JPH04297871A - クラミジア・トラコマティス抗体測定方法及びクラミジア・トラコマティス感染症診断用製剤 - Google Patents
クラミジア・トラコマティス抗体測定方法及びクラミジア・トラコマティス感染症診断用製剤Info
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Abstract
め要約のデータは記録されません。
Description
ティス感染症を診断するための特異性の高いクラミジア
・トラコマティス抗体測定方法およびそれに用いられる
診断用製剤に関するものである。
mydia trachomatis)は、宿主の細
胞内でのみ生存可能な偏性細胞内寄生体である。その増
殖サイクルは特殊で、形態学的には細胞外にあるクラミ
ジア基本小体(elementary body:E
B)が食菌作用により細胞内に取り込まれて空胞封入体
を形成し、網膜体(reticulate body
:RB)に変化する。RBは増殖力はあるが感染力を欠
いており、細胞内で増殖したRBはやがてEBに変化し
、封入体を破り細胞膜を破壊して細胞外に出る。EBは
増殖力を欠くが感染力を持つ。人がこのEBに感染する
と、眼のトラコーマ、性病性リンパ肉芽腫(LGV)、
非リン菌性尿道炎(NGU)や子宮頚管炎などの眼や生
殖器の病気を発症する。
transmitteddiseases)の原因微
生物の1つとしてクラミジア・トラコマティスが注目を
集めており、アメリカではクラミジア・トラコマティス
感染症の新患者数が年間300万人から1,000万人
(熊本悦明ら:クラミジア感染症、Medic、20、
1−8、1985による)と言われており、わが国でも
クラミジア・トラコマティス感染症の実態が徐々に明ら
かにされるにつれて関心が高まってきている。
感度の高い血清診断法はワング(Wang)およびグレ
イストン(Grayston)(Trachoma
andrelated disorders ca
used by chlamydial age
nts、Excerpta Medica、Amst
erdam、pp.273−288、1971参照)の
間接ミクロ免疫蛍光抗体測定法(マイクロ−IF法)で
ある。しかしながらマイクロ−IF法はその試験手技が
困難なため臨床検査室では診断法としては採用されてい
ない。標準的なマイクロ−IF法は15種のクラミジア
・トラコマティス血清型の精製基本小体(EB)を必要
とする。マイクロ−IF法は、免疫蛍光反応を行うため
に同定微生物の完全な形態または構造を必要とする。し
たがってEBの形態または構造を変えたり破壊したりす
る方法は使用できない。このEBは伝染性があり、かつ
毒性をもっているため、そのまま抗原材料として使用す
るためには感染防禦を施した特別な施設を必要とする。 従って、通常はホルムアルデヒドやアセトンなどの固定
化剤処理した抗原を用いている。
LISA)は、簡便かつ迅速に多数検体の処理ができる
利点を有している。このELISAを用いたクラミジア
・トラコマティス抗体の測定に関する報告がなされてい
るが、そのほとんどがクラミジア・トラコマティスL2
株のEBをそのまま、または、SDS(ドデシル硫酸ナ
トリウム、sodium dodecyl sul
fate)処理してELISA用の抗原材料として用い
る。 そのため、精製純度の低い抗原を用いることによるクラ
ミジア・ニューモニエ抗体及びクラミジア・シタシ抗体
との交叉反応を含む非特異的反応の存在が知られている
。これは、主としてクラミジア・トラコマティスの複雑
な抗原性に起因している。クラミジア・トラコマティス
の抗原性には、属(genus)特異的抗原、種(sp
ecies)特異的抗原および血清型(biobar)
特異的抗原があると考えられている。代表的な属特異的
抗原として、リポポリサッカライド(lipopoly
saccharide:LPS)が知られており、これ
は一部腸内細菌のReミュータントLPSと共通抗原性
を有している。
原としては、クラミジア・トラコマティス主要外膜ペプ
チド(Major Outer Membrane
Protein:MOMP)が知られており、これ
はクラミジア・トラコマティス外膜タンパク質の約60
%を占めるといわれている。しかしながらこのMOMP
にも属特異的抗原性の存在が知られている(Colle
tt ら、Annu.Meet.Am.Soc.Mic
robiol.、Washington.D.C.、A
bstract No.D−159、1986)。M
OMP以外のクラミジア・トラコマティス外膜抗原は主
として属特異的抗原であるが、同時に種特異的抗原性の
存在するものもある。サルコシル不溶性の分子量約59
.5ダルトンペプチドはこの範疇にはいる。
ジア・トラコマティスのもつ抗原性は非常に複雑である
。クラミジア・トラコマティス感染者の有するクラミジ
ア・トラコマティス抗体は、クラミジア・トラコマティ
スの複雑な抗原性に対応した多様性を示し、感染者によ
ってそのパターンは異なる。そのため特定の1種類のク
ラミジア・トラコマティス蛋白を用いて、クラミジア・
トラコマティス抗体を測定することは事実上不可能であ
る。従って、クラミジア・トラコマティス感染者の有す
るクラミジア・トラコマティス抗体を高精度かつ高感度
で、クラミジア・ニューモニエ抗体及びクラミジア・シ
タシ抗体との交叉反応を含む非特異的反応を抑えて測定
するためには、用いる抗原材料の適切な選択が必要とな
る。
くとも2種以上のクラミジア・トラコマティス外膜構成
ポリペプチドからなる膜画分を抗原材料とすることによ
って、上述したEBそのものあるいはSDS処理したE
Bを抗原材料としてクラミジア・トラコマティス抗体を
測定する従来のELISA法におけるクラミジア・ニュ
ーモニエ抗体及びクラミジア・シタシ抗体との交叉反応
性を含む非特異的反応の問題点を解消したものである。
クラミジア・トラコマティス外膜構成ポリペプチドを含
有するクラミジア・トラコマティス外膜複合体又は該複
合体から得られる、少なくとも2種以上のクラミジア・
トラコマティス外膜構成ポリペプチド混合物を抗原とし
て用いることを特徴とするクラミジア・ニューモニエ抗
体及びクラミジア・シタシ抗体との交叉反応性を含む非
特異的反応の低い、特異性の高いクラミジア・トラコマ
ティス抗体測定方法並びに該クラミジア・トラコマティ
ス外膜複合体を固相担体に固定化した固相化抗原を含有
してなる特異性の高いクラミジア・トラコマティス感染
症診断用製剤に関する。
いる、少なくとも2種以上のクラミジア・トラコマティ
ス外膜構成ポリペプチドを含有するクラミジア・トラコ
マティス外膜複合体、又はクラミジア・トラコマティス
外膜構成ポリペプチド混合物は、カルドウェル(Cal
dwell)らのInfection and I
mmunity.、31、1161−1176、198
1等に記載される公知の方法を用いて調製することがで
きる。
Bを常套手段により精製し、次いで精製されたクラミジ
ア・トラコマティスEBを、界面張力低下の作用が温和
なイオン性界面活性剤、好ましくはアニオンサルコシン
界面活性剤、特に好ましくはサルコシル(N−ラウロイ
ルサルコシンナトリウム)によって抽出し、可溶分を除
去した後の残渣成分とする。この後、好ましくはデオキ
シリボ核酸分解酵素(DNase)及びリボ核酸分解酵
素(RNase)でヌクレアーゼ処理を行う。
ラミジア・トラコマティスEBを2%サルコシル、1.
5mM EDTAを含むPBS(pH8.0)で抽出
し、サルコシル可溶性成分を抽出除去した後、DNas
e RNase処理して、サルコシル不溶性画分(残
渣成分)として調製することができる。
る大腸菌の外膜調製法として開発されたものである(F
ilipら、J、Bacteriol.、115、71
7−722、1973)。このようにして得られるクラ
ミジア・トラコマティス外膜構成ポリペプチドを含有す
るクラミジア・トラコマティス外膜複合体は、電子顕微
鏡による形態観察で、完全なクラミジア・トラコマティ
ス細胞(EB)から細胞質(cytoplasm)と細
胞質膜(cytoplasmic membrane
)が欠落した細胞壁(cell wall)であること
がわかる。このようにクラミジア・トラコマティス外膜
は、グラム陰性細菌の外膜(細胞壁)と共通した構造的
、機能的特徴を有している。
ラコマティス外膜複合体(サルコシル不溶性画分)は、
このまま本発明の方法における抗原として用いることが
できるが、より本発明に好適な固層への吸着が均一とな
る抗原とするために、次いで前記のイオン性界面活性剤
より界面張力低下の作用が強力な他のイオン性界面活性
剤、好ましくはドデシル硫酸ナトリウム(SDS)によ
り可溶化する。こうして本発明に使用するクラミジア・
トラコマティス外膜構成ポリペプチド混合物が得られる
。
コマティス外膜構成ポリペプチド混合物を、後述する条
件によりSDSポリアクリルアミド電気泳動を行って解
析したところ、約155Kダルトン、約102Kダルト
ン、約79Kダルトン、約75Kダルトン、約59.5
Kダルトン、約49.5Kダルトン、約42Kダルトン
、約39.5Kダルトン、約31Kダルトン、約12.
5Kダルトン等のポリペプチドから構成されている。こ
こで約39.5Kダルトンペプチドは、全体の約60%
を占め、主要外膜ペプチド(MOMP)と呼ばれている
ものである。一方、約12.5Kダルトンペプチドは、
システィン含有量の高いペプチドでクラミジア・トラコ
マティス種に特有のペプチドでありクラミジア・シタシ
種には存在しない(Barron、Microbiol
ogy of Chlamydia、CRC P
ress Inc、Boca Raton、Flo
rida、48−50、1988)。また、約59.5
Kダルトンペプチドには、種特異的抗原性が存在するこ
とが明らかとなっている。
された、クラミジア・トラコマティス外膜複合体又は多
種のポリペプチドを含むクラミジア・トラコマティス外
膜構成ポリペプチド混合物をそのまま抗原として用いる
のが好ましいが、前述の各分子量のポリペプチドのうち
少なくとも2種以上を含んだクラミジア・トラコマティ
ス外膜複合体を抗原として用いることもできる。その場
合、抗体としてIgG又はIgAを使用するときは、約
39.5Kダルトンペプチド(MOMP)及び約59.
5Kダルトンペプチドを含むのが好ましく、抗体として
IgMを使用するときは、約75Kダルトンペプチド及
び約59.5Kダルトンペプチドを含むのが好ましい。 ここでペプチドの分子量に約をつけたのは、測定毎の誤
差を考慮したためである。また、SDS電気泳動の分子
量の測定条件によっては、記載する分子量と異なった分
子量値となることもあるが、本発明で規定する分子量の
ポリペプチドと同一のものであるならば、それをも含む
ものである。
も2種以上のポリペプチドを含むクラミジア・トラコマ
ティス外膜複合体又はクラミジア・トラコマティス外膜
構成ポリペプチド混合物を抗原として用いることが重要
であり、仮にどれか1つのポリペプチド、例えば約39
.5Kダルトンペプチド(MOMP)に精製したものを
用いたのでは、臨床上非常に大きな問題である凝陰性反
応が生じ、また、十分な種特異性が得られるものとも言
い難い。
膜複合体又はクラミジア・トラコマティス外膜構成ポリ
ペプチド混合物をクラミジア・トラコマティス抗体測定
のための抗原原料として用いる本発明の製剤では、該抗
原を固相担体としてポリスチレンや塩化ビニールなどの
プラスチック材料、ニトロセルロースやナイロンなどの
繊維材料及びガラスやシリカゲルなどの無機材料等に固
定化することができ、その形状は、タイタープレート、
ビーズ、磁性ビーズ、ペーパーディスク、糸などあらゆ
る形が可能である。中でも特にポリスチレンビーズ又は
ポリスチレンマイクロタイタープレートが好ましいもの
として使用される。また、本発明の製剤は、上記した固
相担体に物理的吸着に基づく方法で固相化させる方法に
限らず、原理的には抗原材料をBrCN2等を用いた共
有結合法によって担体に固相化したものでもかまわない
。
・トラコマティス抗体測定方法は、検体試料として主に
ヒト血清が用いられる。しかしながら本発明の方法によ
れば、非特異的反応性が低いためにクラミジア・トラコ
マティス抗体価の低い検体試料にも適用できる。従って
、ヒト涙、ヒト子宮頚管内膜分泌物及び,尿道より圧出
した前立腺液ヒト***も検体試料として用いることがで
きる。
を施したクラミジア・トラコマティスに対する抗体を含
有している疑いのある検体試料と接触させ、一定時間保
温し、反応させた後、未反応の検体試料成分を除去して
、担体上にクラミジア・トラコマティス外膜構成ポリペ
プチド抗原とクラミジア・トラコマティス抗体の複合体
を得る。次に、この抗原/抗体複合体に、検体試料に由
来する抗体に対する標識抗体、好ましくは酵素標識抗ヒ
トIgG、IgAまたはIgM抗体と接触させ、反応さ
せる。その後、未反応の標識抗体を除去し、結合した標
識抗体上の標識物質量を測定することによって、検体試
料中に存在するIgG、IgAまたはIgM性のクラミ
ジア・トラコマティス抗体を測定する。
でもよく、酵素に限定されるものではない。また、標識
酵素としてはマレートデヒドロゲナーゼ(酵素番号1.
1.1.37)、グルコース−6−リン酸脱水素酵素(
同1.1.1.49)、グルコースオキシダーゼ(同1
.1.3.4)、西洋ワサビパーオキシダーゼ(同1.
11.1.7)、アセチルコリンエステラーゼ(同3.
1.1.7)、アルカリフォスファターゼ(同3.1.
3.1)、グルコアミラーゼ(同3.2.1.3)、リ
ゾチーム(同3.2.1.17)、β−ガラクトシダー
ゼ(同3.2.1.23)などを用いることができるが
、好ましくはアルカリフォスファターゼまたは西洋ワサ
ビパーオキシダーゼを用いる。なお、標識物質の定量は
、標識物質の種類に応じて選択される常法に従って行う
ことができる。
ラミジア・トラコマティス抗体価は、クラミジア・トラ
コマティス感染症の臨床像をよく反映することが明らか
になっている。即ち、クラミジア・トラコマティスによ
る体表面への感染によりIgM抗体は感染後1〜2週間
で出現し、IgG抗体も比較的早期に認められ時間とと
もに減少するが長時間持続すると考えられている。一方
、分泌型のIgA抗体は細胞性免疫と同様に再感染防禦
に役立っていると考えられている。クラミジア・トラコ
マティスのヒト性器感染に関しては、特に女性の場合、
血清中と子宮頚管内膜分泌物中にIgG、IgA、Ig
M抗体が検出され、IgA抗体量は病原体クラミジア・
トラコマティスの減少と逆比例の関係にあり病原体の排
出拡散を規制していることが知られている(Brunh
amら、Infect.Immun.、39、1491
−1494、1983)。
ミジア・トラコマティス外膜構成ポリペプチド混合物の
単離、固相担体への固定化及びクラミジア・トラコマテ
ィス抗体の測定方法についてより詳細に記述するが、本
発明はこれらに限定されるものではない。
(EB)の精製 クラミジア・トラコマティス菌株はL2/434/Bu
boを用いた。上記菌株を10%牛胎児血清(FBS)
添加イーグル(Eagle)MEM培地中で増殖したマ
ッコイ(MaCoy)細胞に接種した。クラミジア・ト
ラコマティスの接種には培養3日の細胞を用い、150
×g、5分間遠心分離で収集しハンクス(Hank’s
)BSSで3回遠心洗浄した。吸着は宿主細胞あたり1
0個のクラミジア・トラコマティスを反応させ、宿主細
胞濃度107/mlで37℃、2時間温水中で振とうし
つつ行った。吸着後FBS添加培地に細胞濃度が5〜7
×105/mlになるように再浮遊させ37℃で2日間
培養した。培養後、その一部を採取し遠心により感染細
胞を集め塗抹標本を作成し、ギムザ(Giemsa)染
色によりEBが十分に増殖していることを確認した。
(株)日本精機製作所US−300)で20KHz、6
0秒間超音波破砕した後、20℃、20分間遠心し感染
培養上清を得た。この上清液5容を30%ショ糖(w/
v)を含む0.033Mトリス(Tris)−HCl緩
衝液(pH7.2)1容に重層し、10,000×g、
4℃、60分間遠心した。この遠心沈渣に0.14M食
塩を含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液(PBS)
(pH7.2)を加えて懸濁し、この懸濁液を35%ウ
ログラフイン(diatrizoate meglu
mine andtrizatesodium)及び
0.15M食塩を含む0.01MHEPES(N−2−
hydroxyethylpiperazine−N’
−2−ethanesulfonic acid)溶
液に重層し、43,000×g、4℃、60分間遠心し
た(日立工機(株)分離用超遠心機70P−72、スイ
ングロータSPR28SA)。沈渣を0.25Mショ糖
及び5mMグルタミン酸を含む0.01Mリン酸ナトリ
ウム緩衝液(SPG、pH7.2)に懸濁し、ウログラ
フィン不連続密度勾配(40%/44%/52%)に重
層し、43,000×g、4℃、60分間遠心した。4
4%と52%ウログラフィンの界面に生じるEBの沈降
帯を回収し、SPGで希釈し、30,000×g、4℃
、30分間の遠心を繰り返すことにより残留するウログ
ラフィンを除去して精製EBとした。
ポリペプチド抗原の精製 精製クラミジア・トラコマティスL2株EBを2%サル
コシル(Sarcosyl;N−lauroylsar
cosine sodium salt)、1.5
mM EDTA(ethylenediamine
tetraaceticacid)及び0.14M食
塩を含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液(サルコシ
ル緩衝液、pH8.0)に懸濁し、20KHz、60秒
間超音波処理し、37℃で1時間反応後、100,00
0×g、20℃で60分間遠心した。遠心後沈渣を再度
少量の上記サルコシル緩衝液に懸濁し、100,000
×g、20℃で60分間遠心した。沈渣中の過剰のサル
コシルを除くため、PBS(pH8.0)で2回洗浄し
た。次に、DNase、RNaseを各々2.5μg/
mlに溶解した10mM MgCl2を含む0.02
Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0)に上記沈渣を
懸濁し37℃で2時間反応後、100,000×g、4
℃で60分間遠心した。沈渣中に残存するDNase、
RNaseを除くためPBS(pH8.0)で2回洗浄
し、サルコシル不溶性クラミジア・トラコマティス外膜
構成ポリペプチド(クラミジア・トラコマティス外膜複
合体)を得た。
体を可溶化するために、2%SDS、10mM DT
T(dithiothreitol)を含む0.01M
リン酸ナトリウム緩衝液(pH6.4)に懸濁し、
37℃,1時間反応した。次に100,000×g、2
0℃、60分間遠心後上清を0.1%SDS、1mM
DTTを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液(p
H6.4)に対して1晩透析し、SDS可溶化クラミジ
ア・トラコマティス外膜構成ポリペプチド混合物を調製
した。図1は得られたクラミジア・トラコマティス外膜
構成ポリペプチド混合物のSDSポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動の図である。
調製方法により得られたクラミジア・トラコマティス外
膜構成ポリペプチド混合物は、155Kダルトンペプチ
ド(Rf値0.12)、102Kダルトンペプチド(R
f値0.18)、79Kダルトンペプチド(Rf値0.
26)、75Kダルトンペプチド(Rf値0.27)、
59.5Kダルトンペプチド(Rf値0.33)、49
.5Kダルトンペプチド(Rf値0.38)、42Kダ
ルトンペプチド(Rf値0.43)、39.5Kダルト
ンペプチド(Rf値0.49)、31Kダルトンペプチ
ド(Rf値0.67)、12.5Kダルトンペプチド(
Rf値0.99)が含有されるものである。
泳動は次の方法で行った。Laemmli(Laemm
li、U.K.Nature、227、680〜685
、1970)の方法に準じ、12.0%アクリルアミド
ゲル(架橋度0.8)中で泳動した。泳動条件は、濃縮
泳動時15mA、分離泳動時20mAである。泳動試料
は、予め還元剤として、2−メルカプトエタノールを2
5%含む試料用緩衝液〔312.5mM トリス−塩
酸、pH6.8、0.1%BPB(ブロムフェノールブ
ルー)、10%SDS、20%グリセリン〕を0.25
体積加え50℃、30分間処理した。泳動後、0.05
%Coomassie R−250で室温で1晩染色
し、0.7%酢酸で脱色した。なお、分子量は、同じ条
件で泳動した分子量マーカー蛋白質の易動度より推定し
た(マーカー;ウサギ筋フォスフォリラーゼ97.4K
Da、牛血清アルブミン66.2KDa、卵白アルブミ
ン42.7KDa、牛炭酸脱水酵素31KDa、大豆ト
リプシンインヒビター21.5KDa及び卵白リゾチー
ム14.4KDa)。
方法 前記の方法により得られたSDS可溶化クラミジア・ト
ラコマティス外膜構成ポリペプチド混合物を抗原として
担体固定用緩衝液(1l中にNaHCO3、Na2CO
2各々2.93g、1.59gを含む)で0.5μg/
mlに調製し96穴ポリスチレンマイクロタイタープレ
ートの各ウェルに100μlずつ分注し4℃で1晩反応
した。0.05%トウエーン(Tween)20を含む
PBS(pH7.2)(0.05%トウエーン20−P
BS)300μlで3回洗浄し未吸着抗原を除去した。 次に5%BSAを含むブロッキング緩衝液(KPL社製
)(ブロッキング/検体希釈用緩衝液)250μlを各
ウェルに加え37℃、1時間反応し、0.05%トウエ
ーン20−PBS 300μlで2回洗浄して抗原固
定化プレートを作成した。
た希釈検体血清100μlを上記抗原固定化プレートに
加えて37℃、1時間反応後0.05%トウエーン20
−PBS 300μlで3回洗浄した。西洋ワサビパ
ーオキシダーゼで標識した抗ヒトIgG抗体を0.05
%トウエーン20−PBSで1μl/mlに希釈し各ウ
ェルに100μlずつ分注し37℃で1時間反応後、0
.05%トウエーン20−PBS 300μlで3回
洗浄した。次に、パーオキシダーゼの基質ABTS試薬
(KPL社)100μlを各ウェルに加え室温で5分間
反応後、2%シュウ酸25μlを加えて反応を停止し、
マイクロタイタープレートリーダー(コロナ電気(株)
、MTP−22形)で吸光度(λ1:415nm、λ2
:492nm)を測定した。
(クラミジア・トラコマティスIgG抗体の測定)、ク
ラミジア・トラコマティス菌分離が確認されているクラ
ミジア・トラコマティス感染患者血清20検体(抗原陽
性)、クラミジア・トラコマティス抗体陽性者血清9検
体(抗原陰性)、及び正常ヒト血清23検体を用いてC
)に記載の測定方法(ELISA法)に従って感度及び
特異性試験を行った。対照試験法としてマイクロ−IF
法を行った。ヒト血清は1%BSAを含む検体希釈用緩
衝液で80倍に希釈し、クラミジア・トラコマティス抗
体測定用試料液とした。測定結果を図2に示す。なお、
ELISA法は415nmの吸光度で、マイクロ−IF
法は血清希釈倍数(力価)で示した。
るために、クラミジア・トラコマティス抗体測定のため
に対照抗原として精製クラミジア・トラコマティスL2
株EB(精製EB)と精製クラミジア・トラコマティス
主要外膜ペプチド(精製MOMP)を用い、本発明で用
いたクラミジア・トラコマティス外膜複合体抗原と感度
及び特異性を比較した。結果を表1に示す。精製EBの
調製法は既述の通りである。また、精製MOMPは、カ
ルドウェル(Caldwell)H、Dらの方法(特開
昭57−158725号公報)に従って調製した部分精
製MOMP画分をさらに調製用SDSポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法により免疫学的に均一な状態にした標
品を用いた。尚、各試験のカットオフ値は正常ヒト血清
23検体の吸光度の平均値に標準偏差を2倍したものを
加えた値とした。
て得られた結果が、従来のマイクロ−IF法との相関が
極めて良好であることを示している。また、表1の結果
はクラミジア・トラコマティス外膜複合体抗原を用いた
本発明の方法が対照抗原として試験した精製EBや精製
MOMPに比して、マイクロ−IF法との一致率が非常
に優れていることを示している。即ち、凝陽性(fal
se positive)は非常に低く、特に、臨床
上問題になる凝陰性(false negative
)がなく臨床的有用性が高いことを示している。
ラミジア・シタシ抗体との交叉反応性の検討クラミジア
・トラコマティス抗体陽性者血清7検体、クラミジア・
ニューモニエ抗体陽性者血清17検体及びクラミジア・
シタシ抗体陽性者血清2検体を用いてC)に記載の測定
方法(ELISA法)に従って交叉反応性試験を行った
。対照試験法としてMFA法(microplate
immunofluorescence anti
body technique)を行った。ヒト血清
は1%BSAを含む検体希釈用緩衝液でIgG抗体測定
の場合には100倍、IgA抗体測定の場合には20倍
に希釈し、クラミジア・トラコマティス抗体測定用試料
液とした。測定結果を表2に示す。なお、ELISA法
は415nmの吸光度で、またMFA法はクラミジア・
ニューモニエTW株、クラミジア・シタシMP株及びク
ラミジア・トラコマティスL2株に対する血清希釈倍数
(力価)で示した。
のMFA法の結果と極めて高い一致率であることを示し
ている。即ちクラミジア・ニューモニエ抗体及びクラミ
ジア・シタシ抗体とほとんど交叉反応していないことを
示している。なお、各試験のカットオフ値はIgG抗体
測定の場合0.15、IgA抗体測定の場合0.20と
し、それ以上を陽性と判定する。
ミジア・トラコマティス抗体測定方法によれば、精製E
Bや精製MOMPを用いる測定方法に比較して、臨床上
問題となる凝陰性がなく、凝陽性が非常に低くかつクラ
ミジア・ニューモニエ抗体及びクラミジア・シタシ抗体
との非特異的反応のほとんどない、種特異性の高い測定
を行うことができ、臨床的有用性が高いものである。
S−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(12.5%アク
リルアミドスラブゲルの様子)を示すパターン図である
。
チド混合物を抗原として用いた酵素免疫測定法(ELI
SA)とマイクロ−IF法との相関関係を示すグラフで
ある。
5Kダルトンペプチド 4 …102Kダルトンペプチド 5 …79Kダルトンペプチド 6 …75Kダルトンペプチド 7 …59.5Kダルトンペプチド 8 …49.5Kダルトンペプチド 9 …42Kダルトンペプチド 10…39.5Kダルトンペプチド 11…31Kダルトンペプチド 12…12.5Kダルトンペプチド
Claims (25)
- 【請求項1】 少なくとも2種以上のクラミジア・ト
ラコマティス外膜構成ポリペプチドを含有するクラミジ
ア・トラコマティス外膜複合体又は該複合体から得られ
る、少なくとも2種以上のクラミジア・トラコマティス
外膜構成ポリペプチド混合物を抗原として用いることを
特徴とする特異性の高いクラミジア・トラコマティス抗
体測定方法。 - 【請求項2】 クラミジア・ニューモニエ抗体及びク
ラミジア・シタシ抗体との非特異的反応の低い請求項1
記載のクラミジア・トラコマティス抗体測定方法。 - 【請求項3】 クラミジア・トラコマティス外膜複合
体が、クラミジア・トラコマティス基本小体を温和なイ
オン性界面活性剤によって抽出した残渣成分から得られ
るものである請求項1または2記載のクラミジア・トラ
コマティス抗体測定方法。 - 【請求項4】 温和なイオン性界面活性剤がサルコシ
ルである請求項3記載のクラミジア・トラコマティス抗
体測定方法。 - 【請求項5】 クラミジア・トラコマティス外膜構成
ポリペプチド混合物が、温和なイオン性界面活性剤によ
って抽出した残渣成分を、該イオン性界面活性剤よりも
強力な他のイオン性界面活性剤により可溶化して得られ
るものである請求項1記載のクラミジア・トラコマティ
ス抗体測定方法。 - 【請求項6】 クラミジア・トラコマティス外膜構成
ポリペプチド混合物が、温和なイオン性界面活性剤によ
って抽出した残渣成分を、核酸分解酵素で処理し、次い
で該イオン性界面活性剤よりも強力な他のイオン性界面
活性剤により可溶化して得られるものである請求項1記
載のクラミジア・トラコマティス抗体測定方法。 - 【請求項7】 強力な他のイオン性界面活性剤がドデ
シル硫酸ナトリウムである請求項5または6記載のクラ
ミジア・トラコマティス抗体測定方法。 - 【請求項8】 クラミジア・トラコマティス外膜複合
体又はクラミジア・トラコマティス外膜構成ポリペプチ
ド混合物が、約155Kダルトン、約102Kダルトン
、約79Kダルトン、約75Kダルトン、約59.5K
ダルトン、約49.5Kダルトン、約42Kダルトン、
約39.5Kダルトン、約31Kダルトン及び12.5
Kダルトンの分子量をもつポリペプチドからなる群から
選択される少なくとも2種以上のクラミジア・トラコマ
ティス外膜構成ポリペプチドを含有することを特徴とす
る請求項1〜7のいずれかに記載のクラミジア・トラコ
マティス抗体測定方法。 - 【請求項9】 (a)少なくとも2種以上のクラミジ
ア・トラコマティス外膜構成ポリペプチドを含有するク
ラミジア・トラコマティス外膜複合体又は該複合体から
得られる、少なくとも2種以上のクラミジア・トラコマ
ティス外膜構成ポリペプチド混合物を固相担体に固定化
し、(b)固定されたクラミジア・トラコマティス外膜
複合体又はクラミジア・トラコマティス外膜構成ポリペ
プチド混合物を有する該固相担体をクラミジア・トラコ
マティスに対する抗体を含有している疑いのある検体試
料と接触させ、(c)未反応の該検体試料成分を除去し
、(d)生成したクラミジア・トラコマティス外膜構成
ポリペプチド抗原とクラミジア・トラコマティス抗体か
らなる抗原抗体複合体を該検体試料に由来する抗体に対
する標識抗体と接触させ、(e)未反応の該標識抗体を
除去し、(f)結合した該標識抗体上の標識物質量を測
定することによって検体試料中のクラミジア・トラコマ
ティス抗体の存在又は量を測定する各段階を含むことを
特徴とする特異性の高いクラミジア・トラコマティス抗
体測定方法。 - 【請求項10】 クラミジア・トラコマティス外膜複
合体がクラミジア・トラコマティス基本小体を温和なイ
オン性界面活性剤によって抽出した残渣成分から得られ
るものである請求項9記載のクラミジア・トラコマティ
ス抗体測定方法。 - 【請求項11】 クラミジア・トラコマティス外膜複
合体又はクラミジア・トラコマティス外膜構成ポリペプ
チド混合物が、約155Kダルトン、約102Kダルト
ン、約79Kダルトン、約75Kダルトン、約59.5
Kダルトン、約49.5Kダルトン、約42Kダルトン
、約39.5Kダルトン、約31Kダルトン及び12.
5Kダルトンの分子量をもつポリペプチドからなる群か
ら選択される少なくとも2種以上のクラミジア・トラコ
マティス外膜構成ポリペプチドを含有することを特徴と
する請求項9又は10記載のクラミジア・トラコマティ
ス抗体測定方法。 - 【請求項12】 検体試料がヒト涙、ヒト子宮頚管内
膜分泌物、ヒト***及びヒト血清のいずれかである請求
項9、10又は11記載のクラミジア・トラコマティス
抗体測定方法。 - 【請求項13】 標識抗体が抗ヒトIgG、IgAま
たはIgM抗体である請求項9、10、11又は12記
載のクラミジア・トラコマティス抗体測定方法。 - 【請求項14】 標識抗体が酵素標識抗体である請求
項9、10、11、12又は13記載のクラミジア・ト
ラコマティス抗体測定方法。 - 【請求項15】 酵素標識抗体がアルカリフォスファ
ターゼまたは西洋ワサビパーオキシダーゼ標識抗体であ
る請求項14記載のクラミジア・トラコマティス抗体測
定方法。 - 【請求項16】 少なくとも2種以上のクラミジア・
トラコマティス外膜構成ポリペプチドを含有するクラミ
ジア・トラコマティス外膜複合体又は該複合体から得ら
れる、少なくとも2種以上のクラミジア・トラコマティ
ス外膜構成ポリペプチド混合物を固相担体に固定化した
固定化抗原を含有してなる特異性の高いクラミジア・ト
ラコマティス感染症診断用製剤。 - 【請求項17】 クラミジア・ニューモニエ抗体及び
クラミジア・シタシ抗体との非特異的反応の低い請求項
16記載のクラミジア・トラコマティス感染症診断用製
剤。 - 【請求項18】 クラミジア・トラコマティス外膜複
合体がクラミジア・トラコマティス基本小体を温和なイ
オン性界面活性剤によって抽出した残渣成分から得られ
るものである請求項16または17記載のクラミジア・
トラコマティス感染症診断用製剤。 - 【請求項19】 クラミジア・トラコマティス外膜複
合体又はクラミジア・トラコマティス外膜構成ポリペプ
チド混合物が、約155Kダルトン、約102Kダルト
ン、約79Kダルトン、約75Kダルトン、約59.5
Kダルトン、約49.5Kダルトン、約42Kダルトン
、約39.5Kダルトン、約31Kダルトン及び12.
5Kダルトンの分子量をもつポリペプチドからなる群か
ら選択される少なくとも2種以上のクラミジア・トラコ
マティス外膜構成ポリペプチドを含有するものである請
求項16、17又は18記載のクラミジア・トラコマテ
ィス感染症診断用製剤。 - 【請求項20】 温和なイオン性界面活性剤がサルコ
シルである請求項18又は19記載のクラミジア・トラ
コマティス感染症診断用製剤。 - 【請求項21】 固相担体がプラスチック材料、繊維
材料及び無機材料から選択されるものである請求項16
〜20のいずれかに記載のクラミジア・トラコマティス
感染症診断用製剤。 - 【請求項22】 固相担体がポリスチレンビーズ又は
ポリスチレンマイクロタイタープレートである請求項1
6〜21のいずれかに記載のクラミジア・トラコマティ
ス感染症診断用製剤。 - 【請求項23】 請求項16記載の固定化抗原と、標
識抗体として抗ヒトIgG、IgA又はIgM抗体とを
組み合わせてなる特異性の高いクラミジア・トラコマテ
ィス感染症診断用製剤。 - 【請求項24】 標識抗体が酵素標識抗体である請求
項23記載のクラミジア・トラコマティス感染症診断用
製剤。 - 【請求項25】 酵素標識抗体がアルカリフォスファ
ターゼまたは西洋ワサビパーオキシダーゼ標識抗体であ
る請求項23又は24記載のクラミジア・トラコマティ
ス感染症診断用製剤。
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