DE69120192T2

DE69120192T2 - Verfahren zur Herstellung von sekretorischen Immunoglobulin-A-Präparaten

Info

Publication number: DE69120192T2
Application number: DE69120192T
Authority: DE
Inventors: Motoko Nishi-Ku Kobe Hyogo 673 Baba; Hajime Sennan-Gun Osaka 599-02 Hiratani; Kazuo Tarumi-Ku Kobe Hyogo 665 Kato; Mitsuo Nishi-Ku Kobe Hyogo 673 Shimizu; Yoshikazu Kobe Hyogo 673-02 Yuki
Original assignee: NIHON CHEMICAL RESEARCH K K JA
Current assignee: NIHON CHEMICAL RESEARCH K K JA
Priority date: 1990-10-05
Filing date: 1991-10-03
Publication date: 1996-10-10
Anticipated expiration: 2011-10-04
Also published as: JP3145696B2; JPH04145031A; EP0479597A3; EP0479597A2; CA2052809A1; EP0479597B1; DE69120192D1; US5371196A; ES2090255T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines sekretorischen Immunglobulin A (nachfolgend abgekürzt mit sIgA)-Präparats, welches im wesentlichen kein denaturiertes sIgA enthält.
Das sekretorische Immunglobulin A ist ein Immunglobulin, welches in Sekreten einer exokrinen Drüse enthalten ist, insbesondere in großer Menge im Kolostrum, und es weist auf Oberflächen von Schleimhäuten eine schützende Funktion gegenüber Bakterien und Viren auf.
Es ist bekannt, daß sIgA in den Fällen, bei denen eine zusätzliche lokale Immuntherapie der Schleimhaut angewendet werden kann, wie nachfolgend erwähnt wird, sowie bei einem primären Immundeffektsyndrom und bei schwer zu behandelnder Diarrhoe und aftöser Stomatitis, einhergehend mit sekundärer Immundefizienz (Immundefizienz durch Infektion, Ernährungsstörungen, Arzneimittel, etc.), wirksam ist (S. Matsumoto et al., Birth Defect 18, 229, 1983; Okino et al., Nihon Shonigakkai Shi, 84, 158, 1990).
Darüber hinaus kann es im hohen Maße wirksam sein bei der Behandlung einer wiederkehrenden Entzündung des oberen Respirationstrakts oder einer Mittelohrentzündung und bei der Behandlung nach einer Operation eines Gallengangverschlusses (Kurono et al., Therapeutic Research 10, 4433, 1989).
Es kann nicht bestritten werden, daß die Gefahr besteht, Viren wie das Hepatitisvirus, das AIDS-Virus, das Zytomegalievirus, etc., in aus dem Kolostrum gereinigtes sIgA einzumischen. Demgemäß ist die Inaktivierung dieser Viren bei der Verarbeitung des sIgAs zu Präparaten unabdingbar. Es gibt jedoch kein bekanntes Verfahren, bei dem die Inaktivierung der Viren mit den Vorgehensweisen zur Reinigung von sIgA aus dem Kolostrum kombiniert wird.
Zur Inaktivierung von Viren ist auf Serumproteine wie Albumin etc. in Form einer Flüssigkeit als höchstverläßliches Verfahren zur Inaktivierung von Viren, die damit vermischt sein könnten, nach einem Bericht eine Hitzebehandlung angewendet worden (nachfolgend abgekürzt mit "Erhitzen einer verflüssigten Form") von Murray (The New York Academy of Medicine, 31, 341, 1955)). Dieses Verfahren ist über einen langen Zeitraum in großem Umfang angewendet worden.
Dieses Verfahren kann jedoch lediglich auf hitzeresistentes Material wie Albumin angewendet werden, da die meisten Proteine durch Hitze leicht denaturiert werden, wodurch ein Absinken oder ein Verschwinden der Aktivität verursacht werden kann. Darüber hinaus ist dies kein Verfahren, welches ein Virus vollständig inaktivieren kann, sofern man das Hepatitis-B-Virus betrachtet.
Andererseits beschrieben Horowitz et al. (Lancet Vol 29, 1986, S. 706-710), daß Viren mit einer Hülle wie das Hepatitis- B-Virus, das AIDS-Virus, das Non-A-Non-B-Hepatitisvirus etc. durch Behandlung bei 24 ºC bis 30 ºC für eine Zeitdauer von 6 Stunden in Gegenwart von Tri-n-butylphosphat und einem Tensid vollständig inaktiviert werden können, und dieses Verfahren kann auf viele Arzneimittel angewendet werden, die von Serumprotein abstammen. Dieses Verfahren scheint jedoch bei einer Gruppe von Viren unwirksam zu sein, die keine Hüllen aufweisen, wie das Hepatitis-A-Virus, etc. Die JP-A-51-118 825 beschreibt die virale Inaktivierung von Immunglobulin A-Lösungen durch Hitzebehandlung in Gegenwart von Stabilisierungsmitteln.
Die vorliegende Erfindung beabsichtigt die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von sIgA-Präparaten, die im wesentlichen keine infektiösen Viren enthalten, im wesentlichen kein denaturiertes sIgA enthalten, und ein hohes Maß an Sicherheit aufweisen.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung führten darauf hin Forschungen durch und fanden als Ergebnis heraus, daß sIgA-Präparate mit einem hohen Maß an Sicherheit und Wirksamkeit erhalten werden, indem "Erhitzen einer verflüssigten Form" und Fraktionierung mit Polyethylenglykol (nachfolgend abgekürzt mit PEG) kombiniert werden, und sie fanden ferner heraus, daß sIgA-Präparate mit einer höheren Sicherheit erhalten werden, wenn die Behandlung mit Tri-n-butylphosphat und einem Tensid mit dem "Erhitzen einer verflüssigten Form" und der PEG-Fraktionierung kombiniert werden.
Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur Herstellung eines Virus-inaktivierten, sekretorischen Immunglobulin-A-Präparats, dadurch gekennzeichnet, daß sekretorisches Immunglobulin A, welches mit Viren kontaminiert sein könnte, zur Inaktivierung von Viren in einem wäßrigen Medium bei einer geeigneten Temperatur und für eine geeignete Zeitdauer in Gegenwart von mindestens einem Stabilisierungsmittel erhitzt wird, welches 1 bis 3 molar an Aminosäure ist und/oder 20 bis 60 Gew./Vol.% Zuckeralkohol oder Disaccharid aufweist, und anschließende polymerisierte Stoffe aus der resultierenden Lösung bei einem pH-Wert von 6 bis 8 durch Zugabe von Polyethylenglykol entfernt werden.
Vorzugsweise wird eine derartige Hitzebehandlung etwa 10 Stunden lang bei etwa 60 ºC durchgeführt.
Bei der vorliegenden Erfindung ist das Ausgangsmaterial sIgA, welches mit Viren kontaminiert sein könnte, nicht in besonderer Weise beschränkt. Es kann sich um eine aus der Milch von Menschen oder Rindern erhaltene sIgA-Fraktion oder um eine Fraktion eines von Mensch oder Rind erhaltenen monoklonalen Antikörpers des sIgA-Typs handeln, und es kann eine Fraktion sein, die aus dem Kolostrum von Mensch oder Rind erhaltenes sIgA enthält, z.B. eine Fraktion, die sIgA enthält und nach den einzelnen Schritten des folgenden Verfahrens erhalten wurde.

(1) Zentrifugationsverfahren:

Das Kolostrum von Mensch oder Rind wird zentrifugiert (z.B. 3500 bis 8000 UpM für eine Zeitdauer von 30 bis 60 Minuten), und nachfolgend wird das als obere Schicht oder in Form von Präzipitaten abgelagerte Fett entfernt. Nach der Filtration wird das Filtrat auf einen pH-Wert von 4,2 bis 4,6 eingestellt und 30 bis 60 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt, bevor präzipitiertes Casein mittels Zentrifugation entfernt wird.

(II) Verfahren des Aussalzens und Dialysierens:

Die auf diese Weise erhaltene Lösung wird neutralisiert und einer Aussalzung mit Ammoniumsulfat (gesättigt bis 50 %) unterworfen. Die präzipitierte sIgA-Fraktion wird durch Zentrifugieren rückgewonnen und in 0,01 M Phosphatpuffer-Lösung (pH-Wert 6,5 bis 7,5) gelöst, gefolgt durch Dialyse unter Verwendung derselben Pufferlösung.

(III) Verfahren der Behandlung mit Anionenaustauscher:

Die durch Aussalzen gefällte sIgA-Fraktion wird ausreichend dialysiert und anschließend auf eine Anionenaustauschersäule geladen, vorzugsweise DEAE-Toyopearl 650C oder DEAE-Sephacel , zuvor gepuffert mit 0,01 M Phosphatpuffer-Lösung (ph-Wert 6,5 bis 7,5). Die auf die Säule geladene Menge der durch Aussalzen gefällten sIgA-Fraktion beträgt vorzugsweise 1 bis 5 g sIgA/1 l Gel (Füllung), und die Konzentration des Proteins liegt vorzugsweise zwischen 3 und 10 mg/ml. Nach dem Waschen der Säule mit dem 5fachen Säulenvolumen der obigen Pufferlösung wird das sIgA aus der Säule mit einer 0,1 M Phosphatpuffer-Lösung (pH-Wert 8,5 bis 7,5) oder einer Pufferlösung eluiert, die durch Zugabe von 0,10 bis 0,15 M Natriumchlorid zu einer 0,01 M Phosphatpuffer- Lösung (pH-Wert 6,5 bis 7,5) zubereitet wurde.

(IV) Verfahren der Behandlung mit Heparinoid-immobilisierender Säule:

Eine Heparinoid immobilisierende Säule wie Heparin-Sepharose , Heparin-Toyopearl oder Heparin-Sulfate Cellulofine wird zuvor mit einer 0,1 M Phosphatpuffer-Lösung (pH-Wert 6,5 bis 7,5) oder einer Pufferlösung gepuffert, die durch Zugabe von 0,1 bis 0,15 M Natriumchlorid zu einer 0,01 M Phosphatpuffer-Lösung (pH-Wert 6,5 bis 7,5) hergestellt wurde, und die obige aus dem Anionenaustauscher eluierte sIgA-Fraktion wird auf die gepufferte Säule geladen. Die Beladungsmenge der sIgA-Fraktion liegt vorzugsweise bei 10 bis 50 g sIgA/1 l Gel (Füllung), und die Konzentration des Proteins beträgt vorzugsweise 3 bis 10 mg/ml.
Durch Sammlung von Fraktionen, die die Säule passiert haben, ohne adsorbiert zu werden, kann eine sIgA-Fraktion erhalten werden, die frei von Lactoferrin ist. Als in diesem Verfahren eingesetztes Harz wird in der Industrie vorzugsweise Sulfate Cellulofine verwendet, von dem hochmolekulare Substanzen nicht immobilisiert werden. Dieses Harz kann mit 0,6 bis 1,0 M Natriumchlorid regeneriert werden.

(V) Verfahren der Präzipitation mit Polyethylenglykol:

Durch Zugabe von PEG #4000 in einer Endkonzentration von 20 Gew./Vol.% zu der der Behandlung mit der Heparin-immobilisierenden Säule unterworfenen sIgA-Fraktion wird die sIgA-Fraktion gefällt. Die Präzipitate werden durch Zentrifugieren gesammelt und in physiologischer Saline gelöst, um etwa 20 mg/ml einer sIgA-Lösung zu erhalten.
Als Ausgangsmaterial für die vorliegenden Präparationen kann jedwede sIgA-Fraktion verwendet werden, die nach dem obigen "(II) Verfahren des Aussalzens und Dialysierens" und den nachfolgenden Verfahren erhalten wird. Bei der Verwendung der durch das "(II) Verfahren des Aussalzens" oder das "(III) Verfahren der Behandlung mit Anionenaustauscher" zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltenen Fraktion ist es jedoch bevorzugt, das obige Verfahren (III) oder (IV) und die nachfolgenden Verfahrensschritte nach dem vorliegenden Verfahren durchzuführen.
Erfindungsgemäß werden Viren inaktiviert durch Erhitzen in einem wäßrigen Medium, vorzugsweise für eine Zeitdauer von etwa Stunden bei etwa 60 ºC.
sIgA kann in eine wäßrige Lösung von Salzen wie physiologische Saline und Phosphatpuffer-Lösung dispergiert werden, um einen lösungsähnlichen Zustand herbeizuführen, und das Erhitzen erfolgt dann in diesem Zustand.
Durch Erhitzen für eine Zeitdauer von etwa 10 Stunden bei etwa 60 ºC wurde eine beträchtliche Menge an sIgA normalerweise denaturieren, obgleich sich das sIgA nach wie vor in Lösung befindet. Es wurde jedoch gefunden, daß die Denaturierung durch Zugabe eines Stabilisierungsmittel unterdrückt werden kann (Verw. auf Experiment 1).
Als Stabilisierungsmittel können Zuckeralkohole wie Sorbitol, Disaccharide wie Zuckerrohr, und Aminosäuren wie Glycin verwendet werden. Von diesen Stabilisierungsmitteln können eine Art oder mehr als eine Art verwendet werden. Wenn eine Art eines stabilisierungsmittels verwendet wird, ist es vorzugsweise ein Zuckeralkohol wie Sorbitol. Ein Disaccharid und eine Aminosäure werden vorzugsweise gemeinsam eingesetzt.
Nach der Hitzebehandlung enthält die Lösung darin gelöstes polymerisiertes sIgA, wobei sIgA-Polymer und -Monomer jedoch voneinander getrennt werden können, da das Polymer durch Zugabe von PEG zur Lösung ausfällt, wobei eine PEG-Konzentration von 6 bis 9 Gew./Vol.%, vorzugsweise 7 bis 8 % bevorzugt ist, wohingegen das sIgA-Monomer bei einer PEG-Konzentration von 10 % zu fällen beginnt, und die meisten der Monomer-Präzipitate bei 15 % und eine nahezu vollständige Präzipitation bei 20 bis 25 % PEG erfolgt ausfallen.
Als PEG können beispielsweise genannt werden PEG #4000 (mittleres Molekulargewicht 3000), PEG #2000 (mittleres Molekulargewicht 2000), PEG #6000 (mittleres Molekulargewicht 7500), etc.
Durch die obige Hitzebehandlung werden die meisten Viren inaktiviert, wenn man jedoch die Kontamination mit einem hitzeresistenten Virus wie dem Hepatitis-B-Virus betrachtet, ist es wünschenswert, die Behandlung auch durch Reaktion mit Tri-n- butylphosphat und einem Tensid durchzuführen.
Demgemäß wurde die Möglichkeit der Kombination der obigen Hitzebehandlung mit der Behandlung mit Tri-n-butylphosphat und einem Tensid untersucht. Als Ergebnis wurde gefunden, daß die Kombination selbst möglich ist, wobei das sIgA jedoch in einem bestimmten Ausmaß polymerisiert und koaguliert, selbst bei der Behandlung mit Tri-n-butylphosphat und ein Tensid. Daher ist es zur wirksamen Entfernung des koagulierten Polymers angemessen, die Hitzebehandlung nach der Behandlung mit Tri-n-butylphosphat und einem Tensid durchzuführen und dann mit PEG zu fraktionieren.
Bei der Behandlung mit Tri-n-butylphosphat und einem Tensid schließen die Beispiele für das Tensid nichtionische Tenside wie Tween 80 (Polysorbat 80) und anionische Tenside wie Natriumcholat ein. Hinsichtlich der Konzentration an Tri-n-butylphosphat und einem Tensid bei der Behandlung kann die erstere 0,2 bis 0,4 % und die letztgenannte irgendeine Konzentration sein, vorzugsweise jedoch nicht mehr als 1 %, z.B. 0,2 bis 1 %. Diese Agenzien können im allgemeinen für eine Zeitdauer von 5 bis 7 Stunden lang bei 20 bis 30 ºC umgesetzt werden.
Nach einer Ausführungsform werden 0,3 % Tri-n-butylphosphat und 1 % Tween 80, oder 0,3 % Tri-n-butylphosphat und 0,2 % Natriumcholat als jeweilige Endkonzentrationen einer Lösung zugegeben, die sIgA enthält, und die vermischten Lösungen werden 6 Stunden lang bei 24 ºC bzw. 30 ºC behandelt.
Das sIgA kann von dem Tri-n-butylphosphat und dem Tensid in der sIgA-Lösung, welche der obigen Behandlung zugeführt worden ist, rückgewonnen werden durch Zugabe von PEG zu der Lösung in der Weise, daß sie eine PEG-Konzentration von 20 bis 25 % aufweist, wodurch die Präzipitation des sIgA verursacht wird, und durch anschließendes Zentrifugieren. Die resultierenden sIgA- Präzipitate werden gelöst durch Zugabe eines Mediums wie physiologische Saline, und die Lösung wird etwa 10 Stunden lang auf etwa 60 ºC erhitzt, vorzugsweise unter Zugabe des bzw. der oben genannten Stabilisierungsmittel. Anschließend wird die Lösung der obigen PEG-Fraktionierung zugeführt, wodurch sIgA erhalten wird, welches anhand der zwei Schritte zur Virus-Inaktivierung behandelt wurde.
Nach einer anderen Ausführungsform wurde sIgA aus einer sIgA-Lösung, welche der ersten Stufe der Virus-Inaktivierung zugeführt worden war, durch Zugabe von PEG auf eine Konzentration von 20 % präzipitiert, und Tri-n-butylphosphat und das Tensid wurden von den Präzipitaten durch Zentrifugieren entfernt. Das resultierende sIgA wurde gelöst durch Zugabe von physiologischer Saline bis zu einer 1%igen (Gew./Vol.) Lösung (pH-Wert 7). Als Stabilisierungsmittel wurden der Lösung 50 % (Gew./Vol.) Sorbitol-2 M Glycin zugegeben, und die Mischung wurde der obigen "Erhitzung einer verflüssigten Form" (10 Stunden lang bei 60 ºC) und der Fraktionierung mit 8-23 % PEG zugeführt.
Die jeweiligen Ausbeuten nach den Ausführungsformen betrugen 63 und 60 % und lagen demgemäß in gewissem Ausmaß niedriger als die durch alleinige Hitzebehandlung erhaltenen Werte.
Die Potenz des erfindungsgemäß hergestellten sIgA als neutralisierender Antikörper (neutralising antibody potency) ist wie folgt:

(1) Verfahren des "Erhitzens einer verflüssigten Form" - PEG- Fraktionierung:

Durch das obige Verfahren des "Erhitzens einer verflüssigten Form" und der PEG-Fraktionierung hergestelltes sIgA sowie aus demselbem Material anhand eines Verfahrens unter Weglassen der Hitzebehandlung aus dem obigen Verfahren hergestelltes sIgA wurden mittels direkter Agglutination unter Verwendung von Escherichia coli (NHI/J-Stamm etc.) untersucht, und die Potenz dieser sIgAs als neutralisierende Antikörper gegenüber Viren wie dem Rotavirus, dem Echovirus, etc., wurden ermittelt. Bei einem Vergleich der mit beiden sIgAs erhaltenen Ergebnisse wurden zwischen ihnen bei der direkten Agglutination mit Escherichia coli wie auch bei der neutralisierenden Antikörper-Potenz auf die Viren keine Unterschiede festgestellt, so daß bestätigt wurde, daß die Aktivität von sIgA durch dieses Verfahren nicht beeinträchtigt wird (Verw. auf Test-Beispiele 1 und 2).

(2) Verfahren mit Tri-n-butylphosphat - Tensid - "Erhitzen einer verflüssigten Form" - PEG-Fraktionierung:

Die direkte Agglutination unter Verwendung von Escherichia coli (NHI/J-Stamm etc.) und die Potenz von nach diesem Verfahren hergestelltem sIgA als neutralisierende Antikörper wurden verglichen mit denjenigen von sIgA, hergestellt aus demselben Material nach einem Verfahren unter Weglassen der obigen Schritte. Im Ergebnis wurden zwischen ihnen bei der direkten Agglutination von Escherichia coli wie auch bei der Potenz als neutralisierende Antikörper gegen Viren keine großen Unterschiede beobachtet, so daß die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung wie oben unter (1) festgestellt wurde (Verw. auf Test-Beispiele 3 und 4).
Aus den obigen Ergebnissen wurde ferner geschlossen, daß erfindungsgemäß hergestellte sIgA-Präparate kein denaturiertes sIgA enthalten.
Darüber hinaus wurde nach einem Modellexperiment über die Inaktivierung von Viren weitgehend geklärt, daß das Zytomegalievirus und das Hepatitis-A-Virus, welche im selben Ausmaß wie das Poliovirus gegenüber Hitze resistent sind, wie auch das AIDS- Virus, welches gegenüber Hitze weniger als die obigen Viren resistent ist, durch die vorliegende Hitzebehandlung inaktiviert werden, und daß selbst glatte Viren, welche in hohem Maße hitzeresistent sind, wie das Hepatitis-B- oder das Non-A-Non-B-Virus, durch gemeinsame Anwendung der Behandlung mit Tri-n-butylphosphat und einem Tensid und der Hitzebehandlung inaktiviert werden (Verw. auf Test-Beispiel 2).
Die erfindungsgemäß erhaltene sIgA-Lösung kann gegenüber physiologische Saline, etc., dialysiert und anschließend durch Membranfiltration etc. sterilisiert werden. Die resultierende Lösung kann als solche verabreicht oder gefriergetrocknet und für die Verabreichung als orales Präparat zu Kapseln weiterverarbeitet werden. Die Form des Präparates variiert in Abhängigkeit von der Verwendung. Bei der Verarbeitung zu den Präparaten kann eine enterale Ummantelung durchgeführt werden, obgleich diese Ummantelung nicht besonders erforderlich ist, da sIgA eine chemisch und enzymatisch stabile Substanz ist. Das vorliegende sIgA wird als Agens zur zusätzlichen lokalen Immuntherapie von Schleimhäuten eingesetzt, und daher eine orale Verabreichung und Instillation in die Nase oder die Augen bei der Verabreichung berücksichtigt, und eine intravenöse Injektion ist nicht notwendigerweise angemessen, obgleich die Art und Weise der Verabreichung nicht in besonderer Weise beschränkt ist.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Experimente, Beispiele und Test-Beispiele näher erläutert.

Experiment 1

(Untersuchungen des hitzestabilisierenden Agens und der PEG- Fraktionierung für sIgA)
Es wurden Experimente durchgeführt zur Erhitzung einer sIgA enthaltenden Lösung als verflüssigte Form für eine Zeitdauer von 10 Stunden auf 60 ºC in Gegenwart oder Abwesenheit von Hitzestabilisatoren, und das Ausmaß der Polymerisation-Koagulation von sIgA wurde analysiert, um das beste Stabilisierungsmittel herauszufinden und die optimale PEG-Konzentration zur Entfernung der polymerisierten Stoffe zu ermitteln.
Im allgemeinen wird die Hitzedenaturierung von Proteinen von dem Phänomen begleitet, daß das Protein durch Polymerisation koaguliert und wasserunlöslich wird, und daß die Reaktion irreversibel verläuft. Für die Kenntnis des Ausmaßes der Denaturierung eines Proteins ist es wichtig, das Ausmaß der Polymerisation-Koagulation zu kennen. Demgemäß wurde die Lösung des obigen sIgA in 1 % (Gew./Vol.) physiologischer Saline zuerst als solche oder unter Zugabe eines nachfolgend genannten Stabilisierungsmittels für eine Zeitdauer von 10 Stunden bei 60 ºC behandelt. Anschließend wurde die rückgewonnene Menge an sIgA analysiert durch Verwendung einer Superose 8 (hergestellt von Pharmacia Co.)-Säule. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 Vorläufiges Experiment der Hitzebehandlung einer sIgA-Lösung "als verflüssigte Form" Stabilisierungsmittel Aussehen nach Hitzebehandlung Rückgewinnungsrate an sIgA (1) nicht zugegeben (2) 2 M Glycin (3) 50 Gew./Vol.% Sucrose (4) 50 Gew./Vol.% Sorbitol (5) 50 Gew./Vol.% Sucrose-2M Glycin (6) 50 Gew./Vol.% Sorbitol 2 M Glycin weißlich trüb leicht fast klar
Die nach Tabelle 1 erhaltenen sIgA-Proben wurden verdünnt und es erfolgte die Zugabe von PEG auf eine Konzentration von 5 bis 10 %, vorzugsweise 7 bis 8 %, und man ließ die Mischung 1 Stunde lang bei 4 ºC stehen und zentrifugierte sie anschließend. Die Menge an polymerisierten Stoffen in dem Überstand wurde untersucht. Als Ergebnis wurde gefunden, daß die meisten der polymerisierten Stoffe in jedem Fall bei der obigen PEG- Konzentration präzipitieren. Um die Ausbeute an sIgA nach Entfernung des sIgA-Polymers zu ermitteln, wurde dem 8 % PEG enthaltenden Überstand einer jeden Probe weiteres PEG bis zur Endkonzentration von 23 % zugegeben, wodurch das sIgA vollständig präzipitierte und rückgewonnen wurde. Als Ergebnis betrug die Rückgewinnungsrate an sIgA 10 % im Falle der fehlenden Zugabe eines Stabilisierungsmittels, wohingegen die entsprechenden Ausbeuten an sIgA im Falle der Zugabe von Sorbitol, Sucrose- Glycin und Sorbitol-Glycin als Stabilisierungsmittel 88, 87 bzw. 73 % betrugen, wodurch größere Rückgewinnungsraten als in dem obigen Fall erzielt wurden.
Das sIgA-Monomer fängt ab einer PEG-Konzentration von 10 % an zu fällen, wobei der größte Teil des Monomers bei 15 % präzipitiert und eine nahezu vollständige Präzipitation bei 20 bis 30 % gefunden wird.
Aus diesen Ergebnissen wurde geschlossen, daß die Koagulation und Präzipitation von sIgA bei ausbleibender Zugabe eines Stabilisierungsmittels beobachtet wird und die Lösung bei Erhitzung als verflüssigte Form für eine Zeitdauer von 10 Stunden bei 60 ºC weißlich trüb wird, wobei sie durch die Zugabe von Stabilisierungsmitteln jedoch in bemerkenswerter Weise unterdrückt wird.

Experiment 2

(Untersuchung der Virus-Aktivität nach Behandlung zur Inaktivierung)

Im Experiment 1 wurde bestätigt, daß die Denaturierung von sIgA während der Hitzebehandlung in Form einer wäßrigen Lösung für eine Zeitdauer von 10 Stunden bei 60 ºC durch die Gegenwart eines Stabilisierungsmittels unterdrückt wird. Diese Tatsache zeigt jedoch, daß ein Virus möglicherweise nicht vollständig inaktiviert ist, da eine Möglichkeit dafür besteht, daß das die Viruspartikel aufbauende Protein ebenfalls nicht denaturiert ist.
Demgemäß und um nachzuweisen, daß die erfindungsgemäße Behandlung lediglich zur Inaktivierung von Viren wirksam ist, wurden Experimente der Virus-Inaktivierung durchgeführt durch "Erhitzen einer verflüssigten Form" in Gegenwart und Abwesenheit von 50 % (Gew./Vol.) Sorbitol - 2 M Glycin als Stabilisierungsmittel, wobei das Poliovirus (Typ 1) und das vesikuläre Stomatitisvirus (VSV) eingesetzt wurden. Da davon ausgegangen wird, daß das Protein selbst möglicherweise ein Stabilisierungsmittel für ein Virus sein kann, wurden darüber hinaus Experimente zum "Erhitzen einer verflüssigten Form" in Gegenwart von 2 % oder 50 % (Gew./Vol.) Sorbitol-2 M Glycin für eine Zeitdauer von 10 Stunden bei 60 %ºC durchgeführt, wobei humanes Albumin als Modellprotein eingesetzt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2 Virus-Inaktivierung durch "Erhitzen einer verflüssigten Form" Virus Stabilisierungsmittel Hitzebehandlung "einer verflüssigten Form" bei 60 ºC für 10 Stunden Unbehandelt Poliovirus
(In der Tabelle bezeichnen die Zahlenwerte den TCID&sub5;&sub0;-Wert)
Aus den Ergebnissen der Tabelle 2 ergibt sich eine hohe Wahrscheinlichkeit dafür, daß das AIDS-Virus, welches weniger hitzeresistent als das Poliovirus ist, und das Zytomegalievirus und das Hepatitis-A-Virus, welche im selben Ausmaß hitzeresistent sind wie das Poliovirus, inaktiviert werden. Aufgrund der Befunde, daß sowohl das Poliovirus als auch das VSV durch diese Behandlung inaktiviert werden, wird davon ausgegangen, daß die Inaktivierung unabhängig davon erfolgt, ob ein Virus eine Hülle hat oder nicht. Hieraus folgt jedoch nicht zwangsläufig, daß Hepatitis-A- und Non-A-Non-B-Viren, welche im hohen Maße hitzeresistent sind, lediglich durch diese Behandlung inaktiviert werden können.
Demgemäß wurden Experimente zur Virus-Inaktivierung durchgeführt, indem mit Tri-n-butylphosphat - Tensid behandelt wurde, was im Hinblick auf ein Virus mit einer Hülle wie dem Hepatitis- B- oder Non-A-Non-B-Virus oder dergleichen als wirksam betrachtet wird. Unter Verwendung von VSV, das eine Hülle besitzt, und von Poliovirus, das keine Hülle aufweist, als zu untersuchende Viren wurden Experimente zur Virus-Inaktivierung durchgeführt, bei denen die jeweiligen Viren 6 Stunden lang bei 24 ºC und 30 ºC unter Zugabe von 0,3 % Tri-n-butylphosphat - 1 % Tween oder 0,3 % Tri-n-butylphosphat - 0,2 % Natriumcholat behandelt wurden. Unter Berücksichtigung der Möglichkeit, daß das Protein selbst für Viren ein Stabilisierungsmittel sein kann, wurden gleichzeitig Experimente zur Behandlung durch die obige Behandlungsweise unter Zugabe von 2 % humanen Albumins (HSA) als Modellprotein zu den obigen Agenzien durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3 Inaktivierung von Viren durch Behandlung mit Tri-n- butylphosphat (TNBP) - Tensid TNBP/Tween 80 TNBP/Natriumcholat Virus Behandelt Unbehandelt Poliovirus keins vorhanden
(In der Tabelle bezeichnen die Zahlenwerte den TCID&sub5;&sub0;-Wert)
Die Ergebnisse der Tabelle 3 zeigen, daß die Behandlung mit Tri-n-butylphosphat - Tensid lediglich einen Virus mit einer Hülle inaktiviert und gegenüber einem Virus ohne Hülle vollkommen unwirksam ist. Es wird nämlich davon ausgegangen, daß das Hepatitis-B- oder Non-A-Non-B-Virus, das AIDS-Virus, etc., inaktiviert werden, und daß das Hepatitis-A-Virus, etc., nicht inaktiviert werden kann.
Aus diesen Ergebnissen ist offensichtlich, daß das "Erhitzein einer verflüssigten Form" die meisten der pathogenen Viren inaktivieren kann, obgleich bei einem Virus wie dem Hepatitis-B- Virus, welches durch "Erhitzen einer verflüssigten Form" für 10 Stunden bei 60 ºC nicht aktiviert werden kann, jedoch eine vollständigere Inaktivierung erforderlich ist, und daher ist es wünschenswert, die Hitzebehandlung zusammen mit der Behandlung mit Tri-n-butylphosphat - Tensid durchzuführen.

Beispiel 1

Nach der Entfernung von Fett aus 2 l menschlichen Kolostrums durch Zentrifugation wurde der Überstand auf pH-Wert 4,5 eingestellt, und das Casein wurde durch Zentrifugation entfernt. Der somit erhaltene Überstand wurde durch Zugabe von Ammoniumsulfat bis zu einer 50%igen Sättigung ausgesalzen. Die resultierenden Präzipitate wurden gesammelt und ausreichend mit 0,01 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7,4) dialysiert. Das in der Membran verbliebene Dialysat wurde auf 1 l der DEAE-Sephacel (hergestellt von Pharmacia Co.)-Säule geladen, welche zuvor ausreichend mit demselben Puffer wie oben gepuffert worden war. Nachdem die Säule ausreichend mit demselben Puffer gewaschen worden war, wurde sIgA mit 0,01 M Phosphatpuffer-Lösung - 0,1 M Natriumchlorid, pH-Wert 7,4 (PBS), eluiert. Anschließend wurde das Eluat auf 100 ml der Heparin-Sepharose (hergestellt von Pharmacia Co.)-Säule geladen, welche ausreichend mit PBS gepuffert war, und die nicht-adsorbierte Portion wurde gesammelt. Durch Zugabe von Polyethylenglykol (PEG) #4000 (hergestellt von Wako Pure Chemical, Ltd.) zu der Portion wurde sIgA präzipitiert, und die Präzipitate wurden gesammelt und gelöst durch Zugabe von physiologischer Saline (hergestellt von Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) zum Eralt einer 2%igen sIgA-Lösung. Einem ml der Lösung wurden 0,5 g Sorbitol (hergestellt von Wako Pure Chemical, Ltd.) zur Lösung darin zugegeben, und die resultierende Lösung wurde aufgeteilt in Hartglasflaschen gegossen und verschlossen. Diese Flaschen wurden in heißes Wasser von 60 ºC eingetaucht und 10 Stunden lang erhitzt. Nach dem Erhitzen wurde die Lösung 5fach mit physiologischer Saline verdünnt, es erfolgte die Zugabe von PEG #4000, um dessen Konzentration auf 8 % (Gew./Vol.) einzustellen, und die vermischte Lösung ließ man 2 Stunden lang bei 4 ºC stehen, bevor die resultierenden Präzipitate durch zentrifugation entfernt wurden. Zu der auf diese Weise erhaltenen Lösung wurde PEG #4000 bis zu einer Endkonzentration von 23 % zugegeben, und man ließ die Lösung 8 Stunden lang bei 4 ºC stehen. Die resultierenden Präzipitate wurden durch Zentrifugation gesammelt und durch Zugabe von physiologischer Saline zur Herstellung einer 2%igen sIgA-Lösung gelöst. Diese Lösung wurde unter Verwendung von physiologischer Saline dialysiert und durch Membranfiltration sterilisiert. Die Ausbeute an sIgA aus dem Kolostrum betrug 40 % (Charge 1/T). Darüber hinaus wurden die oben genannten Präzipitate bei 20 % PEG, welche nicht erhitzt worden waren, mit physiologischer Saline gelöst, um eine 2%ige sIgA-Lösung zu erhalten. Nach der Dialyse gegen physiologische Saline wurde die Lösung durch Membranfiltration zur Herstellung eines Präparats (Charge 1/N) sterilisiert.

Beispiel 2

In derselben Weise wie in Beispiel 1 wurde aus menschlichem Kolostrum ein sIgA-Präparat hergestellt. Die Ausbeute an sIgA aus dem Kolostrum betrug 40 % (Charge 2/T). Ein anderes Präparat wurde ebenfalls hergestellt durch Auflösen der Präzipitate, welche bei 20 % PEG erhalten und nicht durch Erhitzen behandelt worden waren, in physiologischer Saline zur Herstellung einer 2%igen sIgA-Lösung, durch Dialysieren der Lösung gegen physiologische Saline und Sterilisieren durch Membranfiltration (Charge 2/N).

Beispiel 3

Menschlisches Kolostrum wurde der Entfernung von Fett und Casein zugeführt und anschließend in derselben Weise wie in Beispiel 1 dialysiert. Die resultierende Lösung wurde auf 7 l einer DEAE-Toyopearl (hergestellt von Tohso Corp.)-Säule geladen, welche zuvor ausreichend mit 0,01 M Phosphatpuffer (pH- Wert 7) gepuffert worden war, und anschließend wurde die Säule ausreichend mit demselben Puffer gewaschen, bevor sIgA mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7) eluiert wurde. Anschließend wurde das Eluat auf 600 ml einer Sulfate-Cellulofine (hergestellt von Seikagaku Kogyo Co.)-Säule geladen, welche zuvor ausreichend mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7) gepuffert worden war, wonach die nicht-adsorbierte Portion gesammelt und PEG #4000 zugegeben wurde, damit die PEG-Konzentration 20 % (Gew./Vol.) beträgt, um sIgA zu präzipitieren. Die resultierenden Präzipitate wurden gesammelt und durch Zugabe von physiologischer Saline zur Herstellung einer 2%igen sIgA-Lösung gelöst. Einem ml der Lösung wurden 0,5 g Sorbitol und 0,15 g Glycin zugegeben und darin gelöst, und die vermischte Lösung wurde 10 Stunden lang bei 60 ºC behandelt.
Nach dem obigen "Erhitzen einer verflüssigten Form" wurde die Lösung 5fach mit physiologischer Saline verdünnt, es wurde PEG #4000 zu der verdünnten Lösung zugegeben, um eine PEG-Konzentration von 7 % (Gew./Vol.) zu erhalten, und die auf diese Weise erhaltene Lösung ließ man 1 Stunde lang bei 4 ºC stehen, bevor die resultierenden Präzipitate mittels Zentrifugation entfernt wurden. Zu der resultierenden Lösung wurde PEG #4000 in einer Endkonzentration von 20 % zugegeben, und man ließ die vermischte Lösung 6 Stunden lang bei 4 ºC stehen, bevor die resultierenden Präzipitate durch Zentrifugieren gesammelt und durch Zugabe von physiologischer Saline zur Herstellung einer 2%igen sIgA-Lösung gelöst wurden. Die auf diese Weise erhaltene Lösung wurde mit physiologischer Saline dialysiert und durch Membranfiltration sterilisiert. Die Ausbeute an sIgA betrug 48 % (Charge 3/T). Ein anderes Präparat wurde hergestellt durch Auflösen der Präzipitate, welche bei 20 % PEG erhalten und nicht durch Erhitzen behandelt worden waren, in physiologischer Saline zur Herstellung einer 2%igen sIgA-Lösung, durch Dialysieren der Lösung gegen physiologische Saline und Sterilisieren durch Membranfiltration.

Beispiel 4

In derselben Weise wie in Beispiel 3 wurde eine 2%ige sIgA- Lösung hergestellt, indem 10 l menschlischen Kolostrums der Entfernung von Fett und Casein, der Dialyse, der Säulenchromatographie mit DEAE-Toyopearl und Sulfate-Cellulofine , der Sammlung der sIgA-Fraktion, der Präzipitation von sIgA durch Zugabe von PEG #4000 zu der Fraktion zum Erhalt einer PEG-Konzentration von 20 % (Gew./Vol.), der Sammlung der resultierenden Präzipitate und der Auflösung der Präzipitate mit physiologischer Saline unterzogen wurden.
Die auf diese Weise hergestellte sIgA-Lösung wurde in 3 Aliquotportionen aufgeteilt. Einer dieser Portionen wurde Tri- n-butylphosphat in einer Endkonzentration von 0,3 % und Tween 80 in einer Endkonzentration von 1 % zugegeben. Einer weiteren Portion wurde Tri-n-butylphosphat in einer Endkonzentration von 0,3 % und Natriumcholat in einer Endkonzentration von 0,2 % zugegeben.
Nachdem die erstgenannte Portion auf 24 ºC und die letztgenannte auf 30 ºC für jeweils 6 Stunden erhitzt wurden, wurde beiden Portionen PEG #4000 in einer Endkonzentration von 20 % (Gew./Vol.) zugegeben, um sIgA zu präzipitieren. Die aus den beiden Portionen resultierenden Präzipitate wurden gesammelt und durch Zugabe von physiologischer Saline zum Erhalt von jeweils 2%igen sIgA-Lösungen gelöst. Jeweils einem ml dieser Lösungen wurden 0,5 g Sorbitol und 0,15 g Glycin zugegeben und darin gelöst, und beide vermischten Lösungen wurden 10 Stunden lang bei 60 ºC behandelt. Jeder der durch "Erhitzen einer verflüssigten Form" in der oben genannten Weise behandelten Lösungen wurden mit physiologischer Saline zu einer 5fachen Lösung verdünnt, und es erfolgte die Zugabe von PEG #4000 bis zu einer Endkonzentration von 7 % (Vol./Gew.), und man ließ diesen Ansatz 1 Stunde lang bei 4 ºC stehen, bevor die resultierenden Präzipitate durch Zentrifugieren entfernt wurden. Jeder dieser auf diese Weise erhaltenen Lösungen wurde PEG #4000 bis zu einer Endkonzentration von 20 % zugegeben, und man ließ die Ansätze 8 Stunden lang bei 4 ºC stehen, bevor die resultierenden Präzipitate durch Zentrifugieren gesammelt und durch Zugabe von physiologischer Saline zur Herstellung einer 2%igen sIgA-Lösung gelöst wurden, und die Lösung wurde mit physiologischer Saline dialysiert, bevor durch Membranfiltration sterilisiert wurde. Das Präparat, welches durch Einsatz eines Tensides mit Tween 80 bei der Virus- Inaktivierung erhalten wurde, wurde mit Charge 4/T bezeichnet, und ein weiteres durch Verwendung von Natriumcholat erhaltenes wurde mit Charge 4/C bezeichnet.
Eine weitere, aus der 3fachen Aufteilung resultierende Portion wurde mit physiologischer Saline dialysiert, durch Membranfiltration sterilisiert und als unbehandelte Charge bezeichnet (Charge 4/N). Die Ausbeuten an sIgA aus Kolostrum betrugen 40 % bei Charge 4/T und 38 % bei Charge 4/C.

Test-Beispiel 1

Es wurden Lösungen hergestellt, die jeweils 4 mg/ml einer jeden Charge der in den Beispielen 2 und 3 hergestellten sIgA- Präparationen enthielten, und jede Lösung wurde mit 2 x 10&sup7; Zellen des Escherichia coli-Stammes NIH/J oder des Stammes b/8M vermischt. Die Agglutinationsbilder zum Zeitpunkt von 3 Minuten nach der Vermischung wurden miteinander verglichen. Im Ergebnis zeigten sämtliche der Chargen 1/T, 2/T und 3/T dieselben Agglutinationsbilder wie diejenigen, die mit Chargen 1/N, 2/N und 3/N gezeigt werden konnten. Demgegenüber waren im Falle einer Präparation, die getrennt durch "Erhitzen einer verflüssigten Form" unter Zugabe keines Stabilisierungsmittels und keiner PEG-Fraktionierung hergestellt wurde, nahezu 90 % des sIgA denaturiert, und daher zeigte die sIgA-Lösung mit den beiden Escherichia coli-Stämmen kein Agglutinationsbild, was dem Fall der alleinigen Verwendung von physiologischer Saline ähnlich ist.

Test-Beispiel 2

Jede Charge der in den Beispielen 1 und 2 hergestellten sIgA-Präparationen wurde der Bestimmung der Potenz als neutralisierende Antikörper gegenüber dem humanen Rotavirus, dem Poliovirus 1, dem Coxsakie B3- oder A16-Virus und dem Echovirus zugeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt.
Die Ergebnisse zeigen, daß die Chargen 1/T, 2/T und 3/T der vorliegenden sIgA-Präparation dieselbe neutralisierende Antikörper-Valenz gegenüber diesen Viren zeigte wie die Chargen 1/N, 2/N und 3/N, welche nicht hitzebehandelt worden waren. Tabelle 4 Potenzen der sIgA-Präparationen als neutralisierende Antikörper gegenüber jedem Virus: Neutralisierende Antikörper-Potenz gegenüber Viren** sIgA*-Präparation Charge Nr. Rota Polio Coxsakie Echo
* Jedes sIgA-Präparat wurde als 5 mg/ml Lösung verwendet, hergestellt durch Verdünnung der Präparation mit einer serumfreien Kultur.
** Die neutralisierende Antikörper-Potenz wurde bewertet durch die zur Neutralisierung von 50 % der 100 TCID&sub5;&sub0;-Werte von jedem Virus erforderlichen maximalen Verdünnungsrate.

Test-Beispiel 3

Jede Lösung, die 4 mg/ml eines jeder Charge der in Beispiel 4 hergestellten sIgA-Präparationen enthielt, wurde hergestellt und mit 2 x 10&sup7;/ml Zellen des Escherichia coli-Stammes NIH/J oder b/8M-1 vermischt. Zu einem Zeitpunkt von 3 Minuten nach dem Vermischen wurden die Agglutinationsbilder miteinander verglichen. Als Ergebnis zeigten die Chargen 4/T und 4/C beide dieselben Agglutinationsbilder wie die unbehandelte Charge 4/N.

Test-Beisdiel 4

Jede Charge der in Beispiel 4 hergestellten Präparationen wurde zur Bestimmung der neutralisierenden Antikörper-Potenz gegenüber dem humanen Rotavirus, dem Polio I-Virus, dem Coxsakie B3- oder A16-Virus und dem Echovirus zugeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt.
Als Ergebnis konnten keine großen Unterschiede zwischen den neutralisierenden Antikörper-Potenzen der vorliegenden sIgA- Präparation Charge 4/C und 4/T und denjenigen der unbehandelten Charge 4/N festgestellt werden. Tabelle 5 Neutralisierende Antikörper-Potenzen von sIgA A-Präparationen gegenüber jedem Virus: Neutralisierende Antikörper-Potenz gegenüber Viren** sIgA*-Präparation Charge Nr. Rota Polio Coxsakie Coxsakie Echo
* Jedes sIgA-Präparat wurde als 5 mg/ml Lösung verwendet, hergestellt durch Verdünnung der Präparation mit einer serumfreien Kultur.
** Die neutralisierende Antikörper-Potenz wurde bewertet durch die zur Neutralisierung von 50 % der 100 TCID&sub5;&sub0;-Werte bei jedem Virus erforderlichen maximalen Verdünnungsrate.

[Verfahren der Bestimmung]

Die Bestimmung von sIgA erfolgte anhand eines entwickelten Sandwich-ELISA-Verfahrens, bei dem Anti-sekretorischer-Komponent-Antikörper (hergestellt von Igaku Seibutsugaku Kenkyusho Co., Ltd) als feste Phase eingesetzt wird, und bei dem Peroxidase-markierter gereinigter Anti-α-Kette-Antikörper verwendet wird, der nach dem Verfahren von S. Hashida et al. (J. Appl. Biochem. 6, 56 (1984)) unter Verwendung von Anti-α-Kette-Antikörper (hergestellt von Daiichi Kagaku Yakuhin Co.) hergestellt wurde.
Die Infektionsvalenz des Virus und die neutralisierende Antikörper-Potenz gegenüber dem Virus wurden berechnet durch Beobachtung des zytopathischen Effekts (CPE), hervorgerufen mit einem Virus auf einer Mikrotiterplatte unter Verwendung der etablierten Zellinie MA104, welche aus der Niere des Resusaffen stammt, als Zellen zur Kultivierung des Virus (Virus Jikkengaku Souron, Kapitel 13, 1973; herausgegeben von Maruzen Co.).

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Virus-inaktivierten, sekretorischen Immunglobulin A-Präparats, dadurch gekennzeichnet, daß sekretorisches Immunglobulin A, welches mit Viren kontaminiert sein könnte, zur Inaktivierung von Viren in einem wäßrigen Medium bei einer geeigneten Temperatur und für eine geeignete Zeitdauer in Gegenwart von mindestens einem Stabilisierungsmittel erhitzt wird, welches 1 bis 3 molar an Aminosäure ist und/oder 20 bis 60 Gew./Vol.% Zuckeralkohol oder Disaccharid aufweist, und anschließend polymerisierte Stoffe aus der resultierenden Lösung bei einem pH-Wert von 6 bis 8 durch Zugabe von Polyethylenglykol entfernt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Hitzebehandlung 10 Stunden lang bei 60 ºC durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, bei dem man das sekretorische Immunglobulin A, welches mit Viren kontaminiert sein könnte, ferner mit Tri-n-butylphosphat und einem Tensid in flüssiger Form in einem wäßrigen Medium behandelt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem Tri-n-butylphosphat in einer Konzentration von 0,2 bis 0,4 %, und das Tensid in einer Konzentration von 0,2 bis 1 % vorhanden sind, und die Behandlung 5 bis 7 Stunden lang bei 20 bis 30 ºC durchgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, bei dem das Tensid Polyoxyethylen-20-sorbitanmonooleat (Polysorbat 80) oder Natriumcholat ist.

6. Verfahren nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, bei dem das sekretorische Immunglobulin A vom Menschen, vom Rind oder von der Maus stammt.

7. Verfahren nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, bei dem das sekretorische Immunglobulin A ein polyklonaler oder monoklonaler Antikörper ist.

8. Verfahren nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, bei dem das Molekulargewicht des Polyethylenglykols 1000 bis 9000 beträgt.

9. Verfahren nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, bei dem nach der Hitzebehandlung einer resultierenden Lösung, die 1 bis 5 % an sekretorischem Immunglobulin A enthält, das Polyethylenglykol so zugegeben wird, daß dessen Konzentration 6 bis 9 Gew./Vol.% beträgt, und man die Mischung nicht weniger als 1 Stunde lang bei etwa 4 ºC stehen läßt, und man die präzipitierten polymerisierten Stoffe bei der selben Temperatur durch Zentrifugation entfernt, und man dem Überstand weiteres Polyethylenglykol zugibt, damit dessen Konzentration 15 bis 20 Gew./Vol.% beträgt, und man das präzipitierte sekretorische Immunglobulin A rückgewinnt.