DE69123834T2 - Verfahren zur herstellung von limulus amöbozytenlysat - Google Patents

Verfahren zur herstellung von limulus amöbozytenlysat

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DE69123834T2
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Description

    Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Limulus-Amöbocytenlysat.
    • Technischer Hintergrund
  • Es war allgemein bekannt, daß Limulus-Amöbocytenlysat (nachfolgend als LAL bezeichnet) mit einem Endotoxin, das ein bakterielles Pyrogen ist (nachfolgend als Endotoxin bezeichnet), unter Koagulation reagiert.
  • Auf der Basis dieser Reaktion wurden verschiedene Methoden zur Bestimmung von Endotoxin entwickelt.
  • Neuerdings wurde der vorstehend beschriebene Koagulationsreaktionsmechanismus aufgeklärt, d.h. Koagulogen wird in Koagulin überführt, um eine Koagulation (Gelierung) gemäß einer stufenweisen Reaktion, wie sie in Fig. 1 dargestellt wird, zu verursachen [S. Iwanaga et al., The hemolymph coagulation system in invertebrate animals, J. Protein Chem., 5 (1986) 255-268]. Es ist zu erkennen, daß der Reaktionsmechanismus zwei Koagulationssysteme umfaßt: ein durch Endotoxin initliertes System (Faktor C-System) und ein durch (1T3)-β-D-Glucan (d.h. Curdlan, teilweise carboxymethyliertes (1T3)-β-D-Glucan) initiiertes System (Faktor G-System).
  • Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben bereits gefunden, daß der (1T3)-β-D-Glucan-Strukturanteil mit einem bestimmten Molekulargewicht die Aktivierung des durch (1T3)- β-D-Glucan initiierten Systems des LAL (Faktor G-System) inhibiert, und meldeten eine Patentanmeldung für einen Limulus-Amöbocytenlysat-Faktor G-Aktivierungsinhibitor an (japanische Patentanmeldung Nr. 63-216341 und WO 90/02951).
  • Wenn dieser Inhibitor zu LAL zugegeben wird, um ein für Endotoxin spezifisches LAL zu erhalten, wird jedoch möglicherweise ein den Inhibitor und Faktor G umfassender, in LAL verbleibender Komplex mit einer zugegebenen Probe dissoziiert, und der freigesetzte Faktor G wird durch eine Faktor G-aktivierende Substanz aktiviert.
  • Die EP-A-0 333 187 beschreibt Polysaccharid(derivate), die eine β-1,3-glucosidische Bindung enthalten, beschreibt aber nicht einen (1T3)-β-D-Glucosid-Strukturanteil, der durch Depolymerisieren und/oder Fraktionieren einer Kohlehydratkette erhalten wurde.
    • Beschreibung der Erfindung
  • Aufgabenstellung der vorliegenden Erfindung ist es, ein Faktor G-freies LAL bereitzustellen, das im LAL- Koagulationsmechanismus zuerst mit (1T3)-β-D-Glucan aktiviert wird.
  • Die vorliegende Erfindung stellt somit ein Verfahren zur Herstellung eines im wesentlichen Faktor G-freien Limulus- Amöbocytenlysates bereit, umfassend das Inkontaktbringen von Limulus-Amöbocytenlysat mit einem unlöslichen Träger, auf dem ein (1T3)-β-D-Glucosid-Strukturanteil der Formel [I] fixiert ist.
  • worin n eine ganze Zahl von 2 bis 370 bedeutet.
  • Der erfindungsgemäß verwendete (1T3)-β-D-Glucosid- Strukturanteil ist ein Polyglycosid, das in einem Molekül mindestens einen Poly-(1T3)-β-D-glucosid-Strukturanteil [nachfolgend als Poly((1T3)glucosid-Einheit bezeichnet] besitzt, die 2 bis 370, vorzugsweise 3 bis 310, und insbesondere 4 bis 180 aufeinanderfolgende, durch die folgende Formel dargestellte (1T3)-β-D-Glucosid- Struktureinheiten (Molekulargewicht: 162) besitzt.
  • Das erfindungsgemäß verwendete Polyglycosid muß mindestens eine Poly(1T3)glucosid-Einheit im Molekül aufweisen. Das erindungsgemäß verwendete Polyglycosid kann z.B. im wesentlichen aus einer Poly(1T3)glucosid-Einheit bestehen, z.B. aus dem durch die folgende Formel dargestellten (1T3)-β-D-Glucosid
  • worin n eine ganze Zahl von 2 bis 370, vorzugsweise von 3 bis 310, und insbesondere von 4 bis 180 ist. Alternativ kann es eine Struktur besitzen, in der eine Poly(1T3)glucosid- Einheit eine Kohlehydratkette besitzt, die an die vorstehend beschriebene Poly(1T3)glucosid-Einheit als verzweigte Kette gebunden sein kann und aufgebaut ist aus ein oder mehreren durch die folgende Formel dargestellten (1T4)-β-D-Glucosid- Struktureinheiten;
  • einen oder mehreren (1T6)-β-D-Glucosid-Struktureinheiten der folgenden Formel;
  • oder ein oder mehreren durch die folgenden Formeln dargestellten modifizierten β-D-Glucosid-Struktureinheiten;
  • worin mindestens einer der Reste R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; eine chemisch einführbare Gruppe (Gruppen) darstellt, d.h. eine Methylgruppe, eine Hydroxyalkylgruppe, wie z.B. eine Hydroxymethylgruppe, einer Carboxyalkylgruppe, wie z.B. eine Carboxymethylgruppe, eine Acetylgruppe, eine Sulfatgruppe, eine Phosphatgruppe, eine Allylgruppe, ein Metallsalz einer der vorstehend genannten Gruppen, ein Ammoniumsalz einer der vorstehend genannten Gruppen und ein organisches Aminsalz einer der vorstehend genannten Gruppen, und die verbleibenden Gruppen ein Wasserstoffatom bedeuten.
  • Das erfindungsgemäß verwendete Polyglycosid kann außerdem eine Struktur besitzen, in der zwei oder mehr der vorstehend beschriebenen Poly(1T3)glucosid-Einheiten mit jeder anderen über die anderen Kohlehydrat-Einheiten, wie in der nachfolgenden Formel gezeigt, gebunden sind
  • A&sub1;-B&sub1;-A&sub2;-B&sub2;-.....
  • worin jeder der Reste A&sub1;, A&sub2;, ... eine durch die obige Formel (I) dargestellte Poly(1T3)-β-D-glucosid-Einheit mit 2 bis 370, vorzugsweise 3 bis 310, und insbesondere 4 bis 180 (1T-3)-β-D-Glucosid-Struktureinheiten darstellt, die kontinuierlich aneinander gebunden sind, und die Zahl der Einheiten der Formel (I), die jede Einheit A&sub1;, A&sub2;, aufbaut, kann von jeder anderen verschieden sein, und B&sub1;, B&sub2;, ... gleiche oder verschiedene Kohlehydratketten-Einheiten darstellen. Die anderen durch B&sub1;, B&sub2;, ... dargestellten Kohlehydratketten-Strukturanteile können z.B. eine aus einer durch die vorstehend beschriebenen Formeln (II), (III), (IV), (V) oder (VI) dargestellte Struktureinheit oder aus zwei oder mehreren solcher Struktureinheiten aufgebaute Struktureinheit sein.
  • Das erfindungsgemäß verwendete Polyglycosid kann außerdem auch eine solche Struktur aufweisen, bei der die vorstehend beschriebene Poly(1T3)glucosid-Einheit über die anderen durch die vorstehend beschriebenen Reste B&sub1;, B&sub2;, dargestellten Kohlehydratketten-Strukturen an einen langkettigen Poly(1T3)-β-D-Glucosid-Strukturanteil gebunden ist, der aus 371 oder mehr aufeinanderfolgenden, durch die obige Formel (I) dargestellte (1T3)-β-D-Glucosid- Struktureinheiten aufgebaut ist.
  • Das erfindungsgemäß verwendete Polyglycosid enthält deshalb mindestens eine der vorstehend beschriebenen Poly(1T-3)glucosid-Einheiten pro Molekül, und sein Molekulargewicht ist nicht besonders begrenzt.
  • Es ist außerdem bevorzugt, daß das erfindungsgemäß verwendete Polyglycosid im wesentlichen mindestens eine der vorstehend beschriebenen Poly(1T3)glucosid-Einheiten pro Molekül enthält, ohne darauf beschränkt zu sein. Es kann auch z.B. andere Polyglycoside enthalten, einschließlich einer Poly(1T-3)-β-D-Glucosid-Einheit mit hohem Molekulargewicht, die 371 oder mehr aufeinanderfolgende, durch die vorstehende Formel (1) dargestellte (1T3)-β-D-Glucosid-Struktureinheiten aufweist. Dies deshalb, weil das erfindungsgemäße Polyglycosid rascher und stärker an Faktor G gebunden wird, der ein ein Faktor G-Aktivierungssystem von LAL initiierender Faktor ist, als ein Poly(1T3)-β-D-glucosid mit hohem Molekulargewicht, das eine Faktor G-aktivierende Substanz ist, die verwendet wird, um dadurch die Aktivierung des Faktors G zu einem aktivierten Faktor G zu inhibieren. Die Gegenwart eines solchen Poly(1T3)-β-D-Glucosids mit hohem Molekulargewicht beinträchtigt deshalb die inhibierende Wirkung des erfindungsgemäßen Polyglycosids nicht wesentlich.
  • Das Molekulargewicht des hier verwendeten Polyglycosids wird bestimmt, indem man eine Gelpermeationschromatographie unter Verwendung einer Standardsubstanz mit bekanntem Molekulargewicht verwendet, unter den folgenden Bedingungen durchgeführt, um eine Eichkurve herzustellen, die Testprobe der Gelpermeationschromatographie unter den gleichen Bedingungen unterwirft und die Ergebnisse mit der Eichkurve vergleicht.
  • Säule: TSKgel G-PWXL Serie (Tosoh Corporation), 7,8 x 300 mm, mehrere Säulen verschiedener Typen,
  • Mobile Phase: 0,3M NaOH
  • Fließgeschwindigkeit 0,5 ml/min
  • Konzentration der Probenlösung: 0,1 bis 5 mg/ml
  • Injiziertes Volumen der Probenlösung: 0,1 ml
  • Säulentemperatur: Raumtemperatur
  • Bestimmungsmethode: Messung durch ein Differential- Refraktometer (LKB Co.) oder quantitative Analyse des Kohlehydrats durch die Phenol-Schwefelsäuremethode
  • Standardsubstanz: TSK-Standard-Polyethylenoxid (Tosoh- Corporation) und Polyethylenglycol (Nacalai Tesque), 10 Arten, mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht im Bereich von 1000 bis 860000
  • Die wie vorstehend definierten erfindungsgemäßen Polyglycoside können aus natürlichen Quellen abgeleitet werden oder synthetisiert werden. Sie können auch teilweise chemisch modifizierte Produkte von Poly(1T3)-β-D-glucosid mit drei oder mehreren durch die vorstehende Formel (I) dargestellten (1T3)-β-D-Glucosid-Struktureinheiten sein. Normalerweise sind die aus natürlichen Quellen abgeleiteten Produkte leicht erhältlich. Beispiele solcher Polyglycoside werden nachfolgend angegeben.
  • (1) Im wesentlichen geradkettige Polyglucoside, die im wesentlichen aus den durch die vorstehende Formel (I) dargestellten (1T3)-β-D-Glucosid-Struktureinheiten bestehen, wie z.B. von Bakterien des Genus Alcaligenes abgeleitete (1T3)-β-D-Glucane, von Flagellaten Euglena abgeleitetes Paramylon, von faserigen Geweben höherer Pflanzen abgeleitete β-Glucane oder von Siebhülsen höherer Pflanzen extrahierte Callose, D-Glucose-Polymere mit (1T3)-β-Bindungen, die in teilweise hydrolysierten Produkten von von Braunalgen abgeleiteten Laminaranen vom Genus Laminaria und Eisenia enthalten sind, oder das vorstehend beschriebene (1T3)-β-D- Glucan, Laminaridextrine mit einem Polymerisationsgrad von 10 bis 20, Laminari-Oligosaccharide mit einem Polymerisationsgrad von 10 oder weniger, usw..
  • (2) Polyglycoside, die die durch die obige Formel (I) dargestellten (1T3)-β-D-Glucosid-Struktureinheiten und die durch die obige Formel (III) dargestellten (1T6)-β-D- Glucosid-Struktureinheiten umfassen, wie z.B.
  • a) Polyglucoside mit einer Haupt-Kohlehydratkette mit (1T-3)-β-Bindungen, die eine oder mehrere durch die (1T6)-β- Bindung verbundene Glucosen umfassen, z.B. von Braunalgen des Genus Eisenia abgeleitete Laminarane;
  • b) wie unter a) beschriebene Polyglycoside, in denen eine Kohlehydratkette mit den (1T3)-β-Bindungen an die Glucose oder die Glucosepolymeren als verzweigte Kette über eine (1T-6)-β-Bindung gebunden ist, und die außerdem teilweise andere Kohlehydrat-Anteile umfassen können, z.B. von Braunalgen des Genus Laminaria abgeleitete Laminarane, von Kieselalgen, Ochromonas, Phäodactylum, Skeletonema, Biddulphia, Coscinodiscus und Chätoceros abgeleitete Chrysolaminarane, und von Poria abgeleitetes Pachyman;
  • c) Polyglycoside mit viel mehr dendridenförmigen Verzweigungen, wie z.B. in den Zellwänden von Ascomycetes, Basidiomycetes und Phycomycetes enthaltendes β-Glucan, z.B. von der Zellwand von Phytophthora abgeleitete Glucane usw.;
  • d) Polyglycoside mit einem geradkettigen ((1T3)-β-Glucan, an das über die (1T6)-β-Bindung Glucose gebunden ist, z.B. von Sclerotinia abgeleitetes Sclerotan, das an jedem dritten Glucosyl-Rest der Hauptkette eine Glucosyl-Verzweigung aufweist, von Schizophyllum abgeleitetes Schizophyllan, von Grifola frondosa abgeleitetes Grifolan LE, von Sclerotium, Corticium und Stromatinia abgeleitete Scleroglucane usw., oder solche mit einem geradkettigen (1T3)-β-Glucan, an das über die (1T6)-β-Bindung in einer Menge von zwei Glucosyl- Resten pro fünf Glucosyl-Resten der Hauptkette Glucosen gebunden sind, z.B. von Lentinus abgeleitetes Lentinan usw., und
  • e) Polyglycoside mit einem geradkettigen (1T6)-β-Glucan mit mehreren Glucoseverzweigungen von der C-3-Stellung der Glucose-Reste der Hauptkette über die (1T3)-β-Bindung, z.B. von der Zellwand von Saccharomyces (Bäckerhefe) abgeleitetes β-Glucan, usw..
  • (3) Polyglycoside mit den durch die obige Formel (I) dargestellten (1T3)-β-D-Glucosid-Struktureinheiten und den durch die obigen Formel (II) dargestellten (1T4)-β-D- Glucosid-Struktureinheiten, z.B. von Cetraria, Usnea, Evernia, usw. abgeleitete Lichenane, in Endosperm von Gerste enthaltene β-Glucane usw., die aus einer Kohlehydratkette aufgebaut sind, die (1T4)-β-Oligoglucoside, die aneinander über die (1T3)-β-Bindung gebunden sind und in Intervallen (1-T3)-β-Oligoglucoside enthalten, umfaßt.
  • Einige der vorstehend beschriebenen Polyglycoside sind im Handel erhältlich und können als solche verwendet werden. Wenn erforderlich, werden die Polyglycoside nach einer teilweisen Zersetzung und/oder Fraktionierungsbehandlung verwendet, um eine Fraktion herzustellen, die reich ist an einem Polyglycosid, das die durch obige Formel (I) dargestellte (1T3)-β-D-Glucosid-Struktureinheit in der vorstehend angegebenen Menge enthält.
  • Eine solche partielle Zersetzung und Fraktionierungsbehandlung kann gemäß einem bekannten Verfahren durchgeführt werden. Die partielle Zersetzung einer Kohlehydratkette kann z.B. bewirkt werden durch Hydrolyse mit einer Säure, einem Alkali oder β-Glucanase, Acetolyse, Ultraschallbehandlung oder dergleichen. Eine Molekulargewichts-Fraktionierung kann durchgeführt werden durch Ausfällen mit einem organischen Lösungsmittel, wie z.B. Alkohol, Aceton und Ether, oder Salzen, oder mittels einer Fraktionierung unter Verwendung eines Molekularsieb-Mittels oder einer Molekularsieb-Membran.
  • Ein Teil der Kohlehydratketten des vorstehend unter (1) bis (3) beispielhaft angegebenen Polyglycosids kann auch chemisch modifiziert sein mit einer Alkylgruppe, wie z.B. einer Methylgruppe, eine Hydroxyalkylgruppe, wie z.B. einer Hydroxymethylgruppe, einer Carboxyalkylgruppe, wie z.B. einer Carboxymethylgruppe, einer Säuregruppe, wie z.B. einer Acetylgruppe, einer Sulfatgruppe oder einer Phosphatgruppe, oder anderen funktionellen Gruppen. Sie können hergestellt werden, indem man diese funktionellen Gruppen gemäß einem bekannten Verfahren einführt [vgl. z.B. (1) Seikagakukenkyuho (Methods of Studying Biochemistry) 1, herausgegeben von Ando, Terayama, Nishizawa und Yamakawa, (1967) 284-303, Asakura Shoten, (2) R.L. Whistler, Herausgeber: Methods in Carbohydrate Chmistry III, (1964) 193-267, 271-331, Academic Press, usw.]. Insbesondere wird ein (1T3)-β-Glucan mit einem Molekulargewicht von 60000 oder mehr und einer Faktor G- aktivierenden Wirkung brauchbar, wenn es einer partiellen chemischen Modifizierung unterworfen wird, um die Zahl der durch die obige Formel (I) dargestellten (1T3)-β-D-Glucosid- Struktureinheiten in der Poly(1T3)-β-D-glucosid-Einheit auf 370 oder weniger einzustellen.
  • Geeignete Beispiele der erfindungsgemäßen Polyglycoside sind deshalb die folgenden:
  • - Laminarioligosaccharide mit einem Molekulargewicht von 342 bis 1638;
  • - Laminaridextrin mit einem Molekulargewicht von 1800 bis 3258;
  • - (1T3)-β-D-Glucan mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 2000 bis 60000;
  • - Laminaran mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 3000 bis 23000;
  • - Sclerotan mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 3000 bis 20000;
  • - Schizophyllan mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 500000 oder weniger;
  • - Lentinan mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 1100000 oder weniger;
  • - von Bäckerhefe abgeleitetes wasserlösliches Glucan mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 12000 oder weniger;
  • - Lichenan mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 33000 oder weniger;
  • - Gersten-β-Glucan mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 200000 oder weniger;
  • - partiell carboxymethyliertes (1T3)-β-D-Glucan (Substitutionsgrad: 0,003 bis 1,0) mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 40000 bis 240000, z.B. erhalten durch eine partielle Carboxymethylierung von Curdlan und Salzen davon;
  • - partiell carboxymethyliertes Laminaran (Substitutionsgrad: 1,0 oder weniger) mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 23000 oder weniger, und Salze davon;
  • - partiell methyliertes (1T3)-β-D-Glucan (Substitutionsgrad: 0,003 bis 1,0) mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 80000 oder weniger;
  • - partiell sulfatiertes Laminaran (Substitutionsgrad: 1, oder weniger) mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 23000 oder weniger, und Salzen davon.
  • Zur Immobilisierung des vorstehend beschriebenen (1T3)-β-D- Glucosid-Strukturanteils mit der Poly(1T3)glucosid-Einheit kann irgendein unlöslicher Träger verwendet werden, solange er hydrophile Gruppen, wie z.B eine Hydroxygruppe und eine Carbamoylgruppe, besitzt. Beispiele für diese unlöslichen Träger sind die folgenden: Cellulose, wie z.B. Cellulosepulver (erhältlich von Advantec Toyo), Cellulofine (erhältlich von Seikagaku Corporation), Avicel (erhältlich von Funakoshi Pharmaceutical), Cellex (erhältlich von Bio- Rad); Agarose, wie z.B. Sepharose (erhältlich von Pharmacia), Biogel A (erhältlich von Bio-Rad), Chromagel A (erhältlich von Dojindo Laboratories), Sagavac (erhältlich von Seravac Laboratories), Gelarose (erhältlich von Litex), P-L-Agarose (erhältlich von P-L Biochemicäls); vernetztes Dextran, wie z.B. Sephadex G und Sephacryl (erhältlich von Pharmacia), P-L Dex (erhältlich von P-L Biochemicals); Polyacrylamid, wie z.B. Biogel P (erhältlich von Bio-Rad), Chromagel P (erhältlich von Dojindo Laboratories); poröses Glas, wie z.B. Bioglas (erhältlich von Bio-Rad); hydrophiles synthetisches Polyvinylpolymer, wie z.B. Toyo-Pearl (erhältlich von Tosoh).
  • Zur Immobilisierung des (1T3)-β-D-Glucosid-Strukturanteils an diese unlöslichen Träger müssen diese Träger aktiviert werden. Es können verschiedene Aktivierungsverfahren genannt werden, die für einen Träger mit Hydroxylgruppen eine Cyanogenbromid-Methode (R. Axen, J. Porath und S. Ernback, Nature, 214 (1967) 1302) und eine Methode unter Verwendung von Oxiranen (J. Porath und N. Fornstedt, J. Chromatogr., 51 (1970) 479, und L. Sundberg und J. Porath, J. Chromatogr., 90 (1974) 87) umfassen, für einen Träger mit Carbamoylgruppen eine Methode unter Verwendung eines Alkyldiamins, um den Träger in ein Aminoalkylaminderivat zu überführen, und eine Methode unter Verwendung von Hydrazin, um den Träger in ein Hydrazinderivat zu überführen (beide Methoden werden in J.K. Inman und H.M. Dintzis, Biochemistry, 8 (1969) 4074 beschrieben). Im Hinblick auf die Stabilität und eine herabgesetzte nicht spezifische Absorption ist eine Methode hervorragend, die die Epoxy-Aktivierung eines Trägers mit Epichlorhydrin oder Bisoxiranen, Umsetzung des resultierenden Epoxy-aktivierten unlöslichen Trägers mit Hydrazinhydrat oder einer Dihydrazidverbindung, um ein Hydrazinderivat oder ein Dihydrazidderivat zu erhalten, das als aktiviertes Produkt dient, umfaßt (Isamu Matsumoto et al., JP-A-59-15401)
  • Das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete LAL ist nicht besonders beschränkt, solange es aus Limulus-Blutkörperchen extrahiert wird und sein Faktor C-System in einer Reaktion mit Endotoxin aktiviert wird. Solche verwendbaren LAL umfassen handelsüblich erhältliche Produkte, wie z.B. ein gefriergetrocknetes Produkt von LAL, ein gefriergetrocknetes Produkt von LAL mit einem synthetischen Substrat und dergleichen.
  • Verschiedene im Handel erhältliche Lysate sind die folgenden: Pregel, Pregel-S, Pregel-M, Pyrodick, Toxicolor (alle von Seikagaku Corporation erhältlich), Limulus II-Test Wako, Limulus II-Single-Test Wako, Limulus HS II-Test Wako, Limulus HS II-Single-Test Wako, Limulus S II-Single-Test Wako, Limulus-Amöbocytenlysat II (gefriergetrocknetes Produkt), Limulus-Amöbocytenlysat-HS II (gefriergetrocknetes Produkt) (alle erhältlich von Wako Pure Chemical Industries), Pyrotell (erhältlich von Cape Cod), Pyrosat (erhältlich von Haemachem), Pyrogent , Pyrogent Plus, Pyrogent Singletest, pyrogent Multitest, LAL Singletest-Kit, QCL-1000, Kinetic QCL (alle erhältlich von Whittaker Bioproducts), Coatest Endotoxin (Kabi Bitrum).
  • Das Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäß verwendeten (1T3)-β3-D-Glucosid-Strukturanteils wird nachfolgend detaillierter beschrieben.
  • Der erfindungsgemäß verwendete (1T3)-β-D-Glucosid- Strukturanteil kann z.B. hergestellt werden durch das in den folgenden Herstellungsbeispielen beschriebene Verfahren. Im Handel erhältliche (1T3)-β-D-Glucan-Produkte, die in den Rahmen der vorliegenden Erfindung fallen, können als solche verwendet werden.
    • Herstellungsbeispiel 1 Herstellung von im Handel erhältlichen Curdlan mittels Molekularsieb-chromatographischer Fraktionierung
  • 1 g Curdlan (Wako Pure Chemical Indsutries, Chargen-Nr. PEQ 9080, Mn> 136000, Mw/Mn> 2,76, Probe Nr. 101) wurde in 0,3M NaOH (5 mg/ml) gelöst. Anteile von je 100 ml der resultierenden Lösung wurden einer Gelpermeationschromatographie (nachfolgend als GPC abgekürzt) bei Raumtemperatur unter den folgenden Bedingungen unterworfen. {Säulen: TSKgel G6000PWNX und G5000PWXL (beide 7,8x300 mm) werden in Reihe verbunden; mobile Phase: 0,3M NaOH, Fließgeschwindigkeit: 0,5 ml/min}. Die eluierte Fraktion niedrigen Molekulargewichts (Nr. 44 bis 46) wurde gesammelt und dann weiter einer Chromatographie unterworfen, um 0,015 mg einer Probe (Probe Nr. 1) zu erhalten, die ein durchschnittliches Molekulargewicht (Zahlenmittel) von 3050 und eine Polydispersität von 1,29 besaß. Das vorstehend beschriebene GPC-Fraktionierungsmuster ist in Fig. 2 dargestellt. Die durch Rechromatographie der Fraktion Nr. 44 bis 46 in Fig. 2 erhaltenen Fraktionierungsmuster sind in Fig. 3 dargestellt.
  • Die Probe Nr. 1 wurde mit β-1,3-Glucanase (Zymolyase-100T), erhältlich von Seikagaku Corporation) digestiert und der resultierende Aufschluß mittels GPC analysiert (Säulen: TSKgel G4000PWXL, G3000PWXL und G2500PWXL in Reihe geschaltet; mobile Phase: destilliertes Wasser, Fließgeschwindigkeit: 0,6 ml/min), wodurch bestätigt werden konnte, daß die Zuckerzusammensetzung im Aufschluß 40% Glucose, 30% Laminaribiose, 20% Laminaritriose, 8% Lamaritetraose, 2% Laminaripentaose, Ausbeute 94%, war. Es ist somit ersichtlich, daß die Zuckerstruktur der vorliegenden Probe (Nr. 1) β-Polyglucosid ist, das den (1T-3)-β-D-Glucosid-Strukturanteil umfaßt.
    • Herstellungsbeispiel 2 Fraktionierung von Curdlan, abhängig von der Wasserlöslichkeit
  • 50 g eines im Handel erhältlichen Curdlans (Proben-Nr. 101) wurden in destilliertem Wasser suspendiert und gemäß dem im folgenden Schema dargestellten Verfahren fraktioniert. Probe Nr. 101 (50 g)/destilliertes Wasser Rühren bei Raumtemperatur während 1 Stunde Zentrifugieren (16000xg, 20 Minuten) Destilliertes Wasser Ausfällung Waschen Trocknen wasserunlösliche Kohlehydratfraktion Probe Nr. 102 (Waschungen) Überstand Waschen Konzentrierung unter vermindertem Druck Ultrafiltration Filtra gefriergetrocknete wasserlösliche Fraktion Probe Nr. 2
    • Herstellungsbeispiel 3 Herstellung von wasserlöslicher Kohlehydratfraktion von Curdlan durch Ameisensäure-Zersetzung
  • 45 g der Probe Nr. 102 wurde einer Ameisensäure-Zersetzung gemäß dem Verfahren von K. Ogawa et al. unterworfen [Carbohydr. Res., 29, 297-403 (1973)]. Das Verfahren wird in dem nachfolgenden Schmema dargestellt. Probe Nr. 102 zugabe während 10 Minuten 90% Ameisensäure Rühren während 20 Minuten Filtration (Glasfilter G3) Niederschlag Destilliertes Wasser Kochen während 2 Stunden zur Deformylierung Verdampfung zur Trockne unter vermindertem Druck Rückstand Resuspendierung Glasfilter G4-Filtration wasserunlösliche Fraktion Probe Nr. 4 Filtrat Verdampfung zur Trockene unter vermindertem Druck Gefriergetrocknete wasserunlösliche Fraktion Probe Nr. 3
    • Herstellungsbeispiel 4-1 Refraktionierung der wasserlöslichen Fraktion des Ameisensäure-Abbauproduktes von Curdlan mittels Molekularsieben
  • 0,15 g der im vorstehend beschriebenen Herstellungsbeispiel 3 erhaltenen wasserlöslichen Fraktion (Probe Nr. 3) wurden in 30 ml destilliertem Wasser gelöst und einer GPC unterworfen (Säulen: TSKgel G3000PWXLx2, G2500PWXLx1, mobile Phase: destilliertes Wasser, Fließgeschwindigkeit: 0,5 ml/min) und 0,5 ml Fraktionen gesammelt. Nachfolgende Rechromatographie ergab sechs Proben (Nr. 11 bis 16), mit jeweils einem verschiedenen Molekulargewicht.
    • Herstellungsbeispiel 4-2 Refraktionierung der wasserunlöslichen Fraktion des Ameisensäure-Abbauproduktes von Curdlan durch Molekularsiebe
  • 0,2 g der im Herstellungsbeispiel 3 erhaltenen wasserunlöslichen Fraktion (Probe Nr. 4) wurden in 40 ml 0,3M NaOH-Lösung gelöst und auf gleiche Weise wie im vorstehenden Herstellungsbeispiel 4-1 fraktioniert, unter Verwendung von GPC (Säulen: TSKgel G3000PWXLx2, G25000PWXLx1, mobile Phase: 0,3M NaOH-Lösung, Fließgeschwindigkeit: 0,5 ml/min, und danach einer Rechromatographie unterworfen. Die resultierenden Eluate wurden durch Zugabe von 0,3M HCl - Lösung neutralisiert und zwei Proben erhalten, die jeweils ein verschiedenes Molekulargewicht besaßen (Nr. 17 und 18).
    • Hestellungsbeispiel 5 Herstellung einer Probe einer wasserunlöslichen Fraktion von Curdlan durch Ultraschallbehandlung
  • 1 g der Probe Nr. 102 wurde in ca. 100 ml 5 mM NaOH-Lösung suspendiert und die Suspension einer Ultraschallbehandlung während 12 Minuten bei 20 KHz und 80 W unter Verwendung eines eisgekühlten Sonicator (Modell 5202PZT, Ohtake Works, Tokyo) unterworfen, um das Molekulargewicht der Probe zu verringern.
  • Zur resultierenden Suspension wurde eine 5M NaOH-Lösung zugegeben, um eine Endkonzentration von 0,3M NaOH in den Lösungen zu ergeben. Dann wurde die Fraktionierung durch Chromatographie auf die gleiche Weise wie im vorstehend beschriebenen Herstellungsbeispiel 4-2 durchgeführt, und acht Proben mit jeweils einem verschiedenen Molekulargewicht erhalten (Nr. 19 bis 22 und 103 bis 106).
    • Herstellungsbeispiel 6-1 Herstellung eines Inhibitors, abgeleitet von Seegras (1)
  • Eine von Eisenia bicyclis abgeleitete Probe wurde gemäß dem Verfahren von T. Usui et al. (Agric. Biol. Chem. 43, 603-811, (1979)) hergestellt. 100 g eines im Handel erhältlichen getrockneten Eisensia bicyclis-Blattwedels (Suita Syoten, Tokyo) wurden pulverisiert und einer Extraktion mit 80% Ethanol unterworfen, um die niedermolekulare wasserlösliche Fraktion zu entfernen. Aus dem resultierenden Rückstand wurde dann eine Laminaran-Fraktion unter Verwendung von 2% wäßriger CaCl&sub2;-Lösung extrahiert. Zum Extrakt wurde 95% Ethanol zugegeben, um eine Endkonzentration von 75% zu ergeben, und der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugieren abgetrennt. Nach Waschen mit Ethanol wurde eine rohe Laminaran-Probe erhalten. Sie wurde dann in destilliertem Wasser gelöst und mit einem Anionenaustauscher (DEAE- Toyopearl) behandelt, um verunreinigende saure Substanzen (Alginsäure, usw.) und Pigmente zu entfernen. Mit Ethanol wurde eine Wiederausfällung bewirkt und die Probe Nr. 25 erhalten.
    • Herstellungsbeispiel 6-2 Herstellung eines Inhibitors, abgeleitet von Seegras (II)
  • Eine von Laminaria japonica abgeleitete Probe wurde gemäß dem in J.J. Connell et al., J. Chem. Soc., 3494 (1950) beschriebenen Verfahren hergestellt. 100 g im Handel erhältlicher getrockneter Laminaria japonica-Blattwedel (Suita Syoten, Tokyo) wurden pulverisiert, eine 0,09M HCl- Lösung dazugegeben und ca. drei Tage stehen gelassen, um die Extraktion zu bewirken. Unlösliche Anteile wurden mittels Filtration entfernt und das resultierende Filtrat einen weiteren Tag lang stehen gelassen. Ein kleine Menge des gebildeten Niederschlags wurde durch Zentrifugieren entfernt. Zum erhaltenen Überstand wurde das 3-fache Volumen Ethanol zugegeben, um eine Endkonzentration von 75% zu erhalten. Der so gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugieren abgetrennt, mit Alkohol gewaschen und getrocknet, und eine wasserlösliche Laminaran-Fraktion (Probe Nr. 27) erhalten.
    • Herstellungsbeispiel 7-1 Herstellung eines Inhibitors, abgeleitet von Eumycetes (I)
  • Eine von Eumycetes Sclerotinia libertiana abgeleitete Sclerotan-Probe wurde gemäß der in Kitahara et al., Res. Bull. Fac. Agric. Gifu University 8 (1957) 100-105 beschriebenen Methode wie folgt hergestellt. Das entfettete trockene Pulver des Sclerotiums von Sclerotinia libertiana (30 g) wurde einer Extraktion mit Wasser unterworfen. Der resultierende Rückstand wurde dann einer Extraktion mit 7% NaOH-Löusng unterworfen und eine 10% CuSO&sub4;-Lösung zum Extrakt zugefügt, um einen Niederschlag zu bilden. Der resultierende Niederschlag wurde mittels Filtration gesammelt, mit Chlorwasserstoffsäure-saurem Methanol gewaschen, um Kupfer zu entfernen, und dann mit 80% Methanol gewaschen, um HCl zu entfernen. Der Rückstand wurde durch dreimauge Wiederholung der Waschungen mit Methanol und Ether gereinigt und getrocknet, und 6 g der Probe Nr. 28 erhalten.
    • Herstellungsbeispiel 7-2 Herstellung eines Inhibitors, abgeleitet von Eumycetes (II)
  • Eine von Eumycetes Schizophyllum commune abgeleitete Probe wurde aus im Handel erhältlichem Schizophyllan (Kaken Chemical, Handelsname: Sonifilan, medizinische Charge Nr. J61040) gemäß dem in K. Tabata et al., Carbohydr. Res., (1981) 89, 121-135 beschriebenen Verfahren hergestellt. Eine wäßrige Lösung von Schizophyllan wurde 10 Stunden lang auf die gleiche Weise wie nach dem Verfahren des vorstehenden Herstellungsbeispiels 5 ultraschallbehandelt und danach einer Molekularsieb-Fraktionierung unter alkalischen Bedingungen unterworfen, und drei im Molekulargewicht verschiedene Proben erhalten (Nr. 29, 30 und 31).
    • Herstellungsbeispiel 7-3 Herstellung eines Inhibitors, abgeleitet von Eumycetes (III)
  • Eine von Hefe Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe) abgeleitete β-Glucan-Probe wurde wie folgt hergestellt. 50 ml destilliertes Wasser wurden zu 90 mg von im Handel erhältlichem Bäckerhefe-Glucan (Sigma, Chargen-Nr. 56F-4027) zugegeben, und dann 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zentrifugieren wurden ca. 50 ml des Überstandes unter vermindertem Druck auf 1 ml aufkonzentriert. Unlösliche Anteile wurden durch Zentrifugieren entfernt. Auf diese Weise wurden aus dem Überstand 0,64 g der Probe Nr. 33 erhalten.
    • Herstellungsbeispiel 8 Herstellung einer von Gersten-β-Glucan abgeleiteten Probe
  • Ein im Handel erhältiches Gersten-β-Glucan (Sigma, Chargen- Nr. 56F-0652) wurde in 0,3M NaOH-Lösung gelöst und eine Konzentration von 5 mg/ml erhalten. Dann wurden gemäß dem im Herstellungsbeispiel 4-2 beschriebenen Verfahren die Lösung einer Molekularsieb-Fraktionierung unter alkalischen Bedingungen unterworfen, um die β-Glucan-Probe (Nr. 36) zu erhalten, die eine enge Molekulargewichtsverteilung besaß.
  • Außerdem wurde das vorstehend beschriebene, im Handel erhältliche β-Glucan in heißem Wasser mit einer Konzentration von 5 mg/ml gelöst und danach einer Zentrifugierung (3500 UpM, 10 min) unterworfen. Der so erhaltene Überstand wurde einer GPC-Fraktion (100 µl pro Ansatz, 50 Ansätze) unter Verwendung von destilliertem Wasser als mobile Phase gemäß dem im Herstellungbeispiel 4-1 beschriebenen Verfahren unterworfen. Die Fraktionierung wurde unter den gleichen Bedingungen wiederholt und zwei Proben mit verschiedenem Molekulargewicht erhalten (Proben Nr. 37 und 38).
    • Herstellungsbeispiel 9 Herstellung von teilweise carboxymethyliertem (1T3)-β-D- Glucan (Grad der Substitution DS = 0,63)
  • Ein gemäß dem Herstellungsbeispiel 2 erhaltenes wasserunlösliches Curdlan-Produkt wurde gemäß dem in A.E. Clarke und B.A. Stone: Phytochemistry 1, (1962) 175-188 beschriebenen Verfahren carboxymethyliert. 100 g eines wasserunlöslichen Curdlan-Produktes wurden in 1 l einer 5M NaOH-Lösung bei 0ºC unter einem Stickstoffgasstrom gelöst. Zu der resultierenden Lösung wurden tropfenweise 236 g Monochloressigsäure, gelöst in 200 ml Wasser, unter Rühren zugegeben. Nach Vervollständigung der Zugabe wurde das Rühren 2 Stunden lang bei 60 bis 65ºC fortgesetzt. Das gebildete Gel wurde durch heftiges Rühren in einem 2,5-fachen Volumen Ethanol pulverisiert und danach filtriert. Der resultierende Rückstand wurde sorgfältig hintereinander mit 70% Ethanol, Ethanol und Ether gewaschen und getrocknet. Das getrocknete Produkt wurde in 7 l Wasser gelöst und mit 1M Essigsäure neutralisiert. Dann wurden 40 g Aktivkohle zugegeben und die resultierende Lösung bei Raumtemperatur eine Stunde lang gerührt und dann filtriert. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck auf 1 l aufkonzentriert, und das 3-fache Volumen Ethanol zugegeben, um einen Niederschlag auszubilden. Der Niederschlag wurde mit Ethanol und Ether gewaschen und getrocknet und über konzentrierter Schwefelsäure unter vermindertem Druck getrocknet, und 113,85 g des gewünschten Produktes erhalten
  • Das so erhaltene, partiell carboxymethylierte (1T3)-β-D- Glucan wurde gemäß der Uranylnitrat-Methode von D.F. Durso (Methods in Carbohydrate Chem. VIII (1980) 127-129), auf seinen Veretherungsgrad (Grad der Substitution : DS) untersucht. Als Ergebnis wurde ein solcher von 0,63 gefunden, was bedeutet, daß 0,63 Reste von drei substituierbaren Hydroxylgruppen in einem eine Kohlehydratkette aufbauenden Glucose-Rest substituiert waren.
  • 25 mg des resultierenden, teilweise carboxymethylierten (1T-3)-β-D-Glucans wurden in 5 ml 0,1M Ammoniumacetatlösung gelöst und mittels GPC fraktioniert (Säule: Toyopearl HW65F, 5 x 100 cm, mobile Phase: 0,1M Ammoniumacetatlösung, Fließgeschwindigkeit 5,8 ml/min). Die so erhaltene Fraktion wurde dann einer GPC unter Verwendung verschiedener Säulen unterworfen (Säulen: TSKgel G6000PWXL + G5000PWXL + G3000PWXL, in Reihe geschaltet, mobile Phase: 0,1M Ammoniumacetatlösung, Fließgeschwindigkeit 0,6 ml/min), und die Probe Nr. 41 erhalten, die eine enge Molekulargewichtsverteilung besaß (Mn = 231000).
  • Außerdem wurden 0,3 g des partiell carboxymethylierten (1T-3)-β-D-Glucans in 30 ml destilliertem Wasser gelöst und die resultierende Lösung ultraschallbehandelt (9 kHz, 180-130 W, 1 Stunde, Sonicator: Insonator Modell 201, hergestellt von Kubota Works), um das Molekulargewicht zu verringern.
  • Zu einem Anteil von 4,5 ml der resultierenden Lösung wurden 0,5 ml 1M Ammoniumacetatlösung zugegeben. Nach dem Mischen wurde die Fraktionierung mittels GPC und die Refraktionierung mittels GPC auf die gleiche Weise wie im Verfahren zur Herstellung der Probe Nr. 41 durchgeführt. Auf diese Weise wurden zwei Proben (Nr. 39 und 40) mit einem verschiedenen Molekulargewicht erhalten.
    • Herstellungsbeispiel 10 Herstellung von partiell carboxymethyliertem (1T3)-β-D- Glucan mit einem Substitutionsgrad von 1,2
  • 10 g carboxymethyliertes (1T3)-β-D-Glucan mit einem Substitutionsgrad (DS) von 0,63, erhalten im Herstellungsbeispiel 9, wurden zu 25 ml einer 10,5M NaOH- Lösung bei 0ºC in einem Stickstoffstrom zugegeben, um eine Paste auszubilden. Zu der resultierenden Paste wurde unter sorgfältigem Rühren eine Monochloressigsäurelösung (10 g/12 ml) zugegeben. Die Mischung wurde auf 60ºC erhitzt und 4 Stunden lang gerührt. Nach dem Abkühlen wurden 30 ml 2M HCl dazugegeben und dann in 200 ml chlorwasserstoffsaures Ethanol (40 ml HCl/Ethanol) gegossen. Der so gebildete Niederschlag wurde hintereinander mit 70% Ethanol, Ethanol und Ether gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet, und die Probe Nr. 107 erhalten.
  • Der Substitutionsgrad wurde auf die gleiche Weise wie im Verfahren zur Messung des partiell carboxymethylierten (1T-3)-β-D-Glucans mit dem DS von 0,63, erhalten im Herstellungsbeispiel 9, gemessen. Es wurde ein DS der Probe von 1,20 gefunden.
    • Herstellungsbeispiel 11 Herstellung von partiell carboxymethyliertem Laminaran
  • Ein partiell carboxymethyliertes Laminaran wurde aus einem von Laminaria digitata abgeleiteten Laminaran (Sigma, Chargen-Nr. 77F-3885) wie nach dem Verfahren der partiellen Carboxymethylierung des Herstellungsbeispiels 9 gemäß dem in A.E. Clarke und B.A. Stone: Phytochem. 1 (1962) 175 beschriebenen Verfahren hergestellt, und die Probe Nr. 42 (DS = 0,06) erhalten.
    • Herstellungsbeispiel 12 Herstellung von partiell methyliertem (1T3)-β-D-Glucan
  • Gemäß dem in M. Samec, Kolloid-Beihefte 51 (1940) 369 beschriebenen Verfahren wurden 3,0 g eines wasserunlöslichen Curdlan-Produktes, erhalten im Herstellungsbeispiel 2, in 80 ml Wasser suspendiert, dann 1,35 ml gesättigte wäßrige NaOH- Lösung in einem Stickstoffgasstrom zugegeben, um das wasserunlösliche Curdlan-Produkt vollständig zu lösen. Dazu wurden bei 4ºC 60 g Dimethylsulfat allmählich zugegeben. Nach ca. 1 Stunde wurde die Reaktionsmischung tropfenweise zu Aceton zugegeben und der gebildete Niederschlag gesammelt. Der Niederschlag wurde sorgfältig mit Aceton gewaschen und über konzentrierter Schwefelsäure unter vermindertem Druck getrocknet, und 3,13 g des vorstehend beschriebenen Produktes (Probe Nr. 43, DS = 0,16) erhalten.
    • Herstellungsbeispiel 13 Herstellung von partiell sulfatiertem Laminaran
  • Von Laminaria digitata abgeleitetes Laminaran wurde in Pyridin unter Verwendung eines Pyridin-Schwefeltrioxid- Komplexes (Wako Pure Chemical Industries, Chargen-Nr. PPL 8823) wie nachfolgend beschrieben sulfatiert.
  • 0,5 g von sorgfältig getrocknetem von Laminaria digitata abgeleitetem Laminaran (Sigma, Chargen-Nr. 77F-3885) wurden in 50 ml entwässertem Pyridin gelöst, 1 g Pyridin- Schwefeltrioxid-Komplex dazugegeben und dann die Umsetzung bei 60ºC während 1 Stunde durchgeführt. Zur resultierenden Reaktionsmischung wurden 100 ml Wasser gegeben und die Mischung dann abgekühlt und danach mit NaOH neutralisiert. Die neutralisierte Lösung wurde gegen Wasser unter Verwendung einer Dialysemembran (Spectropore, Grenze 1000), die vorher gut mit einer wäßrigen alkalischen Lösung zur Entfernung von Glucan gewaschen wurde, dialysiert. Nach Konzentrierung des Dialysates wurde das doppelte Volumen an Aceton dazugegeben, um eine Kohlehydrat-Komponente auszufällen. Der Niederschlag wurde mit Aceton gewaschen und über konzentrierter Schwefelsäure unter vermindertem Druck getrocknet und 0,38 g des vorstehend beschriebenen Produktes (Probe Nr. 44, DS = 0,14) erhalten.
  • Der Substitutionsgrad der Methylgruppe(n) und Sulfatgruppe(n) jedes der in den Herstellungsbeispielen 12 und 13 erhaltenen Produkte wurde gemäß den nachfolgenden unter (1) und (2) beschriebenen Verfahren bestimmt und berechnet.
  • (1) Ochiai, Tsuda, Sakamoto: Organic quantitative analysis (microanalysis), Nanzando (1956),
  • (2) R.L. Whistler, Herausgeber, Methods in Carbohydrate Chemistry III (1964) 229-235, 227-280, Academic Press.
    • Im Handel erhältliche Proben
  • Die folgenden im Handel erhältlichen Proben wurden, nach Bestimmung ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften, direkt oder nach Alkah-Solubilisierung und Neutralisation den Messungen unterworfen.
  • Glucose: (Wako Pure Chemical Industries, Reagens von spezieller JIS-Standard entsprechender Qualität), Probe Nr. 108
  • Laminarioligosaccharide: (Seikagaku Corporation, reines Reagens) Proben Nr. 5 bis 10
  • Laminaran: abgeleitet von Eisenia araborea (Nacalai Tesque Reagens), Probe Nr. 23
  • Laminaran: abgeleitet von E. araborea (Tokyo Kasei Kogyo, Reagens), Probe Nr. 24
  • Laminaran: abgeleitet von Laminaria digitata (Sigma, Reagens), Probe Nr. 26
  • Lentinan: abgeleitet von Lentinus edodes (Aginomoto, medizinische Charge Nr. 9Z01LS), Probe Nr. 32
  • Lichenan: abgeleitet von Cetraria islandica (Sigma, Reagens), Probe Nr. 34
  • Lichenan: abgeleitet von Usnea barbata (Sigma, Reagens), Probe Nr. 35
  • Die Ergebnisse der Bestimmung der Molekulargewichte, des die Faktor G-Aktivierung inhibierenden Titers usw. der vorstehend beschriebenen Proben sind in der nachstehenden Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1 Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 1 (Fortsetzung)
  • 1) Die Zahl für die Zuckerkettenstruktur ist die in der Beschreibung definierte Klazzifizierungsnummer;
  • 2) im Hinblick auf Glucose und Laminarioligosaccharide bedeutet Mn ein absolutes Molekulargewicht (theoretischer Wert). Für die anderen ist Mn im Hinblick auf Polyethylenoxid und Polyethylenglycol gemäß dem getrennt beschriebenen Molekulargewichtbestimmungsverfahren berechnet.
  • Die Molekulargewichte in der Tabelle sind als mittlere Molekulargewichte (Mn) (Zahlenmittel) angegeben, definiert durch die folgende Formel, und bestimmt mittels der oben beschriebenen Gelpermeationschromatographie (nachfolgend manchmals als GPC abgekürzt). Die Molekulargewichtsverteilung wird als Polydispersität (Mw/Mn) durch die folgende Formel definiert:
  • Mittleres Molekulargewicht (Mn) (Zahlenmittel) = ΣHi/Σ(Hi/Mi)
  • X (Hixmi) Mittleres Molekulargewicht (Mw) (Gewichtsmittel) = Σ(Hi/Mi)/ΣHi
  • Polydispersität = Mw/Mn
  • In den obigen Formeln bedeutet Hi die Höhe des i-ten Peaks (Probenkonzentration), wenn ein Chromatogramm gleichmäßig durch die Zeit geteilt wird, und Mi bedeutet das i-te Molekulargewicht.
  • Der die Faktor-G-Aktivierung inhibierende Titer wurde gemäß der folgenden Aktivierungstiterbestimmungsmethode der die Faktor G-Aktivierung inhibierenden Substanz gemessen und in Einheiten pro mg dargestellt.
  • Die Aktivierungstiter-Bestimmungsmethode der die Faktor G- Aktivierung inhibierenden Substanz (nachfolgend manchmal als GI abgekürzt) ist:
  • Ein 200 ml-Anteil einer Reaktionsmischung hat die folgende Zusammensetzung.
  • (1) Probe (Anmerkung 1): GI-Probe oder 50 µl reines Wasser [mit oder ohne Zugabe von 10 pg der Faktor G- aktivierenden Substanz (abgekürzt als GA; Anmerkung 2)]
  • (2) Limulus-Amöbocytenlysat prokoagulierende Enzymfraktion (A&sub2;&sub8;&sub0; = 2,5) (Anmerkung 3) 30 µl
  • (3) Limulus-Amöbocytenlysat-Faktor G- Fraktion (A&sub2;&sub8;&sub0; = 0,9) (Anmerkung 3) 20 µl
  • (4) Tris-Chlorwasserstoffsäure-Puffer (pH = 8,0) 20 µMol
  • (5) MgCl&sub2; 20 µMol
  • (6) Boc-Leu-Gly-Arg-PNA 0,13 µMol
  • Nach Inkubieren der vorstehend beschriebenen Reaktionsmischung bei 37ºC während 30 Minuten wurden zu der Reaktionsmischung je 0,5 ml von 0,04% Natriumnitrit (0,48M HCl-Lösung), 0,3% Ammoniumsulfamat und 0,07% N-1- Naphthylethylendiamindihydrochlorid zugegeben, um eine Färbung durch Diazo-Kupplung zu bewirken. Die Menge der freigesetzten PNA wurde durch Messen des Absorptionsmaßes bei 545 nm (A&sub5;&sub4;&sub5;) bestimmt. Die GI-Aktivität wurde gemäß der folgenden Gleichung berechnet:
  • GI-Aktivität (%) = 100 - {[A&sub5;&sub4;&sub5; der GI-Probe (GA-Addition)] - [A&sub5;&sub4;&sub5; von reinem Wasser (keine GA-Addition)]/[A&sub5;&sub4;&sub5; von reinem Wasser (GA-Zugabe)] - [A&sub5;&sub4;&sub5; von reinem Wasser (keine GA-Addition)]} x 100
  • Unter diesen Bedingungen wird die GI-Menge, die eine 100%-ige Inhibierung der Aktivierung des Faktors G durch GA verursacht, als 100 Einheiten definiert.
  • (Anmerkung 1) Wasserunlösliche Proben werden in 0,3M NaOH gelöst und mit einem gleichen Volumen an 0,3M HCl neutralisiert.
  • (Anmerkung 2) Durch GPC-Fraktionierung gereinigtes Produkt des im vorstehenden Herstellungsbeispiel 5 hergestellten ultraschallbehandelten Curdlan- Produktes (Tabelle 2, Nr. 106, Molekulargewicht 216000).
  • (Anmerkung 3) Hergestellt aus japanischem Hufeisenkrebs (horseshoe crab), T. tridentatus, gemäß T. Obayasi et al., Clin. Chim. Acta., 149 (1985) 55-65).
  • Das durch Fixierung des vorstehend beschriebenen (1T3)-β-D- Glucosid-Strukturanteils an einen unlöslichen Träger erhaltene, erfindungsgemäße unlösliche Fixierungsprodukt wird dann mit LAL in Kontakt gebracht. Der Kontakt kann bei 0 bis 40ºC, und vorzugsweise bei 0 bis 10ºC, und bei einem pH-Wert von 6 bis 8 durchgeführt werden. Danach wird das unlösliche immobilisierte Produkt von LAL abgetrennt. Die Abtrennung kann durchgeführt werden, indem man die Mischung einer Filtration oder Zentrifugation unterwirft, um das unlösliche Fixierungsprodukt zu entfernen, oder indem man LAL auf eine Säule appliziert, die mit dem unlöslichen immobilisierten Produkt beschickt ist, um das durchgegangene LAL zu erhalten.
  • Da die Menge des unlöslichen immobilisierten Produktes für das Inkontaktbringen mit LAL abhängig von der Stärke der inhibierenden Wirkung auf die Faktor G-Aktivierung des an einen Träger fixierten (1T3)-β-D-Glucosid-Strukturanteils variiert, kann es z.B. wie folgt bestimmt werden. Unter Eiskühlung werden verschiedene Mengen des unlöslichen immobilisierten Produkts (das kein Endotoxin enthält) mit einer bestimmten Menge an LAL in Kontakt gebracht, dann wird das unlösliche immobilisierte Produkt durch Zentrifugieren entfernt, dann eine bestimmte Menge einer Faktor G- aktivierenden Substanz (die kein Endotoxin und eine die Faktor G-Aktivierung inhibierende Substanz in einer Menge enthält, die so klein wie möglich ist) zugefügt, die LAL unter normalen Bestimmungsbedingungen im wesentlichen aktivieren kann, und nachfolgend eine Reaktion unter den gleichen Bedingungen, wie sie normalerweise unter Verwendung von LAL angewandt werden, durchgeführt. Die Menge des unlöslichen immobilisierten Produktes, das eine 100%-ige Inhibierung einer Aktivierung von LAL zeigt, wird unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen bestimmt. Dann wird das unlösliche immobilisierte Produkt in der oben bestimmten Menge mit der obenbeschriebenen bestimmten Menge an LAL in Kontakt gebracht, und danach verschiedene Mengen an Faktor G- aktivierender Substanz zugegeben, wobei bestätigt wird, daß LAL mit irgendeiner Menge der Faktor G-aktivierenden Substanz nicht aktiviert wird. Gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren kann die Menge des unlöslichen immobilisierten Produkts, die erforderlich ist, um die Aktivierung von Faktor G in einer bestimmten Menge von LAL vollständig zu inhibieren, bestimmt werden.
  • Die Herstellung des erfindungsgemäßen unlöslichen immobilisierten Produktes sowie die Herstellung von LAL, das, wenn es verwendet wird, spezifisch mit Endotoxin reagiert, wird mittels der folgenden Beispiele beschrieben. Das unlösliche immobilisierte Produkt wurde gemäß dem Verfahren von Matsumoto et al. hergestellt (Isamu Matsumoto et al., JP- A-59-15401).
    • Herstellungsbeispiel 14 Herstellung von Cellulose, die ein Ameisensäure-Abbauprodukt (Mn, 5800) von Curdlan darauf immobilisiert enthält
  • 2 g Cellulosepulver (100-200 Mesh, hergestellt von Toyo Roshi) wurden auf einem Glasfilter sorgfältig mit Wasser gewaschen, und danach einer Saugfiltration unterworfen. Der so erhaltene Rückstand wurde in einen Kolben gegeben, und 30 ml Wasser, 13 ml einer 2M NaOH -Lösung und 3 ml Epichlorhydrin hintereinander dazugegeben. Die resultierende Suspension wurde bei 40ºC 2 Stunden lang gerührt, und dann sorgfältig auf einem Glasfilter gewaschen, um Epoxyaktivierte Cellulose zu erhalten. Zu der so erhaltenen Epoxyaktivierten Cellulose (20 ml) wurden 1,5 Volumina (30 ml) einer 80%igen wäßrigen Lösung von hydratisiertem Hydrazin zugegeben, und danach bei 40ºC 1,5 Stunden lang gerührt. Nach der Reaktion wurde das resultierende Produkt auf einem Glasfilter sorgfältig mit Wasser gewaschen, um Hydrazino- Cellulose zu erhalten. Zu 2 g (Naßgewicht) der so erhaltenen Hydrazino-Cellulose wurden 1,5 ml einer 0,2M K&sub2;HPO&sub4;-Lösung, in der 50 mg des im Herstellungsbeispiel 4-1 (Probe Nr. 14, Mn = 5800) erhaltenen Ameisensäure-Abbauprodukts von Curdlan und 26 mg Natriumcyanoborhydrid gelöst waren, zugegeben, und danach bei Raumtemperatur 3 Tage lang gerührt. Nach der Umsetzung wurde das resultierende Produkt auf einem Glasfilter hintereinander mit 1 ml Wasser und 1 ml einer wäßrigen 0,2M Natriumacetatlösung gewaschen. 1 ml einer wäßrigen 0,2M Natriumacetatlösung wurde zugegeben, um eine Suspension auszubilden, und zur resultierenden Suspension wurden 0,5 ml Essigsäureanhydrid zugegeben. Nach Umsetzung bei 00 während 30 Minuten wurden nochmals 0,5 ml Essigsäureanhydrid zugegeben und die resultierende Mischung bei Raumtemperatur 30 Minunten lang stehen gelassen, um dadurch unumgesetzte restliche Hydrazingruppen zu acetylieren. Nach der Umsetzung wurde das resultierende Produkt hintereinander mit Wasser, einer 0,1M NaOH-Lösung, Wasser und phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und eine Cellulose erhalten, die ein Ameisensäure-Abbauprodukt von Curdlan darauf immobilisiert enthielt.
    • Herstellungsbeispiel 15 Herstellung von Laminaran-immobilisierter Cellulose
  • 20 g (Naßgewicht) Cellulose (Cellulofine, GC-700-m, erhältlich von Seikagaku Corporation) wurden auf die gleiche Weise wie im Herstellungsbeispiel 14 in ein Hydrazinderivat überführt. Zu 2 g (Naßgewicht) des so erhaltenen Hydrazinocellulofins wurden 1,5 ml einer wäßrigen 0,2M K&sub2;HPO&sub4;-Lösung, in der 50 mg von von Laminaria digitata (erhältlich von Sigma, Chargen-Nr. 77F-3885) abgeleitetes Laminaran und 26 mg Natriumcyanoborhydrid gelöst waren, zugegeben, und danach bei Raumtemperatur 3 Tage lang gerührt. Nach der Umsetzung wurde gemäß dem Verfahren des Herstellungsbeispiels 14 das resultierende Produkt gewaschen, zur Acetylierung unumgesetzter restlicher Hydrazingruppen behandelt und wieder gewaschen. Auf diese Weise wurde Laminaran-immobilisiertes Cellufine erhalten.
    • Hestellungsbeispiel 16 Herstellung von Laminaribiose-immobilisiertem synthetischem hydrophilem Polyvinylpolymer
  • 1 kg (Naßgewicht) von Toyopearl (synthetisches hydrophiles Polyvinylpolymer, HW55, Fine, erhältlich von Tosoh) wurde auf die gleiche Weise wie im Herstellungsbeispiel 14 behandelt, um Epoxy-aktiviertes Toyopearl zu erhalten.
  • Zu 800 ml des resultierenden Epoxy-aktivierten Toyopearl wurden 1,2 l einer 0,1M Na&sub2;CO&sub3;-Lösung, die 92 g Adipinsäuredihydrazid darin gelöst enthielt und mit Chlorwasserstoffsäure auf pH = 9 eingestellt wurde, zugegeben, danach über Nacht bei 40ºC gerührt. Nach der Umsetzung wurde das resultierende Produkt auf einem Glasfilter sorgfältig mit einer 0,2M NaCl-Lösung gewaschen, um Toyopearl-Hydrazid zu erhalten. Zur Gesamtmenge des resultierenden Toyopearl-Hydrazids wurden 600 ml einer 0,2M K&sub2;HPO&sub4;-Lösung, in der 32 g Laminaribiose (erhältlich von Seikagaku Corporation, Charge 8701100) zugegeben, und 10,4 Natriumcyanoborhydrid gelöst, und dann 3 Tage lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach der Umsetzung wurde das resultierende Produkt auf einem Glasfilter hintereinander mit Wasser und 0,2M Natriumacetatlösung gewaschen. Dazu wurden 400 ml 0,2M Natriumacetatlösung und 200 ml Essigsäureanhydrid gegeben, und danach bei 0ºC 30 Minuten lang gerührt. Zur resultierenden Lösung wurden nochmals 200 ml Essigsäurenahydrid zugegeben, und dann bei Raumtemperatur während 30 Minuten gerührt, um dadurch unumgesetzte restliche Hydrazidgruppen zu acetylieren. Nach der Umsetzung wurde das resultierende Produkt hintereinander mit Wasser, einer 0,1M NaOH-Lösung, Wasser und phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen. Auf diese Weise wurde Laminaribioseimmobilisiertes Toyopearl erhalten.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Fig. 1 zeigt den Reaktionsmechanismus eines Limulus- Amöbocytenlysat-Koagulierungssystems.
  • Fig. 2 zeigt ein Fraktionsmuster (Elutionskurve) eines im Handel erhältlichen Curdlans, erhalten durch Molekularsieb- Chromatographie. Das Symbol gibt den die Faktor G- Aktivierung inhibierenden Titer an (linke Seite, Ordinatenachse), und Δ gibt den Zuckergehalt an.
  • Fig. 3 zeigt ein Fraktionsmuster einer rechromatographierten Fraktion Nr. 44 bis 46 der Fig. 2. Das Symbol gibt den die Faktor G-Aktivierung inhibierenden Titer an (linke Seite, Ordinatenachse) und Δ den Kohlehydratgehalt.
  • Die Fig. 4-1 zeigt das Absorptionsmaß, das erhalten wird, wenn unbehandeltes LAL oder erfindungsgemäß behandeltes LAL mit verschiedenen Konzentrationen an Endotoxin umgesetzt wurde.
  • Das Symbol bedeutet unbehandeltes LAL, und Δ bedeutet gemäß Beispiel 2 behandeltes LAL.
  • Die Fig. 4-2 zeigt das Absorptionsmaß, das erhalten wurde, wenn unbehandeltes LAL oder erfindungsgemäß behandeltes LAL mit verschiedenen Konzentrationen an (1T3)-β-D-Glucan umgesetzt wurde. Das Symbol bedeutet unbehandeltes LAL, und Δ bedeutet gemäß dem Beispiel 2 behandeltes LAL.
    • Beste Ausführungsform zur Durchführung der Erfindung Beispiel 1 Herstellung von LAL unter Verwendung von an Cellulose immobilisiertem Ameisensäure-Abbauprodukt von Curdlan
  • Cellulose, die ein Ameisensäure-Abbauprodukt von Curdlan darauf immobilisiert enthält (Naßvolumen 0,4 ml), erhalten nach dem Herstellungsbeispiel 14, wurde hintereinander mit 1 l 0,1M NaOH und 1 l destilliertem Wasser gewaschen, um Endotoxin zu eliminieren. Um eine Suspension von 2,6 ml herzustellen, wurde destilliertes Wasser dazugegeben. 1 Ampulle Pregel-M-Hauptreagens (Limulus-Testprodukt für das Gelierungsverfahren, gefriergetrocknetes Produkt, Charge ABOL, Empfindlichkeit 0,125 EU/ml, erhältlich von Seikagaku Corporation) wurde in der Suspension gelöst, die dann bei 3000 UpM 10 Minuten lang zentrifugiert wurde, um einen Überstand (LAL-1) zu erhalten. Die Reaktivitäten des so erhaltenen Überstandes und des in 2,6 ml destilliertem Wasser gelösten Pregel-M-Hauptreagens (LAL-2) gegenüber Endotoxin (abgeleitet von E. coli 0111:B4) und gegenüber partiell carboxymethyliertem (1T3)-β-D-Glucan (Probe Nr. 41), erhalten im Herstellungsbeispiel 9, nachfolgend als (1T3)-β- D-Glucan bezeichnet) wurden untersucht, indem man die Gegenwart oder Abwesenheit einer Gelierung gemäß einem Standardverfahren für Pregel-M (0,1 ml LAL wurden zu 0,1 ml einer Probe zugegeben und die Mischung bei 37ºC 60 Minuten lang stehengelassen) bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 angegeben, in denen die Symbole + und - die Gegenwart bzw. Abwesenheit einer Gelierung bedeuten. TABELLE 2
  • Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß LAL-l nur mit Endotoxin die gewünschte Reaktivität zeigt.
    • Beispiel 2 Herstellung von LAL unter Verwendung von Laminaranimmobilisierter Cellulose (Cellulofine)
  • 0,4 ml (Naßvolumen) von Laminaran-immobilisiertem Cellulofine, erhalten im Herstellungsbeispiel 15, wurden nacheinander mit 1 l 0,1M NaOH und 1 l destilliertem Wasser gewaschen. Dazu wurde destilliertes Wasser gegeben, um ein Gesamtvolumen von 4 ml zu ergeben. Zu 0,2 ml davon wurden 1,8 ml destilliertes Wasser zugegeben, um eine Suspension auszubilden, die unter Verwendung einer Polyvinylidenfluoridmembran (0,22 µm, Millex GV Filtereinheit, erhältlich von Nihon Millipore Ltd., Charge Cell) filtriert wurde, um eine Membran zu erhalten, an der Laminaran-immobilisiertes Cellulofine anhaftete. Getrennt davon wurde Limulus (Tachypleus tridentatus) Hämolymphe gesammelt und einer Zentrifugation (3000 UpM, 5 Minuten) unterworfen, um Hämocyten (ca. 20 g) zu erhalten. 100 ml 0,02M Tris-HCl-Puffer (pH = 8,0) wurden hierzu zugegeben und die Mischung mittels eines Waring-Mischers homogenisiert und danach zentrifugiert (8000 UpM, 30 Minuten, 4ºC), um Überstand und Niederschlag zu trennen. Dieses Extraktionsverfahren wurde einmal wiederholt und insgesamt 150 ml Überstand erhalten, um als LAL zu dienen. Ein 1 ml- Anteil des resultierenden LAL wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Membran, an der Laminaranimmobilisierte Cellulofine anhaftete, filtriert, und ein Filtrat erhalten. Zu einem 0,04 ml-Anteil des Filtrats wurden 1,5 ug MgCl&sub2; und 4,0 ug eines synthetischen Substrats (N- tert.-Butoxycarbonyl-Leu-Gly-Arg-p-nitroanilid) zugegeben und danach gefriergetrocknet. 0,1 ml 0,2M Tris-HCl-Puffer (pH = 8,0) und 0,1 ml einer Probe (eine im Beispiel 1 verwendete wäßrige Lösung von Endotoxin oder (1T3)-β-D-Glucan in verschiedenen Konzentrationen) wurden zu dem resultierenden gefriergetrockneten Produkt zugegeben und die Mischung bei 37ºC 30 Minuten lang inkubiert. Die Umsetzung wurde durch Zugabe von 0,4 ml 0,6M Esigsäure beendet und das Absorptionsmaß bei 405 nm gemessen. Die Ergebnisse sowie die unter Verwendung von unbehandeltem LAL auf die gleiche Weise erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 4 dargestellt. In Fig. 4 bedeutet das Symbol ein im Falle von unbehandeltem LAL erhaltenes Absorptionsmaß, und das Symbol Δ bedeutet ein im Falle der Verwendung von mit Laminaran-immobilisierter Cellulofine behandeltem LAL erhaltenes Absorptionsmaß. Aus der Figur ist es klar, daß mit Laminaran-immobilisierter Cellulofine behandeltes LAL nicht mit (1T3)-β-D-Glucan reagierte, aber mit Endotoxin reagierte. Endotoxin kann deshalb unter Verwendung von mit Laminaran-immobilisierter Cellulofine behandeltem LAL spezifisch bestimmt werden.
    • Beispiel 3 Herstellung von LAL unter Verwendung von Laminaribioseimmobilisiertem Toyopearl
  • 60 ml (Naßvolumen) von Laminaribiose-immobilisiertem Toyopearl, erhalten im Herstellungsbeispiel 16, wurden auf einem Glasfilter hintereinander mit 1500 ml 0,1M NaOH und 1500 ml destilliertem Wasser gewaschen. Eine auf die gleiche Weise wie im Beispiel 2 erhaltene 25-fache Verdünnung von 2 ml unbehandeltem LAL mit destilliertem Wasser wurde zugegeben, und dann bei 4ºC bei 30 Minuten gerührt. Die Mischung wurde einer Zentrifugation (3000 UpM, 10 Minuten) unterworfen. Der so erhaltene Überstand wurde gefriergetrocknet, dann destilliertes Wasser bis auf ein Gesamtvolumen von 2 ml zugegeben) Zu einem 0,1 ml-Anteil davon wurden 0,1 ml verschiedener Konzentrationen einer wäßrigen Lösung von Endotoxin oder (1T3)-β-D-Glucan zugegeben, und die Mischung bei 37ºC 60 Minuten lang umsetzen gelassen. Als Ergebnis wurde keine Gelierung beobachtet, wenn (1T3)-β-D-Glucan (0,1 bis 10000 ng/ml) zugegeben wurde, während eine Gelierung beobachtet wurde, wenn Endotoxin (100 pg/ml oder mehr) zugegeben wurde.

Claims (5)

1. Verfahren zur Herstellung eines im wesentlichen Faktor G-freien Limulus-Amöbocytenlysats, umfassend das Inkontaktbringen von Limulus-Amöbocytenlysat mit einem unlöslichen Träger, auf dem der durch Depolymerisieren und/oder Fraktionieren einer Kohlehydratkette hergestellte, durch die folgende Formel (I) dargestellte (1T3)-β-D-Glucosid-Strukturanteil immobilisiert ist:
worin n eine ganze Zahl von 2 bis 370 bedeutet, und nachfolgendes Abtrennen des unlöslichen immobilisierten Produkts von LAL.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der (1T3)-β-D- Glucosid-Strukturanteil zusätzlich eine oder mehrere von mindestens einer Struktureinheit enthält, die ausgewählt ist aus einer Gruppe, bestehend aus den durch die folgenden Formeln (II), (III), (IV), (V) und (VI) dargestellten Struktureinheiten.
worin mindestens einer der Reste R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; eine Gruppe darstellt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Methylgruppe, einer Hydroxyalkylgruppe, einer Carboxyalkylgruppe, einer Acetylgruppe, einer Sulfatgruppe, einer Phosphatgruppe, einer Allylgruppe, einem Metallsalz einer dieser Gruppen, und einem Ammoniumsalz einer dieser Gruppen, und einem organischen Aminsalz einer dieser Gruppen, und die verbleibenden Gruppen ein Wasserstoffatom darstellen.
3) Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der (1T3)-β-D- Glucosid-Strukturanteil abgeleitet ist von natürlichen Quellen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (1T3)- β-D-Glucan, abgeleitet von Bakterien des Genus Alcarigenes, Paramylon, abgeleitet von Euglena, β-Glucan oder Callose abgeleitet von höheren Pflanzen, Laminaranen, abgeleitet von Braunalgen, Chrysolaminaranen, abgeleitet von Kieselalgen, Pachyman, abgeleitet von Poria, Glucan, abgeleitet von der Zeliwand von Phytophthora, Sclerotan, abgeleitet von Sclerotinia, Schizophyllan, abgeleitet von Schizophyllum, Grifolan LE, abgeleitet von Grifola frondosa, Scleroglucanen, abgeleitet von Sclerotium, Corticium oder Stromatinia, Lentinan, abgeleitet von Lentinus, β-Glucan, abgeleitet von der Zellwand von Saccharomyces (Bäckerhefe), Lichenanen, abgeleitet von Cetraria, Usnea oder Evernia, und in Gerstenendosperm enthaltenem β-Glucan.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der (1T3)-β-D- Glucosid-Strukturanteil erhalten wird durch Depolymerisieren einer Kohlenhydratkette durch ein Verfahren der teilweisen Zersetzung, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Hydrolyse unter Verwendung einer Säure, eines Alkalis oder von Glucanase, einer Acetolyse und einer Ultraschallbehandlung, und/oder durch Fraktionieren einer Kohlehydratkette durch ein Verfahren der fraktionierten Ausfällung unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels oder von Salzen, oder ein Fraktionierverfahren, unter Verwendung eines Molekularsiebmitteis oder einer Molekularsiebmembran.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der unlösliche Träger ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cellulose, Agarose, vernetztem Dextran, Polyacrylamid, porösem Glas, und einem Hydrazin oder Hydrazidderivat eines synthetischen hydrophilen Polyvinylpolymers.
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