DE3884565T2

DE3884565T2 - Hefe-Expressionssystem.

Info

Publication number: DE3884565T2
Application number: DE88310755T
Authority: DE
Inventors: Edward Hinchliffe; Enda Kenny
Original assignee: Delta Biotechnology Ltd
Current assignee: Albumedix Ltd
Priority date: 1987-11-18
Filing date: 1988-11-15
Publication date: 1994-05-11
Anticipated expiration: 2008-11-16
Also published as: ATE95242T1; EP0317254A1; DE3884565D1; JPH022380A; GB8726953D0; EP0317254B1

Description

Diese Erfindung betrifft das Gebiet rekombinanter DNA-Technologie. Insbesondere betrifft sie ein neues Hefeexpressionssystem.
In Hefe wird eine Genexpression zumindest teilweise durch Promotoren, die stromaufwärts der Strukturgene oder Kodierbereiche selbst liegen, gesteuert. Einige Hefepromotoren wurden isoliert und zur Expression von Fremdgenprodukten in Hefe benutzt. Die Promotoren besitzen die Eigenschaften des Genprodukts, das sie normalerweise exprimieren. Phosphoglyceratkinase (PGK) ist beispielsweise ein wesentliches Enzym, weswegen ihr Promotor - obwohl in Gegenwart fermentierbarer Kohlenstoffquellen, wie Glucose, etwas erhöht (Mellor und Mitarbeiter, 1983) - konstitutiv ist. Der PGK-Promotor wurde bereits zur Expression der verschiedensten heterologen Polypeptide in Hefe benutzt (Kingsman und Mitarbeiter, 1986).
Es kann in einem Verfahren von Vorteil sein, die Expression eines heterologen Polypeptids zu regulieren, und zwar insbesondere dann, wenn das Produkt für die Zelle schädlich ist oder - nachdem es einmal synthetisiert ist - einen raschen Abbau erfährt. Unter diesen Umständen besteht ein Bedarf nach einem induzierbaren Genexpressionssystem. Eines der am besten untersuchten regulierten Systeme in Hefe ist das die Expression der galactoseabbauenden Enzyme steuernde System.
In Abwesenheit von Galactose werden die durch Gene GAL 1, 7 und 10 kodierten abbauenden Enzyme nicht synthetisiert. Bei Zusatz von Galactose und in Abwesenheit von Glucose werden diese Gene rasch aktiviert, wobei der Grad an Transkription 1000 mal größer ist als die Mengen ohne Induktion (Hopper und Mitarbeiter, 1978; St. John und Davis, 1979). Die Aktivierung erfolgt durch ein durch das GAL4-Gen kodiertes Regulatorprotein. Die Anwesenheit von Galactose ermöglicht eine Bindung von GAL4 stromaufwärts der Strukturgene und fördert somit eine Expression. Diese Bindungsstelle wird als "stromaufwärts gelegene Aktivierungssequenz" oder "UAS" bezeichnet (Guarante und Mitarbeiter, 1982). Die Chromosomenanordnung der abbauenden Gene ist in Fig. 1 gezeigt (St. John and Davis, 1981; St. John und Mitarbeiter, 1981). Eine einzige UAS steuert die divergierende Transkription von GAL1 und GAL10.
Es hat sich gezeigt, daß eine Substitution der nativen UAS eines Promotors durch die GAL10 UAS die Galactoseinduzierbarkeit auf diesen Promotor überträgt (Guarante und Mitarbeiter, 1982). Es hat sich ferner gezeigt (vgl. die frühere Parallelanmeldung EP-A-258 067), daß die bei der Konstruktion eines PGK: GAL10 Hybridpromotors, induzierbar mit Galactose, benutzte GAL10 UAS in jeder Orientierung funktioniert, d. h., daß ein lineares DNA-Fragment mit der GAL10 UAS an die Stelle der nativen PGK UAS treten kann und unabhängig von der Orientierung des DNA- Fragments eine Galactoseregulierung zu übertragen vermag.
Es wurde weiterhin vorgeschlagen (EP-A-132 309), obwohl nicht belegt, daß es sich bei der (GAL10 Promotor- UAS-GAL1 Promotor) -Einheit um ein übertragbares, divergierendes Steuerelement mit der Eignung zur Verwendung mit und eingefügt zwischen zwei heterologe(n) Kodierbereiche(n) handelt. Was nicht gezeigt wurde, und sich auch nicht vorhersagen ließ, ist, daß die GAL UAS selbst (immer) noch als divergierendes Element wirkt, selbst wenn die betreffenden Promotoren auf jeder seiner Seite nicht aus den Promotoren, die dafür nativ sind, bestehen.
Es hat sich gezeigt, daß die GAL1/10 UAS nicht koordinativ die Transkription von 2 heterologen divergierenden Transkripten reguliert (Struhl, 1984).
Wir haben (nun) gefunden, daß die GAL UAS zur Kontrolle der divergierenden Transkription von zwei heterologen Promotoren in einem Hybridsystem verwendet werden kann. Wenn die GAL UAS in geeigneter Weise zwischen zwei Promotoren, denen eine UAS Sequenz fehlt, eingefügt wird, hat es sich gezeigt, daß die Transkription in beiden Promotoren durch die Anwesenheit von Galactose reguliert und eine divergierende Transkription erreicht wird.
Gegenstand einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine DNA-Sequenz, enthaltend die zwischen dem ersten und zweiten Transkriptionspromotor angeordnete GAL UAS, wobei die beiden Promotoren jeweils heterolog zu der UAS sind, sich zueinander in entgegengesetzter Orientierung befinden und funktionsfähig mit der UAS derart verknüpft sind, daß die UAS die Transkription von jedem dieser Promotoren aus aktivieren kann, wobei jeder Promotor aus einem Gen mit einer nativen UAS stammt und diese native UAS in der DNA-Sequenz nicht vorhanden ist.
Die Erfindung liefert ferner ein solches Element in Verbindung mit Kodierbereichen derart, daß jeder Promotor zwischen der GAL UAS und einem entsprechenden Kodierbereich für ein gewünschtes Polypeptid liegt. Die Promotoren und Kodierbereiche befinden sich selbstverständlich in einem geeigneten Leserahmen und in einer solchen Orientierung, daß die beiden Kodierbereiche in jeweils entgegengesetzten Richtungen unter Steuerung ihrer entsprechenden Promotoren zur Bildung von m-RNA mit Kodierung für die gewünschten Polypeptide transkribiert werden können.
Bei den verwendeten Promotoren sind in der Regel deren jeweilige UASen (falls vorhanden) deletiert. In einigen Fällen kann ein UAS-artiger Bereich, reich an Aen und Ten, jedoch ohne Bindung an ein Steuerprotein, fehlen, in anderen Fällen sollte er jedoch deletiert sein. Der Fachmann dürfte solche Modifikationen ohne übermäßigen Versuchsaufwand durchführen können.
Selbstverständlich werden entsprechend den üblichen Anforderungen für eine wirksame Transkription und Translation üblicherweise auch geeignete Stoppsignale, Kappsequenzen und dgl. eingebaut, wenn erfindungsgemäße Sequenzen in polypeptidliefernden Konstrukten verwendet werden sollen. Die beiden Kodierbereiche sollten nicht GAL1 bzw. GAL10 sein.
Die GAL UAS wurde bereits definiert (insbesondere von Giniger und Mitarbeitern, 1985 in "Cell" 40, 767-774).
Die UAS wirkt als Bindungsstelle für ein Aktivatorprotein, das Produkt des GAL4 Gens. Die GAL UAS wurde als 4 homologe 17 Basepaare lange Sequenzen mit Dyade-Symmetrie umfassend beschrieben. Es sind diese Sequenzen, die die Bindung des GAL4 Proteins innerhalb dieses Bereichs dirigieren. Ein solches Element stromaufwärts eines Promotors reicht aus, um eine Transkription zu aktivieren. Maximale Werte erreicht man jedoch (nur) mit Mehrfachkopien dieses Elements. So umfaßt hier und im folgenden der Ausdruck "GAL UAS" jede Sequenz, die das Produkt des GAL4 Gens bindet und/oder eine oder mehrere der 17 Basenpaare langen Sequenzen, der Übereinstimmungssequenzen oder nahezu übereinstimmender Sequenzen hiervon oder synthetischer Analoga hiervon ist (vgl. Giniger und Mitarbeiter, aaO, insbesondere Fig. 7 und die dazugehörige Legende). Bei Anwesenheit von mehr (als einer) 17 Basenpaare umfassenden Sequenz können diese gleich oder verschieden sein. Vorzugsweise sollte die UAS nicht aus lediglich der von Giniger und Mitarbeitern identifizierten vierten 17 Basepaare umfassenden Sequenz oder Wiederholungen derselben bestehen, da diese (als solche) offensichtlich das GAL4 Protein nicht sehr stark bindet. Die beiden Kodierbereiche können gleich oder verschieden sein. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kodiert ein Kodierbereich für Humanserumalbumin (HSA) und der andere für Urokinase. Wenn geeignet, können pro- oder prä-pro-Sequenzen eingebaut werden. Wenn die beiden Polypeptide verschieden sind, kann es zweckmäßig sein, daß das eine Polypeptid aus einem die erfindungsgemäße DNA- Sequenz beherbergenden Wirtmikroorganismus ausgeschieden und das andere Polypeptid intrazellulär produziert und gelagert wird, um die Reinigung der beiden Polypeptide zu erleichtern. So kann die DNA-Sequenz (i) für pro-HSA mit einer vorausgehenden geeigneten Signalsequenz, beispielsweise der nativen HSA-Signalsequenz oder der Hefe-alpha- Faktor-Signalsequenz, und ferner (ii) für pro Urokinase ohne irgendwelche Signalsequenz kodieren.
Unter Kontrolle eines der Promotoren kann (können) ein oder mehrere weitere(r) Kodierbereich(e) eingebaut werden, um Fusionsproteine zu liefern.
Weitere Ausführungsformen der Erfindung umfassen:
(a) einen Vektor mit der DNA-Sequenz und der Eignung zur Transformation eines Mikroorganismus; (b) ein Plasmid mit der DNA-Sequenz und der Fähigkeit zur Selbstreplikation in einem geeigneten Wirtbakterium, in einer geeigneten Wirtalge, in einem geeigneten Wirtpilz (einschließlich Hefe) oder in einer sonstigen Eukaryontenzelle (z. B. einer Säugetierzelle); (c) einen mit der DNA-Sequenz, entweder auf einem selbstreplizierenden Plasmid oder in das Chromosom integriert, transformierten Wirtmikroorganismus (d. h. eine Bakterien-, Algen-, Pilz- oder sonstige eukaryontische Zelle); (d) ein Verfahren zur Herstellung einer DNA-Sequenz der angegebenen Definition durch geeignete Manipulation von/oder Synthese von DNA- Fragmenten mit einem oder mehreren Teil(en) oder der Gesamtheit der GAL UAS, den Genpromotoren und den Kodierbereichen; (e) ein Verfahren zur Herstellung eines oder mehrerer Polypeptid(e) durch Fermentation eines Mikroorganismus gemäß (c) in einem geeigneten Medium einschließlich einer zur Aktivierung der GAL UAS ausreichenden Menge Galactose und (f) ein nach dem Verfahren (e) hergestelltes Polypeptid.
Wenn Hefe der unter (c) aufgeführte Wirtmikroorganismus ist, dann sind normalerweise die Elemente des Galactoseregulatorsystems, z. B. das GAL4 Gen, vorhanden, so daß die GAL UAS in üblicher Weise einwirken gelassen werden kann. Bei anderen Wirten kann es erforderlich sein, den Wirt mit solchen Elementen zu transformieren, damit die galactoseinduzierte Transkription der oben genannten Kodierbereiche ablaufen kann. Die Transformation von Säugetierzellen mit dem Hefe GAL4 Gen wurde von Kakidani & Ptashne, 1988, "Cell", 52, 161-167 und Webster und Mitarbeitern, 1988, "Cell", 52, 169-178 beschrieben. Die betreffenden Verfahren werden allgemein in dem Kapitel von Gorman in "DNA Cloning" Bd. III, (Herausgeber) D. Glover, 1986 beschrieben. Das GAL4 Gen kann in die Wirtzelle auf demselben Vektor wie die erfindungsgemäße Promotor-UAS- Promotor-Sequenz oder auf einem anderen Vektor geklont werden. Nachdem einmal im Wirt befindlich, kann das GAL4 Gen mit dem Chromosom integriert werden oder auf einem selbstreplizierenden Plasmid vorhanden sein. Das GAL4 Gen steht unter der Kontrolle eines geeigneten konstitutiven oder induzierbaren und mit der Wirtszelle verträglichen Promotors, beispielsweise des Mäusebrustdrüsentumorpromotors (MMTV) in einer Säugetierzellinie (Scheidereit und Mitarbeiter, 1983, "Nature", 304, 749-752).
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens (e) besitzt der Mikroorganismus (beispielsweise Laborhefe oder Brauereihefe) die Fähigkeit zu einer derartigen Sekretion und wird aus der Fermentationsbrühe gereinigt. Das zweite Polypeptid entsteht lediglich intrazellulär und wird aus aufgebrochenen Zellen des Mikroorganismus, die ihrerseits aus dem Fermentationsmedium abgetrennt wurden, gereinigt.
Eine Regulierung der Transkription läßt sich unter Verwendung von Hefewirten, die auf chemische oder physikalische Weise gesteuerte Repressoren liefern, bewerkstelligen. Verschiedene Corepressoren für die GAL Gene umfassen Glucose, Glycerin und das Produkt von GAL80 Gen. Eine positive Regulierung oder Aktivierung läßt sich mit Induktoren, wie Galactose, oder Aktivatoren, z. B. dem Produkt des GA14 Gens, erreichen. Statt einer chemischen Regulierung kann man sich auch Temperatur empfindlicher Mutationen bedienen. Diese gestatten die Regulierung durch Repression und/oder Aktivierung auf Grund von Temperaturänderungen entweder nach oben nach unten in der Regel im Bereich von etwa 20ºC bis 50ºC.
In Richtung stromabwärts von den Promotoren können die verschiedensten flankierenden Sequenzen für zahlreiche Funktionen vorhanden sein. Man kann dem Fragment kohäsive Enden oder stumpfe Ende verleihen, um es je nach der speziellen Situation zur Ligierung an andere DNA-Sequenzen zu befähigen. Man kann auch eine Spaltung unmittelbar stromabwärts vom Promotor herbeiführen, um die divergierende Promotorfunktions-DNA-Sequenz mit anderen Sequenzen mit den erforderlichen Transkriptions- und Translationssignalen zu vereinigen.
Gegebenenfalls kann man einen Terminus an einer Stelle stromabwärts vom Promotor, wo sämtliche Transkriptions- und Translationssteuersignale stromabwärts vom Promotor und mit diesem assoziiert entfernt wurden, haben. Andererseits kann man für einen Erhalt sämtlicher derartiger Transkriptions- und Translationsregulator- Sequenzen stromabwärts vom Promotor sorgen, jedoch das Initiationskodon und gegebenenfalls einige wenige Basen stromaufwärts vom Initiationskodon, in der Regel nicht mehr als etwa 20 Basen, zweckmäßigerweise nicht mehr als 10 Basen, entfernen.
Schließlich kann man in dem natürlicherweise mit den Promotoren assoziierten Kodierbereich an einer Stelle, die eine Vereinigung einer DNA-Sequenz im Rahmen mit den jeweiligen Initiationskodons gestattet, eine Spaltung durchführen. In letzterem Falle erhält man ein verschmolzenes Protein.
Ein Vorteil der Verwendung der erfindungsgemäßen GAL UAS anstelle der Verwendung getrennter UASen besteht darin, daß die relativen Mengen der beiden mRNAen und/oder Polypeptide beispielsweise auf 1/1 festgelegt werden können. Dies kann zweckmäßig sein, wenn die beiden Polypeptide Untereinheiten desselben Proteins oder Enzyme in demselben Stoffwechselpfad sind. Weiterhin führt die Anwesenheit lediglich einer UAS für die beiden Kodierbereich/Promotor-Systeme tendenziell zur einer Stabilitätserhöhung des Plasmids und zu einer Verminderung des Rekombinationsvorkommens. Die beiden Promotoren können produktiver oder für eine Expression des Kodierbereichs ansonsten besser geeignet sein als die GAL1 und GAL10 Promotoren gemäß der EPA-132 309.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung. In den Zeichnungen bedeuten:
Fig. 1 eine schematische Darstellung des divergierenden GAL1-GAL10 Promotorbereichs von S. cerevisiae;
Fig. 2 die Konstruktion der UAS GAL Plasmide pDB1 und pDB2;
Fig. 3 eine Restriktionsenzymkarte des Plasmids pKV50;
Fig. 4 eine Restriktionsenzymkarte von pEX-2 (aus Ernst und Chan, 1985; Gatignol und Mitarbeiter, 1987);
Fig. 5 eine Restriktionsenzymkarte von pEK30;
Fig. 6 eine Restriktionsenzymkarte von pEK113 (Hinchliffe and Kenny, 1986), worin der schwarze Block pBR322 DNA und der offene Block Met-HSA DNA repräsentieren;
Fig. 7 eine Restriktionsenzymkarte von pDBUro1, in welcher die Sequenz des N-terminalen Kodierbereichs und 5'-Bereichs dargestellt ist;
Fig. 8 eine Restriktionsenzymkarte von pEK31;
Fig. 9 eine Restriktionsenzymkarte von pSJ22;
Fig. 10 eine schematische Darstellung eines Western
Blot zum Beleg für die intrazelluläre Expression von pro- Urokinase und HSA in pSJ22. Die Spuren 1 bis 4 bzw. 5 bis 8 entsprechen Immunoblots unter Verwendung von pro-Urokinase, bzw. HSA-Antiseren. Die Auftragreihenfolge ist folgende:
Spuren 1 und 5; induziert, lösliche Zellfraktion
Spuren 2 und 7; induziert, unlösliche Zellfraktion
Spuren 3 und 6; uninduziert, unlösliche Zellfraktionen
Spuren 4 und 8; Urokinase bzw. HSA-Standard;
Fig. 11 eine Restriktionsenzymkarte von pET13:1 (Henderson und Mitarbeiter, 1985);
Fig. 12 eine Restriktionsenzymkarte von pSJ22a;
Fig. 13 die Nucleotidsequenz eines 255 Basenpaare umfassenden BamH1-HindIII-Fragments mit Kodierung für eine Teil-MF-alpha-1-prä-pro-Sequenz. Diese wurde durch Ligieren des synthetischen 1-1a, 2-2a und 3-3a duplizierten Oligonucleotids synthetisiert. Die durchgezogenen Linien bezeichnen die einzelnen Oligonucleotide. Dieses Fragment wurde dann zwischen die BamHI- und HindIII-Stellen von M13mp19 eingefügt, um mp19 alpha herzustellen;
Fig. 14 die Konstruktion des Plasmids mp19.7 alpha 1;
Fig. 15 die Konstruktion des Plasmids mp19 alpha 2;
Fig. 16 die Struktur von pEK44 und
Fig. 17 eine Restriktionsenzymkarte von pEK72, in der das HSA-Transkript eine MF-alpha1-Verschmelzung ist, derart, daß das gebildete Polypeptid sekretiert bzw. ausgeschieden wird. u-PA ist N-Methionyl und wird intrazellulär bzw. in der Zelle festgehalten.

Beispiel 1: Laborhefe-HSA/Urokinase

Die Konstruktionsstrategie für die erfindungsgemäße DNA-Sequenz war folgende: zunächst wurde die PGK UAS deletiert und durch die GAL UAS substituiert. Dies erreichte man dadurch, daß unmittelbar 5' zu UAS und distal zum PGK-Promotor eine einzige Restriktionsstelle plaziert wurde. Schließlich wurde der CYC-1 Promotor an der einzigen Stelle in einer solchen Orientierung, daß die Transkription in Bezug auf die durch den PGK-Promotor dirigierte Transkription divergiert, insertiert bzw. eingefügt. Das endgültige Konstrukt enthielt auch zur Insertion heterologer Gene für eine Expression geeignete Restriktionsstellen.
Bei der DNA-Manipulation bediente man sich Standardverfahren (Maniatis und Mitarbeiter (1982)). Die Restriktionsenzyme und sonstige Enzyme wurden entsprechend der Herstellervorschrift eingesetzt. Unter Benutzung der Phosphoramiditchemie wurden auf einem Applied Biosystems 380B-Gerät unter Verwendung von vom Hersteller gelieferten Reagenzien (Applied Biosystems Inc., Foster City, California) Oligonucleotide synthetisiert.
Andere allgemeine Verfahren, z. B. die Transformation von E.coli und von Hefestämmen, die Herstellung von Zellextrakten, die SDS-Elektrophorese und das Immunblotting wurden entsprechend den Angaben von Hinchliffe und Kenny (1986) durchgeführt.

Deletion der PGK UAS

Die Deletion der PGK UAS wurde durch enzymatische Verdauung des 5'-nicht-Kodierbereichs des PGK-Gen bewerkstelligt. Die Deletion wurde in zwei Richtungen wie folgt durchgeführt: Zunächst erreichte man 5'- bis 3'-Deletionen in einem Derivat des Plasmids pMA27 (Mellor und Mitarbeiter, 1983), in dem die ClaI-Stelle an der Stellung-800 im PGK 5'-nicht-Kodierbereich zunächst unter Verwendung eines synthetischen Oligonucleotidlinkers in eine einzige XhoI-Restriktionsstelle umgewandelt worden war. Danach wurde dieses pMA27-Derivat mit XhoI gespalten und mit BAL31-Exonuclease verdaut. Die Plasmide wurden durch Ligieren in Gegenwart von BamHI synthetischen Oligonucleotidinkern wieder zu einem Ring geschlossen und in E.coli transformiert. Die Deletionsendpunkte wurden durch DNA-Sequenzieren charakterisiert. Die Deletionen in der 3'- bis 5'-Richtung wurden mittels einer ähnlichen Modifizierung von pMA22a (Dobson und Mitarbeiter, 1982) durchgeführt. Lediglich in diesem letzteren Falle wurde das Plasmid vor der BAL31-Exonucleasebehandlung mit BamHI verdaut. Wie zuvor wurden die Deletionsendpunkte durch DNA-Sequenzanalyse bestimmt.
Das Plasmid pDB4 wurde durch Ligieren der geeigneten BamHI-PstI-Fragmente von den 5'- und 3'-Deletionsderivaten konstruiert. Das Plasmid pDB4 zeigte eine Deletion zwischen (den) Koordinaten -423 und -470 einschließlich der PGK UAS selbst. Das Plasmid pDB4 ist folglich mit dem Mutterplasmid pMA27 mit Ausnahme der Deletion im 5'- nicht-Kodierbereich des PGK-Gens identisch. Nach Transformation in Hefe überträgt dieser Vektor trotz Vorliegens im Mehrfachkopiezustand lediglich etwas mehr als Wirtchromosomenmengen von PGK-Protein.
Konstruktion eines galactoseinduzierbaren PGK-Gens Die Organisation des GAL1-GAL10 divergierenden Promotors ist in Fig. 1 dargestellt. Der Funktionsbereich der UAS wurde lokalisiert (West und Mitarbeiter, 1984). Seine Lage ist längs der flankierenden Restriktionsstellen angezeigt. Die GAL10 UAS findet sich auf dem Plasmid pLGSD5 (Guarante und Mitarbeiter, 1982). Das 144Bp lange RsaI-AluI DNA-Fragment von pLGSD5 wurde isoliert und am stumpfen Ende mit der SmaI-Stelle von pUC8 zur Bildung von pDB1 (Fig. 2) ligiert. Danach wurde die einzige Eco- Ri-Stelle von pDB1 durch Insertion eines BglII Oligonucleotid-Linkers (Fig. 2) in eine BglII-Stelle umgewandelt. So ließ sich die GAL10 UAS auf einem einzigen BglII-BamHI-DNA-Fragment isolieren. Dieses Fragment wurde anschließend in die einzige BamHI-Stelle in pDB4 geklont. Von dem erhaltenen Plasmid pKV44 konnte gezeigt werden, daß es für ein galactoseregulierbares PGK Gen kodierte. In Abwesenheit von Galactose wurden bei pKV44 beherbergenden Hefen ähnliche PGK-Mengen wie bei pDB4 gefunden. Nach Zusatz von Galactose und in Abwesenheit von Glucose war bei Stämmen, die pKV44 beherbergten, eine deutliche Expressionserhöhung feststellbar, während sich bei pDB4 beherbergenden Stämmen die Expressionsmengen an PGK unverändert blieben.

Konstruktion von GAL10: PKG Expressionsvektor

Das Plasmid pDB4 wurde an der im 3'-Bereich des PGK- Strukturgens lokalisierten einzigen BglII-Stelle verdaut. Das lineare Molekül wurde mit Bal31-Exonuclease verdaut. Die DNA-Fragmente wurden eingefüllt und in Gegenwart von BglII-Oligonucleotid-Linkern ligiert. Die hierbei erhaltenen Plasmide wurden durch DNA-Sequenz-Analyse zur Bestimmung des Deletionsendpunkts gescreent. Unter anderem wurde ein Deletant mit einem Endpunkt in Stellung-8 in Bezug auf die PGK-Kodiersequenz erhalten.
Das erhaltene Deletionsderivat wurde durch Anbringen der 3'-Transkriptionsterminatorsequenz des PGK-Gens weiter modifiziert. Dies erreichte man durch Verdauen des Plasmids mit BglII und PstI und anschließendes Ligieren des hierbei erhaltenen großen Fragments mit dem kleinen BglII-PstI-Fragment mit dem 3'-Transkriptionsterminator des PGK-Gens aus dem Plasmid pMA91 (Mellor und Mitarbeiter, 1983). Das erhaltene Plasmid wurde durch Insertion bzw. Einfügen der GAL10 UAS weiter modifiziert. Zu diesem Zweck wurde das BglII-BamHI-Fragment aus pDB2 (Fig. 2) isoliert und an der einzigen BamHI-Stelle eingefügt, wobei das Plasmid pKV50 (Fig. 3) erhalten wurde. Die Orientierung der UAS-Stelle in letzterem Plasmid ist derart, daß die reformierte BamHI-Stelle distal zum PGK-Promotor liegt.
Klonen des CYC-1-Promotors und Deletion von UAS-Sequenzen Das Cytochrom C-1-Gen und seine 5'- und 3'-Flankenbereiche wurden geklont und ihre DNA-Sequenz bestimmt (Smith und Mitarbeiter, 1979). Ein auf diesen Flankierbereichen basierender Expressionsvektor wurde bereits beschrieben (Ernst und Chan, 1985) und ist in Fig. 3 dargestellt. Dieses Plasmid, pEX-2, enthält den Promotor und Terminator eingefügt zwischen einem EcoR1-SmaI-BamHI-Klonier-Linker, in welchen zur Expression heterologe Gene eingefügt werden können. Der Promotorbereich enthält kein Initiationskodon, da der Promotor von der CYC1-13-Mutante, in der dieses letztere Kodon zu ATA mutiert worden war, herrührt. Folglich beginnt eine Translation am ersten Initiationskodon 3' zu dieser Lage.
Die Lagen der UAS in dem 5'-Bereich sind bekannt. Diese liegen zwischen der XhoI- und der SmaI-Stelle, wie aus Fig. 4 hervorgeht (McNeill und Smith, 1986). Wie gezeigt, umfaßt das 0,5kB lange HindIII-XhoI-Fragment aus pEX-2 den Transkriptionsterminator, den Klonierungs-Linker und den Promotor, jedoch nicht die UAS-Sequenzen.

Die Konstruktion des bidirektionalen Promotors

Diese läßt sich durch Plazieren des beschriebenen 0,5kB langen HindIII-XhoI-Fragments in Nachbarschaft zu der GAL10 UAS in pKV50 distal zum PGK-Promotor und Ablesen des gegenüberliegenden Wegs vom PGK-Promotor bewerkstelligen. So wird pKV50 mit BamHI verdaut und durch Behandeln mit Klenow-Polymerase glattendig gemacht. Danach wurde an diese Spezies das selbst glattendig gemachte 0,5 kb-Fragment ligiert (Fig. 4). Das promotorhaltige Fragment kann in jeder Orientierung eingefügt werden. Das korrekt orientierte Klon, d. h. dasjenige mit dem Terminator distal zu der UAS, ist in Fig. 5 dargestellt und wird mit pEK30 bezeichnet.

Induktion von zwei heterologen Proteinen über einen bidirektionalen Promotor

Die Brauchbarkeit des bidirektionalen Promotors wurde durch die Expression von HSA und pro-Urokinase demonstriert. Das HSA-Gen wurde in der von Hinchliffe und Kenny (1986) beschriebenen Weise konstruiert und aus dem Plasmid pEK113 (vgl. Fig. 6) erhalten. Das Gen für pro- Urokinase wurde aus dem Plasmid pDBUro1 (Fig. 7) isoliert. Dieses Plasmid enthält das pro-Urokinasestrukturgen cDNA, geklont, wie von Heyneker und Mitarbeitern (1986) beschrieben. Die DNA-Sequenz in pDBUro1 wurde jedoch am N-terminalen Kodierbereich zur Kodierung für Methionyl-pro-Urokinase derart modifiziert, daß das reife Genprodukt aus einer Transkriptionsfusion ebenso wie das aus pEX-2 oder pKV50 (vgl. oben), die selbst keine Initiatorkodons enthalten, gebildete exprimiert werden kann. Die Sequenz dieses Genteils ist in Fig. 7 dargestellt.

Subklonierung von HSA

Das 1,8kB lange BamHI-Fragment aus pEK113 (Hinchliffe und Kenny, 1986) wurde isoliert und in die BglII- Stelle von pEK30 geklont, wobei das Plasmid pEK31 (Fig. 8) erhalten wurde.

Subklonierung von pro-Urokinase

Das Plasmid pEK31 wurde mit SmaI verdaut und an das 1,6kB lange HindIII-SacI-Fragment aus pDBUro1, dessen Enden durch Behandeln mit T4 DNA-Polymerase geglättet worden waren, ligiert. SacI hinterläßt eine 3'-Extension, die bei dieser Reaktion entfernt wird. Dagegen wird die 5'-Extension eingefüllt. Das Fragment und der Vektor wurden ligiert, wobei das in Fig. 9 dargestellte Plasmid PSJ22 erhalten wird.
Das Plasmid PSJ22 wurde in den für Leucin Prototroph selektierten Hefestamm DBY745 transformiert. Ein einzelner Transformant DBY745 (pSJ22) wurde wie folgt auf eine HSA- und pro-Urokinaseproduktion analysiert.
Der Stamm wurde in Minimalmedium (vgl. Hawthorne und Mortimer (1960)) mit 2% g/v Glucose als Kohlenstofflieferant gezüchtet, bis die OD&sub6;&sub0;&sub0; 1,0 erreichte. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Kultur geerntet, eine kleine Probe entfernt und der Rest bis zu demselben OD&sub6;&sub0;&sub0;-Wert in mit 2% g/v Galactose als Kohlenstofflieferant ergänztem Minimalmedium resuspendiert. Nach weiterem 24stündigem Inkubieren wurde die Kultur geerntet. Aus der induzierten Kultur und der nicht-induzierten Probe wurden Zellextrakte präpariert. Die Proteinkomponenten der Extrakte wurden durch Polyacrylamidgelelektrophorese aufgespalten und immunogeblottet (Hinchliffe und Kenny 1986). Die Ergebnisse sind in Fig. 10 dargestellt. Die Proben wurden doppelt aufgegeben, ein Satz wurde mit Urokinaseantikörpern, der andere mit HSA-Antikörpern geprüft bzw. sondiert. Standards für beide Proteine wurden mitverwendet.
Wie gezeigt, ist pro-Urokinase in der vorinduzierten Probe nicht nachweisbar. In derselben Probe sind lediglich geringe Menge HSA zu beobachten. Nach der Induktion findet sich Urokinase. Die HSA-Expression stieg wesentlich über den Hintergrundwert an.
Diese Daten belegen die Brauchbarkeit des bidirektionalen Expressionssystems.

Beispiel 2: Brauereihefe

Ähnliche Ergebnisse lassen sich mit Industriehefestämmen, insbesondere Brauereihefen, erreichen. In letzterem Falle kann man jedoch zunächst einen geeigneten selektierbaren Marker für eine Transformantenselektion, z. B. das CUP-1-Gen, der für eine Widerstandsfähigkeit gegen erhöhte Kupferionenspiegel sorgt, einführen (Henderson und Mitarbeiter, 1985).
Das CUP-1-Gen läßt sich aus dem Plasmid pET13 : 1 (Henderson und Mitarbeiter, 1985), dessen Struktur schematisch in Fig. 11 dargestellt ist, erhalten. Dieses kodiert für das CUP-1-Gen auf einem 2kB langen KpnI-Fragment. Folglich läßt sich das Plasmid pSJ22 mit KpnI verdauen und mit dem genannten Fragment zu pSJ22a ligieren (vgl. Fig. 12). Danach kann dieses Plasmid in der von Hinchliffe und Kenny (1986) beschriebenen Weise in einen hinsichtlich einer Kupferresistenz selektierten Stamm BB10.2 transformiert werden.

Beispiel 3

Intrazelluläre Expression von pro-Urokinase

In diesem Beispiel wurde unter Verwendung des bidirektionalen Expressionssystems, welches die induzierte Synthese von HSA und pro-Urokinase derart gestattete, daß letztere wie in Beispiel 1 intrazellulär zurückgehalten, HSA jedoch in das Kulturmedium ausgeschieden wurde, ein Plasmid konstruiert. Dies erreichte man durch Anordnen der Hefe MFalpha-1-Gensignalsequenz (prä-pro-Sequenz) unmittelbar 5' zum Strukturgen für HSA.
Konstruktion der MFalpha-1-prä-pro-Kodiersequenz Die MFalpha-1-prä-pro-Sequenz wurde nach der veröffentlichten Sequenz (Piggott und Mitarbeiter, 1987 in "Current Genetics" 12, 561-567) als eine Reihe von Oligonucleotiden konstruiert (vgl. Fig. 13). Letztere wurden nach der von Heaphy und Mitarbeitern in "Protein Engineering" 1, 425-431, 1987 beschriebenen Methode zusammengefügt. Die Oligonucleotide wurden zunächst, wie von Heaphy und Mitarbeitern beschrieben, enzymatisch phosphoryliert, gemischt und ligiert. Die Oligonucleotide 1 und 3a wurden nicht-phosphoryliert gelassen. Nach dem Ligieren wurde das gewünschte Fragment in M13mp19 (Messing, 1983 in "Methods in Enzymology" 101, 20-78) zwischen die BamHI- und die HindIII-Stelle geklont, wobei mp19alpha erhalten wurde.

Befestigen der MFalpha-1-prä-pro-Sequenz an HSA

Zunächst wurde mp19.7 (Hinchliffe und Kenny, 1986) mit XhoI und S1 Nuclease verdaut und mit einem synthetischen Oligonucleotid ligiert, wobei mp19.7alpha1 (Fig. 14) erhalten wurde. Letzteres Molekül wurde danach mit XbaI und SalI verdaut und mit in ähnlicher Weise verdautem pEK112 ligiert, wobei mp19.7alpha2 (vgl. Fig. 15) erhalten wurde. pEK112 ist im wesentlichen mit pEK113 (Hinchliffe und Kenny, 1986) identisch, jedoch mit der Ausnahme, daß das Insert mit Kodierung für HSA in ersterem Molekül in entgegengesetzter Orientierung vorliegt.
Diese Substitution plazierte eine BamHI Stelle 3' zur HSA-Strukturgensequenz. Schließlich wurde das 0,25 kB lange BamHI-HindIII-Fragment von mp19alpha an das 1,8kB lange BamHI-HindIII-Fragment von mp19alpha2 ligiert.
Dieses Gemisch wurde mit BglII-verdautem pEK30 ligiert, wobei pEK44 (Fig. 16) erhalten wurde.

Kolonierung des pro-Urokinasegens in pEK44

Das Plasmid pEK44 wurde mit SmaI verdaut und mit dem stumpfendigen SacI-HindIII-Fragment aus pDBUrol mit Kodierung für Met-u-PA ligiert. Hierbei entstand das bidirektionale Expressionsplasmid pEK72 (Fig. 17). Dieses ist im wesentlichen mit dem Plasmid pSJ22 identisch, wobei jedoch dem Gen mit Kodierung für reifes HSA die MFalpha- 1-prä-pro-Sequenz vorgeschaltet ist.

Transformantenanalyse

Die Plasmide pEK44 und pEK72 wurden in die Wirthefe DBY745 transformiert. Sowohl aus den induzierten als auch nicht-induzierten Kulturen wurden wie zuvor beschrieben Extrakte präpariert. In diesem Falle wurde jedoch unter Benutzung der Techniken einer SDS-Elektrophorese und des Western-Blotting die intrazelluläre Fraktion auf pro-Urokinase und das Kulturmedium auf HSA analysiert. Die erhaltenen Ergebnisse waren vergleichbar und stimmten überein mit den früheren Ergebnissen für pSJ22. pEK72 dirigierte in Abwesenheit von Galactose nur eine geringe HSA-Sekretionsmenge, die jedoch mit Galactose merklich zunahm.
Von den pEK72 und pEK44-Transformanten wurden ähnliche Mengen HSA ausgeschieden. In intrazellulären Extrakten aus pEK44-Kulturen oder nicht-induzierten pEK72-Kulturen konnte keine pro-Urokinase nachgewiesen werden. Sie ließ sich lediglich in mit Galactose induzierten pEK72- Kulturen feststellen.
Auch diese Daten belegen die Brauchbarkeit des bidirektionalen Promotorsystems.
Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung umfassen die zuvor beschriebenen neuen Plasmide, einschließlich pKV50, pEK30, pEK31, pSJ22 und pSJ22a, sowie die mit pSJ22a transformierte Hefe, insbesondere Brauereihefe.

Literaturhinweise

Dobson et al, (1982), Nucleic Acids Res., 10, 2625-2637.
Gatignol, A., Baron, M and Tiraby, G. (1987) Mol. Gen. Genet. 207, 342-348.
Giniger, E., Varnum, S.M. and Ptashne, M. (1985), Cell 40, 767-774.
Gorman, c. (1986) in "DNA Cloning" Volume III, (Ed.) Glover, D., IRL Press, Oxford.
Guarante, L., Yocum, R.R., and Gifford, P. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 7410-7414.
Hawthorne, D.C. and Mortimer, R.K. (1960) Genetics 45, 1085-1110.
Heaphy et al, (1957) Protein Engineering 1, 425-431.
Henderson, R.C.A., Cox, B.S. and Tubb, R. (1985), Curr. Genet. 9, 133.
Heyneker, H.L., Holmes, W.E. and Vehar, G.A. (1986) U.K. Patent 2121050B.
Hinchliffe, E. and Kenny, E. (1986) EP-A-201 239 Hopper, J.E., Broach, J.R., and Rowe, L.B. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 2878-2882.
Kakidani, H. and ptashne, M. (1988) Cell, 52, 161-167.
Kingsman, S.M., Kingsman A.J., and Mellor, J. (1986) TIBTECH 5, 53-57.
Maniatis, T., Fritsch, E.F. and Sambrook, J. (1982) Molecular Cioning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., USA.
McNeill, J.B., and Smith, M. (1986) J. Mol. Biol. 187, 363-378.
Mellor, J., Dobson, M.J., Roberts, N.A., Tuite, M.F., Emtage, J.S., White, S., Lowe, P.A., Patel, T., Kingsman, A.J. and Kingsman, S.M. (1983) Gene, 24, 1-14.
Messing, (1983) Methods in Enzymology 101, 20-78.
Piggott et Aal (1987) Current Genetics 12, 561-567.
Scheidereit, C. et al, (1983) Nature 304, 749-752.
Smith, M., Leung, D.W., Gillam, S., and Astell, C.R., (1979) Cell, 16, 753-761.
St. John, T., Schrerer, S., MoDonnell, M., and David, R. (1981) J. Mol.Biol, 152, 317-334,
St. John, T., and David, R. (1981) J Mol. Biol. 152, 285-315.
St. John, T., and Davis, R. (1979) Cell 16, 443-452.
Struhl, K. (1984) Proc, Natl. Acad. Sci USA 81, 7865-7869 Webster, N. et al (1988) Cell, 52, 169-178
West, R.W. et al., (1984) Mol. Cell. Biol. 4, 2467- TEXT FEHLT

Claims

1. DNA-Sequenz, enthaltend die zwischen ersten und zweiten Transkriptionspromotor angeordnete GAL UAS, wobei die beiden Promotoren jeweils heterolog zu der UAS sind, sich zueinander in entgegengesetzter Orientierung befinden und unter Erhaltung der Funktionsfähigkeit mit der UAS derart verknüpft sind, daß die UAS die Transkription von jedem dieser Promotoren aus aktivieren kann, wobei jeder Promotor aus einem Gen mit einer nativen UAS stammt und diese native UAS in der DNA- Sequenz nicht vorhanden ist.

2. Sequenz nach Anspruch 1, die zusätzlich zwei codierende Regionen enthält, welche jeweils auf der von der GAL UAS abgewandten Seite der beiden Promotoren liegen und sich im korrekten Leserahmen mit den Promotoren befinden, unter der Bedingung, daß die codierenden Regionen nicht diejenigen für GAL1 bzw. GAL10 sind.

3. Sequenz nach Anspruch 2, worin die codierenden Regionen für Humanserumalbumin (HSA) bzw. Urokinase codieren.

4. Sequenz nach Anspruch 3, worin eine der codierenden Regionen an ihrem 5'-Ende eine für eine Aminosäuresequenz codierende Anfangsregion aufweist, die so gewählt ist, daß das aus dieser codierenden Region translatierte Polypeptid an seinem N-Terminus mit dieser Aminosäuresequenz verknüpft ist und aus einer Wirtszelle, in welcher sich die DNA-Sequenz für die Transkription und die Translation befindet, sezerniert wird.

5. Sequenz nach einem der voranstehenden Ansprüche, worin die GAL UAS mehrfache Kopien von einer oder mehreren der vier homologen, 17 Basenpaare langen Sequenz(en) umfaßt, die GAL4-Protein in Hefe binden.

6. Vektor, enthaltend eine Sequenz nach einem der voranstehenden Ansprüche, der sich für die Transformierung eines Mikroorganismus eignet.

7. Plasmid nach Anspruch 6, welches in der Lage ist, sich in Hefe selbst zu replizieren.

8. Hefezelle, die mit einem Plasmid nach Anspruch 7 transformiert ist.

9. Verfahren zum Herstellen von zwei oder mehreren Polypeptiden durch Fermentierung einer Hefezelle nach Anspruch 8 in einem geeigneten Medium, das ausreichend Galaktose enthält, um die GAL UAS zu aktivieren.