DE3587479T2

DE3587479T2 - Vehikel zur Verabreichung von Interferon.

Info

Publication number: DE3587479T2
Application number: DE85400189T
Authority: DE
Inventors: Leonard F Estis; Sean A Evans; Douglas Testa
Original assignee: Interferon Sciences Inc
Current assignee: Interferon Sciences Inc
Priority date: 1984-02-07
Filing date: 1985-02-05
Publication date: 1993-12-09
Anticipated expiration: 2005-02-06
Also published as: EP0152345B1; ATE91901T1; EP0152345A2; JPH075479B2; EP0152345A3; JPS60188328A; US4680175A; CA1254832A; US4911908A; DE3587479D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. Gebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf Interferon und im besonderen auf Träger zur äußerlichen und lokalen Anwendung von Interferon.

2. Stand der Technik

Im Jahre 1957 beobachteten Isaacs und Lindenmann, daß flüssige, mit einem Virus infizierte Überstände von Zellkulturen eine Aktivität zeigten, die normale Zellen gegen eine Infektion durch eine ganze Reihe unterschiedlicher Viren schützte. Diese Aktivität wurde einer Proteinverbindung zugeschrieben, die sie "Interferon" nannten. Später gelang es dann, weitere unterschiedliche Arten von Interferon, die im allgemeinen als α-, β- und γ-Interferon bezeichnet werden, nachzuweisen. Diese Interferone wirken nicht nur gegen Viren, sondern weisen auch antizelluläre, anti-tumorale und immunregulatorische Aktivitäten auf.
α-, und β-Interferon, auch als Typ I Interferon bezeichnet, werden von Viren oder künstlichen Polynukleotiden, die auf Leukozyten bzw. Fibroblasten wirken, induziert. γ-Interferon, auch als Immun-Interferon oder Typ II Interferon bezeichnet, wird in stimulierten Lymphozyten durch spezifische Antigene induziert oder in nicht stimulierten Lymphozyten durch T-Zellen Mitogene. Die oben genannten Interferone sind äußerst schwer bis zur Homogenität zu reinigen und werden daher oft in ungereinigten oder nur teilweise gereinigten Verbindungen verwendet. Allgemeine Beschreibungen von Interferon finden sich in verschienen Texten und Abhandlungen, zum Beispiel The Interferon System, W.E. Stewart, II, Springer Verlag, New York (1979), Interferon 1981, Vol. 3, Ion Gresser (Hrsg.), Academic Press, New York (1981) und Interferon Therapy, World Health Organization Technical Reports Series 676, World Health Organization, Geneva, 1982.
Seit mehr als zehn Jahren werden die verschiedenen Arten von Interferon in klinischen Versuchen eingesetzt. Ursprünglich wurden sie gegen Viruspathogene eingesetzt, später jedoch wurden damit auch verschiedene andere maligne Erkrankungen behandelt. Ein wichtiger Aspekt bei der klinischen Anwendung von Interferon ist die Art der Verabreichung. Systemische Verabreichung durch intravenöse oder intramuskuläre Injektion ist die am häufigsten angewendete Form. Mit ihr konnten auch einige Erfolge erzielt werden. Problematisch bei dieser Art der Verabreichung ist unter anderem, daß das Interferon mit nicht infizierten oder nicht malignen Zellen in Kontakt kommen kann und so zu unerwünschten Nebenwirkungen führen kann. Die bevorzugte Form der Verabreichung ist folglich, Interferon direkt auf die befallenen Gewebsstellen oder Organe aufzutragen. In einigen Fällen ist dies auch durch direktes Injizieren an der befallenen Stelle möglich. In anderen Fällen, wie z. B. bei Augenerkrankungen oder Erkrankungen wie Herpes genitalis, Herpes labialis, Herpes zoster oder durch Adenoviren hervorgerufene Keratitis und Kondylome, bei denen auch die Haut betroffen ist, ist die lokale äußerliche Anwendung die bevorzugte Form der Verabreichung. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die letztgenannte Art der lokalen Verabreichung.
Die äußerliche Anwendung von Interferon stellte sich aus mehreren Gründen als ganz besonderes Problem heraus. Erstens handelt es sich bei Interferon um ein Protein, dessen Molekulargewicht größer ist als das der meisten anderen äußerlich verabreichten Therapeutika, z. B. Prokain, Nitroglyzerin usw. Im allgemeinen haben Proteine mit einem größeren Molekulargewicht einen viel kleineren Diffusionskoeffizienten für Lösungen als Stoffe mit einem niedrigen Molekulargewicht. Dieser Unterschied tritt bei halbfesten Medien dann meist sogar noch verstärkt zutage. Der zur lokalen Verabreichung des Interferons verwendete Träger muß zum einen also in der Lage sein, das hochmolekulare Interferon während Verpackung, Transport und Anwendung in Suspension zu halten und zum anderen es nach Verabreichung innerhalb eines gewissen Zeitraumes freizusetzen. Zweitens darf der Träger die Aktivität des Interferons nicht durch direkte chemische Einwirkung, Ausfällung oder Immobilisierung beeinträchtigen, da dies eine Wechselwirkung zwischen Interferon und erkrankter Stelle verhindern würde.
Drittens, und dies ist das weitaus schwierigste Problem, sollte der Träger sicherstellen, daß das Interferonpräparat bei Raum- und Körpertemperatur eine ausreichende Lebensdauer besitzt, damit Transport, Handling und Verabreichung an den Patienten problemlos möglich sind. Bei einem Therapeutikum zur lokalen Verabreichung, sollten das Mittel und sein Träger bezüglich der Lebensdauer folgende, allgemeinen Bedingungen erfüllen: 1. bei Raumtemperatur (22ºC) sollte ein maßgeblicher Teil der therapeutischen Wirkung des Mittels über einen Zeitraum von vierzehn Tagen erhalten bleiben; 2. bei Körpertemperatur (37ºC) sollte das Mittel einen maßgeblichen Teil seiner Aktivität über einen Zeitraum von ungefähr einem Tag beibehalten. Der Zeitraum von vierzehn Tagen bei Raumtemperatur ist notwendig zum Transport, Handling und Verkauf des Präparates. Der Zeitraum von einem Tag erlaubt dem Patienten, das Präparat mit sich zuführen, um es im Laufe eines Tages bei Bedarf anzuwenden.
Interferone, die durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt wurden oder solche, die aus natürlichen Quellen stammen und in ungereinigtem oder nur teilweise gereinigtem Zustand vorliegen, sind nicht sehr temperaturbeständig. Moller et al., zum Beispiel, berichteten beim Dritten Jährlichen Internationalen Kongreß der Interferonforschung, daß sich bei Interferongel aus menschlichen Leukozyten bei 4ºC innerhalb von nur zwei Wochen ein 80%iger Aktivitätsverlust einstellte. (Moller B.R., Johannesen P., Osther K., Ulmsteen U., Hastrup J. und Berg K. "Initial Evaluation of Topical Treatment of Dysplasia of the Cervical Epithelium with Human Leukocyte Interferon Gel", Third Annual International Congress for Interferon Research, 1982). Dies ist weit entfernt von einer Stabilität von vierzehn Tagen bei 22ºC und einem Tag bei 37ºC, die ein Interferonpräparat aufweisen sollte, um die handelsüblichen Bedingungen zu erfüllen. In gegenwärtig zur Verfügung stehender Literatur ist zu lesen, daß selbst hoch gereinigte Interferone, im besonderen hoch gereinigtes γ-Interferon, temperaturunbeständig sind. Im Hinblick auf diesen Stand der Technik ist es offensichtlich, daß ein Träger zur lokalen Verabreichung von Interferon im Sinne eines therapeutisch stabilen Präparates hohe Ansprüche erfüllen muß.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die im Stand der Technik dargestellten, sich im Zusammenhang mit Trägern zur äußerlichen Verabreichung von Interferon ergebenden Probleme zu eliminieren. Im besonderen ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Träger zur äußerlichen Anwendung von Interferon anzugeben, die hochmolekulares Interferon während des Verpackens, Transportes und während seiner Anwendung in Suspension halten und dennoch in der Lage sind, das aktive Interferon am Krankheitsherd schnell freizusetzen. Im weiteren ist es Aufgabe der Erfindung, Träger zur Verabreichung von Interferon anzugeben, welche die Aktivität des Interferons durch chemische Einwirkungen, Ausfällungen, Immobilisierung oder anderer Mechanismen während der Herstellung des Präparates und danach nicht maßgeblich beeinträchtigen. Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, einen Träger zur Verabreichung von Interferon anzugeben, bei dem das Interferon bei Raum- ebenso wie bei Körpertemperatur eine verlängerte Lebensdauer aufweist. Im besonderen ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Träger zur Verabreichung von Interferon anzugeben, bei denen das Interferon bei Raumtemperatur einen maßgeblichen Teil seiner biologischen Aktivität über einen Zeitraum von vierzehn Tagen oder länger und bei Körpertemperatur über einen Zeitraum von einem Tag oder länger beibehält.
Die vorstehenden Aufgaben werden erfindungsgemäß durch ein äußerlich anzuwendendes Interferonpräparat gelöst, welches eine therapeutisch wirksame Menge eines oder mehrerer Interferone umfaßt, eine mit dem einem oder mehreren zu verabreichenden Interferonen kompatible Trägergrundlage, dann eine wirksame Menge eines Proteasenhemmers, der dem Zweck dient, die Geschwindigkeit des durch proteolytische Wirkstoffe hervorgerufenen Zerfalls der biologischen Aktivität des oder der Interferone herabzusetzen. Gemäß bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung wählt man den Proteasenhemmer aus der Gruppe bestehend aus α&sub1;- Antitrypsinhemmer, α&sub2;-Makroglobulin, Sojabohnenhemmer, Nahtosyl-L-lysinchlormethyl-keton, Phenylmethylsulfonylfluoride, Nα-tosylphenylalaninchlor-methylketon oder daraus bestehende Gemische. Ein besonders bevorzugter Proteasenhemmer ist humaner α&sub1;-Antitrypsinhemmer. Gemäß anderen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung enthält das Interferonpräparat eine wirksame Menge eines oder mehrerer Konservierungsmittel, um den durch Bakterien hervorgerufenen Aktivitätsverfall des Interferons zu verhindern.
Falls der Träger in Salbenform, z. B. als Paste, Creme, Gel o. ä. vorliegt, sind bevorzugte Trägergrundlagen solche, die Hydroxyethylzellulose enthalten oder aus einer Mischung von Polyethylenglykolen hergestellt sind. Die auf Hydroxylethyl-zellulose basierenden Grundlagen ergeben besonders hohe Interferontiter. Überdies weisen die auf diesen Grundlagen hergestellten Interferonpräparate eine einheitliche Konsistenz und ein angenehmes Aussehen auf und sind auch angenehm aufzutragen.
Für Trägergrundlagen, die mit Polyethylenglykolen hergestellt sind, umfaßt ein bevorzugtes Herstellungverfahren für ein fertiges Präparat mehrere Schritte, nämlich das Erhitzen der Polyethylenglykole auf ungefähr 45ºC, das Erhitzen des oder der Interferone auf eine ähnliche Temperatur, das Mischen des erhitzten Polyethylengklykols mit dem erhitzen Interferon und das Abkühlen der sich ergebenden Mischung auf Raumtemperatur oder darunter. Es zeigte sich, daß die auf diese Weise hergestellten Interferonpräprate einheitlich und homogen sind, und sich eine hohe Interferonaktivität einstellt, obwohl das Verfahren ein Erhitzen des Interferons auf relativ hohe Temperaturen erfordert.

BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG

Fig. 1 zeigt das Lagerverhalten von α-Interferonpräparaten bei -20ºC, wobei einige auf 45ºC erhitzt worden waren und andere nicht.
Fig. 2 zeigt die Wirkung von 0 mg/ml (Diagramm A), 1 mg/ml (Diagramm B) und 10 mg/ml (Diagram C) von Sojabohnenhemmer auf ein flüssiges Interferonpräparat, das bei 22ºC gelagert wurde.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Wie schon weiter oben erwähnt, bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Träger zur äußeren Anwendung von Interferon.
Die Erfindung ist bei allen Arten von Interferon anwendbar, d. h. bei natürlichen Interferonen und solchen, die durch rekombinante DNA-Technik hergestellt wurden, ebenso wie bei chemisch synthetisierten Interferonen. Die Erfindung ist auch bei ungereinigten, teilweise gereinigten und gereinigten Interferonen anwendbar.
Beispiele bekannter Arten von Interferon, bei denen auch die Erfindung Anwendung findet, sind α-, β- und γ-Interferon menschlichen oder tierischen Ursprungs. Jede dieser drei Arten von Interferon kann durch eine Reihe verschiedener Techniken gewonnen werden. Eine Methode zum Herstellen von α-Interferon wurde zum Beispiel von Cantell et al. in Methods in Enzymology, Vol. 78, Seiten 293-38 (1981), beschrieben. Ähnliche Darstellungen zur Herstellungen von β-Interferon wurden von Leong und Horoszewicz in Methods in Enzymology, Vol. 78, Seiten 87-101 (1981) und von Van Damme und Billiau in Methods in Enzymology, Vol. 78, Seiten 101-119 (1981) beschrieben. Johnson et al. beschreiben in Methods in Enzymology, Vol. 78, Seiten 158-162 (1981) ein Verfahren zur Herstellung von γ-Interferon. Die am 2. Dezember 1982 von der Anmelderin der vorliegenden Anmeldung eingereichte US-Patentanmeldung Nr. 446,160 beschreibt ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von γ-Interferon.
Im allgemeinen liegt das nach diesen oder anderen Verfahren hergestellte Interferon in flüssiger Form vor. Eine solche Flüssigkeit, sofern sie als Verbindung eines Trägers zur äußeren Anwendung der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wird im folgenden als "Interferon-Ausgangsflüssigkeit" bezeichnet.
Die Menge an Interferon, die in einem speziellen Fall äußerlich verabreicht wird, und die Häufigkeit der Verabreichung hängen von verschiedenen Faktoren ab. So zum Beispiel von der Art des verwendeten Interferons, der Reaktion des Patienten auf die Interferonbehandlung und ob das verwendete Präparat in halbfester (z. B. Salbe) oder flüssiger Form (z. B. Augen- oder Nasentropfen, Spray oder Spülung) vorliegt.
Für α- und β-Interferon wurden von den US-Gesundheitsbehörden (National Institutes of Health) (United States Department of Health and Human Services, Bethesda, Maryland) Einheiten und ihre Stärke festgelegt. Dosierungen in diesen Einheiten für Salbenpräparate mit ungereinigtem oder teilweise gereinigten natürlichen Interferonen liegen für Salben zwischen ungefähr 10.000 NIH Einheiten/Gramm und 1.000.000 NIH Einheiten/Gramm, während die Dosierung für gereinigte natürliche und rekombinierte DNA Interferone bis zu 50.000.000 NIH Einheiten/Gramm erreichen kann. Die bevorzugte Dosierung für α- und β-Interferone in Salbenform liegt im allgemeinen zwischen 25.000 und 500.000 NIH Einheiten/Gramm.
Die problemlos festzulegenden Dosierungen für Flüssigpräparate sind in Abhängigkeit zum Ausgangsstoff des verwendeten Interferons ähnlich variabel. Die Stärke einer aus ungereinigtem oder teilweise gereinigtem natürlichem α- oder β-Interferon bestehenden Formulierung liegt zwischen ungefähr 25.000 und 2.000.000 NIH Einheiten/ml Präparat, wobei eine besonders bevorzugte Dosierung zwischen ungefähr 100.000 und 1.000.000 NIH Einheiten/ml liegt. Höhere Dosierungen, z. B. 50.000.000 NIH Einheiten/ml mit gereinigten natürlichen und rekombinierten DNA Interferonen sind bei Bedarf ohne weiteres möglich.
Für γ-Interferon wurden bisher noch keine Einheiten festgelegt. Im Handel wird γ-Interferon von verschiedenen Herstellern, z. B. Interferon Sciences, Inc. (New Brunswick, New Jersey), die Anmelderin der vorliegenden Anmeldung und Meloy Laboratories (Springfield, Virginia) angeboten. Die Stärke dieser freiverkäuflichen Präparate wird in Einheiten angegeben, welche vom Hersteller erstellt wurden. Diese Einheiten für γ-Interferonpräparate in Salben- oder flüssiger Form enthalten ungefähr die oben angegebenen Konzentrationenen an α- und β-Interferon.
Die vorliegende Erfindung ist nicht nur auf die Verabreichung eines einzigen Interferons anwendbar, sondern auch auf Interferonmischungen, z. B. verschiedene Arten von Interferonen, Interferone unterschiedlicher Herkunft, sowie Interferone, die auf verschiedene Art und Weise hergestellt wurden. So ist zum Beispiel bekannt, daß α- und γ-Interferone, ebenso wie andere Interferonkombinationen, z. B. Mischungen verschiedener genetisch hergestellter α-Interferone synergistische Effekte haben können. Die vorliegende Erfindungen umfaßt im besonderen die äußerlich Anwendung solcher synergistischen Kombinationen.
Die in der vorliegenden Erfindung zur Anwendung gelangende Trägergrundlage muß folgende Kriterien gleichzeitig erfüllen: 1. die Trägergrundlage muß in der Lage sein, ein bzw. mehrere hochmolekulare Interferone in Suspension halten zu können und dennoch das bzw. die Interferone an der erkrankten Stelle freizusetzen; 2. die Trägergrundlage muß mit dem oder den zu verabreichenden Interferonen kompatibel sein, so daß die Aktivität des Interferons nicht beeinträchtigt wird; 3. die Trägergrundlage muß für den Patienten verträglich sein, d. h. sie sollte keine Reizungen erzeugen, nicht-toxisch sein und sollte bezüglich Geruch, Farbe und Struktur entsprechend gestaltet sein; 4. die Trägergrundlage sollte geeignete rheologische Eigenschaften aufweisen, so daß sie einfach herzustellen ist und in Gefäße aufgeteilt werden kann und ebenso einfach vom Patienten auf die erkrankte Stelle aufgetragen werden kann.
Für Träger in Salbenform können im Rahmen der vorliegenden Erfindung unterschiedliche Grundlagen, z. B. wasserlösliche und wasserunlösliche Grundlagen, verwendet werden. Im allgemeinen werden wasserlösliche Grundlagen, z. B. Glykolether, Zellulosen und Polyoxystearat, aufgrund des proteinhaften Charakters des Interferons bevorzugt.
Eine besonders bevorzugte wasserlösliche Grundlage zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfaßt eine Mischung aus einem oder mehreren Polyethylenglykolen. Durch Kombinieren von Polyethylenglykolen mit unterschiedlichen Molekulargewichten, z. B. Polyethylenglykole mit Molekulargewichten zwischen 300 und 20.000, ergibt sich für diese Art eine breitgefächerte Viskosität und Fähigkeit zur wäßrigen Lösung (15-25%). Eine solche Formulierung umfaßt eine 60 : 40 Mischung eines Polyethylenglykols mit einem Molekulargewicht von 400 und einem weiteren von 3.350. Mit dieser Mischung erhält man eine besonders geeignete Trägergrundlage zur Verabreichung von Interferon.
Die Verwendung dieser Polyethylenglykol enthaltenden Grundlagen zusammen mit Interferonen erfordert beim Einbringen des Interferon in die Trägergrundlage einen besonderen Umgang mit den Substanzen. Bei Raumtemperatur und darunter liegen die erfindungsgemäß verwendeten unterschiedlichen Polyethylenglykolgemische eher in Form halbfester Pasten vor als in flüssiger Form. Im Gegensatz dazu liegen Interferone, wie schon weiter oben erwähnt wurde, normalerweise in flüssiger Form vor. Die beiden Komponenten können zwar auf mechanische Weise vermischt werden, bei einem solchen Mischvorgang entsteht jedoch oft eine nicht homogene Salbe, und das Interferon kann denaturieren. Es hat sich erfindungsgemäß herausgestellt, daß man eine hochwertige Salbe auf Polyethylenglykolbasis dadurch erhält, indem man das Interferon und das Polyethylenglykol kombiniert, nachdem beide Teile auf eine erhöhte Temperatur, z. B. 45ºC, erhitzt wurden. Dies wird auch im folgenden näher beschrieben. Es hat sich hierbei überraschend gezeigt, daß das Interferon bei diesem Verfahren keine maßgeblichen Deaktivierung erfährt, obwohl aufgrund des proteinhaften Charakters des Interferons eine Hitzeempfindlichkeit zu erwarten wäre.
Um die Konsistenz des fertigen Präparates für die Anwendung auf die erkrankte Stelle innerhalb eines angemessenen Rahmens zu halten, hat sich herausgestellt, daß sich die Menge an Interferon-Ausgangsflüssigkeit, z. B. die oben beschriebene 60 : 40 Grundlage, in einem Bereich zwischen 0,01 und 0,25 ml/g Grundlage, bevorzugt jedoch in einem Bereich zwischen 0,05 und 0,15 ml/g Grundlage bewegen sollte.
Bei einer weiteren besonders bevorzugten wasserlöslichen Trägergrundlage für die vorliegende Erfindung verwendet man Hydroxyethylzellulose als Verdickungsmittel für Salbe. Dieses Verdickungsmittel ist bei der Herstellung einer Interferonsalbe besonders nützlich, da es nicht zu einer sofortigen vollständigen Verdickung der Salbe führt, sondern diese erst nach ungefähr 2 bis 4 Stunden einsetzt. Das Interferon kann folglich mit der Hydroxyethylzellulose enthaltenden Trägergrundlage vermischt werden, während die Grundlage noch eine relativ niedrige, fast flüssige Viskosität aufweist. Da Interferone, wie schon erwähnt normalerweise in flüssiger Form vorliegen, ist es dadurch einfacher eine homogene Mischung herzustellen. Weiter hat sich herausgestellt, daß die Hydroxyethylzellulose enthaltenden Trägergrundlagen, nach ihrer vollständigen Umwandlung in ein Gel, dem Präparat ein gefälliges Aussehen verleihen und dieses angenehm aufzutragen ist. Überdies stellte sich überraschend heraus, daß Interferonpräparate mit dieser Trägergrundlage besonders hohe Titer haben.
Eine bevorzugte auf Hydroxythylzellulose basierende Salbengrundlage enthält ungefähr zwischen 1 und 5 Gewichtsprozent Hydroxyethylzellulose mit einer Viskosität von z. B. 2.200 mPas, zwischen 10 und 50 Gewichtsprozent Glyzerin und zwischen 49 und 85 Gewichtsprozent Wasser. Bevorzugt werden dieser Trägergrundlage pro 100 g Grundlage zwischen 10 und 30 ml Interferon-Ausgangsflüssigkeit zugesetzt. Eine besonders bevorzugte Trägergrundlage auf Hydroxyethylzellulosebasis enthält zwischen 2 und 3 Gewichtsprozent Hydroxyethylzellulose (Viskosität 2.200 mPas), zwischen 20 und 38 Gewichtsprozent Glyzerin und zwischen 60 und 78 Gewichtsprozent Wasser. Bei Verwendung dieser Grundlage kommen ungefähr 15 bis 20 ml Interferon-Ausgangsflüssigkeit auf 100 g Grundlage. Für Interferon-Ausgangsflüssigkeiten mit niedrigen Titern, kann die in der Ausgangsflüssigkeit verwendete Menge an Wasser verringert und höhere Mengen an Ausgangsflüssigkeit können der Grundlage zugesetzt werden. Auf diese Weise können die Titer des fertigen Präparates eingestellt werden, ohne dessen rheologischen Eigenschaften zu beeinträchtigen. Anstelle von Glyzerin kann die Hydroxyethylzellulose enthaltende Trägergrundlage auch Polysorbat oder andere ähnliche feuchtigketiserhaltende Mittel enthalten. Anstelle von Hydroxyethylzellulose können auch andere Zellulosen oder deren Derivate, z. B. Methylzellulose, Carboxymethylzellulose und Hydroxypropylzellulose, verwendet werden.
Bei auf Flüssigkeit basierenden Trägern, z. B. Tropfen, Sprays oder Spülungen, enthält die Trägergrundlage eine nicht reizende Flüssigkeit, die mit dem oder den zu verabreichenden Interferonen kompatibel ist. Im allgemeinen werden aufgrund des proteinhaften Charakters des Interferons wäßrige Lösungen bevorzugt. Bevorzugte flüssige Trägergrundlagen sind physiologische Kochsalzlösung, 5-50% Glyzerin in Wasser und 5-50% D-Sorbit in Wasser. Von den vorstehenden Grundlagen ist die physiologische Kochsalzlösung ganz besonders bevorzugt, da sie isotonisch ist und bei den meisten Patienten keine Reizungen auslöst.
Um die Benetzbarkeit der Trägergrundlage zu erhöhen, können bekannte Benetzungsmittel, wie z. B. ein Polysorbattensid, eingesetzt werden. Ebenso kann auch die Viskosität des Präparates mit Hilfe verschiedener, bekannter Mittel, z. B. Polyvinylalkohol, verändert werden.
Wie schon weiter oben ausgeführt, liegen die Interferondosierungen für flüssige Trägergrundlagen je nach Herkunft des verwendeten Interferons zwischen 25.000 und 50.000.000 Einheiten/ml. Der Fachmann wird erkennen, daß die genannten Dosierungen, ebenso wie jede andere gewünschte Dosierung, in einfacher Weise durch Verändern der relativen Mengen an Interferon-Ausgangsflüssigkeit und Trägergrundlage erreicht werden können.
Zusätzlich zu einer Interferonkomponente und einer Trägergrundlagenkomponente, kann das erfindungsgemäße Präparat zur äußeren Anwendung auch einen oder mehrere Proteasenhemmer enthalten. Diese Inhibitoren werden zugesetzt, um den durch proteolytische Substanzen, die in ungereinigten oder teilweise gereinigten Präparaten vorhandenen sind, verursachten Zerfall der biologischen Aktivität der Interferonverbindung aufzuhalten. Erfindungsgemäß hat sich herausgestellt, daß die Hauptursache des Aktivitätszerfalls in äußerlich anzuwendenden Präparaten die Verdauung von Interferon durch proteolytische Enzyme ist, die dem Präparat zusammen mit der Interferon-Ausgangsflüssigkeit zugeführt werden. Dies gilt vor allem bei erhöhten Temperaturen, z. B. Raum- oder Körpertemperaturen. Wenn diese Störenzyme in das Präparat gelangt sind, führt das nach einer gewissen Zeit zur Aufhebung der therapeutischen Wirkung des Interferons.
Die in Interferon-Ausgangsflüssigkeiten vorhandenen proteolytischen Enzyme stammen aus menschlichem Serum, Leukozyten oder anderen biologischen Materialien zur Herstellung von Interferon und möglicherweise auch von kontaminierenden Mikroorganismen. Typische Vertreter dieser Enzyme sind "Serin" Proteasen, die an ihrer aktiven Stelle einen kritischen Serinrest aufweisen. Solche proteolytischen Enzyme sind z. B. Trypsin, Plasmin, Thrombin, Leukozytenelastase, Kallikrein und Cathepsin. In einigen Fällen (z. B. Plasmin und Thrombin) könnte es sein, daß die Interferon-Ausgangsflüssigkeit nicht das aktive proteolytische Enzym selbst enthält, sondern einen inaktiven Vorläufer, der allmählich, besonders bei erhöhten Temperaturen, in die aktive Form umgewandelt wird.
Um die Wirkung dieser proteolytischen Enzyme zu begrenzen, enthalten die erfindungsgemäßen topischen Präparate einen oder mehrere Proteasenhemmer, die mit den proteolytischen Enzymen zusammenwirken und den Verdauungsvorgang und damit das Inaktivieren des Interferons in der Interferon-Ausgangsflüssigkeit verhindern.
Bei der Anwendung der vorliegenden Erfindung können verschiedene proteolytische Hemmer menschlicher, tierischer oder pflanzlicher Herkunft benutzt werden. Da die Proteasenhemmer und die aktiven Stellen der in der Interferon-Ausgangsflüssigkeit üblicherweise vorhandenen proteolytischen Enzyme äußerst geschützt sind, muß der Remmer nicht unbedingt aus derselben Art wie das proteolytische Enzym stammen, sondern kann auch aus einer anderen Art stammen oder sogar pflanzlicher Herkunft sein. Sojabohnen-Trypsinhemmer (im weiteren als "Sojabohnenhemmer" oder "STI" bezeichnet) ist zum Beispiel in der Lage, Trypsin aus ganz verschiedene Quellen, wie z. B. Menschen, Kühen, Lachsen, Stechrochen, Barrakudas und Truthähnen, zu hemmen. Zusätzlich zur Hemmung von Trypsin, kann STI auch Chymotrypsin von Rindern und Hühnern, menschliches Plasmin, menschliches Kallikrein und Kokonase hemmen, und es blockiert die Umwandlung von Prothrombin zu Thrombin.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugte Proteasenhemmer sind STI, α&sub1;-Antitrypsinhemmer (im weiteren als "α&sub1;-AT" bezeichnet), Nah Tosyl-L-lysinchlormethylketon (im weiteren als "TLCK" bezeichnet), Phenylmethylsulfonylfluoride (im weiteren als "PMSF" bezeichnet), Nα-Tosylphenylalaninchlormethylketon (im weiteren als "TPCK" bezeichnet), α&sub2;-Makroglobulin und damit hergestellte Gemische. Von den vorstehend genannten Inhibitoren ist STI aufgrund seiner geringen Kosten als besonders bevorzugt zu nennen und α&sub1;-AT gilt als ganz besonders bevorzugt, da es kaum allergische Reaktionen hervorruft, vor allem, wenn es aus Humanserum gewonnen wurde. Eine geeignete Technik zum Reinigen von menschlichem α&sub1;-AT wurde von J. Travis und D. Johnson in Methods in Enzymology, Vol. 80, Seiten 754-765 beschrieben, wobei relevante Stellen hier zitiert werden. Die anderen aufgeführten bevorzugten Proteasenhemmer sind im Handel erhältlich, so zum Beispiel von Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri (STI, TLCK und PMSF), Chemical Dynamics Corp., South Plainfield, New Jersey (TPCK) und Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana (α&sub2;-Makroglobulin).
Die in dem Präparat zur äußeren Anwendung enthaltene Menge an Proteasenhemmer hängt von der Menge und der Art des in der Interferon-Ausgangsflüssigkeit vorhandenen proteolytischen Enzyms und dem jeweiligen Hemmstoff ab. So enthält zum Beispiel das von Interferon Sciences, Inc. (New Brunswick, New Jersey, Bestell Nr. 1100) verkaufte ungereinigte α-Tnterferon (im weiteren als "ungereinigte, konzentrierte α-Interferon-Ausgangsflüssigkeit" bezeichnet), welches wie in Beispiel 1 beschrieben konzentriert wurde, normalerweise ungefähr 100 mg Protein pro Milliliter Flüssigkeit. Von diesen 100 Milligramm sind etwa 1% proteolytische Enzyme, meist solche, die auch in menschlichem Plasma vorkommen (z. B. Thrombin, Plasmin, etc.). Diese Enzyme haben ein Molekulargewicht zwischen 25.000 und 100.000 Dalton. Im Vergleich dazu hat STI z. B. ein Molekulargewicht von ungefähr 20.000 Dalton. Da dieser Inhibitor mit seinen proteolytischen Targetproteinen im allgemeinen einen 1 : 1 Komplex bildet, kann durch Zusetzen von 1 mg Inhibitor pro Milliliter Interferon-Ausgangsflüssigkeit ein entsprechender mehrfacher molarer Überschuß an Inhibitor produziert werden. Wie in den weiter unten aufgeführten Beispielen 5 und 6 beschrieben wird stellte sich heraus, daß ein STI-Gehalt in der Größenordnung von 0,25 mg/ml ungereinigter, konzentrierter α-Interferon Ausgangsflüssigkeit genügt, um eine verlängerte Halbwertzeit des Interferon, besonders bei erhöhten Temperaturen, z. B. 37ºC, sicherzustellen. Da diese besondere Interferon-Ausgangsflüssigkeit eine Aktivität von ungefähr 2 · 106 Einheiten/ml aufweist, und da die bevorzugte Anzahl an Einheiten zwischen 25.000 und 500.000 Einheiten pro Gramm Salbe beträgt, müssen zwischen 0,003 und 0,06 mg Inhibitor pro Gramm Salbe zugesetzt werden ([25.000 Einheiten/g] / [2 · 10&sup6; Einheiten/ml] · [0,25 mg/ml] = 0,003 mg/gm; [500.000 Einheiten/g] / [2 · 10&sup6; Einheiten/ml] · [0,25 mg/ml] = 0,06 mg/gm). In ähnlicher Weise werden einem flüssigen Präparat, das auf dieser ausgewählten Interferon-Ausgangsflüssigkeit beruht, und eine Stärke zwischen 200.000 und 2.000.000 Einheiten pro Milliliter Präparat aufweist, zwischen 0,025 und 0,25 mg dieses Inhibitors pro Milliliter Lösung zugesetzt ([200.000 Einheiten/ml] / [2 · 106 Einheiten/ml] · [0,25 mg/ml] = 0,025 mg/ml; [2.000.000 Einheiten/ml] / [2 · 10&sup6; Einheiten/ml] · [0,25 mg/ml] = 0,25 mg/ml).
Der Durchschnittsfachmann auf diesem Gebiet wird erkennen, daß zur Bestimmung geeigneter Mengen eines anderen Inhibitors und einer anderen Interferon-Ausgangsflüssigkeit ein Verfahren angewendet werden kann, welches dem oben beschriebenen entspricht.
Zusätzlich zu einem oder mehreren Interferonen und einer Trägergrundlage kann das erfindungsgemäße Interferonpräparat wahlweise auch verschiedene andere Komponenten umfassen. So ist es zum Beispiel im allgemeinen wünschenswert, dem Präparat ein oder mehrere Konservierungsmittel zuzusetzen, um damit Bakterienwachstum zu verhindern. Mögliche mit Interferon kompatible Konservierungsmittel sind zum Beispiel Benzalkoniumchlorid sowie Methyl- und Propylparabene. Das Präparat kann außerdem zu dem oder den Interferonen auch Therapeutika enthalten, die keine Interferone sind. Andere frei wählbare Komponenten, die dem Präparat zugesetzt werden können, sind zum Beispiel Färbemittel und Proteinstabilisatoren wie zum Beispiel Glyzerin, Saccharose, D-Sorbit und D-Mannit.
Die vorliegende Erfindung wird in den Beispielen 4 bis 6 näher beschrieben. Einige der Beispiele erwähnen Aktivitäten von Interferon enthaltenden Salben. Diese Aktivitäten wurden wie folgt bestimmt. Zuerst wurde eine abgemessene Menge an Salbe in einen geeigneten Behälter, z. B. ein Zentrifugierröhrchen gegeben, dann wurde eine abgemessene Menge, z. B. 50 ml einer 4ºC warmen, sterilen mit Phosphat gepufferten Kochsalzlösung (pH 7,4) zugesetzt. Der Behälter wurde dann zentrifugiert und bei 4ºC gelagert, bis die Salbenprobe sich in der Phosphat gepufferten Kochsalzlösung gelöst hatte. Die Berechnung von Titern erfolgte dann mit Proben der Salbe enthaltenden, Phosphat gepufferten Kochsalzlösung bei einer Verdünnung von 0 und 1/10. Bei Bestimmung der prozentualen Aktivität wurden die Daten bestimmt, indem die gemessenen Titer mit den für das ursprünglich bei der Herstellung der Salbe verwendete Interferon zu erwarteten Titern verglichen wurden, wobei von einer einheitliche Verteilung des Interferons in der Salbe ausgegangen wurde und ein Verdünnungsfaktor verwendet wurde, der der Interferonkonzentration in der Salbe und der durch das Zusetzen der Phosphat gepufferten Kochsalzlösung entstandenen Verdünnung entsprach. Bei Bestimmung der Halbwertzeit wurden die Daten mit Hilfe der Zerfallskonstanten aus einer linearen Mindestquadraten-Regressionsanalyse des Logarithmus der prozentualen theoretischen Aktivität im Verhältnis zur Zeit berechnet.

Beispiel 1

Herstellen einer ungereinigten konzentrierten α-Interferon-Ausgangsflüssigkeit

Ungereinigte konzentrierte α-Interferon-Ausgangsflüssigkeit wurde wie folgt aus natürlichem ungereinigtem α-Interferon der Interferon Sciences, Inc. (New Brunswick, New Jersey, Best. Nr. 1100) hergestellt. Der pH-Wert dieses handelsüblichen Produktes wurde geprüft und, falls notwendig, mit Natriumhydroxid auf 7,0 - 7,2 eingestellt. Das so eingestellte Material wurde mit Hilfe eines hohlen Fiberfilters, dessen Cutoff bei einem Molekulargewicht von 10.000 lag, konzentriert und mit 20 psi gefiltert bis das Volumen des Produktes auf 1/50 des Anfangsvolumens geschrumpft war. Das konzentrierte Produkt wurde dann durch Zentrifugieren bei 18-20.000 · g aufgehellt und dann steril gefiltert.

Beispiel 2

Herstellung einer Interferon Stocklösung

Es wurde eine Interferonstocklösung mit der folgenden Zusammensetzung hergestellt:
Volumen %
10X Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung 10,0
10% Polyvinylalkohol 10,0
3% Polysorbat 80 10.0
0,5% Benzalkoniumchlorid 2.0
Ungereinigtes konzentriertes α-Interferon (Beispiel 1) 68.0
Die 10X Phosphat gepufferte Kochsalzlösung wurde hergestellt, indem Natriumchlorid (1,5 M), Kaliumchlorid (70 mM) und einbasisches Kaliumphosphat (200 mM) in gereinigtem Wasser gelöst wurden. Der pH Wert der Lösung wurde mit konzentriertem Natriumhydroxid auf 7,4 ± 0,2 eingestellt und die fertige Lösung wurde steril gefiltert.
Die 10% Polyvinylalkohollösung wurde hergestellt, indem gereinigtes Wasser mit Polyvinylalkohol mit einem Molekulargewicht von 10.000 (Aldrich, Milwaukee, Wisconsin) gemischt wurde. Da eine 10% Polyvinylalkohollösung mit einem solchen Gewicht nicht steril gefiltert werden kann, wurde die Lösung hergestellt, indem man zwei Drittel des Gesamtvolumens an gereinigtem Wasser mit dem Polyvinylalkohol mischte, diese Mischung in einem Autoklaven sterilisierte und dann das verbleibende eine Drittel des gereinigten, steril gefilterten Wassers zusetzte.
Die Polysorbat 80 Lösung wurde hergestellt, indem man Tween 80 (Sigma, St. Louis, Mo.) mit gereinigtem Wasser mischte und die fertige Lösung steril filterte. Die 0,5% Benzalkoniumchloridlösung wurde in ähnlicher Weise durch Mischen mit gereinigtem Wasser und sterilem Filtern der fertigen Lösung hergestellt.
Die fertige Interferonstocklösung wurde in einfacher Weise hergestellt, indem man die Einzelkomponenten unter einer Haube in steriler Umgebung mischte und die sich ergebende Lösung steril filterte.
Ihre Viskosität und Benetzbarkeit machen aus der Stocklösung ein geeignetes Mittel zur Verwendung in einem flüssigem Interferonpräparat, das in Form von Tropfen oder Spray verabreicht werden kann. Wie aus Beispiel 4 hervorgeht, kann die Stocklösung auch zweckmäßigerweise zur Herstellung von Salben mit Hydroxyethylzellulose als Trägergrundlage verwendet werden.

Beispiel 3

Herstellung einer Interferonsalbe mit einer auf Polyethylenglykol basierenden Trägergrundlage

Eine Interferonsalbe mit einer auf Polyethylenglykol basierenden Trägergrundlage wurde wie folgt hergestellt.
60 g Polyethylenglykol 400 in flüssiger Form und 40 g Polyethylenglykol 3350 in Pulverform, die beide von Fisher Scientific, Fair Lawn, New Jersey, vertrieben werden, wurden in einem sterilen Becherglas und in einem Autoklaven bei 121ºC über einen Zeitraum von 40 Minuten sterilisiert. Das Becherglas mit dem geschmolzenen Inhalt wurde in ein sich innerhalb einer LF Haube befindliches 50ºC heißes Wasserbad gestellt. Das Gemisch wurde langsam mit Hilfe eines sterilen Propellerrührers gerührt, wobei eine Temperatur von ungefähr 45ºC eingestellt wurde. 15 ml gefrorenes, ungereinigtes, konzentriertes α-Interferon, hergestellt gemäß Beispiel 1, wurden bei 4ºC aufgetaut und dann in einem Wasserbad auf eine Temperatur von ungefähr 45ºC erhitzt. Das Interferon wurde dann dem geschmolzenen Polyethylenglykolgemisch zugesetzt und die beiden Komponenten wurden so lange miteinander verrührt bis das Gemisch homogen war und eine einheitliche Farbe hatte.
Mit Hilfe einer Spritze oder Pipette wurden Aliquote des Interferon/Polyethylenglykol Gemisches in sterile Salbentuben aus Aluminium gegeben, die vorher auf 4ºC gekühlt worden waren. Die beiden offenen Enden der Tube waren mit einem Parafilm überzogen, der mit Alkohol abgetupft worden war. Die Tuben wurden bei -20ºC in einen Gefrierschrank gestellt. Nach ungefähr 20 Minuten bei -20ºC wurden die Tuben unter einer LF-Haube gefalzt.
Zum Füllen einer großen Anzahl von Tuben sollten vorzugsweise Chargen abgefüllt werden, um die Zeiträume, in denen die Salbe Raumtemperatur ausgesetzt ist, auf ein Minimum zu verkürzen.
Um zu zeigen, daß durch das Erhitzen der Interferon-Ausgangsflüssigkeit auf 45ºC, so daß sich diese leichter mit dem Polyethylenglykol Gemisch vermengt, die Interferonaktivität nicht wesentlich beeinträchtigt, wurde eine gemäß Beispiel 1 hergestellte Probe mit ungereinigter, konzentrierter α-Interferon- Ausgangsflüssigkeit auf 45 ºC erhitzt, dann eine Stunde lang auf dieser Temperatur gehalten und dann bei -20ºC gelagert. Die Änderungen im Titer dieses Beispieles über einen gewissen Zeitraum wurden mit denen eines nicht erhitzten Beispiel es verglichen. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt. Wie aus dieser Figur hervorgeht, stimmen die Titer der erhitzten und nicht erhitzten Interferonproben im wesentlich miteinander überein. Dies bedeutet, daß das Erhitzen beim Herstellen der auf Polyethylenglykol basierenden Salbe die biologische Aktivität des Interferons nicht beeinträchtigt.
Zum Zwecke eines Qualitätsvergleiches zwischen einer Salbe, bei der das Interferon und das Polyethylenglykols bei erhöhten Temperaturen miteinander vermischt wurden, und einer Salbe, bei der diese Komponenten mechanisch bei Raumtemperatur miteinander vermischt wurden, wurde eine Salbencharge hergestellt, indem man zu 300 g des oben beschriebenen, auf Raumtemperatur gekühlten 60 : 40 Polyethylenglykolgemisches 45 ml ungereinigte, konzentrierte α-Interferon-Ausgangsflüssigkeit zusetzte. Die beiden Komponenten wurden in eine verschließbaren Plastiktasche gegeben und der Inhalt wurde durch Kneten und Rollen der Tasche mit Hilfe einer zylindrischen Stange vermischt. Das Kneten und Rollen erstreckte sich über einen Zeitraum von ungefähr 30 Minuten. Danach wurde die Salbe mit der, wie oben beschrieben, durch Erhitzen hergestellten Salbe verglichen. Die mechanisch gemischte Salbe wies eine im allgemeinen uneinheitliche Farbe und Konsistenz auf, was darauf hindeutete, daß es hier zu keiner homogenen Dispersion des Interferons innerhalb des Polyethylenglykolgemisches gekommen war. Im Vergleich dazu wies die durch Erhitzen des Interferons und des Polyethylenglykols hergestellte Salbe gleichwohl eine einheitliche Farbe wie auch eine gleichmäßige Konsistenz auf.

Beispiel 4

Herstellen einer Interferonsalbe mit einer auf Hydroxyethylzellulose basierenden Trägergrundlage

Eine Interferonsalbe mit einer auf Hydroxyethylzellulose basierenden Trägergrundlage wurde wie folgt hergestellt.
Zuerst wurden 0,96 g hochviskose (2200 mPas) Hydroxyethylzellulose der Firma Polysciences (Warrington, Pennsylvania, Bestell- Nr. 05568) in einem Becherglas abgemessen, wobei Verklumpungen des Hydroxyethylzellulosepulvers aufgelöst wurden. Danach wurden dem Hydroxyethylzellulosepulver 7,67 g USP Glyzerin zugegeben und die beiden Komponenten wurden zu einer einheitlichen Masse vermischt. Dann wurden diesem Gemische aus Hydroxyethylzellulose und Glyzerin 24,5 ml gereinigtes Wasser zugesetzt, wobei das Wasser so schnell wie möglich ohne Rühren zugesetzt wurde. Danach wurde die Lösung so lange schnell gemischt bis das Gel sich verdickte.
Diese Trägergrundlagengemisch wurde dann in einem Autoklaven bei 121ºC über eine Zeitraum von 40 Minuten behandelt. Die Behandlung im Autoklaven wurde mit einem manuellen, langsamen Druckablaßvorgang abgeschlossen, so daß der Druck langsam auf Null absank, ohne daß es zu einem Überfließen des Materials während der Dekompression kam. Unter einer LF-Haube wurde das im Autoklaven behandelte Gemisch dann unter Mischen auf eine Temperatur zwischen 60ºC und 70ºC abgekühlt. Bei dieser Temperatur wurden dem Gel 0,023 g Propylparaben und 0,96 g Methylparaben zugesetzt. Um ein Inaktivieren der Propyl bzw. Methylparabens zu verhindern, wurde darauf geachtet, daß die Temperatur des Gemisches 70ºC nicht überschritt. Die Parabene wurden mit der Trägergrundlage so lange vermischt, bis in dem Gemisch kein Parabenpulver mehr zu sehen war. Das Gemisch aus Trägergrundlage und Parabengemisch wurde dann in ein Eisbad gestellt und unter Mischen so lange gekühlt bis die Temperatur 4ºC erreicht hatte.
Fünf Milliliter der gemäß Beispiel 2 hergestellten steril gefilterten Interferonstocklösung wurden dann 0,2 ml einer 50 mg/ml, steril gefilterten Soyabohnentrypsin-Inhibitorlösung (Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri) zugesetzt. Diese Lösung wurde dann dem gekühlten Gemisch aus Trägergrundlage/Paraben zugegeben, und das Gemenge wurde solange gemischt bis eine einheitliche Verteilung sichtbar war. Das Gel wurde dann in sterile Spritzen übertragen, indem man die Kolben aus den Spritzen zog und das Gel mit Hilfe eines sterilen Spatels in die Spritzenzylinder einfüllte, wobei die Austrittsenden der Spritzen vorher mit sterilen, heißversiegelten Ansatzstücken verschlossen wurden. Die Öffnungen der Spritzenzylinder wurden dann mit einem zweilagigen Parafilm überzogen, und die heißversiegelten Teile wurden in eine gekühlte Zentrifuge gestellt. Um in dem Gel eingeschlossene Luft zu entfernen, wurden die Spritzen dann bei 4ºC für einen Zeitraum von 5 min bei 2.000 rpm zentrifugiert.
Nach dem Zentrifugieren wurden das Band und der Parafilm, nicht jedoch die Ansatzstücke, unter einer Sterilisationshaube von den Spritzen entfernt. Die Kolben wurden wieder in die Spritzen eingesetzt und die Ansatzstücke wurden durch sterile Austrittskanäle ersetzt. Mit Hilfe der Spritzen wurde das Gel dann in die sterilen Salbentuben aus Aluminium gefüllt, die dann gefalzt und somit verschlossen wurden.
Bei Anwendung dieses Verfahrens erhielt man einheitliche Salben zur äußerlichen Anwendung, die eine ausgezeichnete Konsistenz aufwiesen. Auch beim Umstellen dieses Verfahrens auf die Herstellung größerer Mengen an Salbe erhielt man die gleiche Einheitlichkeit und Konsistenz.
Zur Darstellung der erhöhten Titer, die sich, im Gegensatz zu Trägern auf Polyethylenglykolbasis, bei Trägern auf Hydroxyethylzellulose ergaben, wurde von jeder Art Salbe mehrere Proben hergestellt und ihre Titer wurden zu verschiedenen Zeiten während ihrer Lagerung bei -20ºC gemessen. Die Salben mit Hydroxyethylzellulose wurden gemäß den in diesem Beispiel beschriebenen Verfahren hergestellt, wobei jedoch anstelle der Interferonstocklösung aus Beispiel 2 die ungereinigte konzentrierte α- Interferon-Ausgangsflüssigkeit aus Beispiel 1 verwendet wurde und auch kein Sojabohnen-Trypsinhemmer eingesetzt wurde. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. In der zweiten Spalte dieser Tabelle finden sich die theoretischen Titer der Salbe in Einheiten/g bezogen auf die Menge und den bekannten Titer der zu Herstellung der Salbe verwendeten Interferon-Ausgangsflüssigkeit. In der dritten Spalte ist der Zeitraum der Lagerung in Tagen angegeben und in der vierten Spalte steht die Anzahl der Versuche, die zwischen den Lagerperioden vorgenommen wurde. In der letzte Spalte findet sich der Durchschnitt dieser Versuche als prozentual er Anteil des theoretischen Titers. Tabelle 1 Titer von Salben mit HEZ-Trägern Lagerung bei -20ºC Exper. Theor. Titer Dauer der Lagerung Anz. der Versuche % Theor. Titer
Die Polyethylenglykol enthaltenden Salben wurden aus der konzentrierten α-Interferonstocklösung aus Beispiel 1 unter Anwendung der in Beispiel 3 beschriebenen mechanischen (Exper. 1-3) und der auf Hitze basierenden Mischverfahren (Exper. 4-15) hergestellt. Die Interferonstocklösung für die Experimente 10-15 wurde vor dem Zusetzen zum Polyethylenglykolträger wie folgt modifiziert: in Experiment 10 wurde der Stocklösung soviel Natriumchlorid zugefügt, bis sich eine Konzentration von 5 mM einstellte; in Experiment 11 wurden 20% Glyzerin (v/v) zugesetzt; in Experiment 12 wurden 0,13% Benzalkoniumchlorid (w/v) zugesetzt; in Experiment 13 wurden 0,25% Methylparaben (w/v) und 0,06 Propylparaben (w/v) zugesetzt; in Experiment 14 wurden 0,13 Benzalkoniumchlorid (w/v), 0,25% Methylparaben (w/v) und 0,06 Propylparaben (w/v) und in Experiment 15 wurden 1% Polyvinylalkohol (w/v), 0,3% Tween 80 (v/v) und 0,01% Benzalkoniumchlorid (w/v) zugesetzt. Diese Additive wurde zugesetzt, um eventuell die Stabilität der Salbe bei erhöhten Temperaturen, z. B. 22ºC und 37ºC, zu verbessern. Es stellte sich heraus, daß keine dieser Modifikationen zu der gewünschten Stabilität führte, und hochtemperaturbeständige Interferonpräparate, wie oben beschrieben und in den Beispielen 5 und 6 dargestellt, nur durch Zugabe des Proteasenhemmers möglich waren.
Die modifizierten ebenso wie die nicht-modifizierten Polyethylenglykol enthaltenden Träger wurden bei -20ºC gelagert und in der gleichen Weise getestet wie die Hydroxyethylzellulose enthaltenden Salben. Die Daten zu diesen Proben sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Ein Vergleich dieser Daten mit denen für Hydroxyethlyzellulose enthaltenden Salben zeigt die deutliche Überlegenheit des Hydroxyethlyzelluloseträgers. Wenn das Interferon mit dem Hydroxyethlyzelluloseträger kombiniert wurde, zeigte sich bei dem Interferon im wesentlichen kein Aktivitätsverlust. Bei einer Kombination mit einem Polyethylenträger stellte sich bei dem Interferon ein Aktivitätsverlust von durchschnittlich 34% ein. Dies ist in der letzten Spalte der Tabelle 2 dargestellt. Auffallend ist hierbei die Tatsache, daß das Interferon nicht nur bei dem Mischverfahren durch Erhitzen (Exper. 4-15) an Aktivität einbüßte, sondern auch bei mechanischem Mischen (Exper. 1-3). Dies unterstützt ebenfalls die sich aus den Daten der Fig. 1 ergebende Schlußfolgerung, daß nämlich das Erhitzen der Interferon-Ausgangsflüssigkeit als solches, so daß diese leichter mit einem Polyethylenglykolträger vermischt werden, nicht zu einer Deaktivierung des Interferons führt.
Obwohl die Salben mit einem Polyethylenglykolträger im Vergleich zu Salben mit Hydroxyethylenträgern geringere Titer aufzeigen, sei darauf hingewiesen, daß das Interferon in diesen Salben einen maßgeblichen Teil seiner Aktivität beibehält. In gewissen Fällen sind Salben mit Polyethylenglykolträgern aufgrund ihrer weiterreichenden Einsatzmöglichkeiten und Akzeptanz in der Medizin bevorzugt. Tabelle 2 Titer von Salben mit PEG-Trägern Lagerung bei -20ºC Exper. Theor. Titer Dauer der Lagerung Anz. der Versuche % Theor. Titer

Beispiel 5

Auswirkungen der Proteasenhemmer auf flüssige Interferonpräparate

Dieses Beispiel zeigt, daß eine wirksame Menge an Proteasenhemmer die Zerfallsgeschwindigkeit der biologischen Aktivität eines Interferonpräparates in flüssiger Form herabsetzt.
Zehn Milliliter der in Beispiel 2 beschriebenen Stocklösung wurden in drei gleiche Teile aufgeteilt. Sojabohnen-Trypsinhemmer in fester Form (Sigma Chemical Company, St. Louis Missouri) wurde einem der Aliquote in einer Konzentration von 1 mg/ml und einem zweiten in einer Konzentration von 10 mg/ml zugesetzt. Dem dritten Aliquot wurde kein STI zugesetzt. Jeder Aliquot wurde bei 22ºC gelagert und über einen Zeitraum von vier bis fünf Wochen zu verschiedenen Zeiten in identischer Weise getestet. Die Titer der Interferonstocklösung lagen an Tag 0 bei ungefähr 1 · 10&sup6; U/ml.
Die Ergebnisse dieses Experimentes sind in Fig. 2 dargestellt, wobei Diagramm A die prozentuale Aktivität der Lösung ohne STI über eine gewissen Zeitraum zeigt, Diagramm B zeigt die prozentuale Aktivität der Lösung mit 1 mg/ml STI und Diagramm C die prozentuale Aktivität der Lösung mit 10 mg/ml STI. Wie diese Daten belegen, zeigt die Lösung ohne STI eine im wesentlichen vollständigen Aktivitätsverlust innerhalb von vier Wochen. Im Gegensatz dazu konnte die Lösung mit 1 mg/ml STI über den gleichen Zeitraum einen signifikanten Teil (etwa 50% der ursprünglichen Aktivität) aufrechterhalten. Die Lösung mit dem noch höheren STI Anteil von 10 mg/ml konnte im wesentlichen fast ihre gesamte ursprüngliche Aktivität aufrechterhalten, wobei die Aktivität nach 4 bis 5 Wochen noch bei über 80% der ursprünglichen Aktivität lag.
Diese Daten belegen eindeutig die Effektivität eines Proteasenhemmers bei der Stabilisierung eines Interferon enthaltenden topischen Präparates, so daß das Präparat bei Raumtemperatur über einen längeren Zeitraum hinweg gelagert werden kann.

Beispiel 6

Auswirkungen eines Proteasenhemmers auf ein Interferonpräparat in Salbenform

Um die sich aus dem Einbringen einer Proteasenhemmers in Interferonpräparate in Salbenform ergebende verbesserte Temperaturbeständigkeit darzulegen, wurde eine Reihe von Salben hergestellt, welche Proteasenhemmer in verschiedenen Konzentrationen enthielten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. Das Herstellungsverfahren der verschiedenen Salben und die Lagerbedingungen, denen die Salben unterlagen, werden im folgenden beschrieben.
Für die Experimente 1-4 wurde eine Interferonstocklösung unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen ungereinigten, konzentrierten α-Interferon-Ausgangslösung gemäß Beispiel 2 hergestellt. Dieser Interferonstocklösung wurden verschiedene Mengen an STI in fester Form zugesetzt. Die STI-enthaltende Stocklösung wurde mit der Trägergrundlage auf Hydroxyethylzellulosebasis aus Beispiel 4 vermischt, die, wie in Beispiel 4 beschrieben, 0,025% und 0,06% (w/v) Methyl- bzw. Propylparaben enthielt. Alle Interferon enthaltenden Lösungen wurden vor ihrer Verwendung bei 4ºC gelagert und auch das Mischen mit der Trägergrundlage auf Hydroxyethylzellulosebasis erfolgte bei 4ºC. Wie oben erwähnt, wurden die verschiedenen Komponenten, aus denen die Interferonstocklösung besteht und auch die fertige Stocklösung selbst vor dem Zubereiten des Interferonpräparats steril gefiltert. Das fertige Gel wurde in Salbentuben gefüllt und bei den verschiedenen, in Tabelle 1 aufgelisteten Temperaturen, z. B. -20ºC, 4ºC, 22ºC und 37ºC, gelagert.
Die in den Experimenten 5-7 verwendeten Salben wurden auf die gleiche Weise hergestellt wie jene aus den Beispielen 1-4, wobei jedoch anstelle der Interferonstocklösung das gemäß Beispiel 1 hergestellte ungereinigte, konzentrierte α-Interferon direkt mit dem Proteasenhemmer vermischt wurde. Die sich ergebende Lösung wurde dann mit der Trägergrundlage auf Hydroxyethylzellulosebasis, welcher Methyl- und Propylparaben in den oben angegebenen Konzentrationen zugesetzt worden war, vermischt.
Wie aus Tabelle 3 hervorgeht, sind die Interferon Salbenpräparate stabil ungeachtet der Tatsache, ob diese einen Proteasenhemmer enthielten oder nicht und unabhängig von der Menge und Art der verwendeten Inhibitors. Die in Klammern angegebenen Zeitabstände für Lagerbedingungen bei -20ºC und 4ºC geben den Zeitraum an, über den die Salbe gelagert worden war, ohne daß ein Abfall der biologischen Aktivität nachweisbar war.
Bei 22ºC zeigte sich die Bedeutung des Proteasenhemmers. In Experiment 1 hatte die Salbe eine Halbwertzeit von 7,5 Tagen. Dieser Zeitraum reicht jedoch aus, um problemlosen Transport, Handling und Weitergabe an den Patienten zu ermöglichen. Im Gegensatz dazu kann die Halbwertzeit durch Verwendung von nur 0,29 mg STI pro Milliliter ungereinigter konzentrierter α-Interferon-Ausgangsflüssigkeit auf ungefähr 30 Tage ausgedehnt werden. Ähnliche Halbwertzeiten erhielt man mit höheren STI Konzentrationen. Bei Konzentrationen von 12,5 mg/ml konnte ein Aktivitätsabfall im wesentlichen ganz vermieden werden, ebenso wie bei Konzentration von 12,5 mg/ml α&sub1;-AT bzw. TLCK.
Bei 37ºC zeigte sich die Bedeutung eines Proteasenhemmers im Salbenpräparat mit noch größerer Deutlichkeit. Ohne Inhibitor lag die Halbwertzeit des α-Interferons in dem Präparat bei nur 6 Stunden. Dies aber ist für einen Patienten einfach kein ausreichender Zeitraum, da er die Salbe bei sich tragen muß, um sie tagsüber auftragen zu können. Mit höheren Mengen an STI kann diese Halbwertzeit bei einer Konzentration von 29 mg STI/ml ungereinigter konzentrierter α-Interferon-Ausgangsflüssigkeit gleichmäßig von 52,5 Stunden auf über 154 Stunden, d. h. über 6 Tage, gesteigert werden. Bei einer Verwendung von 12,5 mg α&sub1;-AT pro ml ungereinigter konzentrierter α-Interferon-Ausgangsflüssigkeit und 12,5 mg TLCK pro ml ungereinigter konzentrierter α-Interferon-Ausgangsflüssigkeit, konnten Halbwertzeiten von 93 Stunden bzw. 249 Stunden erzielt werden. Diese Halbwertzeiten sind für den Patienten von großem praktischen Nutzen, da er die Salbe bei sich tragen und sie tagsüber bei Bedarf auftragen kann.
Die in Tabelle 3 dargestellten Daten zeigen eindeutig, daß das Einbringen eines Proteasenhemmers in ein Interferon Salbenpräparat die Zerfallgeschwindigkeit der biologischen Aktivität des Interferons in dem Präparat deutlich herabsetzt. Tabelle 3 Verbesserung der Temperaturstabilität von Interferon Salben mit Hilfe von Proteasenhemmern Experiment Einheiten Interferon pro mlunger. konz. α-Interferon-Ausgangsflüssigkeit Milliliter unger. konz. α-Interferon-Ausgangsflüssigkeitpro Gramm Salbe Menge an Inhibitor pro Milliliterunger. konz. α-Interferon-Ausgangsflüssigkeit Halbwertzeit bei -20ºC kein Zerfall Monate Stunden

Claims

1. Ein Interferonpräparat zur äußerlichen Anwendung, umfassend:

a) eine therapeutisch wirksame Menge eines oder mehrerer Interferone,

b) eine mit dem oder den Interferonen kompatible Trägergrundlage,

c) ein wirksame Menge eines oder mehrerer Proteasenhemmer, um die durch proteolytische Wirkstoffe hervorgerufene Zerfallgeschwindigkeit der biologischen Aktivität des oder der Interferone herabzusetzen.

2. Interferonpräparat nach Anspruch 1, wobei die Proteasenhemmer aus der Gruppe bestehend aus α&sub1;-Antitrypsinhemmer, α&sub2;- Makroglobulin, Sojabohnenhemmer, Nα-tosyl-L-lysinchlormethylketon, Phenylmethylsulfonyl-fluorid, Nα-tosylphenylalaninchlormethylketon und deren Gemische ausgewählt werden.

3. Interferonpräparat nach Anspruch 1, wobei der Proteasenhemmer ein humaner α&sub1;-Antitrypsinhemmer ist.

4. Interferonpräparat nach Anspruch 1, wobei die wirksame Menge eines oder mehrerer Proteasenhemmer bei 22ºC zu einer Halbwertzeit des oder der Interferone von ungefähr vierzehn Tagen oder länger führt.

5. Interferonpräparat nach Anspruch 1, wobei die wirksame Menge des oder der Proteasenhemmer bei 37ºC zu einer Halbwertzeit des oder der Interferone von ungefähr einem Tag oder länger führt.

6. Interferonpräparat nach Anspruch 1, wobei die Trägergrundlage Hydroxyethylzellulose enthält.

7. Interferonpräparat nach Anspruch 1, wobei die Trägergrundlage Polyethylenglykol enthält.

8. Interferonpräparat nach Anspruch l, das im weiteren eine wirksame Menge eines oder mehrerer antibakterieller Konservierungmittel enthält.

9. Träger zur äußerlichen Anwendung eines oder mehrerer Interferone, umfassend:

a) eine mit dem einen oder mehreren zu verabreichenden Interferonen kompatible Trägergrundlage und

b) eine wirksame Menge eines oder mehrerer Proteasenhemmer mit dem Zweck, die durch proteolytische Wirkstoffe hervorgerufene Zerfallgeschwindigkeit der biologischen Aktivität des einen oder der mehreren Interferone herabzusetzen.

10. Träger nach Anspruch 9, wobei die Proteasenhemmer aus der Gruppe bestehen aus α&sub1;-Antitrypsinhemmer, α&sub2;-Makroglobulin, Sojabohnenhemmer, Nα-tosyl-L-Lysinchlormethylketon, Phenylmethylsulfonylfluorid, Nα-tosylphenylalaninchlormethylketon und deren Gemische ausgewählt werden.

11. Träger nach Anspruch 10, wobei der Proteasenhemmer ein humaner α&sub1;-Antitrypsinhemmer ist.

12. Träger nach Anspruch 9, wobei die wirksame Menge eines oder mehrerer Proteasenhemmer bei 22ºC zu einer Halbwertzeit des oder der Interferone von ungefähr vierzehn Tagen oder länger führt.

13. Träger nach Anspruch 9, wobei die wirksame Menge eines oder mehrerer Proteasenhemmer bei 37ºC zu einer Halbwertzeit des oder der Interferone von ungefähr einem Tag oder länger führt.

14. Träger nach Anspruch 9, wobei die Trägergrundlage Hydroxyethylzellulose enthält.

15. Träger nach Anspruch 9, wobei die Trägergrundlage Polyethylenglykol enthält.

16. Träger nach Anspruch 9, der im weiteren eine wirksame Menge eines oder mehrerer antibakterieller Konservierungsmittel enthält.

17. Interferonpräparat zur Behandlung einer Erkrankung, die therapeutisch auf Interferon anspricht, wenn dieses äußerlich verabreicht wird, wobei dieses Interferonpräparat folgendes umfaßt:

a) eine therapeutisch wirksame Menge eines oder mehrerer Interferone,

b) eine mit dem einen oder mehreren zu verabreichenden Interferonen kompatible Trägergrundlage und

c) eine wirksame Menge eines oder mehrerer Proteasenhemmer, die in der Lage sind, die durch proteolytische Wirkstoffe hervorgerufene Zerfallgschwindigkeit der biologischen Aktivität des oder der Interferone herabzusetzen.

18. Interferonpräparat nach Anspruch 17, wobei die auf Interferon therapeutisch ansprechende Erkrankung eine Erkrankung aus der Gruppe bestehend aus Herpes genitalis, Herpes labialis, Herpes zoster, durch Adenoviren hervorgerufene Keratitis oder Kondyloma ist.

19. Interferonpräparat gemäß Anspruch 18 zur Behandlung einer Erkrankung, das direkt auf die durch die Erkrankung ausgelöste Läsion aufgetragen wird.

20. Interferonpräparat gemäß Anspruch 14, wobei die Proteasenhemmer aus der Gruppe bestehend aus α&sub1;-Antitrypsinhemmer, α&sub2;-Makroglobulin, Sojabohnenhemmer, Nα-tosyl-L-lysinchlormethylketon, Phenylmethylsulfonylfluoride, Nα-tosylphenylalaninchlormethylketon und deren Mischungen ausgewählt werden.

21. Interferonpräparat gemäß Anspruch 17, wobei die Trägergrundlage Hydroxylethylzellulose und Polyethylenglokol ist.

22. Interferonpräparat gemäß Anspruch 17, das im weiteren eine wirksame Menge eines oder mehrerer antibakterieller Konservierun, Nα-tosyl-L-lysinchlormethylketon, Phenylmethylsulfonylfluoride, Nα-tosylphenylalaninchlormethylketon und deren Mischungen ausgewählt werden.

22. Interferonpräparat gemäß Anspruch 17, das im weiteren eine wirksame Menge eines oder mehrerer antibakterieller Konservierungsmittel enthält.