DE3887875T2

DE3887875T2 - Verfahren zur vorbeugung einer von blutplättchen abhängigen gefässthrombose.

Info

Publication number: DE3887875T2
Application number: DE3887875T
Authority: DE
Inventors: Stephen Hanson; Laurence Harker
Original assignee: Scripps Clinic and Research Foundation
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1987-11-25
Filing date: 1988-11-23
Publication date: 1994-08-18
Anticipated expiration: 2008-11-24
Also published as: WO1989005148A1; EP0343241B1; DE3887875D1; CA1335075C; EP0343241A4; JPH04501848A; US4929602A; AU599280B2; ATE101522T1; JP2758953B2; EP0343241A1; AU3286489A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Peptids enthaltend ein Halogen-Methylketon, um die Blutplättchenaggregation in Risikopatienten für arterielle Thrombose zu hemmen
Ein Thrombus ist ein Aggregat aus Elementen, die in dem lebenden Herz oder den Gefäßen aus Bestandteilen des Bluts in Antwort auf einen thrombogenen Stimulus gebildet werden.
Thrombosenbildung, der Vorgang der Thrombusbildung, kann durch bestimmte, aber üblicherweise interagierende Mechanismen hervorgerufen werden. Der erste Vorgang, Blutplättchenaggregation, erfolgt als ein Ergebnis der Aktivierung von Blutplättchen durch einen thrombogenen Stimulus, wie eine Verletzung der Gefäßwand. Der zweite Vorgang, Fibrinbildung, ist das Ergebnis einer Aktivierung des Kaskadensystems der Blutgerinnung, als deren letzter Schritt üblicherweise die Umwandlung von Fibrinogen in Fibrin durch Thrombin, d. h., die Fibrinbildung, angesehen wird. Der Zweck der Fibrinbildung scheint darin zu liegen, die aggregierten Blutplättchen zu stabilisieren, um so den blutstillenden Pfropfen zu stabilisieren.
Von der Größenordnung oder dem Grad der Beteiligung von Blutplättchenaggregation und Fibrinbildung ist mittlerweile bekannt, daß sie als ein Ergebnis von hämodynamischen (Blutfluß-) Faktoren variieren. Zum Beispiel erfolgt venöse Thrombusbildung unter Bedingungen niedriger Flußrate, und es ist gezeigt worden, daß sie einen kombinierten und äquivalenten Verbrauch an Blutplättchen und Elementen des Kaskadensystems der Blutgerinnung einbezieht. Harker et al., N. Eng. J. Med., 287 : 999-1005 (1972). Als ein Ergebnis sind venöse Thromben üblicherweise unstrukturierte Massen, die sich aus relativ wenigen aggregierten Blutplättchen, einer großen Menge von dazwischen verteiltem Fibrin und einigen roten Blutkörperchen, daher der Name "roter Thrombus", zusammensetzen. Siehe Freiman, in "Hemostasis and Thrombosis: Basic Principles and Clinical Practice", Coleman et al. (Herausgeber) 2. Auflage, Philadelphia, J.B. Lippincott Co., Seiten 1123-35 (1987). Diese Beobachtungen legen nahe, daß die Fibrinbildung die vorherrschende Rolle bei venöser Thrombenentwicklung spielt.
Im Gegensatz dazu erfolgt arterielle Thrombusbildung unter Bedingungen hoher Flußrate, und es ist gezeigt worden, daß sie zumindest in ihren frühen Stadien einen selektiven Verbrauch von Blutplättchen umfaßt. Harker et al., N. Eng. J. Med., 287 : 999-1005 (1972). Zum Beispiel haben Tieruntersuchungen gezeigt, daß die prothetische Oberfläche von arteriovenösen Plastikkanülen Thromben erzeugt, die sich vollständig aus Blutplättchen zusammensetzen, wobei der thrombogene Vorgang ohne nachweisbare Beteiligung des Kaskadensystems der Blutgerinnung abläuft. Evans et al., J. Exp. Med., 128 : 877-894 (1968) und Harker et al., J. Clin. Invest., 64 : 559-569 (1979). Vermutlich ist die Fibrinbildung bei der arteriellen Thrombusbildung nur minimal, weil gerinnungsförderndes Material, wie Thrombin, durch den raschen arteriellen Fluß von der thrombogenen Stelle weggeschwemmt wird, bevor die Blutgerinnung voll aktiviert wird. Als ein Ergebnis sind arterielle Thromben üblicherweise entweder vollständig aus Blutplättchen (ein "weißer Thrombus") zusammengesetzt, oder sie sind eine komplexe Struktur, die sich aus einer Grund- oder Primärmasse aus Blutplättchen und einer sekundären Masse aus Blutplättchen und Fibrin zusammensetzt, die die Primärmasse überlagert und sich stromabwärts darüber ausdehnt. Siehe Freiman, siehe oben. In jedem Fall ist die Blutplättchenaggregation an der Stelle einer Verletzung der vorherrschende Mechanismus der arteriellen Thrombenentwicklung. Deshalb kann die arterielle Thrombenentwicklung zumindest in ihren frühen Stadien als von Blutplättchen abhängig gekennzeichnet werden. Harker et al., In "Vascular Diseases: Current Research an Clinical Application", Strandess et al., (Herausgeber) Orlando, Grune & Stratton, Seiten 271-283 (1987).
Anbetracht des Vorgenannten ist es nicht überraschend, daß betreffend die therapeutische Wirksamkeit von Mitteln, die entweder die Blutplättchenaggregation oder Fibrinbildung beeinflussen, gefunden worden ist, daß sie von der Art der zu behandelnden Thrombusbildung abhängig ist.
Zum Beispiel sind Mittel wie Aspirin oder Dipyridamol, die die Blutplättchenfunktion hemmen, d. h., die Fähigkeit der Blutplättchen zum Aggregieren hemmen, wirksam in der Verhinderung von arterieller Thrombusbildung, aber sie sind nicht wirksam in der Behandlung venöser Thrombenbildung vom Stauungstyp. Umgekehrt ist von Mitteln wie Heparin und Hirudin, die die Fähigkeit von Thrombin, Fibrin zu bilden, hemmen, gefunden worden, daß sie therapeutisch wirksam sind gegen venöse Thrombusbildung vom Stauungstyp aber nicht gegen arterielle Thrombusbildung. Harker et al., Thromb. Diath. Haemorrh., 31 : 188-203 (1974).
Somit lehrt der Stand der Technik, bei der wirksamen Behandlung von arterieller Thrombusbildung die Regulation der Blutplättchenaggregation hervorzuheben und nicht der Fibrinbildung. Dies bedeutet, daß die therapeutisch wirksame Hemmung der Blutplättchen-abhängigen arteriellen Thrombusbildung das Verabreichen von Mitteln verlangt, die die Fähigkeit der Blutplättchen zur Aggregation hemmen (Inhibitoren der Blutplättchenfunktion) und nicht Mittel zu verwenden, die die Fibrinbildung per se hemmen (Antikoagulanzien). Idealerweise sollte ein klinisch einsetzbarer Blutplättchen-modifizierender Wirkstoff nicht toxisch sein, anhaltende Wirkung und ein gutes antithrombotisches Potential besitzen, ohne ein übermäßiges Risiko einer abnormalen Blutung zu provozieren. Keines der gegenwärtig erhältlichen klinischen Mittel erfüllt sämtliche dieser Anforderungen. Aspirin, Sulfinpyrazon, Dipyridamol, Suloctidil und Ticlopidin sind Mittel, die bis heute in klinischen Versuchen untersucht worden sind.
Eine der Schwierigkeiten bei der Entwicklung von Mitteln, die die Blutplättchen-abhängige arterielle Thrombusbildung hemmen können, besteht darin, daß die Blutplättchen durch eine Vielzahl von Stimuli, einschließlich Adenosindiphosphat (ADP), Kollagen, Thrombin, Thromboxan A&sub2;, Epinephrin, Serotonin, Vasopressin, Antigen-Antikörper-Komplexe, Plasmin, Viren, Bakterien, Endotoxin und Krebszellen, zum Aggregieren angeregt werden können. Gemäß dem Stand der Technik ist es wahrscheinlich, daß in vivo die lokale Konzentration eines jeden individuellen Stimulationsmittels vermutlich nicht hoch genug ist, um die Aggregation zu verursachen. Als ein Ergebnis ist es wahrscheinlich, daß in vivo mehrere Stimuli auf die Blutplättchen gleichzeitig mit synergistischen Wirkungen einwirken, so daß sehr niedrige Konzentrationen der einzelnen Stimuli ausreichen können, um die Aggregation zu induzieren. Siehe Packham, Thromb. Haemostas., 50 : 610-619 (1983).
Somit legt der Stand der Technik nahe, daß das Verhindern eines speziellen, die Blutplättchenaggregation induzierenden Stimulus möglicherweise kein wirksamer Ansatz ist, um die Blutplättchen-abhängige arterielle Thrombusbildung zu hemmen. Mehrere Untersuchungen stützen diese Ansicht, wobei die relevantesten Studien die sind, die die humorale Aktivität von Thrombin untersucht haben, d. h., seine Fähigkeit, die Blutplättchenaktivierung zu stimulieren im Gegensatz zu seiner enzymatischen Aktivität. Zum Beispiel ist von Heparin und Hirudin, allseits bekannten Antikoagulanzien, gezeigt worden, daß sie die Fähigkeit von Thrombin, die Blutplättchenaggregation in vitro zu stimulieren, hemmen können, Markwardt et al., Haemostasis., 13 : 227-233 (1983), und Hoffman et al., Haemostasis., 14 : 164-169 (1984). Jedoch ist weder Heparin noch Hirudin bei dem Verhindern der arteriellen Thrombusbildung in vivo wirksam, was nahelegt, daß einer oder mehrere Stimuli außer Thrombin für das Induzieren der arteriellen Blutplättchenaggregation in vivo verantwortlich sind.
Von besonderem Interesse für die vorliegende Erfindung ist das Tripeptidderivat D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-arginyl-chlormethylketon (D-Phe-Pro-Arg-CH&sub2;Cl oder PPACK). Kettner et al., Thromb. Res., 14 : 969-973 (1979) und US-PS 4,318,904, 9. März 1982, Shaw et al. PPACK hemmt irreversibel die enzymatische Aktivität von Thrombin durch Alkylieren eines Histidinrestes nahe seinem aktiven Zentrum mit einer Gesamtgeschwindigkeitskonstante (1,1 · 10&sup7; l/mol/sec), die ähnlich zu derjenigen zwischen dem Heparin-Antithrombin-III-Komplex und Thrombin ist.
Von PPACK konnte ähnlich wie von Heparin und Hirudin gezeigt werden, daß es die Fähigkeit von Thrombin, Plasmafibrinogen in Fibrin umzuwandeln, wodurch die Bildung eines roten Thrombus in vivo erfolgen kann, hemmt. Siehe Kettner et al., Thromb. Res., 14 : 969-973 (1979). Jedoch ist anzumerken, daß die extrem hohe lokale Konzentration an Thrombin, die durch Injektion, wie in jeder der zitierten Untersuchungen beschrieben, verursacht wird, vermutlich nicht während einem natürlichen thrombotischen Vorgang auftritt. Weiterhin erlauben die Methoden dieser Untersuchungen nicht die Darstellung der relativen Beiträge der enzymatischen und humoralen Aktivitäten von Thrombin bei der Entstehung von Thromben unter den aufgeführten experimentellen Bedingungen. Somit verwendeten diese Untersuchungen kein Modell, das relevant wäre, Schlüsse über die Einflüsse von PPACK auf die arterielle Thrombusbildung zu ziehen.
Von der Fähigkeit des PPACK, die Fibrinbildung zu verhindern, ist gezeigt worden, daß sie in menschlichem Plasma und in dem Blut von Labortieren rasch abnimmt. Zum Beispiel berichteten Collen et al., J. Lab. Clin. Med., 99 : 76-83 (1982), daß die Halbwertszeit der Fähigkeit von PPACK, die Fibrinbildung in Hasen zu hemmen, ungefähr 2,9 min beträgt. Siehe auch Hauptman et al., Thromb. Res., 20 : 347-351 (1980).
Wegen der relativ kurzen Halbwertszeit der Fähigkeit von PPACK, die Fibrinbildung in Hasenplasma zu hemmen, schloß Collen et al., siehe oben, daß das Aufrechterhalten der gerinnungshemmenden Wirkung von PPACK über einen längeren Zeitraum dessen kontinuierliche Infusion verlangen würde. Weiterhin führte die kurze Halbwertszeit von PPACK in Plasma Collen et al. zu dem Vorschlag, daß PPACK bei einigen Notfallsituationen besonders nützlich sein könnte, wo verstreute, intravaskuläre Blutgerinnungen zu erwarten sind. Ihre Überlegungen waren, daß eine Bolusinjektion von PPACK die enzymatische Aktivität von Thrombin rasch hemmen würde aber nicht zu einer verlängerten, blutgerinnungshemmenden Wirkung führen würde, da seine Fähigkeit, die Fibrinbildung zu hemmen, rasch abnehmen würde.
Markwardt, Ann N.Y. Acad. Sci., 485 : 204-214 (1986) hat berichtet, daß die relativ kurze Halbwertszeit von PPACK auf seiner Fähigkeit beruht, stabile kovalente Bindungen nicht nur mit Thrombin einzugehen sondern auch mit anderen Bestandteilen aus Blut und Gewebe, die Amino- oder Thiolgruppen enthalten. Nach Markwardt macht diese Eigenschaft PPACK ungeeignet zur in vivo-Verwendung als Antikoagulans. Siehe auch Hauptman et al., Thromb. Res., 20 : 347-351 (1980).
Für Beschreibungen der Verwendung von PPACK als ein Heparinähnliches Antikoagulans in vitro siehe Mohler et al., Thromb. Haemostas., 56 : 160-164 (1986) und Bode et al., Vox Sang., 51: 192-196 (1986). Tiefenbrunn et al., Circulation, 73 : 1291-1299 (1986); Ku, J. Car. Pharm., 8 : 29-36 (1986); Ofosu et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 485 : 41-55 (1986); und Schaeffer et al., J. Lab. Clin. Med., 107 : 488-497 (1986).
Ähnlich wie von Heparin und Hirudin ist auch von PPACK gezeigt worden, daß es die Fähigkeit von Thrombin, die Blutplättchenaktivierung in vitro zu stimulieren, hemmt. Siehe Harmon et al., J. Bio. Chem., 261 : 15928-33 (1986), Harmon et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 485 : 387-395 (1986) und Markwardt et al., Haemostasis 13 : 228-233 (1983). Jedoch ist jede dieser Untersuchungen unter Verwendung von Citrat-behandelten Blutplättchen in einem künstlichen Medium durchgeführt worden. Nach Packham, Thromb. Haemostas., 50 : 610-619 (1983) unterscheiden sich die Antworten von humanen Blutplättchen in einem solchen Medium von denen in einem Medium, in dem eine physiologische Konzentration von ionisiertem Calcium anwesend ist. Somit sind nach Packham viele Untersuchungen über Inhibitoren der Blutplättchenfunktion tatsächlich Untersuchungen gewesen über die Hemmung einer künstlichen Stimulation des Arachidonat-Stoffwechselwegs, verursacht durch engen Blutplättchenkontakt in einem Medium mit einer niedrigen Konzentration an ionisiertem Calcium. Das Ziehen von Schlußfolgerungen aus den Untersuchungen über die Fähigkeit von PPACK, die Blutplättchenaggregation in vitro zu hemmen, ist daher schwierig.
Bis heute gibt es keine Untersuchung über den Einfluß von PPACK auf die Blutplättchenaggregation in vivo oder über seine Fähigkeit, die arterielle Thrombusbildung zu hemmen. Dies ist nicht überraschend angesichts der oben diskutierten Lehren, das Mittel wie Heparin, das nicht nur die enzymatische Aktivität von Thrombin hemmt sondern auch dessen Fähigkeit, die Blutplättchenaggregation zu stimulieren, nicht wirksam sind in der Verhinderung der arteriellen Thrombusbildung.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Peptids der Formel (1) zur Herstellung eines Medikaments zum Hemmen der Blutplättchen-abhängigen, arteriellen Thrombusbildung in einem Patienten.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Peptids der Formel (1) zur Herstellung eines Medikaments zum Hemmen einer erneuten posttherapeutischen Arterienverengung in einem Patienten, indem dem Patienten eine therapeutisch wirksame Menge eines Peptids der Formel (1) verabreicht wird, der Patient einer therapeutischen Behandlung zum Vergrößern des Kanaldurchmessers für den Blutfluß in einer verengten Arterie unterzogen wird, um eine behandelte Arterie zu erzeugen, und arterielles Blut des Patienten durch die behandelte Arterie geleitet wird.
Auch betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Peptids der Formel (1) zur Herstellung eines Medikaments zum Hemmen der Blutplättchenablagerung auf einer prothetischen Oberfläche in einem Patienten, indem dem Patienten eine therapeutisch wirksame Menge eines Peptids der Formel (1) verabreicht wird und arterielles Blut des Patienten entlang einer prothetischen Oberfläche geleitet wird.
In den Abbildungen, die einen Teil dieser Offenbarung darstellen, zeigt:
Fig. 1 die Formel (1), eine Formel, die ein Halogen-Methylketon-enthaltendes Peptid darstellt, worin X ein Halogenatom darstellt, vorzugsweise Chlor oder Brom, und Z ein Wasserstoff oder einen C&sub1;-C&sub6;-Acylrest darstellt, vorzugsweise Wasserstoff. Das Symbol (D-) zeigt an, daß der Phenylalaninrest rechtsdrehend ist, der Prolin- und Argininrest hat linksdrehende Konfiguration.
Fig. 2 zeigt die Formel (2), die Formel für PPACK, ein bevorzugtes Halogen-Methylketon-enthaltendes Peptid der Formel (1), worin X Chlor und Z Wasserstoff darstellt.
Fig. 3 enthält 2 Abbildungen, die eine Untersuchung darstellen, in der die Fähigkeit von PPACK gegenüber Heparin, die Blutplättchenablagerung auf arteriellen Transplantaten in Pavianen zu hemmen, verglichen wurde.
In diesen Untersuchungen wurden autologe Blutplättchen mit ¹¹¹In-Oxid markiert. Dann wurden 5 cm-Segmente eines Dacrongewirks als Gefäßtransplantat mit einem Innendurchmesser von 4 mm (ein Geschenk von U.S. Catheter, Inc.) als Verlängerungsstücke in einen dauerhaft nach außen verlegten femoralen arteriovenösen Silicongummishunt eingefügt. Der Blutfluß durch den Shunt wurde unter Verwendung einer Dichtungsmanschette nach Doppler (cuff Doppler transducer) als Messwertsonde und mittleren 175 ± 16 ml/min gemessen. ¹¹¹In-Blutplättchenablagerungen auf den Gefäßtransplantaten wurden gemessen mit Hilfe der Gammadarstellung per Kamera (Dyna Camera, Picker Corporation) gekoppelt mit einem Bildanalysesystem (Medical Date Systems A&sub3;, Medtronic). Die Ergebnisse wurden ausgedrückt als gesamte abgelagerte Blutplättchen, indem die abgelagerte Blutplättchen-Radioaktivität durch die zirkulierende Blutradioaktivität pro ml dividiert wurde und Multiplizieren mit den Counts pro ml der zirkulierenden Blutplättchen. Die Anzahl der Bestimmungen ist in Klammern angegeben, und die vertikalen Balken bedeuten Mittelwerte ± eine Standardabweichung.
Abbildung A zeigt, daß in unbehandelten Kontrolltieren ¹¹¹In- Blutplättchen rasch auf Dacron-Gefäßtransplantatsegmenten abgelagert werden, wobei ein Plateauwert von ungefähr 10¹&sup0; Blutplättchen nach 50 min erreicht wird. Die Transplantate verstopfen nach 1,2 h ± 0,2. Kontinuierliche intravenöse infusionen mit PPACK mit einer Rate von 100 nMol/kg/min für 60 min, angegeben durch den horizontalen schraffierten Balken, hemmten deutlich die Blutplättchenablagerung und verhinderten das Verstopfen des Transplantats. Die Wiederaufnahme der Blutplättchen-abhängigen arteriellen Thrombusbildung erfolgt 30 min nach Unterbrechen der PPACK-Verabreichung, wie durch den Anstieg der Blutplättchenablagerung ungefähr nach der 90 min- Position auf der Abszisse angezeigt wird.
Abbildung B zeigt, daß das Verabreichen von 100 Einheiten (U) an Heparin pro Kilogramm (kg) Körpergewicht an den Pavian (eine Dosis, die eine dreifache Verlängerung der Gerinnungszeit von Gesamtblut erzeugte) die Blutplättchenablagerung auf dem Transplantat innerhalb der 60 min Expositionsspanne nicht signifikant reduzierte. Abbildung B zeigt auch, daß das Verabreichen von 1000 U/kg an den Pavian die Blutplättchenablagerungen auf den Transplantaten nur teilweise hemmte.
Fig. 4 enthält zwei Abbildungen, die die Fähigkeit von PPACK zeigen, die erneute Arterienverengung (¹¹¹In-Blutplättchenablagerung) an einer Endarteriektomiestelle der Carotis zu hemmen. Die vertikalen Balken geben Mittelwerte ± eine Standardabweichung an. In unbehandelten Kontrolluntersuchungen ( ) ist in Abbildung A die akute Blutplättchenablagerung gezeigt, die innerhalb der 90 min, folgend auf den Beginn der arteriellen Zirkulation durch die behandelte Arterie, erfolgte. Da die in Abbildung A gezeigten Werte die Abschwächung durch das Gewebe unter Verwendung eines implantierten Standards berücksichtigt, sind die Ergebnisse als Anzahl abgelagerter Blutplättchen ausgedrückt.
In Abbildung A sind auch die Ergebnisse gezeigt, die erhalten wurden, als PPACK (0) intravenös mit einer Rate von 100 nMol/ kg/min für 1 Std., unmittelbar vor dem Durchleiten des arteriellen Blutes durch die behandelte Arterie, verabreicht wurde.
In Abbildung B ist die ¹¹¹In-Blutplättchenablagerung an der Endarteriektomiestelle als das Verhältnis Endarteriektomie/ Blut dargestellt, erhalten wie in Beispiel 1 beschrieben. Aus Abbildung B ist ersichtlich, daß es unter den Bedingungen der Kontroll- ( ) und PPACK-Behandlung (0) zu minimaler fortschreitender Akkumulation von ¹¹¹In-Blutplättchenaktivität kam.
Fig. 5 zeigt die Fähigkeit von PPACK (0) im Vergleich zu Heparin ( ), den Volumenverlust in einem Hämodialysegerät, als einem Ergebnis der Blutplättchenablagerung auf der prothetischen Oberfläche des Dialysegeräts, zu hemmen. Die vertikalen Balken geben die Mittelwerte ± eine Standardabweichung an.
Fig. 6 zeigt ein Endarteriektomieverfahren an der Carotis. Die normale Carotisarterie wird geklammert und dann distal durchtrennt. Das proximale Segment wird über gekrümmte Pinzetten nach außen gestülpt durch Anwenden eines Gegenzugs. Haltenähte werden angebracht, und die Endarteriektomie wird über einen Abschnitt von 1 cm unter Verwendung von mikrochirurgischen Techniken durchgeführt. Das Gefäß wird in seine normale Anordnung zurückgebracht, und eine End-End-Anastomose wird durchgeführt. Ein Zwischenstück von normaler Intima ist zwischen der Endarteriektomiestelle und der Anastomose vorhanden.
Fig. 7 zeigt zwei Abbildungen, die die Fähigkeit von PPACK darstellen, die Blutplättchenablagerung an Endarteriektomiestellen der Carotis zu hemmen. In unbehandelten Tieren nimmt die Blutplättchenablagerung an Endarteriektomiestellen der Carotis rasch zu, wobei ein Plateau nach 60 bis 90 min schnell erreicht wird. In Tieren, die mit 100 nMol/kg einer intravenösen Infusion mit PPACK für 60 min behandelt wurden, ist die Blutplättchenakkumulation stark verringert. Dieser Effekt ist in der unmittelbaren post-operativen Phase (links) und über 3 Tage sichtbar, wie aus dem Verhältnis Blutplättchen-Endarteriektomie/Blut (rechts) ersichtlich. Die vertikalen Balken zeigen die Varianz um den Mittelwert als + eine Standardabweichung an. Der Vergleich zwischen den Kontroll- und Behandlungsgruppen wurde anhand eines zweifachen Student's-t-Tests durchgeführt.
Fig. 8 zeigt wie Fig. 5 die Fähigkeit von PPACK im Vergleich zu Heparin, den Volumenverlust und die ¹¹¹In-Blutplättchenablagerung innerhalb eines Faserbündels (Hämodialysegerät) zu hemmen, als eine unabhängige Messung der Thrombusbildung in dem Dialysegerät nach jedem Gebrauch. Heparin-behandelte Tiere hatten signifikante und zunehmende Verluste an DFV und umgekehrte Zunahmen an Blutplättchenakkumulation zu allen getesteten Zeiten in den Faserbündeln. Im Gegensatz dazu konservierte die PPACK-Behandlung das DFV mit einer deutlichen Verringerung der Blutplättchenakkumulation in dem Dialysegerät.
"Angioplastie" betrifft die chirurgische Rekonstruktion von verengten (stenösen) arteriellen Blutgefäßen. "Perkutane transluminale Angioplastie" ist die Erweiterung eines arteriellen Blutgefäßes mit Hilfe eines Ballonkatheters, der durch die Haut in das ausgewählte Gefäß eingeführt und dann durch das Lumen des Gefäßes zu der Stelle der stenotischen Läsion geführt wird, wo der Ballon aufgeblasen wird, um die Ablagerung an die Arterienwand zu pressen, wodurch der Durchflußkanal in der kranken Arterie wieder hergestellt wird.
"Antikoagulans" bezieht sich auf ein Mittel, das die Blutgerinnung unterbricht und dadurch die Fibrinbildung hemmt.
"Arterielle Läsion" bezieht sich auf eine thrombogene Oberfläche, der arterielles Blut während der Zirkulation ausgesetzt wird. Typische arterielle Läsionen sind de-endothelialisierte Bereiche einer arteriellen Gefäßwand und nicht-endothelialisierte prothetische Gegenstände.
"Arterieller prothetischer Gegenstand" bezieht sich auf eine biologische oder synthetische Gefäßprothese, die in das Gefäßsystem so eingefügt wird, daß sie arterielles Blut erhält und transportiert.
"Blutgerinnung" bezieht sich auf den sequenziellen Ablauf, bei dem die zahlreichen Blutgerinnungsfaktoren des Bluts miteinander wechselwirken, was zu der Bildung von Fibrin führt.
"Endarteriektomie" bezieht sich auf das Entfernen von verdickter atheromatöser Tunica Intima einer Arterie. Eine "Gasendarteriektomie" bezieht sich auf eine Endarteriektomie, die unter Verwendung von Kohlendioxid unter hohem Druck durchgeführt wird, um Plaqueablagerungen aus den koronaren Blutgefäßen bei der Behandlung von Atherosklerose zu entfernen. Eine "Laserendarteriektomie" bezieht sich auf eine Endarteriektomie, die unter Verwendung eines Katheter-geführten Lasers durchgeführt wird, um atherosklerotische Plaques zu entfernen.
"Formel-(1)-Peptid" bedeutet in seinen verschiedenen grammatikalischen Formen ein Peptid, dargestellt durch Formel (1) wie in Fig. 1 gezeigt, und das Additionsprodukt davon mit Halogenwasserstoff.
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verbindungen für ein Halogen-Methylketon-haltiges Peptid, dargestellt durch die Formel (1) wie in Fig. 1 gezeigt, worin Z Wasserstoff oder eine C&sub1;-C&sub6;-Acylgruppe darstellt; X ist ein Halogenatom; und die Additionsprodukte davon mit Halogenwasserstoffsäure.
Ein bevorzugtes Halogen-Methylketon-enthaltendes Peptid wird durch Formel (2) dargestellt, wie in Fig. 2 gezeigt, worin Z Wasserstoff und X Chlor darstellt, und das hierin als PPACK bezeichnet wird.
Halogenatome umfassen vorzugsweise Chlor, Brom oder Jod.
Die Synthese eines Halogen-Methylketon-enthaltenden Peptids, wie durch Formel (1) dargestellt, und seine Verwendung zum Hemmen der enzymatischen Aktivität von Thrombin sind in US-PS 4,318,904, 9. März 1982, Shaw et al., beschrieben.
Die neuen Verwendungen eines durch die Formel (1) dargestellten Peptids basieren auf dem Befund, daß das Peptid die Blutplättchenablagerung aufarteriellen Läsionen signifikant hemmt und dadurch das Risiko einer Blutplättchen-abhängigen arteriellen Thrombusentstehung verringert.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Peptids der Formel (1) zur Herstellung eines Medikaments zum Hemmen der Blutplättchen-abhängigen arteriellen Thrombusbildung in einem Patienten.
Der Ausdruck "therapeutisch wirksame Menge", wenn in Bezug auf das Peptid der Formel (1) verwendet, bezieht sich auf eine Menge an Peptid, die ausreicht, um die Thrombinzeit des Probanden um mindestens das Zweifache, vorzugsweise mindestens ungefähr fünffach und ganz besonders bevorzugt mindestens ungefähr zehnfach zu erhöhen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Peptid der Formel (1) in einer Menge verabreicht, die ausreicht, um eine Peptidkonzentration in dem Plasma von mindestens ungefähr 0,2 Mikrogramm pro Milliliter (ug/ml), vorzugsweise von mindestens ungefähr 1 ug/ml und ganz besonders bevorzugt von mindestens ungefähr 10 ug/ml zu erzielen. Eine übliche Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge des Peptids nach Formel (1) erzielt eine Peptidkonzentration in dem Plasma in dem Bereich von 0,2 ug/ml bis 10 ug/ml, vorzugsweise 0,5 ug/ml bis 5 ug/ml und ganz besonders bevorzugt 1 ug/ml bis 2 ug/ml. Das heißt, zirkulierendes Blut mit der obigen Plasmakonzentration an Peptid der Formel (1) ermöglicht die Hemmung der Blutplättchenabhängigen arteriellen Thrombusbildung.
Verfahren zum Bestimmen der Konzentration des Peptids der Formel (1) in dem Plasma sind in dem Stand der Technik bekannt, ein bevorzugtes Verfahren stellt das von Collen et al., J. Lab. Clin. Med., 99 : 76-83 (1982) beschriebene Verfahren dar.
Verfahren zur Diagnose des Vorkommens einer Blutplättchen-abhängigen arteriellen Thrombose in einem Patienten (menschlicher Proband) sind aus dem Stand der Technik bekannt. Solche Verfahren umfassen Kontrastangiographie, Arteriographie, computerisiertes Axial-Tomographie-(CAT)-Scanning, in vivo-Darstellung mit Hilfe radioaktiv markierter Blutplättchen und Lokalisierung mit Hilfe zweidimensionaler Dopplergeräte. Spezielle Krankheiten, bei denen Blutplättchen-abhängige arterielle Thrombosen eine Rolle spielen, sind aus dem Stand der Technik bekannt und umfassen cerebrovaskuläre Atherosklerosekrankheiten, wie sie als Schlaganfall oder vorübergehende cerebrale Ischämie in Erscheinung tritt, koronare Atherosklerosekrankheit, wie sie in Form von Herzischämie in Erscheinung tritt, instabile Angina oder akuter Myocardinfarkt und periphäre arterielle Verschlußkrankheit, wie sie in Form von distaler Ischämie in Erscheinung tritt.
Patienten, die einer Behandlung der Blutplättchen-abhängigen arteriellen Thrombose bedürfen, umfassen auch solche, die einer medizinischen (therapeutischen) Behandlung unterzogen werden, um den Blutfluß durch eine verengte Arterie zu verbessern. Zum Beispiel leiden viele Patienten an einer erneuten, post-therapeutischen Stenose aufgrund von Blutplättchen-abhängiger Thrombusbildung, induziert durch eine arterielle Läsion, aufgedeckt oder erzeugt während einer therapeutischen Behandlung, die zum Entfernen eines Verschlußgebildes, wie einem arteriellen Geschwür oder einem atherosklerotischen Plaque oder arteriellen Thrombus, durchgeführt wird.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Peptids der Formel (1) zur Herstellung eines Medikaments zum Hemmen der erneuten post-therapeutischen arteriellen Stenose in einem Patienten. Das Medikament kann in einem Verfahren eingesetzt werden, das umfaßt:
a) Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines Peptids der Formel (1), vorzugsweise PPACK, an den Patienten.
b) Unterziehen des Patienten einer medizinischen Behandlung zum Steigern des Kanaldurchmessers für den Blutfluß in einer verengten Arterie und dadurch Herstellen einer behandelten Arterie. Medizinische Verfahren zum Steigern des Kanaldurchmessers für den Blutfluß in einer verengten Arterie sind aus dem Stand der Technik bekannt und umfassen chirurgische Verfahren (manuelle oder operative Heilverfahren, durchgeführt durch Manipulation oder Eingriff mit einem Instrument oder einer Gerätschaft) und Arzneimitteltherapien. Zum Beispiel umfassen chirurgische Verfahren, die zum Verbessern der Blutdurchflußkapazität einer verengten Arterie durchgeführt werden, Endarteriektomie, insbesondere Gas- oder Laser-Endarteriektomie, Angioplastie und Gefäßprotheseeinsetzung.
Medizinische Verfahren zum Steigern der Blutdurchflußkapazität einer verengten Arterie umfassen auch das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines thrombolytischen Mittels an den Patienten. Thrombolytische Mittel und deren Verwendung sind ebenfalls aus dem Stand der Technik bekannt. Kommerziell erhältliche thrombolytische Mittel umfassen Streptokinase, Urokinase und Gewebsplasminogenaktivator (tPA).
c) Arterielles Blut des Patienten wird durch die behandelte Arterie geleitet. Bei bevorzugten Verfahren zum Behandeln der erneuten post-therapeutischen Stenose wird das Verabreichen des Peptids der Formel (1) nach (a) durchgeführt bevor das zirkulierende arterielle Blut der behandelten Arterie nach (c) ausgesetzt wird. Vorzugsweise wird (c) im Anschluß an (a) durchgeführt aber während die Plasmakonzentration des nach (a) verabreichten Peptids der Formel (1) mindestens ungefähr 0,2 ug/ml, vorzugsweise mindestens ungefähr 1 ug/ml und ganz besonders bevorzugt mindestens ungefähr 10 ug/ml beträgt. Bei einer anderen Ausführungsform wird (c) innerhalb von ungefähr 90 min, vorzugsweise innerhalb von ungefähr 15 min und ganz besonders bevorzugt innerhalb von ungefähr 5 min nach der Durchführung von (a) durchgeführt. Jedoch werden auch Verfahren umfaßt, in denen
(a) und (c) im wesentlichen parallel (gleichzeitig) durchgeführt werden und worin (c) vor (a) ausgeführt wird.
Patienten, die einer Behandlung der arteriellen Thrombusentstehung bedürfen umfassen solche Probanden, deren zirkulierendes arterielles Blut einer thrombogenen Oberfläche ausgesetzt ist. Üblicherweise erfolgt das Aussetzen der arteriellen Zirkulation einer thrombogenen Oberfläche in Patienten, in denen ein arterieller prothetischer Gegenstand operativ eingesetzt worden ist. Somit betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Peptids der Formel (1) zur Herstellung eines Medikaments zum Hemmen der Blutplättchenablagerung auf einer arteriellen prothetischen Oberfläche in einem Patienten. Das Medikament kann in einem Verfahren verwendet werden, welches umfaßt:
a) Verabreichen einer therapeutischen Menge eines Peptids der Formel (1), vorzugsweise PPACK, an den Patienten.
b) Arterielles Blut des Patienten wird an der prothetischen Oberfläche entlanggeleitet.
Arterielle prothetische Gegenstände mit Oberflächen, die dem arteriellen Blut ausgesetzt sind, wenn sie in den Blutkreislauf des Patienten eingesetzt werden, sind aus dem Stand der Technik bekannt. Siehe "Biologic and Synthetic Vascular Prostheses", J. Stanley, Herausgeber, Grune and Stratton, N.Y. (1982). Beispielhafte biologische Arterienprothesen umfassen autogene Arterientransplantate, insbesondere autogene Arterientransplantate aus der Wadenvene, Dialdehyd-Stärke-tannisierte Rinderheterotransplantate und humane Nabelvenentransplantate. Synthetische arterielle Prothesen sind auch aus dem Stand der Technik bekannt und umfassen Dacron-Transplantate, direkte Polytetrafluorethylen-Transplantate, wie beschrieben in US-PS 3,962,153, und hydrophobe Polymer-ausgekleidete Transplantate, wie beschrieben in der US-PS 4,687,482.
Beispielhafte arterielle prothetische Oberflächen sind Arterienröhren (arterial stens) und A-V-Shunts. A-V-Shunts sind üblicherweise Abschnitte von nicht endothelialisierten Röhren, die üblicherweise aus einem Polymermaterial hergestellt sind, die dazu verwendet werden, arterielles Blut in eine Vene, entweder direkt oder zuerst durch ein ex vivo-therapeutisches Gerät, zu transportieren. Beispielhafte ex vivo-therapeutische Gerätschaften umfassen cardiopulmonare Hilfsgerätschaften. Die Verwendung von ex vivo-therapeutischen Gerätschaften ist aus dem Stand der Technik bekannt.
In einem bevorzugten Verfahren zum Hemmen der Blutplättchenablagerung auf einer prothetischen Oberfläche erfolgt das Verabreichen des Peptids der Formel (1) nach Schritt (a) vor dem Entlangleiten des arteriellen Bluts des Patienten an der prothetischen Oberfläche nach (b). Vorzugsweise wird (b) anschließend an (a) durchgeführt während die Plasmakonzentration eines nach (a) verabreichten Peptids mindestens ungefähr 0,2 ug/ml, vorzugsweise mindestens ungefähr 1 ug/ml und ganz besonders bevorzugt mindestens ungefähr 10 ug/ml beträgt. Bei einer anderen Ausführungsform wird (b) innerhalb von ungefähr 90 min, vorzugsweise innerhalb von ungefähr 15 min und ganz besonders bevorzugt innerhalb von ungefähr 5 min nach der Durchführung von (a) ausgeführt. Jedoch werden auch Verfahren umfaßt, worin (a) und (b) im wesentlichen gleichzeitig durchgeführt werden und Verfahren worin (b) vor (a) durchgeführt wird.
Ein Peptid der Formel (1) oder ein Additionsprodukt davon mit Halogenwasserstoff wird üblicherweise als pharmazeutische Zusammensetzung in der Form einer Lösung oder Suspension verabreicht, jedoch, wie aus dem Stand der Technik bekannt, können Peptide auch als Tabletten, Dragees, Kapseln, Formulierungen mit verzögerter Freisetzung oder Pulver zur therapeutischen Verabreichung formuliert werden. Auf jeden Fall enthält die verabreichte Zusammensetzung ungefähr 0,10% bis ungefähr 99% eines Peptids der Formel (1), vorzugsweise 10% bis 90% und ganz besonders bevorzugt 25% bis 75%.
Die Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung, die als aktiven Bestandteil Peptide enthält, ist aus dem Stand der Technik bekannt. Typischerweise werden solche Zusammensetzungen als Mittel zur Injektion, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen, hergestellt, jedoch können auch feste Formen hergestellt werden, die zum Lösen oder Suspendieren in Flüssigkeit vor der Injektion geeignet sind. Die Präparation kann auch emulgiert werden. Der aktive therapeutische Bestandteil wird oft mit anorganischen und/oder organischen Hilfsstoffen, die mit dem aktiven Bestandteil (dem Peptid) pharmazeutisch zulässig und verträglich sind, gemischt. Geeignete Hilfsstoffe sind z. B. Wasser, Saline, Dextrose, Glycerin, Ethanol oder ähnliches, und Kombinationen davon. Falls gewünscht kann die Zusammensetzung weiterhin geringere Mengen an Zusatzstoffen, wie Benetzungs- oder Emulgiermittel, pH-puffernde Mittel, die die Wirksamkeit des aktiven Bestandteils erhöhen, enthalten.
Eine therapeutische Zusammensetzung, die zur Durchführung der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, kann ein Peptid der Formel (1) in der therapeutischen Zusammensetzung als ein neutralisiertes pharmazeutisch zulässiges Salz enthalten. Pharmazeutisch zulässige Salze umfassen die Säureadditionssalze (die sich mit der freien Aminogruppe des Polypeptids oder Antikörpermoleküls bilden) und die mit anorganischen Säuren, wie z. B. Salz- oder Phosphorsäuren, oder organischen Säuren, wie Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure und Mandelsäure, hergestellt werden. Salze mit der freien Carboxylgruppe können auch mit anorganischen Basen, wie z. B. Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium- oder Eisenhydroxiden, und organischen Basen, wie Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminethanol, Histidin und Procain, erhalten werden.
Die, das therapeutische Peptid enthaltende, Zusammensetzung wird üblicherweise intravenös verabreicht, wie z. B. durch Injektion einer Einheitsdosis. Der Begriff "Einheitsdosis" betrifft im Zusammenhang mit einer therapeutischen Zusammensetzung, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, körperlich verschiedene Einheiten, die als einzelne Dosierung für Menschen geeignet ist, wobei jede Einheit eine vorab bestimmte Menge an aktivem Material enthält, die so berechnet wurde, daß die gewünschten therapeutischen Wirkungen erhalten werden, in Assoziation mit dem benötigten Hilfsstoff.
Die Zusammensetzung wird auf eine Weise verabreicht, die mit der Dosisformulierung vereinbar ist, und in einer therapeutisch wirksamen Menge. Die zu verabreichende Menge hängt ab von dem zu behandelnden Probanden, der Kapazität des hämostatischen Blutsystems des Patienten, den aktiven Bestandteil zu verwenden, dem Ausmaß der gewünschten Hemmung der Blutplättchenaggregation. Genaue Mengen des aktiven Bestandteils, der zum Verabreichen benötigt wird, hängt von der Einschätzung des behandelnden Arztes und den Eigentümlichkeiten eines jeden Individuums ab. Jedoch liegen geeignete Dosisbereiche in der Größenordnung von 1 bis mehrere 100 nMol des Peptids der Formel (1) pro kg Körpergewicht pro Minute und hängen von dem Weg der Verabreichung ab. Ein gemäß der vorliegenden Erfindung hergestelltes Medikament kann zum Herstellen einer thromboresistenten Gefäßprothese verwendet werden, die ein verlängertes röhrenförmiges Segment umfaßt, das einen im wesentlichen nicht nachgiebigen Hohlkörperteil besitzt, welches an beiden Enden offen ist. Der Hohlkörperteil besitzt eine luminale (mit zirkulierendem Blut in Kontakt stehende) Oberfläche, die einen beschränkten Durchflußkanal begrenzt. Ein Peptid der Formel (1) ist an der luminalen Oberfläche entfernbar angebracht.
"Entfernbar angebracht" bedeutet, daß ein Peptid der Formel (1) an der luminalen Oberfläche der Prothese so angebracht ist, daß es bei Kontakt mit durch den beschränkten Durchflußkanal zirkulierendem Blut in das Plasma übertreten kann. Das entfernbare Anbringen wird anhand bekannter Verfahren ermöglicht, einschließlich der Ablagerung durch Adsorption einer festen oder flüssigen Form des Peptids der Formel (1) auf der luminalen Oberfläche. Wenn eine im wesentlichen reine Form (mindestens ungefähr 99% rein) eines Peptids an der Oberfläche angebracht ist, wird sich dieses rasch nach Kontakt mit dem zirkulierenden Blut lösen, um eine lokale Peptidkonzentration an der luminalen Oberfläche bereitzustellen, die ungefähr der Löslichkeit des Peptids im Plasma entspricht.
Bei bevorzugten Ausführungsformen ist ein entfernbar an der luminalen Oberfläche des prothetischen Gegenstands angebrachtes Peptid der Formel (1) als Teil einer Formulierung mit verzögerter Freisetzung vorhanden. Eine typische Formulierung mit verzögerter Freisetzung umfaßt ein Peptid der Formel (1) in Kombination mit einem pharmazeutisch zulässigen biologisch abbaubaren Hilfsstoff. Pharmazeutisch zulässige, biologisch abbaubare Hilfsstoffe, die zum Einsatz in der Formulierung mit verzögerter Freisetzung geeignet sind, sind aus dem Stand der Technik bekannt und umfassen Polymere (z. B. Polyethylenglykol) und Polyaminosäuren (z. B. Polyglycin). Wenn eine Formulierung mit verzögerter Freisetzung, enthaltend ein Peptid der Formel (1), entfernbar an der luminalen Oberfläche angebracht ist, wird die lokale Konzentration eines Peptids in dem Blut (d. h., die Peptidkonzentration an der Grenzfläche zwischen Blut/luminaler Oberfläche) proportional zu der Geschwindigkeit der Auflösung des Hilfsstoffs sein. Während das Verhältnis von Peptid zu Hilfsstoff, wie aus dem Stand der Technik bekannt, von der Wahl des Hilfsstoffs und den Blutdurchflußbedingungen durch den prothetischen Durchflußkanal abhängt, können therapeutisch wirksame Mengen eines Peptids der Formel (1) dem Blut, das mit der luminalen Oberfläche in Berührung kommt, für einen Zeitraum von Stunden bis Tagen bereitgestellt werden, wenn eine Formulierung mit verzögerter Freisetzung verwendet wird.
Die erfindungsgemäße Gefäßprothese ist in ihrer bevorzugten Ausführungsform im wesentlichen nicht nachgiebig. Der Ausdruck "nicht nachgiebig", wie hierin verwendet, bedeutet, daß sich der innere Durchmesser weniger als 10% zwischen Systole und Diastole unter normalen arteriellen Drucken (weniger als 250 mmHg) ausdehnt. Die äußere Oberfläche der Gefäßprothese erlaubt das Anhaften von Gewebe bei der Implantation in einen Menschen oder andere Säuger, wie es für gegenwärtig gewerblich erhältliche Prothesen üblich ist.
Das röhrenförmige Segment der Gefäßprothese kann aus Materialien hergestellt werden, die die benötigte Stärke, Haltbarkeit und Vernähbarkeit besitzen. Gewerblich erhältliche Materialien, die zur Herstellung der Prothesen oder Transplantate geeignet sind, umfassen einen Polyester wie Dacron (C.R. Bard, Inc., Billerica, Mass.) und ein Polyfluorcarbon wie Teflon (Gore-Tex) (W.L. Gore, Flagstaff, Ariz.).
Bei bevorzugten Ausführungsformen setzt sich die luminale Oberfläche aus Polymeren zusammen, die eine relativ glatte, unpolare und hydrophobe Oberfläche erzeugen. Solche Materialien und deren Verwendung bei der Herstellung eines Teils einer luminalen Oberfläche sind in US-PS 4,687,482, Hanson, beschrieben.
Eine erfindungsgemäße thromboresistente Gefäßprothese wird durch ein Verfahren hergestellt, das ein entfernbares Anbringen eines Peptids der Formel (1) auf der luminalen Oberfläche der Prothese umfaßt. Somit stellt das entfernbare Anbringen eines Peptids der Formel (1) auf der luminalen Oberfläche eines prothetischen Gefäßgegenstands ein Verfahren zum Verbessern der Thromboresistenz des Gegenstands dar.

Beispiele

Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung erläutern aber nicht beschränken.

1. In vivo-Hemmung der Blutplättchenablagerung auf einem synthetischen arteriellen Prothesegegenstand

Um das Maß der akuten arteriellen Thrombusbildung in vivo auf eine Weise zu bestimmen, die frei ist von nicht kontrollierbaren Variablen, wurde ein Primatenmodell der Thrombusbildung an einem Gefäßtransplantat verwendet. Paviane wurden für diese Untersuchungen ausgewählt, da in ihnen zu Menschen ähnliche thrombotische Vorgänge abzulaufen scheinen. Das Ausmaß der akuten Thrombusbildung wurde in Echtzeit gemessen durch Darstellung der autologen ¹¹¹Indium-markierten Blutplättchenablagerung auf Segmenten aus kleinen Dacron-Gefäßtransplantaten mit Hilfe einer Szintillationskamera, wie beschrieben in Hanson et al., Arterio, 5 : 595-603 (1985).
Kurz beschrieben, ein chronisch arteriovenöser Shunt wurde chirurgisch zwischen die femorale Arterienvene (A-V-Shunt) eines normalen, 10 bis 12 kg schweren männlichen Pavians (Papio anubis) implantiert. Das permanente Shunt-System bestand aus zwei 25 cm langen Silicongummiröhren mit einem inneren Durchmesser (i.d.) von 3 mm (Dow Corning Corp., Midland, MI), verbunden mit 13- und 15-Gauge-Teflon-Gefäßendstücken (Lifemed, Venitron Corp., Compton, CA). Weiterhin waren die zwei Silicongummi-Längsstücke mit die Wunde abdeckenden Dacron-Dichtungsmanschetten (Dupont, E.I. de Nemours and Co., Wilmington, DE) an den Austrittsstellen in der Haut verbunden. Der Blutdurchfluß wurde hergestellt durch Verbinden der zwei Shunt-Segmente aus Siliconkautschuk mit einer Teflonröhre (2,8 mm i.d.) mit stumpfen Enden. Bei allen Untersuchungen wurden die Dacron-Gefäßtransplantate anschließend operativ mit dem Tier verbunden, indem sie zwischen den Segmenten des permanenten A-V-Shunts aus Siliconkautschuk angebracht wurden.
Synthetische vaskuläre Modelprothesen wurden hergestellt zum Verwenden in dem A-V-Shunt-System, indem ein 10 cm langes ungekräuseltes Dacrongewirk als Transplantatmaterial (starkes äußeres Velour (Savage external velour), mittlere Porosität von 2000 bis 2200 ml/H&sub2;O/min bei 120 mmHg, 4,0 mm i.D.) für den Austritt von Blut auffolgende Weise undurchlässig gemacht wurde.
Zuerst wurde ein 4,0 mm Teflondraht, der mit Hilfe einer milden Seifenlösung, dann mit Ethanol und schließlich durch Abspülen mit sterilisiertem, destilliertem Wasser sorgfältig gereinigt worden war, durch das Transplantat eingeführt. Das Transplantat wurde dann äußerlich mit einer 5 · 10 cm-Folie aus Parafilm umhüllt und in ein 10 cm langes "aufschrumpfbares" Teflonrohr mit 6,3 mm i.D. (Small Parts Inc., Miami, FL) eingebracht.
Das Teflonrohr, enthaltend das Transplantatsegment, wurde langsam über einer niedrigen Bunsenflamme erwärmt, bis eine Schrumpfung auf ungefähr 5,3 mm statt gefunden hatte, was zu einer Kompression des Parafilms auf die äußeren Faserzwischenräume führte, ohne die luminale Transplantatoberfläche zu modifizieren. Die Silicongummiröhre, 10 cm · 4,0 mm i.D., wurde auf den Teflondraht übertragen und mit beiden Enden des Transplantatsegments mit Hilfe eines Silicongummiklebers für medizinische Zwecke, Silicontyp A verbunden. Nachdem das Polymer für 24 Stunden gehärtet worden war, wurde der Teflondraht sorgfältig aus dem Röhrenlumen herausgezogen. Dieses Verfahren erzeugte undurchlässige Transplantate, die in eine lineare Geometrie gezwungen wurden, und die einen inneren Durchmesser von 4,0 mm besaßen. Der erhaltene isodiametrische Durchflußkanal war in seinem Übergang von der Silicongummi- zu der Transplantatoberfläche glatt ohne Fehler aufgrund des Kupplungsverfahrens. Das Transplantat wurde mit dem Shunt-System in dem Pavian mit Hilfe von Teflonverbindungsstücken mit stumpfen Enden verbunden.
Autologe Blutplättchen des Pavians wurden mit ¹¹¹In-Oxin gemäß den folgenden Verfahren markiert. Gesamtblut (100 ml) wurde direkt in Plastiktüten (TA-3, Fenwal Labs, Deerfield, IL), enthaltend 20 ml Säure-Citrat-Dextrose-Antikoagulans (NIH Formel A), gesammelt. Das Blut wurde in den Tüten bei 300 g für 10 min zentrifugiert. Der blutplättchenreiche Plasmaüberstand (PRP) wurde dann in eine zweite Tasche überführt, und der pH wurde durch Zusatz von 0,15 M Citronensäure (0,1 ml/10 ml PRP) auf 6,5 eingestellt. Die rote Blutzellfraktion wurde in das Spendersäugetier zurückgegeben. Die Blutplättchen wurden durch Zentrifugation des PRP bei 13000 g für 15 min in ein Pellet überführt. Der blutplättchenarme Plasmaüberstand (PPP) wurde vollständig dekantiert und verworfen.
Zum Entfernen von restlichen Plasmaproteinen wurde die das Blutplättchenpellet enthaltende Tüte einmal sorgfältig gewaschen, indem mit 30 ml einer Citrat-Dextrose nach Ringer (RCD, pH 6,5) überschichtet wurde, welche dann dekantiert und verworfen wurde. Das Pellet wurde vorsichtig in 5,0 ml RCD resuspendiert und für 30 min mit 500 bis 700 uCi ¹¹¹In-Oxin (Amersham Corp., Arlington, Heights, IL) inkubiert. Kontaminierende rote Blutkörperchen wurden durch eine abschließende langsame Zentrifugation bei 200 g für 5 min entfernt.
Die Effizienz der Markierung wurde bestimmt indem 200 ul des markierten Blutkörperchenkonzentrats mit 5,0 ml RCD verdünnt wurden, und vergleichen der Aktivität in 5 ml der verdünnten Blutplättchensuspension mit der Aktivität in 0,5 ml zellfreiem Überstand, der durch Zentrifugation bei 3000 g für 30 min erhalten wurde. Ein abgemessenes Volumen an markierter Blutplättchensuspension, enthaltend ungefähr 13% nicht-plättchengebundenes Isotop, wurde dann direkt in das Empfängersäugetier nach der Herstellung eines 100 ul Standards eingespritzt. Weitere Waschverfahren, um nicht-plättchengebundenes Isotop zu entfernen, wurden als nicht wünschenswert angesehen, da sie eine in vitro-Zellschädigung verursachen könnten.
Die ¹¹¹In-Aktivität von zirkulierenden Blutplättchen wurde aus 4 ml Blutproben bestimmt, die vor und nach der Transplantatanbringung entnommen wurden, und die in 2 mg/ml (Ethylendinitrilo)-Tetraacetat (EDTA) gesammelt wurden. 1 ml einer jeden Probe wurde für das Blutplättchenauszählen verwendet, und in 1,0 ml wurde die ¹¹¹In-Aktivität des Gesamtbluts ausgezählt.
Die verbleibenden 2 ml wurden bei 3000 g für 30 min zentrifugiert, und 1,0 ml des Überstands (PPP) wurde für die ¹¹¹In- Aktivität im Plasma ausgezählt. Alle Blut- und Plasmaproben wurden mit Hilfe eines Gammaspektrometers (Nuclear Chicago, Chicago, IL) ausgezählt. Die Auszählung der Blutplättchen wurde mit Gesamtblut durchgeführt unter Verwendung eines elektronischen Blutplättchenzählers (Clay Adams UF-100, Parsippany, NJ).
Das Darstellen der beiden Gammaphotonenpeaks von ¹¹¹In (172 keV und 247 keV) mit Hilfe der Szintillationskamera hat im allgemeinen eine Hochenergiekollimation erforderlich gemacht, um das Verschwimmen des Bildes zu vermeiden, trotz einer verminderten räumlichen und Empfindlichkeitsauflösung. Da die Blutplättchen-spezifische Aktivität in den vorliegenden Untersuchungen kein limitierender Faktor darstellte, konnte ein hochempfindlicher &sup9;&sup9;Tc-Kollimator mit guter Auflösung verwendet werden, indem nur der niederenergetische Peak von ¹¹¹In (172 keV-Peak und mit einem 5%-Energiefenster) dargestellt wurde. Darstellungen der Dacron-Transplantate, einschließlich der proximalen und distalen Silicongummisegmente, wurden mit einer Picker DC 4/11 Dyna-Szintillationskamera (Picker Corp., Northford, CT) erhalten und gespeichert in und analysiert mit einem Medical Data System SIMUL-Computer (Medtronic, Ann Arbor, MI), der an die Kamera gekoppelt war. Dieses System erlaubte das gleichzeitige Erhalten und die Analyse von Daten in einem 64 · 64-Wortmodus und wurde verwendet, um die in Fig. 3 gezeigten Daten zu erzeugen. Unmittelbar vor der Darstellung der Transplantatsegmente ex vivo wurden 2 min-Darstellungen der 200 ul-Probe des Blutplättchenkonzentrats (Injektionsstandard) und des Silicongummiröhrchens mit 4,0 mm i.D., gefüllt mit autologem Blut und mit dem gleichen luminalen Volumen wie das Transplantatsegment (Blutstandard), benötigt.
Sämtliche Standards und Röhren wurden in eine präzise, in Plexiglas eingearbeitete Vertiefung gebracht, um eine lineare Geometrie beizubehalten, die ungefähr 1 cm von der Oberfläche des Kollimators angeordnet wurde. Die Aktivitäten der Standards und der 10 cm Transplantatsegmente wurden in der gleichen 3,1 cm · 12,5 cm-Region von Interesse (10 · 40 Pixel) gezählt und mit üblicher Software zur Bildanalyse bestimmt. Von dem Zeitpunkt der Anbringung des Transplantats wurden Darstellungen kontinuierlich benötigt mit einer Datenabspeicherung in 2 min-Intervallen. Abgelagerte ¹¹¹In-Blutplättchenaktivität wurde berechnet, indem von sämtlichen Darstellungen der dynamischen Untersuchungen die Blutstandardaktivität abgezogen wurde.
Die Transplantate wurden angebracht und folgend auf die Injektion einer einzigen Präparation von ¹¹¹in-Blutplättchen sequenziell über mehrere Tage dargestellt. Da die zirkulierende ¹¹¹In-Blutplättchenaktivität kontinuierlich durch normale physiologische Mechanismen und akut durch serielles Transplantatanbringen verloren ging, wurden die Messungen der Blutplättchenakkumulation als ein Verhältnis Transplantat/Blut ausgedrückt, wobei das Verhältnis definiert war als abgelagerte Transplantataktivität dividiert durch die Blutplättchenaktivität des Gesamtbluts (zirkulierend) in dem Transplantatlumen, gemessen zu Beginn einer jeden Auswertung. Diese Art der Messung wurde ausgewählt, da sie unabhängig ist von der Größe des Säugers, der Menge des injizierten Isotops oder dem Ausmaß, zu dem das Isotop zerfallen ist, Ritchie et al., Am. J. Cardiol., 47 : 882 (1981); Callow et al., Ann. Surg, 191 : 362 (1980). Das Transplantat/Blut-Verhältnis hängt jedoch ab von dem Zeitpunkt oder der Abfolge der Beobachtungen, als ein Ergebnis der vorkommenden Änderungen der Blutplättchenfunktion wegen Alterung in der Zirkulation oder dem wiederholten Aussetzen der thrombogenen Oberflächen.
Zum Bestimmen des Transplantat/Blut-Verhältnisses wurde die Aktivität des Bluts in dem Transplantatlumen (1,26 ml) durch zwei verschiedene Verfahren bestimmt. Zuerst wurde es direkt nach Darstellung des Blutstandards mit 1,57 ml Blutvolumen berechnet. In dem zweiten Verfahren wurde die zu Beginn eines jeden Experiments pro ml Blut vorhandene Aktivität berechnet, indem der Injektionsstandard vor jedem Experiment dargestellt wurde, Multiplizieren dieses Werts mit den CPM pro ml an Gesamtblut, das zum Zeitpunkt des Experiments entnommen wurde (wie unter Verwendung eines Gammazählers zu einem späteren Zeitpunkt t&sub1; bestimmt), und Dividieren durch die Aktivität des Injektionsstandards (auch in dem Gammazähler bei t&sub1; gemessen). Sämtliche Blutproben und Standards wurden gleichzeitig am Ende einer jeden Serie von Erhebungen gezählt. Bei allen Berechnungen beziehen sich die Radioaktivitätswerte nur auf die Blutplättchenaktivität, wobei die Gesamtblut- und Standardwerte um die Fraktion des nicht-Blutplättchenisotops korrigiert worden sind.
Die Gesamte Blutplättchenablagerung (markierte + nicht-markierte Zellen) wurde ermittelt durch Multiplizieren des Transplantat/Blut-Verhältnisses mit dem Faktor: Transplantat- Blutvolumen (1,26 ml) · Blutplättchenkonzentration/ml des Gesamtbluts. Diese Berechnung berücksichtigte die Annahme, daß die markierten und unmarkierten Blutplättchenpopulationen hinsichtlich der Ablagerung auf dem Transplantat zu allen Zeitpunkten äquivalent waren. Die Werte für die gesamte Blutplättchenablagerung auf den Gefäßtransplantaten, wie durch die obige Methode bestimmt, sind in Fig. 3 gezeigt.
In unbehandelten Kontrolltieren erreichte die Blutplättchenablagerung auf den Gefäßtransplantaten einen Plateauwert von 8,5 · 10&sup9; Blutplättchen nach 60 min (Fig. 3), und die Transplantate verstopften nach 1,2 ± 0,2 Stunden. Weiterhin wurden, wie in Tabelle 1 gezeigt, erhöhte Plasmaspiegel der Blutplättchen-spezifischen α-Körperchenproteine, des Blutplättchenfaktors 4 (PF4) und β-Thromboglobulins (βTG) und des Fibrinpeptids A (FPA), dem Thrombinspaltungsprodukt von Fibrinogen, während der Thrombusbildung in diesen Kontrolluntersuchungen beobachtet. Tabelle 1 Einflüsse von PPACK auf die Bildung von Thromben bei Gefäßtransplantaten Basiswerte Prätransplantat Transplantat PPACK-behandelt Blutplättchenzahl abgelagerte Plasma
¹ Blutplättchen, elektronisch gezählt im Gesamtblut (J.T. Baker, Model 810 Analysator, Allentown, PA), waren in der Zirkulation erniedrigt aufgrund der Blutplättchenbildung während der Thrombusbildung im Gefäßtransplantat
² Plasma PF4 und B-TG wurden mit Hilfe eines Radioimmunoassays der Blutproben, gesammelt und verarbeitet wie von Hanson et al., Arterio., 5 : 595-603 (1985) beschrieben, bestimmt. Die Ermittlung dieser Blutplättchen-spezifischen Proteine in Plasma zeigte die Freisetzung von solchen Blutplättchen an, die zur Thrombusbildung verwendet wurden.
³ FPA-Spiegel, ebenfalls mit Hilfe eines Radioimmunoassay bestimmt, Hanson et al., siehe oben, waren ebenfalls erhöht und stellen ein Thrombinspaltungsprodukt von Fibrinogen dar, welche während der Thrombusbildung in dem Transplantatthrombus erfolgt.
Herkömmliche Dosen an Heparin (100 Einheiten/kg, das verabreicht wurde bevor das arterielle Blut dem Transplantat ausgesetzt wurde) hatte keinen Einfluß auf die Blutplättchenablagerung auf dem Transplantat (Fig. 3B; p> 0,5), obwohl eine zehnfache Steigerung der Heparindosis teilweise wirksam war (Fig. 3B). Es sollte auch angemerkt werden, daß weder Aspirin (32,5 mg/ kg/Tag, die 2 Stunden vor der Transplantatanbringung oral verabreicht wurden) noch Aspirin kombiniert mit Heparin (100 Einheiten/kg) die ¹¹¹In-Blutplättchenablagerung auf dem Gefäßtransplantat beeinflußte, wie in ähnlichen früher durchgeführten Untersuchungen. Siehe Harker et al., In "Vascular Diseases: Current Research and Clinical Applications", Strandness et al., (Herausgeber) Orlando, Grune & Stratton, Seiten 271-283 (1987). Somit war das Gefäßtransplantat in Kontrolltieren stark thrombogen und widerstand den herkömmlichen antithrombotischen Therapien, die dazu entworfen waren, die Fibrinbildung (Heparin-Behandlung), die Blutplättchenfuktion (Aspirin-Behandlung) oder beide (Aspirin- und Heparinbehandlung) zu hemmen.
Im Gegensatz dazu verhinderte die intravenöse Infusion von PPACK mit 100 nMol/kg/min, einer Rate, die eine PPACK-Konzentration im Plasma von ungefähr 1-2 ug/ml einstellte, die ¹¹¹In-Blutplättchenablagerung und verhinderte das Verstopfen des Transplantats (Fig. 3A). Wie in Tabelle 2 gezeigt verhinderte PPACK auch die hämostatische Blutplättchen-Pfropfenbildung (die Blutungszeiten wurden auf > 30 min verlängert, p< 10&supmin;&sup5; im Vergleich mit den Kontrollen) und die Thrombin-induzierte Blutgerinnung (Thrombinzeiten waren > 10 min, p< 10&supmin;&sup5; im Vergleich zu den Kontrollen). Tabelle 2 Einfluß von PPACK auf die hämostatische Funktion Blutplättchen¹ Basiswert während PPACK nach PPACK Blutplättchenanzahl Blutungszeit Aggregation ADP Kollagen Thrombin Koagulation Fibrinogen Thrombinzeit Fibrinolyse Plasminogen D-Dimer
¹ Die hämostatische Funktion der Blutplättchen wurde beurteilt hinsichtlich der Blutplättchenanzahl, der Pfropfenbildungskapazität der Blutplättchen (Template-Blutungszeit) und der Blutplättchenaggregation. Die Blutplättchenaggregation wurde bestimmt durch Aufnahme der Lichttransmission durch aufgerührte Suspensionen an citrathaltigem, blutplättchenreichem Plasma. Die Ergebnisse sind ausgedrückt als die Konzentration an Agonist (ADP, Kollagen und Thrombin), die benötigt wurde, um die halbmaximale Aggregation zu erzielen. Die Ergebnisse sind als Mittelwerte ± eine Standardabweichung dargestellt.
Weiterhin gab es keine nachweisbare Freisetzung von PF4 oder βTG aus Blutplättchen oder FPA in das Plasma während der PPACK-Verabreichung (Tabelle 1).
Die Ergebnisse der in vivo-Dosis-Antwort-Untersuchungen, gezeigt in Tabelle 3, zeigen eine unerwartete Übereinstimmung in der Verlängerung der Thrombin-induzierten Blutgerinnung und der Blutungszeiten, mit maximal beobachteten Effekten bei einer PPACK-Plasmakonzentration von ungefähr 1 bis 2 ug/ml, die durch Infusion mit einer Rate von 100 nMol/kg/min für ungefähr 15 min erzielt wurde. Tabelle 3 Dosis-Antwort-Effekt von PPACK PPACK¹-Dosis Blutungszeit Thrombinzeit
¹ In fünf verschiedenen Tieren wurde PPACK gemäß dem angegebenen zunehmenden Dosierungsschema als Infusion verabreicht. Nach kontinuierlicher Infusion einer gegebenen Dosis für 15 Minuten (min) wurde die Bestimmung der Template-Blutungszeit begonnen, und Blut wurde zum Bestimmen der Thrombinzeit entnommen. Die Steigerung zu der nächsten Dosis wurde nur durchgeführt, nachdem die Bestimmung der Blutungszeit abgeschlossen worden war. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± eine Standardabweichung angegeben.
Wenn PPACK dem Pavianplasma in vitro zugesetzt wurde, verlängerten sich die Thrombinzeiten genau bei einer Konzentration von 6 uM/l oder höher, übereinstimmend mit den Infusionsdaten (Tabelle 3). Ein Einfluß auf die Herzfrequenz oder den Blutdruck konnte während der Therapie nicht festgestellt werden. Nach Absetzen der PPACK-Infusion normalisierten sich die Ablagerung von ¹¹¹In-Blutplättchen auf dem Transplantat innerhalb von 30 min, wie in Fig. 3A gezeigt, und die Blutungszeiten und Thrombinzeiten normalisierten sich im wesentlichen innerhalb von 15 min, wie in Tabelle 2 gezeigt.
Während die Thrombin-induzierte Blutplättchenaggregation verschwand, wenn PPACK in Konzentrationen von 3,2 ± 0,1 mg/L oder höher (Tabelle 2) vorhanden war, wurde die durch Kollagen oder ADP induzierte Blutplättchenaggregation nicht durch PPACK gehemmt (Tabelle 2). Somit war die den Blutplättchen innewohnende Reaktivität nicht beeinflußt.

2. In vivo-Hemmung der Blutplättchenablagerung und der erneuten Arterienverengung

A. Die Fähigkeit von PPACK, die erneute Arterienverengung zu hemmen, wurde in einem Pavianmodell, umfassend das Einsetzen eines Arterientransplantats in vivo und Endarteriektomie, untersucht. Zum Einsetzen des Transplantats wurde eine kleine Gefäßprothese in der Form eines 3 cm langen Goretex-Transplantats (4 mm i.D.) operativ in die Carotisarterie eines männlichen Pavians eingesetzt. Unmittelbar vor dem-Einleiten von arteriellem Blut durch das Transplantat (entlang der prothetischen Oberfläche) und für eine Zeitspanne von mindestens 1 Stunde danach wurde PPACK dem Pavian mit einer Rate von ungefähr 100 nMol/kg/min intravenös verabreicht. Ein Kontrolltier erhielt keine PPACK-Behandlung. Die ¹¹¹In-Blutplättchenablagerung wurde durch Wiederaufnahme des arteriellen Blutflusses, wie in Beispiel 1 beschrieben, aufgezeichnet.
Für die Endarteriektomie wurden Carotisarterien des Pavians gemäß üblichen chirurgischen Verfahren endarteriektomisiert.
Unmittelbar vor dem Durchleiten von Blut durch die endarteriektomisierte (behandelte) Arterie und für eine Zeitspanne von ungefähr 1 Stunde danach wurde PPACK an den Pavian mit einer Rate von ungefähr 100 nMol/kg/min intravenös verabreicht. Ein Kontrolltier erhielt kein PPACK.
Die Ergebnisse von beiden Versuchen sind vergleichbar. Daten aus der Endarteriektomie-Untersuchung sind in Fig. 4 gezeigt und zeigen an, daß die Blutplättchenablagerung (erneute Verengung) zu 90% bis 95%, im Vergleich zu dem Kontrolltier, in dem Tier gehemmt wurde, dem PPACK verabreicht wurde.
B. In einer anderen Untersuchung der Carotisendarteriektomie wurden 14 Paviane mit einem Gewicht zwischen 8 bis 11 kg (10 Männchen und 4 Weibchen) mit Hilfe üblicher chirurgischer Verfahren, wie hierin beschrieben, endarteriektomisiert.
Den Tieren wurde Atropin (0,04 mg/kg intramuskulär) als Präanästhetikum verabreicht und dann anästhetisiert mit Hilfe von Ketamin (10 mg/kg intramuskulär) zur Induktion, und Aufrechterhalten der Narkose mit Halothan (1% in Sauerstoff) durch endotracheale Intubation. Durch einen Mittellinieneinschnitt am Hals wurde die normale Carotisarterie von umgebendem Gewebe von der Clavicula proximal bis zur Carotis-Teilung distal freigelegt. Die normale Carotisarterie wurde 3 min nach einer Bolusinjektion von Heparinsulfat (100 Einheiten pro Kilogramm (U)/(kg) intravenös) kreuzweise geklammert mit Hilfe von atraumatischen Gefäßklammern, die an jedem Ende des freigelegten Gefäßes angebracht wurden, und 1 cm proximal zu der distalen Kreuzklammer (Fig. 6) durchtrennt. Das proximale Arteriensegment wurde dann über gekrümmte Pinzetten gestülpt. Die Pinzetten wurden durch das aufgeschnittene Ende des Gefäßes eingeführt, ein Stück der Arterienwand in voller Dicke wurde dann aus der intraluminalen Seite erhalten, und das Gefäß wurde umgestülpt durch Anwenden eines Gegenzugs auf das abgetrennte Ende des Gefäßes in die proximale Richtung. Nachdem eine maximale Umstülpung erreicht war, wurde ein Paar Polypropylenhaltenähte (7-0) auf jeder Seite proximal und ein zweites Paar distal in dem das Lumen nach außen gekehrten Segment angebracht. Die Endarteriektomie wurde dann durchgeführt, beginnend 1 cm von dem abgetrennten Ende des umgestülpten Gefäßsegments entfernt und über eine Strecke von 1 cm fortgesetzt. Dieses Verfahren umfaßte das mechanische Entfernen der normalen Intima und eines Teils der Media mit Hilfe von Pinzetten und einem chirurgischen Mikroskop (32-fache Vergrößerung, Zeiss Operationsmikroskop, Deutschland). Nach der Endarteriektomie wurde das Gefäß in seine normale Anordnung zurücküberführt, und eine End-End-Anastomose wurde mit einer 7-0-Polypropylennaht unter 2 ½-facher Vergrößerung durchgeführt. In den behandelten Tieren wurde die PPACK-Infusion 5 min vor der Wiederaufnahme des Durchflusses in der operierten Carotisarterie begonnen. Die Durchgängigkeit wurde mit Hilfe einer 5-Megaherz-Doppler-Bleistiftsonde (Parks Electronics Laboratory, Beaverton, OR) sowohl proximal wie auch distal zu der Endarteriektomiestelle und der Anastomose geprüft. Eine ¹¹¹In-Quelle wurde als interner Standard (siehe unten) implantiert. Die Wunde wurde mit unterbrochenen Nähten geschlossen, und Darstellungen mit der Szintillationskamera wurden sofort ausgeführt. Die Tiere tolerierten das Verfahren gut. Der geschätzte Blutverlust betrug ungefähr 25 ml.
Autologe Pavianblutplättchen wurden mit 800 bis 1000 uCi (1Ci= 37GBg) ¹¹¹In-Oxid markiert, wie zuvor in Beispiel 1 beschrieben, und diese wurden vor dem chirurgischen Verfahren injiziert.
Ein mittlerer Energiekollimator wurde mit guter Auflösung verwendet, indem der niedrig- und hochenergetische Peak von ¹¹¹Indium dargestellt wurde. Darstellungen der Carotisarterien wurden mit einer Picker DC 4/11 Dyna Szintillationskamera (Picker Corp., Northford, CT) erhalten und sortiert und analysiert mit einem Medical Data System A³-Computer (Medtronic, Ann Arbor, MI), der mit der Kamera verbunden war. Es wurden auch Darstellungen einer 5 ml-Probe aus Gesamtblut (Blutstandard) erhalten.
Zum Zwecke der Kalibrierung wurde eine kleine ¹¹¹In-Radioisotopquelle (ungefähr 5 uCi) an das Ende eines 0,6 mm i.D. Polyethylenröhrchens (PE-50, Clay Adams Incorporated, New York, New York) angeheftet und zum Zeitpunkt der Operation in Nachbarschaft zu der normalen Carotisarterie in der gleichen Gewebsebene wie die Endarteriektomiestelle angebracht. Nachdem die anfängliche 5 min-Darstellung erhalten worden war (siehe unten), wurde die ¹¹¹In-Quelle entfernt und erneut gezählt. Das Verhältnis der ¹¹¹In-Aktivität des internen Standards, implantiert in der Wunde, und nach Entfernen ergeben ein direktes Maß der abschwächenden Wirkung des dazwischenliegenden Gewebes auf die ¹¹¹In-Aktivität, die an der Endarteriektomiestelle abgelagert ist. Hanson et al., Arteriosclerosis, 6 : 511-518 (1986). Die Aktivität eines 5 ml-Gesamtblutstandards, eines internen Kalibrierungsstandards vor und nach dem Entfernen aus der Wunde, der Endarteriektomiestellen und der kontralateralen Kontrollarterien werden in interessierenden
Bereichen durch routinemäßige Softwareanalyse der Darstellungen bestimmt. Die abgelagerte ¹¹¹In-Blutplättchenaktivität wird berechnet durch Subtrahieren der Aktivität in dem Bereich der kontralateralen Kontrollarterie von den Darstellungen der Untersuchung, Korrigieren um die Abschwächung durch Gewebe und Ausdrücken der Ergebnisse als abgelagerte Blutplättchen unter Verwendung des Gesamtblutstandards.
Wie in Beispiel 1 wird zirkulierende ¹¹¹In-Blutplättchenaktivität kontinuierlich über normale physiologische Mechanismen verloren, und die Bestimmungen der Blutplättchenakkumulation nach jeder akuten Darstellung kann nicht in Form von absoluten Zahlen ausgedrückt werden. Daten werden zu späteren Zeitpunkten aufgenommen und als das Endarteriektomie-Blut- Verhältnis ausgedrückt, welches definiert ist als das Verhältnis der Aktivität der Endarteriektomieregion minus der Aktivität der zirkulierenden Blutplättchen in dem Lumen der nicht operierten kontralateralen Kontrollarterie, dividiert durch die Aktivität des Blutstandards. Diese Bestimmung ist unabhängig von der Größe des Tieres, der Menge des injizierten Isotops oder dem Ausmaß zu dem das Isotop möglicherweise zerfallen ist. Bei allen Berechnungen beziehen sich die Radioaktivitätswerte nur auf die Blutplättchenaktivität, wobei die Gesamtblut- und Standardwerte um die kleine Fraktion von nicht-Blutplättchen-¹¹¹In-Aktivität korrigiert worden sind. Hanson et al., J. Clin. Invest., 81 : 149-158 (1985).
Folgend auf die unilaterale Carotisendarteriektomie wurden in jedem Tier 5 min-Darstellungen mit der Szintillationskamera bei 60 und 90 min und 24, 48 und 72 Stunden nach der Wiederaufnahme des Blutflusses aufgenommen. An dem post-operativen Tag 1 wurde vor der 24 Stunden-Darstellung jeder Pavian mit Ketaminhydrochlorid (10 mg/kg) anästhetisiert, die Wunde wurde geöffnet, und die arterielle Durchgängigkeit wurde mit Hilfe einer Doppler-Bleistiftsonde ermittelt. Die Wunde wurde geschlossen, und die Aufnahmen wurden fortgesetzt.
Die Zählungen der Blutplättchen und die Hematogritbestimmungen wurden präoperativ und täglich für die Dauer von 2 Tagen an Gesamtblut durchgeführt, das in Na&sub2;EDTA (2 mg/ml) gesammelt wurde, mit Hilfe eines Gesamtblutanalysators Baker Model 810. Die mittlere Blutplättchenzahl betrug 318 ± 70 · 10³/ul in der Kontrollgruppe und 296 ± 53 · 10³/ul in der behandelten Gruppe.
Bestimmungen der Blutungszeiten wurden zweifach an den rasierten Handflächen des Unterarms durchgeführt, wobei das Standard-Template-Verfahren, wie zuvor für Untersuchungen an Pavianen beschrieben, verwendet wurde. Harker et al., Blood, 58 : 824-834 (1980)
Die anti-Thrombinaktivitätsspiegel von PPACK wurden in Plasma bestimmt, das aus Gesamtblut hergestellt war, welches in saurer Citrat-Dextrose (ACD) gesammelt wurde und vor der Infusion und nach 30 und 60 min nach dem Start der Infusion und 30 min nach Beendigung der Therapie erhalten wurde. Die anti-Thrombinaktivitätsspiegel des Plasmas wurden sofort ermittelt, oder es wurde schnellgefroren bei -70ºC für anschließende Untersuchungen, wobei eine Standardprobe für PPACK verwendet wurde, welche mit dem tiereigenen Kontrollplasma vor der Behandlung erstellt wurde.
Die PPACK-Lösung wurde in 0,15 M NaCl gelöst und durch Filtration sterilisiert. Die PPACK-Lösung wurde kontinuierlich für einen Zeitraum von ungefähr 1 Stunde mit Hilfe einer Spritzenpumpe (Harvard Apparatus Co., Cambridge, MA) mit einer Rate von 100 nMol/kg/min infundiert.
Die Blutplättchen wurden rasch an Endarteriektomiestellen der Carotis in Kontrolltieren abgelagert, wobei sie ein Plateau innerhalb von 60 min nach der Wiederaufnahme des Durchflusses erreichten (Fig. 7). Danach blieb das Endarteriektomie-Blut- Verhältnis (EBR) in den Kontrollen erhöht, wobei es nur minimal während der ersten drei Tage von 3,03 ± 0,51 bis 3,25 ± 0,48 (p=0,759; Fig. 7) zunahm. Im Gegensatz dazu war die akute Blutplättchenablagerung nach 90 min nach der Operation auf der Endarteriektomiestelle in den mit PPACK behandelten
Tieren im Vergleich zu den Kontrolltieren deutlich erniedrigt (1,59 ± 0,36 · 108 gegen 11,67 ± 1,61 · 10 Blutplättchen/cm; p < 0,002), über die anschließenden drei Tage blieb die Blutplättchenablagerung erniedrigt, wenn sie als das Verhältnis zwischen Nettoradioaktivität in der endarteriektoinisierten Region gegen Gesamtblutaktivität in den Kontrolltieren (EBR) ermittelt wurde. Am Tag der Operation betrug das Verhältnis nach 90 min 0,82 ± 0,25 in PPACK-Tieren bzw. 3,03 ± 0,51 in den Kontrolltieren. Nach 3 Tagen betrug das EBR-Verhältnis 0,85 ± 0,23 in PPACK-Tieren im Vergleich zu 3,25 ± 0,48 in den Kontrolltieren. Sämtliche Gefäße waren in beiden Gruppen nach 24 stündiger Kontrolle durch Doppler-Abtastung durchgängig.
Die mit der Szintillationskamera 90 min nach der Operation erhaltenen Darstellungen zeigten eine herdförmige Akkumulation von Blutplättchen an den Endarteriektomiestellen in den Kontrolltieren. Die PPACK-Behandlung führte zu einer deutlichen Verringerung der ¹¹¹In-Blutplättchenaktivität an den Endarteriektomiestellen.
Abtastelektronenmikroskopie der nicht behandelten endarteriektomisierten Gefäßoberfläche 3 Tage nach der Endarteriektomie zeigte eine akute Blutplättchenthrombenbildung. Sichtbare Blutplättchenablagerung an Endarteriektomiestellen in Tieren, die die PPACK-Behandlung erhielten, war deutlich verringert.
Die Plasmaspiegel an PPACK wurden während der Infusion konstant aufrechterhalten aber fielen rasch ab, nachdem die Infusion unterbrochen wurde (Tabelle 4). PPACK steigerte die Template-Blutungszeiten vor der Behandlung von 5,6 ± 0,8 min auf > 30 min während der Infusion in allen Tieren. Die Blutungszeiten waren 30 min nach Absetzen der PPACK-Infusion normal (6,2 ± 1,3 min).
Die Blutplättchenzahlen blieben im Verlauf der Untersuchung in den behandelten Tieren unverändert (296 ± 53 · 10³/ul am Tag 3, p = 0,725).

Tabelle 4

Plasmaspiegel von PPACK

Basiswert
30 · min nach Infusion 3,72 ± 0,61 ug/ml
60 · min nach Infusion 3,71 ± 0,47 ug/ml
90 · min nach Infusion 1,12 ± 0,27 ug/ml
24 · min nach Infusion
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigen, daß die intravenöse Verabreichung von PPACK für ungefähr 1 Stunde die Blutplättchenablagerung an Stellen starker Verletzung, die durch die chirurgische Endarteriektomie in den Carotisarterien der Paviane erzeugt wurden, dauerhaft unterbricht. Diese Befunde zeigen wie die aus Teil A an, daß die 1-stündige Infusion von PPACK eine signifikante Hemmung der Blutplättchenablagerung für mindestens 3 Tage bewirkt.
Die kontinuierliche Verabreichung von PPACK ist deshalb, wie im Stand der Technik vorgeschlagen, nicht notwendig, um späte post-operative therapeutische Wirkungen zu erzielen.
Die vorliegende Erfindung stellt somit ein Mittel zum Hemmen der Blutplättchen-abhängigen arteriellen Thrombosenentstehung dar, die mit Gefäßeingriffen wie Angioplastie, Endarteriektomie, intravaskuläre Stent-Anbringung (stent placement) und Implantationen von Gefäßtransplantaten mit geringem Durchmesser in Säugetieren verbunden sind.

3. Hemmung der Blutplättchenablagerung auf einer arteriellen Protheseoberfläche

A. Die Wirkung von PPACK unter Verwendung eines Hohlfaser- (Kapillar)-Hämodialysegerät als einem beispielhaften ex vivotherapeutischen Gerät, das in chronische arteriovenöse femorale Shunts gebracht worden war, wurde ausgewählt, um die antithrombotischen Wirkungen auf prothetische Oberflächen zu zeigen.
Ein 0,8 m²-Cuprophan-Kapillar-Durchflußdialysator (Modell 12.11; Travenol, Dearfield, IL) wurde in ein A-V-Shunt-System von sieben verschiedenen männlichen Pavianen eingeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben. PPACK wurde den Pavianen mit einer Rate von 100 nMol/kg/min für ungefähr 1 Stunde vor und während dem Entlangleiten des arteriellen Bluts des Pavians entlang der prothetischen Oberfläche des Dialysators (durch die Dialysatorkapillaren) intravenös verabreicht. Aus Gründen des Vergleichs wurde Heparin anstelle von PPACK in Kontrolluntersuchungen verabreicht. Die Heparinverabreichung bestand aus einem anfänglichen Bolus von 150 Einheiten (U) pro Kilogramm Körpergewicht, gefolgt von kontinuierlicher Infusion von 150 U/kg/Std. für 1 Stunde vor und während dem Durchleiten des arteriellen Bluts des Pavians durch den Dialysator. Die Hemmung der Blutplättchenablagerung auf der prothetischen (Kapillar-) Oberfläche wurde bestimmt, indem das Volumen von Saline, die von dem Dialysator zurückgehalten wurde, vor und nach dem Durchleiten des arteriellen Bluts, dadurch gemessen wurde.
Wie in Fig. 5 gezeigt, hemmte die Verabreichung von PPACK den Volumenverlust im Dialysator signifikant besser als Heparin.
B. In einer anderen Untersuchung mit juvenilen, männlichen Pavianen mit einem Gewicht von 9 bis 13 kg erhielt jedes Tier einen chronischen femoralen arteriovenösen Silicongummishunt vom "Scribner-Typ". Dieses permanente Shuntsystem aktiviert nicht nachweisbar die Blutplättchen oder Blutgerinnung. Harker et al., J. Clin. Invest., 64 : 559-69 (1979); und Hanson et al., Thromb. and Haem., 58(3):801-05 (1987). Hematocritwerte (33 ± 1,6%), weiße Blutplättchenzahl (14 ± 2 · 10³/uL) und Fibrinogenkonzentrationen (403 ± 23 mg/dL) waren in sämtlichen verwendeten Tieren normal. Tiere mit niedrigen Hematocritwerten, erhöhtem WBC, unzulänglichem Shunt-Blutdurchfluß oder lokaler Entzündung wurden von der Untersuchung ausgenommen.
Jedes Tier wurde viermal untersucht. Zwei 2-stündige Behandlungen mit PPACK wurden mit zwei 2-stündigen Behandlungen mit Heparin als Antikoagulans in dem gleichen Versuchstier verglichen. Während jeder Perfusion wurde der kontinuierliche Blutdurchfluß durch die Shunts mit Hilfe eines Ultraschalldurchflußmessers nach Doppler (L and M Electronics Model 10¹², Daly City, CA) gemessen. Die Blutdurchflußraten lagen zwischen 180 und 250 ml pro Minute.
Es wurden Hohlfaserdialysiergeräte (Travenol CF1211, Deerfield, Illinois, USA) des Cuprophan-Hohlfasertyps verwendet. Jeder Dialysator wurde zweimal zu getrennten Anlässen in dem gleichen Tier und mit dem gleichen Antikoagulans verwendet. Vor jeder Verwendung des Hämodialysegeräts und zur Aufbewahrung über Nacht wurde jede Dialyseeinheit (Zelle) mit steriler, normaler Salinelösung gefüllt. Zur erneuten Verwendung wurde der Dialysator bei 4ºC über Nacht zwischen ungefähr 12 bis ungefähr 18 Stunden aufbewahrt. Während der Hämoperfusion war die Dialysekammer mit steriler isotonischer Salinelösung gefüllt, und die Drainageausgänge waren verschlossen. Silicongummischläuche für medizinische Zwecke mit 3,0 mm innerem Durchmesser (i.D.) (Dow-Corning Corporation, Midland, MI) und dünnwandige Teflonschläuche mit 2 cm Länge wurden anschließend verwendet, um die Dialysatoren mit den Shunts zu verbinden.
Das Volumen der Dialysatorfaser wurde vor und nach jedem Gebrauch bestimmt als ein Maß der thrombotischen Faserverstopfung. Gotch et al., Trans. of Amer. Soc. for Artifical Internal Organs, 1969 : 87-96. Somit wurde vor jeder Verwendung die Zelle mit isotonischer Saline gefüllt, und alle sichtbare Luft wurde aus dem Faserbündel gespült. Durch Verbinden eines Manometers mit einem Ballon mit dem arteriellen Stutzen und Durchspülen mit Luft für 1 Minute bei 45 Torr wurde der Wasserinhalt der Zelle quantitativ über den venösen Stutzen in ein Volumenmessgefäß zurückgewonnen. Es wurden zu jedem Zeitpunkt zwei Bestimmungen durchgeführt und gemittelt.
PPACK oder normales Heparin (aus der intestinalen Mucosa des Schweins, Invenex Laboratories, Chagrin Falls, OH) wurden in den arteriellen Schenkel des Gefäßshunts unmittelbar proximal zu dem Dialysator eingeführt. Die Heparinverabreichung erfolgte als ein anfänglicher Bolus von 100 U/kg 5 min bevor der Dialysator eingeführt wurde, und anschließend erfolgte eine kontinuierliche Infusion von 15 U/kg/Std. für mindestens 2 Stunden mit Hilfe einer Harvard-Mikroinfusionspumpe (Modell 901, Harvard Apparatus Co., Inc.), PPACK wurde kontinuierlich mit einer Rate von 100 nMol/kg/min für ungefähr 15 min vor und dann während dem 2-stündigem Entlangleiten von Blut entlang der prothetischen Oberfläche des Dialysators infundiert, wobei die Präinfusion für ungefähr 15 min Steady-State-Spiegel einstellen soll.
Zusätzlich zu der Bestimmung des Verlustes an Hohlfaservolumen wurde das Ausmaß der Blutplättchenakkumulation im Thrombus in den Dialysatorfaserbündeln bestimmt durch Darstellen von autologen ¹¹¹In-markierten Blutplättchen, die in dem durchgespülten Dialysator unmittelbar nach jeder Verwendung verblieben, mit Hilfe einer Szintillationskamera (Picker Corp., Northford, CT). Autologe Pavianblutplättchen wurden mit ¹¹¹In-Oxin (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) markiert und vor dem Einfügen des Dialysators eingespritzt. Kotze et al., Thromb. and Haemostasis, 53 : 404-07 (1985). Darstellungen der "erstmaligen Verwendung" des Dialysators, angegeben in Counts/min (cpm), wurden unmittelbar nach dem Ausspülen des Bluts aus dem System und nach der Vervollständigung der Bestimmung des Faserbündelvolumens erhalten. "Mehrmals verwendete" Dialysatoren wurden vor der zweiten Verwendung dargestellt, um die restliche ¹¹¹In-Blutplättchenradioaktivität zu bestimmen. Die Gesamtblutplättchenablagerung wurde dann berechnet durch Dividieren der Dialysator-cpm durch die cpm/ml des zirkulierenden Bluts und Multiplizieren dieses Verhältnisses mit der Anzahl von Blutplättchen in 1 ml Blut.
Die Zählungen der Blutzellen (Blutplättchen, weiße Blutkörperchen und rote Blutkörperchen) wurden an einem mit Dinatrium- EDTA gerinnungsgehemmten Gesamtblut mit Hilfe eines J.T. Baker-Gesamtblutanalysators Modell 810 (Allentown, PA) durchgeführt. Hanson et al., J. Clin. Invest., 75 : 1591-99 (1985); und Hanson et al., Arteriosclerosis, 5 : 595-603 (1985). Die Standard-Template-Blutungszeiten wurden an der rasierten Handfläche des Unterarms auf eine Weise durchgeführt, wie in Harker et al., New Eng. J. Med., 287 : 155-59 (1972 und Malpass et al., Blood, 57 : 736-40 (1981) beschrieben. Die Blutungszeiten wurden doppelt bestimmt und gemittelt. Gewerblich erhältliche radioimmunometrische Assays wurden durchgeführt, um die Plasmaspiegel an Blutplättchenfaktor 4 (PF4) (Abbott Laboratories, North Chicago, IL), β-Thromboglobulin (βTG) (Amersham Corp., Arlington Heights, IL), Fibrinpeptid A (FPA) (MICRO USA Inc., New York, NY) und aktiviertem Komplement-C3-Antigen (C3a) (Amersham Corp.) zu bestimmen. Die Blutproben für diese Plasmaassays wurden gesammelt, verarbeitet und bestimmt, wie in den Verfahren des Beispiels 1 und in Malpass et al., siehe oben, und Hanson et al., Arteriosclerosis, 5 : 595-603 (1985) beschrieben. Die Thromboplastinaktivierungszeiten (APTT) wurden mit Hilfe eines Standardverfahrens (aktiviertes PTT- Reagens, Ortho Diagnostics, Raritain, NJ) durchgeführt. Ein Fibrometer (Fibrosystem, Abteilung von Becton und Dickinson und Co., Cockeysville, MA) wurde zur Bestimmung des Blutgerinnungsendpunkts benutzt, wie beschrieben in Biggs, R. Human Blood Coagulation, Haemostasis and Thrombosis, Oxford, Blackwell Scientific, Seiten 657-750 (1976). Fibrinogen wurde durch ein Verfahren zum Bestimmen von gesamtem, gerinnungsfähigem Protein bestimmt, wie beschrieben in Jacobsson K., Scand. J. Clin. Lab. Invest., 7 (Ergänzungsauflage 14):9-54 (1955).
Die Aktivitätsspiegel von Heparin und PPACK in Plasma wurden an Blutproben bestimmt, die in 3,8% Natriumcitrat bzw. ACD gesammelt wurden. Die Proben wurden unmittelbar nach dem Sammeln zentrifugiert (2000 g für 5 min), und dann wurde das gewonnene Plasma bis zum Austesten eingefroren. Die Spiegel der Heparin- und PPACK-Aktivität wurden nach 30 und 60 min der kontinuierlichen Infusion bestimmt. In einigen Untersuchungen wurden die PPACK-Spiegel an drei Stellen bestimmt: i) systemisch, ii) unmittelbar proximal zu dem Dialysator aber distal zu der Stelle der PPACK-Infusion, und iii) unmittelbar distal zu dem Dialysator. Die Spiegel der Heparinaktivität wurden bestimmt durch Messen der verstärkenden Wirkung von Heparin auf die Plasmaanti-Xa-Aktivität mit Hilfe eines synthetischen, chromogenen Substrats (Stachrom Heparin, Stago, Frankreich). Teien et al., Thrombo Research, 10 : 399-410 (1977). Die PPACK-Spiegel wurden bestimmt durch Messen der anti-Thrombinaktivitäten mit Hilfe eines Thrombin-Standardreagenzes (Rinderthrombin, Parke-Davis, Morris Plains, NJ). Die Ergebnisse wurden als ug/ml ausgedrückt, welche mit Hilfe einer PPACK-Eichkurve, erstellt mit autologem Pavian-ACD-Plasma, erhalten worden waren.
Die Blutplättchenaggregation wurde in einem citrathaltigen, blutplättchenreichen Plasma (PRP) durchgeführt mit Hilfe eines Chronolog-Blutplättchenaggreometers (Havertown, PA), indem die Zunahme der Lichttransmission durch eine aufgerührte Suspension von PRP bei 37ºC aufgenommen wurde. Die Citratkonzentration wurde konstant bei 0,12M gehalten, und die Blutplättchenzahl des PRP wurde auf 250000 Blutplättchen/ul eingestellt. Die Ergebnisse wurden als EC&sub5;&sub0; angegeben (die Konzentration an Agonist, die 50% der maximalen Aggregationsantwort erzeugt), induziert durch Kollagen (Hormon-Chemie, München) und ADP (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), wie berichtet in Malpass et al., Blood, 57 : 736-40 (1981).
Durch Vergleich der Wirkungen von Heparin und PPACK auf die Blutgerinnung wurden Dosen ausgewählt, die ähnliche Verlängerungen der APTT verursachten (Tabelle 5). Für Heparin war die APTT von systemischen Blut auf 199 ± 18 sec verlängert über den gesamten Zeitraum des Aussetzens des Bluts dem Hämodialysegerät, wobei es mit einer Rate von 100 U/kg als anfänglicher Bolus und 15 U/kg/ Std. danach durch eine kontinuierliche Infusion verabreicht wurde, was einem Plasmaspiegel von 1,06 ± 0,08 U/ml entsprach. Für PPACK war die APTT mit venösem Blut auf 139 ± 23 sec verlängert, wobei eine Rate von 100 nMol/kg/ min proximal zu dem Dialysator infundiert wurde, was einem systemischen Plasmaspiegel von 1,52 ± 0,06 ug/ml entspricht. PPACK, aber nicht Heparin, verhinderte den Anstieg an Plasmaspiegel von FPA, dem Thrombinspaltprodukt des Fibrinogens (Tabelle 5). Tabelle 5 Vergleich der die Blutgerinnung hemmenden Wirkungen von PPACK und Heparin Plasma Bestimmungen Kontrolle Heparin PPACK APTT Heparin PPACK FPA Fibrinogen
Da PPACK direkt in den Dialysator infundiert wurde und das Entfernen aus der Zirkulation rasch erfolgte, waren die Spiegel dieses Reagenzes in dem Gerät beträchtlich größer als die systemischen Konzentrationen (Tabelle 6). Tabelle 6 PPACK-Konzentrationen in Plasma, das in den Hohlfaser- Dialysator eintritt bzw. austritt, verglichen mit systemischen Spiegeln Ort der Probe Plasma-PPACK (ug/ml) Zeitspanne (min) Systemisch Prädialysator Postdialysator
Die Blutplättchenreaktivität wurde ermittelt durch Vergleich der Blutplättchenzahl in Gesamtblut, der Blutungszeit, der Blutplättchenaggregation und der Plasmaspiegel an den Blutplättchen-spezifischen α-Körperchenproteinen βTG und PF4 (Tabelle 7). Während die Blutplättchenzahlen während dem Aussetzen des Dialysators im Verlauf der Verabreichung von Heparin oder PPACK nicht signifikant verändert waren, waren hinsichtlich der hämostatischen Funktion der Blutplättchen signifikante Unterschiede sichtbar. PPACK erhöhte deutlich die Blutungszeiten und verringerte das Freisetzen von PF4 und βTG aus Blutplättchen in das Plasma; Heparin zeigte keine Wirkungen bei diesen Bestimmungen (Tabelle 7). Die Blutplättchenaggregationen, durchgeführt an 5 verschiedenen Tieren, die 100 nMol/kg/min PPACK einschließlich entweder ADP oder Kollagen erhielten, waren im wesentlichen normal (Tabelle 7). Tabelle 7 Wirkungen von Heparin und PPACK auf Blutplättchen Bestimmungen Kontrolle Heparin PPACK Unterschiede Heparin v. PPACK Blutplättchenzahl Blutungszeit Plasma Blutplättchenaggregation
Das Faserbündelvolumen des Dialysators (DFV) und die ¹¹¹In- Blutplättchenablagerung innerhalb des Faserbündels wurden als unabhängige Bestimmungen der Thrombusbildung in dem Dialysator nach jeder Verwendung benutzt (Fig. 8). Heparin-behandelte Tiere zeigten einen signifikanten und progressiven Verlust an DFV und reziproke Zunahmen der Blutplättchenakkumulation innerhalb des Faserbündels zu allen getesteten Zeiten. Im Gegensatz dazu hielt die PPACK-Behandlung das DFV aufrecht mit einer deutlichen Verringerung der Blutplättchenakkumulation in den Dialysatoren.
Keine offensichtlichen Unterschiede wurden zwischen der Heparin- und PPACK-Therapie hinsichtlich der Komplementaktivierung (C3a) oder der Abnahme der weißen Blutkörperchenzahl während des Dialysatoreinsatzes beobachtet. Die C3a-Spiegel stiegen von einem Kontrollwert von 769 ± 209 ng/ml auf einen Spitzenspiegel von 2005 ± 728 ng/ml und 1989 ± 360 ng/ml für Heparin bzw. PPACK an. Umgekehrt wurde eine frühe Abnahme der weißen Blutkörperchenzahl der Kontrollen für Heparin (14100 ± 1000 Zellen/al bis 6200 ± 860 Zellen/ul) und für PPACK auf 5900 ± 810 Zellen/ul beobachtet.
Die Ergebnisse dieser Untersuchung und der aus Teil A zeigen, daß die Infusion des synthetischen Antithrombins PPACK während der Hämodialyse die Blutplättchen-abhängige Thrombenbildung deutlich verringert und demzufolge auch den Volumenverlust in den Hohlfaserbündeln in den Hämodialysegeräten, was im Gegensatz zu den Befunden steht, die in Kontrollexperimenten mit Heparin als Gerinnungshemmer gefunden wurden. Weiterhin liegen andere, indirekte Blutmarker der Thrombusbildung in vivo, d. h., Plasma PF4, βTG und FPA, bei den basalen Spiegeln nach der PPACKInfusion, im Gegensatz zu den während der Heparintherapie beobachteten erhöhten Spiegeln. PPACK, aber nicht Heparin, hemmte auch die Blutplättchen-vermittelte hämostatische Pfropfenbildung, wie durch die verlängerten Blutungszeiten gezeigt, ohne jedoch die Bestimmungen der durch Kollagen oder ADP ex vivo induzierten Blutplättchenaggregation zu verändern. Diese Ergebnisse zeigen, daß der zunehmende Verlust des Dialysators an Hohlfasern ein Blutplättchen-abhängiger, Thrombinvermittelter, okklusiv-thrombotischer Vorgang ist.
Hämodialyse mit Hohlfaserdialysatoren wird bei urämischen Patienten in den Vereinigten Staaten angewandt, die einer chronischen Erhaltungsdialyse unterzogen werden. Der Erhalt der Funktion des Dialysators zur erneuten Verwendung ist nicht nur aus ökonomischen Gründen zu einer wichtigen Überlegung geworden sondern auch angesichts der jüngeren epidemiologischen Untersuchungen, die gezeigt haben, daß die Mortalität und Morbidität mit der Gerätewiederverwendung abnimmt. Bok et al., Proc. Council Dial. Transplant, 10 : 92-9 (1980). Jedoch wird trotz Heparinisierung durch Kontakt des Bluts mit der künstlichen Oberfläche des Dialysators das Komplement, Blutplättchen und die Gerinnung aktiviert, was zu einer vorübergehenden Neutropenie, Thrombusbildung und zunehmendem Verlust an DFV und eventuell der Transportfunktion des Dialysators führt. Chenowith, et al., Artificial Orgn., 11 : 155-62 (1987); Salzman, E., Fed. Proc., 30 : 1503-09 (1971); und Vroman et al., Fed. Proc . . 30 : 1494-502 (1971). Weiterhin können Aktivierungsund/oder Spaltungsprodukte, die aus der Blut-Oberfläche-Wechselwirkung stammen, unerwünschte systemische Effekte verursachen, wie eine Hypotension oder Atemnot. Henderson et al., Blood Purif., 1 : 3-8 (1985); und Dangiradas et al., Kidney In., 1 : 190-96 (1972). Andere mit der Heparinverwendung assoziierte schädliche Reaktionen umfassen abnormale Blutung (insbesondere gastrointestinal und intracranial) [Lindsay et al., Lancet, 2 : 1287-90 (1972); Dangiradas et al., Kidney Int., 1 : 190-96 (1972)], Heparin-induzierte Thrombocytopenie [Cines et al., New Eng. J. Med., 303 : 788-95 (1980)], mit Knochenregeneration und möglicherweise schwerer endcalcifizierender Knochenkrankheit. Squires et al., JAMA, 241 : 2417-18 (1979); und Glowacki, J. Life Sci., 33 : 1019-24 (1983). Weiterhin kann auch Protamin, das am Ende der Dialyse verabreicht wird, um die Heparinblutgerinnung umzukehren, Probleme verursachen, wie Hypotension und Komplementfreisetzung. Anderson et al., Surgery, 46 : 1050 (1959) and Loubser, P.G., Texas Heart J., 14 : 369-73 (1987). In einigen Fällen war gewerbliches Heparin mit arterieller Thrombosenentstehung assoziiert, vermutlich wegen der Wirkungen von einer bzw. einigen kontaminierenden Blutplättchen-aktivierenden Fraktionen. Salzman et al., J. Clin. Invest., 65 : 64-73 (1980).
PPACK wird rasch aus der Zirkulation entfernt (mit einer T&sub5;&sub0;- Entfernungsrate von weniger als 3 min), Collen et al., J. Lab. and Clin. Med., 99 : 76-83 (1982) und vermutlich durch die Dialysemembran wegen seines geringen Molekulargewichts. Es ist möglich, antithrombotische Spiegel lokal in dem Dialysator aufrecht zu erhalten, mit geringen oder keinen systemischen antihämostatischen Wirkungen. Zum Beispiel war in der vorliegenden Untersuchung die gemessene blutgerinnungshemmende Aktivität des Plasmas in dem Dialysator deutlich erhöht im Vergleich mit den systemischen Spiegeln, die erzielt wurden, wenn 100 nMol/kg/min verabreicht wurden (Tabelle 7). Unter tatsächlichen Dialysebedingungen wäre der Unterschied sogar noch deutlicher, da PPACK auch in das Dialysat entfernt würde. Somit ist im Vergleich zu Heparin die erhaltene hämostatische Belastung minimal. Obwohl Heparin nicht vollkommen sicher oder wirksam ist, wird es weiterhin in Dialysepatienten eingesetzt, da keine geeignete Alternative zur Verfügung stand. Die vorliegende Erfindung stellt somit ein verbessertes Verfahren zur Durchführung der Hämodialyse bereit.
Das Vorgenannte soll die vorliegende Erfindung erläutern aber nicht beschränken.

Claims

1. Die Verwendung des Peptides der Formel 1,

worin Z Wasserstoff oder eine C&sub1;-C&sub6;-Acylgruppe und X ein Halogenatom darstellt, oder eines Additionsprodukts davon mit einer Halogenwasserstoffsäure zur Herstellung eines Medikaments zum Hemmen von Blutplättchen-abhängiger Thrombusbildung, Arterienverengung oder Blutplättchenablagerung auf einem prothetischen Gegenstand.

2. Die Verwendung eines Peptides nach Anspruch 1, worin X Chlor und Z Wasserstoff darstellt.

3. Die Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin das Medikament in einem Verfahren zum Hemmen von einer erneuten Arterienverengung in einem Patienten eingesetzt wird, worin der Patient einer medizinischen Behandlung zum Vergrößern des Kanaldurchmessers für den Blutfluß in einer verengten Arterie unterzogen wird, um eine behandelte Arterie zu erzeugen, und arterielles Blut des Patienten wird durch die behandelte Arterie geleitet.

4. Die Verwendung nach Anspruch 3, worin das Verfahren zum Hemmen der erneuten Arterienverengung die Verabreichung dieses Medikaments in einer Menge umfaßt, die ausreicht, um eine Peptidkonzentration in dem Blut von mindestens 0,2 ug/ml zu erzielen.

5. Die Verwendung nach Anspruch 4, worin die Menge des Medikaments ausreicht, um eine Peptidkonzentration in dem Blut von mindestens 1 ug/ml zu erzielen.

6. Die Verwendung nach Anspruch 4 oder 5, worin die Menge des Medikaments ausreicht, um die Peptidkonzentration für eine Zeitspanne von mindestens 5 min aufrechtzuerhalten.

7. Die Verwendung nach Anspruch 4 oder 5, worin die Menge des Medikaments ausreicht, um die Peptidkonzentration in dem Blut für eine Zeitspanne von mindestens 5 min aber nicht länger als 90 min aufrechtzuerhalten.

8. Die Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 7, worin die medizinische Behandlung ein chirurgisches Verfahren darstellt.

9. Die Verwendung nach Anspruch 8, worin das chirurgische Verfahren Endarteriektomie oder Angioplastie darstellt.

10. Die Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 9, worin die medizinische Behandlung die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines thrombolytischen Mittels an den Patienten umfaßt.

11. Die Verwendung nach Anspruch 10, worin das thrombolytische Mittel Streptokinase, Urokinase oder Gewebsplasminogenaktivator darstellt.

12. Die Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 11, worin das Medikament dazu bestimmt ist, dem Patienten vor dessen Unterziehen der medizinischen Behandlung verabreicht zu werden.

13. Die Verwendung nach Anspruch 12, worin die medizinische Behandlung durchgeführt wird während die Peptidkonzentration in dem Blut mindestens 1 ug/ml beträgt.

14. Die Verwendung nach Anspruch 12, worin die medizinische Behandlung innerhalb von 5 min nach der Verabreichung des Medikaments an den Patienten durchgeführt wird.

15. Die Verwendung eines Peptides der Formel I, worin Z und X Reste wie in Anspruch 1 oder 2 definiert sind, oder eines Additionssalzes davon mit einer Halogenwasserstoffsäure zur Herstellung eines Medikaments zum Verwenden in einem Verfahren zum Hemmen der Blutplättchenablagerung auf einer Oberfläche einer arteriellen Prothese oder eines arteriovenösen Shunts in einem Patienten.

16. Die Verwendung nach Anspruch 15, worin das Verfahren zum Hemmen der Blutplättchenablagerung die Verabreichung des Medikaments an den Patienten in einer Menge umfaßt, die ausreicht, um eine Peptidkonzentration in dem Blut von mindestens 0,2 ug/ml zu erzielen.

17. Die Verwendung nach Anspruch 16, worin die Menge des Medikaments ausreicht, um eine Peptidkonzentration in dem Blut von mindestens 1 ug/ml zu erzielen.

18. Die Verwendung nach Anspruch 16 oder 17, worin die Menge des Medikaments ausreicht, um die Peptidkonzentration für eine Zeitspanne von mindestens 5 min aufrechtzuerhalten.

19. Die Verwendung nach Anspruch 16 oder 17, worin die Menge des Medikaments ausreicht, um die Konzentration in dem Blut für eine Zeitspanne von mindestens 5 min, aber nicht länger als 90 min aufrechtzuerhalten.

20. Die Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 19, worin das Medikament dazu bestimmt ist, dem Patienten verabreicht zu werden, bevor arterielles Blut des Patienten an der Oberfläche vorbeigeleitet wird.

21. Die Verwendung nach Anspruch 20, worin arterielles Blut des Patienten entlang der Oberfläche geleitet wird, während die Peptidkonzentration in dem Blut mindestens 2 ug/ml beträgt.