DE3686410T2

DE3686410T2 - Stabilisierte zusammensetzungen von menschlichen aktivatoren des gewebeplasminogens.

Info

Publication number: DE3686410T2
Application number: DE8686309811T
Authority: DE
Inventors: William Franklin Bennett; Stuart Elliot Builder; Larry Alan Gatlin
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1985-12-17
Filing date: 1986-12-16
Publication date: 1993-02-18
Anticipated expiration: 2006-12-17
Also published as: NO168988B; HUT42955A; IE863279L; FR2591485B1; ATE79273T1; GB2184354B; AU600246B2; FR2591485A1; FI88873C; DD255477A5; EP0228862A3; PH24716A; IL80904A; IL80904A0; NO865079L; GR3006078T3; NO865079D0; NO168988C; JPH07173076A; PT83933B

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen, die das Protein Humangewebe-Plasminogenaktivator (t-PA) enthalten, und Verfahren zur Herstellung und Verwendung solcher Zusammensetzungen. Insbesondere bezieht sich diese Erfindung auf solche pharmazeutische Zusammensetzungen, die erhöhte Stabilitäts- und Löslichkeitseigenschaften für die t-PA-Komponente aufweisen, und solche, die leichte Lyophilisierbarkeit gewähren, was es möglich macht, stabile lyophilisierte Formen davon zur sicheren effektiven therapeutischen Verabreichung an Menschen herzustellen.
Die Instabilität von Gefäß-Plasminogenaktivator, der aus den Gefäßnetzen von menschlichen Leichnamen extrahiert wurde, ist von Aoki, J. Biol. Chem. (Tokyo), 75, 731 (1974) beschrieben worden. Aoki fand, daß der Aktivator lediglich durch hohe Natriumchloridkonzentrationen, größer als etwa 0,5 M, stabilisiert wurde.
Binder et al., J. Biol. Chem. 254, 1998 (1979) beschreiben die Verwendung von Puffern, die hohen Salzgehalt und Arginin enthalten, während eines vielstufigen Reinigungsverfahrens als wesentlich, um die Aktivität von Gefäß-Plasminogenaktivator aufrechtzuerhalten, der von Perfusaten menschlicher Leichname stammt. Die Reinigungsschritte wurden in Gegenwart von 0,3 bis 1,0 M NaCl und 0,1 M Arginin ausgeführt.
Radcliffe et al., Arch. of Biochem. & Biophys. 189, 185 (1978) beschreiben die Abtrennung von Plasminogenaktivator aus menschlichem Plasma durch Chromatographie an Lysin-Sepharose . In einem Experiment wurde roher Plasminogenaktivator aus stabilisiertem Plasma unter Verwendung eines Gradienten von 0 bis 0,5 M Arginin in 0,6 M NaCl von Lysin-Sepharose eluiert.
Humangewebe-Plasminogenaktivator, der aus einer natürlichen Gewebeguelle stammt, wird von Collen et al. in der europäischen Patentanmeldung Veröffentl.- Nr. EP-A-041766, veröffentlicht am 16. Dezember 1981, basierend auf einer Erstanmeldung vom 11. Juni 1980, beschrieben. Die Autoren verwendeten ein Reinigungsschema, das Gewebe-Plasminogenaktivator bei relativ hohem Reinheitsgrad liefert. Collen et al. untersuchten die Stabilität von Präparaten ihres gereinigten Gewebe-Plasminogenaktivators sowohl im flüssigen als auch im lyophilisierten Zustand und fanden, daß die lyophilisierten Formen wiederholt instabil waren, sogar wenn sie aus Lösungen, die 0,3 M NaCl enthielten, hergestellt wurden.
Damit Materialien wie Gewebe-Plasminogenaktivator dem Personal in der Gesundheitspflege und den Patienten zur Verfügung gestellt werden können, müssen diese Materialien als pharmazeutische Zusammensetzungen hergestellt werden. Solche Zusammensetzungen müssen für geeignete Zeiträume stabil, für sich zur Verabreichung an Menschen akzeptabel und leicht herstellbar sein. Ein Beispiel einer solchen Zusammensetzung wäre eine Lösung, die für die parenterale Verabreichung bestimmt ist. Obwohl in vielen Fällen pharmazeutische Lösungszusammensetzungen in flüssiger Form bereitgestellt werden, die für die sofortige Verwendung geeignet sind, können solche parenteralen Zusammensetzungen auch in gefrorener oder lyophilisierter Form bereitgestellt werden. Im erstgenannten Fall muß die Zusammensetzung vor der Verwendung aufgetaut werden. Die letztere Form wird oft dazu verwendet, um die Stabilität des in der Zusammensetzung enthaltenen medizinischen Agens unter einer großen Vielfalt von Lagerungsbedingungen zu erhöhen, da es Fachleuten bekannt ist, daß lyophilisierte Präparate im allgemeinen stabiler als ihre flüssigen Gegenstücke sind. Solche lyophilisierten Präparate werden vor der Verwendung durch die Zugabe geeigneter pharmazeutisch verträglicher Verdünnungsmittel rekonstituiert, z.B. autosterilem Wasser oder steriler physiologischer Kochsalzlösung.
Es ist deshalb wünschenswert, stabile Zusammensetzungen des Humangewebe- Plasminogenaktivators, insbesondere solche in stabilisierter lyophilisierter Form, herstellen zu können.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, daß die Einbeziehung von Arginin (als Argininiumion) in eine pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzung von Gewebe-Plasminogenaktivator (t-PA) die Stabilität und Löslichkeit von t-PA deutlich erhöht und darüber hinaus zusammen mit einer Wahl geeigneter Gegenionen die Herstellung von stabilen lyophilisierten Formen davon ermöglicht. So betrifft die Erfindung solche Zusammensetzungen und alle damit verbundenen Äquivalente und Mittel, um solche Zusammensetzungen und Äquivalente wirksam herzustellen.
Im allgemeinen können die Zusammensetzungen andere Komponenten in Mengen enthalten, die vorzugsweise die Herstellung von stabilen lyophilisierbaren Formen nicht beeinträchtigen und in Mengen, die für die effektive, sichere, pharmazeutische Verabreichung geeignet sind.
Geeignete pH-Werte für die Herstellung der Zusammensetzungen liegen im Bereich von 4 bis 9, und vorzugsweise im physiologischen pH-Bereich, d.h. etwa neutral, da diese Zusammensetzungen für Pharmazeutika bestimmt sind. In diesem pH-Bereich existiert Arginin hauptsächlich als protoniertes Kation mit einer Nettoladung +1, das als "Argininiumion" bezeichnet werden kann. Der Ausdruck "Arginin" wird hier austauschbar mit "Argininiumion" verwendet, da "Argininiumion" aufgrund des pH- Werts des Systems eine äquivalente Beschreibung darstellt. Um die elektrische Neutralität aufrechtzubehalten, muß das Argininiumion durch eine äquivalente Menge von entgegengesetzt geladenen (d.h. negativ geladen) ionischen Spezies ausgeglichen werden, die "Gegenionen" genannt werden können. Die Kombination von Argininiumion, anderer kationischer Spezies und den verschiedenen Gegenionen kann "Argininiumionenthaltendes Puffersystem" genannt werden. Akzeptable Gegenionen schließen solche ein, die pharmazeutisch akzeptabel sind und zusätzlich solche, die imstande sind, die scheinbare (offensichtliche) eutektische oder Zusammehbruchstemperatur der Zusammensetzung so einzustellen, daß die Zusammensetzung für leichte Lyophilisierung besonders geeignet ist. Beispiele solcher Gegenionen sind Acetat, Phosphat, Citrat, Succinat, Sulfat, Tartrat, Malat, Maleat oder Carbonat, ebenso wie funktionelle Äquivalente davon. Ein Beispiel eines nicht gut geeigneten Gegenions ist das Chloridion.
Wie oben gesagt, ist von den Erfindern gefunden worden, daß die Einbeziehung von Arginin (als Argininiumion) in pharmazeutische Zusammensetzungen von t-PA die Löslichkeit und Stabilität des t-PAs in diesen Zusammensetzungen deutlich erhöht. Die Argininkonzentrationen können etwa 0,02 bis 1 M, vorzugsweise 0,05 bis 1,0 M und bevorzugter etwa 0,1 bis etwa 0,5 M in der verabreichten Lösung, und/oder im Falle eines lyophilisierten Präparats, in der Lösung vor der Lyophilisierung, betragen.
Zusätzlich können die verbesserten Zusammensetzungen gegebenenfalls ein oder mehrere nicht-ionische Detergentien, z.B. Polysorbat 20 und Polysorbat 80, in Mengen von 0,001 bis 1% enthalten, um die Stabilität des t-PA weiter zu erhöhen. Darüber hinaus können andere pharmazeutisch verträgliche Exzipienten, die den Fachleuten bekannt sind, ebenfalls Teil solcher Zusammensetzungen sein. Diese können beispielsweise verschiedene Schüttmittel, zusätzliche Pufferungsmittel, chelatisierende Agentien, Antioxidantien, Konservierungsmittel, Co-Solventien und dgl. beinhalten. Spezifische Beispiele davon könnten Mannit, Tromethaminsalze ("Trispuffer"), Dinatriumedetat, Gelatine, Humanserumalbumin oder andere Polypeptide, und verschiedene kleine Peptide wie Glycylglycin einschließen.
Die t-PA-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung erfordern überraschenderweise nicht die Verwendung hoher Konzentrationen von Natriumchlorid, d.h. etwa 0,3 M oder darüber. In der Tat sind hohe Konzentrationen von Chloridionen der Lyophilisierbarkeit dieser verbesserten Zusammensetzungen abträglich. Obwohl eine gewisse Menge an Chloridionen toleriert wird, werden niedrige Konzentrationen bevorzugt, z.B., weniger als etwa 0,3 M und sind vorzugsweise nicht höher als normale physiologische Spiegel, d.h. etwa 0,12 M NaCl. Am meisten bevorzugt ist der Ausschluß des Chloridions aus der Zusammensetzung.
Eine "pharmazeutisch effektive Menge" von t-PA bezieht sich auf die Menge, welche eine therapeutische Wirkung bei verschiedenen Verabreichungsweisen ergibt. Die vorliegenden Zusammensetzungen können so hergestellt werden, daß sie Mengen an t-PA von mindestens 0,1 mg/ml bis zu 50 mg/ml, vorzugsweise von 0,4 mg/ml bis 5 mg/ml enthalten. Zur Verwendung dieser Zusammensetzungen bei der Verabreichung an menschliche Patienten, die an myokardialen Infarkt-Zuständen leiden, können diese Zusammensetzungen beispielsweise etwa 0,4 mg/ml bis 3 mg/ml t-PA enthalten, entsprechend der gegenwärtig in Betracht gezogenen Dosierungsrate für eine solche Behandlung.
Die vorliegenden Zusammensetzungen, die lyophilisierte Formen einschließen, werden im allgemeinen hergestellt durch Compoundieren der Komponenten unter Verwendung allgemein zugänglicher pharmazeutischer Compoundierungstechniken, die an sich bekannt sind. Gleichermaßen werden Standard-Lyophilisierungsverfahren und im Stand der Technik bekannte Ausrüstungen verwendet. Ein spezielles Verfahren zur Herstellung einer vorliegenden pharmazeutischen Zusammensetzung von t-PA umfaßt die Verwendung von (nach irgendeinem Standard-Proteinreinigungsschema) gereinigtem t- PA in irgendeinem der verschiedenen bekannten Pufferaustauschverfahren, z.B. Gelfiltration. Dieses bevorzugte Verfahren wurde dazu verwendet, um den t-PA, der als Ausgangsmaterial bei den folgenden Stabilitäts- und Löslichkeitsstudien verwendet wurde, zu isolieren und zu reinigen. Der in dem bevorzugten Verfahren verwendete t-PA wurde aus rekombinant veränderten Eierstockzellen chinesischer Hamster (CHO-Zellen) erhalten, die imstande sind, t-PA als sekretiertes Produkt im CHO-Zellkulturmedium zu exprimieren.
Die Anmelder haben die eindeutige Wirkung entdeckt, daß pharmazeutische Zusammensetzungen von t-PA eine deutlich stabilisierte biologische Aktivität aufweisen, wenn Argininiumion enthaltender Puffer eine Komponente ist, und daß solche Zusammensetzungen kein Natriumchlorid für die Stabilität erfordern, obwohl Salzkonzentrationen geringer als 0,3 M verwendet werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Chloridionenkonzentration 0,1 M oder weniger. Im neutralen pH-Bereich, z.B. etwa pH 6 bis 8, ist die Löslichkeit des t- PAs durch die Anwesenheit von Argininiumion so erhöht, daß es für Zusammensetzungen in relativ hohen Konzentrationen zur Verfügung steht, sogar ohne die Anwesenheit der bisher im Stand der Technik als nötig erachteten hohen stabilisierenden Salzmengen.
Wie hier verwendet, bezeichnen die Ausdrücke "Humangewebe-Plasminogenaktivator", "Human-t-PA" oder "t-PA" menschlichen extrinsischen (Gewebetyp) Plasminogenaktivator, der beispielsweise durch Extraktion einer natürlichen Quelle und Reinigung (siehe Collen et al., supra) und durch rekombinante Zellkultursysteme, wie sie hier beschrieben sind, hergestellt wird. Seine Sequenz und Eigenschaften sind beispielsweise in der europäischen Patentanmeldung Veröffentl.-Nr. EP-A-93619 (veröffentlicht am 9. November 1983), basierend auf einer Erstanmeldung vom 5. Mai 1982 angegeben; siehe auch die europäische Patentanmeldung Veröffentl.- Nr. EP-A-41766 (veröffentlicht am 16. Dezember 1981), basierend auf einer Erstanmeldung vom 11. Juni 1980 und Rijken et al., Journal of Biol. Chem. 256, 7035 (1981). Diese Ausdrücke umfassen gleichermaßen biologisch aktive Humangewebe- Plasminogenaktivator-Äquivalente, die sich in einer oder mehreren Aminosäuren in der Gesamtsequenz oder in den Glykosylierungsmustern, von denen man annimmt, daß sie von den speziell verwendeten Kulturbedingungen und der Natur des Wirts abhängen, woraus der Gewebe-Plasminogenaktivator erhalten wird, unterschieden.

A. Figuren

Figur 1 zeigt die Stabilität von t-PA in verschiedenen Zusammensetzungen.
Figur 2 zeigt den Effekt der Argininkonzentration auf die Löslichkeit von t- PA.
Figur 3 zeigt die Löslichkeitsgrenzen von t-PA bei verschiedenen Konzentrationen von Argininiumphosphat-Puffern bei pH 6 und 4ºC.

B. Lyophilisierung

Die Lyophilisierung oder Gefriertrocknung der Zusammensetzung wird unter Verwendung von Verfahren und Ausrüstung durchgeführt, die Fachleuten wohlbekannt sind. Typischerweise wird eine Zusammensetzung zuerst auf eine Temperatur unterhalb ihrer scheinbaren eutektischen oder Zusammenbruchstemperatur gefroren. Dann wird Vakuum angelegt und den Fächern des Lyophilisators Wärme zugeführt, um das Eis durch Sublimation zu entfernen, wobei die Fach-Temperatur und der Kammerdruck so eingestellt sind, daß die Temperatur der gefrorenen Masse unterhalb der scheinbaren eutektischen oder Zusammenbruchstemperatur bleibt, bis im wesentlichen das gesamte Eis entfernt ist. Nach dieser "Primärtrocknungs"-Phase kann die Fach-Temperatur weiter erhöht werden (mit oder ohne eine Änderung des Kammerdrucks) und die restliche Feuchtigkeit im gefriergetrockneten Kuchen wird abgezogen.

C. S-2288-Assay

Ein synthetisches Peptidsubstrat, S-2288 (H-D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilid 2HCl) wird durch t-PA hydrolysiert, wobei farbiges p-Nitroanilin und Tripeptid gebildet wird. Die maximale Extinktionsdifferenz zwischen Substrat und Produkt (p- Nitroanilin) tritt bei 405 nm auf. Die Produktion von p-Nitroanilin wird durch die Verfolgung der Extinktion bei 405 nm als Funktion der Zeit spektralphotometrisch überwacht. Die resultierende Steigung der Extinktion gegen die Zeit ist proportional zur t-PA-Aktivität. Dieser Assay wird bei 37 ± 0,2ºC durchgeführt.
Für diesen Assay wurden 20 bis 100 Mikroliter einer gegebenen t-PA-Probe zu 1,2 ml Reaktionsmischung, die 0,33 mM S-2288, 0,067 M Trispuffer (pH 7,4) und 0,07 M NaCl enthielt, zugegeben und bei 37ºC 10 Minuten lang inkubiert. Die Extinktionsänderung wurde 1 Minute lang verfolgt und die Aktivität aus der Extinktion bei 405 nm unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnet, die vom Hersteller standardisiert wurde:
Aktivität (IU; internationale Einheiten) = ΔOD x 793,65 (Verdünnungsfaktor)/Inkubationszeit x Probenvolumen

D. Beispiele

BEISPIEL 1

Gereinigter t-PA wurde verdünnt, um eine Endkonzentration von 0,2 mg/ml zu ergeben, in Aliquoten aufgeteilt und gegen die in Tabelle 1 gezeigten Puffer dialysiert. TABELLE 1 Dialysepuffer 0,01% Polysorbat 80 Dialysekonzentration Arginin (als Hydrochlorid) Natriumphosphat Natriumacetat
Nach der Dialyse wurden die Proben zentrifugiert und der Überstand in 1 ml Aliquoten lyophilisiert. Lyophilisierte Proben wurden mit Wasser rekonstituiert und auf t-PA-Aktivität im S-2288-Assay getestet. Jede rekonstituierte Probe wurde danach bei 37ºC gehalten und zu verschiedenen Zeiten getestet.
Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Figur 1 gezeigt. Wie ersichtlich, verhindern diejenigen Systeme, die kein Arginin enthalten, den Verlust der t-PA- Aktivität mit der Zeit nicht. Die t-PA-Aktivität in den Proben, die 0,2 M Arginin oder 0,2 M Arginin plus physiologische Mengen Chlorid enthalten, behält nach 4- tägiger Inkubation bei 37ºC nahezu die gesamte anfängliche t-PA-Aktivität. Diese Ergebnisse zeigen, daß 0,2 M Arginin mit oder ohne NaCl t-PA deutlich stabilisiert.

BEISPIEL 2

Die Stabilität von t-PA als Funktion der Argininkonzentration wurde durch die Messung der Verlustrate der t-PA-Aktivität bei verschiedenen Temperaturen bestimmt.

Formulierung:

1. 0,355 mg/ml t-PA
0,05M Natriumphosphat pH 6,2
0,05M Arginin als Hydrochlorid
2. 0,498 mg/ml t-PA
0,03M Natriumphosphat pH 6,2
0,2M Arginin als Hydrochlorid
0,5 ml Aliquoten von Lösung mit den obigen Formulierungen wurden steril in 2 ml Glasgefäße gefüllt und versiegelt. Die Gefäße wurden bei 250, 370 und 45ºC gehalten. Zwei Gefäße jeder Lösung wurden nach 0, 20, 55 und 160 Tagen als Proben genommen und die t-PA-Aktivität wurde unter Verwendung des S-2288-Assays gemessen. Der natürliche Logarithmus der verbleibenden Aktivität in Prozent wurde gegen die Zeit (in Tagen) für jede Temperatur aufgetragen, woraus die Geschwindigkeitskonstante mittels linearer Regressionsanalyse berechnet wurde.
Die Geschwindigkeitskonstanten (k) für den Verlust der t-PA-Stabilität bei zwei verschiedenen Argininkonzentrationen und bei verschiedenen Temperaturen sind in Tabelle 2 gezeigt. TABELLE 2 Wirkung von Arginin auf die t-PA-Stabilität Formulierung Arginin Natriumphosphat
Wie ersichtlich, ergibt 0,2 M Arginin Geschwindigkeitskonstanten, die kleiner sind als diejenigen, die in 0,05 M Arginin bei jeder der angegebenen Temperaturen erhalten werden, was anzeigt, daß eine Erhöhung der Argininkonzentration die Stabilität von t-PA erhöht.

BEISPIEL 3

Die Stabilität von t-PA ist auch von der Konzentration nicht-ionischer oberflächenaktiver Mittel abhängig. Die Daten sind in Tabelle 3 gezeigt.
t-PA wurde durch Dialyse gegen 0,01 M Natriumsuccinatpuffer bei pH 6,0 gefällt. Der t-PA-Niederschlag wurde aus der dialysierten Probe durch Zentrifugation gewonnen. Dieser Niederschlag wurde in der unten angegebenen Formulierung, die verschiedene Konzentrationen von Polysorbat 80 enthielt, wieder gelöst.

Formulierung:

0,2M Arginin als Hydrochlorid
0,02M Natriumphosphat pH 7,2
Polysorbat 80 (0,0005 bis 0,10 Prozent)
Die Lösungen wurden steril in Gefäße gefüllt und bei 35ºC und 40ºC gehalten. Zwei Gefäße wurden an jedem Zeitpunkt als Proben entnommen und die enzymatische Aktivität wurde unter Verwendung des S-2288-Assays getestet.
Die Geschwindigkeitskonstanten wurden durch lineare Regressionsanalyse des 10 g (t-PA-Aktivität) gegen die Zeitkurve für jede Temperatur berechnet und sind in Tabelle 3 gezeigt. TABELLE 3 Wirkung von Polysorbat 80 auf die t-PA-Stabilität Polysorbat 80 %
Diese Tabelle zeigt, daß mit zunehmender Konzentration an Polysorbat 80 die Geschwindigkeitskonstante (k) abnimmt. Dies zeigt an, daß mit mehr Polysorbat 80 mehr Stabilität erreicht wird.

BEISPIEL 4

t-PA-Lösungen wurden durch Dialyse von gereinigtem t-PA gegen die unten angegebene Argininiumphosphat-Pufferformulierung hergestellt, gefolgt von der Verdünnung mit weiterem Puffer zur gewünschten Endkonzentration an t-PA.

Pufferformulierung:

0,20M Arginin
0,18M Phosphorsäure
0,01% Polysorbat 80
pH 6
Aliquoten jeder Präparation wurden steril in 5 oder 10 ml Gefäße gefüllt, lyophilisiert und versiegelt. Die Gefäße wurden bei verschiedenen Temperaturen gehalten. Zwei Gefäße jeder Formulierung wurden an jedem Zeitpunkt als Proben genommen und die t-PA-Aktivität wurde durch den S-2288-Assay bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. TABELLE 4 Stabilität von t-PA in lyophilisierter Formulierung verbleibender Prozentsatz (Mittel von 2 Assays ± Standardabweichung) * Konzentration von t-PA in der Lösung vor der Lyophilisierung
Diese Daten zeigen, daß t-PA in der lyophilisierten Form stabil ist.

BEISPIEL 5

Eine Lösung, die etwa 0,3 bis 0,5 mg/ml t-PA enthielt, wurde gegen 10 mM Natriumphosphat, pH 7,5, 0,01% Polysorbat 80, verschiedene Konzentrationen von Arginin als Hydrochlorid enthaltend, dialysiert. Unlösliches Material wurde durch Zentrifugation für 2 Minuten in einer Eppendorf-Microfuge entfernt. Die Menge an t-PA, die in der Lösung verblieb, wurde im S-2288-Assay getestet. Ergebnisse sind in Figur 2 gezeigt.
Bereits 50 mM Arginin erhöhen die Löslichkeit von t-PA deutlich. (Die geringere Zunahme der scheinbaren Löslichkeit bei höheren Argininkonzentrationen ist ein Artefakt und beruht auf dem Umstand, daß die ursprüngliche Konzentration an t-PA im Ausgangsmaterial nur 0,3 bis 0,5 mg/ml betrug und so eine Grenzlöslichkeit nie erreicht wurde.

BEISPIEL 6

t-PA wurde durch Dialyse gegen 0,001M Natriumsuccinatpuffer bei pH 6 gefällt. Der resultierende Niederschlag wurde durch Zentrifugation isoliert und dann wurde eine abgemessene Menge dieses Materials in 1 ml des gewünschten Puffersystems 20 Stunden lang bei 5ºC unter Rühren äquilibriert. Die untersuchten Puffersysteme wurden durch Titration von Arginin mit Phosphorsäure hergestellt, um ein Argininiumphosphatsystem bei pH 6,0 herzustellen. Es wurden Stammlösungen mit Wasser verdünnt, um Endpufferlösungen, die 0,10 bis 0,20 M Arginin (als Argininiumion) enthielten, zu erhalten. Nach der Äquilibrierung mit dem gewünschten Puffersystem wurde die resultierende t-PA-Präparation zentrifugiert, um jegliches unlösliche Material zu entfernen, dann wurden die Überstände mit dem S-2288-Assay auf löslichen t-PA getestet.
Ergebnisse sind in Figur 3 gezeigt. Wenn der t-PA bei der Konzentration des ursprünglich zugegebenen t-PAs vollständig löslich ist, dann sollte die Konzentration des löslichen t-PA dieselbe wie die zugegebene sein. Umgekehrt, wenn der t-PA bei der Konzentration, die ursprünglich zugegeben wurde, nicht vollkommen löslich ist, dann wird die Konzentration des löslichen t-PAs geringer sein als die zugegebene. Figur 3 zeigt, daß t-PA in 100 mM Argininphosphat, pH 6,0, bis zu etwa 2 mg/ml löslich ist, und daß bei einer höheren Argininphosphat-Konzentration die Löslichkeit merklich erhöht wird. Insbesondere ist t-PA bei 200 mM Argininphosphat pH 6,0 sogar bei etwa 54 mg/ml noch vollkommen löslich und die Grenzlöslichkeit ist eindeutig wesentlich höher.

BEISPIEL 7

Das folgende Argininiumphosphat-System wurde als Vorlyophilisierungslösung hergestellt. Vorlyophilisierungslösung L-Arginin Phosphorsäure Polysorbat
Nach steriler Filtration wurden etwa 20 ml Aliquoten in 50 cm³ Gefäße gefüllt. Die Lyophilisierung wurde dann wie folgt durchgeführt:
a) Die Gefäße wurden in den Lyophilisator eingebracht und bei -50ºC (Fach- Temperatur) unter Umgebungsdruck 10 Stunden lang eingefroren.
b) Es wurde Vakuum angelegt (Kammerdruck 100 um Hg) und die Fach-Temperatur bei 10ºC/h auf +7ºC erhöht und dann bei dieser Temperatur 41 Stunden lang gehalten.
c) Die Fach-Temperatur wurde dann auf 35ºC erhöht, der Kammerdruck auf 50 um verringert und das System in diesem Zustand 14 Stunden lang gehalten. Die Gefäße wurden dann mit Stopfen versehen, der Druck wurde auf Umgebungsdruck zurückkehren gelassen und die Gefäße wurden aus dem Lyophilisator entfernt.

BEISPIEL 8

Es wurde die Wirkung von Natriumchlorid auf die Beschaffenheit von lyophilisierten Argininphosphat-Kuchen untersucht. Proben von 0,8 M Arginin (pH 7) und 0,2 M Arginin (pH 6) als die Phosphatsalze wurden so hergestellt, daß sie Konzentrationen an Natriumchlorid im Bereich von 0,01 bis 500 mM einschlossen. 2 ml Aliquoten einer jeden Lösung wurden in 10 cm Gefäße eingebracht und mit dem folgenden Zyklus lyophilisiert: Lyophilisierungsschritt Fach-Temperatur (ºC) Kammerdruck (Mikron) Zeit (Stunden) Einfrieren Primärtrocknung Sekundärtrocknung Erhöhung bei 20º/h auf -35º, dann 3ºC/h auf +35º Umgebungsdruck
Die Beschaffenheit der resultierenden Kuchen ist in Tabelle 5 gezeigt. Die Daten zeigen, daß die Bildung von pharmazeutisch verträglichen Kuchen nur bei denjenigen Zusammensetzungen erfolgt, die geringe Mengen an Natriumchlorid enthalten, und daß der tolerierte niedrige Natriumchlorid-Spiegel von der Argininkonzentration abhängig ist. TABELLE 5 Eigenschaften eines lyophilisierten Arginin-Puffersystems, das ausgewählte Natriumchlorid-Konzentrationen enthält Beschaffenheit des Kuchens Natriumchlorid mM anfangs Nach 2 Monaten bei Raumtemperatur Arginin glasige, geschrumpte Masse; kein Kuchen weißer Kuchen; leichtes Schmelzen an den Kuchenseiten weißer Kuchen; glasige Ränder leicht geschrumpft weißer Kuchen; leicht geschrumpft weißer Kuchen; sehr leicht geschrumpft körnige, geschrumpfte Masse; kein Kuchen weißer Kuchen mit glassigem Erscheinungsbild weißer Kuchen; sehr stark geschrumpft wie anfangs glasiger Film auf dem Gefäßboden; kein Kuchen glasige bis weiße Masse auf dem Gefäßboden weiße Masse im Gefäß weiter geschrumpft leichte zusätztliche Schrumpfung

Claims

für die Vertragsstaaten DE, GB, FR, IT, NL, SE, LI/CH, BE und LU

1. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend Humangewebe-Plasminogenaktivator (t-PA) und einen pharmazeutisch verträglichen Argininiumion enthaltenden Puffer, 0,001 bis 1% eines nichtionischen Detergens und gegebenenfalls Chloridion in einer Konzentration von weniger als 0,3 M.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin der Argininiumpuffer ein anderer als Argininiumchlorid ist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, worin der Puffer von Argininiumion und einem Gegenion geliefert wird, das imstande ist, die Zusammenbruchstemperatur der Zusammensetzung auf einen leicht lyophilisierbaren Zustand einzustellen.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, worin das Gegenion aus Citrat, Phosphat, Tartrat, Sulfat, Malat, Maleat und Succinat ausgewählt ist.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 3, worin das Gegenion aus Citrat und Phosphat ausgewählt ist.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 3, worin das Gegenion Phosphat ist.

7. Zusammensetzung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Humangewebe-Plasminogenaktivator eine Konzentration von mindestens 0,1 mg/ml und das Argininiumion eine Konzentration von 0,05 bis 1,0 M aufweist.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, worin der Humangewebe-Plasminogenaktivator eine Konzentration von 0,4 bis 5,0 mg/ml und das Argininiumion eine Konzentration von 0,1 bis 0, 5 M aufweist.

9. Zusammensetzung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, die einen pH-Wert von etwa 4 bis 9 aufweist.

10. Gefrorene Zusammensetzung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche.

11. Stabile lyophilisierte t-PA-Zusammensetzung, die rekonstituiert werden kann, um eine pharmazeutische Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9 zu ergeben.

12. Stabile t-PA-Zusammensetzung, wie erhältlich durch Lyophilisieren einer Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9.

13. t-PA-Zusammensetzung zur pharmazeutischen Verwendung, wie erhältlich durch die Rekonstitution einer lyophilisierten Zusammensetzung nach Anspruch 12.

14. Verfahren, welches das Lyophilisieren einer Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9 umfaßt.

15. Verfahren, welches das Rekonstituieren einer lyophilisierten Zusammensetzung nach Anspruch 11 oder 12 zur Herstellung einer t-PA-Zusammensetzung zur pharmazeutischen Verwendung umfaßt.

für die Vertragsstaaten AT, GR und ES

1. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend das Compoundieren von Humangewebe-Plasminogenaktivator (t-PA) und eines pharmazeutisch verträglichen Argininiumion enthaltenden Puffers, 0,001 bis 1% eines nicht-ionischen Detergens und gegebenenfalls Chloridion in einer Konzentration von weniger als 0,3 M.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Argininiumpuffer ein anderer als Argininiumchlorid ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin der Puffer von Argininiumion und einem Gegenion geliefert wird, das imstande ist, die Zusammenbruchstemperatur der Zusammensetzung auf einen leicht lyophilisierbaren Zustand einzustellen.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin das Gegenion aus Citrat, Phosphat, Tartrat, Sulfat, Malat, Maleat und Succinat ausgewählt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 3, worin das Gegenion aus Citrat und Phosphat ausgewählt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 3, worin das Gegenion Phosphat ist.

7. Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Humangewebe-Plasminogenaktivator eine Konzentration von mindestens 0,1 mg/ml und das Argininiumion eine Konzentration von 0,05 bis 1,0 M aufweist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin der Humangewebe-Plasminogenaktivator eine Konzentration von 0,4 bis 5,0 mg/ml und das Argininiumion eine Konzentration von 0,1 bis 0,5 M aufweist.

9. Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Zusammensetzung einen pH-Wert von etwa 4 bis 9 aufweist.

10. Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Zusammensetzung gefroren ist.

11. Verfahren, welches das Lyophilisieren einer Zusammensetzung umfaßt, wie sie nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9 erhältlich ist.

12. Verfahren, welches die Herstellung einer stabilen lyophilisierten t-PA-Zusammensetzung umfaßt die rekonstituiert werden kann, um eine pharmazeutische Zusammensetzung mit den in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9 definierten Eigenschaften zu ergeben.

13. Verfahren, welches das Rekonstituieren einer lyophilisierten Zusammensetzung nach Anspruch 11 oder 12 zur Herstellung einer t-PA-Zusammensetzung zur pharinazeutischen Verwendung umfaßt.