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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Gegenstand
der Erfindung sind aus Polysaccharid-Derivaten gebildete partikuläre Arzneimittelträger. Ein
Polysaccharid, das mindestens eine nichtionische hydrophile Gruppe
trägt,
die an die einzelnen Monosaccharid-Einheiten gebunden ist, wird
zur Bildung eines Derivats, das mindestens einen langkettigen Alkylrest trägt, hydrophobisiert.
Die Partikelbildung wird dann in Gegenwart von Cholesterin induziert.
Die Partikel sind zum Einschluss oder zur Konjugation pharmazeutisch
aktiver Bestandteile geeignet.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Chitosan
(N-deacetyliertes Chitin) wurde als ein Arzneimittelabgabemittel
untersucht, als es zu vernetzten Mikrosphären (Thanoo et al., J. Pharma.
Pharmacol., 1992, 44, 283–286)
und als eine Beschichtung für
Liposomen (Henriksen et al., Int. J. Pharm., 1994, 101, 227–236) verarbeitet
wurde. Chitosan-Lösungen wurden
auch als Penetrations-Enhancer (Aspden et al., Eur. J. Pharm. Sci.,
1996, 4, 23–32)
verwendet.
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Yoshioka
et al. (Biosci. Biotech. Biochem., 1993, 57, 1053–1057) haben
gezeigt, dass die Präzipitation (beim
Stehen) einer aus hydriertem Eigelb-Lecithin hergestellten Liposomen-Suspension
durch Behandlung der Suspension mit einer wässrigen Lösung aus sulfatiertem N-Myristoylchitosan
(S-M-Chitosan) verhindert werden konnte. Dieses Ergebnis wird durch
die Oberfläche
der Liposomen erklärt,
die mit S-M-Chitosan beschichtet sind, wobei die Ionisierung der
Sulfatgruppe zu einer negativen Ladung an den Liposomen führt. Dies wiederum
führt zur
Abstoßung
zwischen den Liposomen-Partikeln und verhindert die Präzipitation.
Es wurde festgestellt, dass das Beschichtungsverfahren die Lipid-Doppelschicht
nicht zerstört.
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In
jüngerer
Zeit hat die gleiche Gruppe (in Biosci. Biotech. Biochem., 1995,
59, 1901–1904)
die Eigenschaften wässriger
Lösungen
von Chitosan-Derivaten, nämlich
sulfatiertem N-Acylchitosan (S-Cn-Chitosan) mit
unterschiedlichen Alkylkettenlängen
untersucht. S-Cn-Chitosane aus C2 bis C14 lösten sich
zur Bildung transparenter Lösungen
vollkommen in Wasser auf. Es wurde auch S-C16-Chitosan
hergestellt, seine Eigenschaften wurden aber nicht untersucht, da
das gebildete wässrige
Gemisch nicht transparent war und die Annahme bestand, dass ein
Aggregat, wie zum Beispiel ein Flüssigkristall gebildet wurde.
Die Solubilisierungskapazität
der wässrigen
S-Cn-Chitosan-Lösungen in Richtung einer hydrophoben
Substanz (Azobenzen) wurde untersucht, und es wurde festgestellt,
dass die Löslichkeit
mit zunehmender Kohlenstoffzahl über
C10 scharf zunahm. Die Autoren folgerten
daraus, dass die langen Alkylketten zur Bildung von Micellen, die
zum Auflösen der
Azobenzen-Moleküle
fähig sind,
aggregiert wurden. Die gebildeten Micellen werden als „Polymer-Micellen" beschrieben, obwohl
der gebildete Micellentyp nicht ermittelt wurde. Die „Polymer-Micellen" werden zur Verwendung
als Arzneimittelträger
vorgeschlagen.
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Sunamoto
et al. (Chem. Lett., 1991, 1263–1266)
haben berichtet, dass Palmitoyl- oder Cholesterin-substituierte
Derivate von Polysacchariden, wie zum Beispiel Pullulan, Amylopectin
und Dextran in wässriger
Lösung
Selbstaggregate bilden. Es wird über
ein an 5,4 Palmitoyl-Gruppen pro 100 Glucoseeinheiten substituiertes
Palmitoyl-Pullulan-Derivat zusammen mit Cholesterin-substituierten
Pullulanen mit unterschiedlichen Substitutionsgraden berichtet.
Die Untersuchung der Interaktion zwischen den Pullulan-Derivaten
und einer Fluoreszenz-Sonde zeigte, dass die Pullulan-Derivate über einer
kritischen Konzentration Polymer-Selbstaggregate bildeten. Die treibende
Kraft für
die Aggregation wird einer hydrophoben Interaktion zwischen hydrophoben
Teilen zugeschrieben, und es wird bemerkt, dass die Palmitoyl-Gruppe
bei der Bildung der Selbstaggregate weniger wirksam war. Es wird
beschrieben, dass die Aggregate die Kapazität besitzen, verschiedene Substanzen,
wie zum Beispiel Arzneimittel, Proteine und Nukleinsäuren, durch
hydrophobe Interaktion einzukapseln.
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Die
gleiche Gruppe berichtet auch (in Macromolecules, 1993, 26, 3062–3068) über die
Synthese und Lösungseigenschaften
eines nichtionischen Cholesterin-modifizierten Pullulan-Derivates
(CHP) in Wasser. In dieser Arbeit wurde Pullulan durch 1,6 Cholesteringruppen
pro 100 Anhydroglucosid-Einheiten substituiert. Die Autoren geben
an, dass es sich bei den gebildeten CHP-Selbstaggregaten um relativ
monodisperse Partikel handelt, und es wird vorgeschlagen, dass ein
CHP-Selbstaggregat aus ca. 13 CHP-Molekülen besteht. Experimentelle
Daten weisen darauf hin, dass der hydrophobe Kern der CHP-Aggregate
vollständig
und stabil vom hydrophilen Mantel des Polysaccharidgerüsts bedeckt
ist, wobei über
der kritischen Konzentration kolloidal stabile Nanopartikel gebildet
werden. Die Bindung von verschiedenen Fluoreszenz-Sonden wurde untersucht, und
es wurde gezeigt, dass sie mit einer Zunahme der Hydrophobie der
Sonde zunimmt. Daraus wird deshalb gefolgert, dass es sich bei der
wichtigsten treibenden Kraft für
die Komplexbildung um eine hydrophobe Interaktion handelt.
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Diese
Forschungsarbeiten haben (in Chem. Lett., 1995, 707–708) weiter
die Komplexbildung des Hydrogel-Nanopartikels beschrieben, der durch
Selbstassemblierung von CHP mit 5–10 Insulin-Monomeren in Wasser
gebildet wurde. Die Zahl komplexierter Insulin-Moleküle nahm
mit einer Zunahme des Substitutionsgrades der Cholesteringruppe
von CHP zu. Es wird angegeben, dass Insulin tief im Inneren der
amphiphilen Hydrogel-Matrix des Nanopartikels, worin die hydrophobe
Mikrodomäne
des assoziierenden Cholesterins nicht kovalente Vernetzungen der
Gelstruktur bildet, komplexiert ist. Die Zahl der Vernetzungen eines
Nanopartikels nimmt mit einer Zunahme der Zahl des Substitutionsgrades
von Cholesterin zu, was zu einer Zunahme des Bindungsortes für Insulin
führt.
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Die
gleiche Gruppe berichtet (in J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 6110–6115) schließlich über eine
Studie zur Komplexbildung zwischen dem CHP-Selbstaggregat und bovinem
Serumalbumin (BSA). In allen Fällen wurde
ca. ein BSA-Molekül
durch einen Nanopartikel des CHP-Selbstaggregats, ungeachtet der
Struktur des CHP-Selbstaggregats, komplexiert. Das Entfalten von
BSA durch thermische Mittel oder durch ein Denaturierungsmittel,
wie zum Beispiel Harnstoff, wurde bei der Komplexbildung größtenteils
unterdrückt.
Diese Stabilisierung von BSA bei der Komplexbildung wird der Bildung
mehrfacher nicht kovalenter Interaktionen zwischen BSA und dem Hydrogel
des CHP-Selbstaggregats zugeschrieben.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Es
wird erfindungsgemäß eine pharmazeutische
Zusammensetzung bereitgestellt, umfassend Partikel, wobei die Partikel
lineare Polysaccharid-Derivate umfassen, die mindestens eine nichtionische
hydrophile Gruppe und mindestens eine hydrophobe Gruppe pro Molekül tragen
und einen pharmazeutisch verträglichen Träger, worin
die hydrophile Gruppe an die einzelnen Monosaccharid-Einheiten des
Polysaccharid-Moleküls gebunden
ist und die hydrophobe Gruppe an eine Monosaccharid-Einheit des Polysaccharid-Moleküls gebunden
ist, und worin die hydrophobe Gruppe einen C12-24-Alkyl-,
-Alkenyl-, -Alkinyl- oder -Acylrest umfasst.
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Die
nichtionische hydrophile Gruppe ist bevorzugt eine Gruppe der Formel
R1, worin R1 ausgewählt ist aus:
Mono- und Oligo-hydroxy-C1-4-alkyl, Mono-
und Oligo-hydroxy-substituiertem C2-6-Acyl, C1-2-Alkoxyalkyl mit
optional einer oder mehreren Hydroxygruppe(n) substituiert an den
Alkoxy- oder Alkylen-Gruppen,
Oligo- oder Poly-(oxa-C1-3-alkylen), bevorzugt
Polyoxyethylen, umfassend bis zu ca. 120 Ethylenoxid-Einheiten (d.
h. bis zu einem Molekulargewicht von 5000) und C1-4-Alkyl(oligo-
oder poly-oxa-C1-3-alkylen), optional Hydroxy-substituiert,
bevorzugt Oligo- oder Polyglycerolether, wie zum Beispiel die, die
in GB-A-1,529,625 beschrieben sind, die zum Beispiel bis zu 10 Glycerol-Einheiten
enthalten; und worin R1 über eine Ether-Verknüpfung mit
einer Saccharid-Einheit des Polysaccharids verbunden ist. Man sollte
hierin zur Kenntnis nehmen, dass der Begriff Acyl sowohl Alkenoyl-
und Alkinoyl-Gruppen als auch Alkanoyl-Gruppen einschließt.
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Bei
der Anforderung, dass es sich bei der hydrophilen Gruppe um eine
nichtionische handelt, ist ein wichtiges Merkmal, da eine geladene
ionische Gruppe, wie zum Beispiel Sulfat, die anionische DNA, die – in einer
Ausführungsform – mit den
Partikeln als ein Mittel zur Genabgabe oder -vakzination assoziiert
ist, abstoßen
würde.
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Das
Polysaccharid-Derivat ist bevorzugt ein Derivat von Chitosan, Pullulan
oder Dextran und umfasst am bevorzugtesten 1,4-verknüpfte Saccharid-Einheiten.
Die Substitution durch den nichtionischen hydrophilen Teil tritt
in der Regel an der C6-Position einer Saccharid-Einheit
auf.
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Die
hydrophobe Gruppe ist bevorzugt durch eine Amid-, Ester-, Ether-
oder Amin-Verknüpfung,
am bevorzugtesten durch eine Amid-Verknüpfung mit einer Saccharid-Einheit
verbunden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist diese Gruppe
an der C2-Position in einer 1,4-verknüpften Saccharid-Einheit substituiert.
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Die
Verbindung besitzt einen Grad der Substitution durch nichtionische
hydrophile Gruppen im Bereich von 0,1–1,5, bevorzugt größer als
0,9 und am bevorzugtesten 1 pro Saccharid-Einheit.
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Das
Verhältnis
von hydrophilen : hydrophoben Gruppen in den erfindungsgemäßen Verbindungen
liegt im Bereich von 100 : 1 bis 1 : 2, bevorzugt zwischen 10 :
1 und 2 : 1, bevorzugter 5 : 1 und 2 : 1. Es wurde festgestellt,
dass Verbindungen mit einem Grad der hydrophoben Substitution von
0,5 oder darüber
pro hydrophile Gruppe aufgrund der hohen hydrophoben Belastung,
schwer zu dispergieren sind. Verbindungen mit einem Substitutionsgrad
von 0,25 oder weniger sind folglich bevorzugt.
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Eine
bevorzugte erfindungsgemäße Reihe
von Verbindungen sind die N-substituierten Derivate von Polyaminoglykanen,
am bevorzugtesten N-Acylglykol-chitosanen, insbesondere N-Palmitoylglykolchitosan (Poly[β(1→4)-2-deoxy-2-hexadecanamido-6-0-(2-hydroxyethyl)-D-glucopyranose]. In
diesem Fall ist die Anwesenheit freier Aminogruppen vom Standpunkt
des Zulassens der Komplexbildung mit anionischer DNA her gesehen,
vorteilhaft. Solche Gruppen könnten
außerdem
zur Konjugation von Arzneimittel-Molekülen verwendet werden.
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Es
ist erfindungsgemäß weiter
eine Zusammensetzung vorgesehen, umfassend Partikel, die aus einer Verbindung
mit der folgenden Formel gebildet sind:
worin jedes R
1 ausgewählt ist
aus: Wasserstoff, Mono- und Oligo-hydroxy-C
1-6-alkyl,
Mono- und Oligo-hydroxy-substituiertem C
2-6-Acyl,
C
1-2-Alkoxyalkyl, optional mit einer oder
mehreren Hydroxygruppe(n) substituiert an den Alkoxy- oder Alkylengruppen,
Oligo- oder Poly-(oxa-C
1-3-alkylen), wie
zum Beispiel Polyoxyethylen umfassend bis zu ca. 120 Ethylenoxid-Einheiten
und C
1-4-Alkyl(oligo- oder poly-oxa-C
1-3-alkylen),
optional Hydroxy-substituiert, wie zum Beispiel Polyglycerolether,
die zum Beispiel bis zu 10 Glycerol-Einheiten enthalten, vorausgesetzt,
dass mindestens eine der Gruppen R
1 nicht
Wasserstoff ist;
A für
-NH- oder -O- steht;
jedes R
2 aus Wasserstoff,
C
12-24-Alkyl, -Alkanoyl, -Alkenyl, -Alkenoyl,
-Alkinyl oder -Alkinoyl ausgewählt
ist, vorausgesetzt dass mindestens eine der Gruppen R
2 nicht
Wasserstoff ist; und
n für
5–2000
steht.
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Die
Gruppe R1 weist bevorzugt die Formel -CH2CH2OH oder -CH2CH(OH)CH2OH auf,
R2 steht für C16-18-Acyl
und A steht für
-NH-.
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In
einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt
ist auch ein Polysaccharid-Derivat bereitgestellt, das mindestens
eine nichtionische hydrophile Gruppe und mindestens eine hydrophobe
Gruppe pro Polysaccharid-Molekül
trägt,
worin die hydrophile Gruppe an der C6-Position
einer Monosaccharid-Einheit des Polysaccharid-Moleküls über eine
Amid-Verknüpfung
oder Amin-Verknüpfung
substituiert ist und die hydrophobe Gruppe an der C2-Position
einer Monosaccharid-Einheit des Polysaccharid-Moleküls über eine
Amid-Verknüpfung
oder Amin-Verknüpfung
substituiert ist und worin die hydrophobe Gruppe einen C12-24-Alkyl-, -Akenyl-, -Alkinyl- oder -Acyl-Rest
umfasst.
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In
einem noch weiteren erfindungsgemäßen Aspekt ist ein Polysaccharid-Derivat
bereitgestellt, das mindestens eine nichtionische hydrophile Gruppe
und mindestens eine hydrophobe Gruppe pro Polysaccharid-Molekül zur Verwendung
in der Therapie trägt,
worin die hydrophile Gruppe an eine Monosaccharid-Einheit des Polysaccharid-Moleküls gebunden
ist und die hydrophobe Gruppe an eine Monosaccharid-Einheit des
Polysaccharid-Moleküls
gebunden ist und worin die hydrophobe Gruppe einen C12-24-Alkyl-,
-Alkenyl-, -Alkinyl- oder -Acyl-Rest umfasst.
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In
einem noch weiteren erfindungsgemäßen Aspekt ist die Verwendung
eines Polysaccharid-Derivats bereitgestellt,
das mindestens eine nichtionische hydrophile Gruppe und mindestens
eine hydrophobe Gruppe pro Polysaccharid-Molekül zur Herstellung eines Medikamentes
zur Verwendung in der Therapie trägt, worin die hydrophile Gruppe
an eine Monosaccharid-Einheit des Polysaccharid-Moleküls gebunden ist und die hydrophobe
Gruppe an eine Monosaccharid-Einheit des Polysaccharid- Moleküls gebunden
ist und worin die hydrophobe Gruppe einen C12-24-Alkyl-,
-Alkenyl-, -Akinyl- oder -Acyl-Rest umfasst.
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Die
Verbindungen können
gemäß jedwedem
im Stand der Technik für
die Derivatisierung von Polysacchariden beschriebenen Standardverfahren
gebildet werden (siehe zum Beispiel die Referenzen von Yoshioka et
al., op cit.). Das Verfahren kann die Derivatisierung eines Polysaccharid-Ausgangsmaterials
durch eine hydrophile Gruppe in einem ersten Schritt, gefolgt von
einem zweiten Schritt, umfassend die Bindung einer hydrophoben Gruppe
oder umgekehrt, beinhalten. Als Alternative können kommerziell erhältliche
Polysaccharid-Derivate, die bereits eine hydrophile Gruppe besitzen,
unter Verwendung von Standardverfahren zur Bildung einer erfindungsgemäßen Verbindung
hydrophobisiert werden.
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Die
beschriebenen Verbindungen werden in Kombination mit Cholesterin
oder einem Derivat davon zur Bildung von Partikeln verwendet. In
Abwesenheit von Cholesterin tritt die Partikelbildung nicht auf
und das Material präzipitiert.
Die Anwesenheit von Cholesterin ist folglich zur Förderung
der Selbstassemblierung der Polysaccharid-Derivate zur Bildung von
Partikeln erforderlich.
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Die
Partikel werden mittels Verfahren ähnlich denen hergestellt, die
zur Bildung von Liposomen und Niosomen, zum Beispiel durch Mischen
der Verbindungen in einem organischen Lösungsmittel und dann Kontaktieren
des getrockneten Gemischs mit einer wässrigen Lösung, optional gefolgt von
einem Schritt zur Reduktion der Partikelgrößen, verwendet werden.
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Die
gebildeten Partikel können
in einem wässrigen
Vehikel suspendiert werden oder können als Alternative im Trockenzustand
isoliert werden. Die Partikel können
optional einen sterischen Stabilisator, zum Beispiel eine nichtionische
amphiphile Verbindung, bevorzugt einen Poly-24-oxyethylen-cholesterylether,
inkorporieren. Die Partikel können
mikro- oder nanopartikulär
sein, wobei Nanopartikel bevorzugt in Gegenwart des sterischen Stabilisators
gebildet werden. In diesem Fall wird der sterische Stabilisator
in die Struktur des Partikels inkorporiert.
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Die
Partikel umfassen bevorzugt auch einen assoziierten pharmazeutisch
aktiven Bestandteil. Der Wirkstoff kann wasserlöslich sein, in welchem Fall
er mit den hydrophilen Regionen des Partikels assoziiert ist, oder
wasserunlöslich
und folglich mit den hydrophoben Regionen der Partikel assoziiert
ist.
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Ein
derartiger Bestandteil ist bevorzugt physikalisch in dem Partikel
eingeschlossen, kann aber auch durch kovalente Konjugation gehalten
werden. Der pharmazeutisch aktive Bestandteil kann eine therapeutische
Peptid- oder Proteinverbindung sein. Eine weitere bevorzugte Alternative
für die
pharmazeutisch aktive Verbindung ist Nukleinsäure (z. B. DNA), bevorzugt
in der Form eines Gens zur Gentherapie oder Vakzinierung mit einem
Gen.
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Diese
Arzneimittelträger
können
zur Behandlung eines Menschen oder Tieres mittels Therapie, insbesondere
zur oralen Arzneimittelabgabe von Peptiden oder Proteinen oder als
Genabgabevektoren verwendet werden. Es wird angenommen, dass dieses
Arzneimittelabgabesystem auch geeignet ist, wenn es über die intravenösen, intramuskulären, intraperitonealen
oder topischen Wege (Inhalation, intranasal, Applikation auf die
Haut) verwendet wird.
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Die
neuen erfindungsgemäßen Verbindungen
können
auch zur Beschichtung von vorgeformten Liposomen oder Niosomen,
die zum Beispiel in einem wässrigen
Träger
suspendierte Arzneimittelträger
sind, verwendet werden.
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Die
Erfindung wird nun weiter unter Bezugnahme auf die folgenden nicht
einschränkenden
Beispiele erläutert,
worin der wässrige
Fluoreszenz-Marker 5(6)-Carboxyfluoreszein (CF) als ein Modellarzneimittel
und unter Bezugnahme auf die Figuren verwendet wird, worin:
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1 die Stabilität von auf
Bleomycin-GCP41 basierenden Vesikeln nach Lagerung bei 4°C (•,
und Raumtemperatur
bei 16–25°C (o, ☐)
zeigt.
, ☐ =
Einkapselung (%), •o
= mittlere Größe. Datenpunkte
= Mittelwert ± SD,
n = 3;
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2 die Freisetzung von 5(6)-Carboxyfluoreszein
aus GCP41-, Cholesterin-Vesikeln zeigt. Datenpunkte = Mittelwert
von 3 Bestimmungen. Δ =
auf Palmitoylglykolchitosan basierende Vesikel (Mittelwert ± SD, n
= 6),
=
Spanne von 60 Vesikeln (Mittelwert, n = 3), ♦ = 5(6)-Carboxyfluoreszein-Lösung;
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3 die Biokompatibilität von auf
GCP41 basierenden Vesikeln gegen 3 Zelllinien,
=
A549, • = A431,
=
A2780 zeigt. Datenpunkte = Mittelwert ± SD, n = 3; und ...
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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BEISPIEL 1
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SYNTHESE VON N-PALMITOYLGLYKOLCHITOSAN
(Poly[β(1→4)-2-deoxy-2-hexadecanamid-6-0-(2-hydroxyethyl)-D-glucopyranose]
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a) GCP41 (initiales Verhältnis von
Glykolchitosan : Palmitoyl-Einheiten (4 : 1))
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200
mg Glykolchitosan (GC) und 150 mg Natriumbicarbonat wurden in 35
ml Wasser aufgelöst.
Es wurden 10 ml absolutes Ethanol zugefügt, gefolgt von einer tropfenweisen
Zugabe einer Lösung
aus 79 mg Palmitoyl-N-hydroxysuccinimidester, aufgelöst in 60
ml absolutem Ethanol. Das Zufügen
des Palmitoyl-N-hydroxysuccinimidesters wurde unter Rühren über 30 Minuten
durchgeführt.
Das Reaktionsgemisch war initial trüb, wurde aber nach ca. 1 h
klar. Das Reaktionsgemisch wurde 72 h gerührt.
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Nach
dieser Zeit wurden 100 ml Aceton unter Bildung eines leichten Präzipitats
zugefügt.
Dieses Gemisch wurde zu einem reduzierten Volumen unter reduziertem
Druck bei 60°C
verdampft. Die resultierende Flüssigkeit
wurde mit 3 Volumen Ether extrahiert und 24 h erschöpfend gegen
Wasser dialysiert. Das dialysierte Gemisch wurde gefriergetrocknet,
um eine weiße,
lockere, watteartige Substanz zu ergeben.
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b) GCP21 (initiales Verhältnis von
Glykolchitosan : Palmitoyl-Einheiten (2 : 1))
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200
mg Glykolchitosan (GC) und 150 mg Natriumbicarbonat wurden in 35
ml Wasser aufgelöst.
10 ml absolutes Ethanol wurden zugefügt, gefolgt von einer tropfenweise
Zugabe einer Lösung
aus 150 mg Palmitoyl-N-hydroxysuccinimidester, aufgelöst in 120
ml absolutem Ethanol. Das Zufügen
des Palmitoyl-N-hydroxysuccinimidesters wurde unter Rühren über 30 Minuten
durchgeführt.
Das Reaktionsgemisch war initial trüb, wurde aber nach ca. 6 h
klar. Das Reaktionsgemisch wurde 72 h rühren lassen. Nach dieser Zeit
wurden 100 ml Aceton unter Bildung eines leichten Präzipitats
zugefügt.
Dieses Gemisch wurde dann zu einem reduzierten Volumen unter reduziertem
Druck bei 60°C
verdampft. Die resultierende Flüssigkeit
wurde mit 3 Volumen Diethylether extrahiert und 24 h erschöpfend gegen
Wasser dialysiert. Das dialysierte Gemisch wurde zu einer weißen, lockeren,
watteartigen Substanz gefriergetrocknet. Diese wurde mit Wasser
gewaschen und die klebrige Masse gefriergetrocknet, um eine lockere,
watteartige Substanz zu ergeben.
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c) Charakterisierung von
GCP41
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1H-NMR
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Glykolchitosan
ist in Wasser mäßig löslich (2
mg ml–1),
und es wurden am Glykolchitosan in (D2O,
Sigma Chemical Co., UK) und GCP41 in einem CD3OD/D2O-Gemisch unter Verwendung eines Bruker
AMZ 400 MHz 1H-NMR- (mit Integration) und 1H,1H-COSY-Experimente
durchgeführt,
um die nicht austauschbar gekoppelten Protonen zuzuordnen.
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FT-IR
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FT-IR
wurde mit Kaliumbromid-Scheiben an einem Mattson Galaxy FT-IR durchgeführt.
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Der
Grad der hydrophoben Modifikation in GCP41 und der urspüngliche
Grad der Acetylierung in Glykolchitosan wurden anhand der 1H-NMR beurteilt (Vårum et al. 1991, Yoshioka
et al. 1993). Auf diese Weise wurde festgestellt, dass die verwendete
Glykolchitosan-Charge (Sigma Chemical Co., UK – 105H0111) zu einem Drittel
acetyliert war. Die Protonen-Zuordnungen waren wie folgt:
δ 0,86 ppm
= CH3 (Palmitoyl) δ 1,25 ppm = CH2 (Palmitoyl), δ 1,89 ppm
= CH2 (Palmitoyl – abgeschirmt durch Carbonyl), δ 2,13 ppm
= CH3 (Acetyl – GCP41), δ 2,14 ppm = CH2 (benachbart
zu den Carbonyl-Protonen),
δ 1,99
ppm = CH3 (Acetyl – Glykolchitosan), δ 2,71 ppm
= CH (C2-Zucker- Proton – GCP41), δ 2,64 ppm = CH (C2-Zucker-Proton – GCP41), δ 3,31 ppm
= Methanol-Protonen, δ 3,3–4,0 ppm
= nicht austauschbare Zucker-Protonen, δ 4,4 ppm = Wasser-Protonen.
Der Grad der hydrophoben Modifikation in GCP41 wurde unter Verwendung
des Verhältnisses
von nicht austauschbaren C2-Protonen zu
Methyl-Protonen (Spektrum b) beurteilt, und es wurde ermittelt,
dass es 14,48 ± 2,88%
(Mittelwert ± SD,
n = 3) mit zwischen 11 und 16 Mol-% liegenden Werten beträgt. Das
Verhältnis
der N-Acetyl-Protonen, C2-Zucker-Protonen,
9 zusätzlichen
nicht austauschbaren Zucker/Glykol-Protonen bleibt in allen drei
Spektren bei (ca. 1 : 1 : 10).
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GCP41
war unlöslich,
wenngleich in D2O dispergierbar, um eine
trübe Flüssigkeit
zu geben, die mindestens 4 Wochen lang ohne Sediment blieb. Den 1H-NMR-Spektren einer frischen Probe dieser
Dispersion mangelt es an Signalen für die Protonen der Fettsäureseitenkette.
Dies deutet darauf hin, dass Palmitoylglykolchitosan in Wasser eine
Ausrichtung annimmt, worin die Fettsäureseitenketten in hydrophoben
Domänen vorliegen,
die vom hydrophilen Teil des Polymers getrennt sind. Die Acetylgruppe
scheint ein integraler Teil des hydrophilen Anteils des Moleküls im modifizierten
Polymer zu sein, da Signale für
die Acetylgruppen in den GCP41-D2O-Spektren
deutlich zu sehen sind. Folglich bestand keine kooperative Assoziation
zwischen der Acetylgruppe und den hydrophoben Seitenketten, wenn
Palmitoylglykolchitosan in Wasser dispergiert war. Die Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie
wies in dieser trüben
Flüssigkeit
nicht auf das Vorliegen irgendeiner wahrnehmbaren partikulären Substanz
hin.
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Das
FT-IR-Spektrum für
GCP41 ließ eine
Verschärfung
des Amid-Peaks bei 1648 cm–1 erkennen. Das Ausgangsmaterial
Glykolchitosan enthält
bei 1653 cm–1 einen
relativ kleineren Amid-Peak.
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BEISPIEL 2
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HERSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG
VON GCP41- UND GCP21-MIKRO- UND NANOPARTIKELN
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a) GCP21-Cholesterin-Partikel
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7,2
mg Cholesterin wurden in 10 ml Chloroform aufgelöst. Dieser Lösung wurden
12,2 mg GCP21 zugefügt.
Das organische Lösungsmittel
wurde unter Vakuum entfernt und die feste Ablagerung unter einem Stickstoffstrom
getrocknet. Dieser festen Ablagerung wurden 2 ml wässriges
CF (5 mM) zugefügt
und das Gemisch 1 h bei 70°C
zur Bildung einer homogenen Dispersion aus Mikropartikeln geschüttelt.
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0,1
ml dieser Dispersion wurden dann über einer Sephadex G50-Säule (205 × 8 mm)
fraktioniert und die im Totvolumen eluierende Probe gesammelt. Diese
Probe wurde in einem Malvern Mastersizer klassiert. Der Assay auf
eingeschlossenes Material wurde durch Solubilisieren der Partikel
in Isopropanol (0,1 ml Dispersion zu 1 ml Isopropanol) durchgeführt. CF
wurde dann anhand der Fluorometrie (Anregung = 486 nm, Emission
= 514 nm) bestimmt.
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b) GCP21-Cholesterin-Soluan-C24-Partikel
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6,2
mg Cholesterin und 5,4 mg Soluan-C24 wurden in 10 ml Chloroform
aufgelöst.
Dieser Lösung
wurden 11 mg GCP21 zugefügt.
Das organische Lösungsmittel
wurde unter Vakuum entfernt und die feste Ablagerung unter einem
Stickstoffstrom getrocknet. Dieser festen Ablagerung wurden 2 ml
wässrige
CF (5 mM) zugefügt
und das Gemisch zur Bildung einer homogenen Dispersion aus Mikropartikeln
1 h bei 70°C
geschüttelt.
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Die
Nanopartikel wurden durch Filtration dieser Dispersion (0,22 μm) hergestellt.
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0,1
ml dieser Dispersionen wurden dann über einer Sephadex G50-Säule (205 × 8 mm)
fraktioniert und die im Totvolumen eluierende Probe gesammelt. Diese
Probe wurde in einem Malvern Mastersizer oder Autosizer, abhängig von
der Partikelgröße, klassiert.
Der Assay auf eingeschlossenes Material wurde durch Solubilisieren
der Partikel in Isopropanol (0,1 ml Dispersion zu 1 ml Isopropanol)
durchgeführt.
CF wurde dann mittels Fluorometrie (Anregung = 486, Emission = 514
nm) bestimmt.
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c) GCP41-Cholesterin-Partikel
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7,3
mg Cholesterin wurden in 10 ml Chloroform aufgelöst. Dieser Lösung wurden
19,8 mg GCP41 zugefügt.
Das organische Lösungsmittel
wurde unter Vakuum entfernt und die feste Ablagerung unter einem Stickstoffstrom
getrocknet. Dieser festen Ablagerung wurden 2 ml wässrige CF
(5 mM) zugefügt
und das Gemisch zur Bildung einer homogenen Dispersion aus Mikropartikeln
1 h bei 70°C
geschüttelt.
-
0,1
ml dieser Dispersion wurden dann über einer Sephadex G50-Säule (205 × 8 mm)
fraktioniert und die im Totvolumen eluierende Probe gesammelt. Diese
Probe wurde in einem Malvern Mastersizer klassiert. Der Assay auf
eingeschlossenes Material wurde durch Solubilisieren der Partikel
in Isopropanol (0,1 ml Dispersion zu 1 ml Isopropanol) durchgeführt. CF
wurde dann mittels Fluorometrie (Anregung = 486 nm, Emission = 514
nm) bestimmt.
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d) GCP41-Cholesterin-Solulan-C24-Partikel
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6,5
mg Cholesterin und 5,4 mg Solulan-C24 wurden in 10 ml Chloroform
aufgelöst.
Dieser Lösung
wurden 17,3 mg GCP41 zugefügt.
Das organische Lösungsmittel
wurde unter Vakuum entfernt und die feste Ablagerung unter einem
Stickstoffstrom getrocknet. Dieser festen Ablagerung wurden 2 ml
wässriges
CF (5 mM) zugefügt
und das Gemisch zur Bildung einer homogenen Dispersion aus Mikropartikeln
1 h bei 70°C
geschüttelt.
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Die
Nanopartikel wurden durch Filtration dieser Dispersion (0,22 μm) gebildet.
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0,1
ml dieser Dispersion wurden dann über einer Sephadex G50-Säule (205 × 8 mm)
fraktioniert und die im Totvolumen eluierende Probe gesammelt. Diese
Probe wurde in einem Malvern Mastersizer oder Autosizer klassiert.
Der Assay auf eingeschlossenes Material wurde durch Solubilisierung
der Partikel in Isopropanol (0,1 ml Dispersion zu 1 ml Isopropanol)
durchgeführt.
CF wurde dann mittels Fluorometrie (Anregung = 486 nm, Emission
= 514 nm) bestimmt.
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Die
Größen und
Einkapselungseffizienzen sind in Tabelle 1 ersichtlich.
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BEISPIEL 3
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HERSTELLUNG
VON IN VESIKELN EINGESCHLOSSENEM BLEOMYCIN
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Es
wurden GCP41-Vesikel durch Beschallung von GCP41 (8 mg) und Cholesterin
(4 mg, Sigma Chemical Co., UK) in Wasser 2 × 2 Minuten mit dem bei 20%
seiner Maximalkapazität
eingestellten Instrument hergestellt. Bleomycin-GCP41-Vesikel wurden
durch Beschallung von GCP41 (8 mg) und Cholesterin (4 mg) in 2 ml
Ammoniumsulfat (0,12 M, Sigma Chemical Co., UK) hergestellt. Nicht
eingeschlossenes Ammoniumsulfat wurde durch Ultrazentrifugation
(150 000 g × 1
h – MSE
75 Superspeed) entfernt. Die Vesikel wurden dann 1 h bei 60°C mit Bleomycin-Lösung (2
ml, 6 U ml–1)
(Lundbeck, UK) inkubiert und über
Nacht bei Raumtemperatur stehen lassen. Nicht eingeschlossenes Bleomycin
wurde auch durch Ultrazentrifugation (150 000 g × 1 h) entfernt, und der Einschluss
wurde durch Zerreißen
der Vesikel in Isopropanol (10 × Volumen)
(Rathburn Chemical Co., UK), gefolgt von der Ultraviolett-Absorptionsspektrometrie
bei 254 nm (Unicam UV-1) gemessen.
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Bei
der Lagerung bei Raumtemperatur trat ein initialer Verlust von Bleomycin
auf, obwohl über
60% des Arzneimittels in den Vesikeln zurückgehalten werden (siehe 1). Es wurde auch festgestellt,
dass sich die Partikelgröße sehr
wenig änderte.
Die Stabilitätsdaten
deuten darauf hin, dass eine lose gebundene und eine mit GCP41-Vesikeln
assoziierte fest gebundene Bleomycin-Fraktion vorliegt. Es wird
angenommen, dass die fest gebundene Fraktion die Bleomycin-Fraktion
ist, die die Membran des polymeren Vesikels überquert und sich tatsächlich in
ihr als Reaktion auf den Ammoniumsulfat-Gradienten akkumuliert.
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BEISPIEL 4
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5(6)-CARBOXYFLUORESZEIN-FREISETZUNG
AUS VESIKELN
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Die
Vesikel wurden wie in Beispiel 3 beschrieben aus GCP41 (16 mg) und
Cholesterin (8 mg) hergestellt, außer dass es sich bei der Hydratisierungslösung um
4 ml 5(6)-Carboxyfluoreszein (5,03 mM, Sigma Chemical Co., UK) handelte.
Die Sorbitan-Monostearat-Vesikel wurden durch Hydratisieren von
Sorbitan-Monostearat (24 mg, Sigma Chemical Co., UK), Cholesterin
und Poly-24-oxyethylencholesterylether (16 mg, D. F. Anstead, UK)
in Gegenwart von 4 ml 5(6)-Carboxyfluoreszein (5,03 mM) hergestellt.
Nicht eingeschlossenes Material wurde wieder durch Ultrazentrifugation
wie in Beispiel 3 beschrieben entfernt. Die Freisetzung von 5(6)-Carboxyfluoreszein
aus GCP41 und Sorbitan-Monostearat-Vesikeln
wurde wie folgt überwacht.
Ein Gemisch (1 : 2) aus den Vesikeln und 2 Gew.-% Gallensalzen (Natriumcholat
und Natriumdesoxycholat, Sigma Chemical Co., UK) wurden in ein 5
cm langes Visking-Schlauchstück
(MG-Cutoff 12 000–14
000) gegeben und an beiden Enden fest verschlossen. Dieses Gemisch
wurde gegen ein 13faches Volumen der Gallensalz-Lösung dialysiert.
5(6)-Carboxyfluoreszein extern zum Dialyseschlauch wurde in regelmäßigen Zeitabständen fluorometrisch überwacht
(Anregung = 486, Emission = 514 nm, Perkin Elmer LS-5). Ein Gemisch
(1 : 2) aus 5(6)-Carboxyfluoreszein in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS,
pH = 7,4) (0,5 ml) und 2 Gew.-% Gallensalzen (1 ml) wurden als Kontrolle
eingeschlossen.
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Unter
Verwendung der Freisetzung der Verbindung 5(6)-Carboxyfluoreszein
mit kleinem Molekulargewicht (MG = 387) als ein Marker für die Vesikelintegrität wurde
festgestellt, dass diese polymeren Vesikel gegen eine Attacke durch
Detergenzien widerstandsfähiger
sind als Vesikel, die aus dem nichtionischen Tensid Sorbitan-Monostearat
hergestellt wurden (siehe 2).
Es wird angenommen, dass dies auf die Schwierigkeit zurückzuführen ist,
die lösliche
Gallensalz-Tenside beim Insertieren in eine polymere Doppelschicht
im Vergleich zur Leichtigkeit der Insertion in eine Doppelschicht,
die sich aus der Selbstassemblierung von Monomeren ergibt, aufweisen.
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BEISPIEL 5
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BIOKOMPATIBILITÄT UND HÄMOKOMPATIBILITÄTSSTUDIEN
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Biokompatibilitätsstudien
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Die
Cytotoxizität
wurde anhand des IC50-Wertes in einem auf MTT-basierenden Standardassay
(Freshney et al., Culture of Animal Cells, 3. Auflage, Wiley-Liss,
New York, 1994) bewertet. In Abhängigkeit
von der Wachstumsrate wurden 0,5 – 2,0 × 103 Zellen
pro Vertiefung in Platten mit 96 Vertiefungen geimpft und 24 h inkubiert.
Es wurden Reihenverdünnungen
der Suspensionen zugefügt
und 12 h mit den Zellen inkubiert. Die Suspensionen wurden gegen
frisches Medium ausgetauscht, und die Zellen wurden mit wiederholter
Einspeisung 72 h inkubiert. Jeder Vertiefung wurden 50 mg ml–1 MTT
[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (50 μl, Sigma
Chemical Co., UK) zugefügt.
Nach 4-stündiger
Inkubation im Dunkeln wurden das Medium und die MTT-Lösung entfernt,
und die Zellen wurden in DMSO (200 μl, Sigma Chemical Co., UK) lysiert.
Nach dem Zufügen
von S⌀rensen-Glycinpuffer
(25 μl)
wurde die Absorption bei 570 nm gemessen.
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Hämokompatibilitätsstudien
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Frisch
entnommenes humanes Blut wurde zentrifugiert (3 000 g), um die roten
Blutzellen zu trennen. Diese wurden mit PBS (pH = 7,4) gewaschen
und gewogen. 3 g des Erythrozytenpellets wurden in 100 ml PBS (pH
= 7,4) dispergiert und 5 h mit verschiedenen Konzentrationen von
GCP41-, Cholesterin-Vesikeln,
die wie vorstehend beschrieben hergestellt wurden, oder DOTAP-Vesikeln
(Sigma Chemical Co., UK) inkubiert. Die Hämolyse wurde durch Zentrifugation
(3 000 g) zur Isolierung des freigesetzten Hämoglobins, Zufügen von Isopropanaol
(2 × Volumen)
zum Überstand
und die Messung der Absorption (570 nm) beurteilt.
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GCP41-Vesikel
waren mit 3 humanen Zelllinien A2780 (Ovarialkarzinom-Zelllinie),
A549 (Lungenkarzinom) und A431 (Epidermoidkarzinom) mit keiner evidenten
Toxizität
bei GCP41-Konzentrationen unter 150 μg ml–1 und
IC50-Werten von 0,2, 1,0 bzw. 1,0 mg ml–1 biokompatibel
(3). Die GPC41-Vesikel
zeigten eine gute Hämokompatibilität mit humanen
Erythrozyten und eine Fähigkeit,
die hämolytische
Aktivität
von N-[1-(2,3-Dioloyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniummethylsulfat
(DOTAP) – das
DNA-Transfektionsmittel – zu
modulieren (Porteous et al., (1997) Gene Therapy 4 210–218), (Tabelle
2). Diese Biokompatibilitätsdaten stimmen
gut mit denen überein,
die für
lösliches
Glykolchitosan gegen die B16F10-Zelllinie und Rattenerythrozyten
berichtet wurden (Carreno-Gomez und Duncan (1997) Int. J. Pharm.
148, 231–240.
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BEISPIEL 6
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HERSTELLUNG
VON IN VESIKELN EINGESCHLOSSENEM INSULIN UND LHRH
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GCP21
wurde gemäß Beispiel
1 hergestellt:
- a) Insulin. Die GCP21-Vesikel
wurden durch Beschallung eines Gemischs aus GCP21 (8 mg) und Cholesterin
(4 mg) in 2 ml Wasser hergestellt. Die GCP21-Vesikel wurden mit
Insulin durch entweder Inkubation von 1 ml der Vesikel-Dispersion
mit 1 ml Insulin (160 IU ml–1) 16 h bei Raumtemperatur
oder durch die Verwendung des Dehydratation-Rehydratationsverfahrens
(DRV-Verfahren) beladen (Kirkby C., Gregoriadis G. (1984) Biotechnology
979–984),
worin die Insulin-Vesikel-Gemische, wie vorstehend beschrieben, über Nacht
lyophilysiert und anschließend
auf ein Volumen von 2 ml rehydratisiert wurden. Die eingeschlossene Insulinmenge
wurde mittels HPLC nach der Trennung von eingekapseltem Insulin
vom nicht eingekapselten Material durch Ultrazentrifugation (150
000 g) und Zerreißen
der Vesikel mit Isopropanol (1 ml Isopropanol zu 1 ml der Vesikeldispersion)
beurteilt. Die Vesikel wurden auch anhand der Photonenkorrelationsspektroskopie
klassiert und des Zeta-Potenzials der Dispersion gemessen.
- b) Luteinisierendes Hormon-Releasing-Hormon (LHRH). LHRH wurde
unter Verwendung von Ammoniumsulfat-Gradienten auf GCP21-Vesikel
geladen (Haran, G. et al. (1993) Biochim. Biophys. Acta 1151, 210–205). Vesikel,
die Ammoniumsulfat einschließen,
wurden durch Beschallung von GP21 (8 mg), Cholesterin-Gemischen
(4 mg) in 2 ml einer Lösung
aus Ammoniumsulfat (0,03 M) hergestellt. Nicht eingeschlossenes
Ammoniumsulfat wurde durch Ultrazentrifugation (150 000 g) getrennt,
und die pelletierten Ammoniumsulfat-Vesikel wurden mit 2 ml LHRH
(2,5 mg ml–1)
inkubiert. Nicht eingeschlossenes LHRH wurde auch durch Ultrazentrifugation
(eine Stunde bei 150 000 g) entfernt. Diese Vesikel wurden auch
anhand der Photonenkorrelationsspektroskopie klassiert.
- a) Insulin. Die Insulin-GCP21-Vesikel konnten durch Inkubation
von vorgeformten GCP21-Vesikeln mit Insulin ca. 16 h bei Raumtemperatur
inkubiert werden (Tabelle 3). Es wurde mit dem DRV-Verfahren keine Verbesserung
des Anteils von mit den Vesikeln assoziiertem Insulin beobachtet.
Das Zeta-Potenzial der GCP21-Vesikel nahm beim Beladen mit Insulin
von –5
mV auf +10 mV zu, was darauf hindeutet, dass sich das Insulin bis
zu einem bestimmten Grad mit der Oberfläche der Vesikel assoziiert.
- b) LHRH. Die LHRH-Vesikel konnten auch durch die Verwendung
von Ammoniumsulfat-Gradienten hergestellt werden (Tabelle 4).
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TABELLE
1: Größe und CF-Einkapselungseffizienz
von GCP21- und GCP41-Partikeln
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TABELLE
2: Die Hämokompatibilität von GCP41-Vesikeln
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TABELLE
3: Die Größe und Einkapselungs-Effizienz
von Insulin-GCP21-Vesikeln
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TABELLE
4: Die Einkapselung von LHRH in GCP21-Vesikeln