JPH05508640A - 線維芽細胞成長因子を含む安定な医薬組成物 - Google Patents
線維芽細胞成長因子を含む安定な医薬組成物Info
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- JPH05508640A JPH05508640A JP91511862A JP51186291A JPH05508640A JP H05508640 A JPH05508640 A JP H05508640A JP 91511862 A JP91511862 A JP 91511862A JP 51186291 A JP51186291 A JP 51186291A JP H05508640 A JPH05508640 A JP H05508640A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
線維 細 長因 を含む を医 組成物本発明は、ヒトマイトジェン活性を有す
る繊維芽細胞成長因子(F G F )、特にヒト塩基性繊維芽細胞成長因子(
bFGF)を含む凍結乾燥組成物に係わる。bFGFは天然のものまたは組換え
手段によって製造されるものとし得る。
タンパク質は難しい安定性の問題を与える固有の化学的及び物理的特性を有する
ので、タンパク質薬剤を安全に取り扱ったり投与することが、医薬製剤製造業者
に強くめられている。タンパク質には、化学的及び物理的の両方の不安定性に関
与する種々の分解経路が存在する。かかる巨大分子は、精製または保存の間のそ
の溶液の偶発的な汚染に起因する微生物分解の危険性にもさらされている。これ
ら全てに配慮することは、経済的に好ましい保存寿命の期待のもとにかかる薬物
を調製及びパッケージングする医薬製造業者にとっては特に重要である。起こり
得る製剤の問題を解決するために、完璧な前調製プログラムはタンパク質薬剤に
不可欠なステップである。更に、保存寿命が維持されることを保証するために、
一連の安定性指標試験法が必要である。
凍結液中でさえ迅速に分解するタンパク質を含む多くの生物学的材料は、材料を
凍結乾燥することにより長期間にわたって生存可能な状態に維持し得る。凍結乾
燥(フリーズドライとしても公知である)は、凍結後に水分を組成物から昇華さ
せる、組成物を乾燥する方法である。この方法の特に有利な点は、液体を処理す
ることは比較的容易であることを利用して、水溶液中で比較的不安定な材料を液
体の状態で処理して該材料を含宥させる容器中に充填し、温度を常温以上に高め
ずに乾燥し、従って、熱の悪影響を排除し、安定性の問題が比較的少ない乾燥状
態で保存し得ることである。こうすると、生成物は生物学的活性の損失に対して
安定化され、長い保存寿命が与えられる。
単に薬物塊を凍結乾燥することだけを考えて製剤を設計することは非実用的なこ
とが多い、これは、製剤に使用される薬剤の量は通常は極めて少ないからである
。これは、凍結乾燥過程で、薬剤が、該過程に使用される真空によって凍結乾燥
容器から吸引除去され得るので問題である。更に、多くのポリペプチドは、低濃
度で凍結乾燥すると比較的不安定である。それらは、生成物のパッケージ材料に
吸収され、活性を失い得る。多くの凍結乾燥医薬組成物は、凍結乾燥過程に存在
する固体の量を増大し、それによって少量の薬剤塊を凍結乾燥することに関係す
る問題を解消するために、希釈剤または増量剤の使用に頼っている。
欧州特許出願公開第0 308 238号は、ヒトマイトジェン活性を有するポ
リペプチド成長因子と、該組成物の再構成溶液に粘性を与え得る、水溶性または
水膨潤性の医薬的に容認可能なポリマーとを含む安定な凍結乾燥組成物を記載し
ている。成長因子として、上皮成長因子(E G F )が特に述べられている
。
本発明は、繊維芽細胞成長因子(FGF)と、医薬的に容認可能な増量剤(bu
lking agent)と、(a)カルボキシアルキルセルロースのアルカリ
金属塩、または
(b)ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル及びシスティン
のいずれかとを含む凍結乾燥組成物を提供する。
本明細書において、FGFは、天然ヒトFGFポリペプチドが示すのと類似の生
物学的活性を有する種類のポリペプチドを含む、即ちFGFは、組換えDNA技
術によって産生されるまたは天然資源から誘導されるヒトF’GF、及び例えば
ウシ、ネズミまたは誓書動物のような近縁哺乳動物FGFのような酸性及び塩基
性FGFを含む、FGFは更に、4つのシスティンアミノ酸残基のうち少なくと
も1つが誘導体化されているFGFのような化学的に修飾されたFGFをも含む
、従って本発明に使用されるFGFは、1つ以上のシスティン残基の−SH基が
−3−CH2−C00H基に変換されているカルボキシメチル化FGFであり得
る6例えば国際公開W0 86107595号;WO57101728号;欧州
特許出願公開第0226181号;Abraha、m et al、、EMBO
J、旦、2523−2528,1986:またはLobb、Eur。
J、C1in、Invest、l一旦、321−336.1988に記載のごと
き任意のbFGF分子を本発明に有効に使用し得る。
bFGFの混合物を使用することもできる。これは、−Abraham et
al、によって報告されている配列番号1に示された155個のアミノ酸のうち
、N末端Met残基を除いた154個のアミノ酸配列を有するヒトbFGF;及
び
一配列番号1に示されたアミノ酸配列のうち、N末端Met及びAla残基を除
いた153個のアミノ酸配列を有するヒトb FGF
のおおよそ50 : 50の混合物とし得る。
例えば組換えDNA技術によって生産されるヒト塩基性FGFが、本発明に使用
するのに好ましい、特に本発明に使用し得るカルボキシメチル化FGFは、国際
公@WO37101728号に記載のごとき、位置69及び87にある2つのシ
スティン残基がカルボキシメチル基、即ち−3−CH2−COOH基によって個
々にブロックされている146アミノ酸形のbFGFである。以降、この特定の
カルボキシメチル化FGFをCM−FGFと表記する。即ちCM−FGFは、配
列番号1に示した位置10から位置155までのアミノ酸配列のうち、位置78
及び96にあるCys残基がカルボキシメチル化されている配列を有するbFG
Fである。
本発明の1つの実施態様においては、組成物は更に、本発明の組成物が例えば1
〜3力月の長期間にわたって保存されたときにFGFの酸化を十分に防ぐように
選択される抗酸化剤を含む、抗酸化剤はジチオトレイトール(DTT)であるの
が好ましい、存在させるならば、抗酸化剤は典型的には増量剤の0.01〜10
0重量%、好ましくは0.1〜25重量%の量で存在させる。
増量剤は、凍結乾燥に使用するのに適した任意の増量剤である。増量剤は通常は
、凍結乾燥の間の製品の再溶解または圧潰を防ぐために、硬化剤(rtgidi
zer)として優れた特性を有する。適当な医薬的に容認可能な増量剤としては
、マンニトール、ラクトース、ポリビニルピロリドン、ガラクチトール及びトレ
ハロースを挙げることができる。このうち、マンニトールが好ましい0本発明の
組成物におけるFGFの量は典型的には増量剤の0.01〜5重量%、好ましく
は0.1〜1重量%である。
驚くべきことには、医薬的に容認可能な増量剤との混合物中のFGFは、カルボ
キシアルキルセルロース、例えばカルボキシC3−4アルキルセルロースのアル
カリ金属塩の存在下で安定化され得ることが判明した。アルカリ金属塩は例えば
ナトリウム塩またはカリウム塩とし得る。この成分は通常は増量剤の0.1〜5
0重量%、好ましくは2.5〜10重量%の量で存在させる。好ましいのはナト
リウムカルボキシメチルセルロースである。驚くべきことには、セルロース塩を
使用すると、天然アルキルセルロース、例えばメチルセルロースからは得ること
ができない安定性が本発明の組成物に付与される。
本発明の組成物は更に、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル及びシス
ティンを使用することによっても安定化され得る。驚くべきことには、これら2
つの成分が相乗作用して安定性を高めることが判明した。ポリオキシエチレンソ
ルビタン脂肪酸エステルの例としては、エチレンオキシドと共重合されたソルビ
トール並びにその−及び二無水物のCl2−2゜部分飽和または不飽和脂肪酸エ
ステルを挙げることができる。典型的には、ソルビトール及びその無水物各々1
モルに対して10〜40モル、例えば約20モルのエチレンオキシドを存在させ
る。ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルは一般にポリソルベート(p
。
o Iysorbate)として知られている。ポリソルベートの例としては、
ソルビトール及びその無水物各々1モル当たり約20モルのエチレンオキシドと
共重合されたソルビトール並びにその−及び二無水物の部分ラウリン酸エステル
の混合物であるポリソルベート20(ポリオキシエチレン20ソルビタンモノラ
ウレート、ChemicalAbstracts 整理番号9005−64−5
)、ポリソルベート40(ポリオキシエチレン20ソルビタンモノパルミテート
、CAS整理番号9005−66−7)、ポリソルベート60(ポリオキシエチ
レン20ソルビタンモノステアレー)、CAS整理番号9005−67−8)、
ポリソルベート65(ポリオキシエチレン20ゾルビタントリステアレート、C
AS整理番号9005−71−4)、ポリソルベート80(ポリオキシエチレン
20ソルビタンモノオレエート、CAS整理番号9005−65−6)及びポリ
ソルベート85(ポリオキシエチレン20ソルビタントリオレエー)”+ CA
S整理番号9005−70−3)を挙げることができる。ポリオキシエチレンソ
ルビタン脂肪酸エステルの量は好ましくは増量剤の0.01〜25重量%、最も
好ましくは0,1〜1重1%である0本発明の組成物中のシスティンの量は好ま
しくは増量剤の0.001〜1重量%、最も好ましくは0.01〜0.1重量%
である。
本発明の組成物は通常は、凍結乾燥前にバルク溶液中で調製する。バルク溶液は
任意の量で凍結乾燥することができるが、5〜500、例えば10〜100、好
ましくは50μgのFGFを含むアリコートに分割されるのが好ましい、アリコ
ートは別個に、例えば別個のガラスバイアル中で凍結乾燥する。溶液を凍結乾燥
する前に、例えばr遇することで殺菌することができる。このために、0.2μ
mナイロン膜フィルターを使用することができる。このようなヂ過の後にHPL
C分析を行なって1本発明者らは、FGFが一貫して定量的に回収されることを
見い出した。
凍結乾燥は実質的に以下のステップからなる。まず、凍結乾燥すべき溶液を、排
気チャンバ内で共融点以下の温度で凍結する0次いでチャンバを通常は13.3
P a(0,ITorr)以下に排気する。生成物の温度以下の温度で冷たい
凝結表面上で氷を昇華させるが、凝結表面は前記チャンバ内または結合チャンバ
内にある0次いで、制御条件下に生成物に熱を導入し、それによって生成物をそ
の共融温度以下に維持するように計画された速度で昇華するようなエネルギーを
与える。典型的な凍結乾燥サイクルは次の通りである:
(a>−45℃で凍結し、この温度に4時間維持する。
(b)13.3Pa(0,ITorr)以下の真空レベル及び−60℃の11一
温度で、−45℃〜+25℃で約12時約11時間二次乾燥する。本発明者らは
、上記凍結乾燥サイクルが、本発明に従って製造されたFGFバッチの調製に適
していることを見い出した。しかしながら、FGFの安定性を実質的に変えない
上記方法の変形もあり得ることは当業者には明らかであろう。
本発明の組成物のアリコートは、無菌バイアル中に分配することができる。無菌
ガラスバイアルが適当である。タンパク質はガラス表面に付着することが知られ
ており、本発明者らは、本発明の凍結乾燥組成物をガラスバイアル内で再構成す
る場合、付着により幾分かのタンパク質が失われることを見い出した。しかしな
がら本発明者らは、付着を最小化するためにガラスバイアルをシリコーンエマル
ジョン(医薬用)で被覆すると、この問題がうまく解消されることを見い出した
。
更に本発明者らは、ガラスバイアルを慣用のゴム栓で密封すると、FGFがゴム
表面に吸収されることによりタンパク質が損失し得ることも見い出した。フッ素
樹脂積層ブチルゴム栓を使用するとこの吸収は防止される。
本発明の凍結乾燥組成物は空気中または真空下に保存することができる。しかし
ながら、不活性ガス下、例えば窒素下に保存することが好ましい。
本発明の凍結乾燥組成物は実質的に、FGFと、医薬的に容認可能な増量剤と、
(a)カルボキシアルキルセルロースのアルカリ金属塩または(b)ポリオキシ
エチレンソルビタン脂肪酸エステル及びシスティンのいずれかとからなる。
本発明の凍結乾燥組成物は、任意の医薬的に容認可能な溶剤を使用して再構成(
reconstitute)することができる、使用する溶剤は、pHが5.0
〜7.0の再構成溶液を与えるのが好ましい、再構成溶剤は0.9%塩化ナトリ
ウム溶液(即ち生理食塩水)であるのが好ましい、必要によっては、溶液は有効
量の抗菌性保存剤を含む、塩化ベンザルコニウムの効力は十分に報告されており
、例えば眼科用保存剤として医薬製剤に一般に使用されているが故に、塩化ベン
ザルコニウムを約0.005重量%の濃度で含むことは特に適している0本発明
者らは、0.005重量%の塩化ベンザルコニウムは、本発明の再構成溶液にお
いて微生物活性を有効に阻害することを見い出した。
FGFは、正常ヒト細胞の成長のvIIWIにおいて役割を果たす成長因子であ
る。FGFは、創傷治癒及び繊維芽細胞の成長を肩部することにおいて有用であ
る。従って本発明は更に、無菌バイアルに入った上記凍結乾燥組成物と、凍結乾
燥組成物を再構成するための無菌希釈液とを含むキットをも提供する8本発明は
更に、本発明の凍結乾燥組成物を水性希釈液、例えば上述の医薬的に容認可能な
溶剤を用いて再構成することからなる、FGF水溶液を調製する方法をも含む0
本発明の組成物またはキットは、人体または動物体の治療、例えば創傷治療の方
法において有効である。
以下の実施例によって本発明の詳細な説明する。
以下の実施例において、使用したFGFは、Farmitalia Carlo
Erba Biotechn。
1ogy Development Departmentから入手可能な組換
えタンパク質薬剤である塩基性FGF FCE 26184、及びbFGFから
得られる化学的修飾タンパク質であるCM−FGF(146アミノ酸形)である
、これらの調製は調製例において後述する。bFGF及びCM−FGFは、bF
GFについては約2.0mg/ml、またCM−FGFについては約1 、1
m g / m Iの活性物質濃度くこの濃度は、ビウレット反応(birue
treaction)によって測定されたタンパク質濃度として表され、溶液は
、10μMリン酸緩衝液を用いてpH6,0で得られる)の凍結バルク溶液とし
て入手可能である。
本発明者らは、上記バルク溶液を溶かし、2%マンニトール溶液を使用して濃度
的50μg / m 1に希釈してもタンパク質の安定性に影響しないことを見
い出した。希釈溶液のHPLC分析は、活性薬物(b F G FまたはCM−
FGF)が定量的に回収されることを示した。
= 1:bFGF FCE 26184 の−bFGFに対する合成りNA配列
及びかかる配列を保有する発現プラスミドを、欧州特許出願公開第363675
号に記載の方法に従って構築した0発酵及び精製プロセスは以下のごと〈実施し
た。
(a)[ユ土)
Institute Pa5teur collectionからのE、col
iB型細菌株を、bFGFをコードするヒト遺伝子及びテトラサイクリン耐性遺
伝子の両方を保有するプラスミドで形質転換した。この形質転換株を、組換え非
グリコジル化h−bFGF(ヒトbFGF)の製造に使用した。この株のMas
ter Ce1l Bank(15個の凍結乾燥バイアル)及びWorking
Ce1l Bank(W、C,B、)(−190℃の液体窒素中に保存した7
0個のバイアル)を調製した。W、C,B、のバイアルの1つの内容物を、発酵
段階の接穫物として使用した。
発酵プロセスは、41の培養培地を満たした101発酵器内で実施した1株選択
条件を維持するために、テトラサイクリン塩酸塩を培地に加えた。37℃で20
時間増殖させると、最終バイオマスは42±2g/l乾燥重量であり、bFGF
の産生は、比較ゲル電気泳動によって測定したところ2500±500 m g
/ lであった。
細菌を大量に増殖させるためには、発酵段階で純粋酸素に富むことが必要であっ
た。
(b)!LC1JLI!
細胞(微生物)を遠心することにより全発酵ブロスから分離した。得られたベレ
ットを、塩化ナトリウムを含むリン酸ナトリウム*W液中に再懸濁させた。細胞
を十分に破壊するために、高圧ホモジナイザーに少なくとも3回通すことが必要
であった。得られた細胞溶解物を遠心することにより清澄化し、更に処理するた
めに上清を回収した。
(C’)W!LM
清澄化した上清を5epharose(商標)SFastFlow(カチオン交
換体)カラムに入れ、リン酸緩衝液中の塩化ナトリウム濃度増加勾配を使用して
このカラムから生成物を溶出した。生成物を、Heparin 5epharo
se(商標)6Bカラム上でリン酸[新液中の塩化ナトリウム濃度増加勾配によ
って溶出することにより更に精製した。最後に、5ephadex(商標)G2
5樹脂上で緩衝液交換して、大量の生成物M新液(リン酸ナトリウム−EDTA
)中に生成物を得た。
5epharose S Fast Flowカラム及び5ephadex G
25カラムは水酸化ナトリウム溶液で洗浄することにより清浄化した。Hepa
rin 5epharoseは、3M塩化ナトリウムを含むpH=8゜5及びP
H5,5いずれかの溶液を用いて洗浄した。
このようにして、FCE26184と命名されたbFGFを得た。これは、Ab
raham et at、によって報告されている配列番号1に示された155
個のアミノ酸のうち、N末端のMet残基を除く154個のアミノ酸配列を有す
るヒトbFGFと。
配列番号1に示されたアミノ酸配列のうち、N末端のMet及びAla残基を除
く153個のアミノ酸配列を有するヒトbFGF
とのおおよそ50 : 50の混合物である。
:CM−FGF i
110mlの25mMリン酸wW液P)(8,0/SmMEDTA中に、国際公
開WO87101728号に記載のごとく得られる組換えヒトbFGF(146
アミノ酸形)100mgを含む溶液に、110m1の同じ緩衝液中のヨード酢酸
400mgを加えた1反応混合物を暗所において室温で2時間放置した0次いで
反応混合物を、25mMリン酸緩衝液pH7,5で平衡化しておいたMonoS
カラム(HRI O/10.Pharmac i a)に直接入れた。
過剰な試薬を除去するために、カラムを平衡化緩衝液で十分に洗浄し、25mM
リン酸I!衝液p新液、5中の0〜IMNaC1直線濃度勾配を用いてカルボキ
シメチル化bFGF(CM−FGF)を溶出した。CM−FGF含有フラクショ
ンを、10nMリン酸緩衝液p H6,010,1mMEDTAで平衡化してお
いた5ephadex G−25カラム(Pharmac i a)上で脱塩し
た。
衷」111
本発明者らは、溶液中のタンパク質を酸化から保護する上で、抗酸化剤、例えば
1.4−ジチオトレイトール(DTT)の存在が有効であることを見い出した。
しかしながら、溶液中でのその優れた保護作用にもかかわらず、凍結乾燥状態の
タンパク質を長期間にわたって保存する場合、DTTはその分解を阻害しない。
実際、増量剤としてマンニトールを、抗酸化剤としてDTTを含む50μgのb
FGF凍結乾燥製剤は、容認可能な安定性を示さない、35℃及び25℃で1週
間保存した後、約10%の効力損失(HP L C法)が検出された。従って、
保護剤を製剤中に配合する必要性がある。
P、P、De Luca及びM、 W、 Town s e n d(Jour
nal of Parenteral 5cience and Techno
logy、vol、42゜No、6.Nov、−Dec、1988.P190)
によれば、リオプロテクタント(1yoprotectant)またはクリオプ
ロテクタント(cryoprotectant)を使用することにより、凍結、
乾燥または長期保存に起因するタンパク質の構造的変性を防止及び低減し得る。
リオプロテクタントは、凍結乾燥の間及びその後の保存の間タンパク質を安定化
しその分解を防止する化合物と定義され、一方、クリオプロテクタントは凍結の
際の損傷からのみ保護する。
上記理論的考察を踏まえ、リオプロテクタントとして作用し得る多数の化合物の
FCE26184及びCM−FGF保護能力を測定する実験を行なった。
ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HP M C)、ナトリウムカルボキシ
メチルセルロース(NaCMC)、メチルセルロース(M C)、ヒドロキシエ
チルセルロース(HE C)、ポリビニルアルコール(PVA)、塩化ナトリウ
ム、グリシン、システィン及びアルブミンを、使用し得る保護剤として選択した
。bFGF(50ug/m 1)と、増量剤としてのマンニトール(20mg/
ml>と、抗酸化剤としてのDTT(0,5または0 、1 m g / m
1のいずれか)と、適当な濃度の使用可能な各安定剤とを含む溶液を無菌状態で
調製し、バイアル(公称容積:1.0ml>に入れ、凍結乾燥した。最終的な凍
結乾燥製剤におけるタンパク質効力に及ぼす保存の影響を、加速安定性試験(a
ccelerated 5tability 5tudies)(35℃)によ
って検査した。
基本的な実験結果を表1にまとめて示す、既に述べたように、マンニトール及び
DTTを含む凍結乾燥製剤は、1週間保存すると10%の効力損失が認められる
。
DTTとの相乗効果を調査する目的でシスティンを加えても、同程度の損失が認
められた。
NaCMCのようなりオプロテクタントを存在させると、タンパク質の安定性は
著しく向上する。他のセルロース誘導体(HPMC,HEC,MC)は、安定剤
として無効であることが判明したく表1にはMCに対するデータのみ表されてい
るが、他の誘導体も同様の挙動を示した)。
PVA、塩化ナトリウム、グリシン及びアルブミンは、bFGFと極度に相入れ
ないことが判明した。ポリソルベート80またはシスティンは、単独で使用した
場合には無効であることが判明した。しかしながら、ポリソルベート80とシス
ティンを併用すると安定剤として驚異的によく作用した。更に、ポリソルベート
80またはシスティンのいずれもNaCMCと相乗作用した。
表1に示したデータは、凍結乾燥状態のタンパク質のための安定剤としてリオプ
ロテクタントが果たす重要な役割を立証している。かかる化合物の保護能力にお
ける機構は、凍結乾燥調製物において水をタンパク質から分離するのを防ぐ能力
にあると考え得る。試験した各凍結乾燥製剤において、薬物の水分kNi、タン
パク質を水和形態に維持するのに十分な程度の水分が(残留湿分として)存在す
る。タンパク質構造体によって緩やかに配位されている水の殻(She 11)
を破壊しようとするいかなる要因(高温または低温、溶剤)も、変性または凝集
によるタンパク質の不活性化の原因となる。NaCMCのような安定剤は、疎水
構造または極性カルボキシル基のいずれかによって水分子にしっかりと配位し得
る。その結果、安定剤はタンパク質の微小環境を水和状態に維持する。
保護剤として試験したHPMC,MC及びHECような他のセルロース誘導体は
、最も考えられるところではカルボキシル基がないために、無効であることが判
明した。
ポリソルベート80の安定化活性は、水分子に対する配位力が弱いために、低い
ことが推定され得る。これとは対照的に、ポリソルベート80とシスティン及び
NaCMCとの相乗効果は全く予想外であった。
表1−FCE26184前処方試験
bFGF(50mcg)、マンニトール(20mg)及びDTT(0,1mg)
を含む種々の凍結乾燥製剤の加速安定性結果
CM−FGFにおける実験結果を表2にまとめて示す。
表2において、n、d、は未測定であることを意味する。
CM−FGF(50μg/ml>と、増量剤としてのマンニトール(20mg/
ml)と、DTT(0,1mg)と、適当な濃度の使用し得る各安定剤とを含む
溶液を無菌条件下に調製し、バイアル(公称容積1.0ml>に入れ、凍結乾燥
した。最終的な凍結乾燥製剤におけるタンパク質効力(protein pot
ency)に及ぼす保存の影響を、加速安定性試験(35℃/45℃)によって
検査した。既にbFGFにおいて見られたように、Na−CMCはCM−FGF
の安定性を著しく向上する。
下記の材料、装置及び溶液を使用し、後述する条件下に試料のHPLCアッセイ
を実施した。
材料:
bFGF凍結バルク溶液、作業用標準CM−FGF凍結バルク溶液、作業用標準
アセトニトリル、HPLC用水、HPLC用トリブトリフルオロ酢酸用1.4−
ジチオトレイトール。
装置:
・液体クロマトグラフィー装置:以下のものを備えたMilton Roy モ
デルCM4000または等価の装置ニー・Vydac 218TP54 300
人を充填したクロマトグラフィーカラム(長さ250 m m 、内径4゜6m
m)または等価の装置
・・注入バルブ:100mci試料ループを取り付けたRheodyneモデル
7125または等価の装置・・検出器:Shimadzu モデルSFD 6A
または等価の装置
・・積算レコーダー:SP 4270(Spectra−Physics)また
は等価の装置
・膜フィルター:0.22μm多孔度、 Mi I l 1pore Dura
pore GVWPまたは等価の装置・精密実験用ガラス器具
・プラスチックピペットチップ(Gilson)・自動ピペット(Gilson
)
・使い捨てプラスチックマイクロチューブ、容量2.5m1(Eppendor
f)
溶液:
・移動相(A):上記膜フィルターを用いて一過し、脱気した、0.1%のトリ
フルオロ酢酸(w / v )を含む水溶液・移動相(B):上記膜フィルター
を用いて一過し、脱気した、0.1%のトリフルオロ酢酸(w/v)を含む95
%アセトニトリル−5%水からなる溶液
・1,4−ジチオトレイトール溶液
HPLC用水中に約1mg/mlを含むよう調製した溶液
・標準溶液
正確に計量した適量のbFGFまたはCM−FGF作業用標準バルク溶液を、使
い捨てプラスチックマイクロチューブに移し、約50 m c g / m l
のbFGFまたはCM−FGFを含む最終溶液を得るために、適量の1.4−ジ
チオトレイトール溶液で希釈したもの、標準溶液は新しく調製し、作業日中に使
用せねばならない。
・試料溶液
少なくとも5つの凍結乾燥バイアルを使用して試料溶液を調製する。50mcg
のbFGFまたはCM−FGFを含む各バイアルの内容物を1.0mlのHPL
C用水中に溶解し、調製した全ての溶液を用いてプールを作製する。
クロマトグラフィー(HPLC)条件:下記の実験条件下で、液体クロマトグラ
フィーに標準溶液及び試料溶液のいずれかを交互に3回以上注入する二カラム温
度 :室温(22±2℃)
移動相流速 :1ml/分
分析波長 :210±lnm
検出器感度 :検出器“コンピューター”出力を最高感度で積算器に接続してお
く。
注入量 : 100mc +
積算レコーダー
減衰(attenuat i on): 256罫紙速度 :0.5cm/分
寒m
a)ナトリウムカルボキシメチルセルロースを用いて安定化したbFGF組成物
の調製
lバイアル当たり車車車 2,000バイアル当たり車掌本FCE 26184
1 0.0804 mglg 120.8 mg車ナナトリウムカルボキシ 1
.0500論g 2.1 gメチルセルロース
1.4−ジチオトレイトール 0.10501111 210.0 mgマンニ
トール zt、oooo曽g 42.0 gO,01N NaOH又は0.OI
N IfCZ pH=6 pH=6(指示値にする十分量)
注入用水車車 1.05 ml 2.11(指示値にする十分量)
本 製造中の損失を補償するために15%の過剰量を含む。
本末 凍結乾燥の際、注入用水は取り除いた。
本本本5%過剰量のbFにFナトリウムカルボキシメチルセルロース/DTT/
マンニトール溶液を含む。
b)ポリソルベート80及びシスティンを用いて安定化したbFGF組成物の調
製
1バイアル当たり本末* 2,000バイアlし当たり富庫本FCE 2618
4車 0.0604 ml車 120.8 mg車本スティン 0.0105論
[121,0mg1.4−ジチオトレイトール 0.1050 mg 210.
0 mgマンニトール 21.0000論g 42.0 gポリソルベート80
0.0525論g 105.0 mgO,OIN NaOH又は0.OIN
HCf pH=6 pH=6(指示値にする十分量)
注入用水木本 1.05 d 2.11(指示値にする十分量)
本 製造中の損失を補償するために15%の過剰量を含む。
vs 凍結乾燥中の際、注入用水は取り除いた。
本京車5%過剰量のbFGFナトリウムカルボキシメチルセルロース/DTT/
マンニトール溶液を含む。
上記両調製物を凍結乾燥し、個々のバイアルを窒素下に密閉した6
C)ナトリウムカルボキシメチルセルロールを用いて安定化したCM−FGF組
成物の調製
1バイアル当たり本末車 z、oooバイアIし当たり京零車CM−Fil;F
本 0,05 輸g本 100 mgナトリウムカルボキシ 1.00 ml2
.0 gメチルセルロース
1.4−ジチオトレイト−1し 0.10 mg 200.0 mgマンニトー
ル 20.00 mg 40.0 gO,OIN NaOH又は0.OIN H
Cffi pH=6 pH=6(指示値にする十分量)
注入用水軍車 1.05 d 2.11(指示値にする十分量)
車 製造中の損失を補償するために15%の過剰量を含む。
車掌 凍結乾燥の際、注入用水は取り除いた。
車車寧5%過剰量のbFGFナトリウムカルボキシメチルセルロース/DTT/
マンニトール溶液を含む。
d)ポリソルベート80及びシスティンを用いて安定化したCM−FGF組成物
の調製
lバイアル当たり車車車 2,000バイアル当たり車車車CM−FGF車 0
.05 mg車 100.Osg本本スティン o、oi信g 20 mgマン
ニトール 20 mg 40.0gポリソルベート80 0.05 mg 10
0.0 ymgO,OIN NaOR又は0.01N MCI pH=6 、H
=6(指示値にする十分量)
注入用水木本 1.05 ml 2.11(指示値にする十分量)
車 製造中の損失を補償するために15%の過剰量を含む6車車 凍結乾燥の際
、注入用水は取り除いた。
車寧車5%過剰量のbFll;Fナトリウムカルボキシメチルセルロース/DT
T/マンニトール溶液を含む。
上記両調製物を凍結乾燥し、個々のバイアルを窒素下に密閉した。
e)ポリソルベート80及びシスティンを用いて安定化したCM−FGF組成物
の調製
1バイアル当たり京本車 2,000バイアル当たり本車掌CM−FGF O,
05w、g車 100.0 論g富システィア 0.01mg 20 mgl、
4−ジチオトレイトール 0.10 mg 200 mgマンニトール 20
vsg 40.0gポリソルベー)80 0.05 wIg 100.0 +s
gO,OIN NaOH又は0.OIN HCffi El[l=6 pH=6
(指示値にする十分量)
注入用水零京 1.05驕1 2.11(指示値にする十分量)
本 製造中の損失を補償するために15%の過剰量を含む。
本章 凍結乾燥の際、注入用水は取り除いた。
本車車5%過剰量のbFcFFcジナトリウムカルボキシメチルセルロースTT
/マンニトール溶液を含む。
上記両調製物を凍結乾燥し、個々のバイアルを窒素下に密閉した。
叉jlfi一旦
の の
約50μgのbFGFを含む本発明の組成物が入った凍結乾燥バイアルを、種々
の温度で種々の期間にわたって保存したときの長期安定性について調査した。結
果は表3〜22に示す、以下のパラメーターを調査した。容認可能な標準(値)
も以下に示す。
外観:目視検査により評価、圧縮された白色の凍結乾燥ケーキまたは塊を含む無
色のガラスバイアルであること。
識別:*Pharmacia LKB Biotechno logy、Upp
sala、Swedenから入手可能なPhast System(登録商標)
を使用した電気泳動(SDS PAGE)により評価、還元及び変性条件下に、
FCE26184またはCM−FGFの作業用標準溶液と同じ分子量バンドであ
ること。
RP−HPLCアッセイ:標識量の90〜110%であること。
バイオアッセイ(3T3細胞におけるDNA合成の刺激):FCE 26184
のFICE内部標準を使用し、BALB/3T3細胞中への3H−TdR取込み
について測定する平行線アッセイ(parallel 1ine assay)
によって計算される値、値を調製物の力価で表わすと、R=1.0±0.35で
あること。
無菌性:無菌
水分:3%以下
再構成(reconst i tut i on)後の外観*:清浄な無色透明
溶液であり、肉眼で見える異物粒子を含まな再構成後のpH本:5.0〜7.0
本バイアルを5mlの所望の溶剤中に溶解した。
実施例2(a)の組成物
一外観 標準に従う一−−−−−−−−−無変化−−−−一一一−−−−5DS
PAGE A A A A
−バイオアッセイ n、d、 n、d、 n、d、 n、d。
−水分% 0.9 1.2 1.0 1.0−外観 標準に従う一−−−−−−
−−−無変化一一一一一〜−−−一(再構成溶液)
−pH6,06,08,18,0
(再構成溶液)
A=正しい分子量位置に濃いバンド
n、d、=未測定
表4−FCE 26184凍結乾燥バイアルの加速安定性データーバッチP81
99/10/C,活性薬物バッチ番号0P49実施例2(a)の組成物
試験 初期 35℃
対照 1週間 2週間 4週間
−外観 標準に従う一一−−−−−−−−無変化−−−−−−−−一−−SDS
PAGE A A A A
−RP−HPLCアッセイ
・IIcg/バイアル 49.88 50.83 46.84 48.73・初
期値に対する%100.0 101.9 93.9 97.7−バイオアッセイ
n、d、 n、d、 n、d、 n、d。
−水分% 0.9 0.8 0.9 0.9−外観 標準に従う一一−−−−−
−−−無変化−−−−−−−−一−(再構成溶液)
−pH6,05,96,08,0
(再構成溶液)
A=正しい分子量位置に濃いバンド
n、d、=未測定
実施例2(a)の組成物
一外観 標準に従う一−−−−−−−=−−−−−−無変化−−−−−−−−−
−−〜−−−−−5DSPAにE A n、d、 A n、d、 A A−RP
−HPLCアッセイ
一バイオアッセイ 範囲内 n、d、 n、d、 n、d、範囲内 範囲内−水
分% 1.5 1.8 1.5 1.9 1.7 n、d。
−外観 標準に従う一−−−−−−−−−−−−−−無変化−−−−−−−−−
−一〜−−−−−(再構成溶液)
−pHe、o s、o s、o e、o 6.0 5.6(再構成溶液)
A=正しい分子量位置に濃いバンド
n、d、=未測定
実施例2(a)の組成物
一外観 標準に従う−−〜−−−−−−−−−−−−−−−無変無変化−一−−
−−−−−−−−−−−−〜−−SDSPAGE A n、d、 A n、d、
n、d、 A A−バイオアッセイ 範囲内 範囲内 n、d、 n、d、 n
、d、 n、d、 n、d。
−水分% 1.5 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 n、d。
−外観 標準に従う一一−−−−−−−−−−−−〜−−−無変化−−〜−−−
−−−−−−−−−−−−−−−(再構成溶液)
−pH6,06,05,9n、d、 6.0 5.9 5.7(再構成溶液)
一無菌性 無菌 n、d、 n、d、 n、d、 n、d、 n、d、 無菌A
=正しい分子量位置に濃いバンド
n、d、=未測定
実施例2(a)の組成物
一外観 標準に従う一−−−−−−−−−−−−−−−−−一無変化一−−−〜
−−−−−−−−−−−−−−−−SDSPAGE A n、d、 A n、d
、 n、d、 A A−バイオアッセイ 範囲内 n、d、 n、d、 n、d
、 n、d、範囲内 n、d。
−水分% 1.5 2.0 1.5 1.4 1.7 1.8 n、d。
−外観 標準に従う一−−−−−−−−−−−−−−−−−無変化−−−−一一
−−−−−−−−−−−−−−−A=正しい分子量位置に濃いバンド
n、d、=未測定
実施例2(a)の組成物
一外観 標準に従う −一一一一一一一一一無変化一一一一一一一一一一−5D
S PAGE A n、d、 n、d、 A−バイオアッセイ 範囲内 n、d
、 n、d、 n、d。
−水分% 1.5 1.4 1.0 1.0−外観 標準に従う −−−一−−
−−−−無変化−−−−−−−−〜−(再構成溶液)
−pH8,08,05,95,9
(再構成溶液)
LCT =ライトキャビネット温度(28±2℃)F、C,=フートキャンドル
A=正しい分子量位置に濃いバンド −n、d、=未測定
実施例2(a)の組成物
一外観 標準に従う一一−−−−−−−−無変化一−−−−−一−−−−SDS
PAGE A A A A
−バイオアッセイ 範囲内 n、d、 n、d、 範囲内−水分% 1.0 1
.2 1.4 1.5−外観 標準に従う−−−−−−−−−−無変化−〜−一
一一一一一−(再構成溶液)
A=正しい分子量位置に濃いバンド
n、c1.=未測定
表12−FCE 26184凍結乾燥バイアルの長期安定性データーバッチTF
/23625.活性薬物バッチ番号○P48実施例2(a)の組成物
一外観 標準に従う−−−−−−−−−−−−−−−無変化−−−−−−−一一
−−−−−−−SDSPAGE A A n、d、 n、d、 A−RP−HP
LCアッセイ
・mcg/バイアル 49.43 48.34 52.1On、d、 45.4
6・初期値に対する%100.0 97.8 105.4 n、d、 92.0
−バイオアッセイ 範囲内 n、d、 n、d、 n、d、 n、d。
−水分% 1.0 1.2 1.1 1.3 1.1−外観 標準に従う一−−
−−−−−−−−−−−−無変化−−−一−−−−−−−−−−−(再構成溶液
)
−pH5,45,45,45,65,5(再構成溶液)
一無菌性 無菌 n、d、 n、d、 n、d、 n、d。
A=正しい分子量位置に濃いバンド
n、d、=未測定
表13−FCE 26184凍結乾燥バイアルの長期安定性データーバッチTF
/23625.活性薬物バッチ番号0P48実施例2(a)の組成物
一外観 標準に従う−−−−−−−−−−−−−−−無変化−−−一一一−−−
−−−−−−−SDSPAGE A A A n、d、 A−RP−HPLCア
ッセイ
一バイオアッセイ 範囲内 n、d、 n、d、 n、d、 n、d。
−水分% 1.0 1.1 1.2 1.2 1.4−外観 標準に従う一−−
−−−−−−−−−−−−無変化−−−−−−−−−一−−−−−−(再構成溶
液)
−pH5,45,45,45,65,4(再構成溶液)
A=正しい分子量位置に濃いバンド
n、d、=未測定
表14−FCE 26184凍結乾燥バイアルの長期安定性データーバッチTF
/23625.活性薬物バッチ番号0P48実施例2(a)の組成物
一外観 標準に従う−−−−−−−−−−−−−−−−無変化−−−−一一一−
−−−−−−−−−5DSPAGE A A A A n、d、 B−RP−H
PLCアッセイ
・IIcg/バイアル 49.43 46.61 47.06 51.2 48
.82 45.01・初期値に対する%100.0 94.3 95.2 10
3.6 98.8 91.1−バイオアッセイ 範囲内 n、d、 n、d、
n、d、 n、d、 範囲内−水分% 1.0 1.2 1.1 1.1 1.
2 1.2−外観 標準に従う一−−−−−−−−−−−−−−無変化一−−−
一一−−−−−−−−−−−(再構成溶液)
−pH5,45,65,45,45,75,5(再構成溶液)
A=正しい分子量位置に濃いバンド
n、cj、=未測定
表15−FCE 26184凍結乾燥バイアルの長期安定性データーバッチTF
/23625.活性薬物バッチ番号0P48実施例2(a)の組成物
一外観 標準に従う−−−−−−−−−−−−−−−無変化−−−一−−−−−
−−−−−−−5DSPAGE A A A A n、d、 n、d。
−RP−HPLCアッセイ
・lcg/バイアル 49.43 45.82 49.18 51.5 48.
48 n、d。
・初期値に対する%100.0 92.7 99.5 104.2 98.i
n、d。
−バイオアッセイ 範囲内 n、d、 n、d、 n、d、 n、d、 n、d
。
−水分% 1.0 1.2 1.1 1.3 1.3 n、d。
−外観 標準に従う一−−−−−−−−−−−−−−無変化一−−−一−−−−
−−−−−−−(再構成溶液)
−pH5,45,55,55,45,7n、d。
(再構成溶液)
A=正しい分子量位置に濃いバンド
n、d、=未測定
表16−FCE 26184凍結乾燥バイアルの加速安定性データーバッチTF
/23625.活性薬物バッチ番号0P48実施例2(a)の組成物
一外観 標準に従う −−−一−−−−−−−無変化−−−−−−−−−一−−
−5DS PAGE A A A A
−バイオアッセイ 範囲内 n、d、 n、d、 n、d。
−水分% 1.0 15 1.4 1.2−外観 標準に従う −一一一−−−
−−−−無変化−−−−−一−−−−−−(再構成溶液)
−pH5,45,55,55,5
(再構成溶液)
A=正しい分子量位置に濃いバンド
n、d、=未測定
実施例2(b)の組成物
一外観 標準に従う一一一−−−−−−−無変化−−−−一−−−−−−SDS
PAGE A A A A
−バイオアッセイ n、d、 n、d、 n、d、 n、d。
−水分% 0.8 0.9 0.9 1.0−外観 標準に従う一−−−−−−
−〜−無変化−−−〜−−−−−−(再構成溶液)
−pH6,06,26,16,2
(再構成溶液)
A=正しい分子量位置に濃いバンド
n、d、=未測定
実施例2(b)の組成物
一外観 標準に従う一一−−−−−〜−−無変化−−−−−一−−−−−SDS
PAGE A A A A
−バイオアッセイ n、d、 n、d、 n、d、 n、d。
−水分% 0.8 0.8 0.8 0.9−外観 標準に従う−−−−−−−
−−−無変化−一−−−m−−−−(再構成溶液)
−pH6,06,36,36,3
(再構成溶液)
A=正しい分子量位置に濃いバンド
n、d、=未測定
実施例2(b)の組成物
一外観 標準に従う一一−−−−無変化−−−−−−−3DSPAGE A A
A
−RP−HPLCアッセイ
一バイオアッセイ 範囲内 n、d、 n、d。
−水分% 0.8 1.0 1.2
−外観 標準に従う一一一一一一無変化−−−−−(再構成溶液)
−pH6,16,46,3
(再構成溶液)
A=正しい分子量位置に濃いバンド
n、d、=未測定
実施例2(b)の組成物
一外観 標準に従う一〜−−−−−−−−−−−−−無変化−−−−−−−−一
一−−−−−−5DSPAGE A A A A A−パイオアッセイ 範囲内
n、d、 範囲内 n、d、 n、d。
−水分% 0.8 0.8 0.9 1.0 1.1−15溶よ、標準42従5
−−−−−−−−−−−−−−一無変化一一一−−−−−−−−−−−一−−p
)1 6.1 6.3 6.2 6.1 6.3(再構成溶液)
A;正しい分子量位置に濃いバンド
jl、d、=未測定
実施例2(b)の組成物
一外観 標準に従う一−−−−−−−−−−−−〜−−無変化一−−−〜−−−
−−−−−−−−−5DSPAGE A A A A A A−バイオアッセイ
範囲内 n、d、 n、d、範囲内 n、d、、 n、d。
−水分% 0.8 1.0 1.0 0.9 1.2 1.5−外観 標準に従
う一一−−−−−−−−−−−−−−無変化一−−−−−−−一一−−−−−−
(再構成溶液)
−pH6,16,36,36,36,36,1(再構成溶液)
A=正しい分子量位置に濃いバンド
n、d、士未測定
実施例2(c)の組成物
同様の安定性が実施例2(d)及び2(e)の組成物においても認められた。
配列表
(1)配列番号:1
(1)配列の特徴
(A)長さ=155アミノ酸
(B)型二アミノ酸
(C)鎖の数ニー零値
(D)トポロジー二直鎚状
(ii)分子の種類:タンパク質
(×i)配列:配列番号=1
!若
繊維芽細胞成長因子(F G F )の安定な凍結乾燥製剤は、FGFと、医薬
的に容認可能な増量剤と、(a)カルボキシアルキルセルロースのアルカリ金属
塩、または(b)ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル及びシスティン
のいずれかとを含む。
国際調査報告
1m−1−一1−Aw&IN@1lFT/Cロ017I’lll’l11国際調
査報告
SA 49153
Claims (12)
- 1.線維芽細胞成長因子(FGF)と、医薬的に容認可能な増量剤と、 (a)カルボキシアルキルセルロースのアルカリ金属塩、または (b)ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル及びシステイン のいずれかとを含む凍結乾燥組成物。
- 2.更に、抗酸化剤を含む請求項1に記載の組成物。
- 3.前記抗酸化剤がジチオトレイトールである請求項2に記載の組成物。
- 4.前記増量剤が、マンニトール、ラクトース、ポリビニルビロリドン、ガラク チトールまたはトレハロースである請求項1から3のいずれか一項に記載の組成 物。
- 5.前記カルボキシアルキルセルロースのアルカリ金属塩が、ナトリウムカルボ キシメチルセルロースである請求項1から4のいずれか一項に記載の組成物。
- 6.前記ポリオキシエチレン脂肪酸エステルがポリソルベート80である請求項 1から4のいずれか一項に記載の組成物。
- 7.無菌ガラスバイアル内に密封されている請求項1から6のいずれか一項に記 載の組成物。
- 8.前記線維芽細胞成長因子が塩基性FGFである請求項1から7のいずれか一 項に記載の組成物。
- 9.前記線維芽細胞成長因子が、配列番号1に示された位置10から位置155 のアミノ酸配列で、位置78及び96にあるCys残基がカルボキシメチル化さ れている配列を有する塩基性FGFである請求項1から7のいずれか一項に記載 の組成物。
- 10.(a)請求項1から9のいずれか一項に記載の組成物、及び (b)前記組成物を再構成するための無菌溶液を含むキット。
- 11.線維芽細胞成長因子(FGF)と、医薬的に容認可能な増量剤と、 (a)カルボキシアルキルセルロースのアルカリ金属塩、または (b)ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル及びシステイン のいずれかとを水溶液中で混合し、前記水溶液を凍結乾燥することからなる、線 維芽細胞成長因子(FGF)を含む凍結乾燥組成物を製造する方法。
- 12.請求項1から9のいずれか一項に記載の組成物を、無菌水性希釈剤を用い て再構成することからなる、FGF水溶液を製造する方法。
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