HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung betrifft Klone für die XmaI-
Restriktionsendonuklease und -Modifikationsmethylase sowie
die Produktion des Restriktionsenzyms aus den Klonen.
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Restriktionsendonukleasen sind eine Klasse von Enzymen,
welche natürlich in Bakterien vorkommen. Wenn sie von
anderen verunreinigenden bakteriellen Bestandteilen gereinigt
werden, können Restriktionsendonukleasen im Labor verwendet
werden, um DNA-Moleküle in präzise Fragmente zu zertrennen.
Diese Fähigkeit ermöglicht DNA-Molekülen, eindeutig
identifiziert zu werden und in ihre aufbauenden Gene fraktioniert
zu werden. Restriktionsendonukleasen haben sich als
unentbehrliche Werkzeuge in der modernen genetischen Forschung
erwiesen. Sie sind die biochemischen "Scheren", mittels
derer Gentechnologie und -analyse durchgeführt werden.
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Restriktionsendonukleasen wirken, indem sie bestimmte
Nukleotidsequenzen (die "Erkennungssequenz") entlang des
DNA-Moleküls erkennen und daran binden. Wenn sie gebunden
sind, spalten sie das Molekül innerhalb oder an einer Seite
der Sequenz. Verschiedene Restriktionsendonukleasen haben
eine Affinität für verschiedene Erkennungssequenzen. Über
einhundert verschiedene Restriktionsendonukleasen sind
unter den vielen Hunderten von Bakterienspezies, die bis
heute untersucht wurden, identifiziert worden.
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Bakterien neigen dazu, höchstens nur eine kleine Anzahl
von Restriktionsendonukleasen pro Spezies zu besitzen. Die
Endonukleasen werden typischerweise nach den Bakterien
benannt, aus welchen sie stammen. So synthetisiert
beispielsweise die Spezies Haemophilus aegyptius 3
verschiedene Restriktionsendonukleasen, welche HaeI,
HaeII und
HaeIII genannt werden. Diese Enzyme erkennen und spalten
die Sequenzen (AT)GGCC(AT), PuGCGCPy bzw. GGCC.
Andererseits synthetisiert Escherichia coli RY13 nur ein Enzym,
EcoRI, welches die Sequenz GAATTC erkennt.
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Während man nicht durch eine Theorie gebunden werden
möchte, wird angenommen, daß Restriktionsendonukleasen in
der Natur eine schützende Rolle für das Wohlergehen der
Bakterienzelle spielen. Sie ermöglichen Bakterien, einer
Infektion durch fremde DNA-Moleküle wie Viren und Plasmide
zu widerstehen, welche sie andernfalls zerstören oder
parasitieren würden. Sie verleihen eine Resistenz, indem sie
die Länge des infizierenden DNA-Moleküls abtasten und
dieses jedesmal spalten, wenn die Erkennungssequenz auftritt.
Die Spaltung, welche stattfindet, zerstört viele der
infizierenden Gene und macht die DNA anfällig für einen
weiteren Abbau durch Exonukleasen.
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Ein zweiter Bestandteil von bakteriellen Schutzsystemen
sind die Modifikationsmethylasen. Diese Enzyme sind
komplementär zu Restriktionsendonukleasen und stellen das Mittel
zur Verfügung, durch welches Bakterien in der Lage sind,
ihre eigene DNA zu schützen und sie von fremder,
infizierender DNA zu unterscheiden. Modifikationsmethylasen
erkennen und binden an dieselbe Nukleotiderkennungssequenz wie
die entsprechende Restriktionsendonuklease, aber anstatt
die DNA zu spalten, modifizieren sie chemisch das eine oder
andere der Nukleotide innerhalb der Sequenz durch die
Zufügung einer Methylgruppe. Nach der Methylierung wird die
Erkennungssequenz nicht länger durch die
Restriktionsendonuklease gebunden oder gespalten. Die DNA einer
Bakterienzelle ist mittels der Aktivität ihrer
Modifikationsmethylase immer vollständig modifiziert und ist daher vollkommen
unempfindlich gegenüber der Gegenwart der endogenen
Restriktionsendonuklease. Es ist nur unmodifizierte, und
daher identifizierbar fremde DNA, welche gegenüber einer
Erkennung und Spaltung durch die Restriktionsendonuklease
empfindlich ist.
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Mit dem Aufkommen der Gentechnologie ist es nun
möglich, Gene zu klonieren und die Proteine und Enzyme, welche
sie codieren, in größeren Mengen herzustellen, als sie
durch herkömmliche Reinigungstechniken erhältlich sind. Der
Schlüssel, um Klone von Restriktionsendonukleasegenen zu
isolieren ist, ein einfaches und verläßliches Verfahren zu
entwickeln, um solche Klone innerhalb komplexer
"Bibliotheken", d. h. Populationen von Klonen, welche durch
"Schrotschuß"-Verfahren abgeleitet wurden, zu
identifizieren, wenn sie mit Häufigkeiten auftreten, welche so niedrig
wie 10&supmin;³ bis 10&supmin;&sup4; sind. Vorzugsweise sollte das Verfahren
selektiv sein, so daß die unerwünschte Mehrheit der Klone
zerstört wird, während die gewünschten seltenen Klone
überleben.
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Restriktionsmodifikationssysteme vom Typ II werden mit
wachsender Häufigkeit kloniert. Bei den ersten klonierten
Systemen verwendete man eine Bakteriophageninfektion als
ein Mittel zum Identifizieren oder Selektionieren von
Restriktionsendonukleaseklonen (EcoRII: Kosykh et al.,
Molec. Gen. Genet. 178 : 717-719 (1980); HhaII: Mann et al.,
Gene 3: 97-112 (1978); PstI: Walder et al., Proc. Nat.
Acad. Sci. 78 1503-1507 (1981)). Da die Gegenwart von
Restriktionsmodifikationssystemen in Bakterien diesen
ermöglicht, einer Infektion durch Bakteriophagen zu
widerstehen, können Zellen, welche klonierte
Restriktionsmodifikationsgene tragen, im Prinzip selektiv als Überlebende aus
Bibliotheken isoliert werden, welche einem Phagen
ausgesetzt wurden. Es wurde jedoch gefunden, daß dieses
Verfahren nur einen begrenzten Wert hat. Insbesondere wurde
gefunden, daß klonierte Restriktionsmodifikationsgene nicht
immer eine ausreichende Phagenresistenz verleihen, um ein
selektives Überleben zu ermöglichen.
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Ein anderer Klonierungsansatz umfaßt ein Übertragen von
Systemen, welche anfangs als plasmidgetragen
charakterisiert wurden, in E. coli-Klonierungsplasmide (EcoRV:
Bougueleret et al., Nucl. Acid. Res. 12 : 3659-3676 (1984);
PaeR7: Gingeras und Brooks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:
402-406 (1983); Theriault und Roy, Gene 19: 355-359 (1982);
PvuII: Blumenthal et al., J. Bacteriol. 164: 501-509
(1985)).
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Ein dritter Ansatz, und einer, welcher verwendet wird,
um eine wachsende Anzahl von Systemen zu klonieren, umfaßt
ein Selektionieren auf ein aktives Methylasegen, siehe z. B.
BsuRI: Kiss et al., Nucl. Acid. Res. 13: 6403-6421 (1985);
und TaqI: Slatko et al., Nucl. Acid. Res. 15: 9781-9796
(1987). Da Restriktions- und Modifikationsgene dazu neigen,
eng miteinander verknüpft zu sein, können Klone, welche
beide Gene enthalten, oft isoliert werden, indem nur auf
ein Gen selektioniert wird. Die Selektion nach
Methylaseaktivität ergibt jedoch nicht immer ein vollständiges
Restriktionsmodifikationssystem, sondern liefert
stattdessen manchmal nur das Methylasegen (BspRI: Szomolanyi et
al., Gene 10: 219-225 (1980); BcnI: Janulaitis et al., Gene
20: 197-204 (1982); BsuRI: Kiss und Baldauf, Gene 21: 111-
119 (1983); und MspI: Walder et al., J. Biol. Chem. 258:
1235-1241 (1983)). Für eine Gesamtübersicht über das
Klonieren von Restriktionsmodifikationssystemen siehe z. B.
Lunnen et al., Gene 74: 25-32 (1988); und Wilson, G.G.,
Gene 74: 281-289 (1988).
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Ein potentielles Hindernis beim Klonieren von
Restriktionsmodifikationsgenen liegt in dem Versuch, das
Endonukleasegen in einen Wirt einzuführen, welcher noch nicht
durch Modifikation geschützt ist. Wenn das Methylasegen und
das Endonukleasegen zusammen als ein einziger Klon
eingeführt werden, muß die Methylase die Wirts-DNA schützend
modifizieren, bevor die Endonuklease die Gelegenheit hat,
diese zu spalten. Gelegentlich kann es daher nur möglich
sein, die Gene nacheinander zu klonieren, zuerst die
Methylase, dann die Endonuklease.
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Ein weiteres Hindernis beim Klonieren von Systemen in
E. coli wurde im Verlauf des Klonierens von verschiedenen
Methylasegenen entdeckt. Viele E. coli-Stämme
(einschließlich jener, welche normalerweise beim Klonieren verwendet
werden) haben Systeme, die sich der Einführung von DNA,
welche methylierte Cytosine enthält, widersetzen. (Raleigh
und Wilson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9070-9074,
1986). Es ist extrem schwierig, cytosinspezifische
Methylasegene entweder allein oder zusammen mit ihrem
entsprechenden Endonukleasegen in diesen Stämmen von E. coli zu
klonieren. Um diese Gene zu klonieren ist es daher
notwendig, Mutantenstämme von E. coli zu verwenden, in welchen
diese Systeme defekt sind.
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Da gereinigte Restriktionsendonukleasen, und in einem
geringeren Ausmaß Modifikationsmethylasen, nützliche
Werkzeuge zum Charakterisieren und Umordnen von DNA im Labor
sind, besteht ein kommerzieller Ansporn, Bakterienstämme
durch rekombinante DNA-Techniken zu erhalten, welche diese
Enzyme im Überschuß synthetisieren. Solche Stämme wären
nützlich, da sie die Aufgabe der Reinigung vereinfachen
würden, wie auch das Mittel zur Produktion in kommerziell
nützlichen Mengen zur Verfügung stellen würden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes
DNA-Segment zur Verfügung gestellt, welches für die XmaI-
Restriktionsendonuklease codiert, ein Enzym, welches die
DNA-Sequenz 5'-CCCGGG-3' erkennt und zwischen C&sub1; und C&sub2;
spaltet, wobei ein 5'-Überhang von vier Nukleotiden
zurückbleibt, wobei das isolierte DNA-Segment aus einem 10,3 kb-
HindIII-Fragment von Xanthomonas malvacearum ATCC Nr. 9924
erhältlich ist. Die Erfindung stellt ebenfalls einen
rekom
binanten DNA-Vektor zur Verfügung, welcher einen Vektor
umfaßt, in den ein DNA-Segment gemäß der Erfindung, das aus
einem 10,3 kb-HindIII-Fragment von X. malvacearum ATCC Nr.
9924 produziert wurde, eingefügt wurde. Die Erfindung
stellt weiterhin ein isoliertes DNA-Segment zur Verfügung,
welches für die XmaI-Restriktionsendonuklease, ein Enzym,
welches die DNA-Seguenz 5'-CCCGGG-3' erkennt und zwischen
C&sub1; und C&sub2; spaltet, wobei ein 5'-Überhang von vier
Nukleotiden zurückbleibt, und -Methylase codiert, wobei das
isolierte DNA-Segment aus einem 10,3 kb-HindIII-Fragment von
X. malvacearum ATCC Nr. 9924 erhältlich ist. Die Erfindung
stellt ebenfalls Klonierungsvektoren zur Verfügung, welche
die isolierten DNA-Segmente der Erfindung umfassen,
zusammen mit Wirtszellen, welche durch den Vektor der Erfindung
transformiert sind. Zusätzlich stellt die Erfindung ein
Verfahren zur Verfügung, um die
XmaI-Restriktionsendonuklease zu produzieren, welches ein Kultivieren einer
Wirtszelle der Erfindung, welche mit einem Vektor der Erfindung
transformiert ist, in welchen ein DNA-Segment der Erfindung
eingefügt wurde, unter Bedingungen für die Expression der
Endonuklease umfaßt. Die XmaI-Restriktionsendonuklease,
welche gemäß der vorliegenden Erfindung produziert wurde,
ist im wesentlichen rein und frei von den Verunreinigungen,
die normalerweise in XmaI-Präparationen gefunden werden,
welche durch herkömmliche Techniken hergestellt werden.
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Das bevorzugte Verfahren zum Klonieren der Gene für die
XmaI-Enzyme umfaßt ein Bilden einer Bibliothek, welche die
DNA aus X. malvacearum enthält, ein Isolieren jener Klone,
welche DNA enthalten, die für die
XmaI-Modifikationsmethylase codiert, und ein Screenen von diesen, um jene zu
identifizieren, die ebenfalls das
XmaI-Restriktionsendonukleasegen enthalten. Das Gen ist aus Xanthomonas malvacearum
(ATCC 9924) erhältlich (Endow, S.A. und Roberts, R.J., J.
Mol. Biol. 112 : 521-529 (1977)).
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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Fig. 1 stellt ein Schema zum Klonieren und Produzieren
der XmaI-Restriktionsendonuklease dar.
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Fig. 2 ist eine Restriktionskarte des
pUC19-Klonierungsvektorderivats pKL19-2, welches eine zweite XmaI/SmaI-
Stelle enthält.
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Fig. 3 ist eine Restriktionskarte eines 10,3 kb-Hind-
III-Iragmentinserts, welches die
XmaI-Restriktionsendonuklease und -Modifikationsmethylase codiert.
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Fig. 4 ist eine Fotografie eines Agarosegels, welche
die XmaI-Restriktionsendonukleaseaktivität darstellt, die
aus dem Rohextrakt von pKLXmaIRM 102-2 erhalten wurde.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung betrifft Klone der XmaI-
Restriktions- und Modifikationsgene, sowie ein Verfahren
zur Produktion der Restriktionsendonuklease XmaI aus
solchen Klonen. Die XmaI-Gene werden durch ein Verfahren
kloniert, welches die Tatsache ausnutzt, daß gewisse Klone,
die auf der Grundlage selektioniert werden, daß sie das
XmaI-Modifikationsmethylasegen enthalten und exprimieren,
ebenfalls das XmaI-Restriktionsgen enthalten. Die DNA
solcher Klone ist resistent gegenüber einem Verdau in vitro
durch die XmaI-Restriktionsendonuklease wie auch durch die
SmaI-Restriktionsendonuklease. (Die
SmaI-Restriktionsendonuklease ist ein Isoschizomer von XmaI.) Diese Resistenz
gegenüber einem Verdau liefert ein Mittel zum selektiven
Isolieren von Klonen, welche die XmaI-Methylase und
-Restriktionsendonuklease codieren.
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Das hierin beschriebene Verfahren, durch welches das
XmaI-Restriktionsgen und -Methylasegen kloniert und
expri
miert werden können, ist in Fig. 1 dargestellt und umfaßt
die folgenden Schritte:
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1. Die Kultivierung und Lyse von X. malvacearum (ATCC
9924). X. malvacearum wird gemäß den Techniken, die von
Endow et al. beschrieben werden, kultiviert und lysiert.
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2. Die DNA von X. malvacearum wird durch
Standardtechniken wie z. B. Phenol- und Chloroformextraktion, Dialyse
und Isopropanolfällung gereinigt.
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3. Die DNA wird partiell mit einer der
Restriktionsendonukleasen HindIII, BamHI und EcoRI verdaut.
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4. Die verdaute DNA wird in einen Klonierungsvektor wie
z. B. ein pBR322-Derivat, welches eine BamHI-, HindIII- oder
EcöRI-Stelle enthält, ligiert. XmaI-Klone wurden erhalten,
indem pKL19-2 als der Klonierungsvektor verwendet wurde.
pKL19-2 ist ein pUC19, in welchen eine zweite XmaI/SmaI-
Stelle eingefügt wurde, wobei die DNA zwischen Dral-Stellen
bei den Nukleotiden 1563 und 1582 ersetzt wurde, indem ein
phosphorylierter Linker mit 8 bp, d(pCCCCGGGG), verwendet
wurde. (Eine Probe von pKL19-2 ist bei der ATCC unter der
ATCC-Nummer 67997 hinterlegt). Die resultierende Mischung
wird verwendet, um einen geeigneten Wirt, wie z. B. E. coli-
Stamm RR1 (ATCC 31343), zu transformieren.
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5. Die DNA/Zellmischung wird auf antibiotischen Medien
plattiert, die für transformierte Zellen selektiv sind, wie
z. B. Ampicillin. Nach einer Inkubation werden die
transformierten Zellkolonien zu einer einzigen Kultur, der primären
Zellbibliothek, zusammengesammelt.
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6. Die rekombinanten Plasmide werden in toto aus der
primären Zellbibliothek gereinigt, um eine primäre
Plasmidbibliothek zu erzeugen.
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7. Die Plasmidbibliothek wird dann vollständig in vitro
mit der SmaI-Restriktionsendonuklease verdaut, welche aus
Serratia marcescens-Zellen durch
Standardproteinreinigungstechniken wie z. B. Affinitätschromatographie und
Ionenaustauschchromatographie präpariert wurde (Endow et al.).
XmaI-methylierte DNA ist resistent gegenüber einem Verdau
durch sowohl XmaI- als auch SmaI-Restriktionsendonukleasen.
Der Verdau bewirkt die selektive Zerstörung von
unmodifizierten, nicht methylasehaltigen Klonen, was zu einem
Anwachsen der relativen Häufigkeit von
XmaI-Methylase-tragenden Klonen führt. SmaI-Restriktionsendonuklease erkennt
dieselbe Sequenz wie XmaI, schneidet, aber zwischen C&sub3; und
G&sub1; in der Sequenz 5'-CCCGGG-3', wobei glatte Enden
zurückbleiben. Es ist weniger wahrscheinlich, daß gespaltene
Moleküle mit glatten Enden bei der Transformation wieder
zirkulär werden; ein SmaI-Verdau der primären Bibliothek
ist daher möglicherweise selektiver für modifizierte
Moleküle als es ein XmaI-Verdau ist.
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8. Die verdaute Plasmidbibliotheks-DNA wird in einen
geeigneten Wirt wie z. B. E. coli-Stamm RR1
zurücktransformiert, und transformierte Kolonien werden wieder durch ein
Plattieren auf Antibiotika-Platten erhalten. Die Kolonien
werden aufgenommen und ihre DNA wird auf die folgende Weise
auf das Vorliegen des XmaI-Modifikationsgens hin
analysiert: Die Plasmid-DNA, welche sie tragen, wird gereinigt
und in vitro mit XmaI-Restriktionsendonuklease inkubiert,
um zu bestimmen, ob sie gegenüber einem Verdau durch XmaI
resistent ist. Die gesamte zelluläre DNA (chromosomale und
Plasmid-) des Klons wird ebenfalls gereinigt und mit XmaI-
Restriktionsendonuklease inkubiert. Die DNA von Klonen,
welche das XmaI-Methylasegen tragen, sollte modifiziert
sein, und es sollte gefunden werden, daß sowohl die
Plasmid-DNA als auch die gesamte DNA im wesentlichen oder
vollständig resistent gegenüber einem Verdau ist.
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9. Klone, welche die XmaI-Restriktionsendonuklease
tragen, werden identifiziert, indem Rohextrakte von jenen
Klonen hergestellt werden, welche in Schritt 8 als das XmaI-
Methylasegen tragend identifiziert wurden, und indem die
Extrakte auf XmaI-Restriktionsendonukleaseaktivität hin
getestet werden.
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20. Die XmaI-Restriktionsendonuklease kann mit Klonen
produziert werden, welche die XmaI-Restriktions- und
Modifikationsgene tragen, indem in einem Fermenter in einem
Vollmedium, welches Ampicillin enthält, vermehrt wird. Die
Zellen werden danach durch Zentrifugation geerntet und
durch Beschallung aufgebrochen, um einen rohen Zellextrakt
zu erzeugen, welcher die
XmaI-Restriktionsendonukleaseaktivität enthält.
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11. Der rohe Zellextrakt, welcher die
XmaI-Restriktionsendonukleaseaktivität enthält, wird durch
Standardproteinreinigungstechniken wie z. B. Affinitätschromatographie
und Ionenaustauschchromatographie gereinigt.
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Das folgende Beispiel wird angegeben, um eine
Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darzustellen.
BEISPIEL
Klonieren des XmaI-Restriktionsendonukleasegens
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1. DNA-Reinigung: Um die DNA von Xanthomonas
malvacearum (ATCC 9924) zu präparieren, wurden 5 g gefrorene Zellen
1 Stunde lang auf Eis in 20 ml 25% Sucrose, 50 mM Tris, pH
8,0 aufgetaut. 10 ml 0,25 M EDTA, pH 8 plus 6 ml 10 mg/ml
Lysozym in 0,25 M Tris, pH 8,0, wurden zugegeben. Die
Suspension wurde 2 Stunden lang auf Eis inkubiert. Um eine
Lyse der Zellen zu erreichen, wurden 24 ml einer
Lysemischung (1% Triton X-100, 50 mM Tris, 62 mM EDTA pH 5,0)
und 5 ml 10% SDS zugegeben. Die Probe wurde mit 70 ml
Phe
nol (vorher mit 0,5 M Tris pH 8,0 äquilibriert) und dann
mit 60 ml Chloroform extrahiert. Die Emulsion wurde für 30
Minuten bei 10 k Upm zentrifugiert. Die viskose obere
Schicht wurde abgezogen und für 24 Stunden gegen 10 mM
Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0 (vier Pufferwechsel, jeweils 4
Liter) dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde dann für 1
Stunde bei 37ºC mit RNase bei einer Endkonzentration von
100 Mikrogramm/ml verdaut. Die DNA wurde dann geerntet,
indem NaCl bis zu einer Endkonzentration von 0,4 M
zugegeben wurde, 0,55 Volumen Isopropylalkohol darübergeschichtet
wurden, und die DNA auf einen Glasstab aufgewickelt wurde,
indem die Phasen zusammengemischt wurden. Die DNA wurde in
10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0 resuspendiert und bei 4ºC
gelagert.
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2. Verdau der DNA: Die gereinigte DNA wurde partiell
mit HindIII gespalten. Die DNA wurde auf eine Konzentration
von 100 Mikrogramm pro ml in 50 mM Tris pH 7,5, 100 mM
NaCl, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM 2-Mercaptoethanol verdünnt, und
4,0 Einheiten HindIII pro Mikrogramm an DNA wurden zu einem
ersten Röhrchen zugegeben und dann in ein zweites Röhrchen
überführt, um 2,0 Einheiten HindIII/ug zu erreichen, usw.,
wobei jedes nachfolgende Röhrchen die Hälfte der
vorhergehenden Menge an Enzym erhielt. Die DNA wurde eine Stunde
lang bei 37ºC verdaut, dann wurden die Verdaus abgebrochen,
indem 10 Minuten lang auf 72ºC erwärmt wurde. Die Röhrchen,
die einen mäßigen, aber unvollständigen Verdau zeigten,
wurden als die Quelle für Fragmente aus einem partiellen
Verdau zum Klonieren ausgewählt. (Dieses waren die Röhrchen
mit 0,5 U/ug, 0,25 U/ug, 0,1 U/ug, 0,05 U/ug und 0,02 U/ug.
Die fünf Lösungen wurden zusammengemischt und wie unten
beschrieben verwendet.)
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3. Ligation: Die verdaute DNA wurde wie folgt in pKL19-
2 ligiert: 6,0 ug der mit HindIII verdauten X. malvacearum-
DNA (60 ul) wurden mit 3, 0 ug mit HindIII gespaltenem und
dephosphoryliertem pKL19-2 (7,5 ul) gemischt. 20 ul einer
10x-Ligationsmischung (500 mM Tris, pH 7,5, 100 mM MgCl&sub2;,
100 mM DTT, 5 mM ATP) wurden zugegeben, plus 112,5 ul
steriles destilliertes Wasser, um das Endvolumen auf 200 ul zu
bringen. 7,5 ul T4-DNA-Ligase wurden zugegeben, und die
Mischung wurde 4 Stunden lang bei 17ºC inkubiert, dann
durch die Zugabe von 10 ul Chloroform sterilisiert.
Ungefähr 125 ul der ligierten DNA wurden verwendet, um den
E. coli-Stamm RR1 wie folgt zu transformieren: Die DNA
wurde mit 1,0 ml SSC/CaCl&sub2; (50 mM NaCl, 5 mM Na&sub3;citrat, 67
mM CaCl&sub2;) auf Eis gemischt und 2,0 ml eiskalte kompetente
E. coli RR1 (hsd R-M-, ATCC Nr. 31343)-Zellen wurden
zugegeben. Nach einer 5-minütigen Inkubation bei 42ºC wurden
die Zellen durch die Zugabe von 8 ml Luria-Nährlösung (L-
Nährlösung) verdünnt und dann 4 Stunde lang bei 37ºC
inkubiert.
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4. Primäre Zellbibliothek: Die transformierte
Zellkultur wurde kurz zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen
und die Zellen wurden in 1,0 ml L-Nährlösung resuspendiert.
200 ul-Portionen wurden auf Luria-Agar (L-Agar)-Platten,
die 100 ug/ml Ampicillin enthielten, plattiert. Nach einer
Inkubation über Nacht bei 37ºC wurden die Platten jeweils
mit 2,5 ml 10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2; geflutet, und
die transformierten Kolonien wurden zusammengekratzt und
gepoolt, um die primäre Zellbibliothek zu bilden.
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5. Primäre Plasmidbibliothek: Die primäre
Plasmidbibliothek wurde wie folgt hergestellt: 2,5 ml der primären
Zellbibliothek wurden in 500 ml L-Nährlösung, welche 100
ug/ml Ampicillin enthielt, angeimpft. Die Kultur wurde über
Nacht bei 37ºC geschüttelt, dann 5 Minuten lang bei 4000
Upm zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das
Zellpellet wurde in 10 ml 25% Sucrose, 50 mM Tris, pH 8,0
bei Raumtemperatur resuspendiert. 5 ml 0,25 M EDTA, pH 8,0
wurden zugegeben, gefolgt von 3 ml 10 mg/ml Lysozym in 0,25
M Tris, pH 8,0. Die Lösung wurde 1 Stunde lang auf Eis
gelassen, dann wurden 12 ml einer lytischen Mischung (1%
Triton X-100, 50 mM Tris, pH 8,0, 67 mM EDTA) kräftig
hineinpipettiert, und die Zellsuspension wurde leicht
verwirbelt, um eine Lyse zu erreichen. Nach der Lyse wurde die
Mischung in ein 50 ml-Plastikzentrifugenröhrchen überführt
und 45 Minuten lang bei 17000 Upm und 4ºC abzentrifugiert.
Der Überstand wurde mit einer Pipette entfernt. 20,0 g
festes CsCl wurden in einem 50 ml-Plastikröhrchen mit
Schraubdeckel eingewogen, und 22,0 g Überstand wurden in
das Röhrchen pipettiert und gemischt. 1,0 ml
Ethidiumbromidlösung (5 mg/ml Ethidiumbromid in 10 mM Tris, pH 8,0, 1
mM EDTA, 100 mM NaCl) wurde zu der Mischung zugegeben. Die
Lösung wurde in zwei 5/8 Inch · 3 Inch
Polyallomer-Zentrifugenröhrchen überführt und abgedichtet. Diese Röhrchen
wurden dann in einem Beckmann Ti70-Rotor 42 Stunden lang
bei 44000 Upm und 17ºC zentrifugiert. Um die Plasmide zu
sammeln, wurden die Röhrchen mit ultraviolettem Licht
beleuchtet, die oberen Enden wurden mit einem Skalpell
durchstochen, und die untere der zwei fluoreszierenden DNA-
Banden wurde mit einer Spritze eingesammelt. Die unteren
Banden aus jedem Röhrchen wurden in einem Glasröhrchen mit
Schraubdeckel vereinigt und das Ethidiumbromid wurde
entfernt, indem 4-mal mit einem gleichen Volumen an
wassergesättigtem eiskalten N-Butanol extrahiert wurde.
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Die extrahierte Lösung wurde in einen Dialyseschlauch
überführt und 24 Stunden lang gegen 4 Wechsel DNA-Puffer
(10 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA) dialysiert. Die dialysierte
DNA-Lösung wurde dann in ein vorher gewogenes steriles 50
ml-Zentrifugenröhrchen überführt, und ihr Volumen wurde
gemessen. 5 M NaCl wurde bis zu einer Endkonzentration von
0,4 M zugegeben, dann wurden 2 Volumen Isopropanol
zugegeben und gemischt. Die Lösung wurde über Nacht bei -20ºC
gelagert, um die DNA zu fällen. Nach der Fällung wurde die
Lösung 15 Minuten lang bei 15000 Upm und 0ºC zentrifugiert,
und der Überstand wurde verworfen. Das Röhrchen wurde 15
Minuten lang auf dem Labortisch stehen gelassen, um an der
Luft zu trocknen, dann wurde das DNA-Pellet in 500 ul DNA-
Puffer gelöst und bei -20ºC gelagert. Es wurde gefunden,
daß die DNA-Konzentration der Plasmidbibliotheken, welche
auf diesem Wege präpariert wurden, 100 bis 200 ug/ml
betrug.
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6. Verdau des Plasmidpools: Der primäre Plasmidpool
wurde verdaut, um nicht-XmaI-Methylaseklone wie folgt zu
zerstören: 0,5 ug der Plasmidbibliothek in 90 ul
SmaI-Verdaupuffer (6 mM TrisHCl, pH 8,0, 6 mM MgCl&sub2;, 6 mM 2-
Mercaptoethanol, 20 mM KCl) wurden mit 20 Einheiten (2 ul)
SmaI-Restriktionsenzym für 2 Stunden bei 25ºC inkubiert.
Die verdaute DNA wurde mit Chloroform extrahiert und in
einer Mikrozentrifuge zentrifugiert.
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7. Transformation: Eine 12,5 ul-Probe aus dem Röhrchen
wurde verwendet, um 200 ul kompetente E. coli RR1 zu
transformieren. Die Zell/DNA-Mischungen wurden auf
L-Agar-Platten, die 100 ug/ml Ampicillin enthielten, plattiert. Nach
einer Inkubation über Nacht bei 37ºC wurden die Platten
untersucht. Es wurde gefunden, daß der Verdau der
Plasmidbibliothek mit SmaI die Anzahl an Transformanten um einen
Faktor von mehr als 10&sup4; vermindert hatte. Einzelne Kolonien
wurden von der Platte aufgenommen und jede wurde in 10 ml
L-Nährlösung, welche Ampicillin enthielt; inokuliert, um
eine Minikultur herzustellen, und wurde ebenfalls auf L-
Agar-Platten ausgestrichen, um eine Vorratsplatte (master
stock) herzustellen.
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8. Analyse von überlebenden Individuen: 29 der
überlebenden Kolonien, welche aus Abschnitt 8 erhalten wurden,
wurden in 10 ml-Kulturen (Abschnitt 7) kultiviert, und die
Plasmide, welche sie enthielten, wurden durch das folgende
Miniprep-Reinigungsverfahren präpariert, welches ausgehend
von dem Verfahren von Birnboin und Doly (Nucleic Acids Res.
7: 1513 (1979)) angepaßt wurde.
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Miniprep-Verfahren: Jede Kultur wurde 5 Minuten lang
bei 8000 Upm zentrifugiert; der Überstand wurde verworfen
und das Zellpellet wurde in 1,0 ml 25 mM Tris, 10 mM EDTA,
50 mM Glucose, pH 8,0, welcher 1 mg/ml Lysozym enthielt,
resuspendiert. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden
2,0 ml 0,2 M NaOH, 1% SDS zu jedem Röhrchen zugegeben und
die Röhrchen wurden geschüttelt, um die Zellen zu lysieren,
und dann auf Eis gestellt. Wenn sich die Lösungen
aufgeklart hatten, wurden 1,5 ml 3 M Natriumacetat, pH 4,8, zu
jedem zugegeben und geschüttelt. Die Niederschläge, welche
sich bildeten, wurden 10 Minuten lang bei 15000 Upm und 4ºC
abzentrifugiert. Jeder Überstand wurde in ein
Zentrifugenröhrchen gegossen, welches 3 ml Isopropanol enthielt, und
gemischt. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden die
Röhrchen 10 Minuten lang bei 15000 Upm zentrifugiert, um
die ausgefällten Nukleinsäuren zu pelletieren. Die
Überstände wurden verworfen und die Pellets wurden 30 Minuten
lang bei Raumtemperatur an der Luft getrocknet. Wenn sie
trocken waren, wurden die Pellets in 850 ul 10 mM Tris, 1
mM EDTA, pH 8,0 resuspendiert. 75 ul 5 M NaCl wurden zu
jedem zugegeben, und die Lösungen wurden in
Eppendorfröhrchen, die 575 ul Isopropanol enthielten, überführt und
wieder 10 Minuten lang bei Raumtemperatur gefällt. Die
Röhrchen wurden dann 45 Sekunden lang in einer
Mikrozentrifuge zentrifugiert, die Überstände wurden verworfen, und
die Pellets wurden an der Luft getrocknet. Die Pellets
wurden dann in 500 ul 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0, welche
100 ug/ml RNase enthielten, gelöst und 1 Stunde lang bei
37ºC inkubiert, um die RNA zu verdauen. Die DNA wurde
erneut durch die Zugabe von 50 ul 5 M NaCl, gefolgt von 350
ul Isopropanol, gefällt. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur
wurde die DNA durch eine Zentrifugation für 45 Sekunden
abzentrifugiert, die Überstände wurden verworfen und die
Pellets wurden in einer Endlösung von 150 ul 10 mM Tris, 1
mM EDTA, pH 8,0 erneut gelöst. Die Plasmid-Minipreps wurden
anschließend durch Verdau mit XmaI analysiert.
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9. XmaI-Methylasegenklone: Es wurde gefunden, daß 17
der Plasmide, welche analysiert wurden, gegenüber einem
Verdau durch das XmaI-Restriktionsenzym vollkommen
resistent waren. Die Klone enthielten ein HindIII-Fragment mit
ungefähr 10,3 kb in der Länge. (Siehe Fig. 3). Diese
Plasmide schienen identisch zu sein, und es wurde nachfolgend
gezeigt, daß sie nicht nur das
XmaI-Modifikationsmethylasegen sondern auch das XmaI-Restriktionsendonukleasegen
enthielten.
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10. XmaI-Restriktionsgenklon: Bei einem der Plasmide,
welches als pKLXmaIRM 102-2 bezeichnet wurde, die oben
(Abschnitt 9) als das XmaI-Modifikatiorsmethylasegen
tragend identifiziert wurden, wurde gefunden, daß es ebenfalls
das XmaI-Restriktionsendonukleasegen trägt. Dieses wurde
durch einen in vitro-Restriktionsendonukleasetest mit einem
Extrakt festgestellt, welcher aus dem E. coli-Stamm K802
(ATCC 33526) hergestellt wurde, in welchen das Plasmid
durch Transformation übertragen worden war.
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Endonukleasetests: Um auf die Endonukleaseaktivität zu
testen, wurden zwei Lösungen hergestellt:
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(i) 10X-Restriktionsendonukleasepuffer: 100 mM Tris, pH
7,5, 100 mM MgCl&sub2;, 100 mM 2-Mercaptoethanol, 500 mM NaCl;
und (ii) Verdaureaktionsmischung: 55 ul mit HindIII
verdaute Lambda-DNA (500 ug/ml), 55 ul
10X-Restriktionsendonukleasepuffer, 440 ul destilliertes Wasser, um 50 ug/ml DNA zu
erreichen.
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Der Zellextrakt wurde wie folgt hergestellt: Eine 100
ml-Kultur des Klons wurde über Nacht bei 37ºC in
L-Nährlösung plus 100 ug/ml Ampicillin kultiviert, und die Zellen
wurden durch Zentrifugation für 5 Minuten bei 4000 Upm
pelletiert. Der Überstand wurde verworfen, und das Pellet
wurde in 3 ml Beschallungspuffer (50 mM KPO&sub4; pH 7,5, 10 mM
BME, 0,1 mM EDTA) resuspendiert. 0,3 ml Beschallungspuffer,
welche 10 mg/ml Lysozym enthielten, wurden zugegeben, die
Suspension wurde verwirbelt und dann 1 Stunden lang auf Eis
stehengelassen. Eine 1 ml-Probe wurde auf ein
Eppendorfröhrchen überführt und leicht für drei 10 Sekunden-Stöße
beschallt, um die Zellen aufzubrechen. Das Röhrchen wurde
für 5 Minuten in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert, und
der Überstand wurde als der Zellextrakt verwendet. Um den
Extrakt zu testen wurde die Verdaureaktionsmischung auf 5
Röhrchen verteilt, 150 ul in das erste Röhrchen und 100 ul
in jedes der verbleibenden 4 Röhrchen. 7,5 ul des Extraktes
wurden zu dem ersten Röhrchen zugegeben und gemischt. 47,5
ul wurden aus dem ersten Röhrchen entfernt und in das
zweite Röhrchen überführt, gemischt, usw. Das erste Röhrchen
erhielt so 1,0 ul des Extrakts pro ug an DNA, das zweite
Röhrchen 0,3 u1/ug, das dritte Röhrchen 0,1 u1/ug, usw. Die
Röhrchen, welche nun jeweils 100 ul enthielten, wurden für
eine Stunde bei 37ºC inkubiert, dann wurde eine 20 ul-Probe
von jedem durch Gelelektrophorese analysiert. Es wurde
gefunden, daß der Titer des Extrakts ungefähr 1 · 10³
Einheiten pro ml betrug, was ungefähr 1 bis 2 · 10&sup5; Einheiten
an XmaI-Restriktionsendonuklease pro Gramm an Zellen
entspricht. (Siehe
Fig. 4).