DE69032406T2

DE69032406T2 - Wundheilmittel enthaltend heparanase

Info

Publication number: DE69032406T2
Application number: DE69032406T
Authority: DE
Inventors: Zvi Fuks; Israel Shevo Street Vlodavsky
Original assignee: Hadassah Medical Organization
Current assignee: Hadassah Medical Organization
Priority date: 1989-08-23
Filing date: 1990-08-22
Publication date: 1998-10-29
Anticipated expiration: 2010-08-23
Also published as: EP0487627A1; US5362641A; CA2065744A1; EP0487627A4; DE69032406D1; KR927003090A; ATE167230T1; JP3188691B2; EP0487627B1; WO1991002977A1; JPH05504047A; AU6336490A; AU654804B2

Description

1 GELTUNGSBEREICH

Diese Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen zur Stimulierung des Wundheilungsprozesses. Diese Erfindung betrffft insbesondere ein Verfahren zur Förderung der Wundheilung durch den Einsatz von Zusammensetzungen, die eine gereinigte, aus der Zellinie Sk-Hep-1 gewonnene Heparanase-Form enthalten.

2 HINTERGRUND DER ERFINDUNG

2.1 HEPARANSULFAT UND VERBUNDENE VERBINDUNGEN
Das Ektoplasma, die extrazelluläre Matrix und die Basalmembranen sämtlicher Gewebearten enthalten u.a. komplexe Makromoleküle, die Heparansulfat-Proteoglycane (HSPG) bezeichnet werden. Man vermutet, daß diese unterschiedliche Funktionen in biologischen Prozessen haben: wie es scheint, wirken sie mit bei der Zell-Zell- Erkennung, der Gewebedifferenzierung und -morphogenese, der Organisation von extrazellulärer Matrix, permaselektiven Eigenschaften und der Zell-Substrat-Adhäsion. Die extrazelluläre Matrix scheint für die Steuerung der Zellproliferation und -morphogenese wesentlich zu sein, und HSPG als ein Hauptbestandteil von Basalmembranen spielt eine wesentliche Rolle bei der Gewebestruktur und -funktion.
Proteoglycane sind Verbindungen mit großem Molekulargewicht und einer Protein-Hauptkette; mit dieser Hauptkette sind eine Reihe von Seitenketten aus unterschiedlichen Heteropolysaccharid-Arten verknüpft. Ein großer Teil des Molekulargewichts entfällt somit auf die Kohlenhydrate. Diese Verbindungen lassen sich routinemäßig anhand einer Reihe von unterschiedlichen Enzymen aufschließen. Der Abbau der Proteoglycane beginnt gewöhnlich mit der proteolytischen Spaltung der Hauptkette zur Gewinnung von Peptidkomponenten und Glycosaminoglycanen. Letztere wiederum lassen sich mit Hilfe von Endoglycosidasen in kleinere Glykosaminoglycan-Fragmente aufspalten, die wiederum mittels Exoglykosidasen zu Monosacchariden weiter abgebaut werden können. Heparansulfat-Proteoglycane stehen in enger Wechselbeziehung mit den anderen die extrazelluläre Matrix bildenden Makromolekülen, und somit kann sich ihr Abbau auf die Steuerung der Zellverankerung, der Zellbewegung, der Zelifunktion und des Zellwachstums tiefgreifend auswirken.

2.2 HSPG-ABBAU

Eine Reihe von normalen und anormalen physiologischen Zuständen und Störungen hängen, wie man jetzt nachgewiesen hat, mit dem Abbau der extrazellulären Matrix verschiedener Gewebe zusammen. Die Neutrophilenmobilisierung als Teil des Entzündungsprozesses, beispielsweise, erfordert es, daß die Zellen das Endothel der Blutgefäße sowie die darunterliegende Basalschicht durchdringen, um zum Zielgewebe zu gelangen. Diese Penetration erfordert die spezifische und schwache Wirkung von leicht freigesetzten Enzymen (z.B. Heparanase), die von den Neutrophilen unter Bedingungen exprimiert wird, die die Unversehrtheit der Gefäßwand aufrechterhalten (Matzner et al., J. Clin. Invest. 76: S.1306 - 1313, 1985). Ebenso müssen beim Prozeß von Metastasen Tumorzellen in die Basalschicht des vaskulären Endothels eindringen, um zu anderen Punkten im Körper transportiert zu werden. Auch T-Lymphozyten durchdringen bei ihrer Reaktion auf die Gegenwart eines Antigens die Wände von Blutgefäßen und die subendothele extrazelluläre Matrix. Die Zellinvasion wird typischerweise durch den enzymatischen Abbau der die Zellen umgebenden Matrix erreicht. Die eindringenden Zellen müssen daher in der Lage sein, immer dann, wenn es zur erfolgreichen Durchdringung der Blutgefäßwand oder eines anderen Zielgewebes notwendig ist, extrazelluläre Matrix (ECM) abbauende Enzyme zu bilden.
Da man weiß, daß eine Reihe von Proteoglycanen als Teil des Bindegewebes vorkommen, könnte es sich bei den abbauenden Enzymen theoretisch um jedes aus einer Reihe von Enzymen handeln, die ein bestimmtes sulfatiertes Proteoglycan angreifen. So kann die ECM beispielsweise je nach Art des betroffenen spezifischen Gewebes Chondroitinsulfat, Dermatansulfat, Hyaluronat, Keratansulfat oder Heparansulfat in einer charakteristischen Zusammensetzung enthalten. Diese lassen sich jeweils abbauen durch Chondroitinase, Hyaluronidase, Keratanase bzw. Heparanase. Die Fähigkeit einer bestimmten Zelle, einen bestimmten Gewebetyp zu durchdringen, hängt, so gesehen, zu einem großen Umfang von ihrer Produktion eines oder mehrerer Enzyme, die die Proteoglycane in dem Gewebe abbauen können, ab. HSPG wirkt mit verschiedenen Makromolekülen in der ECM zusammen, so z.B. Kollagenen, Laminin und Fibronektin. Dies läßt vermuten, daß dieses Proteoglycan eine Schlüsselrolle spielt bei der strukturellen Integrität, Selbstorganisation und Unlöslichkeit der ECM. Wegen dieser Eigenschaft und weil HSPG das wichtigste Proteoglycan von Basalmembranen ist, ist sein Abbau notwendig, um Zellen das Durchdringen von Blutgefäßen und Epithel-Basalmembran zu ermöglichen.
Vor kurzem hat man festgestellt, daß eine bestimmte Endoglycosidaseart von bestimmtem Zelltypen produziert wtrd. So wurde zum Beispiel aufgezeigt, daß wandemde humane Neutrophile durch Ausscheidung von Heparanase Heparansulfat abbauen können (Matzner et al., a.a.O.). Dieselbe Art von Enzym, so hat man nachgewiesen, wird von metastatischen Melanomzellen (Nakajima et al., J. Biol. Chem. 259: S.2283 - 2290, 1984; Vlodavsky et al., Exptl. Cell Res. 140: S.149 - 159, 1982) und metastatischen Lymphomzellen (Vlodavsky et al., Cancer Res. 43: S.2704 - 2711, 1983) produziert. Antigen-stimulierte T-Lymphozyten scheiden ebenso Heparanase aus, und zwar kurz nach der Konfrontation mit Antigen (Naparstek et al., Nature 310: S.241 - 243, 1984; Fridman et al., J. Cell. Physiol. 130: S.85 - 92, 1987). Die Endoglycosidase Heparanase scheint somit eine Hauptrolle bei einer Reihe von spezifischen physiologischen Funktionen zu spielen, wie z.B. bei der Tumormetastase (durch die Erleichterung des Eindringens in Blutgefäße, Basalmembranen und ECM) und bei Autoimmun-Störungen (durch die Erleichterung der Extravasation von aktivierten Zellen im Immunsystem). Der Einsatz von Heparanase- Inhibitoren zur Verhinderung von Tumormetastasen und Autoimmun- Störungen ist vor kurzem angeregt worden (WO 88/01280, 1988).
Biochemische Analysen von Heparansulfat-(HS-)Abbauprodukten ergaben, daß die Melanomzell-Heparanase β-D-Glycuronosyl-N-acetylglucosaminyl-Bindungen in HS spaltet (Nakajima et al., J. Biol. Chem. 259: S. 2283 - 2290, 1984). Die Melanom- und Leber-Endo-β-D-Glucuronidasen scheinen HS, nicht jedoch Heparin abzubauen. Demgegenüber depolymerisiert Human-Thrombozyten-Enzym sowohl HS als auch Heparin, und zeigt eine Endoglucuronidase von einem Mäuse- Mastozytom strikte Spezifität in bezug auf makromolekulares Heparin- Proteoglycan.

2.3 GEFASSBILDENDE FAKTOREN

Neben den oben in bezug auf Heparanase angeführten Funktionen hat man ferner festgestellt, däß dieses Enzym die Wirkung hat, eine Freisetzung von die Gefäßbildung betreffenden Endothelzellen- Wachstumsfaktoren aus Basalmembranen und Subendothel-ECM zu veranlassen (Vlodavsky et al., PNAS USA 84: S.2292 - 2296); Folkman et al., Am. J. Pathol. 130: S.393 - 400, 1988; Bashkin & Vlodavsky, Biochemistry 28: S.1737 - 1743, 1989. "Angiogenese" ("Geläßbildung") betrifft den Prozeß der Bildung neuer Blutgefäße, der eine Reihe von normalen und anormalen physiologischen Prozessen im Körper begleitet. Die Gefößbildung geht beispielsweise typischerweise einher mit dem Prozeß der Tumorbildung sowie dem Prozeß der Gewebewiederherstellung bei der Wundheilung. Vor kurzem hat man nachgewiesen, daß eine Reihe von Gefäßbildungsfaktoren natürlicherweise in vielen Geweben des Körpers vorkommen (Folkman und Klagsbrun, Science 235: S.442 - 447, 1987). Angiogenin, beispielsweise, ist ein Polypeptid, von dem man festgestellt hat, daß es angiogene Aktivität in der Cornea von Kaninchen sowie in Hühnerembryos besitzt. Die Art seiner Aktivität ist noch unklar, jedoch vermutet man, daß es die Freisetzung von Endothel-Mitogenen oder Chemoattraktanten aus Wirtszellen veranlaßt oder Makrophagen zur Freisetzung dieser Faktoren mobilisiert. Transformierende Wachstumsfaktoren (TGF) sind ebenso Polypeptide, die das Verhalten von Fibroblasten oder anderen Zellen in der Kultur verändern und angiogene Aktivität in vivo zeigen (Folkman und Klagsbrun, a.a.O). Andere Faktoren wie z.B. ein geringes Molekulargewicht aufweisende Endothel-Mitogene, chemotaktische Endothelzell- Faktoren und gewisse Lipide wie z.B. Prostaglandine sind, wie man festgestellt hat, angiogen, doch konnte die Art ihrer Aktivität bislang noch kaum charakterisiert werden. Von keinem dieser vorgenannten Faktoren konnten bisher irgendwelche Verbindungen zu Heparanase aufgezeigt werden.

2.3.1 FIBROBLASTEN-WACHSTUMSFAKTOR

Eine weitere Gruppe von Faktoren, bekannt als Fibroblasten- Wachstumsfaktoren (FGF) und Endothelzellen-Wachstumsfaktoren (ECGF) unterscheiden sich von diesen anderen angiogenen Verbindungen durch ihre Fähigkeit, Heparin mit hoher Affinität zu binden (Lobb et al., J. Biol. Chem. 261, S.1924 - 1928, S.1986). Heparin ist eine bekannte Verbindung, die, wie man festgestellt hat, sekundär in vielen verschiedenen Situationen mit Angiogenese in Verbindung steht, doch ist seine unmittelbare Rolle bei diesem Prozeß bislang noch unklar. Diese Heparin-bindenden Wachstumsfaktoren jedoch sind direkter an dem Prozeß beteiligt. Diese Faktoren zählen zu den ersten, die so identifiziert wurden; FGF umfaßt zwei Klassen von Polypeptiden, kationische oder basische FGF und anionische oder säurebildende FGF, wobei ECGF eine erweiterte Form von säurebildenden FGF ist. Beide Arten von Heparin-bindenden Wachstumsfaktoren stimulieren nachweislich die Endothelzellen-Migration und das Endothelzellen- Wachstum sowohl in vitro als auch in vivo und scheinen auch die Bildung von gefäßreichem Granulationsgewebe anzuregen (Shing et al., J. Cell Biochem. 29: S.275 - 287, 1985).
Ein interessanter Aspekt dieser hochaktiven Faktoren ist, daß sie in normalem lebendem Gewebe praktisch überall vorkommen und die endothele Proliferation in diesen Geweben dennoch recht schwach ist. Diese Feststellung deckt sich mit der Theorie, daß die Faktoren in einem gebundenen, inaktiven Zustand im Gewebe vorkommen und nur selten freigesetzt werden, Diese Vermutung hat sich vor kurzem bestätigt, und man hat jetzt aufgezeigt, daß basisches FGF innerhalb der Basalmembran gespeichert wird (Folkman et al., Am. J. Pathol. 130: S. 393 - 400, 1988). Es spricht sehr vieles dafür, daß FGF innerhalb der ECM (ABB. 1) und innerhalb von Basalmembranen von der Cornea (ABB. 2) und um Blutgefäße herum an Heparansulfat gebunden ist (Bashkin et al., Biochemistry 28: S.1737 - 1743, 1989) und so die Wachstumsfaktoren aus ihrem Wirkungsfeld isolieren, bis ein exogener Faktor seine Freisetzung veranlaßt (ABB. 3).

2.3.2 WUNDHEILUNG

Neben seiner Rolle bei der Angiogenese und Stimulation der Migration und des Wachstums von Endothelzellen ist FGF, wie sein Name impliziert, auch für die Proliferation von Fibroblasten und eigentlich allen anderen von der Mesoderm und Neuroectoderm abstammenden Zellen von Bedeutung. Fibroblasten sind mesenchymale Bindegewebszellen, die für die Produktion von Kollagenfasern, einer der wichtigsten Bausteine des Bindegewebes, verantwortlich sind. Beide, die Endothel- wie auch die Fibroblasten-Proliferation, sind wesentliche Elemente des Wundheilungsprozesses. Kommt es zu einer Verletzung, dann tritt in der unmittelbaren Folge eine Reihe von Ereignissen ein, an denen viele verschiedene Zelltypen beteiligt sind. Weiße Blutzellen, insbesondere phagozytische weiße Blutzellen, werden rasch zu der betroffenen Stelle hingezogen, um die Wunde durch Entfernen von Fremdkörpern einschließlich Mikroben zu reinigen. Zur gleichen Zeit treten in diesem Bereich Fibroblasten in großer Anzahl auf und beginnen, im Rahmen des Prozesses der Bindegewebsbereitung und -regenerierung Kollagen abzulegen. Die Zone wird auch von Endothelzellen überschwemmt, die neue Kapillare bilden zur Versorgung des neuen Gewebes mit Nährstoffen und zur Ableitung von Abfall aus diesem Bereich. Schließlich ist das verletzte Gewebe vollständig durch neues Gewebe ersetzt und wandern Epithelzellen von überall her, um letztendlich die Oberfläche zu überdecken. Schlecht heilende Wunden oder nicht heilende Wunden (Geschwüre) treten unter vielen klinischen Gegebenheiten auf, einschließlich Artheriosklerose und Diabetes; als Nebenwirkungen von Behandlungen, die mit einer Stereotherapie, Immuntherapie, Strahlentherapie und Chemotherapie einhergehen; bei Druckgeschwüren; und als Folge einer Vielzahl von Verletzungen bei älteren Menschen. Verbrennungen stellen eine besondere Art von nicht heilenden Wunden dar. Zwar ist eine Infektion üblicherweise der Grund für schlechtes Heilen, doch gibt es auch andere wichtige Faktoren wie z.B. das Unvermögen, Mesenchymzellen zu rekrutieren und das Unvermögen, eine adequate Blutversorgung herzustellen und aufrechtzuerhalten. Aus diesem Grund werden Mitogene, die, wie man festgestellt hat, Mesenchymzellen in vitro anziehen und deren Proliferation fördern und die Neovascularisierung in vivo einleiten, intensiv als Mittel zur Wundheilung untersucht (Lobb, Euro. J. Clin. Invest. 18: S.321 - 326, 1988).
Setzt man ein gewisses Verständnis der Mechanismen, die bei der Wundheilung mit hinein spielen, voraus, dann scheint es, daß FGF eine bedeutende Rolle in dem Prozeß spielt, und zwar durch seine Wirkung auf die Angiogenese sowie auch durch seine Wirkung auf das Wachstum von Fibroblasten. Die Fähigkeit, seine Freisetzung zu steuern oder seine Produktion zu stimulieren, könnte tiefgreifende Auswirkungen auf die Verbesserung des Wundheilungsprozesses haben. Bislang jedoch ist bei noch keinem bekannten Verfahren FGF zur Beschleunigung des Heilungsprozesses wirksam eingesetzt worden. Rekombinantes FGF ist zwar bekannt, doch ähnelt es verschiedenen Human-Oncogen-Produkten (Thomas, TIBS 13: S.327 - 328, 1988) und kann unter gewissen Umständen eine Zelltransformation auslösen (Rogely et al., Nature 331: S.173 - 175, 1988). Hohe Dosen von FGF sind, so hat man nachgewiesen, auch für verschiedene Zelltypen einschließlich Endothelzellen toxisch.
Wie oben erwahnt, ist FGF in seiner natürlichen Lage in der extrazellulären Matrix (ECM) befindlich an Heparansulfat gebunden und kann durch die Zugabe von Heparanase zur ECM freigesetzt werden. Die Zugabe von Heparanase kann somit eine wirksame Methode zur Mobilisierung und Aktivierung des ECM-gebundenen FGF und somit zur Förderung des Wundheilungsprozesses sein. Der Einsatz von Heparanase zur Freisetzung von FGF aus seiner natürlichen Lage hat den Vorteil, daß die Zellen auf den endogenen natürlichen Wachstumsfaktor lokal und in geeigneten Mengen reagieren. Die Zubereitungen von Heparanase, die man derzeit kennt, sind jedoch zu roh, um therapeutisch zur Entfernung von FGF aus dem Bindegewebe, in dem es gebunden ist, eingesetzt zu werden. Es bedarf einer relativ reinen Heparanase, bevor man überhaupt daran denken kann, dieses Enzym beim Menschen in vivo einzusetzen. Andere pathologische Umstände als die Wundheilung, die wahrscheinlich von der von FGF gelrderten Neovascularisation profitieren werden, sind Herzkrankheiten, Hirnleiden und periphere ischämische Erkrankungen sowie mit Vaskulärschäden einhergehende Krankheiten wie Diabetes, Bluthochdruck und systemischer Lupus erythematosus. Andere mögliche klinische Anwendungsfälle für angiogene Faktoren finden sich in Prozessen wie Ovulation, Haarwachstum, Transplantation, Nervenregeneration und Knochen- und Knorpelregeneration.

3 ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die hier beschriebene Erfindung liefert eine im wesentlichen gereinigte, aus der Zellinie Sk-Hep-1 gewonnene Heparanase sowie ein Verfahren zu deren Herstellung. Die gereinigte Heparanase wird hergestellt, indem man einen heparanasehaltigen Sk-Hep-1-Zellextrakt einer Kationenaustauscherchromatographie auf CM-Sephadex und danach einer Affinitätschromatographie auf Heparin-Sepharose und/oder ConA-Sepharose und Gelfiltration durch Sephadex G-100 unterzieht.
Die so hergestellte Heparanase besitzt eine Reinheit, die die Reinheit des rohen Zellextraktes um mindestens ein 4000faches übertrifft. Diese gereinigte Heparanase liefert die Grundlage für nützliche pharmazeutische Zusammensetzungen, die die gereinigte Heparanase in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren, vorzugsweise langsam freisetzenden Träger enthalten. Eine solche Zusammensetzung eignet sich zur Behandlung von Wunden sowie zur Beschleunigung des Wundheilungsprozesses. Sie ist ebenso dienlich zur Behandlung von anderen physiologischen Zuständen oder Bedingungen, bei denen man erwartet, daß eine Neovascularisierung oder Angiogenese von Nutzen ist. Eine Wundbehandlung läßt sich durch Verabreichung einer wirksamen Menge der Zusammensetzung dieser Erfindung an die verletzte Person bewirken.
Diese Erfindung betrifft also eine Heparanase-Formulierung, die sich aus der Zellinie Sk-Hep-1 gewinnen läßt, wobei die spezifische Heparanase-Aktivität der Formulierung die spezifische Heparanase- Aktivität eines dialysierten Überstandes eines aus der Zellinie Sk-Hep-1 gewonnenen, zentrifugierten Zell-Homogenats um mindestens ein 1000faches überschreitet, sowie ein Verfahren zur Bereitung derselben und die Verwendung dieser Formulierung als Arzneimittel und zur Bereitung von als Diagnosemittel nützlichen Antikörpern.

4 KURZBESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN

Die ABBILDUNG 1 zeigt: Heparin-Sepharose-Chromatographie, Mitogen-Aktivität und durch Elektrophorese vollzogener Transfer Blot von ECM-abstammendem bFGF: a) ECM-Extrakte, aufgebracht auf Heparin-Sepharose, und Wachstumsfaktor-Aktivität, eluiert mit Salzgradienten. Einsatz: aus Rinderaorta gewonnene EC, angesetzt in klonaler Dichte und kultiviert in der Abwesenheit (1) bzw. in der Gegenwart (2) von aus der ECM gewonnenem Wachstumsfaktor; b) elektrophoretischer Transfer Blot: aktive, aus Heparin-Sepharose eluierte Fraktionen, die einer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel- Elektrophorese (SDS-PAGE), Western Blotting und Färbung mit gegen eine interne Sequenz (Positionen 33 - 43) von bFGF gerichtetem Antiserum (Bahn 1) unterzogen wurden.
Die ABBILDUNG 2 zeigt: Grundlegender FGF-ähnlicher Wachstumsfaktor wird in Basalmembranen der Cornea gespeichert; a) Heparin-Sepharose-Chromatographie von Extrakten aus Descemet- Membranen (30 Corneae); b) elektrophoretischer Transfer Blot von aus Heparin-Sepharose eluierten und aus Descemet-Membran (Bahn 2) oder aus dem äußeren Teil (Bahn 1) von Rinder-Corneae gewonnenen und anhand von SDS-PAGE, Blotting und Färben mit gegen eine interne Sequenz von bFGF gerichtetem Antiserum untersuchten aktiven Fraktionen; c) Immunfluoreszenz (Ab gegen innere Sequenz von FGF) (b, d, f) und entsprechende Phasenkontrastbilder (a, c, e) von bFGF innerhalb des gefrorenen Abschnitts von normalen Rinder-Corneae; d) Außenansicht der Bowmanschen Membran; d) Gesamtstärke der Descemet-Membran (f) Färben der Descemet-Membran in der Gegenwart eines löslichen Antigens in 10fachem Überschuß (synthetisches Peptid 33 - 43 von bFGF).
Die ABBILDUNG 3 zeigt: durch Heparanase vermittelte Freisetzung von ECM-gebundenem FGF.
ABBILDUNG 3A: Freisetzung von ECM-gebundenem FGF durch verschiedene gereinigte ECM-abbauende Enzyme. a) ECM-beschichtete Vertiefungen wurden mit ¹²&sup5;I-bFGF inkubiert (90 Min., 22ºC), gewaschen und mit Heparanase (o), Heparinase (o) Chondroitinase ABC (Δ) oder Chondroitinase AC (x) behandelt. In das Inkubationsmittel freigesetzte Radioaktivität wird ausgedrückt als Prozentsatz des insgesamt ECM-gebundenen ¹²&sup5;I-FGF. Die "spontane" Freisetzung in der Gegenwart von Puffer allein lag bei 5 % bis 7 % des insgesamt ECM- gebundenen FGF; b) ECM-beschichtete Kulturschalen mit vier Vertiefungen wurden mit bFGF inkubiert (90 Min., 22ºC), gewaschen und behandelt mit (0,1 Einh./ml, 60 Min., 37ºC) Heparanase (o), Heparinase (o) Chondroitinase ABC (A) oder Hyaluronidase (Δ) Collagenase () oder Trypsin ().Aliquote (20 ul) des Inkubationsmittels wurden auf die Stimulation der DNA-Synthese in wachstumsblockierten 3T3-Zellen hin untersucht; c) ECM-beschichtete Kulturschalen mit vier Vertiefungen wurden nicht behandelt () oder vorbehandelt mit Heparanase (0,1 Einh./ml, 60 Min., 37ºC) () oder Chondroitinase ABC (0,5 Einh./ml, 60 Min., 37ºC) (). ECM wurde gewaschen, mit ¹²&sup5;I-FGF inkubiert (90 Min., 22ºC), und es wurde die Menge des ECM-gebundenen FGF ermittelt.
ABBILDUNG 3B: Freisetzung von endogenem bFGF aus Basalmembranen der Cornea in vivo. Weiße Bahnen zeigen zusammengefaßte Hälften der Innenschichten von Corneae, die eine Stunde lang bei 24ºC
in RPM 1-Medium alleine inkubiert worden waren. Die entsprechenden schwarzen Bahnen stehen für die anderen Hälften dieser Corneae, die in RPMI inkubiert worden waren, das 10 ug/ml Glucosaminoglycan (entweder Heparin, Heparansulfat, ein Hexasaccharidfragment von Heparin oder Chondroitinsulfat C) oder 1 Einh./ml Heparanase oder Chondroitinase/ABC enthielt. Eine durch diese Behandlungen freigesetzte Mitogenaktivität wurde durch polyklonale Anti-bFGF- Antikörper unterbunden.
ABBILDUNG 3C: Freisetzung von ECM-gebundenem FGF durch die Plättchen- und Neutrophilen-Heparanasen. ECM-beschichtete Vertiefungen wurden mit ¹²&sup5;I-FGF inkubiert, gewaschen und entweder mit Heparin, Trypsin, humanen Neutrophilen oder Plättchen in der Abwesenheit () oder Gegenwart () von Karragheen-Lambda (10 ug/ml), einem Inhibitor von Heparanase, inkubiert. Die Freisetzung von FGF durch Plättchen und Neutrophile, nicht jedoch durch Trypsin oder Heparin, wurde durch Karragheen unterbunden.
ABBILDUNG 4: Heparanase-Aktivität in Lysaten von Sk-Hep-1- Zellen. Sk-Hep-1 -Zellen (2 x 106) wurden durch 3maliges Einfrieren und Auftauen lysiert, zentrifugiert, und die überstehende Fraktion wurde mit sulfatmarkierter ECM in der Abwesenheit (Δ) und Gegenwart ovon 10 von 10 ug/ml Heparin, einem Inhibitor der Heparanase- Aktivität, inkubiert (24 Stunden, 37ºC, pH 6,2). Die in das Inkubationsmedium freigesetzten Abbauprodukte wurden durch Gelfiltration auf Sepharose 68 analysiert. Peak 1: Nahezu intaktes HS- Proteoglycan; Peak II: durch Heparanase freigesetzte HS-Abbaufragmente.
ABBILDUNG 5: veranschaulicht die verschiedenen Stufen der Reinigung von Heparanase.
ABBILDUNG 5A: I. CM-Sephadex-Chromatographie. Aus Biorex 70 bei 0,5 M NaCl eluiertes Material wurde gegen 20 mM NaCl, 10 mM Citratphosphatpuffer, pH 5,8, dialysiert und auf CM-SO-Säule aufgebracht (6 x 20 cm). Die Heparanase-Aktivität wurde mit einem linearen Gradienten von 0,01 M - 1 M NaCl eluiert, und jede Fraktion wurde auf ihre Heparanase-Aktivität 0 und Proteinkonzentration hin (Δ) gemessen.
II. Polyacrylamidgel-Elektrophorese und Western Blot-Analyse von Säulenfraktionen. Ausgangsmaterial (Q), ungebundenes Material (Ub), durchgewaschenes Material (W) sowie aus CM-Sephadex mit einem Salzgradienten eluierte Fraktionen (# 12 - 36) wurden einer SDS/PAGE sowie einer Western Immunoblot-Analyse unterzogen. A) Coomassie-Blue-Färbung des Polyacrylamidgels; B) Immobilon-P- Transfermembran, inkubiert mit einer 1 :500fachen Verdünnung von Kaninchen-Anti-Heparanase-Antiserum und durch sukzessive Inkubationen mit biotinylierten Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörpern, peroxidase-konjugiertem Strepavidin und 4-Chlornaphtol-Substrat angefärbt.
ABBILDUNG 5B: Heparin-Sepharose-Chromatographie. Aus CM- Sephadex eluiertes, aktives Material wurde auf eine Salzkonzentration von 0,35 M NaCl in 10 mM Natriumacetat, pH 5,3, eingestellt und auf eine Heparin-Sepharose-Säule (2 x 12 cm) gegeben. Heparanase- Aktivität (o) wurde mit einem Gradienten von 0,4 - 1,2 M NaCl eluiert.
ABBILDUNG 5C: I. Sephadex G-100-Chromatographie. Aus Heparin-Sepharose eluierte und Heparanase-Aktivität enthaltende Fraktionen (34 - 41) wurden zusammengefäßt und gegen 0,2 M Ammoniumformat dialysiert und lyophilisiert. Lyophilisiertes Material wurde in 2 ml 0,5 M NaCl, 10 mM Natriumacetat, pH 5,5, suspendiert und auf eine Sephadex G-100-Säule (1 x 110 cm) gegeben. Heparanase-Aktivität (o) wurde mit demselben Puffer eluiert.
II. SDS-PAGE und Silbernitrat-Färbemuster einzelner, aus Sephadex G- 100 eluierter Fraktionen (31 - 38). Aliquote (200 ul) einer jeden Fraktion wurden dialysiert, lyophilisiert und einer Elektrophorese auf SDS/7 % - 15 % Polyacrylamidgel unterzogen.
ABBILDUNG 5D: I. Con-A-Sepharose-Chromatographie. Aus CM- Sephadex eluierte aktive Fraktionen wurden gegen Puffer A (1 M NaCl, 10 mM Natriumacetat pH 6,0, 1 mM MgCl&sub2;, 1 mM CaCl&sub2; und 1 mM MnCl&sub2;) dialysiert und auf eine Con-A-Sepharose-Säule (2,5 x 6 cm) gegeben. Ausgangsmaterial (o), ungebundenes Material (Δ), durchgewaschenes Material () und mit Puffer A, der 0,2 M Alpha- Methylmannosid (o) enthielt, eluiertes Material wurden auf ihre Heparanase-Aktivität unter Einsatz von sulfatmarkierter ECM als Substrat untersucht.
II, Polyacrylamidgel-Elektrophorese. Bahn 1: MW-Marker; Bahnen 2 & 8: Zell-Lysate; Bahnen 3 & 7: zusammengefäßte aktive Fraktionen, die aus CM-Sephadex eluiert worden waren; Bahn 4: Con- A-Sepharose, ungebundenes Material; Bahn 5: durchgewaschenes Material: Bahn 6; Con-A-Sepharose, mit α-Methylmannosid eluiertes Material. Das Gel war mit Silbernitrat gefärbt worden.
ABBILDUNG 6: Präparative native PAGE. Aus Con-A-Sepharose eluierte aktive Fraktionen wurden zusammengefäßt, dialysiert und auf ein natives 8%iges Polyacrylamidgel aufgebracht. Das Gel wurde in 5- mm-Streifen (0 - 9) geschnitten, und die Heparanse-Aktivität des aus jedem Streifen elektroeluierten Materials wurde untersucht mittels Gelfiltration auf Sepharose 68 von markierten Abbauprodukten, die aus sulfatmarkierter ECM freigesetzt worden waren. Zu Streifen #7 gehöriges Material wurde Ratten injiziert, um die polyklonalen Anti- Heparanase-Antikörper zu bilden, die in ABBILDUNG 5 Einsatz fanden.
ABBILDUNG 7: Präparative isoelektrische Fokussierung. Aus CM- Sephadex eluierte aktive Fraktionen wurden zusammengefäßt, gegen eine 1%ige Glycinlösung dialysiert und einer präparativen isoelektrischen Fokussierung unterzogen. Bei jeder Fraktion wurde die Freisetzung von sulfatmarkiertem Material () und der pH-Wert (Δ) ermittelt. Heparanase-Aktivität wurde in den Fraktionen Nummer 11 bis 15 festgestellt.
ABBILDUNG 8: Identifikation von Heparanase in Extrakten einer Biopsie-Probe eines Eierstocktumors vom Menschen. Ein chirurgisch entfernter Eierstocktumor wurde homogenisiert, und die überstehende Fraktion wurde einer FPLC-Gelfiltration an einer Superose-12-Säule unterzogen. Das Ausgangsmaterial (Bahn 1) sowie die Fraktionen Nr.16 bis 19 des aktiven Peaks (Bahnen 2 - 5) wurden einer SDS/PAGE sowie einer Western Blot-Analyse unterzogen. Rechts: Coomassie-Blue- Färbung von auf Immobilon-P-Transfermembran elektrotransferierten Proteinen. Links: Autoradiogramm derselben Transfermembran im Anschluß an aufeinanderfolgende Inkubationen mit Kaninchen-Anti- Heparanase-Antikörpern und ¹²&sup5;I-Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG.

5 AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Diese Erfindung liefert eine aus der Zellinie SK-Hep-1 gewonnene, im wesentlichen reine Heparanase, die sich für einen Einsatz in einer pharmazeutischen Zubereitung eignet. Die anhand des hier beschriebenen Verfahrens produzierte Heparanase zeigt einen Reinheitsgrad, der den der Rohzellextrakte um mindestens ein 4ooºoaches übertrifft.

5.1 REINIGUNG VON HEPARANASE

Wie man festgestellt hat, kommt Heparanase in vielen verschiedenen Zelltypen vor, so z.B. in metastatischen Melanomzellen (Vlodavsky et al., Exptl. Cell Res. 140: S.149 - 159; Nakajima et al., Science 220: S.611 - 612, 1983), Neutrophilen (Matzner, J. Clin. Invest. 76: S.1306 - 1313, 1985), T-Lymphozyten (Naparstek et al, Nature 310: S.241 - 243, 1984; Fridman et al., J. Cell Phys. 130: S.85 - 92, 1987) oder metastatischen Lymphomzellen (Vlodavsky et al., Cancer Res. 43: S.2704 - 2711, 1983). Eine Zellinie, die bedeutende Mengen der Heparanase in Kultur produziert, ist die humane Hepatomzellinie Sk-Hep-1. Diese Zellinie wird bei dieser Erfindung als Ausgangsmaterial verwendet. (Klagsbrun et al., PNAS USA 83: S.2448 - 2452, 1986). Das Enzym wird in relativ kleinen Mengen in das Medium ausgeschieden, so daß im allgemeinen der Darstellung von Zellysaten Vorrang eingeräumt wird. Ein Rohheparanasextrakt läßt sich gewinnen durch Homogenisierung von tiefgefrorenen und aufgetauten kultivierten Zellen, Zentrifugation zur Formung der Zellbruchstücke zu Pellets und anschließende Sammlung des Überstandes.
Ein erster Schritt ist das Inkontaktbringen des heparanasehaltigen Überstandes mit einem Kationenaustauscherharz, vorzugsweise einem schwachen Kationenaustauscherharz, wie z.B. Carboxymethyl- Sephadex oder Biorex 70 . Gebundene Heparanase wird aus der Säule mit einem Salzgradienten eluiert. Die eluierten aktiven Fraktionen werden dann einer Affinitätschromatographie unterzogen. Die Fraktionen werden auf einen geeigneten gruppenspezifischen Adsorbenten aufgebracht, und die aktiven Fraktionen werden eingesammelt. Solch ein Adsorbent ist einer, der Heparin als Ligand verwendet, da Heparanase eine starke Affinität hin zu Heparin aufweist. Ein Beispiel für so ein Produkt ist Heparin-Sepharose CL-6B (Pharmacia). Besonders zweckmäßig ist eine Lektin-Affinitätssäule, so z.B. Con-A-Sepharose (Pharmacia), vorausgesetzt, die Probe wird in der Gegenwart von 1 M NaCl auf die Säule aufgebracht. Nach Elution aus der gewählten Säule werden die aktiven Fraktionen zusammengefaßt und wird die Heparanase-Aktivität zurückgewonnen. Das Verfahren, anhand dessen die Heparanase-Fraktion eluiert wird, hängt von dem Affinitätsreinigungsverfahren ab. Die Elution aus Heparin-Sepharose wird mit einem Salzgradienten und die aus Con-A-Sepharose mit 0,2 M α-Methylmannosid durchgeführt. Die Con-A-Sepharose-Chromatographie an sich erzielt eine hohe Ausbeute und einen hohen Reinigungsgrad. Eine weitere Reinigung anhand dieses Verfahrens wird für die vorgeschlagene Verwendung bei der Wundheilung aufgrund eines deutlichen Rückgangs in der Ausbeute nicht empfohlen. Im Falle der Heparin-Sepharose-Chromatographie kann eine weitere Reinigung notwendig werden. Die Gelfiltration auf Sephadex G-100 einer mittels Heparin-Sepharose gereinigten Probe bewirkt eine weitere Reinigung der Heparanase-Fraktion bis hin zu einem annehmbaren Niveau. Eine Zusammenfassung dieser Schritte sowie die Reinigungsgrade auf jeder Stufe sind in der Tabelle II zusammengefaßt. Die so erzeugten Produkte sind ausreichend gereinigt, um ihre Verwendung in pharmazeutischen Formulierungen zu gestatten.
Eine Plättchen-Endo-β-D-Glucuronidase ist von Oosta et al. (J. Biol. Chem. 257: S.11249, 1982) teilweise gereinigt worden. Dieses Enzym ist in der Lage, sowohl HS als auch Heparin aufzuspalten und hat einen Mr von 134.000. Heparanase (Mr = 96.000 Dalton) ist den Berichten zufolge anhand von Heparin-Sepharose, Con-A-Sepharose und N-acetylierter, N-desulfatierter Heparin-Sepharose auch teilweise aus Mäuse-B 16-F10-Melanomzellen isoliert worden (Nakajima et al., J. Cell. Biochem. 36: S.157 - 167, Reinigung erwähnt, jedoch nicht beschrieben). TABELLE Ia Reinigung von Sk-Hep-a-Heparanase Heparin-Sepharose mit nachfolgender Gelfiltration
* 1 Einheit = cpm (Peak II)/1-Kav TABELLE Ib Reinigung von Sk-Hep-a-Heparanase CM-Sephadex mit nachfolgender Con-A-Sepharose
Aktivitätsrückgewinnung - ca 75%
Ca.-fache Reinigung - ca. 4.000fach

5.2 THERAPEUTISCHER EINSATZ

Die gereinigte Heparanase und die diese enthaltenden Formulierungen können zu therapeutischen Zwecken in Situationen eingesetzt werden, in denen die Freisetzung von FGF aus der extrazellulären Matrix (ECM) eine erwünschte Wirkung wäre. Genauer gesagt, die Heparanase-Formulierungen sind in Situationen brauchbar, in denen eine Angiogenese und/oder das Wachstum von Fibroblasten gewünscht wird. Eine gängige Situation, in der diese Präparate zu diesem Zwecke geeignet wären, ist die Stimulation und Förderung der Wundheilung.
In diesem Zusammenhang sind unter "Wunde" alle Arten von Verletzungen zu verstehen, die die Unversehrtheit des Gefäßsystems zerstören. Hierzu zählen Hautverletzungen wie Schnittwunden, Verbrennungen und Geschwüre. Angesichts der relativ großen Mengen von FGF-HS-Komplexen, die bekanntermaßen in Basalmembranen der Cornea vorkommen (Folkman et al., J. Am. Pathol. 130: S.393 - 400, 1988), kann die lokale Applikation von Heparanase in Form von Augentropfen insbesondere zur Beschleunigung der Ausmerzung von Geschwüren der Cornea angewandt werden. Die Anwendung von gereinigter Heparanase auf ischämische Gewebe wird auch als erfolgversprechend angesehen wegen der Steigerung der Blutversorgung und somit der Sauerstofiversorgung dieser an Sauerstoffmangel leidenden Gewebe. Heparanase kann auch zur Förderung der Knochenheilung durch Initialisierung der Neovaskularisierung an einer Bruchstelle eingesetzt werden.
Die therapeutisch sinnvollen Heparanase-Präparate können mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern in der Form von Lotionen, Salben, Pudern und anderen geeigneten Vehikeln zur Darreichung kombiniert werden. Die Verfahren der Zubereitung solcher Formulierungen sind den Fachleuten auf pharmazeutischem Gebiet bekannt. Die Anwendung der aktiven Formulierung kann sich über einen Zeitraum von einigen Tagen oder Wochen erstrecken, je nach Ausmaß der Wunde und Geschwindigkeit der Wundheilung.
Der Nutzen der gereinigten Heparanase beschränkt sich nicht auf deren therapeutische Verwendung. Die Verfügbarkeit eines gereinigten Enzyms stellt eine Basis dar für die Herstellung von spezifischen polyklonalen und/oder monoklonalen Anti-Heparanase-Antikörpern. Die Verfügbarkeit solcher Antikörper wird den Nachweis, die Quantifizierung und die Lokalisierung von Heparanase in Blutproben, Körperflüssigkeiten, Pleuraergüssen und Biopsieproben zu Diagnosezwecken ermöglichen. Solche Antikörper sind in unserem Labor tatsächlich schon hergestellt worden gegen aus einem nativen Polyacrylamidgel eluierte aktive Heparanase. Diese Antikörper sind eingesetzt worden zum Nachweis von Heparanase in Säulenfraktionen und Biospieproben (ABB.5AII).

6 BEISPIELE

6.1 MATERIAL UND VERFAHREN

In den nachfolgenden Abschnitten werden die in Abschnitt 6.2 geschilderten Experimente beschrieben.

6.1.1 ZELLEN

Es wurden Kulturen von Rinder-Cornea-Endothelzellen aus Stieraugen wie zuvor beschrieben angelegt (Vlodavsy et al., Cancer Res. 43: S.2704 - 2711, 1983). Vorratskulturen wurden in DMEM (1 g Glucose/l), ergänzt mit 10 % Kalbsserum, 5 % FCS, Penicillin (50 Einh./ml) und Streptomycin (50 ug/ml) bei 37ºC in mit 10 % CO&sub2; befeuchteten Inkubatoren gehalten. Teilweise gereinigtes, vom Hirn stammendes bFGF (100 ng/ml) wurde jeden zweiten Tag während der Phase des aktiven Zellwuchstums zugesetzt. Aorta- und Kapillar- Endothelzellen vom Rind wurden wie beschrieben kultiviert (Vlodavsy et al., PNAS USA 84: S.2292 - 2296, 1987).
6.1.2 VORBEREITUNG VON MIT ECM BESCHICHTETEN SCHALEN
Rinder-Cornea-Endothelzellen wurden von Vorratskulturen (zweiter bis fünfter Durchlauf) mit Kochsalziösung, die 0,05 % Trypsin und 0,02 EDTA enthielt, abgetrennt und auf Schalen mit 4 bzw. 96 Vertiefungen mit einer Ausgangsdichte von 5 x 10&sup4; Zellen/ml ausplattiert. Die Zellen wurden gehalten wie oben beschrieben, wenn man davon absieht, daß FGF nicht hinzugefügt worden war und 5 % Dextran T-40 in dem Wachstumsmittel enthalten war. Sechs bis acht Arbeitstage nach Beginn des Zusammenfließens der Zellen wurde die subendothele ECM durch Auftrennen (3 Min., 22ºC) der Zellschicht einer Lösung ausgesetzt, die 0,5 % Triton X-100 und 20 mM NH&sub4;OH in phosphatgepufferter Kochsalzlösung enthielt, und anschließend viermal in phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Die ECM blieb intakt und fest an dem gesamten Bereich der Gewebekulturschale haften.
Es wurden Kulturschalen, die mit sulfatmarkierter ECM beschichtet waren, wie oben beschrieben vorbereitet, wobei diesmal jedoch Na&sub2;[³&sup5;S]O&sub4; (540 mCi/mmol) zweimal (40 uCi/ml) zugesetzt wurde, und zwar am 3. Tage nach der Ausbringung, als die Kultur kurz vor dem Zusammenfließen war, und 4 Tage danach. Die Kulturen wurden mit dem markierten Sulfat ohne Änderung des Mediums inkubiert, und 10 - 12 Tage nach der Ausbringung wurde die Zellschicht aufgelöst und mit ECM präpariert, wie beschrieben (Vlodavsky et alc, Cancer Res., a.a.O.; Naparstek et aL, Nature 310: S.241 - 243, 1984). 75 % bis 85 % der ECM-Radioaktivität wurden in Heparansulfat (HS) inkorporiert.
6.1.3 ISOLIERUNG VON HEPARANSULFAT AUS ECM
Heparansulfat (HS) wurde aus unmarkierter und sulfatmarkierter ECM anhand von Verfahren isoliert, die für die Isolierung von HS aus Rinder-Aorta (Schmidt et al., Eur. J. Biochem 125: S.95 - 101, 1982) und aus Swarm-Sarkom-Basalmembran (Hassell et al., PNAS USA 77: S.4494 - 4498, 1980) beschrieben sind. Zur Isolierung von ganzen Glucosaminoglycanen (GAGs) wurde entweder markierte oder unmarkierte ECM in 0,05 M Acetatpuffer (pH 4,5), der 0,5 % Papain, 0,05 % EDTA und 0,005 M Cystein enthielt, 24 Stunden lang bei 65ºC digeriert und anschließend einer alkalischen Zersetzung in 0,15 % KOH über 4 Stunden bei 37ºC und Ausfällung durch Cetylpyridiniumchlorid (CPC) unterzogen. Das Pellet, das zum größten Teil HS, Dermatansulfat und Chondroitinsulfat enthielt, wurde mit 0,8 mE Chondroitinase ABC in 10 ml 0,5 M Tris-Puffer, pH 8,0, bei 37ºC über 24 Stunden digeriert. Nach Ablauf der ersten 12 Stunden wurden weitere 0,8 mE zugesetzt. Das Digestionsmittel wird mit Ethanol in einer Endkonzentration von 50 % in der Gegenwart von 5 % Calciumacetat und 0,5 M Essigsäure ausgefällt. Das Präzipitat wird in destilliertem Wasser gelöst und gegen destilliertes Wasser dialysiert und mehrere Male erneut mit Ethanol ausgefällt. Die Reinigung von HS erfolgt durch lonenaustauscherchromatographie auf Dowex 1 X2 (200-400 mesh, Chloridform) und Elution mit einem kontinuierlichen Natriumchloridgradienten (0,1 - 2,0 M NaCl). HS wird bei ca. 1,0 M Natriumchlorid eluiert. HS-haltige Fraktionen werden zusammengefaßt, ausgiebig gegen destilliertes Wasser dialysiert und durch zwei Volumina Ethanol, das 1 % Kaliumacetat enthält, ausgefällt (Schmidt et aL, a.a.O.).

6.1.4 PRÜFUNGEN AUF HEPARANASE-AKTIVITÄT

6.1.4.1 FREISETZUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON HS-ABBAUPRODUKTEN

Zellen, konditioniertes Medium oder zellfreie Enzympräparationen werden mit sulfatmarkierter ECM inkubiert (4 - 24 Stunden, 37ºC, pH 6,0 - 6,5). Das Reaktionsgemisch wird zentrifugiert (10.000 g, 5 min), und 0,5-ml-Aiiquote des Überstandes werden zur Gelifitration auf Sepharose-6B-Säulen (0,7 x 35 cm) aufgebracht, die mit PBS equilibriert worden waren. Fraktionen (0,2 ml) werden bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 5 ml/h gesammelt und auf ihre Radioaktivität hin ausgezählt. Das ausgeschlossene Volumen (VO) wird mit Blaudextran, das insgesamt eingeschlossene Volumen (VT) mit Phenolrot gekennzeichnet. Ähnliche Gelfiltrationsprofile (Kav-Werte) erhält man durch Einsatz von aus Cornea-EC oder vaskulärer EC gewonnener ECM. Die in verschie-denen Experimenten erzielten Rückgewinnungsquoten von auf die Säulen aufgebrachtem markiertem Material lagen zwischen 85 % und 95 %. Die Elutionspositionen (Kav) von durch Heparanase vermittelten Abbauprodukten lagen, je nach Quelle des Enzyms und Inkubationsbedingungen, zwischen 0,5 und 0,75, wobei die Streuung der Kav-Werte für eine gegebene Enzympräparation bei verschiedenen Ermittlungen nicht über +/-15 % hinausging.

6.1.4.2 EINSATZ VON IMMOBILISIERTEM HEPARANSULFAT (HS)

Metabolisch ³H-Glucosamin- oder Na&sub2;³&sup5;SO&sub4;-markiertes HS wird aus Rinder-Aorta-ECM wie oben beschrieben isoliert. Markiertes HS wird an AH-Sepharose (Pharmacia) gekuppelt mit Hilfe von Carbodiimid bei pH 5,0 unter leichtem Rühren des Reaktionsgemischs bei 4ºC über 24 Stunden. Um den Überschuß an nicht in Reaktion getretenem Liganden zu entfernen, wird das Gel vier- bis fünfmal abwechselnd mit 0,2 M NaHCO&sub3;-Puffer (pH 8,3) und 0,1 M Acetatpuffer (pH 4) gewaschen, wobei jeder Puffer 0,5 M Natriumchlorid enthält. Das Gel wird mehrerer Male mit destilliertem Wasser gewaschen und bei 4ºC gelagert. Markiertes immobilisiertes HS (100 ul, 5 x 10³ cpm) wird mit dem Untersuchungsmaterial (Zellen, Zellextrakte, konditioniertes Medium, gereinigte Heparanase) in einem Endvolumen von 0,5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 6,2) mal in der Abwesenheit und mal in der Gegenwart von Heparin (20 ug/ml) inkubiert (4 - 24 Std., 37ºC, unter leichtem Rühren). Das Reaktionsgemisch wird sodann zentrifugiert, und die Radioaktivität wird in dem Pellet und in dem Überstand gesondert ermittelt. Die in der Gegenwart von Heparin freigesetzte Radioaktivität stellt eine nichtspezifische Freisetzung oder Spaltung durch von Heparanase abweichenden Enzymen dar. Wir haben auch das Festphasen-Heparanase-Substrat verwendet, das von Nakajima et al. (Anal. Biochem. 157: S.162 - 171, 1986) entwickelt wurde und durch Quervernetzung von teilweise N-desulfatiertem und N(¹&sup4;C oder ³H]-acetyliertem HS auf Agarose-Kügelchen über eine kovalente Bindung (id.) hergestellt wird. Zu diesem Zweck wird markiertes HS zunächst an dem reduzierenden Ende mit 2 M Ammoniumacetat in der Gegenwart von 0,4 M Natriumcyanborhydrid in 50 % Methanol bei 50ºC über 6 Tage aminiert. Das aminierte HS wird dann durch Gelfiltration gereinigt und mit 1 ml Affi-Gel inkubiert. Die Kupplungsreaktion wird bei 4ºC für 48 Stunden fortgesetzt, und die Kügelchen werden mit 0,1 M Glycinmonoethylester zur Reaktion gebracht, um nicht-kovalent gebundenes HS von den Kügelchen zu entfernen (id.).

6.1.4.3 VERWENDUNG VON ECM-BESCHICHTETEN MIKROTITER-SCHALEN

Wir verwenden derzeit mit sulfatmarkierter ECM beschichtete Mikrotiter-Schalen (96 Vertiefungen) zur Rasteruntersuchung (Screening) der Heparanase-Aktivität in großen Mengen von Fraktionen, die im Laufe der Enzymreinigung eluiert werden. In jede Vertiefung werden Proben (50 - 200 ul) gegeben, dann wird die Schale bei 37ºC inkubiert (4 - 12 Stunden); die Menge an freigesetzter Radioaktivität ist ein Hinweis auf die Heparanase-Aktivität in jeden Fraktion. Wir haben uns dieser Rasteruntersuchung während der Reinigung der Hepatom- Heparanase bedient und dabei festgestellt, daß die freigesetzte Radioaktivität zum größten Teil HS-Abbauprodukten (0,5 < Kav < 0,75) entspricht, wenn auf Sepharose 68 aufgebracht. Es muß hier unbedingt noch einmal herausgestellt werden, daß wir soweit möglich und insbesondere immer bei Untersuchungen von intakten Zellen den zeitraubenden Bioassay der die ECM-Zersetzung implizierenden Gelfiltrationsanalyse von HS-Abbauprodukten durchführen. Die Anforderungen an den Abbau von HS in einer multimolekularen Struktur wie z.B. ECM weichen von denen eines heparanasevermittelten Abbaus von unlöslicher HS ab (Matzner et al., J. Clin. Invest. 76: S.1306 - 1313, 1985).

6.1.5 REINIGUNG VON HEPARANASE

Für ausgedehnte Kulturen der humanen Hepatomzell-Linie Sk- Hep-1 (Klagsbrun et al., PNAS USA 83: S.2448 - 2452, 1986) werden Zellen aus vier T-75-Flaschen in eine 1-Liter-Spinner-Flasche transferiert und wachsen gelassen (DMEM, 10 % Kalbsserum), bis eine Zelldichte von ca. 106 Zellen/ml erreicht ist. Die Zellen werden anschließend auf n 3-Liter-Spinner-Flaschen übertragen und auf dieselbe Weise gezüchtet, um ca. 1 - 2 x 10¹&sup0; Zellen/20 Liter zu produzieren. Die Zellen werden aus den Suspensionskulturen durch Zentrifugation geerntet, zweimal mit PBS gewaschen, in 1 M NaCl, 0,01 M Tris-HCl, pH 7,5, erneut suspendiert und bei -20ºC eingefroren. Das tiefgefrorene Pellet wird aufgetaut, in 1 Liter 1 M NaCl, 0,01 Tris- HCL, pH 7,5, erneut suspen-diert und in einem Waring-Mischgerät 3 Minuten lang homogenisiert. Die Homogenate werden mit 20.000 g 20 Minuten lang zentrifugiert, die Pellets werden weggeworfen, und die Überstände werden gegen 0,1 M NaCl, 0,01 M Tris-HCl, pH 7.0, in einer Zubereitung für die Säulenchromatographie dialysiert.

6.1.5.1 SÄULENCHROMATOGRAPHIE

a) Kationenaustauscherchromatographie. Dialysierte Überstande werden auf eine Biorex 70-Säule (5 x 40 cm) aufgebracht, und Heparanase wird diskontinuierlich mit 0,5 M NaCl eluiert. Aktive Fraktionen werden gesammelt, zusammengefaßt, und gegen 20 mM NaCl, 10 mM Phosphatcitratpuffer, pH 5,8 dialysiert. Dialysiertes Material wird auf eine Carboxymethyl-Sephadex-(CM-50-)Säule (6 x 20 cm) gegeben, die mit 10 mM Phosphatcitrat, 20 mM NaCl, pH 5,8, equilibriert worden ist. Die Säule wird mit zwei Bett-Volumina desselben Puffers gewaschen, und die Heparanase-Aktivität wird mit einem linearen Salzgradienten (0,01 M - 1 M NaCl) von 1 Liter mit einer Durchfluß-geschwindigkeit von 40 ml/h bei 4ºC eluiert.
b) Heparin-Sepharose. Aus CM-Sephadex eluierte aktive Fraktionen werden zusammengefaßt, auf eine Salzkonzentration von 0,35 M NaCl in 10 mM Acetatpuffer, pH 5,3, eingestellt und auf eine 2 x 12 cm große Heparin-Sepharose-Säule (Pharmacia) gegeben, die mit demselben Puffer equilibriert worden ist. Heparanase wird mit einem Gradienten (320 ml) von 0,4 - 1,2 M NaCl mit 40 ml/h bei 4ºC eluiert.
c) Con-A-Sepharose. Aus CM-Sephadex eluierte aktive Fraktionen werden gesammelt, zusammengefaßt und gegen eine Lösung dialysiert, die 1 M NaCl, 10 mM Natriumacetat, pH 6,0, 1 mM CaCl&sub2;, 1 mM MgCl&sub2; und 1 mM MnCl&sub2; (Puffer A) enthält. Dialysiertes Material wird bei 24ºC auf eine 2 x 6 cm große Con-A-Sepharose-Säule aufgebracht. Die Säule wird mit 3 Bettvolumina des Puffers A gewaschen, und die Heparanase wird mit 4 Bettvolumina des Puffers A, dem 0,2 M Alpha-Methylmannosid zugesetzt wurden, eluiert.
d) Gelfiltration. Aus Heparin-Sepharose eluierte aktive Fraktionen werden gegen 0,2 M Ammoniumformat dialysiert, lyophilisiert und in 2 ml 0,5 NaCl, 0,01 M Natriumacetat, pH 5,5, suspendiert. Dieses Material wird auf eine Sephadex-G-100-Säule (1,2 x 100 cm) aufgebracht, die mit demselben Puffer equilibriert worden ist, und wird in einer Durchflußgeschwindigkeit von 3 ml/h eluiert. Zur Bestimmung der Molekularmasse wird die Säule zunächst mit Proteinen mit bekannter Molekularmasse kalibriert (Alkoholdehydrogenase, 150 kD; Albumin, 66 kD; Ovalbumin, 43 kD; Karbonanhydrase, 29 Id); und Aprotinin, 6,4 kD). Das Leervolumen wird mit Blaudextran markiert. Rohe und teilweise gereinigte Heparanase-Präparationen wurden einer HPLC-Ausschlußchromatographie auf TSK 200- und Superose 12- Säulen unter nicht-denaturierenden Bedingungen unterzogen. Hierzu wurden lyophilisierte Präparationen in 200 ul 0,15 M NaCl, 0,01 M Citratposphatpuffer, pH 6,0, rekonstituiert und mit 12.000 g zentrifugiert, um unlösliches Material zu entfernen. Die geklärten Überstände wurden auf die Säule aufgebracht und mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 1 ml/min eluiert. Die Säule war zuerst mit Proteinen mit jeweils bekannter Molukarmasse kalibriert worden.

6.1.6 PRÄPARATIVES NATIVES PAGE

Aus Con A-Sepharose eluierte aktive Fraktionen wurden zusammengefaßt und gegen 10 mM Tris-Phosphat-Puffer, pH 6,7, dem 10 ml NaCl zugesetzt waren, dialysiert. Dialysiertes Material wurde konzentriert und auf ein 6 x 8 x 0,15 cm großes 8 %iges natives Polyacrylamidgel (ohne SDS) aufgebracht, das einen einstündigen Vorlauf mit 20 mA hinter sich hatte. Die Elektrophorese wurde mit 15 mA über 3 Stunden bei 4ºC durchgeführt. Das Gel wurde in 0,5-cm- Streifen geschnitten, die dann einer elektrophoretischen Elution unterzogen wurden.

6.1.7 PRÄPARATIVE ISOELEKTRISCHE FOKUSSIERUNG

Aus CM-Sephadex eluierte aktive Fraktionen wurden zusammengefaßt und gegen 1 % Glycin dialysiert. Dialysiertes Material wurde 30 Minuten lang mit 18.000 g zentrifugiert: der Überstand wurde einer präparativen isoelektrischen Fokussierung unterzogen, und jede Fraktion wurde auf Heparanase-Aktivität hin geprüft.

6.1.8 GELELEKTROPHORESE

Natriumdodecylsulfat-(SDS-)Polyacrylamidgel-Elektrophorese und Silberfärbung wurden wie in Vlodavsky et aL (PNAS USA 84: S.2292 - 2296, 1987) beschrieben durchgeführt.

6.2 VERSUCHSERGEBNISSE

6.2.1 HEPARANASE-AKTIVITÄT IN Sk-Hep-1-ZELLEN

Eine Inkubation (24 Stunden, 37ºC, pH 6,2) von Sk-Hep-1-Zellen auf sulfat-markierter ECM führte zur Freisetzung von markiertem Material mit großer Mr (ca. 0,5 x 10&sup6; Dalton) und kleiner Mr (5 x 10³ -1 x 10&sup4; Dalton), das aus Sepharose 6B mit Kav < 0,2 (Peak I) bzw. 0,35 < Kav < 0,8 (Peak II) eluierte. Eine gleiche Inkubation von Sk-Hep-1- Zell-Lysaten mit der markierten ECM mündete in der Freisetzung von Abbauprodukten mit überwiegend kleiner Mr (Kav = 0,72 auf Sepharose 6B) (ABB. 4). Diese Fragmente mit kleiner Mr (ca. 8.000 Dalton) waren (i) 5- bis 7mal kleiner als intakte, von der ECM abstammende HS-Seitenketten; (ii) resistent in bezug auf eine Aufspaltung mittels Papain oder Chondroitinase-ABC; und (iii) empfänglich für eine Spaltung mit salpetriger Säure - allesamt charakterisierende Merkmale eines mittels Endoglycosidase (Heparanase) hergestellen HS-Abbaufragments. Ungefähr 90 % der freigesetzten Radioaktivität wurde mit 0,05 % Cetylpyridiniumchlorid in 0,6 M NaCl ausgefällt, Bedingungen, die speziell Heparansulfat-Sequenzen ausfällen. Desweiteren wurde die Freisetzung von HS-Spaltungsprodukten mit geringer Mr durch Heparin unterbunden (ABB. 4), einem starken Inhibierungsmittel in bezug auf heparanasevermitteltem HS-Abbau. Diese Ergebnisse zeigen, daß Heparanase durch intakte Sk-Hep-1-Zellen exprimiert wird und daß eine weitaus größere Aktivität aus Lysaten dieser Zellen extrahiert werden kann. Durch kultivierte Sk-Hep-1-Zellen konditioniertes Medium enthielt nur geringe Mengen an Heparanase-Aktivität. Daher wurden in nachfolgenden Experimenten Hepatomzell-Lysate als Quelle für die Reinigung des Enzyms herangezogen.

6.2.2 KATIONENAUSTAUSCHERCHROMATOGRAPHIE

In Spinner-Flaschen bis zu einer Dichte von 10&sup6; Zellen/ml kultivierte Sk-Hep-1-Zellen wurden durch Zentrifugation (250 g x 10 min) geentert und zweimal in phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von 7,4 (PBS) gewaschen. Das Pellet aus 1 - 2 x 10¹ Zellen wurde in 300 mli M NaCl, 0,01 M Tris-HCL, pH 7,5, erneut suspendiert, dann dreimal einem Gefrier-/Auftauzyklus unterzogen und anschließend in einem Waring-Mischer homogenisiert. Die Homogenate wurden zentrifugiert (20.000 g für 30 min), der Überstand wurde gegen 0,1 M NaCl, 0,01 M Tris-HCL, pH 7,0, dialysiert und auf eine Biorex 70- Säule (5 x 40 cm) zur diskontinuierlichen Elution des Enzyms mit 0,5 M NaCl in 10 mM Tris, pH 7,0, aufgetragen. Aktives Material wurde gegen 10 mM Phosphatcitrat-Puffer, 20 mM NaCl, pH 6,0, dialysiert und mit 20.000 g 30 Minuten lang zentrifugiert; der Überstand wurde auf eine CM-50-Sephadex-Säule (6 x 20 cm) aufgebracht. Die Heparanase- Aktivität wurde mit einem linearen Salzgradienten (0,01 M - 1 M NaCl in Phsophatcitrat-Puffer) bei einer Konzentration von 0,7 - 0,8 M NaCl eluiert (ABB. 5A). 50 % - 60 % der insgesamt auf die CM-Sephadex- Säule aufgetragenen Proteine wurden von der Säule nicht abgebunden, und ca. 30 % der gebundenen Proteine wurden bei einer Salzkonzentration eluiert, die unter der lag, die das Enzym eluierte (TABELLE Ia). Zur Bestimmung der Heparanase-Aktivität in diesem Reinigungsschritt sowie den nachfolgenden Reinigungsschritten wurden Proben (50 ul) der Säulenfraktionen zunächst mit sulfatmarkierter ECM in Kulturschalen mit 96 Vertiefungen für Messungen der freigesetzten Radioaktivität inkubiert (0,5 - 3 Stunden, 370C, pH 6,0). Die Heparanase-Aktivität in aktiven Fraktionen wurde dann durch Analyse des freigesetzten Materials an Sepharose-68-Säulen mittels Gelfiltration wie beschrieben untersucht.
Zur weiteren Reinigung der aus CM-Sephadex-Säulen eluierten Heparanase wurden nach zwei weiteren Ansätzen verfahren. Bei dem ersten Ansatz wurde das Enzym einer Heparin-Sepharose-Affinitätschromatographie mit nachfolgender Gelfutration auf Sephadex G-100 unterzogen. Bei dem zweiten Ansatz kam die Con-A-Sepharose- Chromatographie zur Anwendung.
Als Verunreinigung kann mit der Heparanase ein 50-kD)-Plasminogenaktivator-Inhibitor Typ 1 (PAI 1) vorliegen. Das Vorhandensein von PAI-1 kann mit PAI-1-Antikörpern nachgewiesen werden, die mit der gereinigten Heparanase-Präparation bei der Western-Blot-Analyse in Kreuzreaktion treten. Durch die nachstehend genannte Änderung des Reinigungsprotokolls wird das Enzym Heparanase von dem PAI-Protein getrennt. Aus der CM-Sephadex-Säule eluierte aktive Heparanase wird auf CM-Sephadex bei pH 7,4 in der Gegenwart von 0,1 % CHAPS erneut chromatographiert. Der größte Teil von PAI-1 wird kurz vor dem Protein, das Heparanase-Aktivität besitzt, eluiert.

6.2.3 HEPARIN-SEPHAROSE UND GELFILTRATION

Aus CM-Sephadex eluierte aktive Fraktionen wurden zusammengefaßt und durch Dialyse gegen 0,35 M NaCl, 10 mM Natriumacetat, pH 5,3, getrennt und auf eine 2 x 6 cm große Heparin-Sepharose-Säule, die mit demselben Puffer equilibriert worden war, aufgebracht. Ungebundenes Protein, das keine Heparanase-Aktivität zeigte, wurde entfernt, und die Säule wurde einem linearen Gradienten von 0,4 - 1.2 M NaCl ausgesetzt. Heparanase-Aktivität wurde bei einer Konzentration von 0,7 - 0,8 M NaCl eluiert, wie anhand der Freisetzung von unmarkiertem Material aus mit ECM beschichteten Vertiefungen einer Kulturschale mit 96 Vertiefungen (ABB. 5B) und durch die talsächliche Analyse von Heparansulfat-Abbauprodukten auf Sepharose-6B-Säulen bestimmt.
Analysen mittels Gelfiltration (Sepharose 12, TSK-200) von aus CM-Sephadex eluierten Heparanase-Präparationen zeigten für Heparanase eine MW im Bereich von 50 bis 60 kD. Sephadex G- 100 SF wurde daher als geeignetes Harz zur weiteren Reinigung und Ermittlung der Enzym-MW gewählt. Zu diese Zwecke wurden aus Heparin-Sepharose eluierte Fraktionen dialysiert, lyophilisiert und in 1 - 2 ml 0,5 M NaCl in 0,01 M Natriumacetat, pH 5,5, suspendiert. Wie die ABBILDUNG 5C zeigt, wurde Heparanase-Aktivität als ein einzelner Peak in Fraktionen eluiert, deren MW bei ca. 50 kD lag (Fraktionen 33-35). Die geschätzte -fache Reinigung und Ausbeute der Enzyme ist in TABELLE Ia zusammengefaßt. Proben der Fraktionen 31 bis 38 wurden einer SDS- PAGE und Silberfärbung zur weiteren Beurteilung der MW des Enzyms und des Reinigungsgrades unterzogen. Ein der erwarteten MW entsprechende Bahn (ca. 50 kD) korrelierte mit der Heparanase- Aktivität in jeder der Fraktionen. Fraktion #34, die die Aktivität mit der größten Spezifität aufwies, enthielt neben der wichtigsten vermuteten Heparanase-Bahn ein Protein mit geringfügig höherer Molekularmasse MW sowie einige Proteine mit geringerer MW, die kaum erfaßt werden konnten (ABB. 5C).
Wird eine Entfernung von PAI-1 gewünscht, dann läßt sich das ganze obengenannte Verfahren dadurch abändern, daß man die Heoarin-Sepharose-Chromatographie bei pH 7,4 in der Gegenwart von 1 % CHAPS durchführt.

6.2.4 AFFINITÄTSCHROMATOGRAPHIE AUF CON A-SEPHAROSE

Erste Untersuchungen zeigten, daß sich die Hepatom-Heparanase an Con A-Sepharose bindet und daß sie mit 0,2 M Alpha-Methylmannopyranosid eluiert. Ein höheres Maß an Bindungsspezifität, das zu einer besseren Reinigung des Enzyms führt, wurde erzielt, wenn die Probenund Elutionslösungen 1 M NaCl enthielten. Zu diesem Zwecke wurden aus CM-Sephadex eluierte aktive Fraktionen gegen 1 M NaCl eluiert, dem 1 M Natriumacetat, pH 6,0, 1 mM MgCl&sub2;, 1 mM CaCl&sub2; und 1 mM MnCl&sub2; zugesetzt war. Über 95 % des Proteingesamtgehalts der Probe wurden unter diesen Bedingungen nicht an der Säule gebunden, und Heparanase konnte weder in dem ungebundenen noch in dem Säulen- Waschmaterial nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu wurden 80 % - 90 % der gesamten Enzymaktivität in dem Alpha-Methylmannosid- Eluat rückgewonnen werden, das < 2 % des gesamten Proteinanteils, der auf die Säule aufgebracht worden war, enthielt (ABB. 5D, Tabelle Ib). Eine SDS-PAGE zeigte die Gegenwart eines bedeutenderen Proteindoubletts in dem 50-kD-Bereich neben einigen Proteinen mit kleinerer MW, darunter die 27-kD-Untereinheit des Con A-Moleküls als solchem. (ABB. 5D).
Um eine Präparation mit nur einer einzigen Bahn zu erhalten, wurde aus Con A-Sepharose eluiertes Enzym einer nativen Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterzogen, wie in "Materials and Methods" beschrieben. Das Gel wurde in 5-mm-Streifen geschnitten, und Protein wurde aus 5-mm-Segmenten eines jeden Streifens elektroeluiert. Heparanase-Aktivität, gemessen durch Gelfiltrationsanalyse von sulfatmarkierten Abbauprodukten, wurde zuerst aus Streifen #7 eluiert. Eine viel geringere Aktivität wurde in Streifen #4 entdeckt (ABB. 6). Mit dem Streifen #7 in Verbindung stehendes Enzym wurde mit dem Polyacrylamidgel in einer Mindestmenge phosphatgepufferter Kochsalzlösung homogenisiert, mit komplettem Freund-Adjuvans vermischt und Ratten injiziert, um polyklonale Anti-Heparanase-Antikörper zu produzieren. Auch dieses Material wird einer Aminosäure-Sequenzierung zum Zwecke der Genklonierung und Genexpression unterzogen. Die Anti- Heparanase-Antikörper werden eingesetzt zum immunologischen Nachweis des Enzyms in "Western Blots" von Fraktionen, die aus CD- Sephadex (ABB. 5A) und Con-A-Sepharose eluiert wurden, sowie in aktiven Fraktionen, die aus Biopsieproben eines humanen Ovarialtumors gewonnen wurden (ABB. 8).
Eine weitere Entfernung von PAI-1 läßt sich durch Mono-S- (Pharmacia)-Hochdruckflüssigkeitschromatographie erzielen, die bei pH 7,4 in Gegenwart von 0,1 % CHAPS durchgeführt wird. Heparanase wird durch Salzgradienten (0,1 M NaCl bis 0,7 M Nach eluiert. Ist PAI-1 von Heparanase abgetrennt, dann weist die Heparanase eine Reinheit auf, die die Reinheit eines Rohzellextrakts von Heparanase um mindestens ein 6.000faches übersteigt und die vorzugsweise mindestens ein 8.000faches der Reinheit eines Rohzellextrakts von Heparanase ausmacht.

Claims

1. Eine Heparanase-Formulierung, die sich aus der Zellinie Sk-Hep-1 gewinnen läßt, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifische Heparanase-Aktivität der Formulierung um mindestens ein 1000faches größer ist als die spezifische Heparanase-Aktivität eines dialysierten Überstandes eines aus der Zellinie Sk-Hep-1 bereiteten, zentrifugierten Zellhomogenats.

2. Die Heparanase-Formulierung gemäß Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß die spezifische Heparanase-Aktivität der Formulierung um mindestens ein 2000faches größer ist als die spezifische Heparanase-Aktivität des Überstandes.

3. Die Heparanase-Formulierung gemaß Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet. daß die spezifische Heparanase-Aktivitat der Formulierung um mindestens ein 4000faches größer ist als die spezifische Heparanase-Aktivität des Überstandes.

4. Eine pharmazeutische Formulierung umfassend eine wirksame Menge der Heparanase-Formulierung nach einem der Anspruche 1 bis 3 in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.

5. Ein Verfahren zur Herstellung einer Heparanase- Formulierung nach den Ansprüchen 1 bis 4, die folgenden Verfahrensschritte umfassend:

(a) Gewinnen eines Heparanase enthaltenden Zellüberstandes aus der menschlichen Zellinie Sk-Hep-1

(b) Herstellen des Kontaktes zwischen einem Heparanase enthaltenden Überstand und einem Kationenaustauscherharz und Gewinnen eines ersten aktiven Eluats;

(c) Herstellen des Kontaktes zwischen dem ersten Eluat und einem Affinitätsreinigungsabsorber; und

(d) Rückgewinnen eines zweiten aktiven, Heparanase enthaltenden Eluats zur Herstellung einer Heparanase-Formulierung.

6. Das Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Kationenaustauscherharz um ein schwaches Kationenaustauscherharz handelt.

7. Das Verfahren gemaß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Affinitätsabsorber Heparin enthält.

8. Das Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dein Affinitätsabsorber um einen Lectin- Affinitätsabsorber handelt.

9, Das Verfahren gemaß den Ansprüchen 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Eluat durch Elution des Austauscherharzes mit einem Salzgradienten gewonnen wird.

10. Das Verfahren gemaß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Gradienten um einen linearen Gradienten von ca. 0,01 bis ca. 1 M NaCl handelt.

11. Das Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Eluat mit einem Gradienten von ca. 0,4 bis 1,2 M NaCl eluiert wird.

12. Das Verfahren gemaß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es als weitere Verfahrensschritte umfaßt, daß das zweite Eluat einer Gelifitration unterworfen und die Heparanase- Formulierung aus dem Filtrat rückgewonnen wird.

13. Das Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Eluat auf den Affinitätsabsorber in Gegenwart von mindestens 1 M NaCl aufgebracht wird.

14. Das Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Eluat durch Elution mit ca. 0,2 M Alpha- Methylmannosid gewonnen wird.

15. Das Verfahren gemäß den Ansprüchen 5 bis 12 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifische Heparanase-Aktivität des zweiten Eluats um mindestens ein 2000faches größer ist als die spezifische Heparanase-Aktivität eines dialysierten Überstandes eines aus der Zellinie Sk-Hep-1 bereiteten, zentrifugierten Homogenats.

16. Das Verfahren gemäß Anspruch 5, 12 oder 14, dadurch gekennzeichnet, däß die spezifische Heparanase-Aktivität des zweiten Eluats um mindestens ein 4000faches größer ist als die spezifische lieparanase-Aktivität eines dialyslerten Überstandes eines aus der Zellinie Sk-Hep-1 bereiteten, zentrifügierten Homogenats.

17. Das Verfahren gemäß den Ansprüchen 5 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß es als weiteren Verfahrensschritt umfaßt:

(e) Rombinieren einer wirksamen Menge der Heparanase-Formulierung mit einem pharmazeutischen Träger.

18. Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen oder polyklonalen Antikörpers mit Spezifität für die aus Sk-Hep-1- Leberzellen gewonnene Heparanase, das die Verwendung der Heparanase-Formulierung gemäß den Ansprüchen 1 bis 4 umfaßt.

19. Eine Heparanase-Formulierung, die sich aus der Zellinie Sk-Hep- 1 gewinnen läßt und deren spezifische Heparanase- Aktivität um mindestens ein 1000faches größer ist als die spezifische Heparanase-Aktivität eines dialysierten Überstandes eines aus der Zellinie Sk-Hep-1 bereiteten, zentrifugierten Zellhomogenats, vorgesehen zur Verwendung als Medikament.

20. Eine Heparanase-Formulierung gemäß Anspruch 19 zur Verwendung als ein Medikament zur Behandlung von metastatischem Krebs.

21. Eine Heparanase-Foniiullerung gemäß Anspruch 19 zur Verwendung als ein Medikament zur Wundbehandlung.

22. Verwendung einer Heparanase-Formulierung, die sich aus der Zellinie Sk-Hep-1 gewinnen läßt und die eine spezifische Heparanase-Aktivität aufweist, die um mindestens ein 1000faches größer ist al$ die spezifische Heparanase-Aktivität eines dialysierten Überstandes eines aus der Zellinie Sk-Hep 1 bereiteten, zentrifugierten Zellhomogenats, vorgesehen zur Herstellung von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern in einer Form, die darauf abgestimmt ist. Heparanase in einer Probe nachzuweisen, mengenmäßig zu bestimmen oder zu lokalisieren.

23. Die Verwendung einer Heparanase-Formulierung gemaß den Ansprüchen 1 bis 4 zur Herstellung eines Medikaments zur Wundbehandlung.