DE3888804T2 - Verfahren zur Herstellung von FokI-Restriktionsendonuklease und -methylase. - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von FokI-Restriktionsendonuklease und -methylase.

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Description

    TECHNISCHER HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Klone für die FokI Restriktionsendonuklease und Modifikationsmethylase sowie die Erzeugung dieser Enzyme aus den Klonen.
  • Restriktionsendonukleasen sind eine Enzymklasse, die natürlich in Bakterien vorkommt. Wenn sie von anderen verunreinigenden Bakterienbestandteilen gereinigt werden, können Restriktionsendonukleasen im Labor zum Aufspalten von DNA-Molekülen in präzise Fragmente verwendet werden. Diese Eigenschaft ermöglicht die Identifizierung von DNA-Molekülen in einzigartiger Weise und die Fraktionierung in ihre Genbestandteile. Restriktionsendonukleasen haben sich als unverzichtbare Werkzeuge der modernen Genforschung erwiesen. Sie sind die biochemischen "Scheren", mit deren Hilfe Gentechnik und -analyse ausgeführt werden. Restriktionsendonukleasen wirken durch Erkennung und Bindung an bestimmte Nukleotidsequenzen (die "Erkennungssequenz") entlang dem DNA-Molekül. Nach erfolgter Bindung spalten sie das Molekül innerhalb oder an einer Seite der Sequenz. Verschiedene Restriktionsendonukleasen haben eine Affinität für verschiedene Erkennungssequenzen. Mehr als 100 verschiedene Restriktionsendonukleasen wurden unter hunderten von Bakterienspezies identifiziert, die bisher untersucht wurden.
  • Bakterien besitzen gewöhnlich nur eine kleine Anzahl von Restriktionsendonukleasen pro Spezies. Die Endonukleasen sind gemäß der Bakterie benannt, von der sie hergeleitet sind. So synthetisiert die Spezies Haemophilus aegyptius beispielsweise drei verschiedene Restriktionsendonukleasen, die HaeI, HaeII und HaeIII genannt werden. Diese Enzyme erkennen und spalten die Sequenzen (AT)GGCC(AT), PuGCGCPy bzw. GGCC. Escherichia coli RY13 andererseits synthetisiert nur ein Enzym, EcoRI, das die Sequenz GAATTC erkennt.
  • Ohne durch eine Theorie gebunden sein zu wollen wird angenommen, daß in der Natur Restriktionsendonukleasen eine schützende Rolle für das Wohlbefinden der Bakterienzelle spielen. Sie ermöglichen es der Bakterie, einer Infektion durch fremde DNA-Moleküle, wie etwa Viren und Plasmide zu widerstehen, die sie anderenfalls zerstören oder parasitär besetzen würden. Sie verleihen Resistenz durch die Bindung an das infizierende DNA-Molekül und Spalten desselben jedes Mal dann, wenn die Erkennungssequenz auftritt. Die resultierende Zersetzung inaktiviert viele der infizierenden Gene und macht die DNA für den weiteren Abbau durch Exonukleasen empfänglich.
  • Ein zweiter Bestandteil des bakteriellen Schutzsystems sind Modifikationsmethylasen. Diese Enzyme sind zu Restriktionsendonukleasen komplementär und bieten das Mittel, durch das Bakterien in der Lage sind, ihre eigene DNA zu schützen und sie von fremder, infizierender DNA zu unterscheiden. Modifikationsmethylasen erkennen und binden an dieselbe Nukleotiderkennungssequenz wie die entsprechende Restriktionsendonuklease. Anstatt jedoch die DNA aufzuspalten, modifizieren sie chemisch eines oder mehrere der Nukleotide innerhalb der Sequenz durch die Addition einer Methylgruppe. Nach der Methylierung wird die Erkennungssequenz nicht länger von der Restriktionsendonuklease gebunden oder gespalten. Die DNA einer bakteriellen Zelle ist durch die Aktivität ihrer Modifikationsmethylase stets vollständig modifiziert und ist daher vollständig gegenüber der Anwesenheit der endogenen Restriktionsendonuklease unempfindlich. Nur unmodifizierte und daher erkennbare fremde DNA ist gegenüber der Erkennung und dem Angriff von Restriktionsendonukleasen empfindlich.
  • Mit dem Entstehen der Gentechnologie ist es nun möglich, Gene zu klonieren und die Proteine und Enzyme, für die sie codieren, in größeren Mengen zu erzeugen, als durch herkömmliche Reinigungstechniken erhältlich sind. Der Schlüssel zur Isolierung von Klonen von Restriktionsendonukleasegenen ist die Entwicklung eines einfachen und zuverlässigen Verfahrens zur Identifizierung derartiger Klone innerhalb komplexer "Banken", d. h. Klonpopulationen, die durch "Schrotschuß"-Verfahren abgeleitet wurden, wenn sie mit so niedrigen Häufigkeiten wie 10&supmin;³ bis 10&supmin;&sup4; auftreten. Vorzugsweise sollte das Verfahren selektiv sein, so daß die unerwünschte Mehrheit der Klone zerstört wird, während die erwünschten seltenen Klone überleben.
  • Typ II Restriktions-Modifikationssysteme werden mit zunehmender Häufigkeit kloniert. Die ersten klonierten Systeme verwendeten eine Bakteriophageninfektion als Mittel zur Identifizierung oder zur Selektion von Restriktionsendonukleaseklonen (HhaII: Mann et al., Gene 3 : 97-112, (1978); EcoRII: Kosykh et al., Molec. gen. Genet 178 : 717-719 (1980); PstI: Walder et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 78 1503-1507 (1981)). Da die Anwesenheit von Restriktions-Modifikationssystemen in Bakterien diese in die Lage versetzen, einer Infektion durch Bakteriophagen zu widerstehen, können Zellen, die klonierte Restriktions-Modifikationsgene tragen, im Prinzip als Überlebende aus Banken selektiv isoliert werden, die einem Phagen ausgesetzt wurden. Es wurde jedoch festgestellt, daß dieses Verfahren nur einen begrenzten Wert hat. Insbesondere wurde festgestellt, daß klonierte Restriktions-Modifikationsgene nicht immer eine ausreichende Phagenresistenz zeigen, um ein selektives Überleben zu verleihen.
  • Ein weiterer Klonierungsansatz beinhaltet das Übertragen von Systemen, die ursprünglich als plasmidgetragen charakterisiert sind, in E. coli Klonierungsplasmide (EcoRV: Bougueleret et al., Nucl. Acid. Res. 12 : 3659-3676, 1984; PaeR7: Gingeras und Brooks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 : 402-406, 1983; Theriault und Roy, Gene 19 : 355-359, 1982; PvuII: Blumenthal et al., J. Bacteriol. 164 : 501-509, 1985).
  • Ein dritter Ansatz, der zur Klonierung einer zunehmenden Anzahl von Systemen verwendet wird, umfaßt die Selektion nach einem aktiven Methylasegen unter Bezug auf unsere Patentanmeldung Nr. 707079 (BsuRI: Kiss et al., Nucl. Acid. Res. 13: 6403-6421, 1985). Da Restriktions- und Modifikationsgene dazu neigen, eng verbunden zu sein, können oftmals beide Gene enthaltende Klone durch Selektieren nach nur einem Gen isoliert werden. Die Selektion nach Methylierungsaktivität erbringt jedoch nicht immer ein vollständiges Restriktions-Modifikationssystem, sondern erbringt anstelle dessen manchmal nur das Methylasegen (BspRI: Szomolanyi et al., Gene 10 : 219-225 (1980); BcnI: Janulaitis et. al., Gene 20 : 197-204 (1982); BsuRI: Kiss und Baldauf, Gene 21 : 111-119 (1983); und MspI: Walder et al., J. Biol. Chem. 258 : 1235-1241, (1983)).
  • Ein mögliches Hindernis bei der Klonierung von Restriktions- Modifikationsgenen liegt in dem Versuch, das Endonukleasegen in eine nicht bereits durch Modifikation geschützte Wirtszelle einzuführen. Wenn das Methylasegen und Endonukleasegen gemeinsam als ein einzelner Klon eingeführt werden, muß die Methylase die Wirts-DNA schützend modifizieren, bevor die Endonuklease die Gelegenheit hat, diese zu spalten. Fallweise kann es daher möglicherweise nur möglich sein, die Gene sequenziell zu klonieren, zunächst die Methylase und anschließend die Endonuklease. Ein weiteres Hindernis bei der Klonierung von Restriktions-Modifikationssystemen liegt in der Entdeckung, daß einige Stämme von E. coli nachteilig auf die Cytosinmodifikation reagieren; sie besitzen Systeme, die methyliertes Cytosin enthaltende DNA zerstören (Raleigh und Wilson, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83 : 9070-9074, 1986). Cytosinspezifische Methylasegene können nicht problemlos in diese Stämme kloniert werden, sei es alleine oder zusammen mit ihren entsprechenden Endonukleasegenen. Um dieses Problem zu vermeiden, ist es erforderlich, mutierte Stämme von E. coli (McrA&supmin; und McrB&supmin;) zu verwenden, in denen diese Systeme defekt sind.
  • Da gereinigte Restriktionsendonukleasen und in einem geringeren Ausmaß Modifikationsmethylasen nützliche Werkzeuge zur Charakterisierung und Neuanordnung von DNA im Labor sind, besteht ein kommerzieller Anreiz, Stämme von Bakterien durch rekombinante DNA-Techniken zu erhalten, die diese Enzyme im Überfluß synthetisieren. Derartige Stämme wären nützlich, da sie die Aufgabe der Reinigung vereinfachen würden und auch das Mittel zur Produktion in kommerziell nützlichen Mengen bieten würden.
    • KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Gemäß vorliegender Erfindung wird ein Klon geschaffen, der die Gene für die FokI Restriktionsendonuklease und Modifikationsmethylase enthält, die aus Flavobakterium okeanokoites (IFO 12536) abgeleitet sind, sowie die zugehörigen Verfahren für die Erzeugung der Enzyme. Im einzelnen betrifft diese Erfindung Klone, die die Restriktionsendonuklease FokI exprimieren, ein Enzym, das die DNA-Sequenz GGATG erkennt und bei 9/13 Nukleotiden stromabwärts spaltet. Siehe Sugisaki, H. und Kanazawa, S. 1981, Gene 16 : 73-78, dessen Offenbarung hiermit durch Bezugnahme hierin eingeschlossen ist. FokI Restriktionsendonuklease, die gemäß vorliegender Erfindung erzeugt wird, ist im wesentlichen rein und frei von den normalerweise in FokI-Präparationen aufgefundenen Verunreinigungen, die durch konventionelle Techniken hergestellt wurden, wie etwa die von Sugisaki und Kanazawa, s. o., aufgezeigte.
  • Das bevorzugte Verfahren zur Klonierung dieses Enzyms umfaßt die Bildung einer die DNA von Flavobakterium okeanokoites (IFO 12536) enthaltenden Bank, Isolieren derjenigen Klone, die für die FokI Modifikationsmethylase codierende DNA enthalten und Screening dieser, um diejenigen zu identifizieren, die auch das FokI Restriktionsendonukleasegen enthalten.
    • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Fig. 1 zeigt das Schema zur Klonierung und Herstellung der FokI Restriktionsendonuklease.
  • Fig. 2 ist eine Restriktionskarte eines 6kb XbaI-Fragments von F. okeanokoites DNA, das für die FokI Restriktionsendonuklease und Modifikationsmethylase codiert. Das Fragment wurde in die XbaI-Stelle von pUC19 (ATCC 37254) kloniert, um pML109RM 119-1 zu schaffen.
  • Fig. 3 ist eine Photografie eines Agarose-Gels, das die FokI Restriktionsendonukleaseaktivität in einem Zellextrakt von pML109RM 119-1 tragenden E. coli MM294 (ATCC 33625) darstellt.
    • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Klone der FokI Restriktions- und Modifikationsgene sowie die Restriktionsendonuklease FokI, die von derartigen Klonen erzeugt wird. Die FokI-Gene werden durch ein Verfahren kloniert, das sich die Tatsache zunutze macht, daß bestimmte Klone, die auf der Basis ausgewählt sind, daß sie das FokI Modifikationsmethylasegen enthalten und exprimieren, auch das FokI Restriktionsgen enthalten. Die DNA derartiger Klone ist in vitro gegen das Zerschneiden durch die FokI Restriktionsendonuklease resistent. Diese Resistenz gegen das Zerschneiden bietet ein Mittel zur selektiven Isolierung von Klonen, die für die FokI Methylase- und Restriktionsendonuklease codieren.
  • Das hierin beschriebene Verfahren, durch das das FokI Restriktionsgen und Methylasegen vorzugsweise kloniert und exprimiert wird, ist in Fig. 1 dargestellt und schließt die folgenden Schritte ein:
  • 1. Die DNA von Flavobakterium okeanokoites wird gereinigt. Flavobakterium okeanokoites wurde in einer Anzahl von Veröffentlichungen beschrieben, darunter Sugisaki und Kanazawa, s. o., deren Offenbarung hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen wird. Proben dieses Bakteriums sind vom Institute for Fermentation, Osaka (IFO 12536) erhältlich.
  • 2. Die DNA wird mit der Restriktionsendonuklease XbaI zerschnitten.
  • 3. Die zerschnittene DNA wird mit einem Klonierungsvektor, wie etwa pUC19 (ATCC 37254) verknüpft, der eine oder mehrere FokI Stellen enthält. Die verknüpfte DNA wird in eine geeignete Wirtszelle transformiert, wie z. B. E. coli Stamm RR1 (ATCC 31343).
  • 4. Die DNA-Zellmischung wird auf ein für transformierte Zellen selektives antibiotisches Medium plattiert, wie z. B. Ampicillin. Nach der Inkubation werden die transformierten Zellkolonien zu einer einzelnen Kultur, der Zellbank, zusammengefaßt.
  • 5. Die rekombinanten Plasmide werden in toto aus der Zellbank gereinigt, um die Plasmidbank zu erzeugen.
  • 6. Die Plasmidbank wird vollständig mit FokI Restriktionsendonuklease, die aus Flavobakterium okeanokoites durch ein Verfahren ähnlich dem von Sugisaki und Kanazawa, s. o. beschriebenen hergestellt wurde, zerschnitten. Das Zerschneiden durch FokI zerstört differenziert unmodifizierte, nicht Methylase enthaltende Klone und steigert die relative Häufigkeit von FokI-Methylase tragenden Klonen.
  • 7. Die zerschnittene Plasmidbank-DNA wird zurück in eine geeignete Wirtszelle, z. B. E. coli Stamm RR1 transformiert und die transformierten Kolonien werden wiederum durch Plattieren auf antibiotische Platten erhalten. Die Kolonien werden abgenommen und ihre DNA wird auf die Anwesenheit des FokI Modifikationsgens in folgender Weise analysiert: Die Plasmid-DNA, die sie tragen, wird gereinigt und in vitro mit FokI Restriktionsendonuklease inkubiert, um zu bestimmen, ob sie gegen das Zerschneiden durch FokI resistent ist. Die gesamte zelluläre DNA (chromosomal und Plasmid) des Klons wird ebenfalls gereinigt und mit FokI Restriktionsendonuklease inkubiert. Die DNA von Klonen, die das FokI Methylasegen tragen, sollte vollständig modifiziert sein und sowohl die Plasmid-DNA als auch die Gesamt-DNA sollte sich als im wesentlichen oder vollständig resistent gegen die Aufspaltung erweisen.
  • 8. FokI Restriktionsendonuklease tragende Gene werden durch Herstellung von rohen Extrakten derjenigen Klone, die in Schritt 8 als das FokI' Methylasegen tragend identifiziert wurden, und durch Untersuchung der Extrakte auf FokI Restriktionsendonukleaseaktivität identifiziert. Die Erfassung von FokI Restriktionsendonukleaseaktivität in rohen Zellextrakten wird verbessert, wenn die Extrakte aus einem endoA&supmin;Stamm von E. coli, wie z. B. MM294 (ATCC 33625) hergestellt werden, in den die Plasmide durch Transformation übertragen wurden.
  • 9. Die FokI Restriktionsendonuklease kann aus die FokI Restriktions- und Modifikationsgene tragenden Klonen durch Propagierung in einem Fermenter in einem Ampicillin enthaltenden reichen Medium produziert werden. Die Zellen werden anschließend durch Zentrifugation abgeerntet und durch Schallbehandlung zerrissen, um einen rohen Zellextrakt zu erzeugen, der FokI Restriktionsendonukleaseaktivität enthält.
  • 10. Der die FokI Restriktionsendonukleaseaktivität enthaltende rohe Zellextrakt wird durch Standard-Proteinreinigungstechniken gereinigt, wie z. B. Affinitätschromatographie und Ionenaustauschchromatographie.
  • Obgleich die vorstehend umrissenen Schritte den bevorzugten Modus zur praktischen Ausführung der vorliegenden Erfindung darstellen, ist für den Durchschnittsfachmann offensichtlich, daß der vorstehend beschriebene Ansatz in Übereinstimmung mit nach dem Stand der Technik bekannten Techniken variieren kann.
  • Das folgende Beispiel dient zur Erläuterung von Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, wie sie gegenwärtig vorzugsweise praktisch ausgeführt wird. Es versteht sich, daß dieses Beispiel erläuternd ist und daß die Erfindung nicht als darauf beschränkt zu betrachten ist, mit Ausnahme dessen, was in den angefügten Ansprüchen angegeben ist.
    • BEISPIEL Klonierung des FokI Restriktionsendonukleasegens
  • 1. DNA-Reinigung: 10 g gefrorene Flavobakterium okeanokoites (IFO 12536)-Zellen wurden auf Eis 1 Stunde lang aufgetaut und anschließend in 20 ml 25% Sukrose, 50 mM Tris pH 8,0 resuspendiert. 10 ml 0,25 M EDTA pH 8,0 und 6 ml 10 mg/ml Lysozym in 0,25 M Tris pH 8,0 wurden zugegeben. Die Suspension wurde 2 Stunden lang auf Eis belassen und anschließend durch Zugabe von 24 ml 1% Triton X-100, 50 mM Tris pH 8,0, 67 mM EDTA und 5 ml 10% SDS lysiert. Die Lösung wurde mit 70 ml Phenol (vorab mit 0,5 M Tris pH 8,0 äquilibriert) und 60 ml Chloroform extrahiert. Die Emulsion wurde bei 10 K min&supmin;¹ 30 Minuten lang zentrifugiert und die visköse obere Schicht wurde entnommen und gegen vier jeweils ausgetauschte Lösungen von 10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde anschließend mit RNAse bei einer Endkonzentration von 100 ug/ml 1 Stunde lang bei 37ºC zerschnitten. Die DNA wurde dann durch Zugabe von NaCl auf eine Endkonzentration von 0,4 M, Überschichten mit 0,55 Volumina Isopropylalkohol und Spooling der DNA auf einen Glasstab durch Zusammenmischen der Phasen ausgefällt. Die DNA wurde in 10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA resuspendiert und bei 4ºC gelagert.
  • 2. Zerschneiden der DNA: Die DNA wurde auf eine Konzentration von 100 ug/ml in 50 mM Tris pH 7,5, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl&sub2; verdünnt und zwei Einheiten XbaI pro ug DNA wurden zugegeben. Die Lösung wurde bei 37ºC 1 Stunde lang inkubiert, worauf das Zerschneiden durch 12 Minuten langes Erwärmen auf 72ºC beendet wurde.
  • 3. Ligation und Transformation: 4,0 ug XbaI-zerschnittene Flavobakterium okeanokoites-DNA (40 ul) wurden mit 2 ug XbaI- zerschnittenem und dephosphoriliertem pUC19 (10 ul) gemischt. 10 ul 500 mM Tris pH 7,5, 100 mM MgCl&sub2;, 100 mM DTT, 5 mM ATP und 40 ul steriles destilliertes Wasser wurden zugegeben, um das Volumen auf 100 ul zu bringen. 3,75 ul T4-DNA-Ligase wurden zugegeben und die Lösung wurde bei 16ºC 4 Stunden lang inkubiert, anschließend durch Extraktion mit 20 ul Chloroform sterilisiert. 80 ul der verknüpften Mischung wurden mit 1,0 ml 50 mM NaCl, 5 mM Na&sub3; Citrat, 67 mM CaCl&sub2; gemischt und 2,0 ml eisgekühlter kompetenter E. coli RR1 (ATCC 31343)-Zellen wurden zugegeben. Die Lösung wurde bei 42ºC 5 Minuten lang inkubiert, anschließend wurden 8 ml Luria-Nährlösung (L-Nährlösung) zugegeben und die Inkubation wurde bei 300 C 4 Stunden lang fortgeführt.
  • 4. Zellbank: Die transformierte Zellkultur wurde kurz zentrifugiert, der Überstand weggeworfen und die Zellen wurden in 1,0 ml L-Nährlösung resuspendiert. 200 ul-Portionen wurden auf Luria-Agar (L-Agar)-Platten plattiert, die 100 ug/ml Ampicillin enthielten. Nach Inkubation über Nacht bei 30ºC wurden die Platten jeweils mit 2,5 ml 10 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2; geflutet und anschließend wurden die transformierten Kolonien zusammengekratzt und zu einem Pool zusammengefaßt.
  • 5. Plasmidbank: 2,5 ml der Zellbank wurden in 500 ml L-Nährlösung geimpft, die 100 ug/ml Ampicillin enthielt. Die Kultur wurde über Nacht bei 300 C geschüttelt und anschließend bei 4000 min&supmin;¹ 5 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde weggeworfen und das Zellpellet wurde in 10 ml 25% Sukrose, 50 mM Tris pH 8,5 bei Raumtemperatur resuspendiert. 5 ml 0,25 M EDTA, pH 8,0 und 3 ml 10 mg/ml Lysozym in 0,25 M Tris, pH 8,0 wurden zugegeben. Die Lösung wurde 1 Stunde lang auf Eis belassen, worauf 12 ml 1% Triton X-100, 50 mM Tris pH 8,0, 67 mM EDTA kraftvoll zupipettiert wurden und die Suspension wurde sanft gerüttelt, um die Lyse zu erzielen.
  • Nach erfolgter Lyse wurde die Mischung auf ein 50 ml Röhrchen übertragen und 45 Minuten lang bei 17000 min&supmin;¹, 4ºC zentrifugiert. Der Überstand wurde mit einer Pipette entfernt. 20,0 gm festes CsCl wurden in ein 50 ml Kunststoffröhrchen mit Schraubverschluß gewogen und 22 g Überstand wurden in das Röhrchen pipettiert und gemischt. 1,0 ml 5 mg/ml Ethidiumbromid in 10 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA wurden zugegeben. Die Lösung wurde auf zwei 5/8 Zoll · 3 Zoll Zentrifugenröhrchen übertragen und in einem Beckman TI70 Rotor 72 Stunden lang bei 44000 min&supmin;¹, 170 C zentrifugiert. Um die Plasmide zu sammeln, wurden die Röhrchen geöffnet, mit ultraviolettem Licht beleuchtet und das untere der beiden fluoreszierenden Bänder wurde mit einer Spritze aufgenommen. Die unteren Bänder aus jedem Röhrchen wurden kombiniert und das Ethidiumbromid wurde durch viermalige Extraktion mit einem gleichen Volumen wassergesättigtem, eisgekühlten M-Butanol entfernt.
  • Die extrahierte Lösung wurde viermal gegen jeweils ausgetauschten Tris pH 7,5, 1 mM EDTA dialysiert, worauf die Nucleinsäure durch Zugabe von 2 Vol. Isopropanol und ausreichend 5 M NaCl zum Erreichen einer Endkonzentration von 0,4 M ausgefällt wurde. Die Lösung wurde über Nacht bei -20ºC gelagert und anschließend 15 Minuten bei 15000 min&supmin;¹, 0ºC zentrifugiert. Der Überstand wurde weggeworfen, das Pellet 15 Minuten lang luftgetrocknet und anschließend in 500 ul 10 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA aufgelöst und bei -20ºC gelagert. Die Plasmid-DNA-Konzentration wurde mit annähernd 150 ug/ml festgestellt.
  • 6. Zerschneiden der Plasmidbank: Die Plasmidbank wurde auf 30 ug/ml in 10 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 6 mM Mercaptoethanol, 20 mM KCl verdünnt. FokI Restriktionsendonuklease wurde bis zu einer Konzentration von 16 Einheiten/ug DNA zugegeben und das Röhrchen wurde bei 37ºC eine Stunde lang inkubiert. Die Reaktion wurde durch 12 Minuten langes Erwärmen auf 20ºC beendet.
  • 7. Transformation: 12,5 ul der zerschnittenen Bank wurden in E. coli Stamm RR1 transformiert, auf 100 ug/ml Ampicillin enthaltendes L-Agar plattiert und über Nacht bei 30ºC inkubiert. Das FokI-Zerschneiden verringerte die Anzahl der Transformanten um einen Faktor 10³ im Vergleich zur Transformation mit nicht zerschnittenen Plasmiden. Vierzehn Kolonien wurden von den Überlebenden auf den Platten ausgewählt und jede wurde in 10 ml Ampicillin enthaltende L-Nährlösung geimpft, um eine Minikultur zu präparieren, und auf eine Ampicillin enthaltende L-Agar-Platte ausgestrichen, um einen Hauptstamm zu präparieren.
  • 8. Analyse der überlebenden Individuen: Vierzehn der aus Abschnitt 7 erhaltenen über lebenden Kolonien wurden zu 10 ml- Kulturen gezüchtet und die Plasmide, die sie trugen, wurden durch den folgenden Minipräparation-Reinigungsvorgang präpariert, der aus dem Verfahren von Birnboin und Doly, Nucleic Acids Res. 7 : 1513 (1979) adaptiert wurde.
    • Minipräparationsverfahren:
  • Jede Kultur wurde bei 8000 min&supmin;¹ 5 Minuten lang zentrifugiert; der Überstand wurde weggeworfen und das Zellpellet wurde in 1,0 ml 25 mM Tris, 10 mM EDTA, 50 mM Glukose, pH 8,0, 1 mg/ml Lysozym enthaltend resuspendiert. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden 2 ml 0,2 mM NaOH, 1% SDS jedem Röhrchen zugegeben und die Röhrchen wurden zur Lyse der Zellen geschüttelt und anschließend auf Eis gelagert. Nachdem sich die Lösungen geklärt hatten, wurden 1,5 ml 3 M Natriumacetat, pH 4,8 zu jedem Röhrchen zugegeben und geschüttelt. Der entstehende Niederschlag wurde bei 15000 min&supmin;¹, 4ºC 10 Minuten lang abzentrifugiert. Jeder Überstand wurde in ein Zentrifugenröhrchen gegossen, das 3 ml Isopropanol enthielt, und gemischt. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Röhrchen bei 15000 min&supmin;¹ 10 Minuten lang zentrifugiert, um die ausgefällten Nucleinsäuren zu pelletieren. Die Überstände wurden weggeworfen und die Pellets wurden bei Raumtemperatur 30 Minuten lang luftgetrocknet. Nach der Trocknung wurden die Pellets in 850 ul 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0 resuspendiert. 75 ul 5 M NaCl wurden zu jedem Röhrchen zugegeben und die Lösungen wurden in 575 ul Isopropanol enthaltende Eppendorfkolben gegeben und wiederum 10 Minuten bei Raumtemperatur ausgefällt. Die Kolben wurden anschließend 45 Sekunden lang in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert, die Überstände weggeworfen und die Pellets luftgetrocknet. Die Pellets wurden dann in 500 ul 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0, 100 ug/ml RNase enthaltend aufgelöst und eine Stunde bei 37ºC inkubiert, um die RNA zu zerschneiden. Die DNA wurde erneut durch Zugabe von 50 ul 5 M NaCl, gefolgt von 350 ul Isopropanol ausgefällt. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurde die DNA durch 45 Sekunden langes Zentrifugieren abzentrifugiert, die Überstände wurden weggeworfen und die Pellets in 150 ul 10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8,0 erneut aufgelöst. Die Plasmid-Minipräparate wurden nachfolgend durch Zerschneiden mit FokI und XbaI analysiert. 9. FokI Methylasegenklone: Elf der analysierten Plasmide stellten sich als FokI gegenüber empfindlich und als zufällige XbaI-Fragmente von Flavobakterium okeanokoites-DNA tragend heraus. Diese Plasmide waren zufällige Überlebende und wurden weggeworfen. Bei drei verbleibenden Plasmiden wurde festgestellt, daß sie resistent gegen FokI sind und ein einzelnes XbaI-Fragment mit einer Länge von 6 kb tragen (Fig. 2). Diese Plasmide schienen identisch zu sein; eines davon, pML109RM 119-1 wurde weiter analysiert und es wurde nachgewiesen, daß es nicht nur das FokI Modifikationsmethylasegen, sondern auch das FokI Restriktionsendonukleasegen trug.
  • 10. FokI Restriktionsgenklon: Bei pML109RM 119-1 wurde festgestellt, daß es das FokI Restriktionsendonukleasegen trägt, indem ein aus E. coli Stamm MM294 (ATCC 33629), in den das Plasmid durch Transformation übertragen worden war, präparierter Extrakt untersucht wurde.
    • Endonukleaseuntersuchung:
  • Zur Untersuchung auf FokI Endonukleaseaktivität wurden zwei Lösungen hergestellt:
  • (i) 10X Restriktionsendonukleasepuffer: 100 mM Tris, pH 7,5, 100 mM MgCl&sub2;, 60 mM Mercaptoethanol, 200 mM KCl.
  • (ii) Zerschneidungsreaktionsmischung: 18 ul Lambda-DNA (630 ug/ml), 56 ul 10X Restriktionsendonukleasepuffer, 486 ul destilliertes Wasser.
  • Der Zellextrakt wurde wie folgt präpariert: Eine 50 ml-Kultur wurde über Nacht in L-Nährlösung plus 100 ug/ml Ampicillin bei 300 C gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren mit 4000 min&supmin;¹ für 5 Minuten pelletiert und dann in 4 ml 10 mM KPO&sub4; pH 7,5, 10 mM Mercaptoethanol, 0,1 mM EDTA resuspendiert. 0,5 ml 1,8 mg/ml Lysozym in demselben Puffer wurden zugegeben und die Suspension 1 Stunde lang auf Eis belassen. 1 ml der Suspension wurde sanft mit drei 10-Sekunden-Stößen zum Zerreißen der Zellen schallbehandelt. Das Röhrchen wurde 10 Minuten lang in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert und der Überstand wurde als der Zellextrakt verwendet. Zur Untersuchung des Extrakts wurde die Zerschneidungsreaktionsmischung in 5 Röhrchen verteilt, 100 ml in das erste Röhrchen und 50 ml in jedes der übrigen 4 Röhrchen. 15 ul Extrakt wurden zu dem ersten Röhrchen zugegeben und gemischt. 50 ul wurden aus dem ersten Röhrchen entnommen und auf das zweite Röhrchen übertragen, gemischt, und so fort. Das erste Röhrchen erhielt somit 7,5 ul Extrakt pro ug DNA, das zweite Röhrchen 3,75 ul/ug, das dritte Röhrchen 1,88 ul/ug, und so fort. Die Röhrchen, die nun jeweils 50 ul enthielten, wurden bei 37ºC eine Stunde lang inkubiert, dann wurde eine 20 ul Probe jedes Röhrchens durch Gelelektrophorese analysiert. Es wurde festgestellt, daß der Extrakt annähernd 100 Einheiten FokI Endonuklease pro ml enthielt, was etwa 1500 Einheiten pro Gramm Zellen entspricht (Fig. 3).

Claims (7)

1. Isoliertes DNA-Segment, für die FokI-Restriktionsendonuklease codierend, wobei die isolierte DNA aus Flavobacterium okeanokoites (IFO 12536) erhältlich ist.
2. Rekombinanter DNA-Vektor, umfassend einen Vektor, in den ein für die von Flavobacterium okeanokoites (IFO 12536) erzeugte FokI-Endonuklease codierendes DNA-Segment eingefügt wurde.
3. Isoliertes DNA-Segment, für die FokI-Restriktionsendonuklease und -methylase codierend, wobei die isolierte DNA aus Flavobacterium okeanokoites (IFO 12536) erhältlich ist.
4. Klonierungsvektor, umfassend das isolierte DNA-Segment nach Anspruch 1.
5. Klonierungsvektor, umfassend das isolierte DNA-Segment nach Anspruch 3.
6. Wirtszelle, transformiert durch den Vektor nach Anspruch 4 oder 5.
7. Verfahren zur Erzeugung von FokI-Restriktionsendonuklease, umfassend das Züchten einer mit dem Vektor nach Anspruch 4 oder 5 transformierten Zelle unter Bedingungen zur Expression der Endonuklease.
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