Technisches Gebiet
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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur
Herstellung von Limulus-Amöbocytenlysat.
Technischer Hintergrund
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Es war allgemein bekannt, daß Limulus-Amöbocytenlysat
(nachfolgend als LAL bezeichnet) mit einem Endotoxin, das ein
bakterielles Pyrogen ist (nachfolgend als Endotoxin
bezeichnet), unter Koagulation reagiert.
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Auf der Basis dieser Reaktion wurden verschiedene Methoden
zur Bestimmung von Endotoxin entwickelt.
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Neuerdings wurde der vorstehend beschriebene
Koagulationsreaktionsmechanismus aufgeklärt, d.h. Koagulogen
wird in Koagulin überführt, um eine Koagulation (Gelierung)
gemäß einer stufenweisen Reaktion, wie sie in Fig. 1
dargestellt wird, zu verursachen [S. Iwanaga et al., The
hemolymph coagulation system in invertebrate animals, J.
Protein Chem., 5 (1986) 255-268]. Es ist zu erkennen, daß der
Reaktionsmechanismus zwei Koagulationssysteme umfaßt: ein
durch Endotoxin initliertes System (Faktor C-System) und ein
durch (1T3)-β-D-Glucan (d.h. Curdlan, teilweise
carboxymethyliertes (1T3)-β-D-Glucan) initiiertes System
(Faktor G-System).
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Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben bereits
gefunden, daß der (1T3)-β-D-Glucan-Strukturanteil mit einem
bestimmten Molekulargewicht die Aktivierung des durch (1T3)-
β-D-Glucan initiierten Systems des LAL (Faktor G-System)
inhibiert, und meldeten eine Patentanmeldung für einen
Limulus-Amöbocytenlysat-Faktor G-Aktivierungsinhibitor an
(japanische Patentanmeldung Nr. 63-216341 und WO 90/02951).
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Wenn dieser Inhibitor zu LAL zugegeben wird, um ein für
Endotoxin spezifisches LAL zu erhalten, wird jedoch
möglicherweise ein den Inhibitor und Faktor G umfassender, in
LAL verbleibender Komplex mit einer zugegebenen Probe
dissoziiert, und der freigesetzte Faktor G wird durch eine
Faktor G-aktivierende Substanz aktiviert.
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Die EP-A-0 333 187 beschreibt Polysaccharid(derivate), die
eine β-1,3-glucosidische Bindung enthalten, beschreibt aber
nicht einen (1T3)-β-D-Glucosid-Strukturanteil, der durch
Depolymerisieren und/oder Fraktionieren einer
Kohlehydratkette erhalten wurde.
Beschreibung der Erfindung
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Aufgabenstellung der vorliegenden Erfindung ist es, ein
Faktor G-freies LAL bereitzustellen, das im LAL-
Koagulationsmechanismus zuerst mit (1T3)-β-D-Glucan
aktiviert wird.
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Die vorliegende Erfindung stellt somit ein Verfahren zur
Herstellung eines im wesentlichen Faktor G-freien Limulus-
Amöbocytenlysates bereit, umfassend das Inkontaktbringen von
Limulus-Amöbocytenlysat mit einem unlöslichen Träger, auf dem
ein (1T3)-β-D-Glucosid-Strukturanteil der Formel [I] fixiert
ist.
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worin n eine ganze Zahl von 2 bis 370 bedeutet.
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Der erfindungsgemäß verwendete (1T3)-β-D-Glucosid-
Strukturanteil ist ein Polyglycosid, das in einem Molekül
mindestens einen Poly-(1T3)-β-D-glucosid-Strukturanteil
[nachfolgend als Poly((1T3)glucosid-Einheit bezeichnet]
besitzt, die 2 bis 370, vorzugsweise 3 bis 310, und
insbesondere 4 bis 180 aufeinanderfolgende, durch die
folgende Formel dargestellte (1T3)-β-D-Glucosid-
Struktureinheiten (Molekulargewicht: 162) besitzt.
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Das erfindungsgemäß verwendete Polyglycosid muß mindestens
eine Poly(1T3)glucosid-Einheit im Molekül aufweisen. Das
erindungsgemäß verwendete Polyglycosid kann z.B. im
wesentlichen aus einer Poly(1T3)glucosid-Einheit bestehen,
z.B. aus dem durch die folgende Formel dargestellten
(1T3)-β-D-Glucosid
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worin n eine ganze Zahl von 2 bis 370, vorzugsweise von 3 bis
310, und insbesondere von 4 bis 180 ist. Alternativ kann es
eine Struktur besitzen, in der eine Poly(1T3)glucosid-
Einheit eine Kohlehydratkette besitzt, die an die vorstehend
beschriebene Poly(1T3)glucosid-Einheit als verzweigte Kette
gebunden sein kann und aufgebaut ist aus ein oder mehreren
durch die folgende Formel dargestellten (1T4)-β-D-Glucosid-
Struktureinheiten;
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einen oder mehreren (1T6)-β-D-Glucosid-Struktureinheiten der
folgenden Formel;
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oder ein oder mehreren durch die folgenden Formeln
dargestellten modifizierten β-D-Glucosid-Struktureinheiten;
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worin mindestens einer der Reste R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; eine chemisch
einführbare Gruppe (Gruppen) darstellt, d.h. eine
Methylgruppe, eine Hydroxyalkylgruppe, wie z.B. eine
Hydroxymethylgruppe, einer Carboxyalkylgruppe, wie z.B. eine
Carboxymethylgruppe, eine Acetylgruppe, eine Sulfatgruppe,
eine Phosphatgruppe, eine Allylgruppe, ein Metallsalz einer
der vorstehend genannten Gruppen, ein Ammoniumsalz einer der
vorstehend genannten Gruppen und ein organisches Aminsalz
einer der vorstehend genannten Gruppen, und die verbleibenden
Gruppen ein Wasserstoffatom bedeuten.
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Das erfindungsgemäß verwendete Polyglycosid kann außerdem
eine Struktur besitzen, in der zwei oder mehr der vorstehend
beschriebenen Poly(1T3)glucosid-Einheiten mit jeder anderen
über die anderen Kohlehydrat-Einheiten, wie in der
nachfolgenden Formel gezeigt, gebunden sind
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A&sub1;-B&sub1;-A&sub2;-B&sub2;-.....
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worin jeder der Reste A&sub1;, A&sub2;, ... eine durch die obige Formel
(I) dargestellte Poly(1T3)-β-D-glucosid-Einheit mit 2 bis
370, vorzugsweise 3 bis 310, und insbesondere 4 bis 180
(1T-3)-β-D-Glucosid-Struktureinheiten darstellt, die
kontinuierlich aneinander gebunden sind, und die Zahl der
Einheiten der Formel (I), die jede Einheit A&sub1;, A&sub2;,
aufbaut, kann von jeder anderen verschieden sein, und B&sub1;, B&sub2;,
... gleiche oder verschiedene Kohlehydratketten-Einheiten
darstellen. Die anderen durch B&sub1;, B&sub2;, ... dargestellten
Kohlehydratketten-Strukturanteile können z.B. eine aus einer
durch die vorstehend beschriebenen Formeln (II), (III), (IV),
(V) oder (VI) dargestellte Struktureinheit oder aus zwei oder
mehreren solcher Struktureinheiten aufgebaute Struktureinheit
sein.
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Das erfindungsgemäß verwendete Polyglycosid kann außerdem
auch eine solche Struktur aufweisen, bei der die vorstehend
beschriebene Poly(1T3)glucosid-Einheit über die anderen
durch die vorstehend beschriebenen Reste B&sub1;, B&sub2;,
dargestellten Kohlehydratketten-Strukturen an einen
langkettigen Poly(1T3)-β-D-Glucosid-Strukturanteil gebunden
ist, der aus 371 oder mehr aufeinanderfolgenden, durch die
obige Formel (I) dargestellte (1T3)-β-D-Glucosid-
Struktureinheiten aufgebaut ist.
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Das erfindungsgemäß verwendete Polyglycosid enthält deshalb
mindestens eine der vorstehend beschriebenen
Poly(1T-3)glucosid-Einheiten pro Molekül, und sein Molekulargewicht
ist nicht besonders begrenzt.
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Es ist außerdem bevorzugt, daß das erfindungsgemäß verwendete
Polyglycosid im wesentlichen mindestens eine der vorstehend
beschriebenen Poly(1T3)glucosid-Einheiten pro Molekül
enthält, ohne darauf beschränkt zu sein. Es kann auch z.B.
andere Polyglycoside enthalten, einschließlich einer
Poly(1T-3)-β-D-Glucosid-Einheit mit hohem Molekulargewicht, die 371
oder mehr aufeinanderfolgende, durch die vorstehende Formel
(1) dargestellte (1T3)-β-D-Glucosid-Struktureinheiten
aufweist. Dies deshalb, weil das erfindungsgemäße
Polyglycosid rascher und stärker an Faktor G gebunden wird,
der ein ein Faktor G-Aktivierungssystem von LAL initiierender
Faktor ist, als ein Poly(1T3)-β-D-glucosid mit hohem
Molekulargewicht, das eine Faktor G-aktivierende Substanz
ist, die verwendet wird, um dadurch die Aktivierung des
Faktors G zu einem aktivierten Faktor G zu inhibieren. Die
Gegenwart eines solchen Poly(1T3)-β-D-Glucosids mit hohem
Molekulargewicht beinträchtigt deshalb die inhibierende
Wirkung des erfindungsgemäßen Polyglycosids nicht wesentlich.
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Das Molekulargewicht des hier verwendeten Polyglycosids wird
bestimmt, indem man eine Gelpermeationschromatographie unter
Verwendung einer Standardsubstanz mit bekanntem
Molekulargewicht verwendet, unter den folgenden Bedingungen
durchgeführt, um eine Eichkurve herzustellen, die Testprobe
der Gelpermeationschromatographie unter den gleichen
Bedingungen unterwirft und die Ergebnisse mit der Eichkurve
vergleicht.
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Säule: TSKgel G-PWXL Serie (Tosoh Corporation),
7,8 x 300 mm, mehrere Säulen verschiedener
Typen,
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Mobile Phase: 0,3M NaOH
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Fließgeschwindigkeit 0,5 ml/min
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Konzentration der Probenlösung: 0,1 bis 5 mg/ml
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Injiziertes Volumen der Probenlösung: 0,1 ml
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Säulentemperatur: Raumtemperatur
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Bestimmungsmethode: Messung durch ein Differential-
Refraktometer (LKB Co.) oder quantitative
Analyse des Kohlehydrats durch die
Phenol-Schwefelsäuremethode
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Standardsubstanz: TSK-Standard-Polyethylenoxid (Tosoh-
Corporation) und Polyethylenglycol
(Nacalai Tesque), 10 Arten, mit einem
durchschnittlichen Molekulargewicht im
Bereich von 1000 bis 860000
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Die wie vorstehend definierten erfindungsgemäßen
Polyglycoside können aus natürlichen Quellen abgeleitet
werden oder synthetisiert werden. Sie können auch teilweise
chemisch modifizierte Produkte von Poly(1T3)-β-D-glucosid
mit drei oder mehreren durch die vorstehende Formel (I)
dargestellten (1T3)-β-D-Glucosid-Struktureinheiten sein.
Normalerweise sind die aus natürlichen Quellen abgeleiteten
Produkte leicht erhältlich. Beispiele solcher Polyglycoside
werden nachfolgend angegeben.
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(1) Im wesentlichen geradkettige Polyglucoside, die im
wesentlichen aus den durch die vorstehende Formel (I)
dargestellten (1T3)-β-D-Glucosid-Struktureinheiten bestehen,
wie z.B. von Bakterien des Genus Alcaligenes abgeleitete
(1T3)-β-D-Glucane, von Flagellaten Euglena abgeleitetes
Paramylon, von faserigen Geweben höherer Pflanzen abgeleitete
β-Glucane oder von Siebhülsen höherer Pflanzen extrahierte
Callose, D-Glucose-Polymere mit (1T3)-β-Bindungen, die in
teilweise hydrolysierten Produkten von von Braunalgen
abgeleiteten Laminaranen vom Genus Laminaria und Eisenia
enthalten sind, oder das vorstehend beschriebene (1T3)-β-D-
Glucan, Laminaridextrine mit einem Polymerisationsgrad von 10
bis 20, Laminari-Oligosaccharide mit einem
Polymerisationsgrad von 10 oder weniger, usw..
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(2) Polyglycoside, die die durch die obige Formel (I)
dargestellten (1T3)-β-D-Glucosid-Struktureinheiten und die
durch die obige Formel (III) dargestellten (1T6)-β-D-
Glucosid-Struktureinheiten umfassen, wie z.B.
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a) Polyglucoside mit einer Haupt-Kohlehydratkette mit
(1T-3)-β-Bindungen, die eine oder mehrere durch die (1T6)-β-
Bindung verbundene Glucosen umfassen, z.B. von Braunalgen des
Genus Eisenia abgeleitete Laminarane;
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b) wie unter a) beschriebene Polyglycoside, in denen eine
Kohlehydratkette mit den (1T3)-β-Bindungen an die Glucose
oder die Glucosepolymeren als verzweigte Kette über eine
(1T-6)-β-Bindung gebunden ist, und die außerdem teilweise andere
Kohlehydrat-Anteile umfassen können, z.B. von Braunalgen des
Genus Laminaria abgeleitete Laminarane, von Kieselalgen,
Ochromonas, Phäodactylum, Skeletonema, Biddulphia,
Coscinodiscus und Chätoceros abgeleitete Chrysolaminarane,
und von Poria abgeleitetes Pachyman;
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c) Polyglycoside mit viel mehr dendridenförmigen
Verzweigungen, wie z.B. in den Zellwänden von Ascomycetes,
Basidiomycetes und Phycomycetes enthaltendes β-Glucan, z.B.
von der Zellwand von Phytophthora abgeleitete Glucane usw.;
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d) Polyglycoside mit einem geradkettigen ((1T3)-β-Glucan,
an das über die (1T6)-β-Bindung Glucose gebunden ist, z.B.
von Sclerotinia abgeleitetes Sclerotan, das an jedem dritten
Glucosyl-Rest der Hauptkette eine Glucosyl-Verzweigung
aufweist, von Schizophyllum abgeleitetes Schizophyllan, von
Grifola frondosa abgeleitetes Grifolan LE, von Sclerotium,
Corticium und Stromatinia abgeleitete Scleroglucane usw.,
oder solche mit einem geradkettigen (1T3)-β-Glucan, an das
über die (1T6)-β-Bindung in einer Menge von zwei Glucosyl-
Resten pro fünf Glucosyl-Resten der Hauptkette Glucosen
gebunden sind, z.B. von Lentinus abgeleitetes Lentinan usw.,
und
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e) Polyglycoside mit einem geradkettigen (1T6)-β-Glucan
mit mehreren Glucoseverzweigungen von der C-3-Stellung der
Glucose-Reste der Hauptkette über die (1T3)-β-Bindung, z.B.
von der Zellwand von Saccharomyces (Bäckerhefe) abgeleitetes
β-Glucan, usw..
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(3) Polyglycoside mit den durch die obige Formel (I)
dargestellten (1T3)-β-D-Glucosid-Struktureinheiten und den
durch die obigen Formel (II) dargestellten (1T4)-β-D-
Glucosid-Struktureinheiten, z.B. von Cetraria, Usnea,
Evernia, usw. abgeleitete Lichenane, in Endosperm von Gerste
enthaltene β-Glucane usw., die aus einer Kohlehydratkette
aufgebaut sind, die (1T4)-β-Oligoglucoside, die aneinander
über die (1T3)-β-Bindung gebunden sind und in Intervallen
(1-T3)-β-Oligoglucoside enthalten, umfaßt.
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Einige der vorstehend beschriebenen Polyglycoside sind im
Handel erhältlich und können als solche verwendet werden.
Wenn erforderlich, werden die Polyglycoside nach einer
teilweisen Zersetzung und/oder Fraktionierungsbehandlung
verwendet, um eine Fraktion herzustellen, die reich ist an
einem Polyglycosid, das die durch obige Formel (I)
dargestellte (1T3)-β-D-Glucosid-Struktureinheit in der
vorstehend angegebenen Menge enthält.
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Eine solche partielle Zersetzung und
Fraktionierungsbehandlung kann gemäß einem bekannten
Verfahren durchgeführt werden. Die partielle Zersetzung einer
Kohlehydratkette kann z.B. bewirkt werden durch Hydrolyse mit
einer Säure, einem Alkali oder β-Glucanase, Acetolyse,
Ultraschallbehandlung oder dergleichen. Eine
Molekulargewichts-Fraktionierung kann durchgeführt werden
durch Ausfällen mit einem organischen Lösungsmittel, wie z.B.
Alkohol, Aceton und Ether, oder Salzen, oder mittels einer
Fraktionierung unter Verwendung eines Molekularsieb-Mittels
oder einer Molekularsieb-Membran.
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Ein Teil der Kohlehydratketten des vorstehend unter (1) bis
(3) beispielhaft angegebenen Polyglycosids kann auch chemisch
modifiziert sein mit einer Alkylgruppe, wie z.B. einer
Methylgruppe, eine Hydroxyalkylgruppe, wie z.B. einer
Hydroxymethylgruppe, einer Carboxyalkylgruppe, wie z.B. einer
Carboxymethylgruppe, einer Säuregruppe, wie z.B. einer
Acetylgruppe, einer Sulfatgruppe oder einer Phosphatgruppe,
oder anderen funktionellen Gruppen. Sie können hergestellt
werden, indem man diese funktionellen Gruppen gemäß einem
bekannten Verfahren einführt [vgl. z.B. (1) Seikagakukenkyuho
(Methods of Studying Biochemistry) 1, herausgegeben von Ando,
Terayama, Nishizawa und Yamakawa, (1967) 284-303, Asakura
Shoten, (2) R.L. Whistler, Herausgeber: Methods in
Carbohydrate Chmistry III, (1964) 193-267, 271-331, Academic
Press, usw.]. Insbesondere wird ein (1T3)-β-Glucan mit einem
Molekulargewicht von 60000 oder mehr und einer Faktor G-
aktivierenden Wirkung brauchbar, wenn es einer partiellen
chemischen Modifizierung unterworfen wird, um die Zahl der
durch die obige Formel (I) dargestellten (1T3)-β-D-Glucosid-
Struktureinheiten in der Poly(1T3)-β-D-glucosid-Einheit auf
370 oder weniger einzustellen.
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Geeignete Beispiele der erfindungsgemäßen Polyglycoside sind
deshalb die folgenden:
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- Laminarioligosaccharide mit einem Molekulargewicht von
342 bis 1638;
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- Laminaridextrin mit einem Molekulargewicht von 1800 bis
3258;
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- (1T3)-β-D-Glucan mit einem durchschnittlichen
Molekulargewicht von 2000 bis 60000;
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- Laminaran mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht
von 3000 bis 23000;
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- Sclerotan mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht
von 3000 bis 20000;
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- Schizophyllan mit einem durchschnittlichen
Molekulargewicht von 500000 oder weniger;
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- Lentinan mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht
von 1100000 oder weniger;
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- von Bäckerhefe abgeleitetes wasserlösliches Glucan mit
einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 12000 oder
weniger;
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- Lichenan mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht
von 33000 oder weniger;
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- Gersten-β-Glucan mit einem durchschnittlichen
Molekulargewicht von 200000 oder weniger;
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- partiell carboxymethyliertes (1T3)-β-D-Glucan
(Substitutionsgrad: 0,003 bis 1,0) mit einem
durchschnittlichen Molekulargewicht von 40000 bis
240000, z.B. erhalten durch eine partielle
Carboxymethylierung von Curdlan und Salzen davon;
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- partiell carboxymethyliertes Laminaran
(Substitutionsgrad: 1,0 oder weniger) mit einem
durchschnittlichen Molekulargewicht von 23000 oder
weniger, und Salze davon;
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- partiell methyliertes (1T3)-β-D-Glucan
(Substitutionsgrad: 0,003 bis 1,0) mit einem
durchschnittlichen Molekulargewicht von 80000 oder
weniger;
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- partiell sulfatiertes Laminaran (Substitutionsgrad: 1,
oder weniger) mit einem durchschnittlichen
Molekulargewicht von 23000 oder weniger, und Salzen
davon.
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Zur Immobilisierung des vorstehend beschriebenen (1T3)-β-D-
Glucosid-Strukturanteils mit der Poly(1T3)glucosid-Einheit
kann irgendein unlöslicher Träger verwendet werden, solange
er hydrophile Gruppen, wie z.B eine Hydroxygruppe und eine
Carbamoylgruppe, besitzt. Beispiele für diese unlöslichen
Träger sind die folgenden: Cellulose, wie z.B.
Cellulosepulver (erhältlich von Advantec Toyo), Cellulofine
(erhältlich von Seikagaku Corporation), Avicel (erhältlich
von Funakoshi Pharmaceutical), Cellex (erhältlich von Bio-
Rad); Agarose, wie z.B. Sepharose (erhältlich von Pharmacia),
Biogel A (erhältlich von Bio-Rad), Chromagel A (erhältlich
von Dojindo Laboratories), Sagavac (erhältlich von Seravac
Laboratories), Gelarose (erhältlich von Litex), P-L-Agarose
(erhältlich von P-L Biochemicäls); vernetztes Dextran, wie
z.B. Sephadex G und Sephacryl (erhältlich von Pharmacia), P-L
Dex (erhältlich von P-L Biochemicals); Polyacrylamid, wie
z.B. Biogel P (erhältlich von Bio-Rad), Chromagel P
(erhältlich von Dojindo Laboratories); poröses Glas, wie z.B.
Bioglas (erhältlich von Bio-Rad); hydrophiles synthetisches
Polyvinylpolymer, wie z.B. Toyo-Pearl (erhältlich von Tosoh).
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Zur Immobilisierung des (1T3)-β-D-Glucosid-Strukturanteils
an diese unlöslichen Träger müssen diese Träger aktiviert
werden. Es können verschiedene Aktivierungsverfahren genannt
werden, die für einen Träger mit Hydroxylgruppen eine
Cyanogenbromid-Methode (R. Axen, J. Porath und S. Ernback,
Nature, 214 (1967) 1302) und eine Methode unter Verwendung
von Oxiranen (J. Porath und N. Fornstedt, J. Chromatogr., 51
(1970) 479, und L. Sundberg und J. Porath, J. Chromatogr., 90
(1974) 87) umfassen, für einen Träger mit Carbamoylgruppen
eine Methode unter Verwendung eines Alkyldiamins, um den
Träger in ein Aminoalkylaminderivat zu überführen, und eine
Methode unter Verwendung von Hydrazin, um den Träger in ein
Hydrazinderivat zu überführen (beide Methoden werden in J.K.
Inman und H.M. Dintzis, Biochemistry, 8 (1969) 4074
beschrieben). Im Hinblick auf die Stabilität und eine
herabgesetzte nicht spezifische Absorption ist eine Methode
hervorragend, die die Epoxy-Aktivierung eines Trägers mit
Epichlorhydrin oder Bisoxiranen, Umsetzung des resultierenden
Epoxy-aktivierten unlöslichen Trägers mit Hydrazinhydrat oder
einer Dihydrazidverbindung, um ein Hydrazinderivat oder ein
Dihydrazidderivat zu erhalten, das als aktiviertes Produkt
dient, umfaßt (Isamu Matsumoto et al., JP-A-59-15401)
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Das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete LAL ist nicht
besonders beschränkt, solange es aus Limulus-Blutkörperchen
extrahiert wird und sein Faktor C-System in einer Reaktion
mit Endotoxin aktiviert wird. Solche verwendbaren LAL
umfassen handelsüblich erhältliche Produkte, wie z.B. ein
gefriergetrocknetes Produkt von LAL, ein gefriergetrocknetes
Produkt von LAL mit einem synthetischen Substrat und
dergleichen.
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Verschiedene im Handel erhältliche Lysate sind die folgenden:
Pregel, Pregel-S, Pregel-M, Pyrodick, Toxicolor (alle von
Seikagaku Corporation erhältlich), Limulus II-Test Wako,
Limulus II-Single-Test Wako, Limulus HS II-Test Wako, Limulus
HS II-Single-Test Wako, Limulus S II-Single-Test Wako,
Limulus-Amöbocytenlysat II (gefriergetrocknetes Produkt),
Limulus-Amöbocytenlysat-HS II (gefriergetrocknetes Produkt)
(alle erhältlich von Wako Pure Chemical Industries), Pyrotell
(erhältlich von Cape Cod), Pyrosat (erhältlich von
Haemachem), Pyrogent , Pyrogent Plus, Pyrogent Singletest,
pyrogent Multitest, LAL Singletest-Kit, QCL-1000, Kinetic
QCL (alle erhältlich von Whittaker Bioproducts), Coatest
Endotoxin (Kabi Bitrum).
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Das Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäß verwendeten
(1T3)-β3-D-Glucosid-Strukturanteils wird nachfolgend
detaillierter beschrieben.
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Der erfindungsgemäß verwendete (1T3)-β-D-Glucosid-
Strukturanteil kann z.B. hergestellt werden durch das in den
folgenden Herstellungsbeispielen beschriebene Verfahren. Im
Handel erhältliche (1T3)-β-D-Glucan-Produkte, die in den
Rahmen der vorliegenden Erfindung fallen, können als solche
verwendet werden.
Herstellungsbeispiel 1
Herstellung von im Handel erhältlichen Curdlan mittels
Molekularsieb-chromatographischer Fraktionierung
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1 g Curdlan (Wako Pure Chemical Indsutries, Chargen-Nr. PEQ
9080, Mn> 136000, Mw/Mn> 2,76, Probe Nr. 101) wurde in 0,3M
NaOH (5 mg/ml) gelöst. Anteile von je 100 ml der
resultierenden Lösung wurden einer
Gelpermeationschromatographie (nachfolgend als GPC abgekürzt)
bei Raumtemperatur unter den folgenden Bedingungen
unterworfen. {Säulen: TSKgel G6000PWNX und G5000PWXL (beide
7,8x300 mm) werden in Reihe verbunden; mobile Phase: 0,3M
NaOH, Fließgeschwindigkeit: 0,5 ml/min}. Die eluierte
Fraktion niedrigen Molekulargewichts (Nr. 44 bis 46) wurde
gesammelt und dann weiter einer Chromatographie unterworfen,
um 0,015 mg einer Probe (Probe Nr. 1) zu erhalten, die ein
durchschnittliches Molekulargewicht (Zahlenmittel) von 3050
und eine Polydispersität von 1,29 besaß. Das vorstehend
beschriebene GPC-Fraktionierungsmuster ist in Fig. 2
dargestellt. Die durch Rechromatographie der Fraktion Nr. 44
bis 46 in Fig. 2 erhaltenen Fraktionierungsmuster sind in
Fig. 3 dargestellt.
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Die Probe Nr. 1 wurde mit β-1,3-Glucanase (Zymolyase-100T),
erhältlich von Seikagaku Corporation) digestiert und der
resultierende Aufschluß mittels GPC analysiert (Säulen:
TSKgel G4000PWXL, G3000PWXL und G2500PWXL in Reihe
geschaltet; mobile Phase: destilliertes Wasser,
Fließgeschwindigkeit: 0,6 ml/min), wodurch bestätigt werden
konnte, daß die Zuckerzusammensetzung im Aufschluß 40%
Glucose, 30% Laminaribiose, 20% Laminaritriose, 8%
Lamaritetraose, 2% Laminaripentaose, Ausbeute 94%, war. Es
ist somit ersichtlich, daß die Zuckerstruktur der
vorliegenden Probe (Nr. 1) β-Polyglucosid ist, das den
(1T-3)-β-D-Glucosid-Strukturanteil umfaßt.
Herstellungsbeispiel 2
Fraktionierung von Curdlan, abhängig von der
Wasserlöslichkeit
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50 g eines im Handel erhältlichen Curdlans (Proben-Nr. 101)
wurden in destilliertem Wasser suspendiert und gemäß dem im
folgenden Schema dargestellten Verfahren fraktioniert.
Probe Nr. 101 (50 g)/destilliertes Wasser
Rühren bei Raumtemperatur während 1 Stunde
Zentrifugieren (16000xg, 20 Minuten)
Destilliertes Wasser
Ausfällung
Waschen
Trocknen
wasserunlösliche Kohlehydratfraktion Probe Nr. 102
(Waschungen)
Überstand
Waschen Konzentrierung unter vermindertem Druck
Ultrafiltration
Filtra
gefriergetrocknete wasserlösliche Fraktion Probe Nr. 2
Herstellungsbeispiel 3
Herstellung von wasserlöslicher Kohlehydratfraktion von
Curdlan durch Ameisensäure-Zersetzung
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45 g der Probe Nr. 102 wurde einer Ameisensäure-Zersetzung
gemäß dem Verfahren von K. Ogawa et al. unterworfen
[Carbohydr. Res., 29, 297-403 (1973)]. Das Verfahren wird in
dem nachfolgenden Schmema dargestellt.
Probe Nr. 102
zugabe während 10 Minuten
90% Ameisensäure
Rühren während 20 Minuten
Filtration (Glasfilter G3)
Niederschlag
Destilliertes Wasser
Kochen während 2 Stunden zur Deformylierung
Verdampfung zur Trockne unter vermindertem Druck
Rückstand
Resuspendierung
Glasfilter G4-Filtration
wasserunlösliche Fraktion Probe Nr. 4
Filtrat
Verdampfung zur Trockene unter vermindertem Druck
Gefriergetrocknete wasserunlösliche Fraktion Probe Nr. 3
Herstellungsbeispiel 4-1
Refraktionierung der wasserlöslichen Fraktion des
Ameisensäure-Abbauproduktes von Curdlan mittels
Molekularsieben
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0,15 g der im vorstehend beschriebenen Herstellungsbeispiel 3
erhaltenen wasserlöslichen Fraktion (Probe Nr. 3) wurden in
30 ml destilliertem Wasser gelöst und einer GPC unterworfen
(Säulen: TSKgel G3000PWXLx2, G2500PWXLx1, mobile Phase:
destilliertes Wasser, Fließgeschwindigkeit: 0,5 ml/min) und
0,5 ml Fraktionen gesammelt. Nachfolgende Rechromatographie
ergab sechs Proben (Nr. 11 bis 16), mit jeweils einem
verschiedenen Molekulargewicht.
Herstellungsbeispiel 4-2
Refraktionierung der wasserunlöslichen Fraktion des
Ameisensäure-Abbauproduktes von Curdlan durch Molekularsiebe
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0,2 g der im Herstellungsbeispiel 3 erhaltenen
wasserunlöslichen Fraktion (Probe Nr. 4) wurden in 40 ml 0,3M
NaOH-Lösung gelöst und auf gleiche Weise wie im vorstehenden
Herstellungsbeispiel 4-1 fraktioniert, unter Verwendung von
GPC (Säulen: TSKgel G3000PWXLx2, G25000PWXLx1, mobile Phase:
0,3M NaOH-Lösung, Fließgeschwindigkeit: 0,5 ml/min, und
danach einer Rechromatographie unterworfen. Die
resultierenden Eluate wurden durch Zugabe von 0,3M HCl
- Lösung neutralisiert und zwei Proben erhalten, die jeweils
ein verschiedenes Molekulargewicht besaßen (Nr. 17 und 18).
Hestellungsbeispiel 5
Herstellung einer Probe einer wasserunlöslichen Fraktion von
Curdlan durch Ultraschallbehandlung
-
1 g der Probe Nr. 102 wurde in ca. 100 ml 5 mM NaOH-Lösung
suspendiert und die Suspension einer Ultraschallbehandlung
während 12 Minuten bei 20 KHz und 80 W unter Verwendung eines
eisgekühlten Sonicator (Modell 5202PZT, Ohtake Works,
Tokyo) unterworfen, um das Molekulargewicht der Probe zu
verringern.
-
Zur resultierenden Suspension wurde eine 5M NaOH-Lösung
zugegeben, um eine Endkonzentration von 0,3M NaOH in den
Lösungen zu ergeben. Dann wurde die Fraktionierung durch
Chromatographie auf die gleiche Weise wie im vorstehend
beschriebenen Herstellungsbeispiel 4-2 durchgeführt, und acht
Proben mit jeweils einem verschiedenen Molekulargewicht
erhalten (Nr. 19 bis 22 und 103 bis 106).
Herstellungsbeispiel 6-1
Herstellung eines Inhibitors, abgeleitet von Seegras (1)
-
Eine von Eisenia bicyclis abgeleitete Probe wurde gemäß dem
Verfahren von T. Usui et al. (Agric. Biol. Chem. 43, 603-811,
(1979)) hergestellt. 100 g eines im Handel erhältlichen
getrockneten Eisensia bicyclis-Blattwedels (Suita Syoten,
Tokyo) wurden pulverisiert und einer Extraktion mit 80%
Ethanol unterworfen, um die niedermolekulare wasserlösliche
Fraktion zu entfernen. Aus dem resultierenden Rückstand wurde
dann eine Laminaran-Fraktion unter Verwendung von 2% wäßriger
CaCl&sub2;-Lösung extrahiert. Zum Extrakt wurde 95% Ethanol
zugegeben, um eine Endkonzentration von 75% zu ergeben, und
der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugieren
abgetrennt. Nach Waschen mit Ethanol wurde eine rohe
Laminaran-Probe erhalten. Sie wurde dann in destilliertem
Wasser gelöst und mit einem Anionenaustauscher (DEAE-
Toyopearl) behandelt, um verunreinigende saure Substanzen
(Alginsäure, usw.) und Pigmente zu entfernen. Mit Ethanol
wurde eine Wiederausfällung bewirkt und die Probe Nr. 25
erhalten.
Herstellungsbeispiel 6-2
Herstellung eines Inhibitors, abgeleitet von Seegras (II)
-
Eine von Laminaria japonica abgeleitete Probe wurde gemäß dem
in J.J. Connell et al., J. Chem. Soc., 3494 (1950)
beschriebenen Verfahren hergestellt. 100 g im Handel
erhältlicher getrockneter Laminaria japonica-Blattwedel
(Suita Syoten, Tokyo) wurden pulverisiert, eine 0,09M HCl-
Lösung dazugegeben und ca. drei Tage stehen gelassen, um die
Extraktion zu bewirken. Unlösliche Anteile wurden mittels
Filtration entfernt und das resultierende Filtrat einen
weiteren Tag lang stehen gelassen. Ein kleine Menge des
gebildeten Niederschlags wurde durch Zentrifugieren entfernt.
Zum erhaltenen Überstand wurde das 3-fache Volumen Ethanol
zugegeben, um eine Endkonzentration von 75% zu erhalten. Der
so gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugieren
abgetrennt, mit Alkohol gewaschen und getrocknet, und eine
wasserlösliche Laminaran-Fraktion (Probe Nr. 27) erhalten.
Herstellungsbeispiel 7-1
Herstellung eines Inhibitors, abgeleitet von Eumycetes (I)
-
Eine von Eumycetes Sclerotinia libertiana abgeleitete
Sclerotan-Probe wurde gemäß der in Kitahara et al., Res.
Bull. Fac. Agric. Gifu University 8 (1957) 100-105
beschriebenen Methode wie folgt hergestellt. Das entfettete
trockene Pulver des Sclerotiums von Sclerotinia libertiana
(30 g) wurde einer Extraktion mit Wasser unterworfen. Der
resultierende Rückstand wurde dann einer Extraktion mit 7%
NaOH-Löusng unterworfen und eine 10% CuSO&sub4;-Lösung zum Extrakt
zugefügt, um einen Niederschlag zu bilden. Der resultierende
Niederschlag wurde mittels Filtration gesammelt, mit
Chlorwasserstoffsäure-saurem Methanol gewaschen, um Kupfer zu
entfernen, und dann mit 80% Methanol gewaschen, um HCl zu
entfernen. Der Rückstand wurde durch dreimauge Wiederholung
der Waschungen mit Methanol und Ether gereinigt und
getrocknet, und 6 g der Probe Nr. 28 erhalten.
Herstellungsbeispiel 7-2
Herstellung eines Inhibitors, abgeleitet von Eumycetes (II)
-
Eine von Eumycetes Schizophyllum commune abgeleitete Probe
wurde aus im Handel erhältlichem Schizophyllan (Kaken
Chemical, Handelsname: Sonifilan, medizinische Charge Nr.
J61040) gemäß dem in K. Tabata et al., Carbohydr. Res.,
(1981) 89, 121-135 beschriebenen Verfahren hergestellt. Eine
wäßrige Lösung von Schizophyllan wurde 10 Stunden lang auf
die gleiche Weise wie nach dem Verfahren des vorstehenden
Herstellungsbeispiels 5 ultraschallbehandelt und danach einer
Molekularsieb-Fraktionierung unter alkalischen Bedingungen
unterworfen, und drei im Molekulargewicht verschiedene Proben
erhalten (Nr. 29, 30 und 31).
Herstellungsbeispiel 7-3
Herstellung eines Inhibitors, abgeleitet von Eumycetes (III)
-
Eine von Hefe Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe)
abgeleitete β-Glucan-Probe wurde wie folgt hergestellt. 50 ml
destilliertes Wasser wurden zu 90 mg von im Handel
erhältlichem Bäckerhefe-Glucan (Sigma, Chargen-Nr. 56F-4027)
zugegeben, und dann 2 Stunden lang bei Raumtemperatur
gerührt. Nach Zentrifugieren wurden ca. 50 ml des Überstandes
unter vermindertem Druck auf 1 ml aufkonzentriert. Unlösliche
Anteile wurden durch Zentrifugieren entfernt. Auf diese Weise
wurden aus dem Überstand 0,64 g der Probe Nr. 33 erhalten.
Herstellungsbeispiel 8
Herstellung einer von Gersten-β-Glucan abgeleiteten Probe
-
Ein im Handel erhältiches Gersten-β-Glucan (Sigma, Chargen-
Nr. 56F-0652) wurde in 0,3M NaOH-Lösung gelöst und eine
Konzentration von 5 mg/ml erhalten. Dann wurden gemäß dem im
Herstellungsbeispiel 4-2 beschriebenen Verfahren die Lösung
einer Molekularsieb-Fraktionierung unter alkalischen
Bedingungen unterworfen, um die β-Glucan-Probe (Nr. 36) zu
erhalten, die eine enge Molekulargewichtsverteilung besaß.
-
Außerdem wurde das vorstehend beschriebene, im Handel
erhältliche β-Glucan in heißem Wasser mit einer Konzentration
von 5 mg/ml gelöst und danach einer Zentrifugierung (3500
UpM, 10 min) unterworfen. Der so erhaltene Überstand wurde
einer GPC-Fraktion (100 µl pro Ansatz, 50 Ansätze) unter
Verwendung von destilliertem Wasser als mobile Phase gemäß
dem im Herstellungbeispiel 4-1 beschriebenen Verfahren
unterworfen. Die Fraktionierung wurde unter den gleichen
Bedingungen wiederholt und zwei Proben mit verschiedenem
Molekulargewicht erhalten (Proben Nr. 37 und 38).
Herstellungsbeispiel 9
Herstellung von teilweise carboxymethyliertem (1T3)-β-D-
Glucan (Grad der Substitution DS = 0,63)
-
Ein gemäß dem Herstellungsbeispiel 2 erhaltenes
wasserunlösliches Curdlan-Produkt wurde gemäß dem in A.E.
Clarke und B.A. Stone: Phytochemistry 1, (1962) 175-188
beschriebenen Verfahren carboxymethyliert. 100 g eines
wasserunlöslichen Curdlan-Produktes wurden in 1 l einer 5M
NaOH-Lösung bei 0ºC unter einem Stickstoffgasstrom gelöst. Zu
der resultierenden Lösung wurden tropfenweise 236 g
Monochloressigsäure, gelöst in 200 ml Wasser, unter Rühren
zugegeben. Nach Vervollständigung der Zugabe wurde das Rühren
2 Stunden lang bei 60 bis 65ºC fortgesetzt. Das gebildete Gel
wurde durch heftiges Rühren in einem 2,5-fachen Volumen
Ethanol pulverisiert und danach filtriert. Der resultierende
Rückstand wurde sorgfältig hintereinander mit 70% Ethanol,
Ethanol und Ether gewaschen und getrocknet. Das getrocknete
Produkt wurde in 7 l Wasser gelöst und mit 1M Essigsäure
neutralisiert. Dann wurden 40 g Aktivkohle zugegeben und die
resultierende Lösung bei Raumtemperatur eine Stunde lang
gerührt und dann filtriert. Das Filtrat wurde unter
vermindertem Druck auf 1 l aufkonzentriert, und das 3-fache
Volumen Ethanol zugegeben, um einen Niederschlag auszubilden.
Der Niederschlag wurde mit Ethanol und Ether gewaschen und
getrocknet und über konzentrierter Schwefelsäure unter
vermindertem Druck getrocknet, und 113,85 g des gewünschten
Produktes erhalten
-
Das so erhaltene, partiell carboxymethylierte (1T3)-β-D-
Glucan wurde gemäß der Uranylnitrat-Methode von D.F. Durso
(Methods in Carbohydrate Chem. VIII (1980) 127-129), auf
seinen Veretherungsgrad (Grad der Substitution : DS)
untersucht. Als Ergebnis wurde ein solcher von 0,63 gefunden,
was bedeutet, daß 0,63 Reste von drei substituierbaren
Hydroxylgruppen in einem eine Kohlehydratkette aufbauenden
Glucose-Rest substituiert waren.
-
25 mg des resultierenden, teilweise carboxymethylierten
(1T-3)-β-D-Glucans wurden in 5 ml 0,1M Ammoniumacetatlösung
gelöst und mittels GPC fraktioniert (Säule: Toyopearl HW65F,
5 x 100 cm, mobile Phase: 0,1M Ammoniumacetatlösung,
Fließgeschwindigkeit 5,8 ml/min). Die so erhaltene Fraktion
wurde dann einer GPC unter Verwendung verschiedener Säulen
unterworfen (Säulen: TSKgel G6000PWXL + G5000PWXL +
G3000PWXL, in Reihe geschaltet, mobile Phase: 0,1M
Ammoniumacetatlösung, Fließgeschwindigkeit 0,6 ml/min), und
die Probe Nr. 41 erhalten, die eine enge
Molekulargewichtsverteilung besaß (Mn = 231000).
-
Außerdem wurden 0,3 g des partiell carboxymethylierten
(1T-3)-β-D-Glucans in 30 ml destilliertem Wasser gelöst und die
resultierende Lösung ultraschallbehandelt (9 kHz, 180-130 W,
1 Stunde, Sonicator: Insonator Modell 201, hergestellt von
Kubota Works), um das Molekulargewicht zu verringern.
-
Zu einem Anteil von 4,5 ml der resultierenden Lösung wurden
0,5 ml 1M Ammoniumacetatlösung zugegeben. Nach dem Mischen
wurde die Fraktionierung mittels GPC und die Refraktionierung
mittels GPC auf die gleiche Weise wie im Verfahren zur
Herstellung der Probe Nr. 41 durchgeführt. Auf diese Weise
wurden zwei Proben (Nr. 39 und 40) mit einem verschiedenen
Molekulargewicht erhalten.
Herstellungsbeispiel 10
Herstellung von partiell carboxymethyliertem (1T3)-β-D-
Glucan mit einem Substitutionsgrad von 1,2
-
10 g carboxymethyliertes (1T3)-β-D-Glucan mit einem
Substitutionsgrad (DS) von 0,63, erhalten im
Herstellungsbeispiel 9, wurden zu 25 ml einer 10,5M NaOH-
Lösung bei 0ºC in einem Stickstoffstrom zugegeben, um eine
Paste auszubilden. Zu der resultierenden Paste wurde unter
sorgfältigem Rühren eine Monochloressigsäurelösung (10 g/12
ml) zugegeben. Die Mischung wurde auf 60ºC erhitzt und 4
Stunden lang gerührt. Nach dem Abkühlen wurden 30 ml 2M HCl
dazugegeben und dann in 200 ml chlorwasserstoffsaures Ethanol
(40 ml HCl/Ethanol) gegossen. Der so gebildete Niederschlag
wurde hintereinander mit 70% Ethanol, Ethanol und Ether
gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet, und die
Probe Nr. 107 erhalten.
-
Der Substitutionsgrad wurde auf die gleiche Weise wie im
Verfahren zur Messung des partiell carboxymethylierten
(1T-3)-β-D-Glucans mit dem DS von 0,63, erhalten im
Herstellungsbeispiel 9, gemessen. Es wurde ein DS der Probe
von 1,20 gefunden.
Herstellungsbeispiel 11
Herstellung von partiell carboxymethyliertem Laminaran
-
Ein partiell carboxymethyliertes Laminaran wurde aus einem
von Laminaria digitata abgeleiteten Laminaran (Sigma,
Chargen-Nr. 77F-3885) wie nach dem Verfahren der partiellen
Carboxymethylierung des Herstellungsbeispiels 9 gemäß dem in
A.E. Clarke und B.A. Stone: Phytochem. 1 (1962) 175
beschriebenen Verfahren hergestellt, und die Probe Nr. 42 (DS
= 0,06) erhalten.
Herstellungsbeispiel 12
Herstellung von partiell methyliertem (1T3)-β-D-Glucan
-
Gemäß dem in M. Samec, Kolloid-Beihefte 51 (1940) 369
beschriebenen Verfahren wurden 3,0 g eines wasserunlöslichen
Curdlan-Produktes, erhalten im Herstellungsbeispiel 2, in 80
ml Wasser suspendiert, dann 1,35 ml gesättigte wäßrige NaOH-
Lösung in einem Stickstoffgasstrom zugegeben, um das
wasserunlösliche Curdlan-Produkt vollständig zu lösen. Dazu
wurden bei 4ºC 60 g Dimethylsulfat allmählich zugegeben. Nach
ca. 1 Stunde wurde die Reaktionsmischung tropfenweise zu
Aceton zugegeben und der gebildete Niederschlag gesammelt.
Der Niederschlag wurde sorgfältig mit Aceton gewaschen und
über konzentrierter Schwefelsäure unter vermindertem Druck
getrocknet, und 3,13 g des vorstehend beschriebenen Produktes
(Probe Nr. 43, DS = 0,16) erhalten.
Herstellungsbeispiel 13
Herstellung von partiell sulfatiertem Laminaran
-
Von Laminaria digitata abgeleitetes Laminaran wurde in
Pyridin unter Verwendung eines Pyridin-Schwefeltrioxid-
Komplexes (Wako Pure Chemical Industries, Chargen-Nr. PPL
8823) wie nachfolgend beschrieben sulfatiert.
-
0,5 g von sorgfältig getrocknetem von Laminaria digitata
abgeleitetem Laminaran (Sigma, Chargen-Nr. 77F-3885) wurden
in 50 ml entwässertem Pyridin gelöst, 1 g Pyridin-
Schwefeltrioxid-Komplex dazugegeben und dann die Umsetzung
bei 60ºC während 1 Stunde durchgeführt. Zur resultierenden
Reaktionsmischung wurden 100 ml Wasser gegeben und die
Mischung dann abgekühlt und danach mit NaOH neutralisiert.
Die neutralisierte Lösung wurde gegen Wasser unter Verwendung
einer Dialysemembran (Spectropore, Grenze 1000), die vorher
gut mit einer wäßrigen alkalischen Lösung zur Entfernung von
Glucan gewaschen wurde, dialysiert. Nach Konzentrierung des
Dialysates wurde das doppelte Volumen an Aceton dazugegeben,
um eine Kohlehydrat-Komponente auszufällen. Der Niederschlag
wurde mit Aceton gewaschen und über konzentrierter
Schwefelsäure unter vermindertem Druck getrocknet und 0,38 g
des vorstehend beschriebenen Produktes (Probe Nr. 44, DS =
0,14) erhalten.
-
Der Substitutionsgrad der Methylgruppe(n) und Sulfatgruppe(n)
jedes der in den Herstellungsbeispielen 12 und 13 erhaltenen
Produkte wurde gemäß den nachfolgenden unter (1) und (2)
beschriebenen Verfahren bestimmt und berechnet.
-
(1) Ochiai, Tsuda, Sakamoto: Organic quantitative analysis
(microanalysis), Nanzando (1956),
-
(2) R.L. Whistler, Herausgeber, Methods in Carbohydrate
Chemistry III (1964) 229-235, 227-280, Academic Press.
Im Handel erhältliche Proben
-
Die folgenden im Handel erhältlichen Proben wurden, nach
Bestimmung ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften,
direkt oder nach Alkah-Solubilisierung und Neutralisation
den Messungen unterworfen.
-
Glucose: (Wako Pure Chemical Industries, Reagens von
spezieller JIS-Standard entsprechender Qualität),
Probe Nr. 108
-
Laminarioligosaccharide:
(Seikagaku Corporation, reines Reagens)
Proben Nr. 5 bis 10
-
Laminaran: abgeleitet von Eisenia araborea (Nacalai Tesque
Reagens), Probe Nr. 23
-
Laminaran: abgeleitet von E. araborea (Tokyo Kasei Kogyo,
Reagens), Probe Nr. 24
-
Laminaran: abgeleitet von Laminaria digitata (Sigma,
Reagens), Probe Nr. 26
-
Lentinan: abgeleitet von Lentinus edodes (Aginomoto,
medizinische Charge Nr. 9Z01LS), Probe Nr. 32
-
Lichenan: abgeleitet von Cetraria islandica (Sigma,
Reagens), Probe Nr. 34
-
Lichenan: abgeleitet von Usnea barbata (Sigma, Reagens),
Probe Nr. 35
-
Die Ergebnisse der Bestimmung der Molekulargewichte, des die
Faktor G-Aktivierung inhibierenden Titers usw. der vorstehend
beschriebenen Proben sind in der nachstehenden Tabelle 1
angegeben.
Tabelle 1
Tabelle 1 (Fortsetzung)
Tabelle 1 (Fortsetzung)
Tabelle 1 (Fortsetzung)
Tabelle 1 (Fortsetzung)
-
1) Die Zahl für die Zuckerkettenstruktur ist die in der Beschreibung definierte Klazzifizierungsnummer;
-
2) im Hinblick auf Glucose und Laminarioligosaccharide bedeutet Mn ein absolutes Molekulargewicht (theoretischer
Wert). Für die anderen ist Mn im Hinblick auf Polyethylenoxid und Polyethylenglycol gemäß dem getrennt beschriebenen
Molekulargewichtbestimmungsverfahren berechnet.
-
Die Molekulargewichte in der Tabelle sind als mittlere
Molekulargewichte (Mn) (Zahlenmittel) angegeben, definiert
durch die folgende Formel, und bestimmt mittels der oben
beschriebenen Gelpermeationschromatographie (nachfolgend
manchmals als GPC abgekürzt). Die Molekulargewichtsverteilung
wird als Polydispersität (Mw/Mn) durch die folgende Formel
definiert:
-
Mittleres Molekulargewicht (Mn) (Zahlenmittel) =
ΣHi/Σ(Hi/Mi)
-
X (Hixmi)
Mittleres Molekulargewicht (Mw) (Gewichtsmittel) =
Σ(Hi/Mi)/ΣHi
-
Polydispersität = Mw/Mn
-
In den obigen Formeln bedeutet Hi die Höhe des i-ten Peaks
(Probenkonzentration), wenn ein Chromatogramm gleichmäßig
durch die Zeit geteilt wird, und Mi bedeutet das i-te
Molekulargewicht.
-
Der die Faktor-G-Aktivierung inhibierende Titer wurde gemäß
der folgenden Aktivierungstiterbestimmungsmethode der die
Faktor G-Aktivierung inhibierenden Substanz gemessen und in
Einheiten pro mg dargestellt.
-
Die Aktivierungstiter-Bestimmungsmethode der die Faktor G-
Aktivierung inhibierenden Substanz (nachfolgend manchmal als
GI abgekürzt) ist:
-
Ein 200 ml-Anteil einer Reaktionsmischung hat die folgende
Zusammensetzung.
-
(1) Probe (Anmerkung 1): GI-Probe oder 50 µl reines Wasser
[mit oder ohne Zugabe von 10 pg der Faktor G-
aktivierenden Substanz (abgekürzt als GA; Anmerkung 2)]
-
(2) Limulus-Amöbocytenlysat
prokoagulierende Enzymfraktion
(A&sub2;&sub8;&sub0; = 2,5) (Anmerkung 3) 30 µl
-
(3) Limulus-Amöbocytenlysat-Faktor G-
Fraktion (A&sub2;&sub8;&sub0; = 0,9) (Anmerkung 3) 20 µl
-
(4) Tris-Chlorwasserstoffsäure-Puffer
(pH = 8,0) 20 µMol
-
(5) MgCl&sub2; 20 µMol
-
(6) Boc-Leu-Gly-Arg-PNA 0,13 µMol
-
Nach Inkubieren der vorstehend beschriebenen
Reaktionsmischung bei 37ºC während 30 Minuten wurden zu der
Reaktionsmischung je 0,5 ml von 0,04% Natriumnitrit (0,48M
HCl-Lösung), 0,3% Ammoniumsulfamat und 0,07% N-1-
Naphthylethylendiamindihydrochlorid zugegeben, um eine
Färbung durch Diazo-Kupplung zu bewirken. Die Menge der
freigesetzten PNA wurde durch Messen des Absorptionsmaßes bei
545 nm (A&sub5;&sub4;&sub5;) bestimmt. Die GI-Aktivität wurde gemäß der
folgenden Gleichung berechnet:
-
GI-Aktivität (%) =
100 -
{[A&sub5;&sub4;&sub5; der GI-Probe (GA-Addition)] -
[A&sub5;&sub4;&sub5; von reinem Wasser (keine
GA-Addition)]/[A&sub5;&sub4;&sub5; von reinem Wasser (GA-Zugabe)] -
[A&sub5;&sub4;&sub5; von reinem Wasser (keine GA-Addition)]}
x 100
-
Unter diesen Bedingungen wird die GI-Menge, die eine 100%-ige
Inhibierung der Aktivierung des Faktors G durch GA
verursacht, als 100 Einheiten definiert.
-
(Anmerkung 1) Wasserunlösliche Proben werden in 0,3M NaOH
gelöst und mit einem gleichen Volumen an 0,3M
HCl neutralisiert.
-
(Anmerkung 2) Durch GPC-Fraktionierung gereinigtes Produkt
des im vorstehenden Herstellungsbeispiel 5
hergestellten ultraschallbehandelten Curdlan-
Produktes (Tabelle 2, Nr. 106, Molekulargewicht
216000).
-
(Anmerkung 3) Hergestellt aus japanischem Hufeisenkrebs
(horseshoe crab), T. tridentatus, gemäß T.
Obayasi et al., Clin. Chim. Acta., 149 (1985)
55-65).
-
Das durch Fixierung des vorstehend beschriebenen (1T3)-β-D-
Glucosid-Strukturanteils an einen unlöslichen Träger
erhaltene, erfindungsgemäße unlösliche Fixierungsprodukt wird
dann mit LAL in Kontakt gebracht. Der Kontakt kann bei 0 bis
40ºC, und vorzugsweise bei 0 bis 10ºC, und bei einem pH-Wert
von 6 bis 8 durchgeführt werden. Danach wird das unlösliche
immobilisierte Produkt von LAL abgetrennt. Die Abtrennung
kann durchgeführt werden, indem man die Mischung einer
Filtration oder Zentrifugation unterwirft, um das unlösliche
Fixierungsprodukt zu entfernen, oder indem man LAL auf eine
Säule appliziert, die mit dem unlöslichen immobilisierten
Produkt beschickt ist, um das durchgegangene LAL zu erhalten.
-
Da die Menge des unlöslichen immobilisierten Produktes für
das Inkontaktbringen mit LAL abhängig von der Stärke der
inhibierenden Wirkung auf die Faktor G-Aktivierung des an
einen Träger fixierten (1T3)-β-D-Glucosid-Strukturanteils
variiert, kann es z.B. wie folgt bestimmt werden. Unter
Eiskühlung werden verschiedene Mengen des unlöslichen
immobilisierten Produkts (das kein Endotoxin enthält) mit
einer bestimmten Menge an LAL in Kontakt gebracht, dann wird
das unlösliche immobilisierte Produkt durch Zentrifugieren
entfernt, dann eine bestimmte Menge einer Faktor G-
aktivierenden Substanz (die kein Endotoxin und eine die
Faktor G-Aktivierung inhibierende Substanz in einer Menge
enthält, die so klein wie möglich ist) zugefügt, die LAL
unter normalen Bestimmungsbedingungen im wesentlichen
aktivieren kann, und nachfolgend eine Reaktion unter den
gleichen Bedingungen, wie sie normalerweise unter Verwendung
von LAL angewandt werden, durchgeführt. Die Menge des
unlöslichen immobilisierten Produktes, das eine 100%-ige
Inhibierung einer Aktivierung von LAL zeigt, wird unter den
vorstehend beschriebenen Bedingungen bestimmt. Dann wird das
unlösliche immobilisierte Produkt in der oben bestimmten
Menge mit der obenbeschriebenen bestimmten Menge an LAL in
Kontakt gebracht, und danach verschiedene Mengen an Faktor G-
aktivierender Substanz zugegeben, wobei bestätigt wird, daß
LAL mit irgendeiner Menge der Faktor G-aktivierenden Substanz
nicht aktiviert wird. Gemäß dem vorstehend beschriebenen
Verfahren kann die Menge des unlöslichen immobilisierten
Produkts, die erforderlich ist, um die Aktivierung von Faktor
G in einer bestimmten Menge von LAL vollständig zu
inhibieren, bestimmt werden.
-
Die Herstellung des erfindungsgemäßen unlöslichen
immobilisierten Produktes sowie die Herstellung von LAL, das,
wenn es verwendet wird, spezifisch mit Endotoxin reagiert,
wird mittels der folgenden Beispiele beschrieben. Das
unlösliche immobilisierte Produkt wurde gemäß dem Verfahren
von Matsumoto et al. hergestellt (Isamu Matsumoto et al., JP-
A-59-15401).
Herstellungsbeispiel 14
Herstellung von Cellulose, die ein Ameisensäure-Abbauprodukt
(Mn, 5800) von Curdlan darauf immobilisiert enthält
-
2 g Cellulosepulver (100-200 Mesh, hergestellt von Toyo
Roshi) wurden auf einem Glasfilter sorgfältig mit Wasser
gewaschen, und danach einer Saugfiltration unterworfen. Der
so erhaltene Rückstand wurde in einen Kolben gegeben, und 30
ml Wasser, 13 ml einer 2M NaOH -Lösung und 3 ml
Epichlorhydrin hintereinander dazugegeben. Die resultierende
Suspension wurde bei 40ºC 2 Stunden lang gerührt, und dann
sorgfältig auf einem Glasfilter gewaschen, um
Epoxyaktivierte Cellulose zu erhalten. Zu der so erhaltenen
Epoxyaktivierten Cellulose (20 ml) wurden 1,5 Volumina (30 ml)
einer 80%igen wäßrigen Lösung von hydratisiertem Hydrazin
zugegeben, und danach bei 40ºC 1,5 Stunden lang gerührt. Nach
der Reaktion wurde das resultierende Produkt auf einem
Glasfilter sorgfältig mit Wasser gewaschen, um Hydrazino-
Cellulose zu erhalten. Zu 2 g (Naßgewicht) der so erhaltenen
Hydrazino-Cellulose wurden 1,5 ml einer 0,2M K&sub2;HPO&sub4;-Lösung,
in der 50 mg des im Herstellungsbeispiel 4-1 (Probe Nr. 14,
Mn = 5800) erhaltenen Ameisensäure-Abbauprodukts von Curdlan
und 26 mg Natriumcyanoborhydrid gelöst waren, zugegeben, und
danach bei Raumtemperatur 3 Tage lang gerührt. Nach der
Umsetzung wurde das resultierende Produkt auf einem
Glasfilter hintereinander mit 1 ml Wasser und 1 ml einer
wäßrigen 0,2M Natriumacetatlösung gewaschen. 1 ml einer
wäßrigen 0,2M Natriumacetatlösung wurde zugegeben, um eine
Suspension auszubilden, und zur resultierenden Suspension
wurden 0,5 ml Essigsäureanhydrid zugegeben. Nach Umsetzung
bei 00 während 30 Minuten wurden nochmals 0,5 ml
Essigsäureanhydrid zugegeben und die resultierende Mischung
bei Raumtemperatur 30 Minunten lang stehen gelassen, um
dadurch unumgesetzte restliche Hydrazingruppen zu
acetylieren. Nach der Umsetzung wurde das resultierende
Produkt hintereinander mit Wasser, einer 0,1M NaOH-Lösung,
Wasser und phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und
eine Cellulose erhalten, die ein Ameisensäure-Abbauprodukt
von Curdlan darauf immobilisiert enthielt.
Herstellungsbeispiel 15
Herstellung von Laminaran-immobilisierter Cellulose
-
20 g (Naßgewicht) Cellulose (Cellulofine, GC-700-m,
erhältlich von Seikagaku Corporation) wurden auf die gleiche
Weise wie im Herstellungsbeispiel 14 in ein Hydrazinderivat
überführt. Zu 2 g (Naßgewicht) des so erhaltenen
Hydrazinocellulofins wurden 1,5 ml einer wäßrigen 0,2M
K&sub2;HPO&sub4;-Lösung, in der 50 mg von von Laminaria digitata
(erhältlich von Sigma, Chargen-Nr. 77F-3885) abgeleitetes
Laminaran und 26 mg Natriumcyanoborhydrid gelöst waren,
zugegeben, und danach bei Raumtemperatur 3 Tage lang gerührt.
Nach der Umsetzung wurde gemäß dem Verfahren des
Herstellungsbeispiels 14 das resultierende Produkt gewaschen,
zur Acetylierung unumgesetzter restlicher Hydrazingruppen
behandelt und wieder gewaschen. Auf diese Weise wurde
Laminaran-immobilisiertes Cellufine erhalten.
Hestellungsbeispiel 16
Herstellung von Laminaribiose-immobilisiertem synthetischem
hydrophilem Polyvinylpolymer
-
1 kg (Naßgewicht) von Toyopearl (synthetisches hydrophiles
Polyvinylpolymer, HW55, Fine, erhältlich von Tosoh) wurde auf
die gleiche Weise wie im Herstellungsbeispiel 14 behandelt,
um Epoxy-aktiviertes Toyopearl zu erhalten.
-
Zu 800 ml des resultierenden Epoxy-aktivierten Toyopearl
wurden 1,2 l einer 0,1M Na&sub2;CO&sub3;-Lösung, die 92 g
Adipinsäuredihydrazid darin gelöst enthielt und mit
Chlorwasserstoffsäure auf pH = 9 eingestellt wurde,
zugegeben, danach über Nacht bei 40ºC gerührt. Nach der
Umsetzung wurde das resultierende Produkt auf einem
Glasfilter sorgfältig mit einer 0,2M NaCl-Lösung gewaschen,
um Toyopearl-Hydrazid zu erhalten. Zur Gesamtmenge des
resultierenden Toyopearl-Hydrazids wurden 600 ml einer 0,2M
K&sub2;HPO&sub4;-Lösung, in der 32 g Laminaribiose (erhältlich von
Seikagaku Corporation, Charge 8701100) zugegeben, und 10,4
Natriumcyanoborhydrid gelöst, und dann 3 Tage lang bei
Raumtemperatur gerührt. Nach der Umsetzung wurde das
resultierende Produkt auf einem Glasfilter hintereinander mit
Wasser und 0,2M Natriumacetatlösung gewaschen. Dazu wurden
400 ml 0,2M Natriumacetatlösung und 200 ml Essigsäureanhydrid
gegeben, und danach bei 0ºC 30 Minuten lang gerührt. Zur
resultierenden Lösung wurden nochmals 200 ml
Essigsäurenahydrid zugegeben, und dann bei Raumtemperatur
während 30 Minuten gerührt, um dadurch unumgesetzte restliche
Hydrazidgruppen zu acetylieren. Nach der Umsetzung wurde das
resultierende Produkt hintereinander mit Wasser, einer 0,1M
NaOH-Lösung, Wasser und phosphatgepufferter Salzlösung
gewaschen. Auf diese Weise wurde
Laminaribioseimmobilisiertes Toyopearl erhalten.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Fig. 1 zeigt den Reaktionsmechanismus eines Limulus-
Amöbocytenlysat-Koagulierungssystems.
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Fig. 2 zeigt ein Fraktionsmuster (Elutionskurve) eines im
Handel erhältlichen Curdlans, erhalten durch Molekularsieb-
Chromatographie. Das Symbol gibt den die Faktor G-
Aktivierung inhibierenden Titer an (linke Seite,
Ordinatenachse), und Δ gibt den Zuckergehalt an.
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Fig. 3 zeigt ein Fraktionsmuster einer rechromatographierten
Fraktion Nr. 44 bis 46 der Fig. 2. Das Symbol gibt den die
Faktor G-Aktivierung inhibierenden Titer an (linke Seite,
Ordinatenachse) und Δ den Kohlehydratgehalt.
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Die Fig. 4-1 zeigt das Absorptionsmaß, das erhalten wird,
wenn unbehandeltes LAL oder erfindungsgemäß behandeltes LAL
mit verschiedenen Konzentrationen an Endotoxin umgesetzt
wurde.
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Das Symbol bedeutet unbehandeltes LAL, und Δ bedeutet
gemäß Beispiel 2 behandeltes LAL.
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Die Fig. 4-2 zeigt das Absorptionsmaß, das erhalten wurde,
wenn unbehandeltes LAL oder erfindungsgemäß behandeltes LAL
mit verschiedenen Konzentrationen an (1T3)-β-D-Glucan
umgesetzt wurde. Das Symbol bedeutet unbehandeltes LAL,
und Δ bedeutet gemäß dem Beispiel 2 behandeltes LAL.
Beste Ausführungsform zur Durchführung der Erfindung
Beispiel 1
Herstellung von LAL unter Verwendung von an Cellulose
immobilisiertem Ameisensäure-Abbauprodukt von Curdlan
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Cellulose, die ein Ameisensäure-Abbauprodukt von Curdlan
darauf immobilisiert enthält (Naßvolumen 0,4 ml), erhalten
nach dem Herstellungsbeispiel 14, wurde hintereinander mit
1 l 0,1M NaOH und 1 l destilliertem Wasser gewaschen, um
Endotoxin zu eliminieren. Um eine Suspension von 2,6 ml
herzustellen, wurde destilliertes Wasser dazugegeben. 1
Ampulle Pregel-M-Hauptreagens (Limulus-Testprodukt für das
Gelierungsverfahren, gefriergetrocknetes Produkt, Charge
ABOL, Empfindlichkeit 0,125 EU/ml, erhältlich von Seikagaku
Corporation) wurde in der Suspension gelöst, die dann bei
3000 UpM 10 Minuten lang zentrifugiert wurde, um einen
Überstand (LAL-1) zu erhalten. Die Reaktivitäten des so
erhaltenen Überstandes und des in 2,6 ml destilliertem Wasser
gelösten Pregel-M-Hauptreagens (LAL-2) gegenüber Endotoxin
(abgeleitet von E. coli 0111:B4) und gegenüber partiell
carboxymethyliertem (1T3)-β-D-Glucan (Probe Nr. 41),
erhalten im Herstellungsbeispiel 9, nachfolgend als (1T3)-β-
D-Glucan bezeichnet) wurden untersucht, indem man die
Gegenwart oder Abwesenheit einer Gelierung gemäß einem
Standardverfahren für Pregel-M (0,1 ml LAL wurden zu 0,1 ml
einer Probe zugegeben und die Mischung bei 37ºC 60 Minuten
lang stehengelassen) bestimmt. Die Ergebnisse sind in der
Tabelle 2 angegeben, in denen die Symbole + und - die
Gegenwart bzw. Abwesenheit einer Gelierung bedeuten.
TABELLE 2
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Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß LAL-l nur mit Endotoxin
die gewünschte Reaktivität zeigt.
Beispiel 2
Herstellung von LAL unter Verwendung von
Laminaranimmobilisierter Cellulose (Cellulofine)
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0,4 ml (Naßvolumen) von Laminaran-immobilisiertem
Cellulofine, erhalten im Herstellungsbeispiel 15, wurden
nacheinander mit 1 l 0,1M NaOH und 1 l destilliertem Wasser
gewaschen. Dazu wurde destilliertes Wasser gegeben, um ein
Gesamtvolumen von 4 ml zu ergeben. Zu 0,2 ml davon wurden
1,8 ml destilliertes Wasser zugegeben, um eine Suspension
auszubilden, die unter Verwendung einer
Polyvinylidenfluoridmembran (0,22 µm, Millex GV
Filtereinheit, erhältlich von Nihon Millipore Ltd., Charge
Cell) filtriert wurde, um eine Membran zu erhalten, an der
Laminaran-immobilisiertes Cellulofine anhaftete. Getrennt
davon wurde Limulus (Tachypleus tridentatus) Hämolymphe
gesammelt und einer Zentrifugation (3000 UpM, 5 Minuten)
unterworfen, um Hämocyten (ca. 20 g) zu erhalten. 100 ml
0,02M Tris-HCl-Puffer (pH = 8,0) wurden hierzu zugegeben und
die Mischung mittels eines Waring-Mischers homogenisiert und
danach zentrifugiert (8000 UpM, 30 Minuten, 4ºC), um
Überstand und Niederschlag zu trennen. Dieses
Extraktionsverfahren wurde einmal wiederholt und insgesamt
150 ml Überstand erhalten, um als LAL zu dienen. Ein 1 ml-
Anteil des resultierenden LAL wurde unter Verwendung der
vorstehend beschriebenen Membran, an der
Laminaranimmobilisierte Cellulofine anhaftete, filtriert, und ein
Filtrat erhalten. Zu einem 0,04 ml-Anteil des Filtrats wurden
1,5 ug MgCl&sub2; und 4,0 ug eines synthetischen Substrats (N-
tert.-Butoxycarbonyl-Leu-Gly-Arg-p-nitroanilid) zugegeben und
danach gefriergetrocknet. 0,1 ml 0,2M Tris-HCl-Puffer (pH =
8,0) und 0,1 ml einer Probe (eine im Beispiel 1 verwendete
wäßrige Lösung von Endotoxin oder (1T3)-β-D-Glucan in
verschiedenen Konzentrationen) wurden zu dem resultierenden
gefriergetrockneten Produkt zugegeben und die Mischung bei
37ºC 30 Minuten lang inkubiert. Die Umsetzung wurde durch
Zugabe von 0,4 ml 0,6M Esigsäure beendet und das
Absorptionsmaß bei 405 nm gemessen. Die Ergebnisse sowie die
unter Verwendung von unbehandeltem LAL auf die gleiche Weise
erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 4 dargestellt. In Fig. 4
bedeutet das Symbol ein im Falle von unbehandeltem LAL
erhaltenes Absorptionsmaß, und das Symbol Δ bedeutet ein im
Falle der Verwendung von mit Laminaran-immobilisierter
Cellulofine behandeltem LAL erhaltenes Absorptionsmaß. Aus
der Figur ist es klar, daß mit Laminaran-immobilisierter
Cellulofine behandeltes LAL nicht mit (1T3)-β-D-Glucan
reagierte, aber mit Endotoxin reagierte. Endotoxin kann
deshalb unter Verwendung von mit Laminaran-immobilisierter
Cellulofine behandeltem LAL spezifisch bestimmt werden.
Beispiel 3
Herstellung von LAL unter Verwendung von
Laminaribioseimmobilisiertem Toyopearl
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60 ml (Naßvolumen) von Laminaribiose-immobilisiertem
Toyopearl, erhalten im Herstellungsbeispiel 16, wurden auf
einem Glasfilter hintereinander mit 1500 ml 0,1M NaOH und
1500 ml destilliertem Wasser gewaschen. Eine auf die gleiche
Weise wie im Beispiel 2 erhaltene 25-fache Verdünnung von 2
ml unbehandeltem LAL mit destilliertem Wasser wurde
zugegeben, und dann bei 4ºC bei 30 Minuten gerührt. Die
Mischung wurde einer Zentrifugation (3000 UpM, 10 Minuten)
unterworfen. Der so erhaltene Überstand wurde
gefriergetrocknet, dann destilliertes Wasser bis auf ein
Gesamtvolumen von 2 ml zugegeben) Zu einem 0,1 ml-Anteil
davon wurden 0,1 ml verschiedener Konzentrationen einer
wäßrigen Lösung von Endotoxin oder (1T3)-β-D-Glucan
zugegeben, und die Mischung bei 37ºC 60 Minuten lang umsetzen
gelassen. Als Ergebnis wurde keine Gelierung beobachtet, wenn
(1T3)-β-D-Glucan (0,1 bis 10000 ng/ml) zugegeben wurde,
während eine Gelierung beobachtet wurde, wenn Endotoxin (100
pg/ml oder mehr) zugegeben wurde.