheiten führte und auch nicht zu einem Produkt, das im wesentlichen aus stabilisierten Tetrameren bestand. So, wie es bisher eingesetzt wurde, ist Glutaaldehyd ein nicht-spezifisches Reagens und verursacht schneller kovalente intramolekulare Bindungen zwischen Tetrameren unter Bildung von polymerem Hämoglobin als intramolekulare Bindungen zwischen den Untereinheiten zur Stabilisierung des Tetrameren. Das Ergebnis ist eine Mischung von stabilisierten Tetrameren, unstabilisierten Tetrameren und stabilisierten Polymeren, in einer breiten Molekulargewichtsverteilung, bei der jede dieser Komponenten eine unterschiedliche Sauerstoffaffinität hat.
Wenn auf tierischem Hämoglobin basierender Blutersatzstoff bei Menschen verwendet wird, sollte aufgrund der Antigenizität die Bildung von Oligomeren und Polymeren vermieden werden.
Während des Verfahrens zur Fixierung des Hb's in seiner monomeren Form, Hb(T), mit GA, gibt es eine starke Polymerisationstendenz. Im Gegensatz dazu befaßt sich die Erfindung mit unterschiedlichen CSSC-Reagentien und Reaktionsbedingungen zur Stabilisierung des Hämoglobins (Hb). Die Verwendung dieser CSSC-Verbindungen kann eine Stabilisierung des Hb-Monomeren ergeben, sowie eine Minimierung der Dimerenbildung (< 5%) mit nichtdetektierbaren Polymeren, und außerdem können die verschiedenen CSSC-Verbindungen generell dazu verwendet werden, andere Makromoleküle in der gewählten Konformation zu stabilisieren, und zwar, falls erwünscht, unter Minimierung der Polymerisation. Diese CSSC-Verbindungen erlauben die Bewahrung der Aktivität und Funktion des Biomakromoleküls durch Stabilisierung der Makromoleküle in einzigartigen Konformationszuständen. Der Einsatz von CSSC-Verbindungen kann jedoch die gezielte Manipulation der Reaktionsbedingungen zur Verknüpfung von Makromolekülen (Polymerisation) gestatten, und alternativ zur Konjugation derselben mit verschiedenen Makromolekülen, z.B. Inulin. Insbesondere bei dem Gebrauch von Deoxyhämoglobin in seiner gespannten (T) Konformation (HB(T)), mit einer solchen CSSC-Verbindung als Verknüpfungsreagens können die Reaktionsbedingungen, falls gewünscht, so variiert werden, daß die Polymerisation des stabilisierten Hb(T) Monomeren ebenso wie die Verknüpfung von stabilisiertem Hb(T) mit verschiedenen Makromolekülen ermöglicht wird. Solche CSSC-Verbindungen können auch zur Stabilisierung und Polymerisation von Hämoglobinderivaten, z.B. PLP-Hb, abhängig von den Reaktionsbedingungen, und außerdem zur Verknüpfung solcher Derivate mit verschiedenen Makromolekülen verwendet werden.
Die in der Erfindung benutzten CSSC-Verbindungen sind Polyaldehyde.
Besonders bevorzugt als CSSC-Verbindungen sind Aldehydprodukte, die in einer oxidativen Ringöffnungsreaktion an Monosacchariden und Oligosacchariden gebildet werden. Solche Reaktionen, die z.B. die Perjodatoxidation einschließen, sind bekannt. Als Reaktionsergebnis erhält man für jedes Zuckermonomer in dem Oligosaccharid ein Produkt mit zwei Aldehydgruppen. Zum Beispiel stammen somit von der Raffinose (o-Raffinose) oder Maltotriose (o-Maltotriose) sechs Aldehydgruppen. Innerhalb einer homologen Reihe ist die Anzahl der molaren Äquivalente der Polyaldehydvernetzer, die erforderlich ist, um denselben Umfang der Stabilisierung von Untereinheiten zu erreichen, wie ein divalenter Aldehyd wie Glukose, umgekehrt proportional zur Bindigkeit des CSSC.
O-Raffinose ist spezifisch intramolekular vernetzend, so daß höhere molare Verhältnisse von o-Raffinose zu Hb (20:1) für die Darstellung von polymerfreiem Hb(T) verwendet werden können. Diese Erkenntnis zeigt, daß das CSSC Hb-Monomere in spezifischer Konformation mit minimaler intramolekularer Vernetzung wirksam stabilisiert. Dieses erfordert eine wirksamere Reaktionskontrolle durch Verlangsamung des Polymeri sationsprozesses und gestattet somit eine leichtere Produktion des im wesentlichen polymerfreien stabilisierten Hb-Produkts.
Spezifische Beispiele für einsetzbare CSSC-Verbindungen schließen eine homologe Reihe von perjodatoxidierten Sacchariden von Inulin, Maltose, Maltotriose, Maltotetrose, Maltopentose, Maltohexose und Maltoheptose ein. Generell stammen die CSSC-Verbindungen von ringöffnenden Oxidationen von Zuckern ab, die der Formel
entsprechen, in der jedes R, R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4; und R&sub5; unabhängig voneinander aus Wasserstoff, Hydroxy, Methoxy und Hydroxymethyl ausgewählt;
m 0 oder 1;
und Q eine chemische Gruppe ist, die sich aus der oxidativen Ringöffnung eines Oligosaccharids mit bis zu 36 Zuckerresten ergibt.
Wenn die Ausgangsverbindung Raffinose ist (ein Trisaccharid), weist das CSSC-Oxidationsprodukt die folgende Formel auf:
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Vernetzungsreagentien unterscheiden sich somit sehr von den im Stand der Technik üblicherweise verwendeten DPG-Analoga zur Stabilisierung und Vernetzung des Hb in seiner tetrameren Form. Sie weisen keine negativ geladenen Gruppen wie Phosphate, Carboxylate oder dergleichen auf und es ist nicht bekannt, daß sie spezifisch mit der DPG-Stelle des Hb reagieren. Sie sind daher in der Lage, die konformative Stabilisierung des Hb menschlichen und haustierischen Ursprungs zu bewirken, um jedes Hb einheitlich in der Konformation zu behalten, in der es auftritt und mit dem Vernetzer reagiert. Wasserlösliche Vernetzer werden für eine erleichterte Umsetzung bevorzugt.
Die relativen Mengen von Polyaldehyd zu Hämoglobin werden vorzugsweise festgesetzt, um einen molaren Überschuß von Aldehydgruppen zu Hämoglobin von mindestens 12:1 und vorzugsweise mindestens 60:1 zu ergeben.
Die Berechnung des molaren Überschusses erfolgt unter der Annahme, daß Hämoglobin ungefähr 50 primäre Aminogruppen hat. Da die Globinkettenbindungsreaktion der Erfindung nicht ortsspezifisch zu sein braucht, kann ein molarer Überschuß an Aldehyd (z.B. für o-Raffinose, ein molares Verhältnis von 5-30, bevorzugt 20:1) verwendet werden, um höhere Ausbeuten (bis zu 95%) des stabilisierten Produkts zu erhalten. Die Verfahren des Standes der Technik, die eine ortsspezifische Reaktion erfordern, müssen im wesentlichen eine stöchiometrische Menge der Reagentien verwenden, mit folglich sinkenden Ausbeuten. Die Reaktionen erfolgen geeigneterweise in wäßriger Lösung bei Temperaturen zwischen 4º-37ºC, vorzugsweise bei Umgebungstemperatur. Der pH dieser Reaktionsgemische sollte mit einem geeigneten Puffer zwischen 6,7 und 9,5, vorzugsweise 8,0, gehalten werden.
Mit den CSSC-Produkten kann ein Bereich der Hb-Konzentrationen z.B. von 1-20 g/dl, vorzugsweise 3-4 g/dl, verwendet werden, da die Reaktion einfach zu kontrollieren ist.
Stromafreies Hämoglobin, das man aus roten Blutzellen erhält, hat eine Hämoglobinkonzentration von ungefähr 3-4 g/dl. Es ist sehr zweckmäßig, diese Hämoglobinlösung ohne Verdünnung oder Konzentration zu verwenden. Die bevorzugten Konzentrationen hängen von der Wahl des Aldehyds ab. Der Vorteil des neuen CSSC ist folglich, daß es ebenso auf die Herstellung von polymerfreien menschlichen Hb-Derivaten und polymerfreien tierischen Hb-Derivaten anwendbar ist, daß aber die Vermeidung der Bildung von polymerem Hb unter Verwendung des neuen CSSC wie o-Raffinose den Einsatz tierischer Hb-Derivate (HemoSafe- Produkte) beim Menschen gestattet.

Stabilisiertes Hämoglobin:

Bei der Herstellung des konformativ stabilisierten und vernetzten Deoxy-Hb (XL-Hb(T)) der Erfindung kann die intramolekulare Vernetzungsreaktion vor dem Einsetzen der intramolekularen Vernetzung unter Bildung von Dimeren, Trimeren, Tetrameren und höheren Polymeren, durch Zusatz eines Reduktions- oder Quench-Mittels zu einem geeigneten Zeitpunkt beendet werden. Die Reaktion der primären Aminogruppe mit der Aldehydgruppe des CSSC verläuft unter Verknüpfungen von Schiff'schen Basen. Der Zusatz von Natrium- oder Kaliumborhydrid oder dergleichen reduziert die Schiff'sche Basenbindung zu einer sekundären Aminobindung und den Überschuß an Aldehydgruppen zu primären Alkoholen; dies verhindert weitere Vernetzung. Der geeignete Zeitpunkt für die Reduktion kann durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC)-Analyse der Proben der Reaktionsmischungen ermittelt werden.
Das konformationsstabilisierte tetramere Hb-Produkt kann zurückgewonnen und durch Standardtechniken gereinigt werden. So kann es durch Membranfiltration gewaschen und konzentriert und in einer physiologischen Salzlösung als Blutersatzstoff genutzt werden, in einem Notfall, wo seine relativ kurze Halbwertzeit im vasculären System akzeptabel ist. Alternativ kann es als Ausgangsmaterial für die Herstellung anderer Produkte der Erfindung genutzt werden.

Polymer stabilisiertes Hämoglobin

Eines dieser weiteren Produkte ist polymeres Hb (HemoSafe II), in dem das konformativ und dissoziativ stabilisierte tetramere Hämoglobin (HemoSafe I) intermolekular zu polymerem Hb verknüpft ist, mit einem Molekulargewicht, das bei einer Hämoglobinkonzentration von 14 g/dl den isoonkotischen Druck gibt. Die Polymerisation erfolgt unter Verwendung von Polyaldehyden, die gleich oder verschieden von denen sind, die zur Verleihung der konformativen Stabilität benutzt wurden. Nach dem Stand der Technik hergestellten Poly(Hb)Produkten, z.B. unter Verwendung von Glutaraldehyd, fehlte die im wesentlichen vollständige Konformationsstabilität der Erfindungsprodukte, da sie nicht über HemoSafe I hergestellt wurden.
Polymere Produkte der Erfindung können eine Mischung von polymeren Spezies enthalten, die sich voneinander bezüglich des Molekulargewichts unterscheiden (Zahl der Polymereinheiten). Alle diese Spezies sind jedoch konformativ in der T-Konformation stabilisiert. Alle diese Spezies haben dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Sauerstoffaffinität. Demgemäß haben die Polymerisationsprodukte der Erfindung den Vorteil der homogenen Sauerstoffaffinität und der leichten Reproduzierbarkeit der Verbindungen im Vergleich zu dem Stand der Technik.
Geeignete Reaktionsbedingungen zur Herstellung der Polymeren sind wäßrige Lösungen bei Raumtemperatur, die keinesfalls über 37ºC ansteigen darf. Das Verhältnis von Aldehyd zu Hämoglobin ist geeigneterweise 2 zu 100 auf der Basis der Mole der Aldehydgruppe pro Mol des Hb. Die Reaktionslösung sollte zwischen einem pH von 6,7 bis 9,5 gepuffert werden, vorzugsweise 8,0. Die Reaktion kann durch Zusatz eines Reduktionsmittels wie Natriumborhydrid oder Natriumcyanborhydrid zur Reduktion der restlichen Aldehydgruppen und zur Umwandlung der Schiff'schen Base zu einer stabilen kovalenten Kohlenstoff- Stickstoff-Bindung beendet werden.
Eine besonders bevorzugte polymere Produktzusammensetzung der Erfindung hat eine Molekulargewichtsverteilung, in der 20-25% des gebildeten Polymers aus 5 oder mehr tetrameren Hämoglobinmonomereinheiten bestehen, 50-60% der gebildeten Polymere weisen 2-4 monomere Hämoglobineinheiten auf, 20-25% der gebildeten weisen eine einzige Hämoglobineinheit (Molekulargewicht ca. 64 Kilodalton) auf und bestehen zu 1-2% aus unvollständig stabilisiertem Hämoglobin. Eine derartige Zusammensetzung ist isoonkotisch bei 14 g/dl, so daß sie in gleichen Volumina mit Blut als Blutersatz ohne Auslösung von Blutdruckproblemen genutzt werden kann.

Stabilisiertes Hämoglobinkonjugat

Ein weiteres dieser Produkte ist "konjugiertes HemoSafe I", in dem das konformativ stabilisierte und dissoziativ stabilisierte Hämoglobin (HemoSafe I) mit einem Biomakromolekül kovalent verbunden ist, um ein Produkt mit einem erwünscht höheren Molekulargewicht zu bilden. Konjugate von Hämoglobin und Biopolymeren (Inulin, Dextran, Hydroxyethylstärke usw.) sind dem Stand der Technik bekannt. Obwohl bei der vorliegenden Erfindung dieselben Biopolymere und ähnliche Methoden zur Bindung von Hämoglobin wie im Stand der Technik verwendet werden, behält das Hämoglobin seine konformative Stabilität, vorzugsweise T, in der konjugierten Form, mit den oben diskutierten zugehörigen Vorteilen.
Besonders ist Inulin als Polymer für die Herstellung von Konjugaten der Erfindung bevorzugt. Dies ist ein Polysaccharid mit einem ungefähren Molekulargewicht von 5.000, das für die Verwendung in diagnostischen Hilfsmitteln bekannt ist.

Pasteurisiertes Produkt

Die bekannten Stabilisierungen, Polymerisationen und Konjugationsverfahren schützen das Häm nicht vor Oxidation oder das Makromolekül vor Denaturierung, wenn das Makromolekül Hitze, Trocknungsbedingungen oder Gefriertemperaturen ausgesetzt wird. Es wurde im Rahmen der Erfindung ermittelt, daß das hämhaltige Makromolekül, wenn es zuerst stabilisiert und anschließend gegebenenfalls polymerisiert oder wie oben konjugiert wird, vor thermischer Oxidation geschützt werden kann, z.B. bei der Verwendung von Sauerstoffverdrängern oder -fängern oder vorzugsweise durch Bildung von Häm-Schutzkomplexen wie diejenigen, die bei der Reaktion mit Kohlenmonoxid (CO) oder Stickoxiden unter Bildung z.B. von Kohlenmonoxid- Häm-Derivaten entstehen, die die Pasteurisierung und Gefriertrocknung ohne Denaturierung erlauben.
Insbesondere die Addition von Kohlenmonoxid zu den neuen, unter Gebrauch der CSSC-Produkte gewonnenen stabilisierten Hämoglobinen ergibt neue Produkte, die im nachfolgenden gelegentlich CO-HemoSafe(s) genannt werden. Zu diesem Zweck wird CO der Reaktionsmischung zugesetzt, ohne daraus das Hämoglobinprodukt zu isolieren. In dem bereits stabilisierten Hämoglobin verhindern der Schutz des Häms durch CO und die Verhinderung eines allosterischen Konformationswechsels gemeinsam die Oxidation und Denaturierung von CO-HemoSafe(s) unter den Bedingungen des Erhitzens und Gefriertrocknens. Die Verwendung der Kohlenmonoxylierung und Pasteurisierung bei HemoSafe I, Hemosafe II und Hemosafe I-Inulin oder irgendwelchen anderen Hämoglobin-basierenden Blutsubstituten ist nicht im Stand der Technik beschrieben worden.
Pasteurisierung (z.B. feuchte Hitze bei 60ºC für 10 Stunden) und Lyophilisierung (Gefriertrockung) von Hämoglobinderivaten ohne Zusatz von geeigneten Schutzagentien führt zu ihrer Ausfällung und Denaturierung. Beim Schutz des Häms in den einzigartig stabilisierten Hämoglobinen der Erfindung mit CO kann das Erhitzen und das Gefriertrocknen des Produkts CO- HemoSafe erfolgreich durchgeführt werden. Die erfolgreiche Pasteurisierung ergibt ein lösliches und nicht-denaturiertes CO-HemoSafe, das Viruserkrankungs-übertragungsfrei ist. Die erfolgreiche Lyophilisation ergibt ein trockenes CO-HemoSafe- Produkt. Beide flüssigen und trockenen CO-HemoSafe-Produkte sind über einen langen Zeitraum bei jeder vernünftigen Temperatur lagerungsstabil (z.B. 56ºC für 60 Tage). CO-HemoSafe ist stabil, liefert aber keinen Sauerstoff. Daher muß für die Verwendung in der Transfusion die CO-HemoSafe-Lösung in eine Oxy-HemoSafe-Lösung umgewandelt werden, und zwar durch Behandlung mit Licht in Gegenwart von Sauerstoff.
Somit betrifft ein weiterer Gegenstand der Erfindung die Photokonversion von CO-HemoSafe zu Oxy-HemoSafe vor der Transfusion.
Es ist bereits bekannt, daß eine GA-Konzentration von 1mM erforderlich ist, um 95% des als HTLV-III/LAV oder HIV-I bekannten Virus zu inaktivieren. Die Gewährleistung der Sicherheit gegenüber einer Virusübertragung kann jedoch durch eine Pasteurisation erreicht werden, d.h. durch Erhitzen auf 60ºC für 10 Stunden; dies ist der akzeptierte Standard bei der Behandlung von von Plasma abgeleiteten Pharmazeutischen Produkten wie Albumin. Wenn z.B. stabilisiertes Oxy-Hb(T), erhalten wie oben beschrieben, für 10 Stunden 60ºC ausgesetzt wird, erhält man einen braunen Niederschlag (d.h. denaturiertes met-Hb(T)), der ungeeignet für die weitere Verwendung ist. Durch die Umwandlung von stabilisiertem Hb(T) in sein Kohlenmonoxidderivat gebildetes CO-HemoSafe I(T) widersteht einer Pasteurisation und einer Lagerung von bis zu 60 Tagen in Lösung bei 25ºC oder 56ºC ohne erkennbare Änderung seiner physikalisch-chemischen Eigenschaften, z.B. seines sichtbaren Spektrums, der Sauerstoffaffinität (z.B. P&sub5;&sub0;) oder seiner Zusammensetzung, erkennbar an seinem HPLC-Profil. Zusätzlich kann CO-HemoSafe I(T) gefriergetrocknet und bei 25ºC oder 56ºC für 60 Tage gelagert werden, ohne erkennbare Veränderung seiner physikalisch-chemischen Eigenschaften wie oben für die Pasteurisation beschrieben.

Transfundierbares Produkt

Reines CO-HemoSafe kann Sauerstoff nicht binden oder transportieren; daher ist es ungeeignet, trotz seiner Stabilität gegenüber der Herstellung, Pasteurisierung und Gefriertrocknungsschritten Sauerstoff zu liefern oder zu transfundieren. Das Entfernen von CO unter keimfreien Bedingungen ist eine Voraussetzung für seinen Gebrauch als Blutersatz. Die vorliegende Erfindung lehrt daher, daß CO-HemoSafe vollständig zu dem oxygenierten Oxy-Hämoglobinderivat photokonvertiert werden kann. Dazu wird die Lösung mit Sauerstoff versorgt und anschließend wird die Lösung durch transparente Rohre bzw. Schläuche, die dem sichtbaren Licht ausgesetzt sind, geleitet. Die optischen Absorptionsspektren von CO-HemoSafe und Oxy- HemoSafe liefern geeignete Mittel zur Charakterisierung und Quantifizierung der zwei Spezies. Im Gegensatz zu existierenden Blutsubstituten, wie das allgemein erhältliche Poly-PLP- Hb, weist HemoSafe den Vorteil der physiologischen und gleichförmigen Sauerstoffaffinität auf. Seine Vorstufe, CO-HemoSafe, ist gegenüber den Bedingungen der Pasteurisierung, Lyophilisierung, Photokonversion und Lagerung bei jeder Temperatur bis zu 60ºC stabil. Die Erfindung lehrt somit ein Verfahren, das einen sterilen, virusübertragungsfreien, wirksamen Blutersatz liefert.
Außerdem ist gemäß der Erfindung gefunden worden, daß die Stabilität, die durch den Prozeß der Kohlenmonoxylierung verliehen wird, auf jedes im Stand der Technik beschriebene Hb-basierende Blutsubstitut angewendet werden kann. Zum Beispiel ist in Übereinstimmung mit der Erfindung gezeigt worden daß Kohlenmonoxidderivate von Poly-PLP-Hb (Poly-CO-PLP- Hb), von ATP-Hb (CO-ATP-Hb), und von Poly-ATP-Hb (Poly-CO-ATP- Hb) gleichermaßen stabil, pasteurisierbar, trockengefrierbar und zu ihren Sauerstoffderivaten photokonvertierbar sind. Die vorliegende Erfindung schließt somit Verfahren ein, die als allgemein erforderliche Behandlung zur Beseitigung pathogener Viren aus Sauerstoff tragenden Fluiden für die Wiederbelebung auf Basis von Hämoglobin anwendbar sind, sowie zur Verbesserung der Lagereigenschaften der Fluide ein. Somit können alle existierenden Blutsubstitute, die auf Hämoglobin basieren, z.B. Dextran-Hb, Hydroxyethylstärke-Hb, Polyethylenglykol-Hb und Diaspirin-vernetztes Hb mit dem Verfahren der Erfindung frei von der Übertragung von Virusinfektionen hergestellt werden.
Das bevorzugt durchgeführte Verfahren zur Herstellung von HemoSafe der Erfindung läßt sich folgendermaßen zusammenfassen:
(i) Gepooltes Gesamtblut wird mit isotonischer Natriumchloridlösung verdünnt und in einem Filtrationssystem vom Membrantyp eingesetzt.
(ii) Das Plasma wird von den zellulären Elementen des Bluts durch tangentiale Flüssigkeitsmembranfiltration separiert.
(iii) Die roten Blutzellen werden mit isotonischer Salzlösung gewaschen.
(iv) Die roten Blutzellen werden mit einem hypotonischen Phosphatpuffer lysiert. Anschließend werden die Zelltrümmer und andere Substanzpartikel vom löslichen Hämoglobin durch eine tangential-Flüssigfiltration separiert.
(v) Oxy-Hb wird durch Vakuum oder durch ein Gasaustauschgerät und ein Reduktionsmittel zu Deoxy-Hb umgewandelt.
(vi) Deoxy-Hb wird durch Zugabe eines konformationsspezifischen Vernetzungsstabilisator (CSSC), zu dem gewünschten Monomeren oder Polymeren oder Konjugat stabilisiert.
(vii) Deoxy-Hb wird physikalisch mit Kohlenmonoxid stabilisiert und ergibt CO-HemoSafe.
(viii) CO-HemoSafe wird gewaschen und konzentriert, oder durch den Zusatz einer geeigneten physiologischen Salzlösung wird das elektrolytische Gleichgewicht wieder hergestellt.
(ix) Die Pasteurisierung erfolgt an CO-HemoSafe.
(x) Pasteurisiertes CO-HemoSafe wird in Gegenwart von Sauerstoff zu Oxy-HemoSafe photokonvertiert.
< (xi) Oxy-HemoSafe wird steril gefiltert und für die Transfusion verpackt.
Wenn Oxy-Hemosafe wie in der Erfindung beschrieben zugänglich wird, ist es möglich, es in met-HemoSafe-Derivate für den Gebrauch als Antidot und als Präventivtransfusion zur Vorbeugung einer Cyanidvergiftung, z.B. bei der chemischen Verteidigung, zu konvertieren. Die Erfindung lehrt, daß nach der Herstellung von Oxy-HemoSafe bekannte Methoden für die Oxidation desselben zum met-HemoSafe verwendet werden, das als ein sofort wirksamer und lange wirksamer Cyanidfänger transfundiert werden kann. Der intravenöse Einsatz des met-HemoSafes vermeidet die zeitliche Verzögerung, die bei der Behandlung des Körpers bei der Verwertung von oral aufgenommenen Nitriten zur Bildung von met-Hb entsteht. Nitrite rekrutieren außerdem met-Hb aus existierendem RBC-Oxy-Hämoglobin; somit beeinträchtigt der Gebrauch von met-HemoSafe nicht die existierende Sauerstoffträgerkapazität. Somit liefert met-HemoSafe eine Behandlung der Cyanidintoxikation jenseits der aus dem Stand der Technik bekannten.
Die Transfusion von Oxy-Hemosafe kann auch als ein Substitut in der Blutdopingtechnik benutzt werden. Während der Stand der Technik lehrt, daß zur Erhöhung der Sauerstoffträgerkapazität rote Blutzellen an Individuen abgegeben werden können, ist dies jedoch durch den begleitenden Anstieg der Zellviskosität auf 10 bis 15% limitiert. Bei der Verwendung von Oxy-HemoSafe zusammen mit der bekannten Plasmapheresetechnik kann das Plasma durch Oxy-HemoSafe mit einer theoretischen Steigerung der Sauerstoffträgerkapazität von 50% ersetzt werden, ohne Wechsel des Hämatokrit oder der Fließcharakteristika des Blutes.
Obwohl nicht beabsichtigt ist, die Erfindung oder ihren Anwendungsbereich durch irgendeine Theorie zur Struktur der Produkte oder Mechanismen der Verfahren zu ihrer Herstellung zu begrenzen, wird es als möglich angesehen, daß die konformative Stabilität und die dissoziative Stabilität der Produkte sich von kovalenten Bindungen innerhalb der Untereinheiten des tetrameren Hämoglobins mit CSSC herleiten. Diese Bindungen sind stabil genug, um die Dissoziation in Dimere zu verhindern, und starr genug, um einen Konformationswechsel zu verhindern. Wie man auch immer die Struktur erklärt, weist HemoSafe eine einheitliche Konformationsstabilität auf.
Die Erfindung wird weiterhin in den folgenden spezifischen und nicht limitierenden Beispielen beschrieben, auf die sich die verschiedenen Zeichnungen beziehen:

Die beiliegenden Abbildungen zeigen:

Fig. 1 ist das analytische Profil der Gelpermeation einer Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) des stabilisierten menschlichen Deoxyhämoglobinprodukts, hergestellt gemäß dem folgenden Beispiel 3, mit einem Vergleich zu SFH;
Fig. 2 ist eine Sauerstoffdissoziationskurve von HemoSafe (1)-Produkten der Beispiele 3 und 4;
Fig. 3 zeigt ein Absorptionspektrum der Produkte der Beispiele 3 und 13;
Fig. 4 ist eine grafische Darstellung der Halbwertzeituntersuchungen der Produkte der Beispiele 3, 8 und SFH;
Fig. 5 ist das analytische Profil der Gelpermeation der Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) der Produkte gemäß dem Verfahren des Beispiels 8.

Beispiel 1

HERSTELLUNG DES MENSCHLICHEN UND TIERISCHEN STROMAFREIEN HÄMOGLOBINS (SFH)

Menschliches stromafreies Hämoglobin wurde aus Blut oder abgepackten Blutzellen, die vom kanadischen Roten Kreuz erhalten wurden und deren Haltbarkeitsdatum überschritten war, hergestellt. Zunächst wurde das Vollblut bei 3.000 rpm für 30 min zentrifugiert. Dann wurden Plasma und Buffy Coat durch Absaugen mit der Pipette entfernt und verworfen. Das Erythrocytensediment wurde dreimal durch Suspendierung in einer eisgekühlten Salzlösung des dreifachen Volumens gewaschen. Nach jeder Waschung wurden die Zellen durch Zentrifugation resedimentiert und der Überstand entfernt und verworfen.
Als nächstes wurden die gewaschenen roten Zellen mit vier Volumina eines 5mM-Phosphatpuffers (pH 7,6) zur Zerstörung der intakten Zellwände und zur Freisetzung des Hämoglobins lysiert. Zur Entfernung von Stroma und Membranfragmenten wurde das Hämolysat durch ein Pellicon-Cassettensystem (Millipore) mit einem Fluorkohlenstoffpolymerfilter (HVLP, Porosität 0,5 um) filtriert, gefolgt von einem Polysulfonfilter (100.000 Molekulargewicht Cut-off). Das Hämoglobin im Filtrat wurde zuerst auf 14 bis 20 g/dl konzentriert und dann mit dem 10fachen Überschuß eines PBS-Puffers (pH 7,4), der mit einer Membrancassette mit 5,0 sq.ft. eines Pellicon-Cassettensystems (PT-Serie, 30.000 Molekulargewicht Cut-off) ausgerüstet war, gewaschen und durch eine 0,22 um Millipore-Sterilfiltereinheit filtriert und anschließend bei 4ºC bis zum Einsatz gelagert.
Für tierische Hämoglobinpräparate wurde das gleiche Verfahren angewendet wie bei der Herstellung des menschlichen Hämoglobins, mit Ausnahme des Hämoglobins der Ratte, bei der ein 20 mM Boratpuffer (pH 9,5) anstelle des PBS-Puffers (pH 7,4) zur Verbesserung der Solubilisierung des Hämoglobins benutzt wurde.

Beispiel 2

HERSTELLUNG VON PERJODATOXIDIERTER RAFFINOSE UND ANDEREN ZUCKERN ALS CSSC FÜR HÄMOGLOBIN

Es wurden jeweils 200 mg Raffinose, Maltose, Maltotriose, Maltopentose, Maltohexose, Maltoheptose und andere Zucker in 6 ml destilliertem H&sub2;O in einem konstanten molaren Verhältnis von festem Natrium-m-perjodat zu Saccharid bei Raumtemperatur behandelt. (Das molare Verhältnis von Natrium-m-perjodat zu eingesetztem Saccharid war 2,2 für das Pyranosid und 1,1 für das Furanosid). Nach einer Stunde wurde das Reaktionsgemisch in einem Eis/Wasserbad abgekühlt und das Natriumbisulfit unter heftigem Rühren zugesetzt, bis sich das ausgefallene Jod zu einer farblosen Lösung gelöst hatte. Der pH der Lösung wurde daraufhin unverzüglich auf 8,0 ± 0,1 unter Zusatz von 6N NaOH eingestellt. Die resultierende oxidierte Zuckerlösung wurde bis zu einer Konzentration von 20 mg/ml weiter verdünnt, durch einen Millipore-0,45um-Typ GS-Membranfilter filtriert und bis zum Einsatz bei 4ºC gelagert.

Beispiel 3

HERSTELLUNG VON MENSCHLICHEM HEMOSAFE I (T), KONFORMATIONSSTABILISIERT UND VERNETZT DURCH RINGGEÖFFNETE RAFFINOSE (O-RAFFINOSE)

Herstellung intramolekular vernetzten Deoxyhämoglobins (XL- Hb(T)): Eine Lösung von 350 ml stromafreiem Oxy-Hämoglobin (Hb(R)) 1% W/V in einem 0,1M-Phosphatpuffer (pH 8,0) wurde magnetisch gerührt und schätzungsweise 4 Stunden im Vakuum bei Raumtemperatur in das Deoxyhämoglobin (Hb(T)) umgewandelt. 0,1 mmol Natriumdithionit, gelöst in 0,3 ml entgastem Puffer, wurden zu der Hämoglobinlösung gegeben und 5 min umgesetzt. Es wurden 1,08 mmol der Vernetzungssubstanz, o-Raffinose, in 20 ml vorher entgasten Puffer (pH 8,0) unter heftigem Rühren im Vakuum hinzugefügt, und anschließend wurde die Lösung noch für weitere 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Eisbad abgekühlt und anschließend 15,0 mmol Natriumborhydrid in 5 ml entgaster 1 mM NaOH unter positivem inertem Gasdruck zugefügt. Man ließ die Reduktion 45 min ablaufen.
Fig. 1 ist das HPLC-Profil, das man bei 5 ug/100 ml des Produkts (durchgezogene Linie) und eines menschlichen Kontroll-SFH (gestrichelte Linie) erhält. Die Molekulargewichtskalibrierung ist für B-Globin-Molekülhälften (Peak a) und (α B)&sub2; stabilisiertes menschliches Hb(T), (Peak b) wie angegeben. Der eingesetzte Puffer war 50 mM Phosphat und 150 mM NaCl (pH 7,0). Das Chromatogramm wurde auf einem Pharmacia FPLC-System erhalten, ausgerüstet mit einem programmierbaren GP-250-Gradienten, einer P500-Pumpe, einem 482er Aufzeichnungsrekorder und einem Einweg-UV-Monitor mit einem 405-nm-Filter.
Das Profil zeigte, daß mehr als 95% des Hämoglobins stabilisiert und vernetzt ist und daß weniger als 5% in zwei Molekülhälften des XL-Hb(T) dissoziieren. Unter den gleichen experimentellen Bedingungen dissoziiert Hämoglobin vollständig in die Molekülhälften.
Herstellung der Kohlenmonoxid (CO)-Derivate von XL-Hb(T) (COXL-Hb(T)) und Pasteurisierung: Nach der Reduktion mit Natriumborhydrid wurde CO direkt in die XL- Hb(T)-Reaktionsmischung eingeleitet. Nach Waschen und Konzentrierung mit einem Membranfilter wurde das COXLHb(T) unter einer 100%-igen CO-Atmosphäre 10 Stunden bei 60ºC zur Herstellung von CO-HemoSafe I pasteurisiert. Für eine längere Lagerung bei Raumtemperatur kann CO-HemoSafe I zu einem Trockenpulver und bei Bedarf mit einem Puffer rekonstituiert werden.
Photokonversion von CO-HemoSafe I(T) zu Oxy-HemoSafe I(T): 15 ml des CO-HemoSafe I(T) wurden in einen 500ml-Rundkolben transferiert, der mit einem Rotationsverdampfer verbunden war und kontinuierlich unter einer CGE-Brooder-Lampe (C 250 R40/1, Innenseite mattiert, Weichglas) in einem Eis/Wasserbad bei 0ºC rotierte. Zur Entfernung des nicht gebundenen CO wurde der Kolben über eine Wasserstrahl-Vakuumpumpe evakuiert. Nach 2 min wurde Luft oder 100%-iger Sauerstoff eingeleitet. Dieser Zyklus wurde solange wiederholt, bis die Spektrometrische Prüfung der Zusammensetzung der Probe bei Werten zwischen 577 und 560 mm ein Absorptionsverhältnis von 1,8 ergab, bei dem die Entfernung des CO als vollständig anzunehmen ist (Methods in Enzymology, Bd. 76, Hemoglobin, S. 60 & 164). Das so erhaltene Endprodukt wies eine unveränderte gelpermeationschromatographische Zusammensetzung auf, die in Fig. 1 dargestellt ist.
Fig. 3 zeigt das relative Absorptionsspektrum der Produkte von diesem und anderen Beispielen, in Ringer-Puffer (pH 7,4) bei 22ºC. Die durchzogene Linie ist die des XL-AB (T), d.h. vor der Kohlenmonoxylierung und die gepunktete Linie ist die des Oxy-HemoSafe-Endproduktes. Die Kurven der Fig. 3 zeigen, daß das Endprodukt im wesentlichen unveränderte physikalisch-chemische Eigenschaften aufweist.
Fig. 2 zeigt die Sauerstoffdissoziationskurve von HemoSafe (1), vernetzt und stabilisiert mit o-Raffinose in diesem Beispiel (gestrichelte Linie) und die von Oxy-Hämoglobin oder Hb(R) (durchgezogene Linie), gemessen bei 37ºC in einer Ringer-Phosphatpufferlösung bei pH 7,4 mit einer Hämoglobinkonzentration von 3,5 g/dl. Dies sind typische Kurven solcher Produkte. Die Werte des Sauerstoffpartialdruckes bei einer 50%-igen Sättigung (P&sub5;&sub0;) können direkt der Kurve entnommen werden.
Das HemoSafe (1)-Produkt zeigt in diesem Beispiel übereinstimmend zur Fig. 2a eine hyperbolische Sauerstoffdissoziationskurve mit einem P&sub5;&sub0;-Wert (P&sub5;&sub0; entspricht dem Sauerstoffpartialdruck, wenn 50% des Hämoglobins in den oxygenierten Zustand überführt sind) von 27 mmHg und 37ºC in einem PBS-Puffer (pH 7,4). Es weist einen Hill-Koeffizienten von ca. 1-1,5 auf.
Fig. 4 zeigt typische Plasmahalbwertzeitstudien von Blutsubstituten auf Hämoglobinbasis einschließlich, wiedergegeben in diesem Beispiel durch die gestrichelte Linie, denjenigen für das Endprodukt Oxy-HemoSafe 1(T). Die Messungen wurden in einem 30%-igen hypervolemischen Modell bei Ratten gemacht. Das Produkt wies eine Halbwertzeit von schätzungsweise 4-5 Stunden auf, verglichen mit der des Hämoglobins (gepunktete Linie) von etwa 1-1,5 Stunden.

Beispiel 4

HERSTELLUNG VON MENSCHLICHEM HEMOSAFE I(R), KONFORMATIONSSTABILISIERT UND VERNETZT MIT RINGGEÖFFNETER RAFFINOSE (O-RAFFINOSE)

Das Verfahren ist dem des in Beispiel 3 hergestellten HemoSafe I(T) ähnlich, mit der Ausnahme, daß die Reaktion in Gegenwart von Sauerstoff und der Abwesenheit von Natriumdithionit ausgeführt wurde.
Das Endprodukt zeigt eine hyperbolische Sauerstoffdissoziationskurve mit einem P&sub5;&sub0;-Wert von 2-3 mmHg bei 37ºC in einem PBS-Puffer, pH 7,4, (Fig. 2, durchgezogene Linie); seine gelpermeationschromatographische Zusammensetzung und sein sichtbares Spektrum sind von dem des HemoSafe I(T) nicht zu unterscheiden.

Beispiel 5

HERSTELLUNG VON RINDER-HEMOSAFE I(T), KONFORMATIONSSTABILISIERT UND VERNETZT MIT RINGGEÖFFNETER RAFFINOSE (O-RAFFINOSE)

Herstellung von intramolekular vernetztem Rinder-Deoxyhämoglobin: Eine 90ml-Lösung von stromafreiem Rinderoxyhämoglobin, 1% w/v in einem 0,1M-Phosphatpuffer pH 8,0 wurde unter magnetischem Rühren im Vakuum ungefähr 2 Stunden bei Raumtemperatur in Deoxyhämoglobin überführt. 400 umol Natriumdithionit, gelöst in 0,3 ml entgastem Puffer, wurden der Hämoglobinlösung zugesetzt, und man ließ 5 min reagieren. Das Vernetzungsreagens, o-Raffinose, 276 umol in 6 ml vorher entgastem Puffer (pH 8,0), wurde unter Vakuum der Lösung zugesetzt und weitere 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde in einem Eis/Wasserbad gekühlt und 3,5 mmol Natriumborhydrid in 2 ml zu 1 mM NaOH (entgast) unter inertem Gasdruck zugegeben. Man ließ die Reduktion 45 min fortschreiten. Das HPLC-gelpermeationschromatographische Profil zeigte, daß > 90% des Rinderhämoglobins intramolekular stabilisiert war. Das Chromatogramm des vernetzten Rinderhämoglobins ist ähnlich dem in Fig. 1 gezeigten.
Die Verfahren Prozeß für die Herstellung von o-Raffinose-stabilisiertem Rinder-CO-HemoSafe I(T), seine Pasteurisation, Lyophilisation und Photokonversation zu Oxy-HemoSafe I(T) sind ähnlich den in Fig. 3 angestrebten.
Das so erhaltene Endprodukt hat eine unveränderte gelpermeationschromatographische Zusammensetzung und physikalisch-chemische Eigenschaften. Das Produkt zeigt eine hyperbolische Sauerstoffdissoziationskurve mit P&sub5;&sub0; von 34 mmHg, gemessen bei 37ºC in einem PBS-Puffer (pH 7,2), einen Hill-Koeffizienten von ca. 1,5 und eine Plasmahalbwertzeit von ca. 4 Stunden, gemessen in einer 30%-igen hypervolemischen Transfusion an der Ratte.

Beispiel 6

HERSTELLUNG VON SCHARARTIGEM-HEMOSAFE I(T), KONFORMATIONSSTABILISIERT UND VERNETZT MIT RINGGEÖFFNETER RAFFINOSE (O-RAFFINOSE)

Herstellung von intramolekular vernetztem schafartigem Deoxyhämoglobin: Eine 100ml-Lösung von stromafreiem Schafoxyhämoglobin, 1% w/v in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8,0) wurde im Vakuum etwa 2 Stunden bei Raumtemperatur magnetisch unter Umwandlung zu Deoxyhämoglobin gerührt. 50 umol Natriumdithionit in 100 ul entgastem Puffer wurden der Hämoglobinlösung zugesetzt. Nach 5 min wurde das Vernetzungsreagens o-Raffinose 616 umol in 12,5 ml vorher entgastem Puffer (pH 8,0) unter Rühren im Vakuum zugegeben. Die Vernetzung wurde nach 16 Stunden bei 4ºC abgebrochen. Die Reaktionsmischung wurde in einem Eis/Wasserbad gekühlt und 4,4 mmol Natriumborhydrid in 2,5 ml entgaster 1 mM NaOH unter einem Inertgasüberdruck zugegeben. Die Reduktion wurde nach 45 min abgebrochen. Das HPLC-gelpermeationschromatographische Profil zeigt, daß mehr als 95% der schafartigen Hämoglobinmolekülhäften intramolekular stalisiert waren, ähnlich zu dem in Fig. 1 gezeigtem.
Das Verfahren zur Herstellung von o-Raffinose-stabilisierten Ovin-CO-HemoSafe I(T), ist ähnlich zu dem in Beispiel 3 beschriebenen hinsichtlich seiner Pasteurisation, Lyophilisation und Photokonversation zu Oxy-Hemosafe I(T).
Das so erhaltene Endprodukt hat eine unveränderte gelpermeationschromatographische Zusammensetzung und physikalisch-chemische Eigenschaften. Das Produkt hat einen P&sub5;&sub0; von 38 mmHg, gemessen bei 37ºC in einem PBS-Puffer (pH 7,4).

Beispiel 7

HERSTELLUNG VON RATTEN-HEMOSAFE I(T), KONFORMATIONSSTABILISIERT UND VERNETZT MIT RINGGEÖFFNETER RAFFINOSE (O-RAFFINOSE)

Herstellung von intramolekular vernetztem Rattendesoxyhämoglobin: Eine 18ml-Lösung von stromafreiem Rattenoxyhämoglobin, 2 % w/v in 20 mM Boratpuffer (pH 9,5), wurde im Vakuum für etwa 1 Stunde bei Raumtemperatur magnetisch unter Umwandlung zu Deoxyhämoglobin gerührt. 50 umol Natriumdithionit wurden in 0,1 ml entgastem Puffer gelöst und der Hämoglobinlösung zugesetzt; man ließ 5 min reagieren. Die Vernetzungssubstanz, o-Raffinose, 110 umol in 3 ml vorher entgastem Puffer (pH 8,0), wurde im Vakuum unter Rühren zugesetzt. Man ließ die Vernetzung 16 Stunden bei 4ºC ablaufen. Das Reaktionsgemisch wurde in einem Eis/Wasserbad gekühlt und 1,2 mmol Natriumborhydrid in 1 ml einer 1 mM NaOH wurden unter posivem Inertgasdruck zugesetzt. Der Reduktionsprozeß wurde nach 45 min abgebrochen. Das HPLC-gelpermeationschomatographische Profil zeigt, daß mehr als 90% der Hämoglobinmolekülhälften der Ratte, intramolekular ähnlich wie diejenigen in Fig. 1 gezeigten, stabilisiert waren.
Das Verfahren für die Herstellung von o-Raffinose-stabilisiertem CO-HemoSafe I(T) der Ratte ist ähnlich dem in Beispiel 3 beschriebenen hinsichtlich seiner Pasteurisierung, Lyophilisierung und Photokonversion zu Oxy-HemoSafe I(T).
Das erhaltene Endprodukt war in der gelpermeationsschromatischen Zusammensetzung und den physikalisch-chemisch Eigenschaften unverändert. Das Produkt hat einen P&sub5;&sub0; von 24 mmHg, gemessen bei 37ºC in einem PBS-Puffer (pH 7,4) und einen Hill-Koeffizienten von ca. 1,0.

Beispiel 8

HERSTELLUNG VON MENSCHLICHEM HEMOSAFE II, KONFORMATIONSSTABILISIERT UND POLYMERISIERT MIT RINGGEÖFFNETER RAFFINOSE (O-RAF FINOSE)

Herstellung von intramolekular stabilisiertem und intramolekular vernetztem Deoxyhämoglobin: Eine 77ml-Lösung menschlichen Oxy-Hämoglobins, 4% w/v, in einem 0,1 M-Phosphatpuffer (pH 8,0) wurde im Vakuum etwa 4 Stunden bei Raumtemperatur unter magnetischem Rühren in Deoxyhämoglobin umgewandelt. 0,10 mmol Natriumdithionit, gelöst in 0,3 ml entgastem Puffer, wurden der Hämoglobinlösung zugesetzt; man ließ 5 min reagieren. Das Vernetzungsreagens, o-Raffinose, 0,95 mmol in 20 ml vorher entgastem Puffer, wurde im Vakuum zugesetzt und man ließ die Reaktion 6 Stunden ablaufen. Das Reaktionsgemisch wurde in einem Eis/Wasserbad gekühlt, und es wurden 9,5 mmol Natriumborhydrid in 4 ml entgaster 1 mM NaOH unter Inertgasdruck zugesetzt. Man ließ die Reduktion 45 min ablaufen. In der beiliegenden Fig. 5 zeigt das HPLC-gelpermeationschromatographische Profil, daß mehr als 98% des Hämoglobins stabilisiert und vernetzt sind, wobei 20-25% stabilisiertes Monomer, 55 5% die Summe von Dimeren, Trimeren und Tetrameren und 20-25% kombinierte Pentamere und Polymere sind.
Dieses chromatographische Profil wurde bei der Verwendung eines 50mM-Phosphatpuffers und 150 mM NaCl (pH 7) mit dem in Fig. 1 beschriebenen Apparat erhalten. Das poly-Hb(T) wurde in Monomere (Peak a), die Summe der Dimeren, Trimeren und Tetrameren (Peak b) sowie Pentamere oder größere (Peak c) mit einer Superose -12 vorgepackten HR-10/30-Säule und einer Fließgeschwindigkeit von 0,4 ml/min aufgetrennt. Eine solche Zusammensetzung des polymerisierten Produkts verhielt sich isoonkotisch bei einer Konzentration von 14 g/dl.
Das Verfahren zur Herstellung von o-Raffinose-stabilisiertem CO-HemoSafe II(T) ist ähnlich der in Beispiel 3 beschriebenen, hinsichtlich der Pasteurisierung, Lyophilisierung und Photokonversion zu Oxy-HemoSafe II(T).
Das so erhaltene Endprodukt wies vor und nach der Pasteurisation eine unveränderte gelpermeationschromatographische Zusammensetzung und physikalisch-chemische Eigenschaften auf; es hat eine hyperbolische Sauerstoffdissoziationskurve mit einem uniformen P&sub5;&sub0; von 32 mmHg und einem Hill-Koeffizienten 1,6, gemessen bei 37ºC in einem PBS-Puffer (pH 7,2). Das isolierte, gereinigte, fraktionierte HemoSafe II(T), d.h. Monomer, Dimer, Trimer, Tetramer, Pentamer oder größer (siehe Fig. 5) haben einen nicht unterscheidbaren P&sub5;&sub0;, einen Hill-Koeffizienten und eine Halbwertzeit von 7-8 Stunden, gemessen an der Ratte mit einem 30%-igen hypervolemischen Austausch.

Beispiel 9

HERSTELLUNG VON MENSCHLICHEM HEMOSAFE II, KONFORMATIONSSTABILISIERT UND POLYMERISIERT MIT RINGGEÖFFNETER SACCHAROSE (O-SACCHAROSE)

Herstellung von intramolekular stabilisiertem und intramolekular vernetztem menschlichen Deoxyhämoglobin mit o-Saccharose: Eine 10ml-Lösung menschlichen stromafreien Oxy-Hämoglobins, 13% w/v in einem 0,1M-Phosphatpuffer (pH 8,0) wurde in etwa 2 Stunden unter magnetischem Rühren im Vakuum zu Deoxyhämoglobin umgewandelt. 40 umol in 0,2 ml entgastem Puffer gelöstes Natriumdithionit wurden der Hämoglobinlösung zugesetzt. Nach 5 min wurde das Vernetzungsreagens, o-Saccharose, 200 umol in 3 ml vorher entgastem Puffer im Vakuum zugesetzt; man ließ die Reaktion 6 Stunden ablaufen. Das Reaktionsgemisch wurde in einem Eisbad gekühlt und 2,0 mmol Natriumborhydrid in 1 ml entgaster 1 mM NaOH wurden unter positivem Inertgasdruck zugesetzt. Man ließ die Reduktion 45 min ablaufen. Das HPLC- gelpermeationschromatographische Profil zeigte, daß > 98% des Hämoglobins stabilisiert und vernetzt waren und daß die Produktzusammensetzung ähnlich der in Beispiel 8 beschriebenen ist (Fig. 5).
Die Verfahren zur Herstellung des o-Saccharose-stabilisierten CO-HemoSafe II(T) sind ähnlich den in Beispiel 3 dargestellten, hinsichtlich Pasteurisation, Lyophilisation und Photokonversion zu Oxy-HemoSafe II(T).
Das so erhaltene Endprodukt weist keine veränderte gelpermeationschromatographische Zusammensetzung und physikalischchemische Eigenschaften vor und nach der Pasteurisation auf. Das Produkt hat einen P&sub5;&sub0; von 24 mmHg, gemessen bei 37ºC in einem PBS-Puffer (pH 7,2), einen Hill-Koeffizienten von 1,3 und eine Halbwertzeit von ca. 7-8 Stunden bei der Ratte, gemessen bei einem 30%-igen hypervolemischen Austausch.

Beispiel 10

HERSTELLUNG VON RINDER-HEMOSAFE II(T), KONFORMATIONSSTABILISIERT UND POLYMERISIERT DURCH RINGGEÖFFNETE RAFFINOSE (O-RAFFINOSE)

Herstellung von intramolekular stabilisiertem und intramolekular vernetztem Rinderdesoxyhämoglobin mit o-Raffinose: 40 ml einer stromafreien Rinderoxyhämoglobinlösung, 6% w/v in einem 0,1M-Phosphatpuffer (pH 8,0), wurden im Vakuum etwa 4 Stunden bei Raumtemperatur magnetisch gerührt und zu Deoxyhämoglobin umgewandelt. 80 umol Natriumdithionit, gelöst in 0,2 ml entgastem Puffer, wurden der Hämoglobinlösung zugesetzt; man ließ 5 min reagieren. Das Vernetzungsreagens, o-Raffinose, 550 umol in 10 ml vorher entgastem Puffer, wurde unter Vakuum zugesetzt; man ließ die Reaktion weitere 6 Stunden ablaufen. Das Reaktionsgemisch wurde in einem Eis/Wasserbad gekühlt und 3,5 mmol Natriumborhydrid in 4,0 ml entgaster 1 mM NaOH wurde unter Inertgasdruck zugegeben. Die Reduktion wurde nach 45 min abgebrochen. Das HPLC-gelpermeationschromatografische Profil zeigte, daß > 95% der Rinderhämoglobinhälften stabilisiert und vernetzt war, und die Produktzusammensetzung ähnlich der im Beispiel 8 beschriebenen ist.
Die Verfahren zur Herstellung des o-Raffinose-stabilisierten Rinder-CO-HemoSafe II(T) sind ähnlich den in Beispiel 3 beschriebenen hinsichtlich Pasteurisation, Lyophilisation und Photokonversion zu Oxy-HemoSafe II(T).
Das so erhaltene Endprodukt zeigt eine unveränderte gelpermeationschromatographische Zusammensetzung und physikalische Eigenschaften vor und nach der Pasteurisation. Das Produkt hat einen P&sub5;&sub0; von 28 mmHg, gemessen bei 37ºC in einem PBS-Puffer (pH 7,4) und einem Hill-Koeffizienten von ca. 1,5 und eine Halbwertzeit von 7-8 Stunden, gemessen an der Ratte mit einem 30%-igen hypervolemischen Austausch.

Beispiel 11

HERSTELLUNG VON HEMOSAFE II(T) DER RATTE, KONFORMATIONSSTABILISERT UND POLYMERISIERT MIT RINGGEÖFFNETER RAFFINOSE (O-RAFFINOSE)

Herstellung von intramolekular stabilisiertem und intramolekular vernetztem Deoxyhämoglobin der Ratte: Eine 6ml-Lösung stromafreies Oxy-Hämoglobin der Ratte, 9,4 % w/v in einem 20mM-Boratpuffer (pH 9,5), wurde im Vakuum etwa 2 Stunden bei Raumtemperatur unter Umsetzung zu Deoxyhämoglobin magnetisch gerührt. 20 umol Natriumdithionit, gelöst in 100 ul entgastem Puffer, wurden der Hämoglobinlösung zugesetzt; man ließ 5 min reagieren. Das Vernetzungsreagens, o-Raffinose, 87 umol in 2 ml vorher entgastem Puffer, wurde im Vakuum zugesetzt. Nach einer Reaktionszeit von 16 Stunden bei 4ºC ließ man anschließend noch 5 Stunden bei Raumtemperatur reagieren. Die Reaktionsmischung wurde im Eis/Wasserbad gekühlt und 1,2 mmol Natriumborhydrid in 1,0 ml entgaster 1 mM NaOH unter positivem Inertgasdruck zugegeben. Man ließ die Reduktion 45 min ablaufen. Das HPLC-gelpermeationschromatographische Profil zeigte, daß > 98% der Hämoglobinmolekülhälften der Ratte stabilisiert und vernetzt waren, und daß die Produktzusammensetzung ähnlich der in dem Beispiel 8 beschriebenen ist.
Die Verfahren zur Herstellung des o-Raffinose-stabilisierten CO-HemoSafe II(T) der Ratte sind ähnlich den im Beispiel 3 beschriebenen hinsichtlich Pasteurisierung, Lyophilisierung und Photokonversion zu Oxy-HemoSafe II(T).
Das erhaltene Endprodukt zeigt eine unveränderte gelpermeationschromatographische Zusammensetzung und physikalisch-chemische Eigenschaften vor und nach der Pasteurisation.

Beispiel 12

HERSTELLUNG VON RINGGEÖFFNETEM RAFFINOSE-KONFORMATIONSSTABILISERTEM MENSCHLICHEM HEMOSAFE I(T) - INULINKONJUGAT

Herstellung von intramolekular vernetztem menschlichen HemoSafe I(T). Die Herstellung ist identisch zu der in Beispiel 3 beschriebenen.
Herstellung von perjodat-oxidiertem Inulin (o-Inulin): Die Herstellung von ringgeöffnetem Inulin ist ähnlich zu der im Beispiel 2 beschriebenen.
Herstellung von HemoSafe i(T) - Inulinkonjugat: Eine 35ml-Lösung von menschlichem Oxy-HemoSafe i(T), 4% w/v in 0,1 M NaHCO&sub3; wurde unter magnetischem Rühren im Vakuum etwa 2 Stunden bei Raumtemperatur zu Deoxy-HemoSafe I(T) umgewandelt. 40 umol Natriumdithionit, gelöst in 50 ul entgastem Puffer, wurden hinzugefügt. Nach 5 min wurde äquimolar o-Inulin in 8,5 ml vorher entgaster 0,1 M NaHCO&sub3; im Vakuum unter Rühren zugesetzt; man ließ die Reaktion 5 Stunden bei Raumtemperatur ablaufen. Das Reaktionsgemisch wurde in einem Eis/Wasserbad gekühlt und 2,0 mmol Natriumborhydrid in 1,5 ml entgaster 1 mM NaOH unter positivem Inertgasdruck zugesetzt. Die Reduktion wurde nach 45 min abgebrochen. Das HPLC-gelpermeationschromatographische Profil und die Produktzusammensetzung von HemoSafe I(T)-Inulinkonjugat ist dem in Fig. 5 gezeigten ähnlich. Die Verfahren zur Herstellung von Raffinose-stabilisierten menschlichem CO-HemoSafe I(T)-Inulinkonjugat sind ähnlich den in Beispiel 3 beschriebenen hinsichtlich Pasteurisierung, Lyophilisierung und Photokonversion zu menschlichem Oxy-HemoSafe I(T)-Inulinkonjugat
Das so erhaltene Endprodukt hat eine unveränderte gelpermeationschromatographische Zusammensetzung und physikalisch-chemische Eigenschaften. Das Produkt hat eine P&sub5;&sub0; von 27 mmHg bei 37ºC in einem PBS-Puffer (pH 7,2), einen Hill-Koeffizienten von ca. 1,2 und eine Halbwertzeit von 7-8 Stunden, gemessen an der Ratte mit einem 30%-igen hypervolemischen Austausch.

Beispiel 13

HERSTELLUNG VON O-RAFFINOSE-KONFORMATIONSSTABILISIERTEM MENSCHLICHEN MET-HEMOSAFE I(T) und (R)

Nach der Photokonversion des CO-HemoSafe I(T) und (R) zu ihren entsprechenden Oxy-HemoSafes wie oben beschrieben (Beispiel 3), wurden die Oxy-HemoSafes bei 37ºC in ihre met-HemoSafes umgewandelt. Die Umwandlung kann als abgeschlossen betrachtet werden, wenn der met-Hämoglobinspiegel, der mit Hilfe der optischen Absorptionsspektroskopie charakterisiert wurde, > 90% ist, als gestrichelte Linie in Fig. 3 dargestellt. Seine Effektivität als CN-Abfänger läßt sich über seine Fähigkeit zur Aufnahme eines korrespondierenden Cyanomet-Hämoglobin-optischen Absorptionsspektrums ermitteln, als strichpunktierte Linie in Fig. 3 dargestellt.

Beispiel 14

HERSTELLUNG VON O-RAFFINOSE-KONFORMATIONSSTABILISIERTEM UND POLYMERISIERTEM MENSCHLICHEN MET-HEMOSAFE II(T) UND (R)

Konformationsstabilisierte o-Raffinose und polymerisiertes Human-HemoSafe II(T) und (R) wurden entsprechend dem Beispiel 8 hergestellt. Diese wurden zu ihren jeweiligen met-HemoSafes wie in Beispiel 13 beschrieben umgewandelt.

Beispiel 15

HERSTELLUNG VON O-RAFFINOSE-KONFORMATIONSSTABILISIERTEM MENSCHLICHEM MET-HEMOSAFE I(T)-INULINKONJUGAT

O-Raffinose-konformationsstabilisiertes menschliches HemoSafe I(T)-Inulinkonjugat wurde entsprechend dem Beispiel 12 dargestellt und zu met-HemoSafe wie im Beispiel 13 beschrieben umgewandelt.

Beispiel 16

VIRUSINAKTIVIERUNG VON RAFFINOSE-KONFORMATIONSSTABILISIERTEM UND POLYMERISIERTEM HEMOSAFE II

Menschliches HemoSafe II wurde entsprechend dem Beispiel 8 hergestellt. Es wurden Proben hergestellt, die aus HemoSafe II, HemoSafe II mit 10&sup4; HIV-Einheiten geimpft, und nur 10&sup4;-HIV-Einheiten bestanden. In Kontrollexperimenten konnte gezeigt werden, daß die Anwesenheit von HemoSafe II in Lösung nicht die Infektiosität von HIV-I beeinflußt. Die Proben wurden einer feuchten Hitze von 56ºC für eine Woche ausgesetzt. Am Ende der Behandlung wurden die Proben auf HIV-Infektiosität durch Anwendung eines Antigen-Assays geprüft. In keiner der Proben konnte eine HIV-Infektiosität aufgezeigt werden.

Claims

1. Konformationsmäßig stabilisiertes Hämoglobinerzeugnis, im wesentlichen bestehend aus tetrameren Hämoglobineinheiten, die sowohl gegen Dissoziation zu dimeren Häinoglobineinheiten als auch konformationsmäßig gegen einen konformationellen Wechsel zwischen der T-Konformation und der R-Konformation bei der Bildung wäßriger Zubereitungen derselben stabilisiert sind, wobei die tetrameren Einheiten kovalente chemische sekundäre Aminobindungen zwischen Globinketten der Untereinheiten zur Bewirkung der Stabilisierung aufweisen, und wobei die Bindungen durch Umsetzung des Hämoglobins mit einem Polyaldehyd unter Bildung von SchiffbasenVerknüpfungen, gefolgt von einer Reduktion zu sekundären Aminoverknüpfungen, gebildet wurden.

2. Stabilisiertes Hämoglobinerzeugnis nach Anspruch 1, das konformationsmäßig in der T-Konformation stabilisiert ist.

3. Stabilisiertes Hämoglobinerzeugnis nach Anspruch 2, gebildet durch Umsetzung des Hämoglobins mit einem Polyaldehyd, der durch oxidative Ringöffnung eines Oligosaccharids mit mindestens zwei Zuckerresten gebildet wurde.

4. Stabilisiertes Hämoglobinerzeugnis nach Anspruch 3, bei dem das Oligosaccharid bis zu sieben Zuckerreste pro Molekül aufweist.

5. Stabilisiertes Hämoglobinerzeugnis nach Anspruch 4, bei dem das Oligosaccharid Raffinose ist.

6. Stabilisiertes Hämoglobinerzeugnis gemäß einem jeden der Ansprüche 1 bis 5, bei dem das Hämoglobin menschlichen Ursprungs ist.

7. Stabilisiertes Hämoglobinerzeugnis gemäß einem jeden der Ansprüche 1 bis 5, bei dem das Hämoglobin tierischen Ursprungs ist.

8. Stabilisiertes Hämoglobinerzeugnis, enthaltend eine Vielzahl von stabilisierten tetrameren Hämoglobineinheiten gemäß Anspruch 1, untereinander kovalent verbunden unter Ausbildung eines polymeren Hämoglobinerzeugnisses, in dem jede Hämoglobineinheit konformationelle Stabilität und dissoziative Stabilität aufweist.

9. Stabilisiertes polymeres Hämoglobinerzeugnis gemäß Anspruch 8, bei dem jede Hämoglobinuntereinheit desselben in der T-Konformation stabilisiert ist.

10. Stabilisiertes polymeres Hämoglobinerzeugnis gemäß Anspruch 9 mit einer Zusammensetzung, derzufolge 20 bis 25 % der Bestandteile tetramere Hämoglobineinheiten, 50 bis 60 % der Bestandteile Hämoglobinoligomere mit 2 bis 5 tetrameren Hämoglobinuntereinheiten, 20 bis 25 % der Bestandteile einzelne Hämoglobintetramere und 1 bis 2 % Dimere von Hämoglobinuntereinheiten sind.

11. Verfahren zur Herstellung einer wäßrigen Lösung eines tetrameren, konformationsmäßig stabilisierten Hämoglobins, mit den Schritten der Umsetzung von Hämoglobin in wäßriger Lösung mit einem Polyaldehyd-Vernetzungsreagens unter Ausbildung von kovalenten Schiffbasen-Bindungen zwischen Ketten der gleichen tetrameren Hämoglobineinheiten, gefolgt von einer Reduktion der genannten Bindungen zu sekundären Aminobindungen, und des Erhalts einer wäßrigen Lösung von Hämoglobin aus dem Reaktionsgemisch, in dem mindestens 95 % des Hämoglobins in der konformationsmäßig stabilisierten, tetrameren Form vorliegt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem das Polyaldehyd-Vernetzungsmittel mindestens vier Aldehydgruppen pro Molekül aufweist.

13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem die Vernetzungsreaktion bei einem molaren Verhältnis von Aldehydgruppen auf dem Vernetzungsreagens zu Hämoglobin von mindestens 12:1 und bei einer Temperatur im ungefähren Bereich von 4 bis 37ºC erfolgt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem die Vernetzungsreaktion weiterhin bei einer Hämoglobinkonzentration in wäßriger Lösung von etwa 1 bis 20 g/dl und bei einem pH von 6,7 bis 9,5 stattfindet.

15. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem der Polyaldehyd das Produkt einer ringöffnenden Oxidation eines Oligosaccharids ist.

16. Verfahren nach Anspruch 15, bei dem das Oligosaccharid bis zu 36 Zuckerreste aufweist.

17. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem das Oligosaccharid aus der von Maltose, Maltotriose, Maltotetrose, Maltopentose, Maltohexose, Maltoheptose und Raffinose gebildeten Gruppe ausgewählt ist.

18. Stabilisiertes Hämoglobinerzeugnis gemäß Anspruch 1, komplexiert mit Kohlenmonoxid, wobei der Komplex in wäßriger Lösung Temperaturen von bis zu 60ºC für zehn Stunden ohne wesentliche Denaturierung oder Zersetzung widerstehen kann.

19. Stabilisierter CO-Hämoglobinkomplex gemäß Anspruch 18, bei dem die Hämoglobineinheiten in der T-Konformation stabilisiert sind.

20. Stabilisierter CO-Hämoglobinkomplex nach Anspruch 19 in lyophilisierter Form.

21. Stabilisierter CO-Hämoglobinkomplex gemäß Anspruch 19, bei dem das molare Verhältnis CO/Hämoglobinkomplex etwa 4:1 beträgt.

22. Verfahren zur Herstellung eines Hämoglobinprodukts, das geeignet zum Einsatz als Blutsubstitut und frei von übertragbaren viralen Infektionen ist, mit den Schritten des Pasteurisierens des Kohlenmonoxid-stabilisierten Hämoglobinkomplexes nach Anspruch 19 durch Erwärmung einer Lösung desselben auf geeignete Pasteurisierungstemperaturen für eine Zeit, die ausreicht, um eine wirksame Deaktivierung jeglicher viraler Verunreinigungen des genannten Komplexes zu bewirken, gefolgt von einer anschließenden Umsetzung des Komplexes mit Sauerstoff zur Überführung desselben in einen Oxy- oder Deoxyhämoglobinkomplex oder eine Mischung derselben.

23. Pasteurisierter, viral inaktivierter Blutersatzstoff, enthaltend konformationsmäßig und dissoziationsmäßig stabilisiertes Oxy- oder Deoxyhämoglobin oder eine Mischung derselben, hergestellt durch ein Verfahren gemäß Anspruch 22.

24. Verfahren zur Herstellung eines met-Hämoglobinkomplexes, der als Blutersatzstoff für das Abfangen von Cyanid verwendbar ist, umfassend den Schritt der Oxidation des pasteurisierten Oxyhämoglobins nach Anspruch 23 unter geeigneten Bedingungen.