DE69121290T2 - Methode zur Bestimmung von Antikörper gegen Chlamydia Trachomatis und diagnostisches Präparat für Chlamydia Trachomatis-Infektion - Google Patents
Methode zur Bestimmung von Antikörper gegen Chlamydia Trachomatis und diagnostisches Präparat für Chlamydia Trachomatis-InfektionInfo
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Description
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die Bestimmung eines Antikörpers gegen Chlamydia trachomatis zur Diagnose einer C. trachomatis-Infektion und einem hierfür verwendeten diagnostischen Präparat.
- C. trachomatis gehört zur Spezies der obligatorisch intrazellulären Parasiten, die nur in den Zellen eines Wirtes überleben können. Der Vervielfältigungskreislauf dieser Spezies ist einzigartig. Morphologisch gelangt ein extrazellulärer chlamydialer Elementarkörper (EB) durch Phagozytose in die Zellen eines Wirtes, indem sie durch Einschluß eine Vakuole bilden. Daraufhin wandelt er sich in einen retikulierten Körper (RB) um, der sich vervielfältigt, aber nicht infektiös ist. Der intrazellulär vervielfältigte RB wandelt sich dann in einen EB, der aus dem Einschluß herauspiatzt, die Zellmembran des Wirtes durchbricht und so aus der Zelle herausgelangt, um. Der EB ist infektiös, aber nicht multiplikativ. Ist eine Person mit EB infiziert, so leidet sie an Augen- und Geschlechtskrankheiten, wie Augentrachoma, Lymphogranuloma Venerum (LGV), nichtgonokokkaler Urethritis (NGU) und Cervizitis.
- Seit neuestem gewinnt C. trachomatis als einer der ursächlichen Mikroorganismen sexuell übertragener Krankheiten an Aufmerksamkeit. In den Vereinigten Staaten von Amerika werden jährlich 3 bis 10 Millionen neuer Fälle an C. Infektionen gemeldet. Die Besorgnis über C.-Infektionen nimmt auch in Japan zu, seit die Bedingungen für die Infektion in zunehmendem Maße bekannt werden.
- Die empfindlichste serologische Diagnose auf C. trachomatis ist die indirekte Mikrofluoreszens-Antikörper-Technik (Mikro-IF-Technik), entwickelt von Wang und Grayston (vergleiche "Trachoma and related disorders caused by chlamydial agents", Excerpta Medical, Amsterdam, Seiten 273- 288, 1971). Wegen der technischen Schwierigkeiten in ihrer Anwendung wurde die Mikro-IF-Technik bisher jedoch nicht als diagnostisches Verfahren in klinischen Laboratorien angewandt. Die Standard-Mikro-IF-Technik benötigt gereinigte Elementarkörper (EB) aus 15 verschiedenen C. trachomatis- Serotypen. Bei der Immunofluoreszensreaktion der Mikro-IF- Technik wird die gesamte Morphologie oder Struktur eines Mikroorganismus benötigt, um ihn zu identifizieren. Aus diesem Grund ist die Veränderung oder die Aufspaltung der Morphologie oder Struktur der EB nicht anwendbar. Da die EB infektiös und toxisch sind, benötigt man bei Gebrauch intakter EB als antigenem Material eine spezielle Einrichtung mit einer Schutzausrüstung gegen die Infektion. Dementsprechend wird gewöhnlich ein Antigen angewandt, das mit einem Fixiermittel, wie Formaldehyd oder Aceton, behandelt wurde.
- Auf der anderen Seite hat ein kürzlich entwickeltes Verfahren, das auf einem Enzymimmunoassay (ELISA) basiert, den Vorteil, daß es auf viele Testproben schnell und auf einfache Weise angewendet werden kann. Es sind Berichte über den ELISA-Assay bekannt geworden, die einen C. trachomatis-Antikörper als antigenes Material verwenden, dabei wurde jedoch ineist EB des Stranges L2 von C. trachomatis entweder intakt oder mit SDS behandelt, verwendet. Dementsprechend traten durch die Verwendung eines Antigens niedriger Reinheit nichtspezifische Reaktionen auf, einschließlich der Kreuzreaktionen mit einem C. pneumoniae-Antikörper und mit einem C. psittaci-Antikörper. Dies wird hauptsächlich der komplizierten Antigenizität von C. trachomatis zugeschrieben. Man nimmt an, daß die Antigenizität von C. trachomatis auf drei Klassen von Antigenen beruht, genusspezifischen Antigenen, speziesspezifischen Antigenen und serotypspezifischen Antigenen. Lipopolysaccharide (LPS) sind als typisch genusspezifische Antigene bekannt, diese Antigenizität haben sie mit den RE-Mutanten LBS einiger intestinaler Mikroorganismen gemein.
- Als weiteres typisch speziesspezifisches oder serotypspezifisches Antigen ist das Hauptprotein der äußeren Membran (MOMP) von C. trachomatis bekannt, das bis zu 60% des Proteins der äußeren Membran von C. trachomatis ausmacht. Jedoch ist von MOMP bekannt, daß es einige genusspezifische Epitope hat (Colett et al., Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol., Washington, DC., Abstract Nr. D-159, 1986). Von MOMP verschiedene weitere Antigene der äußeren Membran von C. trachomatis sind vorwiegend genusspezifische Antigene, aber einige besitzen gleichzeitig auch speziesspezifische Antigenizität. Das Natrium-N-lauroylsarcosin-unlösliche Peptid mit einem Molekulargewicht von etwa 59,5 KDa gehört zu der zuletztgenannten Kategorie.
- Wie oben beschrieben, ist die Antigenizität von C. trachomatis sehr kompliziert. Ein C. trachomatis-Antikörper aus C. trachomatis-infizierten Patienten ist facettenreich bezüglich dieser komplizierten Antigenizität von C. trachomatis und unterscheidet sich in Abhängigkeit vom jeweiligen Patienten in seinem Muster. Folglich ist es praktisch unmöglich, ein einziges spezifiziertes C. trachomatis-Antigen für den Assay auf C. trachomatis-Antikörper anzuwenden. Dementsprechend muß das angewendete Antigenmaterial sorgfältig ausgewählt werden, um einen hochpräzisen und empfindlichen Assay auf den Anti-C. trachomatis-Antikörper zu erhalten und dabei nichtspezifische Reaktionen einschließlich der Kreuzreaktionen mit einem C. pneumoniae-Antikörper und einem C. psittaci-Antikörper einzuschließen.
- Das Journal of General Microbiology, Bd. 132, S. 1599-1610, 1986 (ME Ward et al.) beschreibt die antigene Spezifität humaner Antikörper auf Chlamydia in Trachoma und Lymphogranuloma Venerum. Dabei wird eine Western-Blotting-Technik angewendet, bestehend aus der Trennung von Polypeptiden nach ihrem Molekulargewicht und der Reaktion der getrennten Peptide mit Antikörpern.
- In Infection and Immunity, Bd. 57(9), S. 2914-2918, 1989 (R.R. Mondesire et al.) werden polydonale und monodonale Antikörper verwendet, um die immunogene und antigene Charakteristik der Chlamydiae zu untersuchen. Dieses Dokument wendet die ELISA-Technologie an und verwendet C. trachomatis als ein Antigen; im besonderen wird das gereinigte EB selbst verwendet.
- Die vorliegende Erfindung zielt darauf ab, das Problem der nichtspezifischen Reaktionen einschließlich der Kreuzreaktionen mit einem C. pneumoniae-Antikörper und einem C. psittaci-Antikörper zu lösen, die bei der gegenwärtigen ELISA-Technik für den Assay auf einen C. trachomatis-Antikörper auftreten, die den oben beschriebenen EB intakt oder mit SDS behandelt als antigenes Material verwenden. Dies wird dadurch erreicht, daß man als Antigen ein Gemisch der Polypeptide, die die C. trachomatis-Außenmembran aufbauen, verwendet, enthaltend mindestens drei Polypeptide mit Molekularqewichten nach SDS-PAGE von 59,5 KDa, 39,5 KDa und 75 KDa, wobei das Antigen durch Extraktion gereinigter C. trachomatis-Elementarkörper mit einem ionischen Tensid, das eine milde Herabsetzungsaktivität für die Grenzflächenspannung aufweist, wobei lösliche Bestandteile entfernt werden, und Solubilisierung des Extraktionsrückstands mit einem zweiten ionischen Tensid mit einer stärkeren Herabsetzungsaktivität für die Grenzflächenspannung als das erstgenannte ionische Tensid erhalten worden ist.
- Die Erfindung betrifft demnach ein Verfahren zum Nachweis eines Antikörpers gegen C. trachomatis in einer Probe, das dadurch gekennzeichnet ist, daß der Antikörper mit einem Antigen behandelt wird, das aus einer Mischung der Polypeptide besteht, die die C. trachomatis-Außenmembran aufbauen, enthaltend mindestens drei Polypeptide, deren Molekulargewichte nach SDS-PAGE 59,5 KDa, 39,5 KDa und 75 KDa betragen, wobei das Antigen durch Extraktion gereinigter C. trachomatis-Elementarkörper mit einem ionischen Tensid, das eine milde Herabsetzungsaktivität für die Grenzflächenspannung aufweist, wobei lösliche Bestandteile entfernt und Solubilisierung des Extraktionsrückstandes mit einem zweiten ionischen Tensid mit einer stärkeren Herabsetzungsaktivität für die Grenzflächenspannung als das erstgenannte ionische Tensid erhalten worden ist.
- Figur 1 zeigt das elektrophoretische Verhalten einer Mischung der Polypeptide aus der C. trachomatis-Außenmembran auf einem SDS-Polyacrylamidgel (Verhalten auf einer 12,5%igen Acrylamidgelscheibe) als Muster. Figur 2 zeigt in einem Diagramm die Korrelation zwischen der Enzymimmunoassaytechnik (ELISA), die eine Mischung der Polypeptide der C. trachomatis-Außenmembran als Antigen verwendet, und der Mikro-IF-Technik.
- In Figur 1:
- 1: Auftragungspunkt. 2: Laufmittelfront (Markerfarbstoff: BPB).
- Das C. trachomatis-Außenmembranantigen, das bei der Erfindung verwendet wird, enthält mindestens drei Polypeptide, die die C. trachomatis-Außenmembran aufbauen, und kann durch ein bekanntes Verfahren, wie es von Caldwell et al. in Infection and Immunity, 31, 1161-1176, 1981 beschrieben ist, hergestellt werden.
- Somit werden EB aus C. trachomatis nach gängigen Methoden gereinigt, und um lösliche Bestandteile zu entfernen, werden die gereinigten C. trachomatis-EB mit einem ionischen Tensid extrahiert, das eine milde Herabsetzungsaktivität für die Grenzflächenspannung aufweist, vorzugsweise ein anionisches grenzflächenaktives Sarcosin-Reagens, am meisten bevorzugt Natrium-N-lauroylsarcosin. Hierdurch wird ein nichtextrahierter Bestandteil erhalten.
- Vorzugsweise unterwirft man das Produkt nachfolgend einer Ribonukleasebehandlung mit einer DNase und einer RNase.
- Um es genauer zu beschreiben, die gereinigten C. trachomatis-EB werden mit PBS (pH 8,0), das 2% Natrium-N-lauroylsarcosin und 1,5 mM EDTA enthält, extrahiert, um lösliche Bestandteile zu entfernen, gefolgt von einer DNase-RNase- Behandlung. So kann eine Natrium-N-lauroylsarcosin-unlösliche Fraktion (nichtextrahierter Bestandteil) erhalten werden.
- Ursprünglich wurde dieses Verfahren, zur Präparierung von Außenmembranen von Escherichia coli, einem Gram-negativen Organismus, entwickelt (Filip et al., J. Bacteriol. 115, 717-722, 1973). Morphologische Untersuchungen unter einem Elektronenmikroskop eines so hergestellten C. trachomatis Außenmembrankomplexes, der sich aus mindestens drei Polypeptiden und Lipid, welche die C. trachomatis-Außenmembran aufbauen, zusammensetzt, ließen erkennen, daß der Komplex die Zellwand von C. trachomatis ist, die sich durch den Verlust des Cytoplasmas und der Cytoplasmamembran der ganzen Zelle (EB) von C. trachomatis bildet. Dementsprechend ist die C. trachomatis-Außenmembran in ihrer Struktur und Funktion ähnlich der Außenmembran (Zellwand) Gram-negativer Bakterien.
- Der C. trachomatis-Außenmembrankomplex (die in Natrium-N- lauroylsarcosin unlösliche Fraktion), erhalten wie oben beschrieben, wird mit einem zweiten ionischen Tensid, das eine stärkere Herabsetzungsaktivität für die Grenzflächenspannung besitzt als das eben angewendete, solubilisiert, vorzugsweise mit Natriumdodecylsulfat (SDS) um ein Antigen herzustellen, das zur Verwendung in der Erfindung besser geeignet ist. Somit wird ein Gemisch aus mindestens drei Polypeptiden der C. trachomatis-Außenmembran hergestellt zur erfindungsgemäßen Anwendung als Antigen.
- Analysiert durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach den unten beschriebenen Bedingungen enthält das Gemisch der Polypeptide der C. trachomatis-Außenmembran Pölypeptide mit ca. 155 KDa, ca. 102 KDa, ca. 79 KDa, ca. 75 KDa, ca. 59,5 KDa, ca. 49,5 KDa, ca. 42 KDa, ca. 39,5 KDa, ca. 31 KDa, ca. 12,5 KDa etc. Das Polypeptide von ca. 39,5 KDa repräsentiert etwa 60% des gesamten Peptids und wird Hauptaußenmembranprotein (MOMP) genannt. Auf der anderen Seite ist das 125 KDa-Peptid ein cysteinreiches Peptid, das für die Spezies C. trachomatis spezifisch ist, bei der C. psittaci- Spezies aber nicht auftritt. (Barron, Microbiology of Chlamydia, CRC Press Inc., Boca Raton, Florida, 48-50, 1988). Es wurde ebenfalls gefunden, daß das 12,5 KDa-Peptid eine genusspezifische Antigenizität aufweist.
- Für die vorliegende Erfindung ist es vorteilhaft, als Antigen den oben hergestellten Außenmembrankomplex von C. trachomatis zu verwenden, der eine Reihe von Peptiden enthält, aber ein Gemisch, das mindestens die drei Peptide der C. trachomatis-Außenmembran des oben angegebenen Molekulargewichts enthält, kann ebenfalls als Antigen verwendet werden. Das Molekulargewicht der Peptide, auf die hier Bezug genommen wird, ist angesichts möglicher Fehler, die bei jeder Messung auftreten können, als ungefährer numerischer Wert angegeben. Obwohl Peptide abhängig von den Bedingungen für die Molekulargewichtsbestimmung durch SDS-Elektrophorese ein Molekulargewicht aufweisen können, das einem anderen als dem angegebenen Wert entspricht, decken überdies die Peptide mit dem erfindungsgemäß definierten Molekulargewicht die zuvor genannten Peptide mit ab, wenn sie beide identisch sind.
- Erfindungsgemäß ist es wichtig, ein Antigen zu verwenden, das mindestens drei der oben genannten Polypeptide der C. trachomatis-Außenmembran enthält. Falls ein Polypeptid einzeln verwendet wird, beispielsweise das auf ca. 39,5 KDa gereinigte Peptid (MOMP), tritt eine pseudonegative Reaktion auf, die aus klinischer Sicht problematisch ist, oder die Speziesspezifität wird nur unzureichend erhalten.
- Bei den vorliegenden Präparaten wird das Antigen an einen geeigneten festen Träger aus Kunststoff, wie beispielsweise Polystyrol oder Vinylchlorid, aus einem Fasermaterial, wie beispielsweise Nitrocellulose oder Nylon, und aus einem anorganischen Material, wie Glas oder Silicagel, fixiert. Diese Materialien können in unterschiedlicher Form auftreten einschließlich als Titerplatte, Perlen, magnetischen Perlen, Papierscheibe und Fäden. Von diesen werden bevorzugt Polystyrolperlen und eine Polystyrol-Mikrotiterplatte angewendet. Zusätzlich zur oben angegebenen Bildung einer festen Phase durch physikalische Adsorption an einen festen Träger kann das erfindungsgemäße Präparat prinzipiell auch eine feste Phase beinhalten, bei dem das antigene Material kovalent an einen Träger gebunden vorliegt, beispielsweise unter Verwendung von BrCN&sub2;.
- In dem Assay auf humane C. trachomatis-Antikörper, der das vorliegende Präparat verwendet, wird in der Mehrheit der Tests humanes Serum als Probe eingesetzt. Das erfindungsgemäße Verfahren kann jedoch auch eingesetzt werden, um Proben mit einem niedrigen C. trachomatis-Antikörpertiter zu testen, weil die nichtspezifische Reaktivität niedriger ist. Dementsprechend können auch humane Tränen, ein Sekret der internen Membranen des humanen uterocervikalen Kanals, ein aus der Prostata gepreßtes Sekret und humanes Sperma als Testproben dienen.
- Der Festphasenträger mit einem darauf wie oben beschrieben fixierten Antigen wird mit einer sorgfältig verdünnten Testprobe behandelt, von der vermutet wird, daß sie Antikörper gegen C. trachomatis enthält. Gefolgt von einer Inkubation für einen vorbestimmten Zeitraum, um die beiden miteinander reagieren zu lassen. Nichtumgesetzte Bestandteile der Probe werden entfernt, so daß auf dem Träger ein Komplex aus dem Antigen der C. trachomatis-Außenmembran und dem Antikörper aus C. trachomatis entsteht. Der Antigen/Antikörper-Komplex reagiert dann durch Behandlung eines markierten Antikörpers mit dem Antikörper, der aus der Testprobe stammt, der markierte Antikörper ist vorzugsweise ein enzymmarkierter Anti-human-IgG, IgA- oder IgM-Antikörper. Nichtumgesetzte markierte Antikörper werden dann entfernt, und die Menge der gebundenen Markersubstanz auf dem markierten Antikörper wird untersucht, um die IgG, IgA oder IgM aus C. trachomatis-Antikörpern, die in der Testprobe vorhanden sind, zu bestimmen.
- Die Markersubstanz ist nicht auf Enzyme beschränkt, sondern schließt auch radioaktive Isotope, Fluoreszensfarbstoffe und andere mit ein. Als Markerenzym können Maleatdehydrogenase (EC Nr. 1.101.37), Glucose-6-phosphatdehydrogenase (EC Nr. 1.1.1.49), Glucoseoxidase (EC Nr. 1.1.3.4), Meerrettichperoxidase (EC Nr. 1.11.1.7), Acetylcholinesterase (EC Nr. 3.1.1.7), alkalische Phosphatase (EC Nr. 3.1.3.1), Glucoamylase (EC Nr. 3.2.1.3), Lysozym (EC Nr. 3.2.1.17), β-Galactosidase (EC Nr. 3.2.1.23) etc. verwendet werden. Bevorzugt werden alkalische Phosphatase oder Meerrettichperoxidase verwendet. Abhängig von der ausgewählten Natur der Markersubstanz kann ein Assay auf die Markersubstanz nach konventionellen Methoden durchgeführt werden.
- Es wurde gezeigt, daß die so bestimmten C. trachomatis-Antikörpertiter die klinischen Anzeichen für eine C. trachomatis-Infektion gut wiedergeben. Folglich wird angenommen, daß ein IgM-Antikörper 1 bis 2 Wochen nach einer C. trachomatis-Infektion an der Körperoberfläche auftritt und daß ein IgG-Antikörper bereits zu einem früheren Zeitpunkt auftritt, im Verlauf der Zeit abnimmt, aber während längerer Zeit vorhanden ist. Andererseits nimmt man an, daß in der Prävention IgA-Antikörper des sekretorischen Typs als zelluläre Immunität erfolgreich eine erneute Infektion verhindem. Aus genitalen C. trachomatis-Infektionen beim Menschen, speziell bei Frauen, weiß man, daß die IgG-, IgA- und IgM-Antikörper im Serum und Sekreten der internen Membranen des uterozervikalen Kanals nachgewiesen werden können und daß die Menge an IgA-Antikörpern umgekehrt proportional zur Abnahme der pathogenen Parasiten von C. trachomatis ist und die Exkretion und Diffusion der pathogenen Parasiten bestimmt (Brunham et al., Infect. Immun., 39, 1491-1494, 1983).
- Die vorliegende Erfindung wird nun in Hinsicht auf die Isolierung eines Gemisches der Außenmembran mit mindestens drei Polypeptiden aus C. trachomatis, seiner Fixierung an einen festen Träger und einem Verfahren zur Prüfung auf C. trachomatis-Antikörper hin näher beschrieben. (Die Begriffe Urografin, Tween, ABTS sind geschützte Warenzeichen.)
- Es wurde der C. trachomatis-Strang L2/434/Bubo verwendet. Der Strang wurde auf McCoy-Zellen angeimpft und in einem Eagle-MEM-Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) vermehrt. Für das Animpfen mit C. trachomatis wurden Zellen verwendet, die über 3 Tage kultiviert, durch Zentrifugation bei 150 x g während 5 min gesammelt und 3mal durch Zentrifugation mit einer Hank's-BSS gewaschen wurden. Die Adsorption der C. trachomatis wurde erzielt durch Schütteln von 10 Parasiten pro Wirtszelle in Wasser bei 37ºC während 2 Stunden bei einer Wirtszellkonzentration von 10&sup7;/ml. Nach dem Adsorptionsverfahren werden die Zellen mit dem FBS-enthaltendem Medium resuspendiert bis zu einer Zellkonzentration von 5-7 x 10&sup5;/ml, gefolgt von einer Kultivierung bei 37ºC für 2 Tage. Nach beendeter Kultivierung wurde ein Teil der Kultur entnommen und zentrifugiert, um infizierte Zellen zu sammeln. Es wurde eine Abstrichprobe der Zellen entnommen und durch die Giemsa-Färbemethode auf eine genügende Propagierung der EB hin untersucht.
- Die oben beschriebene Suspension der infizierten Zellkultur wurde einem Ultraschall-Aufschlußverfahren bei 20 KHz für 60 s in einem Supersonic-Desintegrator (US-300, hergestellt von K.K. Nippon Seiki Seisakusho) unterzogen, und dann bei 20ºC für 20 min zentrifugiert, um einen Überstand der infizierten Zellen zu erhalten. Ein Volumen einer 0,033 M Tris- HCl-Pufferlösung (pH 7,2), die 30% (Gew./Vol.) Saccharose enthält, wurde überschichtet mit fünf Volumen des Überstandes, gefolgt von einer Zentrifugation bei 10.000 x g bei 4ºC während 60 min. Der Niederschlag aus der Zentrifugation wurde in einer 0,01 M Natriumphosphat-Pufferlösung (PBS) (pH 7,2), die 0,14 M Natriumchlorid enthält, suspendiert, und die Suspension über eine 0,01 M HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure)-Lösung geschichtet, die 35% Urografin (Meglumindiatriazoat und Natriumtrizat) und 0,15 M Natriumchlorid enthält, gefolgt von einer Zentrifugation bei 43.000 x g bei 4ºC während 60 min. (Separative Ultrazentrifuge 70P-72, Ausschwingrotor SPR 28SA,, hergestellt von Hitachi Koki K.K.). Die Präzipitate werden suspendiert in einer 0,01 M Natriumphosphat-Pufferlösung (SPG, pH 7,2), die 0,25 M Saccharose und 5 mM Glutaminsäure enthält, dann wurde die Suspension auf einen diskontinuierlichen Urografin-Dichtegradienten (40%/44%/52%) überschichtet, gefolgt von einer Zentrifugation bei 43.000 x g bei 4ºC während 60 min. Die Niederschlagszone der EB bildete sich an der Grenzschicht zwischen 44% und 52% Urografin, sie wurde zurückgewonnen und in SPG verdünnt. Gereinigte EB wurden erhalten durch wiederholte Zentrifugation bei 30.000 x g bei 4ºC während 30 min, um das verbleibende Urografin zu entfernen.
- Die gereinigten EB aus C. trachomatis-Strang L2 wurden in einer 0,01 M Natriumphosphat-Pufferlösung, die 2% Natrium(N-lauroylsarcosin), 1,5 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) und 0,14 M Natriumchlorid (Natrium-N-lauroylsarcosin-Pufferlösung, pH 8,0) enthält, suspendiert, und die Suspension wurde einem Ultraschall-Aufschlußverfahren bei 20 KHz während 60 s unterzogen, bei 37ºC während 1 h stehengelassen und dann bei 100.000 x g bei 20ºC während 60 min zentrifugiert. Im Anschluß an die Zentrifugation werden die Präzipitate in einer kleinen Menge der wie oben erwähnten Natrium-N-lauroylsarcosin-Pufferlösung resuspen-diert und die Suspension bei 100.000 x g bei 20ºC während 60 min zentrifugiert. Überschüssiges Natrium-N-lauroylsarcosin wurde in den Niederschlägen durch zweimaliges Waschen mit PBS (pH 8,0) entfernt. Die gewaschenen Niederschläge wurden dann in einer 0,02 M Natriumphosphat-Pufferlösung (pH 8,0) suspendiert, die 10 mM MgCl&sub2; enthielt, und in welcher DNase und RNase zu je 2,5 µg/ml gelöst vorlagen. Bei 37ºC ließ man die Suspension für 2 h stehen und zentrifugierte bei 100.000 x g bei 4ºC während 60 min ab. In den Niederschlägen verbleibende DNase und RNase wurde durch zweimaliges Waschen mit PBS (pH 8,0) entfernt. So wurden Natrium-N-lauroylsarcosin-unlösliche Polypeptide hergestellt, die die Außenmembran von C. trachomatis aufbauen (C. trachomatis- Außenmembrankomplex).
- Um den C. trachomatis-Außenmembrankomplex zu lösen, wurde er in einer 0,01 M Natriumphosphat-Pufferlösung (pH 6,4), die 2% SDS (Natriumdodecylsulfat) und 10 mM DTT (Dithiothreit) suspendiert und die Suspension bei 37ºC für 1 h stehengelassen, anschließend bei 100.000 x g bei 20ºC während 60 min zentrifugiert und der Überstand über Nacht gegen 0,01 M Natriumphosphat-Pufferlösung (pH 6,4) dialysiert, die 0,1% SDS und 1 mM DTT enthielt. So wurde ein SDS-löslicher Komplex der Außenmembran von C. trachomatis hergestellt, ein Gemisch von Polypeptiden der C. trachomatis-Außenmembran. Figur 1 zeigt ein SDS-Polyacrylamidgelektrophorese-Muster eines Gemisches der Polypeptide der Außenmembran von C. trachomatis.
- Wie man in Figur 1 deutlich sehen kann, enthält das Gemisch der Polypeptide der Außenmembran von C. trachomatis Peptide von 155 KDa (Rf 0,12), 102 KDa (Rf 0,18), 79 KDa (Rf 0,26), 75 KDa (Rf 0,27), 59,5 KDa (Rf 0,33), 49,5 KDa (Rf 0,38), 42 KDa (Rf 0,43), 39,5 KDa (Rf 0,49), 31 KDa (Rf 0,67) und 12,5 KDa (Rf 0,99).
- Die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese wurde wie folgt durchgeführt:
- Die Elektrophorese wurde in einem 12,0%igen Acrylamidgel (Vernetzungsgrad 0,8) nach dem Verfahren von Laemmli durchgeführt (Laemmli, U.K. Nature, 227, 680-685, 1970). Die Elektrophoresebedingungen betrugen 15 mA während der konzentrierenden Elektrophorese und 20 mA während der Trenn- Elektrophorese. Für den Lauf wurde der Probe zu Beginn 0,25 Volumen einer Pufferlösung als Reduktionsmittel für die Elektrophoreseprobe zugegeben [312.5 mM Tris-Salzsäure, pH 6,8, 0,1% BPB (Bromphenol-Blau), 10% SDS, 20% Glycerin], und die Mischung wurde während 30 min auf 50ºC erhitzt. Nach dem Lauf wurde das Gel bei Raumtemperatur über Nacht mit 0,05% Coomassie-R-250 gefärbt und entfärbt mit 0,7% Essigsäure. Das Molekulargewicht wurde abgeschätzt durch Vergleich mit der Mobilität der Molekulargewicht-Markerproteine (Marker: Kaninchenmuskel-Phosphorylase 97,4 KDa, Rinderserumalbumin 66,2 KDa, Ovalbumin 42,7 KDa; Rinderdecarboxylase 31 KDa, Sojabohnen-Trypsininhibitor 21,5 KDa und Albumin-Lysozym 14,4 KDa).
- Eine Lösung, die 0,5 µm/ml der SDS-gelösten Außenmembran von C. trachomatis, wie oben hergestellt (ein Gemisch der Polypeptide der Außenmembran von C. trachomatis), in einer trägerfixierenden Pufferlösung enthielt (die pro Liter 2,39 g an NaHCO&sub3; und 1,59 g an Na&sub2;CO&sub3; enthielt), wurde in die Mulden einer 96-Mulden-Polystyrol-Mikrotiterplatte in einem Volumen von 100 µl pro Mulde verteilt und über Nacht bei 4ºC reagieren gelassen. Jede der Mulden wurde dreimal mit 300 µl PBS (pH 7,2) gewaschen, die 0,05% Tween 20 (0,05% Tween 20-PBS) enthielt, um das nichtadsorbierte Antigen zu entfernen. In jede Mulde wurden dann 250 µl einer Blockierungs-Pufferlösung gegeben, die 5% BSA enthielt (hergestellt von KPL) (eine Pufferlösung zur Blockierung/Verdünnung der Testproben), gefolgt von einer einstündigen Reaktion bei 37ºC. Jede der Platten wurde zweimal mit 300 µl 0,05% Tween 20-PBS gewaschen. Auf diese Weise wurde die Platte mit dem fixierten Antigen erhalten.
- Zu jeder Mulde der Platte mit dem fixierten Antigen gab man 100 µl einer Serumprobe, verdünnt mit der Pufferlösung zur Blockierung/Verdünnung der Testprobe, gefolgt von einer einstündigen Reaktion bei 37ºC. Jede Mulde wurde dreimal mit 300 µl 0,05% Tween 20-PBS gewaschen. Ein Anti-human- IgG-Antikörper, markiert mit Meerrettichperoxidase, wurde mit 0,05% Tween 20-PBS auf 1 µl/ml verdünnt und so auf die Mulden verteilt, daß sie je 100 µl Antikörper enthielten. In den Mulden ließ man während 1 h bei 37ºC reagieren und wusch dann dreimal mit 300 µl 0,05% Tween 20-PBS, gefolgt von der Zugabe von 100 µl pro Mulde an ABTS-Reagens (hergestellt durch KPL), einem Substrat der Peroxidase. Dieses Gemisch ließ man bei Raumtemperatur für 5 min reagieren, gefolgt von der Zugabe von 25 µl pro Mulde an 2%iger Oxalsäure, um die Reaktion zu beenden. Mit Hilfe eines Mikrotiterplattenlesers (Modell MTP-22, Corona Electric Co., Ltd.) wurde die Absorption (λ&sub1;: 415 nm, λ&sub2;: 492 nm) gemessen.
- Ein Empfindlichkeits- und Spezifitätstest wurde durchgeführt mit 20 Serumproben von Patienten, die mit C. trachomatis infiziert waren und deren Parasiten isoliert wurden (Antigen-positiv), 9 Serumproben von Patienten, die C. trachomatis-Antikörper-positiv waren (Antigen-negativ) und 23 Serumproben von normalen Personen gemäß der unter C) an gegebenen Messung (ELISA-Technik). Als vergleichende Testmethode wurde die Mikro-IF-Technik angewandt. Um eine Probenlösung für den Assay auf C. trachomatis-Antikörper zu erhalten, wurden die humanen Sera mit einer Pufferlösung zur Verdünnung von Testproben, die 0,1% BSA enthält, 1:80 verdünnt. Die Ergebnisse des Assays sind in Figur 2 angegeben. Die Ergebnisse werden für die ELISA-Technik als Absorption bei 415 nm angegeben, und für die Mikro-IF-Technik als Vielfache der Verdünnung (Titer).
- Um die Wirkung der Erfindung zu verdeutlichen, wurden Vergleiche bezüglich der Empfindlichkeit und Spezifität angestellt, verglichen wurden EB von C. trachomatis-Strang L2 (gereinigte EB) oder gereinigte Hauptproteine der äußeren Membran von C. trachomatis (gereinigte MOMP) als Kontrollantigen, und dem Gemisch der Polypeptide der Außenmembran von C. trachomatis, das in der Erfindung benutzt wird. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Die gereinigten EB wurden wie zuvor beschrieben hergestellt. Die gereinigten MOMP wurden als immunologisch einheitliches Material verwendet. Dazu wurde eine Fraktion partiell gereinigter MOMP nach der Methode von Caldwell, H.D. et al. (japanische offengelegte Patentanmeldung Nr. 158725/1982) und die MOMP-Fraktion einer präparativen SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese unterworfen. Der Wert der Ausschlußgrenze wurde bestimmt durch das Hinzufügen der mit zwei multiplizierten Standardabweichung zu einer durchschnittlichen Absorption aus den 23 Serumproben von normalen Personen.
- Die Ergebnisse in Figur 2 zeigen, daß die Ergebnisse, die mit dem Assay der vorliegenden Erfindung produziert wurden, in guter Übereinstimmung mit denen der früher benutzten Mikro-IF-Technik sind.
- Die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen ebenfalls, daß das er findungsgemäße Verfahren, bei dem ein Gemisch der Polypeptide der Außenmembran von C. trachomatis verwendet wird, im Vergleich zur Mikro-IF-Technik, bei der gereinigte EB verwendet oder gereinigtes MOMP als Kontrollantigen getestet wurde, wesentlich überlegen ist. Bei dem erstgenannten Verfahren beobachtet man sehr wenige falschen Positiv- und im besonderen keine falschen Negativergebnisse, was klinisch problematisch wäre. Dies deutet auf eine hohe klinische Anwendbarkeit des vorliegenden Assayverfahrens hin. Tabelle 1
- Ein Kreuzreaktivitäts-Test wurde durchgeführt mit 7 Serumproben von Patienten, die positiv auf C. trachomatis-Antikörper waren, 17 Serumproben von Patienten, die positiv auf C. pneumoniae-Antikörper waren und 2 Serumproben von Patienten, die auf C. psittaci-Antikörper positiv waren, entsprechend dem Assayverfahren, wie es unter C) beschrieben wurde (ELISA-Technik). Als ein Vergleichsverfahren wurde die MFA-Technik angewendet ("microplate immunofluorescence antibody technique"). Vor dem Gebrauch wurde eine Probenlösung für den Assay auf einen C. trachomatis-Antikörper vorbereitet, durch Verdünnung des humanen Serums mit einer Pufferlösung zur Verdünnung der Proben, die 1% BSA enthält, 100fach für den Assay auf einen IgG-Antikörper oder 20fach für einen IgA-Antikörper. Die Ergebnisse des Assays sind in Tabelle 2 angegeben. Die Daten sind angegeben als Absorption bei 415 nm für die ELISA-Technik und als Mehrfache der Verdünnung (Potenz) gegen C. pneumoniae- Strang TW, C. psittaci-Strang MP und C. trachmatis-Strang L2 für die MFA-Technik.
- Tabelle 2 zeigt, daß die Ergebnisse des Assayverfahrens der Erfindung in sehr hoher Übereinstimmung zu den Ergebnissen, erhalten nach der bisher verwendeten MFA-Technik, liegen, das bedeutet, es gibt fast keine Kreuzreaktion mit einein C. pneumoniae-Antikörper und auch keine mit einem C. psittaci- Antikörper.
- Die Ausschlußgrenze wurde so bestimmt, daß Werte höher als 0,15 für den Assay auf IgG-Antikörper und 0,20 für den Assay auf IgA-Antikörper als Positiv bewertet wurden. Tabelle 2
- * Geschl. = Geschlecht M: Männlich, F: Weiblich
- Daraus ergibt sich deutlich, daß man einen hochspezifischen Assay auf C. trachomatis gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung durchführen kann, ohne die klinisch problematischen falschen Negativergebnisse und mit sehr viel weniger falschen Positivergebnissen und dazu fast ohne nichtspezifische Reaktionen gegen einen assoziierten C. pneumoniae- oder einen assoziierten C. psittaci-Antikörper, verglichen mit der Nachweismethode, die gereinigte EB oder gereinigte MOMP verwendet. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist deshalb für klinische Anwendungen sehr viel besser geeignet.
Claims (13)
1. Verfahren zum Nachweis eines Antikörpers gegen Chlamydia
trachomatis in einer Probe, dadurch
gekennzeichnet, daß der Antikörper mit einem Antigen behandelt wird,
bestehend aus einem Gemisch von Polypeptiden, die die
Außenmembran von C. trachomatis aufbauen, enthaltend mindestens
drei Polypeptide mit Molekulargewichten nach SDS-PAGE von
59,5 KDa, 39,5 KDa und 75 KDa, wobei das Antigen durch
Extraktion gereinigter C. trachomatis-Elementarkörper mit einem
ionischen Tensid, das eine milde Herabsetzungsaktivität für
die Grenzflächenspannung besitzt, wobei lösliche Bestandteile
entfernt werden, und Solubilisierung des
Extraktionsrückstands mit einem zweiten ionischen Tensid, das eine stärkere
Herabsetzungsaktivität für die Grenzflächenspannung besitzt
als das erste ionische Tensid, erhalten worden ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Gemisch weitere
Polypeptide mit einem Molekulargewicht nach SDS-PAGE von
155 KDa, 102 KDa, 79 KDa, 49,5 KDa, 42 KDa, 31 KDa und
12,5 KDa enthält.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, das folgende Stufen
einschließt
(a) Fixierung des Antigens an einen festen Träger,
(b) Behandlung des festen Trägers mit einer Test-Probe, die
verdächtigt wird, einen Antikörper gegen C. trachomatis
zu enthalten, um einen Antigen-Antikörper-Komplex zu
bilden, umfassend das C.
trachomatis-Außenmembran-Antigen und den C. trachomatis-Antikörper,
(c) Entfernung nichtumgesetzter Bestandteile aus der Test-
Probe,
(d) Behandeln des Antigen-Antikörper-Komplexes mit einem
markierten Antikörper gegen den Antikörper in der Test-
Probe,
(e) Entfernung nichtumgesetzter markierter Antikörper, und
(f) Nachweis der Anwesenheit oder Menge der markierten
Substanz, die an den markierten Antikörper gebunden ist,
zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge des
Antikörpers gegen C. trachomatis in Test-Proben.
4. Verfahren nach Anspruch 3, worin die Test-Probe humane
Tränenflüssigkeit, das Sekret der internen Membranen des
humanen uterocervicalen Kanals, humanes Sperma oder humanes
Serum ist.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, worin der
markierte Antikörper ein anti-human-IgG, -IgA- oder
-IgM-Antikörper ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, worin der
markierte Antikörper ein enzymmarkierter Antikörper ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, worin der enzymmarkierte
Antikörper ein Antikörper ist, der mit alkalischer Phosphatase
oder Meerrettich-Peroxidase markiert ist.
8. Präparat zur Diagnose von C. trachomatis-Infektion,
wobei das Präparat ein Antigen, definiert wie in Anspruch 1
oder 2, fixiert an einen festen Träger, umfaßt.
9. Präparat nach Anspruch 8, worin der feste Träger aus der
Gruppe, bestehend aus Kunststoffen, fibrösen Materialien und
anorganischen Materialien ausgewählt wird.
10. Präparat nach Anspruch 9, worin der feste Träger
Polystyrolperlen sind oder eine Polystyrol-Microtiter-Platte ist.
11. Präparat nach einem der Ansprüche 8 bis 10 weiter
umfassend markierte anti-human-IgG, -IgA- oder -IgM-Antikörper.
12. Präparat nach Anspruch 11, worin der markierte
Antikörper ein enzymmarkierter Antikörper ist.
13. Präparat nach Anspruch 12, wobei der enzymmarkierte
Antikörper ein mit alkalischer Phosphatase oder Meerrettich-
Peroxidase markierter Antikörper ist.
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