DD221843A1 - Heterogener enzym-immuno-assay und vorrichtung zur durchfuehrung desselben - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft einen heterogenen Enzym-Immuno-Assay und eine Vorrichtung zur Durchfuehrung desselben. Ziel der Erfindung ist es, den Enzym-Immuno-Assay so weiterzuentwickeln, dass eine Vereinfachung der Handhabung und eine Einsparung von Reagenzien erreicht wird. Der erfindungsgemaesse Enzym-Imuno-Assay und die Anordnung zur Durchfuehrung desselben sind dadurch gekennzeichnet, dass nach Bildung des Antigen-Antikoerper-Komplexes auf einem planaren Formkoerper, vorzugsweise Kunststoff oder Glas, eine waessrige Substratloesung aufgetragen wird, die anschliessend mit einem ebenfalls planaren Nachweiselement in Kontakt gebracht wird. Das folienartige Nachweiselement enthaelt ein zur Farbbildung befaehigtes Indikatorsystem. Die in Abhaengigkeit von dem Markerenzym auftretende Faerbung wird photometrisch oder visuell ausgewertet. Die Erfindung wird in der Medizin, der Landwirtschaft, der pharmazeutischen Industrie und weiteren Industriezweigen angewendet.

Description

.Or.' H. Gφ Müller Dr. W. Schößler Prof. Or. P. Mohr Or. B. Ebert Th· Hanke ι

"Heterogener Enzym-Immuno-Assay und Vorrichtung zur Öurchführ rung desselben" ^

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur qualitativen, halbquantitativen oder quantitativen Bestimmung von Antigenen, Antikörpern und Haptenen nach dem ELISA-Prinzip (ELISA « Enzyme linked immuno sorbent assay). Ein Einsatz dieses analytischen Systems erfolgt in der Medizin, der Landwirtschaft, der mikrobiologischen und Nahrungsgüterindustrie sowie im Umweltschutz für diagnostische Meß- und Kontrollzwecke·

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Enzym-Immuno-Assays sind für den Nachweis von Antigenen (z. B. (X-Fetoprotein) und Haptenen (z, B. Thyroxin), Antikörpern, aber auch komplexeren Systemen biologischen Ursprungs (zum Beispiel Viren) in wäßriger Lösung von Bedeutung. Verwendet werden neben den sogenannten homogenen Tests vor allem die heterogenen Systeme (ELISA-Prinzip), von denen wiederum verschiedene Varianten gebräuchlich sind.Fast allen heterogenen Enzym-Immuno-Assays ist gemeinsam, daß eine feste Unterlage (zum Beispiel Mikrotiterplatten oder Kunststoffröhrchen aus Polystyrol oder Polypropylen) mit dem Antikörper oder dem Antigen beschichtet wird (Enzym-Immuno-Assay, herausgegeben von W. Vogt; G. Thieme Verlag, Stuttgart, 1978; Praktische Anwendung des Enzymimmunoassays, herausgegeben von WVVogt ; G. Thieme Verlag, Stuttgart, 1979).

Zur Durchführung eines Testes mit quantitativer oder semiquantitativer Aussage wird in an sich bekannter Weise die Probenlösung oder eine Reagenzlösung durch Inkubation mit den fixierten Antikörpern oder Antigenen in Kontakt gebracht· Nach der erforderlichen vorgegebenen Inkubationszeit werden die gebundenen und nachzuweisenden Antigene/Haptene/Antikörper mit einem spezifischen enzymmarkierten Antikörper oder Antigen (Konjugat), welches abhängig ist von der gewählten Variante des ELISA, nachgewiesen· Hierzu werden die bereits gebundenen Immunreaktanden mit dem Konjugat inkubiert und die nicht gebundenen Anteile in der üblichen Art und Weise durch Waschen entfernt«

Durch anschließendes Inkubieren mit einem geeigneten Indikatorsystem ermittelt man dann die enzymatische Aktivität des gebundenen Konjugates. Als Indikatoren werden bei Enzym-Immuno-Assays üblicherweise solche Verbindungen eingesetzt, die durch das Markerenzym zu typisch gefärbten Substanzen mit charakteristischen spektralen Eigenschaften umgesetzt werden (zum Beispiel p-Nitrophenylphosphat bei alkalischer Phosphatase oder ein Benzidin-Derivat bei Peroxidase als Marker-Enzym) «Aus den photometrisch durch Transmissions- oder Reflexionsmessung erhaltenen Daten lassen sich unter Zuhilfenahme einer Kalibrierkurve Rückschlüsse auf die Konzentration des Antigens/Haptens/Antikörpers in der Probenlösung ziehen· Für eine qualitative Bestimmung ist bereits die Bildung von Farbstoff ausreichend für eine positive Aussage· Bei der Mehrzahl der beschriebenen heterogenen Ehzym-Immuno-Assays ist jedoch von Nachteil, daß relativ große Mengen an z. T. teuren Chemikalien und Hilfsmitteln sowie an Probenlösung benötigt werden· Letzteres kann in der medizinischen Diagnostik nicht immer gewährleistet werden·

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Ziel der Erfindung

Es ist das.Ziel der Erfindung, die analytischen Verfahren zur enzymimmunologischen Bestimmung bzw· zum Nachweis von Antigenen, Antikörpern und Haptenen so weiterzuentwickeln, daß eine Vereinfachung der Handhabung sowie eine Einsparung von Reagenzien erreicht werden.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, einen heterogenen Enzym-Immuno-Assay mit einem neuen Indikatorsystem und einer Anordnung zur Durchführung desselben zu entwickeln·Die erfindungsgemäße Lösung der Aufgabe ist dadurch gekennzeichnet, daß nach Bildung des Antigen-Antikörper-Komplexes auf einer planeren, festen Phase, vorzugsweise Kunststoff oder Glas, eine wäßrige Substratlösung aufgetragen wird, die Anschließend mit einem ebenfalls planeren, folienartigen, quellfähigen oder ggf. saugfähigen Nachweiselement unter Ausnutzung von Kohäsionskräften in Kontakt gebracht wird, wobei die in Abhängigkeit von der Konzentration der zu bestimmenden Komponenten auftretende Farbbildung im Nachweiselement photometrisch oder visuell ausgewertet wird«Die Erfindung ist weiterhin durch eine Anordnung zur Durchführung des heterogenen Enzym-ImmunorAssays gekennzeichnet. Sie besteht aus einem Formkörper mit planerer Oberfläche, insbesondere aus Kunststoff oder Glas, auf der definierte Felder für die Aufnahme der Proben vorhanden sind, und aus einem planaren, folienartigen, quellfähigen oder ggf. saugfähigen Nachweiselement· Das Nachweiselement enthält, in einer dünnen Schicht aufgetragen, ein Indikatorsystem in einem quellfähigen oder saugfähigen Bindemittel, wie Gelatine oder cellulosehaltige Flächengebilde, wobei die Schicht ggf. auf einen transparenten oder nichttransparenten Träger aufgebracht wird.

Die Schichtoberfläche hat die gleiche Größe und Form wie die Probenaufnahmefläche·

Die Erfindung wird im folgenden noch näher erläutert.' Der Ablauf des Enzym-Imrauno-Assays erfolgt derart, daß die Kopplung von Antigenen oder Antikörpern an die feste Phase in an sich bekannter Weise durch kovalente oder nicht kovalente Bindungen erfolgt. An die gebräuchlichen Kunststoffmaterialien, wie Polystyrol, Polypropylen usw. erfolgt die Bindung vorzugsweise durch Adsorptionskräfte, während die Bindung an Glas nach vorheriger Oberflächenmödifizierung mit Silanhaftmitteln und hetero- oder homobifunktionellen Reagenzien, wie Glutaraldehyd, durchgeführt wird· Nachfolgend werden in Abhängigkeit von der gewählten Variante des Enzym-Immuno-Assays die so gebundenen Antigene oder Antikörper mit der die entsprechenden Antikörper bzw· Antigene enthaltenden Flüssigkeit in Kontakt gebracht und schließlich diese mit einem spezifischen Konjugat, bestehend aus dem entsprechenden Antigen bzw. Antikörper und einem Enzym, wie Peroxydase, nachgewiesen. Die Aktivität des Markerenzyms ist je nach gewählter Variante der Konzentration der zti bestimmenden Substanz direkt oder indirekt proportional. Erfindungsgemäß erfolgt nun die Bestimmung der Enzymaktivität durch Auftragen einer wäßrigen Substratlösung -und Aufbringen eines Nachweiselementes, das durch spezifische Farbreaktionen die Aktivitätsbestimraung des an die feste Phase gebundenen Enzyms (Peroxydase) gestattet. Die Auswertung erfolgt photometrisch oder visuell* Die spezifische Farbreaktion kann entweder unter Benutzung eines Hilfsenzyms, wie Glukoseoxidase, das im Nachweiselement eingelagert ist, und dem entsprechenden Substrat Glukose oder durch Verwendung von H₂O₂ als Substrat der Peroxydase unter Umgehung eines Hilfsenzyms erfolgen. Die Auswertung der Farbreaktion erfolgt vorzugsweise durch Trennung des Nachweiselementes von der festen Phase und nachfolgende photometrische Messung bzw. visuellen Vergleich mit einem Komparator, ist aber auch bei Verwendung: eines transparenten Nachweiselementes und einer transparenten festen Phase ohne Trennung der beiden voneinander möglich. Die photometrische Messung kann im Auflichtoder Purchlichtverfahren erfolgen·

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Die Anordnung besteht im wesentlichen aus zwei Teilen« Der eine Teil dient der Aufnahme der zu untersuchenden Proben» während mit dem anderen Teil die Aktivität dee Markerenzyms bestimmt wird·

Der die Probe aufnehmende Teil ist ein Formkörper aus Kunststoff oder Glas mit planarer Oberfläche* Die Größe der Oberfläche richtet sich nach der Anzahl der Proben. Wichtig ist dabei, daß die Oberfläche dergestalt ist, daß ein Zusammenfließen der wäßrigen Proben verhindert wird. Das wird beispielsweise dadurch erreicht, daß die die Probe aufnehmenden Felder entweder hydrophobe Ränder oder Vertiefungen aufweisen.

Der andere Teil der Anordnung, das Nachweiselement, ist in seiner Flächengröße dem die Proben aufnehmenden Formkörper angepaßt. Eine Ausfuhrungsvariante besteht aus einer flexiblen, transparenten Polyesterfolie, auf der sich, in einer Gelatineschicht verteilt, das Indikatorsystem befindet. Das System besteht aus einem Benzidinderivat, «insbesondere o-Tolidin, ggf. Glukoseoxidase, Farbstabilisierungsmittel der allgemeinen Formel I-III und weiteren Zusätzen, wie Puffer und Tenside. In einer zweiten Ausführungsvariante ist das Indikatorsystem in ein saugfähiges, papierähnliches Flächengebilde eingearbeitet, wobei die Dicke dieses saugfähigen Nachweiselementes der Menge der flüssigen Probe angepaßt ist, das heißt es muß die Proben vollständig aufnehmen können.

Ausführunqsbeispiel

Quantitative Bestimmung des Faktors F VIII-Antigens in Plasma Die Vorbereitung des Farbtests erfolgt nach Schößler et al. (Acta biol. med. german, 41, 263 & 695 (1982)). Hierzu werden Polystyrol-Folien, deren Fläche etwa 25 mm beträgt mit 0.5 ml einer Lösung, die den Faktor VIII des humanen Blutgerinnungssystems in 0.1 m Karbonat/Bikarbonat-Puffer vom pH = 9.6 enthält, inkubiert· Wenn der Adsorptions-Vorgang beendet

ist, wird dreimal mit PBS-Puffer (0,01 m Phosphat-Puffer + 0,15 m NaCl) vom pH =7.4, der außerdem 0,1% Tween 20 enthält, gewaschen und anschließend bei 37⁰C etwa 6 Stunden mit 0.5 ml eines Inkubationsgemisches, bestehend aus dem Probenplasma, das mit einem Überschuß an Kartinchen-anti-human-Faktor.'VIII versetzt wird, behandelt·

Nach erneutem dreimaligem Waschen versetzt man die Polystyrolfolien mit je 0.5 ml eines Konjugates (390 ng/ml) -bestehend aus einem Schaf-anti-Kaninchen-IgG-Antikörper mit gebundener Peroxidase - und bestimmt nach mehrstündiger Inkubationszeit und nachfolgendem Auswaschen des nicht gebundenen Konjugates die Enzym-Aktivität. Erfindungsgemäß werden hierzu auf die Testfolien je 10 .ul einer wäßrigen Glukoselösung (oder H₂Op enthaltende Glukoselösung) gegeben und anschließend die Indikator-Filmplättchen so aufgelegt, daß das Bindemittel mit dem gebundenen peroxidatisch aktiven Konjugat direkt in ' Berührung kommt (Abbildung 1)· Die konstante Fixierung beider Folien zueinander erfolgt durch Kohäsionskräfte»Die nunmehr im Feuchtigkeitsfilm ablaufende Farbentwicklung und anschließende Stabilisierung in der Filmfolie korreliert mit der Aktivität des Peroxidase-markierten Antikörpers und wird visuell bestimmt oder spektralphotometrisch bei 625, nm gemessen» Aus den erhaltenen Meßdaten läßt sich unter Zuhilfenahme einer Kalibrierkurve der Gehalt der Probelösungen an Faktor F VIII-Antigen berechnen«

X-A,

.y* ν*

κ = Η» oder Alkylresf

If I

O R.

_L= Alkylrest mit 4 - 22 Kohlenstoffatomen

I* ^Y2 ^{s H}"^J -SO₃HV-COOH -SO₂Me; -COOMe; Alkyl, wobei wenig* stens Y₁ oder Y₂ eine anionische Gruppe der aufgeführten Struktur darstellen muß

Me> Na⁺* K⁺, NH₄ ⁺

X- CH^

SO Rs Alkylrest mit 1-8 C-

Atomen oder H Me= H⁺, Na⁺. K⁺, NH₄ ⁺ X = -SO₃Me oder -OR

NHCO

SOjH R-S=R₀= Alkyl (1-20 C-Atome)

1 ', . 6¹ . · '.'

R_» Alkyl (1-6 C-Atome)

Claims (4)

1. Erfindungsanspruch

   1. Heterogener Enzym-Immuno-Assay zur Bestimmung von Antigenen, Antikörpern und Haptenen durch Bildung des Antigen-Antikörper-Konjugat-Komplexes auf einer festen Phasen gekennzeichnet dadurch, daß auf einer planeren, festen Phase, vorzugsweise Kunststoff oder Glas, nach Bildung des Antigen-Antikörper-Konjugat-Komplexes eine wäßrige Substratlösung aufgetragen wird, die anschließend mit einem ebenfalls planaren, folienartigen, quellfähigen, ggf. saugfähigen Nachweiselement unter Ausnutzung von Kohäsionskräften in Kontakt gebracht wird, wobei die in Abhängigkeit von der Konzentration der zu bestimmenden Komponente auftretende Farbbildung im Nachweiselement visuell oder photometrisch ausgewertet wird.
2. 2. Heterogener Enzym-Immuno-Assay nach Punkt.1, gekennzeichnet dadurch, daß als wäßrige Substratlösung Glukose oder HgCL eingesetzt werden»
3. 3. Anordnung zur Durchführung des heterogenen Enzym-Immuno-Assays nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Anordnung aus einem Formkörper mit planarer Oberfläche, insbesondere aus Kunststoff oder Glas, auf der definierte zwei- oder dreidimensionale Felder für die Aufnahme der Proben vorhanden sind, und aus einem planaren, folienartigen, quellfähigen oder ggf. saugfähigen Nachweiselement besteht, das in einer dünnen Schicht ggf. auf einen transparenten oder nichttransparenten Träger aufgetragen, ein Indikatorsystem in einem quellfähigen oder saugfähigen Bindemittel, wie Gelatine oder cellulosehaltige Flächengebilde, enthält.
4. 4. Anordnung nach Punkt 3, gekennzeichnet dadurch, daßdas Indikatorsystem aus Benzidinderivaten, wie o-Tolidin, ggf. Glucoseoxidase, Farbstabilisatoren der allgemeinen Formel I -IJIund weiteren Zusätzen, wie Puffer und Tenside besteht. \

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