DE68923882T2 - Verfahren zur herstellung des hochmolekulargewichtigen zell-verbundenen proteins von campylobakter pylori und seine verwendung zum serologischen nachweis von campylobakter pylori-infektionen. - Google Patents
Verfahren zur herstellung des hochmolekulargewichtigen zell-verbundenen proteins von campylobakter pylori und seine verwendung zum serologischen nachweis von campylobakter pylori-infektionen.Info
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Description
- Diese Erfindung betrifft zellassoziierte Proteine mit hohem Molekulargewicht, welche als Antigene für den Nachweis eines Antikörpers gegen eine Campylobacter pylori-Infektion verwendet werden. Sie ist sowohl für die Herstellung des Antigens als auch bei dem Nachweis und Überwachen der Infektion nützlich.
- Campylobacter pylori (C. pylori) wurde erstmals 1982 isoliert. Es ist jetzt bekannt, daß es eine wichtige Ursache von Gastritis ist, und es wurde mit Zwölffingerdarmgeschwüren, Magengeschwüren, Dyspepsie und Magenkarzinomen in Verbindung gebracht. Seit der Entdeckung in 1982 gab es ein gewaltiges weltweites Interesse für C. pylori und für Versuche, seine tatsächliche Rolle bei Magenerkrankungen und der Bildung von Geschwüren zu beschreiben. Trotz der zahlreichen Studien, welche einen engen Zusammenhang zwischen C. pylori und abnormaler Magenpathologie zeigen, gibt es zu wenig Beweise, um abschließend zu bestimmen, ob der Organismus pathogen oder opportunistisch ist. Nichtsdestotrotz ist die Gegenwart von C. pylori eine wichtige Erwägung beim Behandeln einer Magenerkrankung.
- Patienten, in welchen sich C. pylori angesiedelt hat, rufen eine spezifische Antikörperantwort hervor, welche potentiell als eine diagnostische Hilfe und zum Überwachen des Krankheitszustandes während einer Behandlung nützlich ist. Folglich wurden viele Systeme entwickelt, um anti-C. pylori-Antikörper im Serum nachzuweisen. Jedoch lassen einleitende Studien vermuten, daß C. pylori eine antigene Kreuzreaktivität mit den thermophilen Campylobakterien C. jejuni und C. coli zeigt. Diese Kreuzreaktivität führt zu einem Mangel an Spezifität.
- Bei Versuchen, die Probleme, welche mit der Kreuzreaktivität zusammenhängen, zu vermeiden, haben Forscher eingehend die sauren extrahierbaren Oberflächenproteine und die äußeren Membranproteine von C. pylori untersucht. Newall, D.G., Journal of General Microbiology 133: 163 - 170 (1987); und Perez-Perez, G.I. und Blaser, M.J., Infection and Immunity 55: 1256 - 1263 (1987). Newall zeigte, daß saure extrahierbare Proteine in dem Molekularbereich von 20.000 bis 100.000 Dalton existierten, welche einmalig bei C. pylori vorhanden waren. Jedoch waren einige dieser Proteine ähnlich zu Proteinen von C. jejuni und viele zeigten ebenfalls eine Kreuzreaktivität mit C. jejuni. Wenigstens ein Hauptantigen (ungefähr 60.000 Dalton) zeigte nur minimale Kreuzreaktivität mit C. jejuni, jedoch gab es noch immer eine gewisse Kreuzreaktivität. Auf der anderen Seite zeigte Perez-Perez, daß ein Antigen mit ca. 62.000 Dalton eine deutliche Kreuzreaktivität aufwies. C. pylori ist in der Lage, sowohl eine systemische als auch eine lokale Antikörperantwort in Patienten mit chronischer Gastritis hervorzurufen, jedoch scheint diese sekretorische Antikörperantwort die Ansiedelung nicht auszuschließen. Rathbone, B.J. et al., Gut, 27: 642 - 647 (1986). Rathbone et al. verwendeten in ihrem immunologischen Test den ganzen Organismus.
- Andere Studien unter Verwendung der Immunoblot-Technik zeigen, daß C. pylori eine Anzahl von immunreaktiven Komponenten in dem Bereich von 100.000 Dalton oder weniger aufweist. Kaldor, J. et al., The Medical Journal of Australia 145: 133 - 135 (1986).
- ELISA-Tests mit ganzen Organismen erfassen C. pylori-Antikörper, sind aber immer noch nicht in der Lage, das Kreuzreaktivitätsproblem zu lösen. Morris et al., The New Zealand Medical Journal 99: 657 - 659 (1986).
- Saure Glycin-Extrakte von C. pylori weisen unter Verwendung von ELISA-Techniken Antikörper nach. Jedoch existiert eine Anzahl von falschen Positiven und falschen Negativen. Obwohl die relative Zahl von jedem falschen Ergebnis durch Einstellen des Grenzpunktes (cut off point) reguliert werden kann, gibt es immer noch eine deutliche Überlappung zwischen den Gruppen. Godwin et al., The Journal of Infectious Disease 155: 488 - 494 (1987). Ähnliche Ergebnisse werden gefunden, wenn Komplementfixation, Bakterienagglu tination und Immunoblotting verwendet werden. Jones et al., General Clinical Pathology 37: 1002 - 1006 (1984) und Jones et al., J. of Med. Microbiology 22: 57 - 62 (1986). Mit Saure gewaschene Fraktionen zeigen sowohl bei der Komplementfixation als auch bei SDS-PAGE-Immunoblots ähnliche Ergebnisse. Wulffen et al., Journal of Clinical Microbiology 24: 716 - 720 (1986).
- Es existieren zahlreiche Berichte, die C. pylori-Antikörper in dem Serum von befallenen Menschen zeigen. All diese Studien beschäftigten sich mit der äußeren Oberfläche des Mikroorganismus. In diesen Testsystemen ist das Antigen entweder der gesamte Organismus oder Unterbereiche der Flaggellen und Außenmembran in dem Molekulargewichtsbereich von 100.000 Dalton oder weniger. Keine dieser Studien ist geeignet, um einen genauen Nachweis der Infektion zu erlauben. Es gibt eine merkliche Fehlklassifizierung, sowohl falsche Positive als auch falsche Negative, wie auch eine merkliche Kreuzreaktivität mit anderen Organismen, wie z.B. C. jejuni und C. coli. Somit besteht ein Bedarf für ein schnelles immunologisches Verfahren, um spezifisch den C. pylori-Antikörper nachzuweisen. Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen Bedarf. Die vorliegende Erfindung beschreibt einen neuen und genauen serologischen Test für die Diagnose einer C. pylori-Infektion. Früher veröffentlichte Ergebnisse verwendeten Bestandteile mit niedrigerem Molekularge wicht und wiesen merkliche Kreuzreaktivitätsniveaus mit anderen Bakterien auf. Kein anderer Test hat dieselbe Gesamtzuverlässigkeit (Empfindlichkeit plus Spezifität).
- Das Symptom Dyspepsie ist in der gesamten westlichen Welt mit großen Ausgaben für die medizinische Versorgung verbunden. Obwohl genaue Statistiken, was die Häufigkeit der Dyspepsie betrifft, schwierig zu erhalten sind, haben neuere Studien gezeigt, daß sie ein häufiges Problem ist. In England ist z.B. geschätzt worden, daß ungefähr 1 % der Patienten, welche von praktischen Ärzten betreut werden, jedes Jahr mit der hauptsächlichen Beschwerde Dyspepsie erscheinen. Die Kosten der Dyspepsie sind zahlreich und sie schließen ein: (i) jene für Arzneimittel, wie z.B. Antazida oder H&sub2;-Rezeptor-Antagonisten (der Umsatz von Cimetidin und Ranitidin betrug mehr als 2 Milliarden Dollar); (ii) Unkosten für diagnostische Auswertungen, wie z.B. obere Gastrointestinal-Reihenaufnahmen mit Barium oder fiberoptische Endoskopie und (iii) Kosten, welche mit dem Ausfall bei der Arbeit verbunden sind. Die Auswirkungen der Dyspepsie auf eine Verwendung von Arzneimitteln wurden untersucht, indem in Schweden Patienten ausgewertet wurden, bei denen eine klinische Diagnose auf Gastritis oder Dyspepsie ohne Geschwüre aufgestellt wurde. Tyllstrom et al., Scand. J. Gastroenterol. 1984, 19: 755-60.
- Tyllstrom fand heraus, daß eine Antazidum- oder H&sub2;-Rezeptorantagonisten-Therapie bei diesen Patienten häufig war. Tatsächlich wurde den meisten Patienten, welche einen Arzt aufsuchten, ein Rezept gegeben. Dieses Ergebnis ist ähnlich zu den Daten aus Britannien, wo 91 % solcher Patienten eine regelmäßige Verwendung von Antazida berichteten. Tyllstrom berechnete, daß 1 % der gesamten Bevölkerung von Schweden eine tägliche Dosis einnahm und daß die Dyspepsie ohne Geschwür eine primäre Indikation für die Verwendung von Cimetidin war, was 35 % der Rezepte ausmachte. Es wurde ebenfalls ein wachsender Trend bei dem Prozentsatz an Patienten festgestellt, die mit Cimetidin behandelt werden.
- Aufgrund des hohen Vorkommens und der Kosten von Magenproblemen und Geschwüren in der westlichen Gesellschaft ist die Fähigkeit, die Behandlung dieser Krankheiten zu erfassen und zu überwachen, in hohem Maße wünschenswert. Somit ist die vorliegende Erfindung in ihrer Fähigkeit wichtig, spezifisch C. pylori, welches mit diesen Krankheiten in Zusammenhang gebracht wird und dessen Verschwinden mit einer klinischen Verbesserung in Zusammenhang gebracht wird, nachzuweisen.
- Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Isolierung und Reinigung von Antigenen aus den zellassoziierten Proteinen von C. pylori mit hohem Molekulargewicht.
- Eine zusätzliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Erfassen einer C. pylori-Infektion in Menschen.
- Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist ein diagnostisches Kit.
- Somit werden beim Erfüllen der obigen Aufgaben gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung Antigene aus den zellassoziierten Proteinen mit hohem Molekulargewicht (HM-CAP) aus C. pylori zur Verfügung gestellt, wobei die Antigene in im wesentlichen gereinigter Form ein Molekulargewicht von ca. 300.000 bis 700.000 Dalton und einen pI bei der isoelektrischen Fokussierung von ca. 5,9 bis 6,3 aufweisen, und in phosphatgepufferter Salzlösung und Tris-Chloridpuffern löslich sind. In einer bevorzugten Ausführungsform zeigt das Antigen eine Urease-Aktivität.
- Eine andere Ausführungsform umfaßt einen serologischen Test für den Nachweis einer C. pylori-Infektion in Menschen, welcher ein Verbinden der Antigene, die aus HM-CAP isoliert wurden, mit einer Serumprobe umfaßt, die gemäß dem immunologischen Verfahren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus enzymgebundenem Immunsorptionstest, Radioimmuntest, komplementfixation, Latexagglutination und passivem Hämagglutinationstest, unter Verwendung von HM-CAP-beschichteten Erythrozyten, welche durch Glutaraldehyd oder Tanninsäure vorbehandelt (aktiviert) wurden, getestet werden soll.
- In einer Ausführungsform wird ein enzymgebundener Immunsorptionstest verwendet. Dieser Test umfaßt ein Immobilisieren des Antigens auf einem Festphasenträger, Zugeben einer Serumprobe zu dem Immobilisierten Antigen, Inkubieren der Serumprobe und des immobilisierten Antigens, um einen Antigen-Antikörper-Komplex zu bilden. Zugeben eines enzymkonjugierten anti-humanen IgG zu dem Antigen-Antikörper- Komplex und Inkubieren, um einen Komplex aus Antigen-Antikörper und enzymkonjugiertem anti-humanem IgG zu bilden. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das Enzym alkalische Phosphatase, Meerrettich-Peroxidase oder beta-Galaktosidase einschließen. Wenn alkalische Phosphatase verwendet wird, wird para-Nitrophenylphosphat (Enzymsubstrat) zu dem Komplex zugegeben. Dieses Substrat reagiert mit der alkalischen Phosphatase, was eine Farbe ergibt, die gemessen werden kann, um die Antikörpermenge zu bestimmen.
- Eine andere Ausführungsform umfaßt ein Kit, welches sich aus den Antigenen von zellassoziierten Proteinen mit hohem Molekulargewicht aus C. pylori, die auf einem Festphasenträger immobilisiert sind, zusammensetzt.
- Andere und weitere Aufgaben, Merkmale und Vorteile werden aus der folgenden Beschreibung der derzeit bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung deutlich werden, welche zum Zwecke der Offenbarung angegeben werden, wenn sie mit den begleitenden Zeichnungen in Verbindung gebracht wird.
- Die Erfindung wird leichter durch ein Lesen der folgenden Beschreibung und durch Bezug auf die begleitenden Zeichnungen, welche einen Teil davon bilden, verstanden werden, wo Beispiele von Ausführungsformen der Erfindung gezeigt werden und worin:
- Figur 1 ein typisches Elutionsprofil von rohen HM-CAP ist, welches auf eine Agarose A-5m-Säule aufgetragen wurde.
- Figur 2 ein typisches Elutionsprofil einer HM-CAP-Präparation von in Nährlösung ( - ) und auf Platte ( ) kultivierten Bakterien ist, welches den Bereich der Urease- Aktivität zeigt.
- Figur 3 vier verschiedene positive und negative Seren unter Verwendung eines ELISA-Tests mit Antigen von auf Platte kultivierten Bakterien vergleicht, um anti-C. pylori nachzuweisen.
- Figur 4 vier verschiedene positive und negative Seren unter Verwendung eines ELISA-Tests mit Antigen von in Nährlösung kultivierten Bakterien vergleicht, um C. pylori nachzuweisen.
- Die Zeichnungen sind nicht notwendigerweise maßstabsgetreu und gewisse Merkmale der Erfindung können im Maßstab übertrieben sein oder im Interesse von Klarheit und Prägnanz in schematischer Form gezeigt sein.
- Antigene aus den zellassoziierten Proteinen mit hohem Molekulargewicht (HM-CAP) von C. pylori liegen in im wesentlichen gereinigter Form vor, mit einem Molekulargewicht von ca. 300.000 bis 700.000 Dalton, einem pI bei der isoelektrischen Fokussierung von ca. 5,9 bis 6,3, und sind in häufig verwendeten gepufferten Lösungen, einschließlich PBS (phosphatgepufferter Salzlösung, welche ca. 0,05 M Phosphatpuffer, ca. 0,85 % NaCl bei ca. pH 7,2 einschließt) oder Tris-Chloridpuffer (ca. 0,05 M Tris, pH ca. 8,0) löslich. Die Proteinbestandteile sind durch Absorption bei 280 nm, Erniedrigungs-Proteintest (lowering Protein assay) und durch Färben von Gelen mit Coomasie-Blau nachweisbar. HM- CAP werden durch Behandlung von C. pylori-Zellen mit n- Octylglucosid (NOG) extrahiert (solubilisiert). NOG extrahiert Membran- und Oberflächenproteine, ohne die Zellen aufzubrechen. In der bevorzugten Ausführungsform zeigen diese Antigene eine Urease-Aktivität.
- Wenn C. pylori-Zellen geerntet und gewaschen werden, bleibt die Urease-Aktivität an die Bakterienzellen gebunden. Nach Beschallung und Zentrifugation befindet sich die Urease- Aktivität in dem Pellet, was einen weiteren Beweis liefert, daß das Protein mit Urease-Aktivität mit der äußeren Oberfläche der Membran assoziiert ist. Der Ausdruck Proteine, welche mit der äußeren Oberfläche der Membran assoziiert sind" bezieht sich auf Proteine, welche entweder in der Membran sind oder auf der Oberfläche der Membran sind. Weiterhin setzt ein Zerreißen der Zelloberfläche ohne ein Aufbrechen der Zelle Urease-Aktivität in die Überstandsfraktion frei.
- Die Antigene können durch eine Vielzahl von Verfahren hergestellt werden. Bei der bevorzugten Ausführungsform wird C. pylori zuerst auf Blutagarplatten kultiviert. Die Blutagarplatten werden mit ca. 7 % frischem (nicht mehr als acht Tage altem) Pferdeblut und einer DIFCO Hirn-Herz-Fusionsbasis hergestellt. Nach Inkubieren der Kulturen für ca. 48 Stunden bei ca. 37ºC in ca. 12 % CO&sub2; und ca. 100%ig feuchter Atmosphäre, werden die C. pylori von den Platten geerntet. Die geernteten Bakterien werden mit PBS gewaschen und ca. 12 Minuten lang bei ca. 8.000 UpM zentrifugiert. Dieses wird wenigstens zweimal wiederholt.
- In einer anderen Ausführungsform werden die C. pylori in einem Nährlösungsmedium kultiviert, welches aus DIFCO Hirn- Herz-Infusionsnährlösung, die ca. 10 % Pferdeserum, ca. 0,03 % gereinigtes Kaninchen-Hämoglobin und ca. 0,15 % DIFCO-Hefeextrakt enthält, zusammengesetzt ist. Für Nährlösungskulturen wird das Inokulum von einer Blutagarplatte (wie oben beschrieben) hergestellt. Die Inkubationsbedingungen sind dieselben wie für Blutagar-Plattenkulturen. Bakterien aus der Nährlösung werden durch Zentrifugation bei ca. 8.000 UpM für ca. 12 Minuten geerntet und dann wird dem Waschverfahren gefolgt, wie es für auf Platten kultivierte Bakterien beschrieben ist.
- Als nächstes werden die gewaschenen C. pylori-Zellen, ob aus Nährlösung oder von Agarplatten, extrahiert, indem die gewaschenen Bakterien in ca. 1%iger Lösung von n-Octylglucosid in PBS, ca. pH 7,2, unter Verwendung von ca. 2,5 ml pro 1,0 ml an gepackten Zellen resuspendiert werden. Nach Extraktion für 20 Minuten bei Raumtemperatur wird die Extraktionslösung 15 Minuten lang bei ca. 15.000 UpM zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und 18 bis 24 Stunden lang gegen 1.600 Volumen (ca. 4 Liter) gegen PBS oder einen PBS mit halber Konzentration, d.h. 1:1 Wasser/PBS, welcher 0,024 % Natriumazid als ein Konservierungsmittel enthält, dialysiert. Das Dialysat wird ca. 15 Minuten lang bei ca. 18.000 UpM zentrifugiert. Das Pelletmaterial wird verworfen und der Überstand wird aufbewahrt. Der Überstand enthält die rohen (HM-CAP). Die rohe HM-CAP-Präparation wird auf eine Agarose A-5m-Säule aufgebracht und mit ca. 0,05 M Tris-Cl-Puffer bei einem ungefähren pH von 8,0, welcher ca. 0,025 % Natriumazid enthält, eluiert. Die Säule ist ungefähr eine 1,6 auf 100 Zentimeter-Säule. Ungefähr 2,5 Milliliter-Fraktionen von der Säule werden gesammelt und überwacht. Die optische Dichte dieser Fraktionen wird bei 280 nm bestimmt und die Urease-Aktivität wird durch einen Test mit Harnstoff als Substrat bestimmt. Die Fraktionen (ca. 6 bis 8), welche eine maximale Urease-Aktivität enthalten, werden gepoolt. Diese Fraktionen, welche gepoolt werden, repräsentieren den Molekulargewichtsbereich von ca. 300.000 bis 700.000 Dalton. Die HM-CAP-Präparation enthält an diesem Punkt wenigstens zwei separate Proteine.
- Figur 1 zeigt die Ergebnisse, die erhalten wurden, wenn 2,5 ml der rohen HM-CAP-Präparation durch eine Agarose A-5m- Säule geleitet werden. Der Peak aus bei 280 nm absorbierendem Material bei den Fraktionen 47 - 49 fällt mit dem Peak der Urease-Aktivität zusammen und wird dicht gefolgt von einem anderen Peak aus bei 280 nm absorbierendem Material mit einem niedrigeren Molekulargewicht bei den Fraktionen 51 - 52. Diese zwei Peaks weisen eine beträchtliche Überlappung auf und die teilweise gereinigten HM-CAP, Fraktionen 47 - 49, enthalten wenigstens zwei oder möglicherweise mehr molekulare Spezies. Weitere Trennungen können durchgeführt werden, um diese einzelnen Proteine zu trennen.
- Das Molekulargewicht (MW) wurde bestimmt, indem Proteine mit bekannten Molekulargewichten durch dieselbe Agarose A- 5m-Säule eluiert wurden und ihre Elutionspositionen festgestellt wurden, z.B. Thyroglobulin (MW 669.000) bei Fraktion 46; Apoferritin (MW 443.000) bei Fraktion 51; Hefe-Alkoholdehydrogenase (MW 150.000) bei Fraktion 55; und Rinderserumalbumin (MW 66.000) bei Fraktion 62. Aus diesen Proteinstandards kann berechnet werden, daß teilweise gereinigte HM-CAP molekulare Spezies in dem Molekulargewichtsbereich von 300.000 (Fraktion 53) bis 700.000 (Fraktion 46) enthalten.
- Die antigene Aktivität der einzelnen Proteinfraktionen ist in den Figuren 2 - 4 gezeigt. HM-CAP-Fraktionen wurden auf der Grundlage von Urease-Aktivität ausgewählt und gepoolt und als Antigen in einem ELISA-Test verwendet. Diese Antigene waren extrem wirksam beim Nachweisen der Gegenwart oder Abwesenheit von Serum-anti-C. pylori-IgG-Antikörper. Die Gegenwart oder Abwesenheit des Organismus hing mit der Gegenwart oder Abwesenheit des Antigens zusammen. Diese Korrelation wurde durch Nachweisen des C. pylori-Organismus mit anderen weniger bequemen aber anerkannten Verfahren bestätigt. Zwei Chargen von C. pvlori wurden kultiviert, eine unter Verwendung des Platten-Verfahrens und eine unter Verwendung des Nährlösungs-Verfahrens, um zu bestimmen (1) wieviel von dieser Spezifität auf andere Antigene als Urease zurückgeführt werden konnte und (2) ob das Kultivierungsverfahren der Bakterien (Platte gegenüber flüssigem Mediuin, oder Nährlösung) bei der Antigenproduktion irgendeinen Einfluß auf die Spezifität des ELISAS hatte. Rohe CM- CAP wurden aus beiden Bakterienchargen hergestellt und einzeln durch dieselbe Agarose A-5m-Säule geleitet. Die Elutionsdiagramme sind in Figur 2 gezeigt.
- In beiden Fällen wurden zwei oder mehr Säulenfraktionen zusammen gepoolt, um die acht verschiedenen Pools, die in Figur 2 bezeichnet sind, zu schaffen. Proteinbestimmungen wurden mit jedem Pool durchgeführt, so daß Mikrotiterplatten mit einer äquivalenten Menge an Protein (100 Mikroliter Antigen bei 0,007 mg Protein pro ml) aus jedem Pool beschichtet werden konnten. Die Proteinbestimmung kann in der folgenden Tabelle gesehen werden. Protein in Agarosefraktionspools vor Verdünnung Pool-Nummer gepoolte Fraktionen mg/ml Protein Nährlösung Platte
- Pool 2 entspricht der HM-CAP Antigen-Präparation, welche in dem standardisierten Test verwendet wird. Vier ELISA-positive und vier ELISA-negative Serumproben wurden zufällig ausgewählt und verwendet, um die ELISA-Tests durchzuführen. Die Ergebnisse sind in den Figuren 3 und 4 gezeigt.
- Eine Untersuchung der Figuren 3 und 4 zeigt, daß die Pools 1 - 4, welche die Agarosefraktionen 53 - 60 darstellen, verglichen mit den Pools 5 - 8, die größte Differenzierung zwischen ELISA-positiven und ELISA-negativen Seren liefern. Die Pools 5 - 8 zeigen als Testantigene eine gewisse Selektivität und lassen somit vermuten, daß es nicht nötig ist, HM-CAP weiter zu reinigen, um einen C. pylori-spezifischen ELISA-Test zu haben.
- Diese Ergebnisse zeigen, daß die Selektion der Urease-positiven Säulenfraktionen für eine Verwendung als HM-CAP-Antigene in dem C. pylori-spezifischen ELISA-Test eine angemessene Empfindlichkeit und Selektivität zur Verfügung stellt. Daher ist eine weitere Trennung in spezifische Bestandteile nicht notwendig. Zusätzlich sind auf Platte kultivierte und in Nährlösung kultivierte Bakterien in gleichem Maße als die Quelle von HM-CAP für ELISA-Antigene nützlich. Die größere Ausbeute an Urease-Protein in der in Nährlösung kultivierten Charge von HM-CAP (siehe Figur 2) beruht höchstwahrscheinlich auf der Tatsache, daß die Pools 5 - 8 des in Nährlösung kultivierten Antigens aufgrund einer weniger effizienten Trennung der zwei Hauptpeaks besser abschnitten als die Pools 5 - 8 des auf Platte kultivierten Antigens.
- Somit zeigen die Figuren 3 & 4, daß die Mischung von wenigstens zwei Proteinen genauso wirksam beim Nachweisen von C. pylori-Antikörpern im Serum ist, wie jedes Protein allein. Obwohl diese Daten zeigen, daß der Bestandteil mit höherem Molekulargewicht, welcher mit der Urease-Aktivität zusammenfällt, ein besseres Antigen ist als das Antigen mit niedrigerem Molekulargewicht, legen sie ebenfalls nahe, daß die Mischung beim Bestimmen einer C. pylori-Infektion genauso gut, wenn nicht besser ist. Obwohl die Proteine weiter zu einzelnen Bestandteilen gereinigt werden können, ist somit ein Beenden der Reinigung vor der Trennung der Mischung ausreichend.
- Eine Vielzahl von Verfahren kann verwendet werden, um C. pylori-Antikörper in dem Serum nachzuweisen. Ein Fachmann wird leicht erkennen, daß Festphasen-Enzymimmunoassays (ELISA), Radioimmunassays (RIA), Komplementfixation, Latexkügelchen-Agglutination, Immunoblotassays und passive Immunagglutination alle verwendet werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform schließt der serologische Test das ELISA-Verfahren ein. Dieser Test schließt ein Immobilisieren des HM-CAP-Antigens auf einem Festphasenträger ein. Nachdem das Antigen immobilisiert wurde, wird eine zu testende Serumprobe mit dem immobilisierten Antigen vereinigt und diese werden ca. 90 Minuten lang bei Raumtemperatur und unter feuchten Bedingungen inkubiert. Während der Inkubation bildet sich ein Antigen-Antikörper-Komplex. Nachdem der Antigen-Antikörper-Komplex gebildet ist, wird mit alkalischer Phosphatase konjugierter anti-humaner IgG zu dem Antigen-Antikörper-Komplex auf dem Festphasenträger zugegeben und für ungefähr 90 Minuten bei Raumtemperatur unter feuchten Bedingungen inkubiert, um einen Komplex aus Antigen-Antikörper und mit alkalischer Phosphatase konjugiertem anti-humanem IgG zu bilden. Eine Vielzahl von Substraten kann verwendet werden, um die Menge der Bindung zu bestimmen, welche stattgefunden hat. In einer bevorzug ten Ausführungsform wird para-Nitrophenylphosphat zu diesem Komplex zugegeben und das resultierenden gelbe Produkt wird gemessen, um die Menge des gebildeten Antigen-Antikörper- Komplexes und somit die Menge an Antikörper, welche in dem Serum vorhanden ist, zu bestimmen. Die oben erwähnten Testverfahren können ebenfalls verwendet werden, um die Behandlung einer C. pylori-Infektion zu überwachen, indem fortlaufende Serumproben aus den behandelten Subjekten entnommen werden und die Verfahren mit der genannten Probe durchgeführt werden.
- Vertiefungen von Mikrotiterplatten werden mit 100 Mikrolitern HM-CAP-Antigen, welches mit PBS auf ungefähr 0,007 Milligramm pro Milliliter Protein verdünnt ist, beschichtet. In einer Ausführungsform wird eine Standardplatte mit 96 Vertiefungen verwendet. Nach ca. 18 bis 24 Stunden bei 37ºC in einer feuchten Kammer haftet das Antigen auf der Plastikoberfläche, indem es eine nicht-spezifische permanente Bindung ausbildet. Die überschüssigen Protein-Bindungsstellen auf dem Plastik werden blockiert, indem ca. 1 % BSA (Rinderserumalbumin) in PBS ca. 30 Minuten lang bei ungefähr 37ºC in einer feuchten Kammer inkubiert wird. Das überschüssige BSA wird entfernt, indem dreimal mit PBST (PBS, welcher ca. 0,02 % Tween-20 enthält) gewaschen wird. Als nächstes werden pro Vertiefung ca. 100 Mikroliter an Serum in Verdünnungen von entweder 1:50 oder 1:100 in PBS zugegeben. Nach Inkubation bei Raumtemperatur für ca. 90 Minuten in einer feuchten Kammer werden die überschüssigen Antikörper durch dreimaliges Waschen mit PBST entfernt. Pro Vertiefung werden ca. 100 Mikroliter einer Kalibrierungsverdünnung aus Konjugat anti-humane IgG-Antikörper aus Ziege, die mit dem Enzym alkalische Phosphatase konjugiert sind) zugegeben, und die Mischung wird ca. 90 Minuten lang bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer inkubiert. Nach Entfernen des überschüssigen Konjugates, d.h. nicht umgesetztem Konjugat, durch dreimaliges Waschen mit PBST, werden pro Vertiefung ca. 100 Mikroliter eines Substrates für alkalische Phosphatase, z.B. para-Nitrophenylphosphat, zugegeben. Nach weiterer Inkubation für ca. 60 Minuten in einer feuchten Kammer wird das gelb gefärbte Enzymprodukt gemessen. Jede Mikrotiterplatte schließt eine Anzahl von Kontrollen ein, z.B. bekanntes ELISA-positives Serum, bekanntes ELISA-negatives Serum und einen Reaktionsblindwert. Ein Wert der optischen Dichte von ca. 0,200 oder höher ist ein positives Ergebnis. Die folgenden Ergebnisse wurden beobachtet: DIAGNOSE EINER C. PYLORI-INFEKTION HM-CAP-Elisa
- Eine C. pylori-Infektion wurde durch histologische Untersuchung und Kultivierung von Biopsiematerial oder durch den ¹³C-Harnstoff-Atmungstest entweder als positiv oder als negativ diagnostiziert.
- Der HM-CAP-ELISA-Test erfaßte 113 der 116 Proben von Individuen mit einer C. pylori-Infektion. Dieses entspricht einer Spezifität von 97,4 %. Die Empfindlichkeit des Tests wird bestimmt, indem die negativen HM-CAP-ELISA-Ergebnisse betrachtet werden. Die Ergebnisse zeigen, daß 90 von 93 C. pylori-negativen Individuen erfaßt wurden. Dieses entspricht einer Empfindlichkeit von 96,8 %. Die Gesamtzuverlässigkeit des Tests entspricht 97,1 % (203 von 209 Proben wurden genau vorhergesagt). Diese Daten zeigen deutlich, daß es unter Verwendung des ELISA-Tests wenige, wenn überhaupt irgendwelche, Fehlklassifizierungen gibt.
- Ein Kit wird hergestellt, indem das HM-CAP-Antigen auf einem Festphasenträger inkubiert wird. Der Festphasenträger kann irgendein geladenes Membran- oder Plastikmaterial sein. Der Festphasenträger-Antigen-Komplex kann dann einzeln oder in mehreren Kombinationen abgepackt werden. Das Kit kann ebenfalls Kontrollen für falsche Positive und falsche Negative und Reagenzien umfassen. Das Kit kann verwendet werden, um 1 Probe oder mehrere Proben zu erfassen.
- Antikörper gegen C. pylori können in Serumproben mit HM-CAP-beschichteten Latexkugelpartikeln gemessen werden. Zusätzlich kann die Gegenwart von Antigenen gemessen werden, indem die Latexpartikel mit monospezifischem Antikörper (anti-HM-CAP) beschichtet werden. Partikel aus Polyvinyl- oder Toluol-Latex mit ca. 0,77 Mikrometern im Durchmesser oder Polystyrol-Latexpartikel (Kügelchen), welche ca. 0,81 bis 1,77 Mikrometer messen, können mit HM-CAP beschichtet werden. Ungefähr 2,0 ml der Latexpartikel werden in ungefähr 20 ml destilliertem Wasser suspendiert, gemischt und durch ein Whatman Nr. 40-Filterpapier filtriert. Nach Einstellen des Filtrates auf eine optische Dichte von ca. 2,0 bei einer Wellenlänge von 640 Tun in phosphatgepufferter Salzlösung, pH ca. 7,2, oder einem gleichwertigen Puffer, werden ca. 0,1 ml der Latexsuspension mit ca. 5,0 ml PBS verdünnt. Ungefähr 0,5 ml einer 0,5%igen Antigenlösung werden zu der verdünnten Latexsuspension zugegeben. Diese Mischung wird dann 30 Minuten lang bei ca. 37ºC inkubiert. Die Latexpartikel werden dann zweimal, jedes Mal mit zehn Volumen PBS, gewaschen. Die endgültige Suspension wird auf eine optische Dichte von 0,3 eingestellt, indem 0,1 M Glycinpuffer verwendet wird, welcher 0,1 % Rinderserumalbumin enthält. In dem Test werden gleiche Volumen von beschichteten Latexpartikeln und Serumverdünnungen in 0,1 M Glycinpuffer gemischt. Kontrollröhrchen erhalten Salzlösung anstelle von Serum. Die Röhrchen werden 2 Stunden lang bei 50ºC inkubiert, 3 Minuten lang bei 15.000 x g zentrifugiert und leicht geklopft. Der Klumpungsgrad wird festgestellt. Das Klumpen beruht auf der Aggregation (Agglutination) der Kügelchen über die Antigen-Antikörper-Komplexbildung.
- Eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen wird mit ca. 100 Mikrolitern einer optimalen Antigenkonzentration beschichtet. Nach Inkubation für ca. 18 - 24 Stunden bei ca. 37ºC werden die überschüssigen Bindungsstellen in den Vertiefungen mit 1 % BSA in PBS oder etwas Gleichwertigem blockiert. Ungefähr 100 Mikroliter pro Vertiefung einer geeigneten Verdünnung(en) von zu testendem Serum werden zu zweifachen Vertiefungen zugegeben und bei Raumtemperatur ca. 2 Stunden lang inkubiert. Nach Waschen der Platten zahlreiche Male mit PBST werden pro Vertiefung 100 Mikroliter einer optimalen Verdünnung von anti-humanem IgG aus Ziege oder Kaninchen, welches mit Iod-125 markiert war, zugegeben. Die Mikrotiterplatten werden ca. 4 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert, zahlreiche Male mit PBST gewaschen und luftgetrocknet. Die Vertiefungen werden in einem gamma-Zähler gezählt, um die Menge an Radioaktivität zu bestimmen, welche am Ende des Tests in jeder Vertiefung zurückbleibt. Positive und negative Seren sind auf jeder Platte als Kontrollen eingeschlossen. Das Verfahren wird standardisiert, um zu bestimmen, welche Werte zwischen einem positiven und einem negativen Serum unterscheiden.
- Ein Fachmann wird wirklich würdigen, daß die vorliegende Erfindung gut geeignet ist, um die Aufgaben zu erfüllen und die erwähnten Endziele und Vorteile zu erhalten, wie auch jene, die darin inhärent sind. Die Verfahren, Prozeduren und Techniken, welche hierin beschrieben sind, sind derzeit repräsentativ für die bevorzugten Ausführungsformen, es ist beabsichtigt, daß sie beispielhaft sind, und es ist nicht beabsichtigt, daß sie Beschränkungen des Umfangs darstellen. Änderungen darin und andere Verwendungen, welche durch den Umfang der angefügten Ansprüche definiert sind, werden den Fachleuten einfallen.
Claims (10)
1. Im wesentlichen gereinigte Antigene aus Campylobacter
pylori mit hohem Molekulargewicht, wobei die Antigene:
Ein Molekulargewicht von ungefähr 300.000 bis 700.000
dalton, wie durch Agarose A-5m-Säule bestimmt,
aufweisen;
einen PI bei der isoelektrischen Fokussierung von 5,9
bis 6,3 aufweisen;
Ureaseaktivität aufweisen;
in PBS- und Tris-Chlorid-Puffern löslich sind;
abgeleitet sind von der äußeren Membranoberfläche von
Campylobacter pylori; und
sie mit n-Octylglucosid von der äußeren
Membranoberfläche abgelöst werden können.
2. Ein serologischer Test zur Erfassung einer Infektion
mit Campylobacter pylori, welcher umfaßt:
Vereinigen der Antigene gemäß Anspruch 1 mit einer
Serumprobe, welche getestet werden soll nach einem
Verfahren, welches ausgewählt wird aus: Enzymgebundenem
Immunsorptionstest, Radioimmuntest, Komplementfixation,
indirekter Hämagglutination oder Latexagglutination.
3. Der serologische Test nach Anspruch 2, worin das
Verfahren der enzymgebundene Immunsorptionstest ist,
welches die Schritte einschließt:
Zugeben einer Serumprobe zu einem Antigen,
immobilisiert auf einem Festphasenträger;
Inkubieren der Mischung aus Serumprobe und
immobilisiertem Träger, um einen Antigen-Antikörper-Komplex zu
bilden;
Zugeben von enzymkonjugiertem anti-Human IgG zu dem
Antigen-Antikörper-Komplex;
Inkubieren des Antigen-Antikörper-Komplexes und der
enzymkonjugierten anti-Human IgG-Mischung, um einen
Antigen-Antikörper-enzymkonjugiertes-anti-Human-IgG-Komplex
zu bilden;
Zugeben von Substrat zu dem
Antigen-Antikörper-enzymkonjugiertes-anti-Human-IgG-Komplex; und
Messen des Produktes oder der Änderung in dem Substrat,
um die Menge des Antikörpers zu bestimmen.
4. Der serologische Test nach Anspruch 3, worin das Enzym
ausgewählt wird aus: Alkalischer Phosphatase,
Meerrettichperoxidase oder Betagalaktosidase.
5. Ein Verfahren zum Überwachen der Behandlung einer
Campylobacter pylori-Infektion, welches umfaßt:
Sammeln einer Reihe von Proben aus dem behandelten
Patienten und wiederholen der Schritte gemäß Anspruch 3
an jeder Probe.
6. Der serologische Test nach Anspruch 2, worin das
Verfahren der Radioimmuntest ist, welches die Schritte
einschließt:
Zugeben einer Serumprobe zu einer Vertiefung, die mit
Antigen beschichtet ist;
Inkubieren der Serumprobe in der beschichteten
Vertiefung, um einen Antigen-Antikörper-Komplex zu bilden;
Zugeben von radioaktiv markiertem anti-Human IgG;
Inkubieren der Mischung aus dem
Antigen-Antikörper-Komplex und anti-Human IgG, um einen
Antigen-Antikörperanti-Human-IgG-Komplex zu bilden; und
Messen der Radioaktivitätsmenge, welche in dem Antigen-
Antikörper-anti-Human-IgG-Komplex gebunden ist.
7. Der serologische Test nach Anspruch 2, worin das
Verfahren eine Latexagglutination ist, welches die
Schritte einschließt:
Zugeben einer Serumprobe zu Latexkügelchen, die mit
antigen beschichtet sind;
Inkubieren von Serumprobe und beschichteten
Latexkügelchen; und
Messen des Verklumpungsgrades.
8. Ein Kit zum Bestimmen des Vorliegens von Campylobacter
pylori-Antikörpern mit einem Behälter, der die Antigene
gemäß Anspruch 1, immobilisiert auf einem
Festphasenträger, aufweist.
9. Der Kit nach Anspruch 8, welcher ferner falschnegative
und falschpositive Kontrollen umfaßt.
10. Ein Verfahren zum Herstellen eines Antigens gemäß
Anspruch 1, welches die Schritte umfaßt:
Extrahieren von Proteinen mit hohem Molekulargewicht
aus Campylobacter pylori mit einer Lösung von ungefähr
1% n-Octylglucosid in PBS bei ungefähr pH 7,2.;
Zentrifugieren der Extraktionssuspension und Entfernen
des Überstandes, um einen Extrakt zur Verfügung zu
stellen;
Dialysieren des Extraktes gegen PBS oder eine 1:1
Wasser/PBS-Lösung, welche ungefähr 0,024% Natriumazid
enthält;
Zentrifugieren des Dialysates, worin der sich ergebende
Überstand die Antigene enthält;
Chromatographieren des Überstandes auf Agarose A-5m mit
ungefähr 0,05m Tris-Cl-Puffer und ungefähr pH 8,0,
ungefähr 0,025% Natriumazid enthaltend; und
Sammeln der Fraktion, die in dem
Molekulargewichtsbereich von 300.000 bis 700.000 eluiert.
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