DE69025934T2

DE69025934T2 - Verfahren und zusammensetzung zur thrombosebehandlung beim säugetier

Info

Publication number: DE69025934T2
Application number: DE69025934T
Authority: DE
Inventors: Arthur Johnson; Philip Nguyen; Edgar O'rear; Eugene Patterson; Thomas Whitsett
Original assignee: Research Corp Technologies Inc
Current assignee: Research Corp Technologies Inc
Priority date: 1989-05-17
Filing date: 1990-05-15
Publication date: 1996-09-19
Anticipated expiration: 2010-05-16
Also published as: DE69025934D1; WO1990014078A1; CA2016949C; EP0472657A4; ES2085352T3; EP0472657A1; CA2016949A1; EP0472657B1; JPH05501855A; AU635541B2; AU5810590A; ATE135200T1; DK0472657T3; US5503850A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen pharmazeutische Zusammensetzungen zur Behandlung thrombotischer Zustände.
Die Erfindung betrifft einerseits ein Arzneimittel, welches eine Vielzahl von zur parenteralen Injektion bei Säugern geeigneten Mikrokapseln umfaßt, die jeweils bestehen aus: einem einen Plasminogenaktivator enthaltenden Innenteil und einer biokompatiblen, den Innenteil umgebenden Schicht, wobei die Schicht semipermeabel ist und eine geregelte Freigabe von wenigstens einem Teil des im Innenteil enthaltenen Plasminogenaktivators im Thrombusbereich des kardiovaskulären Systems von einem Säuger erlaubt, wodurch eine Herabsetzung der für die Wiederdurchblutung eines Blutgefäßes beim Säuger benötigte Zeit im Vergleich zur Verabreichung eines Mittels mit einem freien Plasminogenaktivator um etwa 20% bis etwa 50% herabgesetzt wird.
Die Erfindung ist in den Patentansprüchen definiert.
Was die Zeichnungen anbetrifft, so zeigt
Fig. 1A die Zeitabhängigkeit vom Druckabfall, überwacht während der Filtration von plättchenarmen Plasma (platelet poor plasma = PPP),
Fig. 1B die Zeitabhängigkeit vom Druckabfall, überwacht während der Filtration von einer Mischung von Streptokinase und plättchenarmen Plasma (SK/PPP) durch von Blutgerinseln verschlossene Membranen,
Fig. 2 die Inkubation von Streptokinase (SK) und liposomal-eingekapselter Streptokinase (LESK) in PPP, was zu einer Zunahme der Gerinselauflösungszeit der menbrangebundenen Thromben führt.
Die Bildung von einem okklusiven Thrombus in einem Blutgefäß kann das normalerweise durch den Blutstrom in diesem Gefäß versorgte Gewebe schädigen. Sofern der okklusive Thrombus innerhalb von einer arteriosklerotischen Koronararterie gebildet wird, kann ein akuter Myokardinfarkt ausgelöst werden, der für den Patienten fatale Folgen haben kann. Wenn es auch wünschenswert ist, jeden thrombotischen Zustand baldmöglichst zu behandeln, so besteht doch eine wesentliche Abnahme in Bezug auf die Herabsetzung der Sterblichkeit, Verbesserung der ventrikulären Funktion und posttherapeutischen Lebensqualität, falls der Myokardinfarkt-Patient rasch, d.h. innerhalb weniger Stunden nach Einsetzen der Symtome, behandelt wird. Die Zeit ist aus zwei Gründen von kritischer Bedeutung für Patienten mit akutem Myokardinfarkt. Erstens nimmt der Grad, bis zu dem das Myokardgewebe gerettet werden kann, mit der Zeit ab und zweitens sinkt die Wiederdurchflußrate mit der Zeit, da die Wirksamkeit der Thrombolyse abfällt.
Im allgemeinen wird angenommen, daß die Myokardwiederherstellung während eines Zeitraums bis zu 6 Stunden von Vorteil ist. Indessen hat eine rasche intravenöse Verabreichung von Streptokinase eine statisch signifikante unterschiedliche Ausscheidungsfraktion, dem Maß für die Kardialfunktion, im Falle der Behandlung innerhalb von weniger als 1,5 Stunden nach Einsetzen der Schmerzen im Vergleich zu Patienten, die zwischen 1,5 und 4 Stunden behandelt wurden, gezeigt.
Die konventionelle thrombolytische Therapie im Falle eines akuten Myokardinfarkts mit Plasminogen-Aktivatoren, Streptokinase, Urokinase und tPA, erfordert 30 Minuten bis zu 1 Stunde oder noch länger zur Wiederherstellung des Flusses; dieses kann beträchtlichen Gewebeverlust während und nachfolgend zu der Behandlungsperiode bedeuten. Darum ist eine Beschleunigung der thrombolytischen Aktivität von einem Plasminogen-Aktivator für die Behandlung von Patienten mit Myokardinfarkt von Vorteil. Eine solche Beschleunigung wird gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht.
Die Möglichkeit von verschiedenen Nebenwirkungen, wie lebensbedrohenden unkontrollierten Blutungen, begleitet den Einsatz von Plasminogen-Aktivatoren. Die Herabsetzung der Dosis vom Plasminogen-Aktivator kann das Auftreten von solchen schädlichen Nebenwirkungen reduzieren; für eine solche Herabsetzung der minimal wirksamen Menge von Plasminogen-Aktivator, der zur Thrombolyse bei einem Säuger, wie einem Menschen, erforderlich ist, sorgt die vorliegende Erfindung.
Über Plasminogen-Aktivatoren, die mit Phospholipid-Vesikeln assoziiert sind, wird von S. Soeda, M Kakadi, H. Shimeno und A. Magamatsu unter dem Titel "Some Properties of Tissue-Type Plasminogen Activator Reconstituted Onto Phospholipid and/or Glycolipid Vesicles" in Biochemical and Biophysical Res. Comm., 146 (1987), 94-100, berichtet. Soeda et al beschreiben die Bildung von multilamellaren Liposomen mit mindestens teilweiser t-PA-Bindung an die Oberfläche vom Liposom. Das EP 0160266 offenbart eine Liposom-Zusammensetzung mit einem quervernetzten Netzwerkmaterial, bei dem ein Liposom in dem Netzwerk eingeschlossen ist.
Die erfindungsgemaßen Mittel umfassen eine Vielzahl von Mikrokapseln, die zur parenteralen Injektion bei einem Säuger, wie einem Menschen, geeignet sind. Die Mikrokapseln bestehen aus einem einen Plasminogen-Aktivator enthaltenden wässerigen Innenteil, vorzugsweise einem Streptokinase enthaltenden Innenteil, und einer biokompatiblen Schicht um den Innenteil herum. Die Schicht ist semipermeabel oder abbaubar und erlaubt eine geregelte Freigabe von wenigstens einem Teil der im Innenteil enthaltenen Streptokinase in das kardiovaskuläre System vom Säuger.
Plasminogen-Aktivatoren, die gemäß der Erfindung verwendet werden, umfassen Streptokinase, Urokinase und tPA. "Streptokinase", "Urokinase" und "tPA", wie sie hier beschrieben sind, schließen deren Derivate, Konjugate, Analoge oder genetisch abgewandelte Stoffe mit mindestens einem Teil an den Steptokinase, Urokinase oder tPA kodierenden Genen mit zumindest teilweiser Beibehaltung der thrombolytischen Wirkungen von Streptokinase, Urokinase oder tPA samt acyliertem Plasminogen- Streptokinase-Aktivator-Komplex ein. Die gemäß der Erfindung verwendeten Plasminogen-Aktivatoren umfassen auch jedwede Kombination von Streptokinase, Urokinase und/oder tPA.
Die Schicht der erfindungsgemäßen Mikrokapseln ist "biokombatibel", was bedeuten soll, daß sie für den bevorzugten Verabreichungsweg physiologisch kompatibel ist. Zur intravenösen Injektion liegen die Osmolalität und der pH-Wert des Mittels innerhalb von dem zum Injizieren geeigneten Bereich und sind die Mikrokapseln hinreichend gereinigt, um so weit als möglich ohne antigene Wirkung zu sein.
Die Hüllschicht bei dem erfindungsgemäßem Mittel ist semipermeabel; dies bedeutet, daß mindestens ein wesentlicher Teil von dem Plasminogen enthaltenden Innenteil entweder die Schicht passiert oder sich die Schicht bei dem Aussetzen in dem kardiovaskulären System vom Säuger soweit abbaut, daß der Plasminogen-Aktivator seine thrombolytische Aktivität auf den Thrombus in dem kardiovaskulären System vom Säuger, wie einem Menschen, ausüben kann. Diese Semipermeabilität von der Schicht erlaubt eine geregelte Freigabe von mindestens einem Teil von dem im Innenteil enthaltenen Plasminogen-Aktivator.
Einmal eingespritzt, zirkulieren die Mikrokapseln in dem kardiovaskulären System vom Sänger und besonders plaziert beim darin befindlichen Thrombus. Die Schicht sichert insbesondere eine zeitliche Barriere zu der Verhinderung von einer Zersetzung der Innenbestandteile durch Blutbestandteile und eine Verminderung immunologischer Reaktionen. Mindestens ein Anteil vom Inneren wird aus den Mikrokapseln durch die semipermeable Schicht hindurch freigegeben, damit wenigstens ein Teil von dem Thrombus in dem kardiovaskulären System vom Sänger aufgelöst wird. Am meisten wird bevorzugt, den Innenteil bei oder nahe vom Thrombus freizusetzen, um die Thrombolyse zu beschleunigen.
Die Mikrokapseln gemäß der Erfindung können von jeder Gestalt oder Form sein, die für eine intravenöse Injektion geeignet und zur Aufnahme von einem den Plasminogen- Aktivator enthaltenen Innenteil fähig ist. Vorzugsweise haben die Mikrokapseln eine Größe von etwa 25 nm (250 Å) bis etwa 10 µm.
Die Schicht der erfindungsgemäßen Mittel kann Phospholipide und vorzugsweise ein Liposom umfassen. Liposome sind mikroskopisch verschlossene, flüssigkeitsgefüllte Vesikel, die üblicherweise Phospholipide mit hydrophoben Schwänzen und hydrophylen Köpfen betreffen und elektrostatisch geladen oder neutral sein können. Die Liposomen haben zwei Standardformen: Multilamellare Vesikel (MLV) mit mehreren Lipiddoppelschichten und unilamellare Vesikel (ULV) mit einer einzelnen Doppelschicht um den flüssigen Innenteil. Die unilamellaren Vesikel sind charakterisiert als schmale unilamellare Vesikel (SUV) und große unilamellare Vesikel (LUV).
Die LUV werden bei der Erfindung bevonugt, obgleich eine jede Art von Mikrokapseln mit den geeigneten, hier definierten Eigenschaften verwendet werden kann. Es können verschiedene Liposome mit den gewünschten Charakteristiken ausgewählt oder zur Bildung der gewünschten Eigenschaften manipuliert werden. Zum Beispiel kann die Retention vom Gelöstem und deren Halbwertszeit bei der Zirkulation durch eine geeignete Behandlung der liposomalen Membran-Fluidität und Zusammensetzung geregelt werden. Bei Abwesenheit von Cholesterin können Liposome erheblich lecken, besonders wenn sie intravenös eingebracht werden. Es wird angenommen, daß dies auf Zwischenreaktionen mit Plasmaproteinen und dem Lipidaustausch mit Lipoproteinen beruht, welche durch die Anwesenheit von Cholesterin erheblich inhibiert werden können. Cholesterin ändert die mechanischen und strukturellen Eigenschaften von den Phospholipiddoppelschichten der Liposome unter Verursachung einer veränderlichen Permeabilität und Resistenz.
Eine Regionsselektivität kann in begrenztem Ausmaß geregelt werden durch Auswahl von Liposomen mit variablen Resistenz- und Durchlässigkeits-Eigenschaften: die beim Hindurchtreten eines teilweise verschlossenen Gefäßes entstehenden Belastungen vermögen empfindliche Liposome zu öffnen, wodurch die Streptokinase im Thrombusbereich selektiv freigesetzt wird.
Es wird angenommen, daß die Liposome auch aufgrund ihrer Zusammensetzung stellenspezifisch für Thromben sind und darum den Plasminogen-Aktivator dort abgeben. Es wird ferner angenommen, daß die Liposome eine temporäre Barriere bilden, die vor dem Abbau von dem Plasminogen-Aktivator durch Blutkomponenten schützt und so eine vorzeitige Inaktivierung derselben verhindert. Dadurch kann die benötigte erforderliche Dosis herabgesetzt werden. Die durch die Liposome geschaffene temporäre Barriere kann auch immunologische Reaktionen und Nebenwirkungen durch internäres Bluten vermindern oder vermeiden. Wie dem auch sei, es hat sich aus den hier erörterten Versuchen ergeben, daß die Einhüllung von Plasminogen-Aktivator in Liposome eine geregelte Freigabe vom Plasminogen-Aktivator erlaubt, welche im Vergleich zur Anwendung von nicht eingehülltem Plasminogen-Aktivator in nicht zu erwartender Weise zu einer merklichen Beschleunigung der Thrombolyse bei Säugern führt.
Die Beschleunigung der thrombolytischen Aktivität kann durch verschiedene Faktoren, wie Abnahme der zum Auflösen von einem Thrombus benötigten Zeit (Gerinselauflösungszeit = CDT (clot dissolving time) im nachfolgenden Beispiel 1) oder durch Abnahme der für den Wiederdurchfluß benzötigten Zeit gezeigt werden. Unter Verwendung von den hier erhaltenen Daten über die Größe der Gerinselreste kann die Thrombolyse von einem 500 mg-Thrombus von 6 mg/Minute bei Einsatz von freier, also nicht eingehüllter Streptokinase auf 15 mg/Minute bei Einsatz von eingehüllter Streptokinase beschleunigt werden. Im Beispiel 2 wurde die Wiederdurchblutungszeit bei einem Hundeversuch ermittelt, und zwar durch Aufnahme der elektrokardiographischen Veränderungen durch Ischämie, Wiederherstellung vom linken arteriellen Umfluß und Zyanoseverlust in der linken Koronararterien-Verteilung.
Die Beschleunigung der Thrombolyse senkt die zum Wiederdurchfluß einer mit einem Thrombus verschlossenen Arterie benötigte Zeit. Die gemäß der Erfindung erzielbare Beschleunigungsrate ist um etwa 5 bis 60%, besonders 10 bis 55% und vorzugsweise 20 bis etwa 50% rascher als der Grad für die Thrombolyse bei einem dem Säuger verabreichten Mittel mit nicht eingehülltem Plasminogen-Aktivator.
Die erfindungsgemaßen Mittel können ferner ein flüssiges Medium enthalten, das zur parentalen Injektion, wie bei einer intravenösen Injektion in den Säuger, geeignet ist und in dem die Mikrokapseln suspendiert sind. Der Träger soll steril sein, eine für die Injektion bei einer Person geeignete Osmolalität und pH-Reichweite aufweisen und relativ inert sein, damit die Zusammensetzung wenigstens teilweise die thrombolytische Aktivität behält. Beispiele für geeignete Träger sind normale sterile Salzlösungen und sterile 5-prozentige Dextroselösungen in Wasser sowie deren Kombinationen.
Die Dosis von dem Mittel kann üblichen Mengenanforderungen, also den von Plasminogen-Aktivator-Herstellern und Forschern gesetzten Dosierungen folgen. So wird z.B. bei einem Myokardinfarkt eine Dosis von 1,5 Millionen Einheiten an Streptokinase während einer Stunde oder von 30 Einheiten von acyliertem Plasminogen- Streptokinase-Aktivator-Komplex (APSAC) während 3 bis 5 Minuten infundiert.
Indessen vermindert die Umhüllung vom Plasminogen-Aktivator die minimale therapeutisch wirksame Menge an dem für den Wiederdurchfluß von einer durch einen Thrombus verschlossenen Arterie benötigten Plasminogen-Aktivator im Bereich von etwa 5 bis etwa 60%, besonders um etwa 10 bis 55% und vorzugsweise um etwa 20 bis 50% gegenüber der minimal wirksamen Dosis an freiem Plasminogen-Aktivator, also einem nicht eingehüllten Plasminogen-Aktivator. Wie zuvor ausgeführt, vermag die Herabsetzung von der Menge an Plasminogen-Aktivator das Risiko von schädlichen Nebenwirkungen zu vermindern. Zusätzlich werden die Kosten vom Plasminogen- Aktivator für die Patienten geringer.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung in der Praxis.

Beispiel 1

Bei diesem Beispiel wird ein in vitro-Versuch durchgeführt, bei dem membrangebundene Thromben hergestellt werden und diese dann zur Analyse der Wirkung von Streptokinase (SK) und liposomal eingekapselter Spreptokinase (LESK) bei einer Fließfiltrationsuntersuchung verwendet werden. Der erste Schritt war die Ermittlung, daß die Mikrokapseln bei dem Filtrationstest nicht stören. Daher werden die stabilen Blutdruckabfälle (steady state pressure drops) im Falle von Blind-LUV/PPP und PPP (platelet poor plasma) bei dem Filtrieren durch die verschlossenen Membranen gemessen. Die Druckabfalle der beiden Systeme waren vergleichbar und zeigten, daß die kleinen Liposome den Widerstand des Flusses durch die Thromben nicht änderten, selbst wenn sich einige der Liposome oder von diesen lysierten Membranen an den die Poren verschließenden Thromben angehaftet haben konnten. Zusätzlich zeigten die Versuchsergebnisse, daß restliche Plättchen in dem PPP nicht signifikant zu einer weiteren Blockierung von den verschlossenen Poren beitrugen.
Falls die SK nicht mit Plasmaproteinen vorinkubiert war, war die Gerinselauflösungszeit bei LESK/PPP vergleichbar mit der von SK/PPP (Fig. 2). Diese Ergebnisse zeigen, daß die festgehaltene SK ein ähnliches fibrinolytisches Vermögen wie nicht festgehaltene SK zu früheren Zeiten hat. Besonders wichtig ist, daß diese Daten ergaben, daß die Liposome zur Freigabe von SK im Zielbereich beim Durchqueren der verschlossenen Poren geeignet waren. Der Mechanismus für die Freigabe von SK ist nicht bekannt, er beruht jedoch wahrscheinlich auf chemischen und physikalischen Zwischenreaktionen zwischen den Liposomen und ihrem Umfeld.
Dieses Beispiel belegt auch, daß die Einkapselung der SK in Liposome die SK vor einem Abbau durch Plasmaproteine schützen kann, wie dies durch die Inkubation von SK und LESK in Plasmaproteine enthaltenden Lösungen und dem Vergleich der Resultate von der in vitro-Thrombolyse gezeigt wird.

Es wurden folgende Materialien und Arbeitsweisen angewendet:

Materialien:

Octylglukosid (OG; n-Octyl-β-D-glukopyranosid) wurde von Calbiochem (La Jolla, CA) bezogen und in Tris-gepufferter Salzlösung (TBS; 20mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl) gelöst, 1-Palmitoyl-2-oleyl-phosphatidylcholin (PC) wurde von Avanti Polar-Lipids (Birmingham, AL) bezogen und ohne weitere Reinigung verwendet, wohingegen das radioaktiv markierte L-1-Palmitoyl-2-oleyl- (oleyl-1-¹&sup4;C)phosphatidylcholin ((¹&sup4;C)PC) vom New England Nuclear (Boston, MA) stammte. Triton X-100 wurde von Research Products International (Mount Prospect, IL) erhalten und Trinatriumzitrat von J.T. Baker Chemical (Phillipsburg, NJ) bezogen. Eine Lösung von Streptokinase ((SK), von Sigma Chemical, St. Louis, MO), wurde frisch hergestellt durch Auflösen von 10000 IU (1 Phiole) vom lyophylisierten Pulver in 1 ml TBS. Dialyserohre (Molekulargewichtsschnitt 12000 bis 14000) wurden von Spectrum Medical Industries (Los Angeles, CA) erhalten und Sepharose CL-6B von Pharmacia LKB Biotechnology (Piscataway, NJ) bezogen. Hydrophile Polycarbonat- Membranen (Nuclepore Corp., Pleasanton, CA), hatten zylindrische Poren mit einen 3 µm-Durchmesser bei einem Dichte von 2 x 10&sup6;/cm² laut den Herstellerangaben.

Liposom-Bildung und Einkapselung der Streptokinase erfolgten wie folgt:

Die Arbeitsweisen zur Gewinnung von großen unilamellaren Lipid (large unilamellar lipid = LUV)-Vesikeln durch die Detergentienentfernungs-Methode sind gut beschrieben. Große unilamellare Vesikel (LUV werden für die Zwecke der hier durchgeführten Versuche folgendermaßen hergestellt. PC (10 mg) in 2 ml Chloroform/Methanol (1 : 1, V/V) in einem 10 ml-Pyrextestrohr werden mittels eines Stickstoffstroms evaporiert und über Nacht lyophilisiert. Der dünne Film aus getrocknetem PC am Boden des Rohres wird in 250 µl von 0,4 M OG in TBS unter Rühren und Erwänmen auf 37ºC während 2 Stunden aufgenommen. Nach der vollständigen Lösung vom PC werden 1,5 µg an (¹&sup4;C) PC (0,1Ci) zugegeben; diese Lösung von Lipid und Detergens wird als PC-OG-Lösung bezeichnet. Die restliche Darstellung von LESK wird in einem kalten Raum bei 4ºC durchgeführt. Zur Dialyse enthielten die Proben je ml: 50 µl PC-OG-Lösung, 450 µl an 0,4 M OG in TDS und 5000 U an SK in 500 µl TBS. Zur Herstellung der proteinfreien Blindproben (Blind- LUV) wurde TBS anstelle der SK-Lösung zugegeben. Die Mischung wurde gegen 1 Liter TBS während insgesamt 48 Stunden dialysiert, mit Dialysat-Wechseln nach 8 und 24 Stunden. Die dialysierte Probe (1 ml oder weniger) wurde mit 1 ml/Min. über Sepharose CL-6B (15 cm x 1 cm i.d., voräquilibriert in TBS) zum Abtrennen von freiem LESK von nicht eingekapselter SK gelfiltriert. Die Elution von LESK und SK aus der Kolonne wurde durch Absorptionsüberwachung (und Lichtstreuung) bei 280 nm (A&sub2;&sub8;&sub0;) nachgewiesen. In dem Zwischenkomvolumen eluierte Vesikel, typischerweise zwischen zwei 0,5 ml Fraktionen, wurden gepoolt und als LESK-Probe bestimmt. Diese Liposome wurden bei 4ºC gelagert und innerhalb von 48 Stunden verwendet. Die Rückgewinnung vom Phospholipid in den Vesikeln wurde als direkt proportional zu der Gewinnung von (¹&sup4;C)PC in den gepoolten Vesikelfraktionen (typischerweise 30%) angenommen.

Vesikelgröße:

Der COULTER - submikroskopische Teilchen-Analysator (Modell N&sub4;MD) wurde zur Ermittlung der Teilchengröße und Teilchengrößenverleilung von den Liposomen mittels Laserlichtstreuung eingesetzt. Die Meßprinzipien basierten auf der Theorie der Brownschen Molekularbewegung und photonenbezogenen Spektroskopie.

Untersuchungen zur SK-Aktivität und -Konzentration:

Die Aktivitäten und Konzentrationen der SK vor und nach der liposomalen Einkapselung wurden mittels der handelsüblichen Ausrüstungssätze und deren Anwendungen ermittelt (Aktivität: Helena Laboratories, Beaumont, TX; Konzentration: Bio-Rad, Richmond, CA). Standard-SK in lyophilisiertem Pulver wurde gebildet mittels normalem Salz und wies eine Gesamtaktivität von 40000 U/ml auf; eine serienmäßige Verdünnung mit TBS erfolgte zur Bildung einer Standard-Aktivitätskurve über den Bereich von 200 bis 10000 U/ml. Vor einem Versuch wurde die eingekapselte SK aus den Liposomen durch Zugabe von OG zur Bildung von einer Endkonzentration von 40 mM freigegeben; diese Konzentration an OG beeinflußte weder die Messung von der Aktivität noch von der Konzentration an SK.

AK-Adsorption an oder Durchdringung der Liposom-Membranen:

Zur Ermittlung der Verbindung von SK mit den Versikel-Membranen wurden 0,5 ml SK (Konzentration von 10000 U/ml) zu 0,5 ml an Blind-LUV zugegeben, während 4 Stunden bei 4ºC in kubiert und dann einer Gelfiltration wie oben beschrieben unterworfen. Im Anschluß an die Chromatographie wurde die Liposom-Fraktion auf die SK-Aktivität und Konzentration hin untersucht.

Gerinselbildung:

Alle Blutspender (n=16) waren gesunde, nicht rauchende männliche Probanden, standen unter keiner Medikation und hatten im Verlauf der letzten 12 Stunden gefastet. Ihr durchschnittliches Alter war 25 Jahre. Venöses Blut wurde aus den Armen der Spender in sterile Einmalspritzen aus Plastik abgezogen und zu einer Trinatriumzitrat- Lösung (1,1 ml, 3,8% (Gew./Vol.) Zitrat je 10 ml vom Vollblut) in silikonisierten Teströhrchen gegeben. Plättchenreiches Plasma (PRP) wurde durch Zentrifugieren des zitratversetzten Blutes bei 1000 upm (145 x g) während 10 Minuten in einer Beckmann AccuSpin-Zentrifuge (Modell ACSR-IM-3, Palo Alto, CA) gewonnen. Der obere Teil (etwa 2,8 ml) vom Überstehenden wurde entfernt und mit PRP bezeichnet. Der übrigbleibende Teil wurde mit 5000 upm (3400 x g) während weiterer 20 Minuten zum Erhalt von plättchenarmen Plasma (PPP) zentrifugiert. Der Plättchengehalt im PRP und PPP wurde zweimal mittels einer Blutkörperchen-Zählkammer unter Anwendung der Phasenkontrast-Mikroskopie-Methode, wie sie von Brecher und Cronkite beschrieben ist, untersucht. Die Anzahl der im PPP gezählten Plättchen ergab 16250 Plättchen ± 3230 Plättchen/mm³ (n=4; P < 0,05).
Hydrophile Nucleopor-Membranen mit einem 3 µm Porendurch messer wurden für den Porenverschluß eingesetzt. Deren spezielle Merkmale und deren Herstellung vor der Filtration wurden anderswo beschrieben. Zum Verschließen der Poren in der Membran wurden 4 ml an PRP bei Raumtemperatur in eine 30 ml-Plastikspritze plaziert. 82,5 µl an 0,125 M CaCl&sub2; (Sigma Chemical Co.) wurden pro ml an Plasma in der Spritze zugegeben und die Nullzeit unmittelbar aufgezeichnet. Die Spritze wurde mit der Hand leicht geschüttelt, um ein gutes Mischen von Ca&spplus;&spplus; mit dem Plasma zu erreichen. Eine konstante Fließrate von 1,15 ml/min. durch die Membran wurde mittels einer Sage-351 Infusionspumpe aufrechterhalten. Der Druckabfall (delta P) wurde als abhängige Größe mit einem Gould Stathan-Druckaufnehmegerät (Modell P23ID), das mit einem Gould DC-Verstärker/Filter (Modell 11-4113-01) verbunden war, gemessen und auf einem Registrierapparat aufgezeichnet. Der Filtriervorgang wurde unterbrochen, wenn delta P einen Wert von 16 kPA (120 mm Hg) erreichte; das verstopfte Filter wurde alsdann aus dem Filtergestell entfernt. Durch leichtes Saugen unter Verwendung einer Pasteur- Pipette wurde das gelähnliche Koagulat am Filtergestell vor dem Ausbau entfernt. Die verstopfte Membran wurde zweimal mit Salzlösung (0,9% (Gew./V.) NaCl) gewaschen und dann wieder für eine weitere Stufe vom Versuch in ein trockenes und sauberes Filtergestell eingebaut.

Filtrationen durch die verstopften Membranen:

SK oder LESK wurden zu 5 ml von PPP unter Erhalt einer Endaktivität von 250 U/ml zugegeben. Die Filtrationen von SK/PPP oder LESK/PPP durch die mit den gebundenen Thromben verstopften Membranen wurden wie oben dargelegt durchgeführt. Für Vergleichsfiltrationen wurden die verschlossenen Membranen auch mit PPP oder Blind-LUV/PPP durchströmt. Nachdem die verschlossenen Membranen mit PPP, Blind-LUV/PPP, SK/PPP oder LESK/PPP durchströmt worden waren, wurde die Morphologie der restlichen Gerinsel und der Membranen unter dem Mikroskop (Olympus Researeh Modell BHTU) untersucht.

Inkubation von SK und LESK:

Zur Untersuchung des Einflusses der Inkubation mit Plasmaproteinen auf die SK- Aktivität wurden äquivalente Aktivitäten von nicht eingekapselter SK und von LESK getrennt in silikonosierte Glasröhrchen mit 5 ml von derselben PPP-Herstellung injiziert. Die Inhalte in jedem Röhrchen wurden - vor der Inkubation bei 37ºC - während einer Minute in einem Hämatologiemischer (Fischer Scientific, Pittsburg, PA) sanft vermischt; die Röhrchen wurden danach dreimal in fünfminütigen Intervallen invertiert. Nach entweder 15 oder 30 Minuten wurden die Mischungen einer Filtration durch verstopfte Membranen wie früher beschrieben unterworfen.

Datenanalyse:

Alle statistischen Vergleiche wurden gemaß dem Student's-t-Test ausgewertet. Die statistische Signifikanz wurde lediglich akzeptiert, sofern die Wahrscheinlichkeit unter 0,05 lag. Soweit nicht anders vermerkt, sind die Ergebnisse als Mittelwerte ± SD (Standard deviation = normale Abweichung) wiedergegeben.

Ergebnisse:

Wirksamkeit der liposomalen Einkapselung:

Das von den Erfindern entwickelte Vorgehen ermöglichte die Einkapselung von 30% von der insgesamt zur Probe zugesetzten SK bereits zu Beginn des Prozesses (Tabelle I). Die Radioaktivitätsmessungen zeigten, daß etwa 1/3 vom ursprünglichen Anteil an PC den Liposomen zugeführt war (Tabelle I). Die Radioaktivitätsmessungen zeigten, daß etwa 1/3 vom ursprünglichen Anteil an PC den Liposomen zugeführt war (Tabelle I). Die Messungen der SK-Aktivität und Konzentration zeigten auch, daß nur eine geringe Menge von SK (etwa 2%) von der Oberfläche vom Blind-LUV absorbiert war oder diese durchdrungen hatte (Tabelle I). Demzufolge waren mehr als 90 bis 95% von der SK bei der LESK-Herstellung in die Vesikel eingekapselt worden.

Vesikel-Größe und Verteilung:

Die Analyse der Partikelgröße ergab, daß 82 (±3) % (n=5) der Vesikel in der Lösung einen Teilchendurchmesserwert von 178 (±40) nm (n=5) aufwiesen.

Druckabfall bei den Filtrationen:

Zeitabhängige Änderungen im Druck während der Filtration zeigten das Ausmaß, bis zu dem die Poren im Verlauf der Filtration von kalzifiziertem zitrathaltigen PRP verschlossen worden waren oder auf Grund der Filtration von SK/PPP oder LESK/PPP wieder geöffnet werden konnten. Die delta P-Werte, die nach einer 15 minütigen Filtration von PPP oder Blind-LUV/PPP durch verstopfte Membranen erhalten wurden, wurden als stationäre delta P-Werte betrachtet (Fig. 1-a). Die stationären delta P-Werte bei Filtrationen von Blind-LUV/PPP waren vergleichbar mit denen bei PPP (nämlich 4,9 ± 1,0 kPA (37,0 ± 7,7 mmHg (n=12)) gegenüber 4,7 ± 1,1 kPA (35,6 ± 8,6 mm Hg (n=12)). Im Gegensatz dazu wurde ein Null- oder als Basis dienender Druck ermittelt, wenn diese Lösungen durch nicht verstopfte Membranen mit derselben Fließrate wie im Falle der verstopften Membranen gefiltert wurden. Das Ergebnis zeigt deutlich, daß der Fließwiderstand auf der Anwesenheit der Thromben beruhte und nur wenig durch LUV beeinflußt wurde.
Lösungen von SK/PPP und LESK/PPP mit denselben SK-Aktivitäten wurden durch die verstopften Membranen abifitriert, um deren Gerinsel-Auflösungsvermögen zu vergleichen. Die fibrinlösende Wirkung von nicht eingekapselter SK und von LESK wurde durch Aufnahme der delta P-Werte als Funktion von der Zeit bei dem Filtrieren von einer Lösung von SK/PPP oder LESK/PPP durch die verstopfte Membran überwacht (Fig. 1-b). Bei den Filtrationen dieser Lösungen stieg delta P auf ein Maximum und nahm dann graduell bis auf den Grundliniendruck ab. Die Gerinselauflösungszeit (CDT=clot dissolving time) wurde als die Zeit zwischen dem Beginn der Filtration und der Zeit bei der Rückkehr von delta P zur Grundlinie festgelegt. Beim Fehlen einer Vorinkubation mit Plasma war der CDT-Wert von LESK/PPP (12,4 ± 1,7 Min (n=12)) geringfügig höher (P=0,05, siehe Fig. 2) als der von SK/PPP (10,7 ± 1,9 Min. (n=12)). Eine Reduzierung der fibrinlösenden Aktivität von sowohl nicht eingekapselter SK als auch LESK würde zu einer Erhöhung vom CDT-Wert führen; eine solche Abnahme in der SK-Aktivität wurde beobachtet, sofern SK und auch LESK mit PPP inkubiert worden waren (siehe den höheren CDT in Fig. 2). Nach einer Inkubation von 15 Minuten stieg der CDT-Wert von SK/PPP auf 15,5 ± 1,5 Min. (n=5; P=0,05), wohingegen der CDT-Wert von LESK/PPP weniger anstieg, und zwar auf 13,3 ± 0,8 Min. (n=5). Nach einer Inkubation von 30 Minuten war der CDT-Wert von SK/PPP beträchtlich größer als der von LESK/PPP, nämlich 24,1 ± 2,5 Min. (n=5) gegenüber 16,0 ± 1,3 Min. (n=5); P=0,05. Dieses Ergebnis zeigt an, daß nicht eingeschlossenes SK im Verlauf der Berührung mit Plasmaproteinen inaktiviert wird, wohingegen die eingeschlossene SK durch die Phospholipid- Doppelschicht stark geschützt wird.

Mikroskopische Prüfung:

Eine mikroskopische Untersuchung der verstopften Membranen im Anschluß an den Durchlauf von SK/PPP oder LESK/PPP zeigte, daß die Poren in der Membran völlig frei von den Spuren der Thrombenbildung waren, während diejenigen im Falle des Filterns von PPP oder Blind-LUV/PPP noch mit großen Fibrinmaschen oder Plättchenaggregaten verschlossene Poren zeigten. TABELLE I Recovery- Effizienz der liposomalen Einkapselung Werte vor der Einkapselung Werte nach der Gelfiltration (Mittel ± SD) Prozentsatz (Mittel ± SD) Phosphatidylcholin SK-Aktivität SK- Konzentration Anteil der SK, absorbiert an Blind-LUV a Phosphatidylcholin (Mol.-Gew. b Streptokinase (Mol.-Gew. * P < 0,05 im Vergleich zu den Werten vor der Einkapselung

Beispiel 2

Liposome wurden wie zuvor beschrieben hergestellt. Die ermittelte Einkapselungs- Effizienz von SK in Liposomen vom zwitterionischen Lipid 1-Palmitoyl-2-oleyl- Phosphatidylcholin betrug - bestimmt durch Messungen der Streptokinase-Aktivität und der Gesamtproteine - etwa 30%. Die außerhalb der Liposome befindliche Streptokinase wurde aus den LESK-Ansätzen durch Gelflitration mittels Sepharose CL-6B (Pharmacia) entfernt. Uber 92% der Streptokinase in der fertigen LESK-Suspension befanden sich innerhalb der Liposome.
Der durchgeführte Versuch belegte die Performanz der Liposomsuspensionen in vivo, unter Anwendung einer geringen Modifizierung vorn üblichen Hundetest für einen myokardialen Infarkt auf Grund eines Thrombusverschlusses. Bastardhunde beiderlei Geschlechts wurden mittels Natriumpentobarbital (30 mg/kg) intravenös anästhetisiert. Ein endotrachiales Rohr wurde eingebracht und die Tiere mit Raumluft unter Einsatz eines Respirators mit konstanten Volumen beatmet. Eine linksseitige Brustwanderöffnung wurde im vierten Zwischenrippenraum durchgeführt und das Herz freigelegt. Die linke herumgebogene Koronararterie wurde proximal zu der ersten stumpfen marginalen Abzweigung isoliert und der Strom der linken herumgebogenen Koronararterie mittels eines 20 mHz Impuls-Dopplers oder einer elektromagnetischen Fließprobe gemessen. Bine arterielle Thrombose wurde durch Injektion von 100 U Thrombin (Sigma) und 0,1 ml Vollblut in ein 5 bis 10 mm langes Segment der proximal und distal abgebundenen linken herumgebogenen Kotonararterie initiiert. Nach 10 Minuten wurde die proximale Ligatur freigegeben. Nach weiteren 5 Minuten wurde auch die distale Ligatur freigegeben. Bei einigen Versuchen waren nicht weniger als 3 Injektionen zur Bildung eines Thromenverschlusses notwendig (Tabelle II). Der Thrombus wurde während 30 Minuten bis zur Verabreichung der Streptokinase reifen gelassen. Nach Beendigung des Versuchs wurde die Arterie seziert und die Thrombenmasse gravimetrisch bestimmt.
Die thrombolytische Aktivität der liposomal eingekapselten Streptokinase wurde direkt mit der von freier Streptokinase verglichen. Die relativen Dosierungen von den beiden thrombolytischen Arzneimitteln waren identisch. Ein Initialbolus von 20000 U vor einer i.v.-Infusion von 2000 U/min. bis zur Wiederdurchblutung wurde beachtet. Ähnlich zu den berichteten Feststellungen im Falle der linken anterioren absteigenden Koronararterie betrug die Durchschnittszeit für die Wiederdurchblutung im Falle von Streptokinase allein etwa 78 ± 43 Minuten (mittlere ± SD vgl. Tabelle II). Der Wiederdurchfluß wurde belegt durch: (1) Rasterung der durch Ischämie induzierten elektrokardiographischen Änderungen, (2) Wiederherstellung des Fließens in der linken gebogenen Arterie und (3) das Nachlassen der Cyanose in der linken gebogenen Koronararterie. In starkem Kontrast zu den Werten bei freier Streptokinase reduzierte die liposomal eingekapselte Streptokinase die für die Thromben-Auflösung benötigte Zeit auf im Mittel 32 ± 28 Min. bei einigen raschen Wiederdurchblutungen von nur 10 Minuten. Unter der Annahme von normalen Verteilungen und einer äquivalenten Probendichte entspricht dies einem statistisch signifikanten Unterschied von P < 0,05. Es war nicht überraschend, daß die Wiederdurchblutungszeiten in jeder Gruppe mit der Anzahl der für die Bildung eines stabilen Verschlusses benötigten Thrombininjektionen in Wechselbeziehung zu stehen scheint.
Die liposomale Einkapselung vom Plasminogen-Aktivator erhöht deutlich die Wirksamkeit der Streptokinase bei diesem Hundemodell und erfordert geringere Gesamtdosierungen an eingekapseltem Material zur Wiederherstellung des Blutflusses. Bei diesen einleitenden, nicht optimierten Versuchen betrug die Gesamtmenge an freier Streptokinase im Mittel 170500 U gegenüber 81900 U im Falle von LESK. Darüber hinaus bestätigten die Größen der aus dem sezierten Koronarsegment isolierten Thrombenreste die beschleunigte Thrombenauflösung, obgleich die Daten unvollendet sind (vgl. Tabelle II). Die restlichen Gerinsel waren bei LESK-behandelten Tieren kleiner, auch wenn die Dosierungen und Wirkzeit bei LESK reduziert waren. Am wichtigsten ist, daß die Einkapselung von SK die für den Wiederdurchfluß benötigte Zeit um mehr als 50% verkürzte.
Der Mechanismus, aufgrund dessen die liposomale Einkapselung die Thrombolyse in vivo beschleunigt, ist nicht klar. Wie oben angemerkt, nehmen die Erfinder an, daß die Einhüllung der Streptokinase in Liposome sowohl die Inaktivierung durch Plasmaproteine herabsetzt (vgl. die in vitro-Versuche) und auch die SK-Initiierung systemischer Reaktionen verzögert sowie Depletion oder Inaktivierung der Schlüsselkomponenten vom fibrinlösenden System verhindert. So deuten z.B. gruppenseitige Computermodelle darauf hin, daß die gegenwärtigen klinischen Dosen die rasche Bildung eines Streptokinase-Plasminogen-Komplexes, die Depletion von für die Aktivierung verfügbarem freien Plasminogen und folglich niedrige Plasminspiegel verursachen. Gemäß dem Modell trägt die langsame Freigabe von Streptokinase aus den Liposomen zur Herabsetzung der Konzentration am Komplex unter Erhöhung von der an Plasmin bei. Dieses verschiedene Profil der fibrinlösenden Komponenten könnte den Auflösungsmechanismus von der Aktivierung des gerinselgebundenen Plasminogens prinzipiell auf das mit einer erhöhten Rolle vom zirkulierenden Plasmin verschieben. Andere Möglichkeiten sind, daß die Liposome die Freigabe von SK an oder in den Blutpfropfen durch Konzentrieren nahe beim Pfropfen und/oder durch bevorzugte SK- Freigabe falls die Vesikel einen Fließdruck beim Passieren von Thrombus erleiden. Tabelle III zeigt die Abnahme an der Menge der benötigten Streptokinase, sofern die Streptokinase in die Liposome eingekapselt ist.
Schließlich ist es wahrscheinlich, daß die Resultate von diesen Vorversuchen nicht die größtmögliche Reduzierung der Wiederdurchflußzeit enthalten. So besitzen tPA und Urokinase eine größere Bindungsaffinität für Fibrin als SK und ebenso auch ein höheres Vermögen zur Aktivierung von gerinselgebundenem Plasminogen. Folglich können tPA- und Urokinase-Aktivatoren eine raschere Thrombolyse nach sich ziehen, besonders sofern sie in Liposomen vor einer Inaktivierung geschützt sind. TABELLE II In Vivo- Thrombolyse- Versuche mit freier und eingekapselter Streptokinase Hunde-Nr Anzahl der Thrombininjektionen Wiederdurchblutungszeit (Min.) Gewicht vom restlichen Thrombus (mg) Freie Streptokinase Liposomal eingekapselte Streptokinase TABELLE III In Vivo- Thrombolyse- Versuche mit freier und eingekapselter Streptokinase Hunde- Nr + Dosierung * (Einheiten) Freie Streptokinase Liposomal eingekapselte Streptokinase * Verabreichung der Dosen wie folgt: 2000 Einheiten als Bolus gegeben; 2000 Einheiten/ Min. infudiert bis zum Erreichen der Wiederdurchblutung + Die mittlere und Standard-Abweichung bei 5 SK- behandelten Hunden war 18,8 ± 4,0 kg und bie 5 LESK- behandelten Hunden 20,9 ± 5,2 kg.

Claims

1. Arzneimittel umfassend:

eine Vielzahl von zur parenteralen Verabreichung bei Säugern geeigneten Mikrokapseln,

die jeweils bestehen:

aus einem einen Plasminogenaktivator enthaltenden Innenteil, der in ein semipermeables oder abbaubares, biokompatibles, großes einschichtiges Vesikel (LUV = large unilamellar vesicle) zur Freigabe vom Plasminogenaktivator im Thrombusbereich innerhalb eines kardiovaskulären Systems von einem Säuger eingekapselt ist, wobei dieses die Zeit, die für die Wiederdurchblutung eines Blutgefäßes nach der Verabreichung eines Mittels mit einem äquivalenten Anteil an freiem Plasminogenaktivator bei einem Säuger benötigt wird, zu reduzieren vermag.

2. Arzneimittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Wiederdurchblutungszeit um mindestens 5 % reduziert wird.

3. Arzneimittel gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Liposom ein Phospholipid umfaßt.

4. Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet durch ein flüssiges System, das zur parenteralen Verabreichung bei Säugern geeignet ist und in dem die Mikrokapseln suspendiert sind.

5. Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Plasminogenaktivator α-Streptokinase umfaßt.

6. Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der P]asminogenaktivator α-Urokinase umfaßt.

7. Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Plasminogenaktivator α-tPA umfaßt.

8. Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Plasminogenaktivator Streptokinase und Urokinase umfaßt.

9. Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Plasminogenaktivator Urokinase Lind tPA umfaßt.

10. Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Plasminogenaktivator Streptokinase und tPA umfaßt.

11. Verwendung von Mikrokapseln gemäß Anspruch 1 zur Herstellung von einem Arzneimittel für den Einsatz bei der Behandlung von einem thrombotischen Zustand bei Säugern, das zur Reduzierung der Zeit, die für die Wiederdurchblutung von einem Blutgefäß nach der Verabreichung eines Mittels mit einem äquivalenten Anteil an freiem Plasminogenaktivator bei einem Säuger benötigt wird, imstande ist.

12. Verwendung der Mikrokapseln gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Wiederdurchblutungszeit um mindestens 5 % herabgesetzt wird.

13. Verwendung von Mikrokapseln gemäß Anspruch 1 zur Herstellung von einem Arzneimittel für den Einsatz bei der Behandlung von einem thrombotischen Zustand bei Säugern, das zur Reduzierung des Anteiles an Plasminogenaktivator, der für die Wiederherstellung des Blutdurchtlusses im Vergleich zu der vorbestimmten Mindeststandardmenge an Plasminogenaktivator in freier Form benötigt wird, imstande ist.