DE3880758T2 - Von monozyten abstammendes gefaesswirksames protein und dessen analogen, verfahren zu seiner gewinnung und ihre verwendungen fuer therapeutische zwecke und zur antikoerperherstellung. - Google Patents

Description

• Vorliegende Erfindung betrifft eine Proteinfamilie, insbesondere Glycoproteine, mit vaskulärer Wirksamkeit, die Proliferationshemmer von Endothelzellen sind, insbesondere einen von Monozyten abgeleiteten Faktor, ein Verfahren zur Extraktion dieses Faktors sowie die Anwendung dieser Proteine.
• Die Wachstumsregulierung von Gefäßzellen ist in der Genese und der Entwicklung der Arteriosklerose und der Neoangiogenese ein wichtiger Faktor. Neuerdings widmete man eine besondere Aufmerksamkeit den Wachstumsfaktoren, welche die Proliferation von Endothelzellen, Zellen der glatten Muskeln und von Fibroplasten stimulieren. Es wurde lediglich eine geringe Anzahl von Faktoren charakterisiert, die fähig sind, die Proliferation von Gefäßzellen zu inhibieren.
• Zahlreiche Forscher haben in jüngster Zeit ihr Interesse auf die Rolle von zirkulierenden Monozyten bei der Wachstumsreglierung von Zellen von Gefäßwänden konzentriert. Über die Teilnahme von Monozyten an zahlreichen pathologischen Prozessen, welche die Wand von Blutgefäßen umfassen, wie z.b. die Vaskulitis, die Arteriosklerose, die Entzündung und die Krebsmetastasen, wurde neuerdings berichtet (vgl. Literaturreferenzen 1 und 2). In solchen Fällen nehmen die Faktoren der Wachstumsregulierung wichtige Rollen ein Faktoren, welche das Wachstum begünstigen, die sich von Monozyten ableiten MDGF (Monocyte-derived Growth Promoting Factors) wurden isoliert und charakterisiert (vgl. Referenzen 3 bis 11).
• Die Ergebnisse von vorläufigen Untersuchungen des Patentinhabers (vgl. Referenz 12), die in Übereinstimmung mit den von Kahaleh (vgl. Referenz 13) stehen zeigen, daß überdas Wachstum begünstigende Faktoren hinaus, die Monozyten ebenfalls Hemmfaktoren erzeugen können.
• Der Patentinhaber hat insbesondere festgestellt, daß die normalen menschlichen Monozyten einen Hemmfaktor der Proliferation von menschlichen Endothelzellen erzeugen, dem er den Namen MECIF (Monocyte-derived Endothelial Cell Inhibitory Factor: von Monozytewn abgeleiteter Hemmfaktor von Endothelzellen) gab.
• Der Patentinhaber fand nun ein Verfahren zur Extraktion, welches ermöglicht, den Faktor MECIF in einem Reinheitsgrad zu erhalten, welcher seine Analyse ermöglichte.
• Gemäß einem ihrer Aspekte hat die Erfindung ein Verfahren zur Extraktion eines von Monozyten abgeleiteten Hemmfaktors für Endothelzellen, MECIF, zum Gegenstand, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es im wesentlichen diejenigen Verfahrensstufen umfaßt, welche bestehen aus:
• 1) Kultivierung von normalen menschlichen Monozyten,
• 2) Durchleiten des Überstandes der filtrierten Kultur durch eine auf einen pH-Wert von etwa 8 eingestellte Säule aus vernetztem Polysaccharid,
• 3) nachfolgendes Durchleiten dieses Überstandes durch eine auf einen pH-Wert von etwa 8 eingestellte Säule aus einem phenylierten und vernetzten Agarosegel, wobei mit einem fallenden Gradienten an Ammoniumsulfat entwickelt wird,
• 4) Durchleiten der in Stufe 3) erhaltenen aktiven Fraktionen durch eine auf einen pH-Wert von etwa 8 eingestellte Säule von der Art, wie sie in Stufe 2) benutzt wurde,
• 5) Durchleiten des in Stufe 4) erhaltenen Eluats durch eine Ionenaustauschersäule vom Typ Diethylaminoethyl (DEAE), wobei mit einem steigenden Gradienten Natriumchlorid entwickelt wird,
• 6) Durchleiten der in Stufe 5) erhaltenen Fraktionen durch eine Niederdruck-Ausschlußchromatographiesäule, die mittels eines Zellkulturmediums ins Gleichgewicht gebracht wurde, und
• 7) Auffangen des gereinigten Produkts, gegebenenfalls nachdem die in Stufe 6) erhaltenen aktiven Fraktionen einer Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie unterworfen wurden.
• Die normalen menschlichen Monozyten werden, sei es durch die Differential-Zentrifugierung, sei es durch Zytapherese und anschließend selektive Adhäsion in Kunststoffbehältern, die mit Fibronektin bedeckt oder nicht bedeckt sind, aus dem Blut gewonnen. Die Einzelheiten dieses Verfahrens sind in dem folgenden experimentellen Teil beschrieben.
• Die Monozyten werden vorteilhafterweise während etwa 24 Stunden kultiviert.
• Die vernetzte Polysaccharid-Säule kann z.B. von dem Typ sein, welcher unter der Bezeichnung Sephadex - G-25 von der Firma Pharmacia Fine Chemicals (Uppsala, Schweden) in den Handel gebracht wird.
• Die phenylierte und vernetzte Agarosegel-Säule kann z.B. von dem Typ sein, welcher unter der Bezeichnung Phenyl-Sepharose CL 4B von derselben in den Handel gebracht wird.
• Die Ionenaustauscher-Säule vom Typ DEAE kann z.B. diejenige sein, welche unter der Bezeichnung DEAE-Trisacryl LS von der Firma IBF, Gennevilliers, Frankreich in den Handel gebracht wird.
• Die Niederdruck-Ausschlußchromatographiesäule kann z.B. diejenige sein, welche unter der Bezeichnung Trisacryl GF-05 von der vorgenannten Gesellschaft in den Handel gebracht wird. Die Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPL) kann mit einer Säule bewirkt werden, welche unter der Bezeichnung TSK-250 von der Firma Bio-Rad, München, BRD, in den Handel gebracht wird. Zu einer noch besseren Erklärung wird ein nicht begrenzendes, detailliertes Beispiel der Durchführung dieses Verfahrens im experimentellen Teil vorliegender Beschreibung gegeben.
• Gemäß einer Variante, kann der MECIF, ausgehend von den Überständen monozytoider leukämischer Zellstämme, wie vom Stamm HL 60 (vgl. Referenz 14) nach Stimulierung durch Retinsäure oder noch besser durch DMSO isoliert werden.
• Der Faktor MECIF und seine weiter unten behandelten Derivate können ebenfalls nach gentechnischen Arbeitsweisen erhalten werden, und zwar ausgehend von der bekannten Peptidsequenz, und unter Isolierung des entsprechenden ARNm.
• Die Analyse des erhaltenen, gereinigten MECIF erlaubte festzustellen, daß es sich um ein Glycoprotein der scheinbaren Molekularmasse 64-70 kd handelt.
• Dieses Glycoprotein umfaßt 568 Aminosäurereste, welche sich auf folgende annähernde Anteile verteilen:
• Asp: 80; Thr: 23,06; Ser: 29,40; Glu: 56,5;
• Pro: 27,70; Gly: 38,98; Ala: 42,88; Val: 36,16;
• Met: 4,83; Ile: 18,79; Leu: 50,92; Tyr: 20,15;
• Phe: 27,16; GlcNH&sub2;: 3,10 ; Lys: 60,87; His: 13,81;
• Arg: 27,60.
• Seine N-terminale Peptidsequenz ist:
• Ser-Pro-Glu-Leu-Thr-Phe-Arg-X-Y-Thr-Ile-Ser-
• worin X und Y, die gleich oder verschieden sein können, jeweils Trp oder Asp darstellen.
• Dieses Glycoprotein umfaßt Aminozucker und nicht aminierte Zucker.
• Es kann während zwei Monaten bei 4 ºC oder über längere Zeiträume hinweg bei - 80 ºC oder in gefriergetrockneter Form aufbewahrt werden.
• Das so definierte Glycoprotein bildet ein weiterer Gegenstand der Erfindung. Die Erfindung hat ferner ein, vorzugsweise glycosyliertes, Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 0,6 bis 200 kd zum Gegenstand, welches die Sequenz
• -Ser-Pro-Glu-Leu-Thr-Phe-
• umfaßt.
• Vorzugsweise ist diese Sequenz N-terminal.
• Noch bevorzugter ist die in Frage stehende Sequenz
• -Ser-Pro-Glu-Leu-Thr-Phe-Arg-X-Y-Thr-Ile-Ser-
• worin X und Y, die gleich oder verschieden sein können, jeweils Trp oder Asp darstellen.
• X und Y sind vorzugsweise verschieden und noch bevorzugter, stellt X Trp, und Y Asp dar.
• Ein derartiges Protein wird vorzugsweise unter Durchführung klassischer Arbeitsweisen der Gentechnik hergestellt.
• Der Faktor MECIF ist bezüglich menschlicher Endothelzellen in Konzentrationen der Größenordnung eines Pikogramms pro Milliliter wirksam; bezüglich Endothelzellen des Schweins ist er wenig wirksam. Er verändert nicht auf wahrnehmbare Weise das Wachstum von Zellen glatter Muskeln, menschlicher Arterien und auch nicht von Fibroplasten der Haut von Erwachsenen oder Fibroplasten von Embryonenlungen.
• Die Wirkung auf menschliche Endothelzellen ist 6 Stunden nach Berührung erkennbar. Sie erreicht eine Plattform am Ende von zwölf Stunden und ist 48 Stunden stabil.
• Seine Wirkung ist partiell reversibel (50 %) durch Zugabe eines Wachstumsfaktors (ECGF: Endothelial Cell Growth Factor: Wachstumsfaktor von Endothelzellen).
• Der Faktor MECIF ist nicht zytotoxisch bei einer Konzentration von 5 mg/ml.
• Der Faktor MECIF und die sich davon ableitenden, weiter oben definierten (Glyco)proteine, welche die gleichen Eigenschaften besitzen, können in Gegenwart von Hilfsmitteln und/oder üblichen Exzipientien in galenische Formen übergeführt werden, welche zur lokalen kutanen Anwendung, zur intraartikulären Injektion, zur subkutanen Injektion oder zur intavenösen Perfusion oder besonders als Augentropfen bestimmt sind.
• Der Faktor MECIF und seine die gleichen Eigenschaften besitzenden Derivate können insbesondere therapeutisch wie folgt verwendet werden:
• - in der Augenheilkunde bei der Behandlung von diabetischen Retinopathien, der Neovaskularisation, der Entartung roter Altershautflecken;
• - bei der Behandlung der peripheren oder arteritischen Gefäßkrankheit, bei der Verhütung der Obstruktion von Prothesen durch Endothelproliferation;
• - bei der Behandlung der Venenkrankheit, um die Proliferation von Neokapillaren zu verhindern,
• - bei der Behandlung der Venenkrankheit von unteren Gliedern und der Couperose;
• - bei der Behandlung der tumoralen Gefäßkrankheit: Angiome mit Gefäßproliferation, Kaposi-Syndrom, tumorale Neoangiogenese (feste Tumore, Nieren, Leber ...);
• - bei der Behandlung der Entzündungskrankheit: rheumatoide Arthritis.
• Die Verabreichungsform und die Dosis hängen im wesentlichen einerseits von der zu behandelnden Krankheit und andererseits von den besonderen Charakteristiken des Patienten ab. Sie können durch den Fachmann auf Grundlage seiner üblichen Kenntnisse bestimmt werden. Überdies kann der MECIF nach üblichen Verfahren zur Herstellung von spezifischen poly- und monoklonalen Antikörpern verwendet werden, die in der Gefäß- und Tumor-, der Rheuma- und Entzündungspathologie zur Ermittlung des MECIF-Spiegels benutzt werden können.
• Zu diesem Zweck kann man vorteilhafterweise die Methode ELISA, insbesondere die in der Literaturreferenz 15 beschriebene, zur Hilfe nehmen.
• Die weiter oben beschriebenen Derivate des MECIF können ebenfalls zur Herstellung von Antikörpern verwendet werden.
• Die folgende detaillierte Beschreibung eines Beispiels für die Extraktion von MECIF und der physikalisch-chemischen sowie pharmakologischen Untersuchungen dient zu einer besseren Erklärung der Erfindung, ohne deren Umfang jedoch einzuschränken.
EXPERIMENTELLER TEIL I) Herstellung eines Überstands einer Monozytenkultur:
• Man verwendet eine Probe menschlichen Vollbluts, die mit Zitrat versetzt wurde und von normalen Spendern mit gutm Gesundheitszustand stammt. Die mononuklearen Zellen werden zuerst durch Zentrifugieren mit Dichtegradienten abgetrennt, wonach man die Monozyten nach einem selektiven Adhäsionsverfahren isoliert, d.h., indem man die mononuklearen Zellen auf Kulturbehältern aus Kunststoff kultiviert (vgl. Literaturreferenz 16). Die anhaftenden mononuklearen Zellen, die nach dieser Aufarbeitung gewonnen wurden, bestanden zu 95 ± 3% aus Monozyten, wie die mit einer spezifischen Esterase- Färbung und Markierung der Zellen durch für die Monozyten und Lymphozyten spezifische monoklonale Antikörper durchgeführte Bestimmung ergab (vgl. Referenz 16). Die Verunreinigung durch Plättchen betrug 5-10 Plättchen pro Monozyt.
• Danach werden die Monozyten in Kulturmedium M-199 der Firma GIBCO inkubiert, und es werden während 24 Stunden bei 37 ºC in einer Atmosphäre von 5 % Kohlendioxid 2,5 % fötales Rinderserum (FCS) zugegeben. Am Ende dieses Zeitraums wird der Überstand der Kultur aufgefangen und mittels eines Filters mit einer Porösität von 0,2 u filtriert. Alle die vorhergehenden Verrahrensstufen werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
Anmerkung:
• Die Wirkungen der verschiedenen chemischen Produkte auf die Bildung des MECIF wurden unter Zugabe dieser Produkte zu den Monozyten am Anfang der Inkubation untersucht.
II) Reinigung des Proteins: Materialien
• Die Träger der Chromatographie, nämlich Sephadex G-25, die Phenyl-Sepharose CL4B stammten von der Firma Pharmacia Fine Chemicals (Uppsala, Schweden), das DEAE-Trisacryl LS und das Trisacryl GF-05 stammten von der Firma IBF, Gennevilliers, Frankreich, während die HPLC-Säule TSK-250 von der Firma Bio-Rad, München, BRD stammte. Alle benutzten chemischen Produkte waren von der Qualität "reaktiv".
• Bei jeder Stufe des Reinigungsverfahrens wurde jede Fraktion im Proliferationstest der Endothelzellen dreifach getestet, um die Fraktion zu ermitteln, welche die Hemmungswirksamkeit aufwies.
• In getrennten Testen läßt man mehrere Portionen von einem Liter des Überstands der Monozytenkultur durch eine Säule von Sephadex G-25 (4,4 x 70 cm) durchlaufen, die mit dem Puffer Tris 10 mM auf den pH-Wert 8,0 eingestellt ist. Die vereinten aktiven Fraktionen werden sodann mit festem Ammoniumsulfat auf eine Sättigung von 30 % behandelt, und man leitet nach Zentrifugieren sodann den Überstand durch eine Kolonne von Phenyl-Sepharose (3,2 x 33 cm), die mit Tris-Puffer 10 mM, der Ammoniumsulfat in einer Sättigung von 30% enthält, auf den pH-Wert 8,0 eingestellt ist. Nach Aufbringen der Probe und ausreichendem Spülen mit vorgenanntem Puffer wird die Säule mit einem linearen Gradienten an Ammoniumsulfat [entwickelt], der von 30 - 0 % geht, die mit dem Puffer Tris 10 mM auf den pH-Wert 8,0 eingestellt ist. Es werden die aktiven Fraktionen vereint, und man läßt sie durch eine Kolonne mit dem weiter oben beschrieben Sephadex G-25 laufen, bevor man eine ergänzende Trennung mittels einer DEAE-Säule Trisacryl-LS (1,5 x 8 cm) mit einem linearen Gradienten von NaCl, der von 0 bis 1 M reicht, in dem Puffer Tris 10 mM mit dem pH-Wert 8,0 vornimmt. Bevor ihre biologische Wirksamkeit auf Gefäßzellen in Kultur geprüft wird, müssen alle Fraktionen der Chromatographie durch eine Säule mit Trisacryl GF-05 (2,4 x 10 cm) geleitet werden, die mit einem Kulturmedium, nämlich dem Puffer nach Hanks (der vom Institut Pasteur, Paris, Frankreich stammt) ins Gleichgewicht gebracht ist. Der Endfaktor der Reinigung bis zur Chromatographie an der Kolonne GF-05 ist das 570Fache. Zum Beweis, daß das nach den Chromatographien an den Säulen DEAE und GF-05 isolierte Protein das Protein MECIF darstellt, und zur Ermittlung des Molekulargewichts dieses Proteins wird sodann die aktive Fraktion einem anderen Chromatographieverfahren an einer HPLC-Säule TSK-250 unterworfen und durch Elektrophorese SDS PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate - Poly Acrylamide Gel Elektrophoresis): Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese) analysiert.
• Die Proteinkonzentration wird anhand der reinen Fraktion mittels der Aminosäurezusammensetzung und durch Messung mit dem Autoanalysator bestimmt. Der weiter oben wiedergegebene Zusammensetzung an Aminosäuren wird mit Hilfe eines Sequenzermittlers bestimmt.
• Die Analyse einer Probe des Produkts mit einem Autoanalysator ermöglichte, folgende Konzentrationen an Aminosäuren zu ermitteln (die Werte sind in Pikomolen angegeben):
• Asp: 20,079; Thr: 5,79; Ser 7,38; Glu: 14,18;
• Pro: 6,95; Gly: 9,78; Ala: 10,764; Val: 9,078;
• Met: 1,212; Ile: 4,716; Leu: 12,781; Tyr: 5,058;
• Phe: 6,189; GlcNH&sub2;: 0,778; Lys: 15,279;
• His: 3,48; Arg: 6,92.
• Hieraus wurden die weiter oben angegebenen Näherungswerte der Reste dieser verschiedenen Aminosäuren abgeleitet.
III. Zellkultur- und Proliferationstest
• Ausgehend von der Nabelschnur, wurden menschliche vaskuläre Endothelzellen gewonnen und nach der vorstehend beschriebenen Methode (vgl. Referenz 17) kultiviert. Die Fibroplasten der menschlichen Haut und die Embryolunge waren ein Geschenk vom A. Macieira Coehlo, (INSERM U-50, Villejuif. Frankreich) während die Zellen der menschlichen femoralen glatten Muskeln ein Geschenk von J. Larrue (INSERM U-8, Pessac, Frankreich) waren. Die Endothelzellen der Schweineaorta wurden durch L. Drouet (INSERM U-150, Paris, Frankreich) geliefert. Das (Methyl-H³)-thymidin (5 Ci/Millimol) stammte vom Commissariat l'Energie Atomique, Frankreich. Die Gefäßzellen in der Kultur, markiert mit Thymidin, wurden unter Verwendung eines "Zellsammlers" (harvester) der Firma Skatron, Lier, Norwegen gesammelt.
• Die biologische Aktivität von MECIF wurde anhand von drei Exemplaren durch Einverleibung des (Methyl-H³)thymidins in die ADN der Gefäßzellen in der Kultur getestet. Hierzu werden in jeder Kulturbrühe eines Mehrfachkultur-Brühenbehälters 12 bis 15.000 Zellen im Kulturmedium M-199, das mit 10% fötalem Rinderserum versetzt war, angesetzt und während 24 Stunden bei 37 ºC in Gegenwart von MECIF und unter einer 5%igen Kohlendioxidatmosphäre inkubiert. Sodann werden die kultivierten Zellen während 16 Stunden mit dem (methyl-H³)- thymidin (1 uCi/Brühe) inkubiert. Danach wird das Medium abgesondert, und die Zellen werden, nachdem sie Collagenase ausgesetzt wurden, auf Glasfaserfiltern aufgefangen, indem man einen "Zellsammler" benutzte. Die für die Untersuchung der Proliferation herangezogenen Endothelzellen von Mensch und Schwein stammten von Primärkulteren, während die Zellen der glatten Muskeln und die Fibroplasten aus dem 8 bzw. 13. Durchlauf stammten.
ERGEBNISSE: Herstellung von MECIF durch normale menschliche Monozyten in Kultur:
• Es wurde gefunden, daß die vom menschlichen Blut isolierten Monozyten einen MECIF genannten Faktor freisetzen, der die Proliferation von Endothelzellen der menschlichen Nabelvene inhibieren kann, wie es die Einverleibung von (Methyl-H³)- thymidin in diese Zellen zeigt. Die Erzeugung von MECIF durch die Monozyten in Kultur erreicht ihr Maximum nach 24 Stunden Inkubation, wonach sie nachläßt. Indessen könnte der in dem Medium nach den ersten 24 Stunden vorliegende Faktor MECIF während mindestens 72 Stunden stabil bleiben. Die Erzeugung von MECIF ist von der Monozytenanzahl und der Konzentration der Serumproteine im Kulturmedium abhängig. Der Maximalwert an MECIF wurde beobachtet, als die Konzentration am fötalen Rinderserum im Kulturmedium der Monozyten 2,5% war.
• Um die Möglichkeit auszuschließen, daß die verunreinigenden Zellen den MECIF-Wert mit verursachen, wurden Kulturmedien von Plättchen oder Lymphozyten hinsichtlich Endothelzellen in der Kultur bei Konzentrationen getestet, die normalerweise bei der Monozytenaufbereitung gefunden werden, indem man eine Methode benutzte, die derjenigen ähnlich ist, welche für die Monozyten beschrieben wurde. Die Ergebnisse zeigten im Gegenteil ein Anwachsen der ADN-Synthese in den Endothelzellen, was nahelegt, daß die Bildung von MECIF direkt den Monozyten zuzuschreiben ist.
• Die Behandlung der Monozyten in Kultur durch Cycloheximid schließt die Freisetzung von MECIF im Kulturmedium völlig aus. Übrigens führt die Behandlung mit Indomethazin, ein Cyclooxigenase-Inhibitor, nicht zu einer Veränderung des MECIF-Wertes. Das legt die Notwendigkeit der Synthese der Proteine, jedoch nicht des Arachidonsäure-Metabolismus für den MECIF-Wert nahe.
• Die Aktivierung der Monozyten durch das Endotoxin [LPS (Lipopolysaccharid), Escherichia coli, 10 u/Milliliter] oder durch das fMLP (formyl-Methionyl Leucin Phenylanalin, 0,1 uM) begünstigt nicht die Bildung von MECIF.
• Die Lagerung eines MECIF enthaltenden Kulturmediums bei 4 ºC hat keine Wirkung auf die Bioaktivität, und das Medium ist während 5 Minuten bei 56 ºC stabil.
• Die Bioaktivität von MECIF wird nicht durch Aprotinin, ein Proteaseinhibitor, neutralisiert.
• Andere Beobachtungen zeigen, daß der Faktor MECIF seine Bioaktivität auf die Endothelzellen nicht mittels einer direkten Zytotoxizität ausübt, und zwar in Anbetracht dessen, daß er nicht die Freisetzung Cr&sup5;¹, ausgehend von zuvor markierten Endothelzellen, hervorruft.
Reinigung des Proteins
• Nach der Reinigungsstufe an Phenyl-Sepharose wurde die Wirksamkeit des MECIF auf Endothelzellen in dem Peak untersucht, der mit etwa 14 % Ammoniumsulfat eluiert worden war. Die anderen Fraktionen zeigten eine vernachlässigbare Wirksamkeit. Die zusätzliche Reinigungsstufe mit dem DEAE Trisacryl-LS trennte den Faktor MECIF von anderen Proteinen. Die den MECIF enthaltende Fraktion wurde in dem ersten Peak eluiert, und die Analyse mit Geleelektrophorese zeigte, daß es sich um eine einzige Bande handelte.
• Die Wirksamkeit dieses Proteins wurde noch derart bestätigt, daß sie sich in den Fraktionen des einzigen Peaks zeigt, nachdem dieser der HPLC-Chromatographie mit TSK-250 unterzogen wurde. Überdies wurden die aktiven Fraktionen in dem gleichen Volumen wie die aus der DEAE-Chromatographie stammenden aktiven Fraktionen gefunden, wenn man das den rohem Faktor MECI enthaltende Kulturmedium der Monozyten durch die Säule mit TSK-250 leitete.
• Es wurden ebenfalls Versuche durchgeführt, Chromatographien an Heparin Sepharose und an Cibracron Blue F3GA Sepharose in das Reinigungsverfahren einzuführen. Es erwies sich indessen, daß der Faktor MECI durch den einen oder den anderen dieser Chromatographieträger nicht zurückgehalten werden konnte.
Eigenschaften des gereinigten MECIF
• Wie durch SDS-PAGE-Elektrophorese unter unverminderten Bedingungen und Färbung mit Coumassie-Blau ermittelt, wandert der nach Chromaotgraphie an DEAE-Trisacryl LS gereinigte Faktor MECI in Form einer einzigen breiten Bande mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 64 kd. Unter verminderten Bedingungen erscheint er in Form von zwei Banden mit einer Hauptbande von etwa 70 kd und einer zweiten Bande von etwa 68 kd. Die Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie an TSK-250 (60 x 0,75 cm) gibt einen einzigen Peak zu erkennen, der einem Molekulargewicht von etwa 66 kd entspricht.
• Die Färbung des Elektrophrosegels SDS/PAGE mit Silbernitriat gibt keine zusätzlichen Banden zu erkennen, wie es bei der Färbung mit Coumassie-Blau der Fall war. Die Umsetzung der periodischen Säure mit Schiff-Reagenz (PAS) ist positiv, was zeigt, daß der Faktor MECI ein Glycoprotein ist. Wenn der Überstand der Monozyten einer Hochdruck-Flüssigkeitchromatographie (an TSK-250) unterworfen wird, findet sich die Hemmwirkung in den Fraktionen (Molekulargewicht: 66 kd) wieder, welche in gleichem Volumen eluiert wurden, wie es beim reinen Faktor MECI der Fall war, was zeigt, daß der Faktor MECI der Hemmwirkung entspricht, die im Überstand der Monozyten vorliegt.
Wirksamkeit der Wachstumsregulierung
• Es wurde gefunden, daß die Hemmung unter Einverleibung von (Methyl-H³)thymidin von der Konzentration des MECIF enthaltenden Kulturmediums abhängig ist. Die Verdünnung dieses Mediums, ausgehend von seiner Ursprungskonzentration bis zu dem 64Fachen, ruft die Herabsetzung des Hemmeffekts von 80 auf 30%, bezogen auf die Vergleichsprobe (n=15), hervor, Eine Konzentration von 14 pg MECIF führt zu einer Hemmwirkung von 81 ± 2,5 % (X ± SEM; SEM = mittlerer Standardfehler) gegenüber der Einverleibung des Thymidins in Gegenwart von fötalem Rinderserum (2,5-10 %) (n=16). Die Wirkungen der Wachstumsregulierung auf vaskulare Endothelzellen sind von der Konzentration an MECIF abhängig. Bei gleichen Konzentration beeinflußt der Faktor MECIF nicht auf markante Weise die Einverleibung von Thymidin in die Fibroplaste in dem Maße, wenn sie von der normalen menschlichen Haut stammen (113 ± 5 %, n=6), wie wenn sie von der Embryolunge stammen (128 ± 6%, n=8). Unter den gleichen Bedingungen werden die Zellen der glatten Muskeln und der menschlichen Arterien nicht angegriffen (108 ± 8 %, n=12). Eine Hemmung von 28 ± 7 % (n=12) wird bei Endothelzellen des Schweins beobachtet, jedoch in einem viel weniger bedeutsamen Maße.
• Eine Langzeitstudie zeigte, daß die ADN-Synthese nach 6stündiger Inkubation durch MECIF unterdrückt wird und ihr Plateau nach 12stündiger Inkubation erreicht. Darüberhinaus verläuft die Wirkung von MECIF bei der Hemmung der ADN-Synthese parallel zur Verminderung der Zellprolieferation, was durch Zellauszählungen unter einem optischen Mikroskop ermittelt wurde.
Reversibilitätstest
• Die Endothelzellen wurden zuerst in Gegenwart von MECIF während 24 Stunden kultiviert, wonach die Einverleibung von (Methyl-H³)- thymidin bei einem Teil der Zellkultur nach 16,72 und 120 Stunden gemessen wurde. Währenddessen führte man die Kultur der Zellen bei zwei anderen Zellkulturen nach dieser Inkubation von 24 Stunden in Gegenwart von entweder 20 % fötalem Rinderserum oder aber von 25 ug ECGF (Wachstumsfaktor der Endothelzellen) während anderen Zeiträumen von 16,72 und 120 Stunden weiter. Die Ergebnisse wurden in Prozentsätzen der Einverleibung des (Methyl-H³)- thymidins in die Zellen am Ende jeder Inkubation ausgedrückt, im Vergleich mit den in Abwesenheit von MECIF kultivierten Zellen.
• Nach dem gleichen Test mit TGFβ fand man, daß die Reversibilität des Wachstums der Endothelzellen viel leichter zu erhalten war, nachdem man diese MECIF aussetzte, als wenn man sie TGFβ aussetzte.
Vergleichsstudie zwischen der Wirksamkeit von TGFβ und derjenigen von MECIF
• Wie von dem Hersteller (R & G, Minneapolis, Mn, USA) beschrieben, wurde vom Erfinder gefunden, daß 50 ul (100 ug IgM äquivalent) spezifisch gegen menschlichen TGFβ (R + G) gerichtete polyklonale Antikörper die biologische Wirksamkeit von 2 ng/ml TGFβ (Calbiochem. La Jolla, Ca.) neutralisierten. Verschiedene Konzentrationen (2-12 ug/ml) an MECIF mit einer Zwischenreinheit (d.h. nach Chromatographie an DEAE) wurden eingesetzt, und die Menge, welche zu einer 50 % Hemmung der Proliferation der Endothelzellen führte, wurde mit derjenigen an TGFβ verglichen, die ebenfalls eine 50 % Hemmung des Wachstums bewirkte (2 ng/ml). MECIF bzw. TGFβ wurde mit den Anti-TGFβ-Substanzen während einer Stunde bei Umgebungstemperatur inkubiert, bevor sie bezüglich ihrer Hemmwirkungen getestet wurden. Diese Anti-TGFβ-Substanzen neutralisierten die Hemmungswirkungen von MECIF auf das Wachstum der Endothelzellen nicht.
• Bei der Beobachtung der Endothelzellen unter einem optischen Mikroskop war feststellbar, daß die Gegenwart von MECIF im Kulturmedium morphologische Veränderungen der Zellen hervorruft, welche eine längliche Form annahmen. Indessen behalten die Zellen noch, wie Immunfluoreszenz-Untersuchungen und Beobachtungen mit dem Transmissions-Elektronenmikroskop zeigten, ihre spezifischen kennzeichen, d.h. den Fktor von Willebrand und die Körper von Weibel Palade.
• Vermerkt sei, daß TGFβ, wenn es die Proliferation der Endothelzellen hemmte, die Morphologie der Zellen nicht veränderte.
Diskussion der Ergebnisse
• Die in vorliegendem experimentellen Teil dargelegten Ergebnisse zeigen, die Fähigkeit normaler menschlicher Monozyten in Kultur einen Faktor freizusetzen, welcher das Wachstum von menschlichen Endothelzellen hemmt. Dieser Hemmeffekt ist nicht einer zytotoxischen Wirksamkeit, sondern vielmehr einer Hemmung der ADN-Synthese zuzuschreiben. Der in Frage stehende Faktor MECIF ist ein Glycoprotein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 66 kd, wenn er sehr gereinigt ist. Der Wert dieses Faktors in den rohen Monozytenextrakten ist von der Anzahl der Monozyten abhängig, die in der Kulturbrühe angesetzt werden, und seine Bildung impliziert die Proteinsynthese.
• Der monozytäre Ursprung von MECIF wird durch die Tatsache bestätigt, daß die möglichen Zellverunreinigungen (Plättchen, Lymphozyten) unter den angewandten experimentellen Bedingungen keine Hemmung hervorbringen; jedoch könnte ein geringer Anteil an Lymphozyten (weniger als 10 %) einen Einfluß auf die Bildung des Inhibitors durch die Monozyten haben.
• Es wurde gezeigt, daß aufgrund seiner biologischen Eigenschaften der vom rohen Monozytenextrakt isolierte Faktor MECI ein Hemmfaktor ist, der gegenüber dem Wachstum von Endothelzellen wirksam ist. Überdies ruft der Faktor MECI die Hemmung der ADN-Synthese in den Endothelzellen hervor, und zwar auf eine Weise, die von der Dosis abhängt. Die hohe Wirksamkeit von MECIF wird durch seine Fähigkeit gezeigt, seine Wirkungen bei einer so geringen Konzentration von 10 pg/ml gegenüber dem Wachstum von 15.000 Zellen auszuüben. Ferner wurde gefunden, daß der Faktor MECI gegenüber Zellen spezifisch ist, da er das Wachstum von Zellen menschlicher glatter Muskeln, von Fibroplasten der menschlichen Haut und von Endothelzellen des Schweins nur wenig beeinflußt. Indessen waren die verschiedenen Zellen in verschiedenen Replikationsstadien, und man kann infolgedessen nicht die Möglichkeit eines unterschiedlichen Ansprechens auf MECIF je nach Alter der Zelle ausschließen.
• Die biologischen Wirkungen von MECIF auf das Wachstum menschlicher Endothelzellen könnte teilweise durch die Anwesenheit von wachsenden Mengen an Mitteln übertroffen werden, welche das Wachstum im Versuchsmedium stimulieren, wie z.B. durch ECGF (Wachstumsfaktor der Endothelzellen). Die Reinheit von MECIF, soweit sie realisiert wurde, wurde durch Auftreten einer einzigen Proteinhauptbande bei der Gelelektrophorese und ebenso eines einzigen Peaks nach seinem Durchleiten durch eine Gelfiltration-Chromatographiesäule vom Typ einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie nachgewiesen. Die Gelelektrophorese-Analyse unter unverminderten Bedingungen zeigt, daß die Proteinhauptbande ein scheinbares Molekulargewicht von 64 kd aufweist. MECIF zeigt biologische und chemische Eigenschafte, die von denjenigen aller bekannter, das Wachstum regulierender Produkte unterschiedlich ist, die einem monozytären oder makrophagen Ursprung haben, wie z.B. die Interferone (Referenzen 18, 19, 20), das Interleukin-1 (Referenz 11), das TNF (Referenz 21) oder das β-TGF (Referenz 22).
• Das MECIF unterscheidet sich von anderen bekannten Hemmfaktoren, wie den Interferonen, dem IL-1, dem TNFalpha und dem TGFβ durch seine scheinbare Molekularmasse. Obgleich seine Wirkung auf das Wachstum von Endothelzellen derjenigen von TGFβ ähnlich war, zeigen zahlreiche verschiedene Charakteristika, daß es sich um unterschiedliche Faktoren handelt. Der Faktor MECI wird in Abwesenheit einer Stimulation durch ein Endotoxin synthetisiert, während das TGFβ eine derartige Stimulation erfordert. Die Reversibilität des Wachstums von Endothelzellen, nur viel leichter zu erzielen, nachdem man die Endothelzellen dem MECIF aussetzte, als es beim TGFβ der Fall war. Die spezifisch gegen TGFβ, TNFalpha ("Cachetin") und gegen INFalpha und gamma gerichteten Antikörper konnten die Hemmwirkungen von MECIF auf das Wachstum von Endothelzellen nicht neutralisieren.
• Die mögliche Verunreinigung von MECIF durch unbestimmte Mengen an TGFβ zeigte sich als unwahrscheinlich in Anbetracht der Tatsache, daß Zubereitungen an MECIF mit höheren Konzentrationen die Proliferation von Fibroplasten der normalen Rattenniere, welche klassische Vergleichszellen beim biologischen Test aus TGFβ sind, nicht veränderten.
• Andere Hemmfaktoren gegenüber dem Wachstum von Endothelzellen von aufgrund ihres Ursprungs unterschiedlichen Zelltypen, wie z.B. Knorpel (Referenz 23), Glaskörperflüssigkeit (Referenz 24), Plättchen (Referenz 25), Endothelzellen (Referenz 26 und 27) zeigen ebenfalls von den Zellen des MECIF verschiedenen Eigenschaften. Zusammenfassend kann gesagt werden, daß die Untersuchungen in ihrer Gesamtkeit nahelegen, daß MECI ein Hemmfaktor für Endothelzellen ist, der sich von anderen Hemmfaktoren, wie weiter oben charakterisiert (Referenzen 28 bis 30), unterscheidet.
• In Anbetracht dessen, daß man wußte, daß die Monozyten fähig waren, Mittel zu erzeugen, welche das Wachstum von Endothelzellen begünstigen, sollte in einer großen Anzahl pathophysiologischer Zustände, einschließlich die Entzündung und Arteriosklerose, die Aufrechterhaltung des Gleichgewichts zwischen den begünstigenden Faktoren und den das Wachstum hemmenden Faktoren wichtig sein. Ferner könnte dieses Gleichgewicht eine entscheidende Rolle bei der Modulation der Angiogenese spielen, welche die Methoden der Wiederherstellung von Geweben, diabetische Retinopathien und die tumorale Neovaskularisierung begleiten kann.
Literaturzsuammenstellung
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Claims (10)

1. Vorzugsweise glycosyliertes Protein mit einem Molekulargewicht zwischen etwa 0,6 und 200 kd, das einen solchen Reinheitsgrad aufweist, daß seine Analyse möglich ist, und das das Wachstum von Zellen glatter Muskeln nicht wahrnehmbar verändert, umfassend die Sequenz:

- Ser - Pro - Glu - Leu - Thr - Phe - .

2. Protein gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz N-terminal ist.

3. Protein gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz folgende ist:

-Ser-Pro-Glu-Leu-Thr-Phe-Arg-X-Y-Thr-Ile-Ser-

worin X und Y, die gleich oder verschieden sein können, jeweils Trp oder Asp bedeuten.

4. Protein gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß X und Y verschieden sind, und daß vorzugsweise X Trp, und Y Asp bedeuten.

5. Glycoprotein mit einer scheinbaren Molekularmasse von 64 bis 70 kd, umfassend 568 Aminosäurereste, die sich gemäß folgenden Anteilen aufteilen:

Asp: etwa 80; Thr : etwa 23,06; Ser: etwa 29,40; Glu : etwa 56,5; Pro : etwa 27,70; Gly : etwa 38,98; Ala : etwa 42,88; Val : etwa 36,16; Met : etwa 4,83; Ile : etwa 18,79; Leu : etwa 50,92; Tyr : etwa 20,15; Phe : etwa 27,16; GlcNH&sub2; : etwa 3,10; Lys : etwa 60,87; His : etwa 13,81; Arg : etwa 27,60, und das die N-terminale Peptidsequenz

Ser-Pro-Glu-Leu-Thr-Phe-Arg-X-Y-Thr-Ile-Ser-

aufweise, worin X und Y, die gleich oder verschieden sein können, jeweils Trp oder Asp bedeuten.

6. Glycoprotein gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß seine scheinbare Molekularmasse 66 kd beträgt.

7. Verfahren zur Extraktion des Glycoproteins gemäß Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß es im wesentlichen folgende Stufen umfaßt:

1.) Kultivierung von normalen menschlichen Monocyten,

2.) Durchleiten des Überstands der filtrierten Kultur durch eine auf einen pH-Wert von etwa 8 eingestellte Säule aus vernetztem Polysaccharid,

3.) nachfolgendes Durchleiten dieses Überstands durch eine auf einen pH-Wert von etwa 8 eingestellte Säule aus einem phenylierten und vernetztem Agarosegel, wobei mit einem fallenden Gradienten Ammoniumsulfat entwickelt wird,

4.) Durchleiten der in Stufe 3.) erhaltenen aktiven Fraktionen durch eine auf einen pH-Wert von etwa 8 eingestellte Säule von der Art, wie sie in Stufe 2.) benutzt wurde,

5.) Durchleiten des in Stufe 4.) erhaltenen Eluats durch eine Ionenaustauschersäule vom Diethylaminoethyl- (DEAE)-Typ, wobei mit einem steigenden Gradienten Natriumchlorid entwickelt wird,

6.) Durchleiten der in Stufe 5.) erhaltenen Fraktionen durch eine Niederdruck-Ausschlußchromatographiesäule, die mittels eines Zellkulturmediums ins Gleichgewicht gebracht wurde, und

7.) Auffangen des gereinigten Produkts, ggfls. nachdem die in Stufe 6.) erhaltenen aktiven Fraktionen einer Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie unterworfen wurden.

8. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an zumindest einem (Glyco)protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 als Wirkstoff.

9. Verwendung des Glycoproteins gemäß Anspruch 5 oder 6 zur Herstellung von Antikörpern.

10. Verwendung des Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung von Antikörpern.