JP2002507185A

JP2002507185A - 改良された人工血液

Info

Publication number: JP2002507185A
Application number: JP50524592A
Authority: JP
Inventors: フェオラ，マリノ; シモニ，ジャン・エス
Original assignee: テキサス・テック・ユニバーシティー・ヘルス・サイエンシズ・センター
Priority date: 1991-02-12
Filing date: 1991-12-13
Publication date: 2002-03-05
Anticipated expiration: 2018-08-18
Also published as: NO308934B1; FI933550A; AU1270492A; CA2103680A1; AU656763B2; NO932857L; EP0586381B1; JP3437572B2; NO932857D0; KR100227453B1; EP0586381A4; ATE173273T1; CA2103680C; DE69130483D1; FI106362B; EP0586381A1; FI933550A0; WO1992013875A1; DE69130483T2

Abstract

(57)【要約】過ヨウ素酸酸化ＡＴＰ（o-ＡＴＰ）によって分子内架橋し、過ヨウ素酸酸化アデノシン（o-アデノシン）によって分子間架橋し、かつ、還元グルタチオン（ＧＳＨ）と結合させ、所望によりマンニトール、非電解質及び／又は電解質を富化した精製ヘモグロビン（好ましくはウシヘモグロビン）からなる、改良された人工血液。この人工血液は長い血管内寿命を有し、血漿量を維持することができ、低い酸素親和性を有し、生理学的酸素運搬体として働くことができ、血管拡張活性を有し、出血後の血管収縮を弛緩させることができる。急性失血及び／又は鎌状赤血球化による鎌状赤血球貧血の発症を伴うヒトを処置する方法は、有効量の人工血液をヒトに静脈内投与することよりなる。

Description

【発明の詳細な説明】改良された人工血液発明の分野本発明は人工血液及びその調製方法に関する。さらに詳しくは、本発明は様々な種の動物の（ヒトを含む）重度の出血後に生命を維持する上で有効であり、かつ毒性及び血液伝染性疾病のない新規なヘモグロビン組成物に関する。背景の説明血液は多くの機能を有しており、これらはすべて生命に欠くべからざるものである。しかし重度の出血又は失血は次の２つの主な理由で生命を危機にさらす：１）循環血液容量の低下は組織の潅流を減少させ、虚血を生じる；２）酸素運搬量の減少によって組織で酸素が欠乏し、低酸素症を生じる。循環系はこれらの変化に反応して血管収縮し、虚血と低酸素症をいっそう悪化させる。最終的には細胞代謝が変化し、機能が低下して、ショックと死に至る。本発明の状況においては、「人工血液」はすべての機能において血液と置き換えられるような製剤ではなく、下記の機能を行うことのできる緊急蘇生用液体である。血液量の回復、酸素運搬、血管収縮の減少。ただし、この液体は毒性のある副作用があってはならず、また細菌やウィルス等の病原体を有していてはならない。 50年以上の間、人工血液の開発はヘモグロビン（Hb）を中心に行われてきた。これは、ヘモグロビンが大気中から十分な酸素を取り込み、生理学的酸素運搬体として働くことのできる唯一の物質であるためである。さらにヘモグロビンは血清アルブミンと同じコロイド浸透圧を有し、したがって血漿増量剤として役に立つことができる。しかし現在まで、これらの開発の努力は、下記に概説するようになかなか認識されずしかも解決の難しい多くの問題のために成功しなかった。（１）環境の細菌性内毒素、ストローマ性リン脂質、ならびに非ヘム蛋白質及びペプチドでヘモグロビンが汚染されることによる毒性。（２）溶液中のヘモグロビンの酸素親和性が高いために、組織への酸素放出が妨げられること。（３）ヘモグロビン分子が不安定であり、溢出し、急速に腎臓から***される傾向にあること。（４）ヘモグロビンの自動酸化が起こり、機能を持たないメトヘモグロビン（ Het−Hb）及び毒性のある酸素フリーラジカルを生成する傾向にあること。（５）天然ヘモグロビンが、肝炎、エイズ等の、血液に関連した疾病を伝染させること。認識されるべき第１の問題は毒性であった。すなわち、ヘモグロビン溶液が血管内での血液凝固を促進し、腎臓に障害を与える可能性があった。ラビナー（Ra biner）は、1960年代に、これらの毒性はヘモグロビンではなく、赤血球のストローマ（赤血球膜の断片）によるものであるという考えを発表した。彼は、無ストローマ・ヘモグロビンの必要性を強調した。しかし、実際にはこの言葉に反して、ストローマ性要素を全く含まないヘモグロビンは何年もの間製造されなかった。赤血球膜の毒性因子は、フォスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）及びフォスファチジルセリン（ＰＳ）という、通常は細胞質側に存在するアミノリン脂質であることが、本発明者らにより同定された。これらの化合物はヘモグロビンに対して特別の親和性を有しており、これらはその他のストローマ性成分と比べて、ヘモグロビン溶液から除去するのが困難である。ＰＥ及びＰＳで汚染されたヘモグロビンを実験動物（ラビット及びサル）に有意量（たとえば、少なくとも動物の計算上の血液量の1/3量）投与すると、血管内血液凝固及び捕体が活性化され、白血球及び血小板が活性化され、生体器官に虚血性炎症障害が発生することを特色とする、全身性炎症反応が引き起こされる。最近になって初めて認識されるようになった問題は、環境の細菌性内毒素によってヘモグロビン溶液が容易に汚染されることである。リムルスのアメーバ血球ライゼート試験法が開発されるまでは、米国薬局方は内毒素の検出法としては、ラビットによる発熱性物質試験法に頼っていた。しかし、発熱性を生じるレベルよりはるかに低い濃度の内毒素で汚染されたヘモグロビンが、アミノリン脂質で汚染されたヘモグロビンと同様の毒性を引き起こすことが報告されている。内毒素の毒性物質は、実際には脂質（リピッドＡ）だからである。細菌性内毒素は、デトキシゲル（Detoxi-Gel）カラム（Pierce Chemical Co.）等のアフィニティー・クロマトグラフィーカラムを用いて生物性の溶液から除去することができる。しかし、出発材料が２内毒素ユニット/ml（「定量的色原体リムルス試験（QCL-1 00O，Whittaker M.D．Bioproducts）」によって測定、ＩＥＵは0.1ngの細菌性リポ多糖類に相当）以上の内毒素を含む場合には、これらのカラムでは内毒素をすべて除去することはできない。非ヘム蛋白質及びペプチドからヘモグロビンを精製しなくてはならない。毒性はどの特定の蛋白質の存在とも無関係であるが、天然ヘモグロビン溶液の免疫原性を低下させる必要があるため、精製を行わなくてはならない。また、ペプチドは単離された臓器（心臓及び腎臓）及び動脈において見られる、ヘモグロビン溶液の血管収縮効果の原因となるという仮説もある。この精製については、下記を含めて従来から様々な方法が当技術分野において知られている。（１）遠心分離及び濾過、コクジ（Coczi）、米国特許第3,991,181号（２）トルエン抽出、ボンセン（Bonsen）、米国特許第4,001,200号及び第4,0 01,401号）（３）限外濾過、コザ(Kothe)ら、米国特許第4,526,715号（４）限外濾過及び酸沈殿、ボナード(Bonhard)ら、米国特許第4,136,093号及び第4,336,248号（５）イオン交換クロマトグラフィー、メイラー（Meiller）、米国特許第4,1 00,149号（６）亜鉛沈殿、タイ（Tye）、米国特許第4,473,494号及び第4,529,719号（７）結晶化、デヴェヌート（DeVenuto）ら、Journal of Laboratory and Cl inical Nedicine，89：pp．509-514，1977）これらの方法はいずれも満足すべきものではない。方法（１）〜（４）はヘモグロビンを他の蛋白質から完全に分離する能力において本質的に限界があり、方法（５）〜（７）は大量精製には適していない。 1970年代に認識された問題は、溶液中のヘモグロビンが酸素に対して高い親和性を有することである。酸素親和性とは、肺で空気から酸素を取り込み、組織でこれを放出するというヘモグロビンの能力を制御している特性である。この性質はＰ₅₀値、すなわちHbの酸素飽和度が50％となるときの酸素分圧で表わされる。Ｐ₅₀が低くなればなるほどヘモグロビンの酸素結合能力は大きくなり、組織中へ酸素を放出する能力は低下する。ヒトの血液のＰ₅₀は約28mmHgであるが、ヒトヘモグロビンの溶液におけるＰ₅₀は約13mmHgである。この差は、赤血球中においてはヘモグロビンは2,3-ジフォスフォグリセリン酸（2,3-ＤＰＧ）と反応し、酸素に対する親和性が低下しているためである。赤血球の外では、この相互作用は失われる。その結果、ヘモグロビンはＯ₂と非常に強く結合し、Ｏ₂運搬体としての機能がなくなる。この問題を解決するために、ベネシュ（Benesch）らは、ヘモグロビンとピリドキサール-5'-リン酸（2,3-ＤＰＧのアナログ）との共有結合反応法を開発した。最初はこのような反応によって酸素親和性が低下し、かつヘモグロビンの分子が４量体型で安定化されることが期待された。しかし、これは実現しなかった。本発明者らは、ウシヘモグロビン溶液は、ヒト血液と同じＰ₅₀値を有し、その酸素親和性は2,3-ＤＰＧではなく塩化物によって制御されることを示した。この好ましい性質に加えて、さらにウシ赤血球が大量に入手可能であると、及び純粋なヘモグロビンは哺乳類の中では免疫原性が低いことからみて、人工血液の基礎としてウシヘモグロビンを用いることは有益である。 1970年代に認識されたもうひとつの問題点は、ヘモグロビンの血管内寿命が短く、急速に溢出することである。これは一般的には、ヘモグロビン４量体（α₂ β₂）が、毛細血管を通過することのより容易な２量体（２αβ）に解離する傾向があるためである。現在では、蛋白質の表面電荷もまた重要な役割を果たしていること、すなわち、長い血管内寿命のためには、負の電荷と低い等電点が好ましいことが明らかになっている。ヘモグロビンの溢出は下記のようにいくつかの望ましくない効果を有する。（１）血漿増量効果の持続時間が短い。（２）ヘモグロビンが腎臓の腎糸球体を通過すると、浸透圧利尿効果が生じ、血漿量は維持されるよりむしろ減少する。（３）ヘモグロビンが尿細管で再吸収されることによって、細管細胞に障害をもたらす。（４）ヘモグロビンが組織間液中に移動するため、浮腫と細胞障害をもたらす。従来の技術は、ヘモグロビンの２量化を防ぐことにのみ焦点をあてていた。この目的のために、これまでに３種のヘモグロビン修飾法が開発されてきた。（ａ）分子間架橋又は重合、（ｂ）ヘモグロビンと他の分子との結合、（ｃ）α鎖又はβ鎖の分子内架橋。上記方法のうち最も広く用いられているものは、グルタルアルデヒドを用いたヘモグロビンの分子間架橋である：ボンセン（Bonsen）ら、米国特許第4,001,20 0号、第4,001,401号および第4,053,590号；モリス（Morris）ら、米国特許第4,0 61,736号；ボナード（Bonhard）ら、米国特許第4,136,093号；これらの内容全体をここに参考として引用する。分子間架橋法自体にも下記に挙げる種々の欠点がある。（１）グルタルアルデヒドは本来毒性があり、グルタルアルデヒドの代謝による副生物の潜在毒性については知られていない。（２）グルタルアルデヒドは非常に反応性が高く、ヘモグロビン分子の様々な部位、たとえばα−及びε−アミノ基及びスルフヒドリル基と、複数の架橋を形成する傾向にある。このため予想できない数の分子種を形成する。（３）重合反応は制御が困難であり、４℃において保存している間にも反応が続行しているように見え、このため高分子の分子量は増加しつづけ、粘度と酸素親和性も増加する。（４）架橋に特異性がないという性質のため、溶液中には依然としてヘモグロビンの２量体が残りうる。他の方法として、デキストラン及びヒドロキシエチル・スターチ（米国特許第 4,064,118号）、ポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコール（米国特許第4,412,986号）、イヌリン（米国特許第4,377,512号）、ポリアルキレンオキサイド（米国特許第4,670,417号）等の、大きな分子にヘモグロビンを結合させた。しかし、これらの結合したヘモグロビンは酸素親和性が増加しており、結合に用いられた物質に特有の望ましくない性質を得る傾向にある。分子内架橋は、「ジアスピリン」エステル（タイ（Tye）、米国特許第4,529,719号；ウォルダー（Walder）、米国特許第4,598,004号）；及び「過ヨウ素酸酸化アデノシン三リン酸」（o-ＡＴＰ）（スキャノン（F.J.Scannon）、「ヘモグロビンの分子修飾"Molecular modification of hemoglobin"，Critical Care Hedicine 10:261- 265(1982)」；グリーンバーグ（A.G.Greenburg）及びマフイド（P.W.Naffuid）、「ヘモグロビンの修飾−開環ジオール("Modification of hemoglobin-Ring op ened diols")，Advances in Blood Substitute Research，Alan R.Liss，New Yo rk，pp．9-17(1983)」）の使用により達成された。しかし、ジアスピリン・ヘモグロビンは依然として血管内滞留時間が短く（半減期３〜４時間）、またＡＴＰヘモグロビンはメトヘモグロビンが多く、かつ、酸素親和性が高く半減期が短いために、満足できないことが見出された。ヒトヘモグロビンをピリドキサール-5'-リン酸及びグルタルアルデヒドと反応させて、重合したピリドキサール化ヘモグロビン（ポリ−ＰＬＰ−ヘモグロビン）を得ることによる著しい進歩が報告されている、すなわち、このヘモグロビンが低い酸素親和性とより長い血管内滞留時間とを合わせ持つと主張されている（モス（G.S.Noss）ら、「ヘモグロビン溶液−４量体から高分子へ（"Hemoglobin solution-From tetramer to polymer"，Biomaterials，Artificial Cells and A rtificial Organs 16(1-3):57-69(1988)）」；デヴェヌート（F.DeVenuto）とゼグナ（A.Zegna）、「ピリドキサール化、重合ヒトヘモグロビンの調製及び評価（"Preparation and evaluation of pyridoxalated-polymerized human hemoglo bin"，Journal of Surgical Research 34:205-212(1983)）」）。しかし、ピリドキサール化は重合を阻害し、このためピリドキサール化ヘモグロビンの多くは依然として重合されておらず、これに対し重合したヘモグロビンがピリドキサール化されていないことが見出された。その結果、溶液を注入したのち、良好な酸素運搬機能を有するヘモグロビンは腎臓から急速に排出され、これに対し循環系に残存するヘモグロビンは高い酸素親和性を有している。ここ数年の間、ヘモグロビンの本質的な毒性に関する疑問が提示されてきた。一方では血管収縮効果を観察した実験結果が報告されている。他方ではヘモグロビンが自動酸化によりメトヘモグロビンになる傾向があり、すなわち、ヘム鉄が＋２価の鉄から＋３価の鉄に酸化され、この反応から毒性のある酸素フリーラジカルが生じる。このことから見て、循環系に注入された場合にヘモグロビンがプロオキシダントとして作用すると推測されている。この結果、細胞膜の脂質過酸化反応が生じ、細胞構造に障害がもたらされる。血管収縮と酸素フリーラジカルの生成という両方の効果によって、出血によって生じる虚血性・低酸素性障害は緩和されるよりむしろ悪化する。本発明者らによる先の実験は、血管収縮とラシカルの生成は両方とも次の３段階の実施により制御しうることを示している。（１）ヘモグロビンの完全な精製（２）メトヘモグロビンの形成の少ないヘモグロビン分子の調製と安定化（３）酸素ラジカル捕捉剤の添加最後に、天然ヘモグロビン溶液の投与は血液製剤伝染性疾病の危険を伴う。細菌及び寄生虫は濾過や限外濾過によって容易に除去できるが、ウィルスはより深刻な問題を提起する。従来、ウィルスの不活性化の方法としては、２つの方法が知られている。ひとつは物理的方法であって、デオキシ型のヘモグロビンを60℃ 、pH7.5で10時間低温殺菌することよりなる。この方法は、モデルウィルス（シンドビス、ポリオ、シュードレビー）及びヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）を不活性化させることがわかっている。もうひとつの方法は化学的方法であり、クロロホルムで処理するというものである。しかし、どちらの方法も、特殊な方法を用いない限り、ヘモグロビンを著しく変性させる。したがって、安定であり、酸素親和性が低く、毒性がなく、かつ血液伝染性病原性粒子を含まない改良された人工血液が依然として求められている。本発明の概要本発明は、精製した哺乳類ヘモグロビン（Hb）（好ましくはウシHb）からなり、ＡＴＰ（o-ＡＴＰ）（たとえは過ヨウ素酸酸化ＡＴＰ）と分子内架橋し、かつアデノシン（o-アデノシン）（たとえば過ヨウ素酸酸化アデノシン）と分子間架橋し、還元グルタチオン（ＧＳＨ）と反応し、所望により非電解質水溶液に溶解し、使用直前にたとえばマンニトール、電解質及び所望により他の薬剤学的に受容しうる添加物を富化した人工血液に関する。また本発明は人工血液として適した組成物を調製するための下記よりなる方法に関する：ヘモグロビンを細菌性内毒素、ストローマ・リン脂質及び／又は非ヘム蛋白質ならびにペプチドから分離し；ヘモグロビンを溶液中においてカルボキシヘモグロビンに変換し；カルボキシヘモグロビンをo-ＡＴＰと反応させて、主としてヘモグロビンを分子内架橋し；カルボキシヘモグロビンをo-アデノシンと反応させて、主としてヘモグロビンを分子間架橋し；溶液にグルタチオン、たとえば還元グルタチオンを添加して、o-アデノシン架橋反応を停止し、かつヘモグロビンの等電点を低下させ；架橋したカルボキシヘモグロビンを架橋したオキシヘモグロビンに変換し；そして所望により薬剤学的に受容しうる架橋ヘモグロビン溶液を調製する。得られる生成物は安定であり、約２４時間の循環系内半減期を有し、低い酸素親和性及び血液のものに類似するＰ₅₀値を有し、かつ毒性及び血液伝染性疾病を伴わない。また本発明は、赤血球鎌状化の発症による鎌状赤血球貧血を伴うヒトを処置する方法であって、ヒトに赤血球鎌状化症状を改善するために有効な容量の本発明の人工血液を静脈内投与することよりなる方法に関する。また本発明は、血液置換を必要とするヒトを処置する方法であって、ヒトに血液の容量及び／又は機能を補足するために有効な容量の本発明の人工血液を静脈内投与することよりなる方法に関する。本発明のより完全な認識及びそれに付随する多くの利点は、下記の図面と関連づけて考慮する場合に以下の詳細な記述を参照することによって本発明がより良く理解されるのに伴って認められるであろう。図面の簡単な説明図１は、サイズ除去カラムを装着したＨＰＬＣによって得られた純粋ウシヘモグロビンのスペクトル分析を示す。クロマトグラムは、9.4分のところに単一ピークを示し、これは４量体ヘモグロビン（64,000ダルトン）と同定された。図２は、ＤＥＡＥカラムを装着したＨＰＬＣによって得られた純粋ウシヘモグロビンのスペクトル分析を示す。クロマトグラムは、20から36分の間に複数のピークを示し、これは等電点の異なる様々なヘモグロビン成分に対応する。図３Ａ及び３Ｂは、低温殺菌による精製の前（３Ａ）及び後（３Ｂ）のウシヘモグロビンのスペクトルインデックスを示す（ＤＥＡＥカラム付きＨＰＬＣ、スペクトル波長230〜599nm）。図３Ａにおいては、保持時間17分と51分に、非ヘム蛋白質が見られる。図３Ｂにおいては、非ヘム蛋白質はもはや見られない。図４は、o-ＡＴＰで分子内架橋し、o-アデノシンで分子間架橋し、還元グルタチオンと結合させたウシヘモグロビンの、ＨＰＬＣサイズ除去カラムによるスペクトル分析を示す。クロマトグラムは、凝集ヘモグロビンの６つのピークを示す。図５は、図４と同様に修飾したウシヘモグロビンの、ＨＰＬＣ−ＤＥＡＥカラムによるスペクトル分析を示す。クロマトグラムは、保持時間51分のところに単一ピークを示す。ヘモグロビンの等電点は、表面の負電荷の増加によってシフト（修飾していないヘモグロビンと比べて）している。図６は、等電点電気泳動（IEF-Pharmacia）による実験を示す。図７は、セファデックス(Sephadex)カラムから水で溶出された、o-ＡＴＰ及び過ヨウ素酸ナトリウムの反応混合物の連続分画の、258nmにおける吸光度を示す。図８は、陰イオン交換カラムから溶出剤Ａで溶出された、o-アデノシン及び過ヨウ素酸ナトリウムの反応混合物の連続分画の、258nm及び232nmにおける吸光度を示す。本発明の他の目的、利点及び特色は以下の考察から当業者に明らかになるであろう。好ましい具体例の説明本発明は人工血液の置換を伴う先行技術の処置を改善するという本発明者らの願望に由来する。本発明の技術により、急激な血液損失に際して、及び症状の発症を阻止及び／又は軽減するためにそれらの血液容量の少なくとも一部を迅速かつ効果的に置換することが要求される血液疾患を伴う患者を処置するために、安全かつ効果的な血液置換法を提供する。このような状況の一例は、鎌状赤血球貧血を伴う患者の場合である。これらの患者が赤血球鎌状化を発症した場合、患者に本発明の人工血液を静脈内投与することができ、これにより発症によって生じた症状が予想外に著しく軽減される。本発明は、実質的に発熱性物質を含ます、微生物を含まない、o-ＡＴＰ及びo- アデノシンと反応した活性ヘモグロビンを含む組成物を提供する。本発明の特に好ましい１形態においては、本発明はウシヘモグロビンを用いる。しかし他のヘモグロビン源も本発明に利用しうる。他の好ましい形態においては、o-アデノシンとの架橋を停止するために、本発明の架橋ヘモグロビンをさらに還元グルタチオンと反応させる。これはヘモグロビンの等電点を低下させる効果をも有する。さらに他の好ましい形態においては、o-ＡＴＰは過ヨウ素酸酸化ＡＴＰからなり、o-アデノシンは過ヨウ素酸酸化アデノシンからなり、ヘモグロビンは過ヨウ素酸酸化ＡＴＰと分子内架橋し、過ヨウ素酸酸化アデノシンと分子間架橋して、ポリヘモグロビンを形成する。 o-ATP及びo-アデノシンは２つのプリン（Ｐ）を有する誘導体であるため、生成物はここではHb−ＰＰ−ＧＳＨと表示する。本発明の他の好ましい形態においては、組成物はヘモグロビン、o-ＡＴＰ、 o-アデノシン及びグルタチオンを約１:３:10:20のモル比で含む。本発明の架橋ヘモグロビンは、好ましくは約130〜390キロダルトンの分子量、より好ましくは約190〜260キロダルトンの分子量を有する。組成物のさらに好ましい形態は、ヘモグロビンが約５％未満のメトヘモグロビンを含む。極めて好ましい形態においては、本発明のヘモグロビンはウシヘモグロビンからなる。本発明のヘモグロビン(Hb)製剤は、その成分の好ましい性質を合わせ持つ。（１）効果的な酸素運搬体。ウシヘモグロビンは特に本来酸素結合性が低く（Ｐ₅₀値は28mmHgである）、この値は様々な化学反応によっては影響されない。（２）有効な血漿増量剤。ヘモグロビンは分子内及び分子間の両方で架橋しており、したがって長い血管内寿命（半減期24時間）を有している。（３）血管拡張性。ヘモグロビンと結合した両方のプリン誘導体が、ノルエピネフリン誘導血管収縮を弛緩させる。（４）還元グルタチオンとマンニトールが存在するため、プロオキシダント効果を示さない。ウシヘモグロビンの好ましい性質については、フェオラ（M.Feola）らの、「人工血液としてのウシ無ストローマ・ヘモグロビン溶液の開発（"Development o f a bovine stroma-free hemoglobin solution as a blood substitute"，Surge ry，Gynecology and Obstetrics 157:399-408(1983)）」に述べられている。大量に入手できること、及びヒト血液特有の伝染性疾病、特にエイズを回避できることに加え、生理食塩水に溶解したウシヘモグロビンはヒトヘモグロビンの２倍以上のＰ₅₀値を有しており（13mmHgに対して28mmHg）、2,3-ＤＰＧによる調節を必要としない。また本発明は、実質的に発熱性物質を含まず、微生物を含まない、o-ＡＴＰ及びo-アデノシンにより架橋した本発明の活性ヘモグロビン（Hb）、ならびに薬剤学的に受容しうる液体キャリヤーを含む人工血液を提供する。極めて好ましい形態においては、キャリヤーは薬剤学的に受容しうる溶液、より好ましくは水溶液である。ヘモグロビンの機能特性を妨害しないこのような溶液はいずれも本発明において用いるのに適している。水溶液はさらに非電解質及び／又は電解質を含みうる。本発明の１形態によれば、非電解質水溶液である溶液が提供される。この形態は例１に示される。本発明の架橋ヘモグロビンの水溶液に添加しうる非電解質の例は、ヒトアルブミン、種々の血漿画分、及び血漿である。しかし、薬剤学的に受容でき、本発明の架橋ヘモグロビンの酸素運搬機能を妨害しない非電解質、たとえばデキストラン及びヒドキシエチル・スターチはいずれも使用しうる。他の形態においては、キャリヤーは電解質を含有する薬剤学的に受容しうる水溶液である。これは例２〜４に示される。一般に本発明の人工血液に使用しうる電解質の例は、ナトリウム、カリウム、カルシウム及びマグネシウムカチオン、ならびにクロリド、バイカーボネート、グルコネート及びスルフェートアニオンである。以下は一例にすぎず、他も用いられる。特に注射用（無菌無発熱性物質）水、pH約8.1〜8.2、無菌無発熱性物質の緩衝剤の添加により調整、サム（THAM ）溶液（トロメタミン（Tromethamine）注射用；Abbott Labaratories,North Ch icago,II）；注射用水−サム溶液プラス電解質添加、たとえば113meq/l塩化ナトリウム、27meq/l炭酸水素ナトリウム、４meq/l塩化カリウム、５meq/lグルコン酸カルシウム、3.5meq/l硫酸マグネシウム；電解質平衡食塩溶液(ノルモゾル（N ormosol）R、pH7.4、140meq/lナトリウム、５meq/lカリウム、３meq/lマグネシウム、98meq/l塩素、27meq/l酢酸、及び23meq/lグルコン酸を含む、；Abbott La baratories)；ならびに乳酸加リンゲル液、130meq/lナトリウム、４meq/lカリウム、３meq/lカルシウム、109meq/l塩素、及び28meq/l乳酸を含む(Abbott Labara tories)。本発明によれば、ウシヘモグロビンの酸素親和性は、人工血液中の塩素イオンの濃度を増加させることによってさらに低下させることができる。これは約10〜 25meq塩素/l人工血液、より好ましくは約15meq塩素/l人工血液の添加により達成される。潜在的な免疫学的問題に関しては、異なった種の哺乳類間における、ヘモグロビン輸血の実施可能性は当技術分野において十分に示されている。実際には、計算された血液量の1/3から1/2量の純粋ウシヘモグロビンを６回まで繰り返しラビットやサルに与えた場合、反応の臨床的形跡はなく、オクタロニーテストによって検出できる抗体の生成も認められなかった(フェオラ（M.Feola）ら、「ヘモグロビン溶液の免疫学的生体適合性（”Immunologic biocompatibillty of hemogl obin solutions"，Trasfusione del sangue(Italian)33:121-128(1988)）」)。細菌性内毒素のないヘモグロビン溶液を製造するために、本調製法において用いられる方法は、一般に汚染を中和するよりもむしろ防止するものである。内毒素のヘモグロビンに対する親和性のため、いったん著しい汚染が生じると、精製は不可能ではないが非常に困難になる。汚染の実質的防止には次のことが必要である。（１）出発物質の汚染が最低限であること。（２）調製工程が閉鎖系で行われること。（３）ヘモグロビンと接触するすべての表面が滅菌されており、発熱性物質がないこと。（４）すべての試薬が精製されていること。（５）すべての溶液が滅菌されており、発熱性物質がないこと。（６）すべての工程において、品質管理が行われること。内毒素の最も高感度な検出方法は、「定量的色原体リムルステスト（QCL-1000 、Whittaker Bioproducts）」である。出発材料あるいはいずれかの調製段階のヘモグロビンが、2EU/ml以上の内毒素を含むことを発見した場合には、これを廃棄する。すべての工程において、汚染レベルを低く保ち、最後に溶液をデトキシゲル（Detoxi-Gel，Pierce Chemical Company）等のアフィニティー・クロマトグラフィーカラムに通すことによって、完全な精製が達成される。最終精製における全体の汚染の回避と同じ原理を、ストローマ性リン脂質、特にアミノリン脂質の除去にも適用する。ストローマ性の汚染を避けるために本発明方法は、赤血球（ＲＢＣ）の透析と限外濾過のための既知の技術を採用する（デローチ（J.R.DeLoach）ら，Analytical Biochemistry 157:191-198(1986)）。デローチ法によれば、まずトラベノール（Travenol）人工腎臓を用いて、赤血球をリン酸低張液に対して、懸濁液が約150〜200mOsm/l、より好ましくは約160mOsm/ lの浸透圧になるまで透析する。このとき、赤血球は球形を示し、細胞膜の孔は引き伸ばされる。次に細胞を孔径0.1μmのアミコン（Amicon）フィルターを用いて約5〜15psi（0.35〜1.05kg/cm²）、より好ましくは約10psi（0.70kg/cm²）のカラム圧で限外濾過する。したがって、ヘモグロビンは細胞膜を破壊することなく細胞から「絞り出される」。本発明によれば、ひとつの閉鎖系工程を用いて赤血球の透析と限外濾過の両方を行うことができる。この工程は無菌無発熱性物質の、使い捨ての工程である。さらに、透析液は、無菌無発熱性物質脱イオン水からなり、リン酸溶液ではなくヘモグロビンの酸化の少ないサム溶液によって約pH 8..0〜8.4、より好ましくは約pH8.2に調製される。ただし他の非電解質も使用できる。この工程の結果、ヘモグロビン溶液は「リン脂質テストセット（Boeringe r-Mannheim Diagnostics，Indianapolis，Indiana）」を用いて測定して約３〜５mg/dlのリン脂質と、薄層クロマトグラフィーによって測定して痕跡量のアミノリン脂質ＰＥ及びＰＳを含む。これらの残存リン脂質は、クロロホルム抽出によって除去できる。リン脂質存在量が少ないため、この工程は、低濃度クロロホルムを用い、短時間の遠心分離によって行うことができる。したがって、ヘモグロビンの変性を防ぐことができる。ただし、蛋白質の変性を避け、又は最小限に抑えるべく注意する限り、リン脂質の除去を他の手段で行うことができる。同じ原理を用いて、ヘモグロビンを、非ヘム蛋白質及びペプチドから精製することができる。この場合には、最初の工程は赤血球を「精製」することによってすべての血漿蛋白質を除去することよりなる。この場合、赤血球膜を大きく破壊することなく赤血球からヘモグロビンを抽出し、したがってストローマ性蛋白質による汚染を防止することができる。次いで、選択的熱沈殿（ベルター（P.A.Be lter）、クスラー（E.L.Cussler）、フー（W.S.Hu）編、「バイオ分離（"Biosep arations"」，John Wiley & Sons，New York,pp.227-229(1988)）を行う。この方法においては、蛋白質の変性及び沈殿は温度を約56〜72℃、より好ましくは約 56〜72℃に高めることにより達成される。この蛋白質の処理はアレニウスの温度依存性の１次化学反応速度式に従う。したがってここでＰは溶解蛋白質の濃度である。速度定数κは次の式で与えられる。式中、κ₀は特性定数であり、Ｅ／Ｔは変性の活性化エネルギーであり、Ｔは温度である。変性のエネルギーは、蛋白質の種類によって異なる。等式においてＥが指数として表わされているため、温度がわずかに変動するだけでも大きな影響を有する。このエネルギーはまた、pHの変化によっても影響される。我々はまた、一酸化炭素で飽和したヘモグロビン（HbCO）がpH7.6〜7.8において温度誘導性沈殿に耐性であることを見出した。我々は、HbCO溶液の低温殺菌を約56〜64℃、より好ましくは60℃の温度で９時間、続いて約68〜74℃、より好ましくは約70℃ で約0.45〜1.15時間、より好ましくは約１時間、約pH7.6〜7.8において、約８〜 12g/dl、より好ましくは約10g/dlの濃度で実施することができる。これらの条件は、ヘモグロビンをほとんど変性させずに、すべての非ヘム蛋白質を沈殿させる。この方法によって調製された溶液に非ヘム蛋白質が含まれていないことを、等電点電気泳動（ＩＥＦ）及びサイズ除去陰イオン交換高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて確認した。ＩＥＦの集束バンドの「にじみ」がないこと、及び酸素運搬機能が保存されていること（酸素解離曲線、Ｐ₅₀、ボーア効果）から、回収されたヘモグロビンが変性していないことが示される。ウィルスの不活性化も、この精製工程の副産物である。実際、クロロホルム抽出によって血漿及び血清中の多くの脂質外被ウィルス、例えばＢ型及び非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス、バクシニアウィルス、ポックスウィルスが不活性化していることが見出されている（フェインストン（S.M.Feinston）ら、「クロロホルムによるＢ型及び非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスの不活性化(”Inactivation of Hepatitis B virus,and non-A,non-B hepatitis by chloroform”,Infection and Immunity 41:816-821(1983))」）。脂質を持たないウィルス（レオウィルス）もまた、クロロホルムによって一部不活性化される。一方、約56〜64℃、より好ましくは約 60℃で、約９〜12時間、より好ましくは約10時間の低温殺菌によって、多くの非脂質外被ウィルス及びヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）が不活性化される（エステップ（T.N.Estep）ら、「熱によるヘモグロビン溶液中のウィルスの不活性化( "Virus Inactivation in Hemoglobin Solutions by Heat".Biomaterials.Artifi cial Cells,and Artificial Organs 16(1-3):129-1343(1988))」）。グルタルアルデヒドによる重合は望ましくない効果を有することが知られているため、本方法においてはアデノシン5'-三リン酸のジアルデヒド誘導体(o-ＡＴＰ)を用いて、ヘモグロビン分子を４量体の形で「安定化」させる。ＡＴＰ分子は、下記に示したものからわかるように、プリン塩基（アデニン）、糖（Ｄ-リボース）及び三リン酸鎖の３つの基本的な成分からなる。ＡＴＰを過ヨウ素酸ナトリウムで酸化すると、下記に示したようにリボース環が2',3'シス位で開環し、2',3'ジオールが対応するジアルデヒドに変換される（ロア（P.N.Lowe）ら、「過ヨウ素酸酸化アデノシン三リン酸及び関連化合物の調製とその化学的性質("Preparation and chemical properties of periodate-oxi dized adenosine triphosphate and some related compounds"，Biochem．Soc． Transact．7:1131-1133(1979))」）。 o-ＡＴＰのそれぞれのアルデヒド基はリジンのε-アミノ基と反応し、下記化学式のシッフ塩基付加化合物が生成する。 (Hb)−ＮＨ₂＋ＯＣＨ−ＡＴＰ→(Hb)−Ｎ＝ＣＨ−ＡＴＰヘモグロビンの2,3-ＤＰＧポケットは、ヘモグロビン分子の、2,3-ＤＰＧと結合する領域である。この領域が２つのリジンを含むため、o-ＡＴＰを用いてこれらの基を架橋させ、分子を４量体の形で安定化することができる。三リン酸鎖が存在するためこの反応の特異性が増加する。このような特性はピリドキサール− 5'−リン酸等の、他のポリリン酸についても見られる。他の化合物と比べてＡＴＰの利点はアデニン部分にある。インビボにおいて、ＡＴＰはＡＤＰ、ＡＭＰ、最終的にはアデノシンに加水分解される。この加水分解は、たとえば全身及び肺の両方の循環における血管拡張という有益な薬理学的効果を生じることが見出されている。さらに、ＡＴＰを塩化マグネシウム（MgCl₂）と組み合わせて投与すると、出血ショック状態においてさらに有益な効果が示される。これらの有益な効果としては、微小循環の改善、細胞膜機能の改善、及び細胞内アデニンヌクレオチドの回復における「プライミング」効果などがある（チャウドリー（I.H.Ch audry）、バウ（A.E.Baue）、「溶血ショックの概要("Overview of hemorrhagic shock"，Pathophysiology of Shock，Anoxia and Ischemia，R.A.Cowley and B .F.Trump，editors，Williams and Wilkins，Baltimore，Maryland,pp.203-219( 1982))」）。上述のように、ヘモグロビンとo-ＡＴＰとを架橋させるというこれまでの試みは、化学反応によって許容されないレベルのメトヘモグロビン（30％まで）が生じること、及びo-ＡＴＰ修飾ヘモグロビンが依然として短い血管内寿命しか有していないために成功しなかった。しかし、o-ＡＴＰのオキシダント効果は化合物中に存在するヨウ化物（ＩＯ₄ 及びＩＯ₃ ^-）の痕跡によるものである。実際、o-ＡＴＰを完全に精製すると（例 10を参照のこと）、この問題は実質的に解決する。さらに、以前に行われていたようなo-ＡＴＰとデオキシ-Hbとの反応ではなく、むしろo-ＡＴＰとカルボキシ- Hb（一酸化炭素飽和Hb）との反応によって、メトヘモグロビンの生成を最小限にすることができる。溶液のpHが約7.25〜7.15まで下がると、さらに特に約7.20まで下がるとo-ＡＴＰとHbCOとの反応が起こる。しかし、短い血管内寿命という問題はまだ残っている。我々は分子内架橋した４量体ヘモグロビンは、依然として腎臓の腎糸球体を通り抜け、腎管に障害を与えることを見出した。したがって、適当な血管内保持時間を達成し、かつ腎障害を避けるためには、ヘモグロビンを分子内架橋とともに分子間架橋させることが必要である。本発明においては、第２プリン誘導体、アデノシンのジアルデヒド誘導体、または過ヨウ素酸酸化アデノシン（o-アデノシン）を第２架橋剤として用いる。ヘモグロビン分子はその表面にリジンのアミノ基を44個有している。したがって、 o-アデノシンを用いて２以上のこれらの基を架橋し、２以上のヘモグロビン４量体を架橋することができる。他の化合物に対するアデノシンの利点はいくつかある。アデニンが存在するため、アデノシンはＡＴＰと同様な血管拡張効果を有する（スー（C.Su）、「心臓及び血管におけるヌクレオチドの細胞外機能("Extra cellular functions of nucleotides in heart and blood vessels"，Annual Re view of Physiology 47:665-676(1985))」）。さらに、アデノシンは血小板凝集を阻害し、かつ、腎臓における腎糸球体濾過を改良する。これら２つの効果は出血後及び再潅流後に有益である（バーン（R.M.Berne）、「アデノシンの制御機能(Regulatory Functions of Adenosine，Martin Nijhoff Publisher，Boston， Nassachusettes(1983))」）。ヘモグロビンとo-アデノシンの反応は本発明以前は知られていなかった。メトヘモグロビンの生成を抑制するために、カルボキシ形のヘモグロビン（HbCO）を用いて反応させることが重要である。最後に、反応は温度が低いほど、たとえば約25〜10℃低速で進行し、約４℃においては非常にゆっくりと進行する。これらの条件は、これによって所望の分子凝集体が生成した後いつでも反応を停上させることができるので重要である。この性質によって、異なる分子量のヘモグロビンポリマーを計画通りに、再現性よく調製することが可能になる。これはグルタルアルデヒド等の他の架橋剤を用いた場合には達成できない。ヘモグロビンと o-アデノシンの架橋反応は、リジンのようにε-アミノ基を有する還元グルタチオン（ＧＳＨ）を添加することによって停止させることができる。ＧＳＨは、この反応に入ることによって、ヘモグロビン組成物の一部になる。ＧＳＨが好ましいのは、これが赤血球中に大量に存在し、かつ、赤血球中におけるその第１の機能が「オキシダント・トラップ」として働き、ヘモグロビンをオキシダントの刺激から保護することたからである（ラーソン（A.Larsson）、「グルタチオンの機能(Functions of Glutathione：Biochemical，Physiologica l，Toxicological and Clinical Aspects，Raven Press，New York(1983))」。ＧＳＨは溶液中と同様に赤血球環境においてもヘモグロビンを保護する。ヘモグロビンをo-アデノシンにより架橋した後にＧＳＨと反応させることによって、ヘモグロビン分子の表面の電気的陰性度が増加し、ヘモグロビンの等電点が6.8から6.1〜6.2に減少する。このことによってヘモグロビンの安定性が高まり、腎臓からのその濾過が防止されることによりその血管内寿命が長くなる。 o-ＡＴＰとo-アデノシンは市販されており（Sigma Chemical Co.，St．Louis ，Missouri）、又は下記に例10及び11として述べる方法によって調製してもよい。還元グルタチオンは市販されている。これらの反応及びカルボキシヘモグロビンからオキシヘモグロビンへの再変換の後、得られた化合物（Hb−ＰＰ−ＧＳＨ）を保存の必要性に応して各種の媒質に溶解する。溶液を数カ月間、さらには数年間保存したい場合、（Hb−ＰＰ−ＧＳＨ）を20mMサム溶液の添加により約pH8.1〜8.2に調整された「注射用」の無菌無発熱性物質の水に溶解しておくことができる。本発明者らは、アルカリ性pHであるpH8.1〜8.2の水に溶解したヘモグロビンは自動酸化を受けることがより少なく、約pH7.4の電解質溶液に溶解したヘモグロビンより長期間保存できることを見出した。この場合、使用直前に溶液に電解質を添加することができる（前記の例を参照）。これに対し溶液を数時間又は数日以内に用いる場合、（Hb −ＰＰ−ＧＳＨ）を電解質平衡生理食塩水、たとえばノルマル（Normal）Ｒに直接溶解することができる（前記の例を参照）。あるいはこの化合物を乳酸加リンゲル液（前記の例を参照）、又は特に低張もしくは等張の塩化ナトリウム溶液に溶解してもよい。本発明の人工血液を出血性ショックの処置に用いる場合、塩化マグネシウム（MgCl₂）を、好ましくは使用直前に、組成物中のＡＴＰ含量とほぼ等モル量で添加することができる。このことは微小循環におけるＡＴＰの有益な効果を補完し、過剰の塩素イオンを供給してヘモグロビンの酸素親和性を下方調節し、より良好な組織酸素供給をもたらすことが見出された。マンニトールを、好ましくは使用直前に添加してもよい。これはＯＨ・ラジカル（最も毒性の高い酸素由来のフリーラジカル）及び、おそらくは他のラジカルに対しても捕捉剤として働くことが知られているからである(フリーマン（B.A.Freeman）、クラポ（J.D.Crapo）、「フリーラジカルと組織障害("Free radicals and tissueinjur y"，Laboratory Investigation 47:412-426(1982))」)。一般にマンニトールは約0.5〜2.0mg/ml、好ましくは約0.8mg/mlの量で添加することができる。したがって本発明は、人工血液として有用な、すなわち、（ａ）血漿量を維持、回復することができ、（ｂ）生体器官に酸素を供給することができ、かつ（ｃ）出血後の血管収縮を弛緩させることのできる、組成物を提供する。本発明の組成物は、哺乳類（ヒトを含む）に投与した場合に毒性のない、かつ血液伝染性病原性粒子を含まない人工血液を提供する。本発明のその他の目的、特色及び利点は、ヘモグロビンから人工血液を調製する方法を提供することにある。本発明のその他の目的、特徴、及び利点は、後述する本発明の好ましい具体例の詳細な説明によって明らかとなるであろう。実施例本発明による複合製品の好ましい調製工程は、次の５段階からなる。（Ａ）赤血球の精製（Ｂ）ヘモグロビンの抽出（Ｃ）ヘモグロビンの精製（Ｄ）o-ＡＴＰ、o-アデノシン、及びグルタチオンとの反応によるヘモグロビンの修飾（Ｅ）最終生成物(Hb−ＰＰ−ＧＳＨ)ｎの調製例１：赤血球（ＲＢＣ）の精製上述のように、本発明の組成物の好ましい出発材料はウシ血液である。しかし本発明による組成物の調製方法は、ほかの哺乳類（ヒトも含む）の血液を出発物質とした場合にも利用することができる。ウシ血液は、多数の健康なドナーから、または屠殺場に出された個々の動物から得ることができた。前者の場合には、雌牛成体を拘束して首の毛を剃り、防腐性石鹸で皮膚を処理する。血液は無菌条件下で外頸静脈に穿刺して吸引した。１頭の動物から約1,500mlの血液が得られ、これをＡＣＤ抗凝集剤200ml（Virbac．Inc．Lenexa，Kansas）の入った無菌無発熱性物質の、２１の空の瓶に集めた。後者の場合には、動物を屠殺する前に気絶させ、首の片側を速やかに「用意」し、頸動脈にトローカーを経皮的に挿入した。それぞれの雌牛成体から約10lの血液を採取することができた。異なる動物から得た血液は混合しない。実験室までの運搬中、瓶は氷中に保った。特にウシ血液から出発する場合に重要なことは、赤血球（エリスロサイト）を白血球（ロイコサイト）、血小板及び血漿から完全に分離することである。この工程によって、最終的にヘモグロビンの精製のために除去する必要のある非ヘム蛋白質及びその他の物質の負荷を減少させることができる。また、すべての白血球を除去することによって、白血球、特にリンパ球に付随するウィルス、たとえはサイトメガロウィルス、ヒト免疫不全ウィルス、その他を除去することができる。赤血球は「スピン・クール・フィルター」法によって精製される。「スピン」工程は、閉鎖系においてDIDECOシステム（Electromedics Inc.，Englewood．Col orado）等の血液銀行用細胞分離機を用いた多段階の遠心分離からなり、次のような方法で行った。 1,100rpm、15℃、20分の遠心分離によって、血小板と血漿とを除去した。 4,500rpm、15℃、10分の遠心分離によって、血漿をさらに完全に除去した。等張生理食塩水（赤血球：生食＝１．４）で、4,100rpm，４℃、10分間洗浄した（４回）。等張サム溶液、pH8.1〜8.2（Tham USP，Abbott Laboratories，North Chicago ，Illinois）を用いて最終洗浄を行った。この工程によって、洗浄赤血球の懸濁液はヘモグロビンを酸化から保護する無電解質高pH溶液となった。「冷却」工程においては、赤血球は「トランスファーパック（無菌無発熱性物質のプラスチック容器（Fenwal Laboratories，Deerfield，Illinois社製）」において、４℃で一晩もしくは18時間、放置した。低温において、白血球は凝集して小さな固まりを形成する傾向にある。「濾過」工程においては、20μmの「高容量輸血フィルター（high capacity transfusion filter，Fenwal社製）」等のセルロースフィルターに細胞を通して、白血球凝塊を除去した。白血球と血小板がないことを確認するために、コールター（Coulter）細胞計数器を用いて細胞数を計測し、通常の化学的方法によって、懸濁液に蛋白質が存在しないことを確認した。細菌性内毒素の存在は、「定量的色原体リムルステスト（QCL-1000，Whittaker Bioproducts，Walkersville，Maryland）」を用いて検出した。例２：ヘモグロビンの抽出赤血球からのヘモグロビンの抽出は、２段階で行った。最初に等張サム溶液（ pH8.1〜8.2）に20％の濃度で（ヘマトクリット0.20）懸濁した赤血球１lを、「クロスフロII（Krosflo II Filtration Module with 10 Ft² Surface Area．Mic rogon，Inc.，Laguna Hills，Califormia）」等の、孔径0.20μmの人工腎臓を用いて、10lの低張（230mOsm/L）サム溶液に対して透析した。透析は透析液が赤い色（ヘモグロビン色）を呈するようになるまで行った。このとき、赤血球は球形に膨潤し、細胞膜が引き伸ばされてヘモグロビンが透過できるようになった。第２段階として、人工腎臓に10psi（0.7kg/cm²）の圧力をかけ、細胞膜を破壊することなくヘモグロビンを細胞から絞り出した。「ゴースト」膜は、１工程を終えた後、廃棄した。ヘモグロビンが低張溶液リサーバーに入るため、230mOsm/Lのサム溶液を加えることによって赤血球リザーバーの容量を維持した。抽出されたヘモグロビンは、「ポジダインＩＶフィルター（Posidyne I．V．Filter，PALL Biomedical Inc.，Fajardo，Puerto Rico）」等の0.20μmのフィルターを用いて濾過して残った粒子残骸と汚染微生物を除去し、「トランスファーパック」において、４℃で保存した。この工程の結果、ヘモグロビン溶液は３〜５mg/dlのリン脂質（リン脂質テストキット（Boeringer-Nanheim Diagnostics，Indianapolis，Indiana）を用いて測定）と、痕跡量のアミノリン脂質ＰＥ及びＰＳ（薄層クロマトグラフィーを用いて測定）を含んでいた。ヘモグロビンの精製ヘモグロビンの精製は、次の４段階で行った。例３：カルボキシ型ヘモグロビン（HbCO）の低温殺菌この工程は「マイクロリフト・バイオリアクター（Microlift-15 liter steri lizable-in-place bioreactor with NBS Model ML-4100 control system，New B runswick Scientific Co.，Edison，New Jersey）」等の、予め殺菌された無発熱性物質の生物反応層の中で行った。これは気体と液体の入り口が複数あり、サンプリング用の口と撹拌器を有し、温度制御のできる閉鎖系容器である。このバイオリアクターを、排気「ヒュームフード」の下に設置した。ゆっくりと撹拌しながら無菌ガスを760mmHg、４℃で連続フラッシングすることによって、ヘモグロビンを一酸化炭素（純度99.99％、Criogenic Rare Gas Co.，Hanahan，South Carolina）で飽和させた。総飽和度はコオキシメーター（Nodel 282，Instrumen tation Laboratories，Lexington，Massachusetts）を用いて確認した。この工程には約15分間を要した。溶液は、760mmHgのＣＯ中に放置した。次に、バイオリアクター内の温度を４℃から60℃へと徐々に昇温し、その温度において９時間放置し、その後１時間かけて70℃に昇温することによって、低温殺菌を行った。その後、温度を徐々に４℃まで下げた。例４：クロロホルムとともに遠心分離この工程のために、バイオリアクターから取り出したヘモグロビン溶液を0.20 μmのフィルターを用いて濾過し、250mlの無菌無発熱性物質の、適当な蓋でシールされた遠心管（クロロホルム、蛋白質、アルコールに耐性の「ポリアロマー」遠心管（Sorvall Division，Du Pont Co.，Wilmington，Delaware）に入れた。ソルボール遠心分離機（Sorvall，Model OTD75B）により、TFA20.250のローターを用いて、以下のようにして３回の遠心分離を行った。 15：１の割合（遠心管１本あたり、ヘモグロビン232ml、クロロホルム18ml）でヘモグロビンとクロロホルムを混合し、760×ｇ、４℃、30分の遠心分離を行った。上清を、層流フードにおいて、無菌無発熱性物質の管とペリスタポンプを用いて次の遠心管に移した。 16：１で混合したヘモグロビンとクロロホルムを、1,600×ｇ、４℃、15分間、つづいて3,800×ｇで15分間、遠心分離した。上清を第３の遠心管に移した。クロロホルムを加えずに、61,400×ｇで60分間遠心分離した。３回目の遠心の後、ヘモグロビン溶液を1,000mlの、無菌無発熱性物質の、撹拌子の入った減圧排気した管（Abbott Laboratories）に移した。ゆっくりと撹拌しながら４℃、２時間、無菌ＣＯガスをフラッシングすることによって、残っている痕跡量のクロロホルムを溶液から除去した。この工程に用いたクロロホルムは、ＵＶカットオフ244nmのＨＰＬＣグレードのもの（Fisher Scientitic Co.，Fair Lawn，New Jersey）であった。遠心管は次の処理を施すことによって再使用できる：（ａ）E-TOXAクリーン石鹸（E-TOXA -Clean soap，Sigma Chemicals）；（ｂ）190プルーフ（95％）のエタノール；（ｃ）120℃、80分間の滅菌。この一連の遠心分離によって、すべてのリン脂質のみならず、前工程の低温殺菌において変性して沈殿した非ヘム蛋白質をも、精製ヘモグロビンから除去することができた。例５：内毒素アフィニティ・クロマトグラフィー・カラムによる濾過ヘモグロビン溶液を、デトキシゲルカラム（Detoxl-Gel colulnn，Pierce Che mical Co.，Rockford，Illinois）等のアフィニティ・クロマトグラフィー・カラムを用い、入り口と出口に「トランスファーパック」とペリスタポンプを用いて閉鎖系を形成したカラムで濾過した。この工程はクラス100の層流フードにおいて行った。この工程によって、内毒素の濃度を、2.0〜2.5EU/mlから0.10EU/ml未満に減少させることができた。例６：透析ヘモグロビン溶液を、サム溶液によってpH7.20に調整した無菌無発熱性物質の脱イオン水に対して１：10の割合で透析した。透析は、「90SCE-人工腎臓（C-DA K Co.，Niami Lakes，Florida）」等の、6,000ダルトンの孔径を有する人工腎臓を用いて行った。この工程によって、小さい分子が除去され、ヘモグロビンの濃度は10g/dlとなり、ヘモグロビン溶液のpHが約8.2から約7.2に下がった。工程中のこの時点において、「純粋な」ヘモグロビンが生成し、すなわち、細菌性内毒素、ストローマ性脂質とリン脂質、及び非ヘム蛋白質を全く含まないヘモグロビンが得られた。また、工程の様々な点で、0.20μmのフィルターを用いた濾過を繰り返すことによって、汚染微生物をすべて除去したことが期待され、一方、低温殺菌とクロロホルム処理によって、非脂質及び脂質外被ウィルスを不活性化させたことが期待される。さらに、ヘモグロビンをカルボキシ型で用いることにより、酸化を低く抑えた精製（１〜2.5％のメトヘモグロビンが生成）が可能になった。例７：ヘモグロビンの修飾ヘモグロビンとo-ＡＴＰ、o-アデノシン、及び還元型グルタチオンとの反応は、以下のようなバイオリアクターを用いて行った。サム溶液でpHを7.20に調整した水に、カルボキシ型のヘモグロビンを10g/dlとなるように懸濁し、これを再びバイオリアクターに導入して、１気圧の一酸化炭素下で、ゆっくりと撹拌しながら４℃に保った。例10に従ってo-ＡＴＰを調製し、粉体形で保存した。pHを7.20に調整した無菌無発熱性物質水にこれを溶解し、これをただちに、Hb：o-ＡＴＰのモル比が１：３となるようにヘモグロビン溶液に加えた。４℃、ＣＯ存在下で、150rpmで撹拌しながら24時間反応させた。溶液のサンプルを６時間ごとに採取し、ヘモグロビンの分子量の増加をサイズ除去カラムを装着したＨＰＬＣによって、電荷の変化を陰イオン交換カラムを装着したＨＰＬＣによって、それぞれ測定した。測定には、ウォーターズ（Waters）のＨＰＬＣシステム（Waters 600E System Control ler、Waters 712 injector、Waters 990 Photodiode Detector及びNEC Power Ma te 2 computerからなる）を用いた。サイズ除去カラム（Protein Pak 300 SW）及び陰イオン交換カラム（DEAE-5 PW）もまたウォーターズ（Waters Chromatogr aphy Division，Nillipore Co.，Milford，Massatusetts）より入手した。架橋の理想的な条件は約24時間後に生じ、このとき陰イオン交換ＨＰＬＣの実験によって90〜95％のo-ＡＴＰが化学反応に用いられたことが示された。この結果、表に示す次の各成分からなる分子凝集体が生成した。すなわち、この反応の条件下では、o-ＡＴＰは主に分子内架橋を生成するが、一部に分子間架橋も生成する。しかし、このことによって以下の反応は阻害されなかった。 24時間後、例11に従って調製し、粉体形で保存したo-アデノシンを、サム溶液によってpH7.20に調整し、エタノール数滴を加えた滅菌水に溶解した。この化合物をヘモグロビン溶液にHb：o-アデノシンのモル比が１：５になるように加え、同じ条件下でさらに24時間反応を続けた。この時点で、第２回分のo-アデノシンを同じモル比１：５で加え、さらに24時間反応させた。ＨＰＬＣを用いてサンプルを測定し、ヘモグロビン４量体のレベルが70から30％に低下した時に反応を停止させた。反応がこの点をはるかに越えて進行すると、サイズの大きすぎるポリマーが生成する。次に、サムを加えた水（pH7.20）に溶解したＧＳＨをヘモグロビン溶液に、Hb：ＧＳＨのモル比が１：20となるように加え、16時間反応させた。この時点で、ヘモグロビンの分子凝集体は、次表に示す下記の形態を含むものであった。この凝集体は、ＨＰＬＣ−ＤＥＡＥにおいて50-51分に単一ピークを示した。これらの化学反応の最後に、４℃で、穏やかに撹拌しながら、滅菌した酸素を 35psi（2.5kg/cm²）で繰り返しフラッシングし、同時に「タイプ4051モルクォーツ（"molequarts"，Mole-Richardson Co.，Hollywood，Califormia）」と接続した「クォーツライン・ランプ（"quartzline lamp"，DWY，120V，650W，General Electric Co.，Cleavland，Ohio）」を用いて、強い光を20秒のパルスで照射し、ヘモグロビンをカルボキシ型からオキシ型へ再変換させた。このヘモグロビンの再酸化反応はＩＬコオキシメーターを用いて確認した。例８：本発明組成物の調製及び保存最終工程においては、ヘモグロビン溶液を50mHのサム溶液（pH8.1）に対して、分子量カットオフ約65〜85キロダルトンの人工腎臓（「デュオ−フラックス(" Duo-Flux"；C-DAK,Miami Lakes,Florida)」）を用いて、ヘモグロビン４量体の％が30%から約５%に低下するまで透析した。最終的なヘモグロビン凝集体の分子量分布を次表に示すしたがって、最も多い分子種は、４つのヘモグロビン４量体からなり、分子量２60,000ダルトンのものであった。この凝集体は、ＨＰＬＣ−ＤＥＡＥにおいて 50〜51分に単一ピークを示し、これは等電点が6.8から6.1に変化したことを示す。廃棄されたヘモグロビンを含む透析液は、6,000ダルトンの人工腎臓（90 SCEa rtificial kidney，C-DAK Co.）を用いて透析することによって、ヘモグロビン濃度を10g/dlまで濃縮し、o-アデノシンとの分子間架橋に再利用することができる。このヘモグロビン溶液を数時間又は数日以内に用いる場合は、50mMサム溶液に対する１回目の透析後に、電解質平衡生理食塩水（ノルモゾール（Normosol）R, pH7.4,140meq/lナトリウム、５meq/lカリウム、3meq/lマグネシウム、98meq/l 塩素、27meq/l酢酸、及び23meq/lグルコン酸を含む；Abbott Laboratories）に対して透析した。本発明の修飾したヘモグロビン（Hb−ＰＰ−ＧＳＨ）は、長期保存のためには約10g/dlの濃度で水−サム溶液（約pH8.1〜8.2）中に、又は大幅な遅滞なしに用いるためには電解質平衡生理食塩水（約pH7.4）中に溶解することができる。長期保存のためには、水−サム溶液に溶解したヘモグロビンを600mlのフエンウォール・プラスチックバッグ（無菌無発熱性物質のバッグ；Baxter Healthcar e Co,Fenwal Division,Deerfield,Illinois）に入れ、約−90℃で凍結保存することができる。これらの条件下では約１年間まで、ヘモグロビンの自動酸化が起こらないことが見出された。この期間中、ＨＰＬＣ及び等電点電気泳動により調べたヘモグロビンの重合度は変化しなかった。中間的な期間、たとえば１〜６カ月間の保存のためには、水−サム溶液に溶解したヘモグロビンをガラス瓶（無菌無発熱性物質の「空の排気した容器」；Abbott Laboratories）中に、液状で約４℃に保存することができる。これらの条件下でヘモグロビンの自動酸化が起こるのは約１％／月の速度であることが見出された。６カ月間にわたって重合度はごくわずか変化し、大型ポリマーが約５〜７％減少し、同時に８量体及び４量体が増加することが見出された。短期間、たとえば１カ月以下の保存のためには、ヘモグロビンを電解質平衡生理食塩水に溶解し、ガラス瓶（「空の排気した容器」；Abbott Laboratories）中に、液状で約４℃に保存することができる。これらの条件下では約３〜５％／月の速度でヘモグロビンの自動酸化が起こることが見出された。例９：本発明組成物の特性解明この新規製品の特性は次のようにして測定した。ヘモグロビン、メトヘモグロビン、及びカルボキシヘモグロビンの濃度は、コオキシメーター（Model 282 Co oximeter，Instrumentation Laboratories，Lexington，Nassachusetts）によって測定した。溶液の電解質濃度及び浸透圧は、ＡＳＴＲＡ装置（Beckman Co.，P alo Alto，California）を用いて測定した。膠質浸透圧はウェイルオンコメーター（Weil oncometer，Instrumentation Laboratories）を用いて測定した。粘度は、ブルックフィールド粘度計（Brookfield Engineering Laboratories，Stoug hton，Nassachusetts）を用いて、37℃において、剪断速度100/sで測定した。その他の蛋白質、リン脂質、細菌性内毒素に対するヘモグロビンの純度は、前述のようにして評価した。酸素結合容量は、ヘモグロビン濃度とコオキシメーターによる酸素容積から計算した。ヘモグロビン・酸素解離曲線は、ヘム-O-スキャン装置（Hem-O-Scan，SLM Amico，American Instruments，Silver Spring，Ma ryland）によって得た。Ｐ₅₀値は、標準的な条件（温度37℃、pH7.40、pCO₂ 40t orr）における解離曲線から求めた。リン酸含量の分析は、フィスケ（Fiske）とスバロウ（Subbarow）の方法（Jou rnal of Biological Chemistry,66：375-380（1925））に従って行った。ＧＳＨ含量は、リード（Reed）らの方法（Analytical Biochemistry,106:55-62,(1980) ）に従って決定した。アデノシンはＨＰＬＣを用い、258nmで吸光度を測定し、入光量とヘモグロビンに取り込まれた光量から計算した。ＡＴＰは、リン酸の測定から計算した。ここで特性を測定した製品は、(Hb−ＰＰ−ＧＳＨ)ｎ、（ただし、Hbは精製ウシヘモグロビン、ＰＰは２つのプリン誘導体、すなわち、o-ＡＴＰ及びo-アデノシンであり、ＧＳＨは還元グルタチオンである。）と同定された。基本分子は図１及び図２に示すヘモグロビン４量体である。図３に、他の蛋白質からの精製を示す。この化合物には、ヘモグロビン１mMに対し、ＡＴＰ約３mM、アデノシン約 1-0mM、ＧＳＨ約20mMが含まれていた。調製の過程において様々な間隔でこの化学組成とＨＰＬＣ分析を行ったところ、o-ＡＴＰは主としてヘモグロビンの分子内架橋に関与し、一方、o-アデノシンは分子間架橋を形成していることが示された。さらに、o-アデノシンはＧＳＨ分子をヘモグロビンに繋ぐアンカーとなった。この化合物を図４及び図５に示す。ＨＰＬＣサイズ除去によるスペクトル分析（図４）によって、この化合物が次表に示す６つの分子種からなることが示された。これらのうちで、（Hb）₄、すなわち４量体４つの凝集体が主要分子種であった。ＨＰＬＣ−ＤＥＡＥカラムによる分析（図５）は、50〜51分に単一ピークを示し、このことは、この化合物が均一な、還元型の（修飾していないヘモグロビンに対して）等電点を有していることを示している。等電点電気泳動による分析（図６）は、これらのヘモグロビン修飾を別の観点から示している。化合物（Hb−ＰＰ−ＧＳＨ）を水−サム溶液中に保存する場合、下記の電解質を使用前に添加することができる。塩化ナトリウム、たとえば25meq/ml 113meq/ml 注射用、米国薬局方NaCl(Abbott Lab.) 炭酸水素ナトリウム、たとえば1.0meq/ml 27meq/ml 注射用、米国薬局方NaHCO₃(Abbott Lab.) 塩化カリウム、たとえば20meq/ml 4meq/ml 注射用、米国薬局方KCl(Abbott Lab.) グルコン酸カルシウム、たとえば0.465meq/ml 5meq/ml 注射用、米国薬局方(American Reagent Lab.) 硫酸マグネシウム、たとえば0.8meq/ml 3.5meq/ml 注射用、米国薬局方MgSO₄(ANTRA Pharmaceutical) さらにマンニトールを約0.8mg/ml（溶液）の量で添加することができる。これらの溶液を用いた場合、最終的なヘモグロビン溶液は次表に示す組成を有する。化合物（Hb−ＰＰ−ＧＳＨ）をノルモゾール（Normosol）Ｒ中に溶解して保存する場合、使用前に上記と同量のマンニトールのみを添加した。最終製品の特性は、ノルモゾールＲがグルコン酸カルシウムを含有しない点以外は上記の表に示したものと同様であった。大気に接触したヘモグロビン溶液は、10g/dlの濃度において13容量％の酸素を運搬し、このことは酸素結合容量がほぼ100％（ヘモグロビン１ｇあたり1.3容量の酸素）であることを示した。高い塩素濃度による重合にもかかわらず、この溶液のＰ₅₀値は高かった（〜28mmHg）。浸透圧は、血漿のものより高く、粘度は全血のものより低かった。ヘモグロビンの濃度が高い（アルブミンと比較して）にもかかわらずコロイド浸透圧は血漿のものより低かった。これはヘモグロビンが重合しており、「ヘモグロビン粒子」の数が減少しているという事実のためである。例１０：o-ＡＴＰの大量調製 o-ＡＴＰの基本的調製法は従来から知られている（イースターブルック・スミス（S.B.Easterbrook-Smith）ら、「ピルビン酸カルボキシラーゼ("Pyruvate Ca rboxylase:Affinity Labelling of the magnesium adenosine triphosphate bin ding site"，European Journal of Biochemistry,62:125-130(1976))」を参照のこと）。大量の材料を製造し、ヘモグロビンとの十分な化学反応を確実にするために修飾を行った。アデノシン-5'-三リン酸二ナトリウム塩水和物（ＡＴＰ、F.W.551.15）及び過ヨウ素酸ナトリウム（NaIO₄、純度99％、F.W.213.89）はアルドリッチ社（Aldri ch Chemical Company，Milwaukee，Wisconsin）より入手した。10本の120mlセファデックスＧ-10カラムはファルマシア社（Pharmacia Fine Chemicals，Piscata way，New Jersey）より入手した。１本のカラムにつき、サム溶液を用いてpH7.0 （０℃）に調整した無菌無発熱性物質の水（注射用水、Abbott Laboratories）1 5mlに、550mgのＡＴＰを溶解して用いた。過ヨウ素酸ナトリウムをＡＴＰ：NaIO₄ のモル比が１：1.1となるように加え、溶液を４℃で暗所に１時間放置した。エチレングリコールをＡＴＰ：エチレングリコールのモル比が２：１となるように、15分間かけて加えることによって、反応を停止させた。反応混合物を４℃において、あらかじめ注射用水で平衡化したセファデックスＧ−10カラムにかけた。カラムは200mlの水で溶出した。ヌクレオチドのピークの前半（図７の分画20から30）を集め、ただちにラブコンコ凍結乾燥システム（Labconco Fre eze-Dry System with Stoppering Tray Dryer，Labconco Co.，Kansas City，Mi ssouri）を用いて、-40℃、＜10μHgの真空で凍結乾燥した。得られた粉体は、使用するまで-90℃において褐色瓶にて保存した。 o-ＡＴＰの濃度は、258nmの吸光度を測定して求め、過ヨウ素酸の存在は、232 nmの吸光度を測定して求めた。カラムは再使用の前に、注射用水を用いて４℃で 30時間洗浄し、流出物が232nmにおいて0.043未満の値を示すまで、すなわちすべての過ヨウ素酸が流出するまで、洗浄した。本発明においては、次の２つの処置が重要である。（１）o-ＡＴＰを含み過ヨウ素酸の痕跡を含まない分画のみを集めること、（２）これらの分画をただちに凍結乾燥し、-90℃で凍結すること。これらの処置によって、化学反応によるヘモグロビンの酸化を防止することができる。例１１：o-アデノシンの大量調製 o-アデノシンの基本的調製方法は、従来から知られている（キム（J.X.Khym）及びコーン（W.E.Cohn）、「過ヨウ素酸酸化ヌクレオチドの特性化といくつかの化学反応（"Characterizations and some chemical reactions of periodate-ox idized nucleotides"，Journal of American Chemical Society 82:6380-6386(1 960)）」を参照のこと）。大量の材料を製造し、ヘモグロビンとの十分な化学反応を確実にするために修飾を行った。純度98％のアデノシンはシグマ社（Sigma Chemical Co.）、過ヨウ素酸ナトリウムはアルドリッチ社（Aldrich Chemical Co.）より入手した。６ｇのアデノシンを室温で30分間、150mNのNaIO₄水溶液200mlに溶解した。この溶液を、あらかじめ20mN酢酸（Fisher Scientifuc Co.より入手）（溶出液Ａ）で平衡化した300 mlの陰イオン交換樹脂（AG1-X-8、100-200メッシュ、酢酸形）のカラム（Bio- Rad Laboratories，Richmond，California）に通した。このカラムを２１の溶出液Ａを用い、流速15ml/min、温度４℃で溶出し、150mlの分画を得た。分画２〜1 5のみを集め(図８に示す)、o-ＡＴＰと同様にただちに凍結乾燥し、凍結した。再使用の前には、６１の100mM塩化アンモニウム（溶出液Ｂ）をカラムに通し、すべての過ヨウ素酸を解離させた。分画中の過ヨウ素酸の濃度は、232nmの吸光度を測定して求めた。この後、カラムを６１の注射用水で洗浄し、20mHの酢酸で再び平衡化した。本発明の目的には、次の２つの処置が重要である。すなわちo-アデノシンを含み、過ヨウ素酸の痕跡を含まない分画のみを集めること、及びこれらの分画をただちに凍結乾燥し、-90℃で凍結することである。これらの処置によって、化学反応によるヘモグロビンの酸化を防止することができる。本発明の応用の説明例１２：ラビットにおける毒性本発明組成物（Hb−ＰＰ−ＧＳＨ）の毒性を、科学文献に報告されている方法（フェオラ（M.Feola）ら、「高分子化ヘモグロビン溶液の毒性("Toxicity of p olymerized hemoglobin solutions"，Surgery，Gynecology and Obstetrics 166 :211-222(1988))」）に従って、ラビットで試験した。体重4.0kgのニュージーランド・ラビット12匹に、１％のリドカインによる局部麻酔下で、滅菌したカニューレを片方の耳の中心動脈及び他方の耳の縁静脈内に挿入した。滅菌したカテーテルを膀胱に挿入した。サーミスタプローブ及びＥＣＧ針電極を局部麻酔下で四肢に挿入した。心電図（ＥＣＧ）、血圧、体温及び排出尿を３時間連続してモニターした。その後カテーテルと電極を取り除き、動物をケージに戻した。30分間の定常状態（ベースライン）の後、血液量の1/3にあたる（ラビットの血液量をｋｇで表わした体重の６％として計算）80mlの血液を５分間かけて動脈系から除去した。電解質溶液に溶解した等量のHb−ＰＰ−ＧＳＨを30分間かけて静脈系から輸血した。この量は、約２ｇのヘモグロビンに相当する。血液を除去すると、血圧が低下し、心拍数が増加した。これらの変化はすみやかにもとに戻った。さらに、出血後細くなった脈圧（収縮期血圧と拡張期血圧の差）は、まず正常値に戻り、次にベースラインより大きくなった。このことは、ヘモグロビン溶液の血管拡張効果を示す。この効果は、３時間の観察の間ずっと見られた。***尿は正常な状態を維持し、ヘモグロビンの尿への溢出は見られなかった。血液交換の後30分、１、３、及び24時間後に血液をサンプリングしたところ、下記のことが明らかになった。（１）血液希釈効果を越えた、白血球及び血小板の減少は見られなかった。（２）血清フィブリノーゲン、プロトロンビン時間及びフィブリン分解生成物を測定したところ、血管内血液凝固及びフィブリン溶解の活性化は見られなかった。（３）脳又は心筋の障害を示唆する、クレアチニンフォスフォキナーゼ脳アイソザイム（ＣＰＫ−ＢＢ）又は心筋アイソザイム（ＣＰＫ−ＭＢ）の上昇は見られなかった。（４）肝臓障害を示唆する、血清グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＳＧＰＴ）の上昇は見られなかった。（５）動脈血液ガスは正常であって、肺機能が正常であることを示した。（６）血清クレアチニンは正常であって、腎機能が正常であることを示した。３時間後と24時間後の、血液と尿のサンプルの組み合わせは、正常なクレアチニン・クリアランスを有し、腎機能が正常であることを示した。全血の酸素解離曲線は、Ｐ₅₀値が変化していないこと、すなわち、ヘモグロビンによる酸素親和性の増加がないことを示した。24時間後における血漿ヘモグロビンのレベルは、最初のレベルの約50％であり、このことは、ヘモグロビンの半減期が24時間であることを示唆した。 24時間の間、動物は、外観、振る舞いとも正常であった。この時点で実験動物を殺し、生体器官を組織学的に研究した。これまで科学文献に報告されている病理学的変化は、（ａ）心臓、（ｂ）肺、（ｃ）肝臓、（ｄ）腎臓のいずれにも観察されなかった。これらの発見は、これまで報告されてきた純粋でないヘモグロビンをグルタルアルデヒドによって架橋したものを用いた場合（上述の参考文献を参照のこと）と鋭い対比を示している。例１３：ラビットにおける薬効この製品の人工血液としての薬効をラビットで試験した。上記の例で述べた方法と同様に、対照群として、体重4.0kgのニュージーランド・ラビット10匹から1 /3量の血液（血液量はkgで表わした体重の６％として計算）を除去し、15分後にさらに1/3量を除去した。処置を行わない場合には、これらの動物すべてが１時間以内に死亡した。実験群として、10匹のラビットに同じ実験を行い、ただし電解質溶液に溶解したHb−ＰＰ−ＧＳＨを、失われた血液の総量と等しい量で輸血した。これらの動物はすべて生存し、７日以内にヘマトクリット値（赤血球の濃度）はベースラインまで戻った。例１４：ラットにおける血液交換後の血管拡張体重350〜450ｇのスプラグ・ドーリー（Sprague-Dawley）ラット12匹に、45mg /Kgのペントバルビタールナトリウムを腹腔内に注入して麻酔し、手術台に仰向けに寝かせた。右の大腿部動脈、頸動脈、及び外頸静脈を外科的に開き、ポリエチレンカテーテル（モデルPE50、Intramedic，New York）を挿入した。外頸静脈カテーテルを右心房の中に進め、一方、サーミスタプローブ（モデルＩＦ、Colu mbus Instruments，Columbus，Ohio）を頸動脈を通して上行大動脈中に進めた。それぞれのカテーテルをウシヘパリン５IU/mlを含む生理食塩水で満たした。大腿部動脈と頸静脈系を血圧変換器に接続した。針電極を四肢内に皮下挿入し、心電図（ＥＣＧ）のモニターに使用した。温熱ランプを調整して一定の体温を維持した。心拍数をＥＣＧトレースから決定し、心拍出量は熱希釈、すなわち、室温（20 〜22℃）に保持した200μlの生理食塩水を右心房に注入し、大動脈サーミスタからの熱希釈曲線を記録することによって測定した。全身血管抵抗は平均動脈圧から右心房圧を差し引き、これを心拍出量で割って求めた。血行動態データのベースラインを記録した後、計算された血液量（ラットの血液量はkgで表わした体重の７％として計算）の1/3量を動脈系から５分間かけて除去した。15分後、電解質溶液に溶解した同量のHb−ＰＰ−ＧＳＨを静脈系から輸血した。ベースライン（Ｔ₁）、血液除去15分後（Ｔ₂）、ヘモグロビン輸血 15分後（Ｔ₃）において、心拍数、平均動脈血圧、及び心拍出量を測定し、全身血管抵抗を計算した。データの統計学的分析は、対データについてスチューデントｔ検定を用いて行った。下記にその結果を示すが、全身血管抵抗は血液除去後に増加し、血液交換の後正常値に戻り、ベースラインに対しても、血管拡張が起こった。例１５：ラビットにおける酸素フリーラジカルの生成体重4.0kgのニュージーランド・ラビット12匹をクロルプロマジン（５mg/kg、筋注）で沈静させ、限定された測定を行った。滅菌したプラスチックカニューレを中心動脈及び片方の耳の縁静脈内に挿入し、サーミスタブローブと針電極を四肢に皮下挿入した。計算された血液量（kgで表わされた体重の２％）の1/3量を５分間かけて動脈系から除去し、同量のヘモグロビン溶液を30分間かけて静脈系から輸血した。ラビット６匹の対照群には未修飾ヘモグロビンを、実験群（６匹）には電解質溶液に溶解したHb−ＰＰ−ＧＳＨを投与した。血漿中の過酸化水素（Ｈ₂Ｏ₂）及び脂質過酸化物レベルについて、ベースライン、ヘモグロビン輸血の１５分、１時間、３時間、及び24時間後において、輸血の効果を検討した。血漿中のヘモグロビン及びメトヘモグロビンもまた同じ間隔で測定した。未修飾ヘモグロビンを投与した群では、Ｈ₂Ｏ₂が１時間後に２±２から70±５ μmol/mlに増加し、３時間後には50±５μmol/ml、24時間後には10±５μmol/ml に減少した。実験群では、Ｈ₂Ｏ₂が１時間後に２±２から10±２μmol/mlに増加しただけであり、３時間後にはベースラインにまで戻った。同様に、脂質過酸化物については、対照群ではベースライン1.5±0.9nmol/mlから、１時間後には4.0 ±1.0nmol/mlに増加した。実験群については、有意の増加は起こらなかった。血漿中のメトヘモグロビンは、未修飾ヘモグロビンを投与した群では、１時間後に０％から15％に増加し、Hb−ＰＰ−ＧＳＨを投与した群では、０％から５％に増加した。２つの群におけるこれらの変数の差は、統計学的分析、すなわち、非対及び対サンプルのスチューデントｔ検定及び分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって有意であることが示された。上述の特定の具体例によって本発明を説明してきたが、多くの変更、応用、修正が可能であることが、当業者には理解されるであろう。これらの変更、応用及び修正は、添付した特許請求の範囲の趣旨及び目的の範囲の中に含まれる。例１６：電解質の不在下でのHb−ＰＰ−ＧＳＨの配合物 Hb−ＰＰ−ＧＳＨの調製は例１〜９に示したものにしたがって実施された。修飾されたヘモグロビンを50mMサム溶液（トロメタミン（Tromethamine）、注射用、Abbott Laboratories,N.Chicago,Illinois）（pH8.1）のみに対して透析した。Hb−ＰＰ−ＧＳＨ製剤はその最終形態において、水＋サム溶液（pH8.1）中に1 0g/lの濃度で含まれていた。この配合物は電解質を含まなかったが、あらかじめ 0.8mg/ml（溶液）の量で添加されたマンニトールを含んでいた。一般にこの溶液はそれぞれ100mlの水につき6.66mlのサムを含んでいた。例１７：電解質を含まないHb−ＰＰ−ＧＳＨ製剤の特性解明インビトロの観察において、Hb−ＰＰ−ＧＳＨは生理食塩水に溶解した場合より、非電解質溶液、たとえばサム溶液に溶解した場合の方が長期間、４℃で冷蔵庫内に保存できることが示された。３カ月間にわたって、ヘモグロビンからメトヘモグロビンへの自動酸化は電解質を含む配合物については３〜５％／月の速度で起こり、これに対し電解質を含まない溶液については１％／月の速度で起こることが観察された。これは生理食塩水中に存在する塩素イオンがヘモグロビンの酸素親和性を低下させ、酸素の放出及び自動酸化を促進することに基づいて説明することができる。例１８：電解質無添加Hb−ＰＰ−ＧＳＨのインビボ効果 Hb−ＰＰ−ＧＳＨをサム溶液に10％の濃度で溶解した。マンニトールを0.8mg/ mlの量で添加したが、電解質を添加しなかった。計算された血液量の1/3に等しい容量を、30分間かけて９匹のラット（350〜400g体重）の群に静脈内注入した。動物は実験の前は飼料及び水を普通に摂取しており、45mg/Kgのペントバルビタールナトリウムを腹腔内注入することにより麻酔され、前記の例14に報告したと同様に取り扱われた。体温、呼吸数、心電図、動脈血圧、及び心拍出量を２時間モニターした。尿排出量をヘモグロビン溶液の投与前１時間、及び投与後２時間記録し、尿をヘモグロビンにつき検査した。血清中のイオン化−及び全−カルシウムレベルの測定のために、Hb−ＰＰ−ＧＳＨ投与の前、及び投与後２時間の間１５分間隔で、血液試料を採取した。いずれの動物も急性毒性の徴候を発現しなかった。一過性の心拍数減少が起こったが、不整脈又は心電図の変化は生じなかった。呼吸数、血圧、及び心拍出量は有意に一定に維持された。動物の尿排出量は約0.6±0.3ml/時から約1.6±0.3m l/時に増加し（Ｐ＜0.05）、血色素尿症は生じなかった。全血清カルシウムは実質的に一定であり、これに対しイオン化カルシウムは約0.85±0.05mMから約0.62 ±0.03mMに減少した。しかしこれは十分に有意ではなく、数分間続いたにすぎない。イオン化カルシウムレベルの変化は、カルシウム2mg/体重100gの量において２分間隔で注入されたグルコン酸カルシウム(注射用10%グルコン酸カルシウム、 W.A.Butler,Cincinati,Ohio)の静脈内投与によって戻った。この実験は、たとえば注入すべき量が計算された血液量の1/3未満に相当する場合には、電解質を添加しなくてもHb−ＧＳＨを投与できることを証明する。例１９：Hb−ＰＰ−ＧＳＨの臨床試験 Hb−ＰＰ−ＧＳＨをヒトにおいて（Kanshasa、ザイール共和国、アフリカ）、同国政府（Department of Education and Scientific Research）の許可を得たのち試験した。1990年８月15日から９月15日までの期間、１グループ９人の患者を処置した（Center for Sickle Cell Anemia,Kanshasa）。年齢４〜13歳の男子５人及び女子４人がいた。５人の子供が重度の貧血を呈し、血液ヘモグロビンレベルが５g/dl以下であった。４人の子供がより軽度の貧血を示し、ヘモグロビンレベルが約８g/dlであったが、「鎌状赤血球貧血の発症」、すなわち手足（２人）、左肺（１人）、及び脾臓（１人）の微小血管閉塞を伴っていた。患者は痛み、発熱ならびに汎化した倦怠感及び脱力感を示した。重度の貧血を伴う患者のグループは輸血が必要であると医学的に判定され、これに対し第２グループは静脈内液、血管拡張薬、及び鎮痛抗炎症薬で処置すべきものであった。ヘモグロビン（Hb−ＰＰ−ＧＳＨ）を両グループの処置に処方することを考慮した。ヘモグロビンは赤血球（RBC）の代替を提供し、かつ下記の２メカニズムにより循環系及び組織の酸素付加を改善することが期待された。循環血液量の増加酸素供給の増加さらにヘモグロビンが、血管拡張薬であるＡＴＰ、ならびに血管拡張薬でありかつ抗炎症薬であるアデノシンの誘導体で架橋されているので、この溶液は「鎌伏赤血球化」の発症を伴う患者が患っている微小血管閉塞を軽減すると期待された。輸血に優る他の利点として、本発明のHb−ＰＰ−ＧＳＨによる処置は血液伝染性疾病、たとえばマラリア、細菌性疾患及びエイズの危険性をもたない。本発明のHb−ＰＰ−ＧＳＨを、それぞれ水−サム溶液中の10％ヘモグロビン２ 50mlを入れたフェンウォール（Fenwal）バッグ内に保存した。バッグは使用時まで凍結状態（ゲルアイス中にパック）に保持された。投与の２時間前にフェンウォールバッグを室温に置き、ヘモグロビン溶液を融解させた。電解質及びマンニトールを前記にしたがって添加した。各バッグの全量を約３０滴／分の速度で静脈内投与した。この量は血液量の約12〜23％（各患者につきkgで表した体重の７％として計算）に相当する。重度の貧血を伴う１患者に、ヘモグロビン3.5g/dlを連続２日間、２回注入した。生徴候である体温、脈拍、呼吸数及び血圧をヘモグロビン投与中及びその後２時間、１５分毎に測定した。この期間中、起こる可能性のあるアレルギー反応、たとえば蕁麻疹、皮疹、気管支痙攣及び吐き気の発現にも注目した。尿排出量を Hb−ＰＰ−ＧＳＨ投与前２時間、及び投与後２時間、測定した。尿をヘモグロビンの存在につき検査し、沈降物を鏡検により検査した。血液試料をHb−ＰＰ−ＧＳＨ投与の前、直後、その後２時間、及び５日間毎日１回採取した。患者の血液を血漿ヘモグロビン（注入したヘモグロビン）、全ヘモグロビン（注入したヘモグロビン＋赤血球に含まれていたもの）及び網状赤血球（幼若赤血球）につき検査した。アレルギー反応を発現した患者はなく、全員が全般的に改善されたと感じた。「鎌状赤血球化」の発症を伴う者は、鎮痛剤を使用しなくても痛みが軽減したと報告した。発熱は低下し、脈拍はより低速となり、血圧は若干の脈圧の上昇を伴って（血管拡張を示唆する）安定に維持され、呼吸数は変化しなかった。尿排出量はグループ全員につき、Hb−ＰＰ−ＧＳＨ投与前２時間の50±７mlからHb−ＰＰ −ＧＳＨ投与後２時間の130±15mlに増加した。尿は血色素尿症を示さず、沈降物中に血球円柱（cast）は見られなかった。最も印象的な所見は、全ヘモグロビン量が５日間にわたってグループ全員についての平均値約6.39±2.12g/dlから約 10.5±1.13g/dlに徐々に改善され、網状赤血球が約11.2±7.6から約44.2±12/10 0に著しく増加したことである。これは、このヘモグロビン溶液が赤血球の直接的代替を供給しただけでなく、自身の新しい赤血球を産生する骨髄を模したことを示唆する。この刺激は５日間につき報告したにすぎないが、それより長期間持続したと思われる。結論として、鎌状赤血球貧血を患う９人の子供に投与された有意量のHb−ＰＰ −ＧＳＨは、毒性反応又はアレルギー反応を起こさず、彼らの全般的状態を改善し、骨髄に対して新しい赤血球を産生するという長期的な有益な効果をもたらした。以上、本発明を十分に説明したが、本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく多くの変更及び修正をなしうることは、当業者には自明であろう。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】平成５年２月２２日（１９９３．２．２２）【補正内容】請求の範囲１．o-ＡＴＰ及びo-アデノシンと反応させて架橋ヘモグロビンを形成し、さらに還元グルタチオンと反応させた、実質的に発熱性物質を含まず、微生物を含まない活性ヘモグロビンからなる組成物であって； o-ＡＴＰが過ヨウ素酸酸化ＡＴＰからなり、o-アデノシンが過ヨウ素酸酸化アデノシンからなり；ヘモグロビンが該o-ＡＴＰによって分子内架橋し、かつ、該o-アデノシンによって分子間架橋し；ヘモグロビン、o-ＡＴＰ、o-アデノシン及びグルタチオンが約１:３:10:20のモル比で反応している組成物。４．溶液がさらに非電解質を含む、請求項１記載の改良された人工血液。６．架橋ヘモグロビンが約130から約390キロダルトンの分子量を有する、請求項１記載の組成物。７．約５％未満のヘモグロビンがメトヘモグロビンからなる、請求項１記載の組成物。８．ヘモグロビンがウシヘモグロビンからなる、請求項１記載の組成物。９．下記よりなる方法により調製された、請求項１記載の組成物ヘモグロビンを溶液中でカルボキシヘモグロビンに変換する；ヘモグロビン溶液を低温殺菌し、非ヘム蛋白質を変性させて沈殿させる；溶液からリン脂質及び沈殿した非ヘム蛋白質を除去する；ヘモグロビン溶液から内毒素を除去する；溶液を濃縮する；カルボキシヘモグロビンを濃厚溶液中でo-ＡＴＰにより、主として分子内架橋させる；カルボキシヘモグロビンをo-アデノシンにより、主として分子間架橋させる；架橋ヘモグロビン溶液にグルタチオンを添加し、o-アデノシン架橋反応を停止させる；そして架橋カルボキシヘモグロビンを溶液中で架橋オキシヘモグロビンに変換する。２２．人工血液として用いるのに適した組成物を調製するための、下記よりなる方法ヘモグロビンを溶液中でカルボキシヘモグロビンに変換する；カルボキシヘモグロビン溶液を濃縮する；カルボキシヘモグロビンを濃厚溶液中でo-ＡＴＰにより、主として分子内架橋させる；カルボキシヘモグロビンを溶液中でo-アデノシンにより、主として分子間架橋させる；カルボキシヘモグロビン／o-アデノシン溶液にグルタチオンを添加し、o-アデノシン架橋反応を停止させる；架橋カルボキシヘモグロビンを架橋オキシヘモグロビンに変換する；そして電解質の不在下で、薬剤学的に受容しうる架橋オキシヘモグロビンの架橋水溶液を調製する。２３．さらに水溶液に電解質及び／又はマンニトールを添加することよりなる、請求項２２記載の方法。２４．精製ヘモグロビン溶液が全血から下記により得られる、請求項２２記載の方法：全血を白血球と赤血球の混合物、血小板、及び血漿に分離する；こうして得られた白血球と赤血球の混合物を水溶液中に懸濁する；白血球と赤血球の溶液を冷却して白血球を凝集させる；白血球凝集体を除去する；実質的に白血球を含まない赤血球懸濁液を低張溶液に対して透析し、赤血球からヘモグロビンを抽出し、ヘモグロビン溶液を得る；高静水圧下で限外濾過することによって、ヘモグロビン溶液から赤血球を分離する；抽出したヘモグロビンを溶液中でカルボキシヘモグロビンに変換する；ヘモグロビン溶液を低温殺菌し、非ヘム蛋白質を変性させて沈殿させる；溶液からリン脂質及び沈殿した非ヘム蛋白質を除去する；そしてヘモグロビン溶液からアフィニティー・クロマトグラフィーにより内毒素を除去する。２５．ヘモグロビンを得る全血がウシ血液からなる、請求項２２記載の方法。【手続補正書】【提出日】平成１０年１２月１１日（１９９８．１２．１１）【補正内容】請求の範囲１．ｏ−ＡＴＰ及びｏ−アデノシンと反応させて架橋ヘモグロビンを形成し、さらに還元グルタチオンと反応させた、実質的に発熱性物質を含まず、微生物を含まない活性ヘモグロビンからなる組成物であって；ｏ−ＡＴＰが過ヨウ素酸酸化ＡＴＰからなり、ｏ−アデノシンが過ヨウ素酸酸化アデノシンからなり；ヘモグロビンが該ｏ−ＡＴＰによって分子内架橋し、かつ、該ｏ−アデノシンによって分子間架橋し；ヘモグロビン、ｏ−ＡＴＰ、ｏ−アデノシン及びグルタチオンが約１：３：１０：２０のモル比で反応している組成物。２．溶液がさらに非電解質を含む、請求項１記載の改良された人工血液。３．架橋ヘモグロビンが約１３０から約３９０キロダルトンの分子量を有する、請求項１記載の組成物。４．約５％未満のヘモグロビンがメトヘモグロビンからなる、請求項１記載の組成物。５．ヘモグロビンがウシヘモグロビンからなる、請求項１記載の組成物。６．下記よりなる方法により調製された、請求項１記載の組成物：ヘモグロビンを溶液中でカルボキシヘモグロビンに変換する；ヘモグロビン溶液を低温殺菌し、非ヘム蛋白質を変性させて沈殿させる；溶液からリン脂質及び沈殿した非ヘム蛋白質を除去する；ヘモグロビン溶液から内毒素を除去する；溶液を濃縮する；カルボキシヘモグロビンを濃厚溶液中でｏ−ＡＴＰにより、主として分子内架橋させる；カルボキシヘモグロビンをｏ−アデノシンにより、主として分子間架橋させる；架橋ヘモグロビン溶液にグルタチオンを添加し、ｏ−アデノシン架橋反応を停止させる；そして架橋カルボキシヘモグロビンを溶液中で架橋オキシヘモグロビンに変換する。７．ヘモグロビン溶液が下記により得られる、請求項６記載の組成物：全血を白血球と赤血球の混合物、血小板、及び血漿に分離する；こうして得られた白血球と赤血球の混合物を水溶液中に懸濁する；白血球と赤血球の溶液を冷却して白血球を凝集させ、そして白血球凝集体を除去する；実質的に白血球を含まない赤血球懸濁液を低張溶液に対して透析し、赤血球からヘモグロビンを抽出し、ヘモグロビン溶液を得る；そして高静水圧下で限外濾過することによって、ヘモグロビン溶液から赤血球を分離する。８．請求項１記載の組成物；及び薬剤学的に受容しうる水溶液を含む人工血液。９．溶液が非電解質水溶液である、請求項８記載の人工血液。１０．架橋ヘモグロビンが水溶液に溶解される、請求項８記載の人工血液。１１．溶液のデシリットル当たり約７．５〜１５ｇの請求項１記載の組成物を含む、請求項８記載の人工血液。１２．血液交換を必要とするヒトを処置するための医薬組成物であって、目的とする効果を達成するのに有効な量の請求項９記載の組成物を含む組成物。１３．ヒトが急性失血を伴う、請求項１２記載の組成物。１４．ヒトが鎌状赤血球化による鎌状赤血球貧血の発症を伴う、請求項１２記載の組成物。１５．人工血液の投与量がヒトの全血液量の約３３〜１００％である、請求項１２記載の組成物。１６．血液量の回復を必要とするヒトの血液量を回復するための医薬組成物であって、目的とする効果を達成するのに有効な量の請求項９記載の組成物を含む組成物。１７．ヒトが鎌状赤血球貧血の発症を伴う、請求項１６記載の組成物。１８．ヒトが急性失血を伴う、請求項１６記載の組成物。１９．人工血液として用いるのに適した組成物を調製するための、下記よりなる方法：ヘモグロビンを溶液中でカルボキシヘモグロビンに変換する；カルボキシヘモグロビン溶液を濃縮する；カルボキシヘモグロビンを濃厚溶液中でｏ−ＡＴＰにより、主として分子内架橋させる；カルボキシヘモグロビンを溶液中でｏ−アデノシンにより、主として分子間架橋させる；カルボキシヘモグロビン／ｏ−アデノシン溶液にグルタチオンを添加し、ｏ− アデノシン架橋反応を停止させる；架橋カルボキシヘモグロビンを架橋オキシヘモグロビンに変換する；そして電解質の不在下で、薬剤学的に受容しうる架橋オキシヘモグロビンの架橋水溶液を調製する。２０．さらに、水溶液の形成中またはその後に水溶液に電解質及び／又はマンニトールを添加することよりなる、請求項１９記載の方法。２１．精製ヘモグロビンが全血から下記により得られる、請求項１９記載の方法：全血を白血球と赤血球の混合物、血小板、及び血漿に分離する；こうして得られた白血球と赤血球の混合物を水溶液中に懸濁する；白血球と赤血球の溶液を冷却して白血球を凝集させる；白血球凝集体を除去する；実質的に白血球を含まない赤血球懸濁液を低張溶液に対して透析し、赤血球からヘモグロビンを抽出し、ヘモグロビン溶液を得る；高静水圧下で限外濾過することによって、ヘモグロビン溶液から赤血球を分離する；抽出したヘモグロビンを溶液中でカルボキシヘモグロビンに変換する；ヘモグロビン溶液を低温殺菌し、非ヘム蛋白質を変性させて沈殿させる；溶液からリン脂質及び沈殿した非ヘム蛋白質を除去する；そしてヘモグロビン溶液からアフィニティー・クロマトグラフィーにより内毒素を除去する。２２．ヘモグロビンを得る全血がウシ血液からなる、請求項１９記載の方法。２３．請求項２２記載の方法により調製された、精製ヘモグロビン組成物。２４．鎌状赤血球化による鎌状赤血球貧血の発症を伴うヒトの処置のための医薬組成物であって、症状を軽減するのに有効な量の請求項６記載の人工血液を含む組成物。

Claims

【特許請求の範囲】１．o-AＴＰ及びo-アデノシンと反応させて架橋ヘモグロビンを形成した、実質的に発熱性物質を含まず、微生物を含まない活性ヘモグロビンからなる組成物。２．架橋ヘモグロビンをさらに還元グルタチオンと反応させた、請求項１記載の組成物。３．o-ATPが過ヨウ素酸酸化ＡＴＰからなり、o-アデノシンが過ヨウ素酸酸化アデノシンからなり；ヘモグロビンが過ヨウ素酸酸化ＡＴＰによって分子内架橋し、かつ、過ヨウ素酸酸化アデノシンによって分子間架橋し、ポリヘモグロビンを形成している、請求項１記載の組成物。４．溶液がさらに非電解質を含む、請求項３記載の改良された人工血液。５．ヘモグロビン、o-ＡＴＰ、o-アデノシン及びグルタチオンが約１:３:10:20 のモル比で反応している、請求項１記載の組成物。６．架橋ヘモグロビンが約130から約390キロダルトンの分子量を有する、請求項１記載の組成物。７．約５％未満のヘモグロビンがメトヘモグロビンからなる、請求項１記載の組成物。８．ヘモグロビンがウシヘモグロビンからなる、請求項１記載の組成物。９．下記よりなる方法により調製された、請求項１記載の組成物：ヘモグロビンを溶液中でカルボキシヘモグロビンに変換する；ヘモグロビン溶液を低温殺菌し、非ヘム蛋白質を変性させて沈殿させる；溶液からリン脂質及び沈殿した非ヘム蛋白質を除去する；ヘモグロビン溶液から内毒素を除去する；溶液を濃縮する；カルボキシヘモグロビンを濃厚溶液中でo-ＡＴＰにより、主として分子内架橋させる；カルボキシヘモグロビンをo-アデノシンにより、主として分子間架橋させる；架橋ヘモグロビン溶液にグルタチオンを添加し、o-アデノシン架橋反応を停止させる；そして架橋カルボキシヘモグロビンを溶液中で架橋オキシヘモグロビンに変換する。１０．ヘモグロビン溶液が下記により得られる、請求項９記載の組成物：全血を白血球と赤血球の混合物、血小板、及び血漿に分離する；こうして得られた白血球と赤血球の混合物を水溶液中に懸濁する；白血球と赤血球の溶液を冷却して白血球を凝集させ、そして白血球凝集体を除去する；実質的に白血球を含まない赤血球懸濁液を低張溶液に対して透析し、赤血球からヘモグロビンを抽出し、ヘモグロビン溶液を得る；そして高静水圧下で限外濾過することによって、ヘモグロビン溶液から赤血球を分離する。１１．請求項１記載の組成物；及び薬剤学的に受容しうる水溶液を含む人工血液。１２．溶液が非電解質水溶液である、請求項１１記載の人工血液。１３．架橋ヘモグロビンが水溶液に溶解される、請求項１１記載の人工血液。１４．溶液のリットル当たり約7.5〜15gの請求項１記載の組成物を含む、請求項１１記載の人工血液。１５．血液交換を必要とするヒトを処置する方法であって、目的とする効果を達成するのに有効な量の請求項１２記載の組成物をヒトに静脈内投与することよりなる方法。１６．ヒトが急性失血を伴う、請求項１５記載の方法。１７．ヒトが鎌状赤血球化による鎌状赤血球貧血の発症を伴う、請求項１５記載の方法。１８．人工血液の投与量がヒトの全血液量の約33〜100％である、請求項１５記載の方法。１９．血液量の回復を必要とするヒトの血液量を回復する方法であって、目的とする効果を達成するのに有効な量の請求項１２記載の組成物をヒトに静脈内投与することよりなる方法。２０．ヒトが鎌状赤血球貧血の発症を伴う、請求項１９記載の方法。２１．ヒトが急性失血を伴う、請求項１９記載の方法。２２．人工血液として用いるのに適した組成物を調製するための、下記よりなる方法：ヘモグロビンを溶液中でカルボキシヘモグロビンに変換する；カルボキシヘモグロビン溶液を濃縮する；カルボキシヘモグロビンを濃厚溶液中でo-ATPにより、主として分子内架橋させる；カルボキシヘモグロビンを溶液中でo-アデノシンにより、主として分子間架橋させる；カルボキシヘモグロビン／o-アデノシン溶液にグルタチオンを添加し、o-アデノシン架橋反応を停止させる；架橋カルボキシヘモグロビンを架橋オキシヘモグロビンに変換する；そして電解質の不在下で、薬剤学的に受容しうる架橋オキシヘモグロビンの架橋水溶液を調製する。２３．さらに水溶液に電解質及び／又はマンニトールを添加することよりなる、請求項２２記載の方法。２４．精製ヘモグロビン溶液が全血から下記により得られる、請求項２２記載の方法：全血を白血球と赤血球の混合物、血小板、及び血漿に分離する；こうして得られた白血球と赤血球の混合物を水溶液中に懸濁する；白血球と赤血球の溶液を冷却して白血球を凝集させる；白血球凝集体を除去する；実質的に白血球を含まない赤血球懸濁液を低張溶液に対して透析し、赤血球からヘモグロビンを抽出し、ヘモグロビン溶液を得る；高静水圧下で限外濾過することによって、ヘモグロビン溶液から赤血球を分離する；抽出したヘモグロビンを溶液中でカルボキシヘモグロビンに変換する；ヘモグロビン溶液を低温殺菌し、非ヘム蛋白質を変性させて沈殿させる；溶液からリン脂質及び沈殿した非ヘム蛋白質を除去する；そしてヘモグロビン溶液からアフィニティー・クロマトグラフィーにより内毒素を除去する。２５．ヘモグロビンを得る全血がウシ血液からなる、請求項２２記載の方法。２６．請求項２５記載の方法により調製された、精製ヘモグロビン組成物。２７．鎌状赤血球化による鎌状赤血球貧血の発症を伴うヒトを処置する方法であって、症状を軽減するのに有効な量の請求項９記載の人工血液をヒトに静脈内投与することよりなる方法。