DE69025175T2

DE69025175T2 - Automatisches gerät für einen stufenweisen immuntest mindestens einer biologischen substanz in einer mehrzahl von proben, verfahren und reagens die besagtes gerät gebrauchen

Info

Publication number: DE69025175T2
Application number: DE69025175T
Authority: DE
Inventors: Thierry Gicquel; Edouard Lentwojt; Dario Narminio; Michel Uzan
Original assignee: Laboratoires Merck Clevenot SA
Current assignee: Merck SA
Priority date: 1989-11-17
Filing date: 1990-11-16
Publication date: 1996-09-12
Anticipated expiration: 2010-11-17
Also published as: CA2044588A1; DE454826T1; EP0679891A2; ES2027631T3; ES2027631T1; EP0679891A3; AU643732B2; DE69025175D1; JP3142868B2; RU2102758C1; FR2654836A1; FR2654836B1; US5736413A; AU6754890A; CN1053682A; GR3019803T3; CN1042172C; EP0454826B1; IN171967B; ATE133789T1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung zum automatischen Durchführen eines Immuntests in einer Mehrzahl von aufeinanderfolgenden Stufen an zumindest einer biologischen Substanz in einer Mehrzahl von biologischen Proben, sowie auf ein Verfahren und ein Reagens zur Verwendung mit dieser Vorrichtung.
Die Erfindung wird insbesondere zur simultanen Detektion von Liganden, Antiliganden, Haptenen oder anderen, gegebenenfalls in dem zu analysierenden biologischen Fluidum vorhandenen biologischen Substanzen einer einzelnen Probe verwendet, ist aber nicht darauf eingeschränkt.
Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder der Konzentration von Liganden oder biologischen Substanzen in biologischen Fuida auf immunologischem Weg sind bereits bekannt. Sie basieren auf der Bildung eines Komplexes zwischen der zu bestimmenden Substanz und einem oder mehreren Antikörpern, wobei einer der Bestandteile des Komplexes insbesondere mit einem Enzym markiert werden kann, um seine Detektion und/oder quantitative Analyse nach Trennung des markierten Antigen- oder des Antikörperkomplexes von dem nicht markierten Antigen- oder Antikörperkomplexes zu ermöglichen.
Die Prinzipien des RIA- und des ELISA-Verfahrens sind ebenso bekannt.
Insbesondere ist das ELISA-Verfahren Enzyme linked immunosorbent assay) ein immunenzymatisches Verfahren mit großer Empfindlichkeit bei der Titrierung von Antikörpern, das beispielsweise die Verwendung eines komplexen Immun-Adsorbens umfaßt, welches insbesondere ein Antigen bildet, das an einem festen Träger fixiert ist, um die in dem biologischen Medium, wie das zu testende Serum, enthaltenen spezifischen Antikörper aufzunehmen, wobei der so erhaltene Immunkomplex durch einen mit einem Enzym markierten Antikörper festgestellt wird, nachdem man dem Enzym ein spezifisches Substrat hinzugefügt hat, dessen Zersetzung durch das Enzym ein farbiges Produkt zum Vorschein bringt. Die Intensität der Färbung ist proportional zu der Menge der reagierenden Enzyme und folglich der Menge an Antikörpern in dem getesteten biologischen Medium. Die Farbintensität kann durch das Auge beurteilt oder mit jedem geeigneten Mittel gemessen werden, insbesondere durch Photometrie.
Bei immunologischen Verfahren der obigen Art wird eine heterogene Phase verwendet, wobei die Eigenschaften der festen Phase, welche den Träger für die immunologische Reaktion bildet, sehr wichtig sind, da sie die Empfindlichkeit der Messung bestimmen.
Die Träger, die für den ELISA-Test vorgeschlagen wurden, sind insbesondere Körner aus Polyacrylamid aktiviert mit Glutaraldehyd (AVRAMEAS und TERNYNK, Immunochemistry, 1969, 6, Seiten 53-65), Zelluloseteilchen aktiviert mit dem Bromid des Zyanogens, an welchen die Antikörper durch kovalente Bindung befestigt sind (ENGVALL und PERLMANN, Immunochemistry, 1971, 8, 871-874), Polystyrolröhren, an deren Oberflächen die Antigene durch einfache physikalische Adsorption anhaften (ENGVALL und PERLMANN, J. Imm. 1972, 160, 129-136), Papierscheiben, die mit dem Bromid des Zyanogens aktiviert sind und an welchen ein Antikörper oder Antigen befestigt ist (BRIGHTON und Coll. Scand. 1974, 29, 166-174). Die derzeit am weitesten verbreiteten Träger weisen jedoch Kunststoffoberflächen auf, die im Form von Mikroplatten mit 96 Schächten mit ebenem, U- oder V-förmigem Boden aus Polystyrol oder PVC oder als Streifen mit 8 Schächten ausgebildet sind.
Ein anderer Träger, der durch magnetische Kugeln gebildet wird, ist ebenso bereits beschrieben worden und ermöglicht eine Automatisierung der Durchführung des Verfahrens.
Insbesondere sind zu nennen: die magnetischen Kugeln, die in dem europäischen Patent 38 730 von RHONE POULENC SPECIAITES CHIMIQUES als magnetisches Latexpolymer beschrieben sind, die magnetischen Kugeln, die in dem europäischen Patent 125 995 von ADVANCED MAGNETICS INC. beschrieben sind, die in dem französischen Patent 2 262 805 und 2 454 098 von CORNING GLASS WORKS beschriebenen Kugeln oder die Kugeln, die in den europäischen Anmeldungen von SERONO DIAGNOSTICS PARTNERS, 105 714, 190 006, 238 353, 249 357 beschrieben sind.
Der in Clin. Chim. Acta, 1978, 84, 69-84 erschienene Artikel bezieht sich auf T&sub4;-Tests (immunologische und nicht immunologische), bei welchen magnetische Mikroteilchen aus Albumin zur Trennung des freien T&sub4; in einer komplexen Probe verwendet werden. Das freie T&sub4; verbindet sich mit dem Albumin durch Adsorption an den magnetischen Mikroteilchen aus Albumin.
Die in den oben genannten Druckschriften beschriebenen unterschiedlichen magnetischen Kugeln sind ebenso zur Anwendung in einem Immuntest wie ELISA oder RIA verwendbar.
Das RIA-Verfahren kann ebenso wie das ELISA-Verfahren auf verschiedene Arten durchgeführt werden:
- Das indirekte Verfahren ist das einfachste zum Bestimmen von Antikörpern. Das Antigen ist an der Mikroplatte befestigt (in Anwesenheit von Albumin, um die nicht belegten Stellen zu blockieren). Das zu bestimmende Serum wird zugefügt und die Befestigung des Antikörpers wird durch Addition des richtig markierten Antikörpers Anti-Ig detektiert, der insbesondere an ein Enzym gekoppelt ist und quantitativ nach Addition des Enzymsubstrates spektrometrisch nachgewiesen wird.
- Ein Konkurrenzverfahren kann verwendet werden, um die Antigene zu bestimmen. Wie nach dem obigen Stand der Technik ist ständig das Antigen an den Platten befestigt. Eine Mischung von Antigenen und geringen Mengen von Antikörpern wird zugegeben. Die Menge der an der Platte befestigten Antikörper vermindert sich um die von den Antigenmolekülen neutralisierten Antikörpermoleküle.
- Das Sandwich-Verfahren oder zweistufige Verfahren wird verwendet, um Antigene oder Antikörper zu bestimmen. Zum Bestimmen von Antigenen werden die Mikroplatten mit Antikörpern bedeckt und die Antikörper werden zugegeben, wonach die spezifischen, mit einem geeigneten Stoff markierten Antikörper, die insbesondere an ein Enzym gekoppelt sind, eingesetzt und durch Addition mit dem Substrat erkennbar werden. Das Verfahren kann jedoch nur für divalente Antigene verwendet werden oder besitzt mehrere Lösungen. Um Antikörper zu bestimmen, werden die Mikroplatten im Gegensatz dazu mit Antigenen bedeckt und es werden nach und nach die zu bestimmenden Antikörper und das durch ein Enzym markierte Antigen zugegeben.
Solche Verfahren sind nicht immer automatisierbar, da sie nicht das automatische Bestimmen zumindest einer Substanz in einer Mehrzahl von Proben ermöglichen. Tatsächlich ermöglicht die Durchführung dieser unterschiedlichen Verfahren nur das serielle Bestimmen eines Typs (Konkurrenz, Sandwich oder Immunaufnahme), Parameter für Parameter, sowohl bei kontinuierlichem Durchsatz als auch bei diskontinuierlichem Durchsatz in geringer zeitlicher Aufeinanderfolge.
Die Anmeldung WO 88/02866 beschreibt eine Vorrichtung zur automatischen heterogenphasigen immunologischen Bestimmung unter Verwendung einer Transferscheibe, die Reaktionsröhren enthält und das Durchführen einer großen Anzahl von Tests unterschiedlicher Art ermöglicht, in dem die Inkubationsperiode in Abhängigkeit des zu analysierenden Stoffes und des Reagens verändert wird (Seite 3, Zeilen 1-13).
Die Anmeldung EP 355 823 beschreibt ebenso eine Vorrichtung zur automatischen immunologischen Bestimmung in heterogener Phase, wobei diese Vorrichtung dazu geeignet ist, eine Mehrzahl von Reaktionsröhren aufzunehmen, eine Mehrzahl von aufeinanderfolgenden Arbeitspositionen und Mittel zum sequentiellen schrittweisen Positionieren von Reaktiosröhren aufweist, wobei diese Positioniermittel zumindest zwei komplette Zyklen ausführen.
Die unterschiedlichen Positionen sind geeigneten Mitteln zum Zugeben einer Probe und/oder eines Reagens, zur Inkubation, zum Spülen oder zum Messen des Inhaltes der Röhren zugeordnet und weisen insbesondere Mittel zum Spülen in Form zweier getrennter Blöcke auf, die entlang einer horizontalen Achse bewegbar sind und die fallweise deaktiviert werden können. Eine solche Vorrichtung ermöglicht insbesondere das Durchführen einer großen Anzahl von unterschiedlichen Tests mit unterschiedlichen Vorschriften.
Nun ist es insbesondere in den Laboratorien zur Analyse medizinischer Proben wünschenswert, automatische Vorrichtungen zur Bestimmung einer Vielzahl von Parametern, mit willkürlichem Zugriff, mit größerem Durchsatz und mit geringeren Kosten bereitzustellen.
Eine vielfach parametrisierte Bestimmung mit willkürlichem Zugriff ermöglicht insbesondere bei einer biologischen Probe das Durchführen einer Bestimmung von zwanzig unterschiedlichen Parametern und bei der darauffolgenden Probe beispielsweise das Durchführen einer Bestimmung von nur zwei Parametern.
Die Anmelderin hat sich daher zur Aufgabe gemacht, ein Verfahren und eine Vorrichtung zu zur Bestimmung und/oder zur automatischen Bestimmung zumindest einer Substanz, insbesondere von Liganden, Antiliganden, Haptenen oder anderen biologischen Molekülen zu schaffen, die besser als die bisher bekannten Vorrichtungen und Verfahren den praktischen Anforderungen entsprechen, insbesondere in bezug auf eine mögliche Vielfach- Parametrisierung mit willkürlichem Zugang für jede Probe innerhalb relativ kurzer Zeit (erhöhter Durchsatz bei der Bestimmung) und bei geringeren Kosten, sodaß die Verwendung von weniger Reagenzien, insbesondere eines Monoreagens bei einfacher Anwendung möglich ist, und daß die Durchführung unterschiedlicher Bestimmungsarten, wie Konkurrenz-, Zweistufen- und Immunaufnahme-Verfahren möglich ist.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrichtung zum Spülen, die für ein heterogenphasiges immunologisches Testverfahren verwendet werden kann, bei welchem ein fester Träger in Form von magnetischen Kugeln vorhanden ist und welches folgendes aufweist:
(1) vier Mittel zum Erzeugen eines magnetischen Feldes in dem unteren Bereich von Reaktionsröhren (Tr), welche die zu analysierenden Proben enthalten, und ein oder mehrere für die Bestimmung geeignete Reagenzien, von welchen eines dieser Reagenzien aus magnetischen Kugeln besteht, die von einer Substanz bedeckt sind, die sich spezifisch mit der zu detektierenden Substanz als eine Suspension in einer geeigneten Flüssigkeit verbindet und eine organische Matrix bilden, welche eine magnetische Ladung umschließt, wobei das Verhältnis von magnetisierbarer zu nicht magnetisierbarer Masse dieser Kugeln größer oder gleich 45% beträgt, jedes Mittel zum Erzeugen eines magnetischen Feldes vorzugsweise aus einem Magnetenpaar besteht, die gegenüberliegend zu beiden Seiten von zwei aufeinanderfolgenden Reaktionsröhren angeordnet sind, und jedes Magnetenpaar (50) eine metallische Umhüllung zur Ausrichtung der magnetischen Feldlinien aufweist, sodaß die Erzeugung des magnetischen Feldes immer nur auf zwei aufeinanderfolgende Röhren begrenzt ist, und
(2) einen Spülkopf(L) welcher an einer Halterung folgendes aufweist:
(i) vier Mittel zum Absaugen der in den Röhren enthaltenen Flüssigkeit,
(ii) drei Mittel zum Verteilen einer Spülflüssigkeit auf diese Röhren,
(iii) ein Mittel zum Verteilen eines geeignetes Substrates,
wobei diese Mittel an der Halterung in der Weise angeordnet sind, daß das erste notwendigerweise ein Mittel zum Absaugen und das letztere notwendigerweise ein Mittel zum Verteilen eines Substrates ist und
die Spülvorrichtung entlang ihrer Vertikalachse bewegbar ist.
Ziel der Erfindung ist ebenso eine Vorrichtung zum automatischen immunologischen Bestimmen von zumindest einer Substanz in einer Mehrzahl von zu analysierenden heterogenphasigen Proben in mehreren aufeinanderfolgenden Schritten, die einen analytischen Zyklus bilden, welche einen festen Träger in Form magnetischer Kugeln umfaßt und die Vorrichtung weiters folgendes aufweist:
(1) ein Probemodul (A), das aus einer Mehrzahl von Trägern für Röhren (Te) besteht, welche die Proben enthalten,
(2) ein Reaktionsmodul (C), das aus folgendem besteht:
(i) einer Mehrzahl von Trägern für Röhren (Tr), die bestimmt sind, um aufeinanderfolgend eine aliquote Menge der Proben und eine aliquote Menge eines geeigneten Reagens aufzunehmen und
(ii) einer Mehrzahl von sequentiellen Behandlungspositionen dieser Reaktionsröhren, welche einen analytischen Zyklus bilden;
(3) ein Reagenzmodul (E), das aus einer Mehrzahl von Trägern für Röhren besteht, welche das geeignete/die geeigneten Reagenzien für die verschiedenen Bestimmungen enthalten, die verwirklicht werden sollen, wobei zumindest eines der Reagenzien in Form von magnetischen Kugeln vorhanden ist, die mit einer Substanz bedeckt sind, welche sich spezifisch mit der zu detektierenden Substanz als Suspension in einer geeigneten Flüssigkeit verbindet;
(4) ein Mittel (B) zum Entnehmen und zum Verteilen der Proben in die Röhren (Tr) des Reaktionsmoduls,
(5) ein Mittel (D) zum Entnehmen und zum Verteilen der Reagenzien in die Röhren des Reaktionsmoduls,
(6) ein geeignetes Mittel zum Ablesen der in dem Reaktionsmodul ablaufenden Reaktion.
und die Vorrichtung, durch folgendes gekennzeichnet ist:
(a) das Reaktionsmodul (C), das mit einem Steuerungsmikroprozessor verbunden ist, weist eine Einrichtung nach Anspruch 1 zum Spülen der magnetischen Kugeln auf, die aus einer organischen Matrix gebildet werden, welche eine magnetische Ladung umgibt, wobei das Verhältnis von magnetisierbarer zu nicht magnetisierbarer Masse dieser Kugeln größer oder gleich 45% ist und
(b) die Vorrichtung weist ein Informationssystem auf, das aus einem Steuerrechner für die verschiedenen Module und den Mitteln (1) bis (6) besteht und das Durchführen einer Aufeinanderfolge analytischer Zyklen ermöglicht.
Ein analytischer Zyklus gemäß der Erfindung besteht aus einer Abfolge von Schritten, die zumindest eine immunologische Inkubation aufweisen, und einer Abfolge von Schritten, die eine Inkubation zur Sichtbarmachung aufweisen, insbesondere eine enzymatische Inkubation.
Jeder Schritt entspricht einer Anzahl von sequentiellen Positionen einer Röhre in dem Reaktionsmodul, wobei die Verweildauer einer Röhre an einer Position konstant ist.
Gemäß einem Merkmal der Erfindung weist der Spülkopf der festen Spüleinrichtung des Reaktionsmoduls als Mittel zum Ansaugen und Verteilen eine Halterung auf, die mit Saug- und Verteilernadeln für eine geeignete Flüssigkeit versehen ist, wobei diese Halterung entlang einer vertikalen Achse bewegbar ist und diese Bewegung mit der Verschiebung der Reaktionsröhren synchronisiert ist.
Gemäß eines weiteren Merkmals der erfindungsgemäßen Vorrichtung weist jedes Reaktions-, Proben- und Reagenzienmodul eine in Drehung versetzbare Trommel auf, wobei die Drehungen der verschiedenen Trommeln durch das Informationssystem synchronisiert sind.
Gemäß eines weiteren Merkmals der erfindungsgemäßen Vorrichtung weist das Reaktionsmodul eine Anzahl von Positionen für Röhren auf, welche der Verwirklichung zumindest eines analytischen Zyklus entsprechen, welcher die folgende Reihenfolge aufeinanderfolgender Stufen aufweist:
- Einbringen der Probe, die analysiert werden soll in Position 1,
- Einbringen des geeigneten Reagens in Position 4,
- Vormagnetisieren in Position 86,
- Magnetisieren und Ansaugen in Position 87,
- Spülen in Position 88,
- Vormagnetisieren in Position 89,
- Magnetisieren und Ansaugen in Position 90,
- Spülen in Position 91,
- Vormagnetisieren in Position 92,
- Magnetisieren und Ansaugen in Position 93,
- Spülen in Position 94,
- Vormagnetisieren in Position 95,
- Magnetisieren und Ansaugen in Position 96,
- etwaiges Verteilen des Substrats in Position 98,
- Vormagnetisieren in Position 82,
- Ablesen des Ergebnisses in Position 83.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird die Spülung als eine Ansammlung von obligatorischen immunologischen Inkubationsschritten, das heißt, die aufeinanderfolgenden Etappen der Vormagnetisierung von Kugeln und der Magnetisierung von Kugeln werden zugleich mit dem Absaugen des Aufschwimmenden und dem Verteilen der Spüllösung durchgeführt.
Die Spülvorrichtung gemäß der Erfindung ermöglicht gleichzeitig das Durchführen mehrerer Spülvorgänge an verschiedenen Reaktionsröhren.
Bestimmte, oben präzisierte sind daher obligatorisch, wie die Anordnung der Schritte, welche den Spülvorgang bilden. Andere Schritte, wie die Verteilung eines Substrates, können fakultativ sein, je nach der gewählten Markierung.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird eine komplette Drehung des Reaktionsmoduls definiert als die Abfolge einer gegebenen Anzahl von Positionen einer Röhre.
Wenn man die Position 1 als Startposition aller Röhren betrachtet und wenn die Anzahl der Positionen 100 ist, besteht eine Drehung aus 100 aufeinanderfolgenden Positionen einer bestimmten Röhre.
Die Anordnung dieser aufeinanderfolgenden Schritte bilden, wie oben festgelegt, einen analytischen Zyklus, der im Fall der Verteilung eines einzigen Reagens (Monoreagens- Bestimmung), zwei komplette Drehungen des Reaktionsmoduls durch alle geeignete Mittel, insbesondere einen Elektromotor, und in dem Fall der Verteilung von zwei Reagenzien (Bireagens-Bestimmung), drei komplette Drehungen des Reaktionsmoduls, wobei das Ablesen des Ergebnisses immer am Ende der letzten Drehung erfolgt.
Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung liegt die Haltezeit einer Reaktionsröhre in einer Position ungefähr zwischen 5 und 20 Sekunden.
So kann man hunderte analytische Sequenzen in einer Stunde vornehmen.
Gemäß einem anderen Merkmal der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist das Reaktionsmodul darüber hinaus einer Einrichtung zum Regeln der Temperatur zugeordnet.
Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung weist die Einrichtung darüber hinaus zumindest ein Mittel zum Dekontaminieren durch Spülung der Mittel zum Entnehmen und zum Verteilen der Proben und der Reagenzien auf.
Dieses Mittel zur Dekontamination wird in vorteilhafter Weise durch einen Behälter gebildet, der mittels einer Pumpe und einem Elektro-Dreiwegventil beispielsweise einem Behälter mit einer geeigneten Reinigungslösung zugeordnet ist.
Die Vorrichtung gemäß der Erfindung besitzt den Vorteil, eine integrierte Automatisation der Verfahren ELISA und RIA, Immunfluoreszenz usw. zu ermöglichen und gleichzeitig an einer einzigen Probe beispielsweise Bestimmungen von Proteinen, Haptenen und Antikörpern innerhalb einer sehr kurzen Zeit unter einer Stunde vorzunehmen.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist ebenso ein Verfahren zur immunologischen, heterogenphasigen Bestimmung einer Substanz, insbesondere mittels eines Konkurrenzverfahrens oder einer Zweilagen-Methode, in mehreren aufeinanderfolgenden Schritten an einer Mehrzahl von zu analysierenden Proben unter Verwendung von geeigneten magnetischen Kugeln als festen Träger, welches folgende Schritte aufweist:
- aufeinanderfolgende Verteilung von Proben und Reagenzien,
- immunologische Inkubation,
- Spülen und,
- Messen dieser Substanz,
wobei die automatisierten Schritte einen analytischen Zyklus bilden, welcher eine Mehrzahl von sequentiellen Behandlungspositionen der Reaktionsröhren bildet und durch synchrone Rotation von Proben-, Reagenzien- und Reaktionsmodule bestimmt ist, welche die Röhren mit den zu analysierenden Proben tragen, nämlich die Reagenzienröhren und die Reaktionsröhren, und dieses Verfahren durch folgendes gekennzeichnet ist:
(a) die magnetischen Kugeln, welche mit einer Substanz bedeckt sind, die sich spezifisch mit der zu detektierenden Substanz als eine Suspension in einer geeigneten Flüssigkeit verbindet, werden durch eine organische Matrix gebildet, welche eine magnetische Ladung umschließt, und besitzen ein Verhältnis zwischen magnetisierbarer und nicht magnetisierbarer Masse von größer oder gleich 45%,
(b) die Dauer der immunologischen Inkubation ist für alle zu detektierenden Substanzen gleich und entspricht einer Drehung des Reaktionsmoduls zwischen den Behandlungspositionen 5 und 85,
(c) das Spülen dieser magnetischen Kugeln erfolgt mit Hilfe einer Spülvorrichtung nach Anspruch 1 und
(d) der Meßschritt weist die folgende Sequenz von Behandlungspositionen auf:
Position 95: Vor-Magnetisieren,
Position 96: Magnetisieren und Absaugen,
Position 98: Verteilen des Substrates,
Position 82: Vor-Magnetisieren,
Position 83: Ablesen des Ergebnisses.
Die Dauer einer immunologischen Inkubation bei dem erfindungsgemäßen Verfahren entspricht einer kompletten Drehung des Reaktionsmoduls. Die Dauer einer Inkubation zur Sichtbarmachung liegt ebenso in der Größenordnung einer kompletten Drehung des Reaktionsmoduls und ist von der Rotationsdauer zwischen dem Verteilen des Substrates und dem Schritt des Ablesens des Ergebnisses abhängig. Wenn das Verfahren beispielsweise zwei immunologische Inkubationen umfaßt, wird das Reaktionsmodul drei mal gedreht bevor das Ergebnis abgelesen werden kann.
Bei einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfaßt der analytische Zyklus eine einzige immunologische Inkubation und eine Entwicklungsinkubation, die aus einer enzymatischen Inkubation besteht, wobei diese Inkubationen die folgenden Stufen aufweisen:
I. Immunologische Inkubation:
a) Die Verteilung einer aliquoten Menge einer zu analysierenden Probe in einer Reaktionsröhre,
b) die Verteilung einer aliquoten Menge eines geeigneten Reagens in der Reaktionsröhre,
c) die Herstellung eines Kontakts zwischen Probe und Reagens während einer geeigneten Zeit, welche der Dauer einer vollständigen Drehung einer Reaktionsröhre entspricht,
d) eine erste Sedimentation der magnetischen Kugeln, der eine Ansaugung des Aufschwimmenden, sodann eine erste Spülung folgt,
e) eine zweite Sedimentation der magnetischen Kugeln, der eine Ansaugung des Aufschwimmenden, sodann eine zweite Spülung folgt,
f) eine dritte Sedimentation der magnetischen Kugeln, der eine Ansaugung des Aufschwimmenden, sodann eine dritte Spülung folgt,
g) eine vierte Sedimentation der magnetischen Kugeln, der eine Ansaugung des Aufschwimmenden folgt, sodann
II. Enzymatische Inkubation:
h) Eine Verteilung des Substrats und die Herstellung eines Kontakts der magnetischen Kugeln mit dem Substrat während einer geeigneten Zeit, die von der Dauer einer Drehung der Reaktionsröhre zwischen der Verteilung des Substrats und der Stufe des Ablesens des Ergebnisses abhängt, der eine Sedimentation der magnetischen Kugeln folgt,
i) sodann die Ablesung des Ergebnisses,
wobei jede der Stufen einer Anzahl sequentieller Positionen einer Reaktionsröhre entspricht.
Ein solches Verfahren wird im folgenden Monoreaktives Verfahren bezeichnet.
Bei einer vorteilhaften Ausgestaltung dieser Ausführungsform wird die Inkubation unter Anwesenheit eines Monoreagens verwirklicht, das aus einer Vormischung eines ersten Reagens R&sub1;, das magnetische Kugeln enthält, die von einer Substanz S&sub1; bedeckt sind, die sich spezifisch mit der Substanz bindet, die erfaßt werden soll, und eines zweiten Reagens R&sub2;, "konjugiert" genannt, besteht, das aus einer geeigneten Markierung besteht, die mit einer Substanz S&sub2; gekoppelt ist, die unterschiedlich oder identisch mit S&sub1; ist und die mit S&sub1; nicht reagiert.
Bei einer vorteilhaften Variation dieser Ausgestaltung besteht das Monoreagens aus einer Vormischung des folgenden: eines ersten Reagens R&sub1;, das magnetische Kugeln enthält, die von einer Substanz S&sub1; bedeckt sind, die aus einer Gruppe gewählt ist, die folgendes umfaßt: die geeigneten monoklonalen Antikörper, die Fragmente F (ab')&sub2; eines geeigneten monoklonalen Antikörpers, die geeigneten polyklonalen Antikörper, wobei die Antikörper gegen die Substanz gerichtet werden, die bestimmt werden soll und die geeigneten Antigene, insbesondere die Substanz, die bestimmt werden soll oder eines ihrer Fragmente; und eines zweiten Reagens R&sub2; oder ein "Konjugiertes", das aus der alkalischen Phosphatase besteht, die einer Substanz S&sub2; zugeordnet ist, die aus der Gruppe gewählt ist, welche folgendes umfaßt: die geeigneten monoklonalen Antikörper, die Fragmente F(ab')&sub2; eines geeigneten monoklonalen Antikörpers, die geeigneten polyklonalen Antikörper, wobei die Antikörper gegen die Substanz gerichtet werden, die bestimmt werden soll, und die geeigneten Antigene, insbesondere die Substanz, die bestimmt werden soll oder eines ihrer Fragmente und die Antigen-Immunglobulin-Komplexe.
Ein solches Reagens besitzt den Vorteil, daß es während 30 Tagen oder länger stabil ist und gut für das automatische Testverfahren gemäß der Erfindung geeignet ist.
Bei einer anderen Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung umfaßt der analytische Zyklus zwei immunologische Inkubationen und eine Entwicklungsinkubation, die aus einer enzymatischen Inkubation besteht, wobei dieser Zyklus die folgenden Stufen aufweist:
I. Erste immunologische Inkubation:
a) Das Einbringen einer aliquoten Menge einer zu analysierenden Probe in einer Reaktionsröhre,
b) das Einbringen einer aliquoten Menge eines geeigneten Reagens in der Reaktionsröhre,
c) die Herstellung eines Kontakts zwischen Probe und des Reagens während einer geeigneten Zeit, welche der Dauer einer vollständigen Drehung einer Reaktionsröhre entspricht,
d) eine erste Sedimentation der magnetischen Kugeln, der eine Ansaugung des Aufschwimmenden, sodann eine erste Spülung folgt,
e) eine zweite Sedimentation der magnetischen Kugeln, der eine Ansaugung des Aufschwimmenden, sodann eine zweite Spülung folgt,
f) eine dritte Sedimentation der magnetischen Kugeln, der eine Ansaugung des Aufschwimmenden, sodann eine dritte Spülung folgt,
g) eine vierte Sedimentation der magnetischen Kugeln, der eine Ansaugung des Aufschwimmenden folgt, sodann
II. Zweite immunologische Inkubation:
die Stufen b) bis g) werden ein zweites Mal ausgeführt, sodann
III. Enzymatische Inkubation:
h) Eine Verteilung des Substrates und die Herstellung eines Kontakts der magnetischen Kugeln mit dem Substrat während einer geeigneten Zeit, die von der Dauer einer Drehung zwischen der Verteilung des Substrats und der Stufe des Ablesens des Ergebnisses abhängt, der eine Sedimentation der magnetischen Kugeln folgt,
i) sodann die Ablesung des Ergebnisses,
wobei jede der Stufen einer Anzahl sequentieller Positionen einer Reaktionsröhre entspricht.
Ein solches Verfahren wird im folgenden Bireaktives Verfahren genannt.
Bei einer vorteilhaften Ausgestaltungsform dieser Ausführungsform wird die erste immunologische Inkubation in Anwesenheit eines ersten Reagens R&sub1; bewirkt, das aus magnetischen Kugeln besteht, die von einer Substanz S&sub1; bedeckt sind, die sich spezifisch mit der Substanz bindet, die erfaßt werden soll, und die zweite immunologische Inkubation im Beisein eines zweiten Reagens R&sub2; - "konjugiert" genannt - bewirkt, das aus einer geeigneten Markierung besteht, die mit einer Substanz S&sub2; gekoppelt ist, die unterschiedlich oder identisch mit S&sub1; ist, und die mit S&sub1; nicht reagiert.
Bei einer vorteilhaften Variante dieser Ausgestaltungsform wird die erste immunologische Inkubation in Anwesenheit eines ersten Reagens R&sub1; bewirkt, das aus magnetischen Kugeln besteht, die von einer Substanz S&sub1; bedeckt sind, die aus der Gruppe gewählt ist, welche folgendes umfaßt: die geeigneten monoklonalen Antikörper, die Fragmente F (ab')&sub2; eines geeigneten monoklonalen Antikörpers, die geeigneten polyklonalen Antikörper, wobei die Antikörper gegen die Substanz gerichtet werden, die bestimmt werden soll, und die geeigneten Antigene, insbesondere die Substanz, die bestimmt werden soll oder eines ihrer Fragmente; und die zweite immunologische Inkubation in Anwesenheit eines zweiten Reagens R&sub2; oder eines Konjugierten bewirkt, das aus der alkalischen Phosphatase besteht, die einer Substanz S&sub2; zugeordnet ist, die aus der Gruppe gewählt ist, welche folgendes umfaßt: die geeigneten monoklonalen Antikörper, die Fragmente F (ab')&sub2; eines geeigneten monoklonalen Antikörpers, die geeigneten polyklonalen Antikörper, wobei die Antikörper gegen die Substanz gerichtet werden, die bestimmt werden soll, und die geeigneten Antigene, insbesondere die Substanz, die bestimmt werden soll, oder eines ihrer Fragmente und die Antigen-Immunglobulin-Komplexe.
Für gewisse zu bestimmende Substanzen umfaßt der analytische Zyklus nur eine einzige immunologische Inkubation und eine Entwicklungsinkubation. Davon sind insbesondere aber nicht einschränkend betroffen: das α-Fetoprotein (AFP), LH, FSH, hCG, IgE und das Prolactin.
Für andere Substanzen umfaßt der analytische Zyklus zwei immunologische Inkubationen und eine Entwicklungsinkubation. Davon sind insbesondere aber nicht einschränkend betroffen: TSH, T3, gebundenes T4, freies T4, Cortisol oder die Antikörper, die bei Infektionen auftreten, insbesondere aufgrund eines Parasiten (z.B. Toxoplasmose), eines Virus (z.B. Rubor, VIH) oder eines Mikroorganismus (z.B. Chlamydia).
Für die letzteren Substanzen (Antikörper) ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren das durchführen der Bestimmungen unter Vermeidung von Schritten zur Vorverdünnung, die gewöhnlich erforderlich sind.
Bei einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung umfaßt dieses darüber hinaus eine Stufe des Kalibrierens mittels mehrerer Parameter umfaßt, die vor der Bestimmung der Proben durchgeführt wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt eine Reihe von Vorteilen:
- Es ist keine Kalibrierung für jede Bestimmungsserie erforderlich, da eine Kalibrierung für unterschiedliche Reagenzien ausreichend ist.
- Es ist möglich, nach einem einzigen Schritt die Anordnung der gegebenenfalls zu bestimmenden Substanzen zu kalibrieren.
- Es ist überdies möglich eine Vielfachparameter-Bestimmung für eine Probe durchzuführen.
- Es ist ebenso möglich, eine erhöhte zeitliche Abfolge von Bestimmungen (beispielsweise 100 Bestimmungen in 50 Minuten) durchzuführen.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist überdies ein Reagens für immunologische Diagnostik, bestehend aus magnetischen Kugeln, die von einer Substanz bedeckt sind, welche sich spezifisch mit der zu detektierenden Substanz als Suspension in einer Flüssigkeit bindet, dadurch gekennzeichnet, daß diese Kugeln aus einer organischen Matrix bestehen, die eine magnetische Ladung umschließt, wobei das Verhältnis von magnetisierbarer zu nicht magnetisierbarer Masse dieser Kugeln größer oder gleich 45% ist.
Bei einer besonders vorteilhaften Realisierung dieses Reagens besteht dieser aus magnetischen Kugeln, deren Verhältnis von magnetisierbarer zu nicht magnetisierbarer Masse zwischen 60 und 70 % liegt.
In vorteilhafter Weise ist die organische Matrix ein Latex aus Polymeren wie Polystyrol oder Divinylbenzol.
Vorzugsweise besteht das Reagens aus magnetischen Kugeln mit einem Durchmesser, der kleiner als 1,5 µm ist und vorzugsweise zwischen 0,7 und 1,5µm liegt.
An dieser Stelle sind insbesondere magnetische Kugeln mit diesen Eigenschaften anzuführen, die in dem europaischen Patent 38 730 von RHONE POULENC SPECIALITES CHIMIQUES beschrieben sind und ESTAPOR-Kugeln genannt werden.
In besonders vorteilhafter Weise besteht das Reagens aus magnetischen Kugeln, die von einer Substanz S&sub1; bedeckt sind, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, welche folgendes umfaßt: Die geeigneten monoklonalen Antikörper, die Fragmente F(ab')&sub2; eines geeigneten monoklonalen Antikörpers, die geeigneten polyklonalen Antikörper, wobei diese Antikörper gegen die zu detektierende Substanz gerichtet werden, und die geeigneten Antigene, insbesondere die zu detektierende Substanz oder eines ihrer Fragmente.
Die Kopplung dieser Substanz an den magnetischen Teilchen kann mittels Kopplungstechniken durch kovalente Bindung, die im Stand der Technik beschrieben ist, und insbesondere nach dem Arbeitsmodus realisiert werden, welcher durch WOOD et coll. in dem Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry, Vol 21, 1983, pp. 789-797 beschrieben ist.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel des Reagens besteht dieses aus einer Vormischung, aus den magnetischen Kugeln, die mit der Substanz S&sub1; und einer Konjugierten bedeckt sind, welche eine geeignete Markierung enthält, die an eine Substanz S&sub2; gekoppelt ist, die identisch oder verschieden von S&sub1; ist und mit S&sub1; nicht reagiert, wobei die Vormischung durch Ausführen des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellt wird.
Bei einer vorteilhaften Ausführungsvariante dieses Ausführungsbeispiels umfaßt das Reagens eine Konjugierte, die durch Alkaliphosphatase gebildet wird, welche einer Substanz S&sub2; zugeordnet ist, die aus der Gruppe ausgewählt wird, welche die geeigneten monoklonalen Antikörper, die Fragmente F (ab')&sub2; eines geeigneten monoklonalen Antikörpers, die geeignete polyklonalen Antikörper enthält, wobei die Antikörper gegen die zu bestimmende Substanz und die geeigneten Antigene, insbesondere die zu bestimmende Substanz gerichtet werden, oder eines ihrer Fragmente und die Immunglobulin-Antigenkomplexe.
Das Reagens besteht insbesondere aus einer Lösung, die 0,1 Vol% magnetischer Kugeln enthält (d.i. 1% Trockengewicht magnetischer Kugeln in einem Liter eines geeigneten Puffers).
Ein solches Reagens ist besonders gut zur automatischen Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in einer oben beschriebenen Vorrichtung geeignet, da es trotz der festen Phase wie eine Flüssigkeit gehandhabt werden kann und so bei Ausführen der unterschiedlichen Arbeitsschritte der immunologischen Bestimmung und insbesondere bei dem ELISA-Verfahren eine Zeitersparnis und eine Vereinfachung zur Folge hat.
Überdies ermöglicht die erhöhte magnetische Ladung der Kugeln unter der Wirkung eines geeigneten magnetischen Feldes eine extrem kurze Magnetisierungsdauer, welche die völlige Trennung dieser Kugeln von dem Aufschwimmenden ermöglicht. Beispielsweise beträgt die Magnetisierungsdauer 15 Sek. unter der Wirkung eines magnetischen Feldes, das von zwei Magneten mit ca 1023 Tesla (oder Wb. m&supmin;²) erzeugt wird, wodurch ein erhöhter Durchsatz von Bestimmungen in dem automatischen Analysegerät möglich ist.
Weiters ermöglicht die große Reaktionsoberfläche der magnetischen Kugeln unabhängig von der zu bestimmenden Substanz, daß die immunologische Inkubationsdauer immer einer kompletten Drehung des Reaktionsmoduls entspricht.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist weiters ein einsatzbereiter Diagnostiksatz, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er aus zumindest einem Reagens für eine immunologische Diagnostik gemäß der vorliegenden Erfindung besteht.
Zusätzlich zu den bereits genannten Merkmalen enthält die Erfindung weitere Merkmale, die aus der folgenden Beschreibung hervorgehen, welche auf die beiliegenden Figuren Bezug nimmt, in welchen Fig. 1 schematisch die erfindungsgemäße Einrichtung, Fig. 2 eine schematische, perspektivische Ansicht des Spülkopfes, Fig. 3 schematisch die Funktionsweise der Spülvorrichtung, Fig. 4 schematisch die Abfolge von Schritten in dem Reaktionsmodul, Fig. 5 eine schematische Darstellung der Dekontaminationseinrichtung zeigt.
An dieser Stelle ist jedoch anzumerken, daß die Zeichnungen und die dazugehörige Beschreibung nur zur Illustration der Erfindung dienen und daher keine Einschränkung bilden.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist schematisch in Fig. 1 dargestellt.
Sie weist ein Probenmodul A, ein Reaktionsmodul C und ein Reagenzienmodul E auf, wobei jedes Modul im wesentlichen aus einer Trommel gebildet wird, die mit Halterungen für Röhren versehen ist, die entnehmbar und mittels eines Elektromotors unter Steuerung durch einen Mikroprozessor drehbar sind. Die Steuerungseinheit wird durch einen Rechner gebildet, welcher die Koordination des Betriebes und insbesondere die Rotation der drei Module A, C und E in der Weise gewährleistet, daß sie untereinander synchronisiert sind.
Das Probenmodul A enthält eine Halterung, die zur Aufnahme einer Mehrzahl von Röhren Te bestimmt ist, welche in einer Reihe angeordnet sind und von welchem jede eine Probe eines biologischen Fluidums enthält, in welchem zumindest eine Substanz zu bestimmen ist. In vorteilhafter Weise kann die Halterung eine Reihe von Aufnahmen besitzen, die für Behälter mit Kalibrierungsflüssigkeiten bestimmt sind.
Das Probenmodul ist einem Arm B zum Entnehmen und Verteilen der Proben zugeordnet.
Das Reagenzienmodul E trägt eine Mehrzahl von Röhren oder Behältern, welche die für unterschiedliche Bestimmungen geeigneten Reagenzien enthalten, und ist einem Arm D zum Entnehmen und Verteilen dieser Reagenzien zugeordnet.
Das Reaktionsmodul C trägt eine Mehrzahl von Reaktionsröhren und weist eine feste Spülvorrichtung auf, die aus einem Spülkopf L und zumindest einem Mittel zum Erzeugen eines magnetischen Feldes im unteren Abschnitt der Reaktionsröhren besteht.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Einrichtung wird der Spülkopf L durch einen Träger für Ansaug- und Verteilernadeln gebildet, wobei dieser Träger an einer Halterung angeordnet und entlang einer Vertikalachse beweglich ist.
Vorzugsweise, jedoch nicht einschränkend ist der Nadelträger mit vier Ansaugnadeln und drei Verteilernadeln für eine Spüllösung und einer Verteilernadel für die Verteilung eines Substrates versehen.
Das Reaktionsmodul C kann in vorteilhafter Weise auf einer Temperatur von 37º gehalten werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform dieser Vorrichtung kann das Probenmodul A bis zu 36 Röhren Te, insbesondere jene Röhren die gewöhnlicherweise in Laboratorien für medizinische Analysen verwendet werden, und bis zu achtzehn Kalibrierbehälter enthalten. Das Reagenzienmodul E kann bis zu zwanzig Behälter umfassen, die bis zu 100ml Reagens enthalten können, und das Reaktionsmodul trägt einhundert Reaktionsröhren (vier Platten mit fünfundzwanzig Gefäßen) und kann daher einhundert verschiedene Winkelstellungen mit einer konstanten Verweildauer einnehmen, die vorzugsweise zehn Sekunden beträgt.
Der Arm B zum Entnehmen und Verteilen von Proben besteht aus einem Nadelträger, der an einer Halterung angeordnet ist, einer Nadel mit geeignetem Durchmesser und einem kapazitiven Flüssigkeitsanzeiger, welcher unabhängig von dem in der Röhre Te enthalten Probenvolumen ein Absenken des Endes der Nadel in die Probe auf eine vorbestimmte und konstante Höhe ermöglicht. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Vorrichtung kann das durch den Arm B entnommene Probenvolumen zwischen 10 und 150µl betragen.
In vorteilhafter Weise ist der Arm B mit einer Dekontaminationseinrichtung für das Innere und das Äußere der Nadel versehen, die aufweist (vgl. Fig. 5):
Eine Dekontaminationsstelle 101, die eine Öffnung 102 an ihrem Oberteil aufweist, die Dekontaminationsflüssigkeit enthält und in einem Gehäuse 103 eingeschlossen ist, welches mit einem Mittel zum Entleeren 104 versehen ist.
Eine Spritze 105, die über eine biegsame Röhre 107 und einem Dreiweg-Elektroventil 108 mit ihrem Oberteil mit der zu dekontaminierenden Nadel 106 verbunden ist, wobei das Ventil über eine Schleife mit einem Behälter 109 für die Dekontaminationsflüssigkeit und einer Schlauchpumpe 110 verbunden ist.
Nach dem Einbringen einer aliquoten Probenmenge in einer Reaktionsröhre Tr wird der Arm B verschwenkt, um die Nadel an der Dekontaminationsstelle zu dekontaminieren. Wenn das Elektroventil sich öffnet, kann die in dem Dekontaminationsflüssigkeitsbehälter enthaltene Flüssigkeit während einer Sekunde in die zu dekontaminierende Nadel fließen. Wenn sich das Elektroventil wieder schließt, saugt die Spritze ein bestimmtes Volumen, beispielsweise 200µl der Dekontaminationsflüssigkeit an, wonach sich das Elektroventil öffnet und die Spritze unter Druck 150µ der Flüssigkeit ausstößt und 50µl Flüssigkeit behält, welche als Komplementärvolumen für die nächste aufzunehmende, aliquote Probe dient, die danach in die Reaktionsröhre eingebracht wird. Die Nadel stößt die Dekontaminationsflüssigkeit unter einem ausreichenden Druck aus, um dieser Flüssigkeit das Spülen des Äußeren der Nadel zu ermöglichen. Die Flüssigkeit strömt über die Öffnung der Dekontaminationsstelle, und der Überschuß wird durch das Mittel zum Entleeren des Gehäuses abgeleitet. Das Elektroventil schließt sich wieder, und der Arm B wird verschoben, um die Nadel aus der Dekontaminationsstelle zu entnehmen und über der aus dem Probenmodul A zu entnehmenden Probe auszurichten.
Während der Spülung bewirkt die Spritze eine Dekontamination der Flüssigkeit und verbessert so die Spülung.
Der Arm B entnimmt eine aliquote Menge der Probe und bringt diese mit dem in der Spritze enthaltenen Komplementärvolumen in die Reaktionsröhre ein, die sich in Position 1 des Reaktionsmoduls C befindet.
In vorteilhafter Weise ist die Dekontaminationsflüssigkeit eine Reinigungslösung, die beispielsweise unter der Bezeichnung "Tween" bekannt ist.
Die drei Arbeitsschritte zum Entnehmen der Probe, Verteilen der Probe und Dekontaminieren der Nadel, die durch den Mikroprozessor des Probenmoduls gesteuert werden, werden während der Verweildauer einer Reaktionsröhre, welche in vorteilhafter Weise zehn Sekunden beträgt, in Position 1 des Reaktionsmoduls durchgeführt.
Wenn die nachfolgende Bestimmung an der selben Probe durchgeführt wird, bewegt sich nur das Reaktionsmodul C um eine Röhre weiter, wogegen das Probenmodul A unbeweglich bleibt. Im gegenteiligen Fall bewegen sich das Reaktionsmodul C und das Probenmodul A um eine Röhre weiter. Die Verteilung der Probe in Position 1 des Reaktionsmoduls wird für alle in dem Probenmodul vorhandenen Proben und für jede Probe mit jeder zu bestimmenden Substanz durchgeführt.
Das Reagenzienmodul E ist mit einem Arm D zum Entnehmen und Verteilen von Reagenzien versehen, welcher im wesentlichen analog zu dem Arm B zum Entnehmen und Verteilen von Proben ausgebildet ist und kann vorzugsweise mit einer vergleichbaren Dekontaminationseinrichtung versehen sein. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung beträgt das entnehm- und verteilbare Reagenzvolumen zwischen 50 und 400µl.
Wenn die erste Reaktionsröhre, in welcher sich eine aliquote Probe befindet, an Position 4 des Reaktionsmoduls eingelangt ist, entnimmt der Arm D aus dem Reagenzienmodul eine aliquote Menge des geeigneten Reagens und bringt dieses in die Reaktionsröhre von Position 4 ein. Das Reaktionsmodul bewegt sich sodann um eine Position weiter, um die nachfolgende Reaktionsröhre an die Position 4 zu bringen. Die Drehung des Reagenzienmoduls erfolgt unabhängig von jener der zwei anderen Module in Abhängigkeit von dem Reagens, welches den an Position 4 einlangenden und eine zu bestimmende Probe enthaltenden Röhren des Reaktionsmoduls zuzugeben ist.
Das Reagenzienmodul kann vorteilhafterweise Mittel zum Bewegen der Reagenzien enthalten, welche die magnetischen Kugeln in Suspension halten und so deren Homogenität gewährleistet. Die Bewegung der Reagenzien wird insbesondere durch eine abwechselnde Drehung der Trommel bewirkt, welche das Reagenzienmodul bildet, und durch den Mikroprozessor dieses Moduls gesteuert wird, wobei diese Drehung alle zehn Minuten für zwanzig Sekunden, während die Vorrichtung im Stillstand ist, und kontinuierlich durchgeführt wird, während das Entnehmen und Verteilen der Reagenzien stattfindet.
In Fig. 2 ist ein erfindungsgemäßer Spülkopf dargestellt, der dem Reaktionsmodul C zugeordnet ist und einen Träger für Nadeln aufweist, welcher vorzugsweise vier Ansaugnadeln 20&sub1; - 20&sub4;, drei Verteilernadeln für eine Spüllösung 21&sub1; - 21&sub3; und eine Verteilernadel für ein Substrat 22 aufweist, wobei diese Nadeln in einer vorbestimmten Abfolge angeordnet sind.
Die vier Ansaugnadeln 20&sub1; - 20&sub4; sind mit ihren oberen Abschnitten mittels eines biegsamen Schlauches an zwei Pumpen angeschlossen, welche stromauf eines Aufsammelbehälters angeordnet sind.
Die drei Verteilernadeln für die Spüllösung sind mit ihren oberen Abschnitten mittels einer Leitung an drei Dreiweg-Elektroventilen angeschlossen, welche einerseits an einen Sammelbehälter und andererseits an eine Schlauchpumpe angeschlossen sind, welche mit einem Behälter für eine Spüllösung verbunden ist.
Die Verteilernadel für das Substrat ist mit ihrem oberen Abschnitt an ein Elektroventil angeschlossen, welches mit einem Substratbehälter verbunden ist.
Die vertikale Verschiebung der Nadelhalterung und die Synchronisation des Betriebes der unterschiedlichen Mittel bilden den Spülkopf L und werden durch den Mikroprozessor des Reaktionsmoduls C gesteuert.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Vorrichtung besitzt die Spüleinrichtung vier Mittel zum Erzeugen eines Magnetfeldes im unteren Bereich der Reaktionsröhren, wobei jedes dieser Mittel aus einem Permanentmagnetenpaar 50 besteht und jeder Magnet eine magnetische Induktion von ca. 1023 Tesla (oder Wb.m&supmin;²) aufweist. Die Abmessung der Röhren entspricht der Fläche, die von zwei Reaktionsröhren belegt wird und ermöglicht so das gleichzeitige Einwirken des magnetischen Feldes auf zwei aufeinanderfolgende Röhren.
Wie in Fig. 3 zu sehen ist, sind die zwei Magneten eines Paares gegenüberliegend zu beiden Seiten von zwei Reaktionsröhren angeordnet. Jedes Magnetenpaar ist einer magnetischen Einfassung zur Ausrichtung der magnetischen Flußlinien zugeordnet, welche ein Fokussieren des Magnetfeldes auf die zwei Reaktionsröhren, die durch Drehung des Reaktionsmoduls zwischen die zwei Magneten gebracht werden, und ein Ausschließen der stromauf und stromab gelegenen Reaktionsröhren von der Wirkung des Magnetfeldes ermöglicht.
Diese Fig. 3 illustriert schematisch die Funktionsweise der Spüleinrichtung bei einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung, bei welcher die Einrichtung die Positionen 86 - 98 belegt, wobei die vier Magnetenpaare an den Positionen 86 - 87, 89 - 90, 92 - 93, 95 - 96 angeordnet sind. Die vier Ansaugnadeln sind an Position 87, 90, 93, 96, die drei Verteilernadeln für die Spüllösung an Position 88, 91, 94 und die Verteilernadel für das Substrat an Position 98 des Reaktionsmoduls angeordnet. Die für die Sedimentation der Kugeln erforderliche Magnetisierungsdauer liegt in der Größenordnung von 15 Sekunden.
Wenn eine Röhre an Position 86 des Moduls gebracht wird, erfolgt eine Vormagnetisierung der magnetischen Kugeln im Bereich des ersten Magnetenpaares und ermöglicht deren Trennung von dem flüssigen Inkubationsmedium, wonach an Position 87, an welcher sich die erste Ansaugnadel befindet, eine vollständige Magnetisierung der magnetischen Kugeln, deren Trennung und ein Absaugen der in der Röhre enthaltenen Flüssigkeit vorgenommen wird. An Position 88 erfolgt eine Spülung der magnetischen Kugeln, die an Position 87 sedimentiert wurden, mit Hilfe der ersten Spülnadel. Die Abfolge Vormagnetisierung, Magnetisierung - Absaugung, Spülen wird an Positionen 89, 90, 91; 92, 93, 94 erneut durchgeführt, wonach eine letzte Abfolge die Verteilung des Substrates anstelle der Spülung umfaßt, die an Positionen 95, 96, 98 durchgeführt wird.
Eine solche Spülvorrichtung ermöglicht, daß jede Röhre mehreren Spülvorgängen ausgesetzt ist, von welchen jeder eine Vormagnetisierung, eine Magnetisierung verbunden mit dem Absaugen des Aufschwimmenden und eine Verteilung einer Spüllösung umfaßt, sodaß die Rotationsgeschwindigkeit des Reaktionsmoduls konstant gehalten werden kann.
Das Reaktionsmodul weist überdies ein geeignetes Mittel zum Ablesen der immunologischen Reaktion auf. Dieses Mittel zum Ablesen kann insbesondere ein Photometer mit Interferenzfiltern sein, welche ein systematisches Ablesen jeder Reaktionsröhre an drei verschiedenen Wellenlängen ermöglicht. Das Mittel zum Ablesen kann in vorteilhafter Weise einem Mittel zum Erzeugen des magnetischen Feldes im unteren Abschnitt der Reaktionsröhren zugeordnet sein.
Eine solche Vorrichtung ermöglicht insbesondere die Bestimmung von hCG, TSH, T3, T4, Cortisol, IgG oder IgM, welche insbesondere bei folgenden Infektionen vorkommen: Toxoplasmose, Rubeola, Chlamydia-Infektionen, Hepatitis, VIH-Infektionen, Polypeptiden und Proteinen wie AFP und ACE.
Die Markierung kann in vorteilhafter Weise Alkaliphosphatase sein.
Die Fig. 4 zeigt die Abfolge von Schritten eines analytischen Zyklus wie oben definiert und umfaßt eine immunologische Inkubation und eine enzymatische Inkubation bei einer Ausführungsform, welche in dem Reaktionsmodul einhundert Röhren enthält:
- An Position 1 erfolgt das Einbringen der zu analysierenden Proben.
- An Position 4 erfolgt das Einbringen des Reagens.
- An Position 86 erfolgt die erste Vormagnetisierung.
- An Position 87 erfolgt die erste Magnetisierung und Absaugung.
- Die erste Spülung erfolgt an Position 88.
- Die zweite Serie von Vormagnetisierung, Magnetisierung, Absaugung und Spülung wird an den Positionen 89, 90 und 91 durchgeführt.
- Die dritte Serie von Vormagnetisierung, Magnetisierung, Absaugung und Spülung wird an den Positionen 92, 93 und 94 durchgeführt.
- Die vierte Serie umfaßt das Verteilen des Alkaliphosphatasesubstrates (PNPP) und weist eine Vormagnetisierung, eine Magnetisierung, eine Absaugung und eine Verteilung des Substrates an den Positionen 95, 96 und 98 auf.
- Das Ablesen der Reaktion erfolgt vor einer Vormagnetisierung an Position 82, wobei die eigentliche Ablesung an Position 83 mit Hilfe eines geeigneten Ablesesystems, insbesondere eines Photometers mit Interferenzfiltern durchgeführt wird und ein systematisches Ablesen an drei unterschiedlichen Wellenlängen vorgenommen wird, ohne daß man darauf eingeschränkt ist.
Die Vorrichtung ermöglicht insbesondere das Durchführen von immunenzymatischen Bestimmungen wie folgt:

Beispiel 1: Beispiel zum Anwenden des immunologischen Testverfahrens mit Hilfe einer erfindungsgemäßen Vorrichtung: Bestimmung von hCG, Prolactin, IgG Anti- Chlamydia, IgG Anti-Rubor, IgG Anti-Toxoplasmose in ein und demselben Serum, im folgenden Schwangerschaftskomplex genannt.

Bei diesem Beispiel erfordert die Bestimmung von IgG und IgM Anti-Toxoplasmose, IgG Anti-Rubor, IgG Anti-Chlamydia zwei immunologische Inkubationen, die erste in Anwesenheit eines ersten Reagens R&sub1;, bestehend aus magnetischen Kugeln, die an eine Substanz S&sub1; gekoppelt sind, welche sich spezifisch mit der zu detektierenden Substanz verbindet, und die zweite in Anwesenheit eines zweiten Reagens R&sub2; oder "einer Konjugierten" mit einer Markierung, die an eine Substanz S&sub2; gekoppelt ist, die identisch oder unterschiedlich von S&sub1; ist, jedoch mit dieser nicht reagiert, wogegen die Bestimmung von hCG und des Prolactin nur eine einzelne immunologische Inkubation erfordern, nämlich mit einer Vormischung der oben genannten Reagenzien R&sub1; und R&sub2;.
Die bei diesem Beispiel verwendeten Reagenzien sind aus Polystyrol-Latexteilchen mit einem Durchmesser zwischen 0,7 und 1,5µm hergestellt, welche eine magnetische Ladung umschließen, und deren Verhältnis zwischen magnetisierbarer und nicht magnetisierbarer Masse zwischen 60 und 70% liegt.
Diese Kugeln werden "ESTAPOR" genannt und werden von RIIONE POULENC SPECIALITES CHIMIQUES hergestellt.
Die Kopplung der Substanz S&sub1; (monoklonale Antikörper, Fragmente F (ab')&sub2; der monoklonalen Antikörper, polyklonale Antikörper, ...) wurden nach dem Arbeitsmodus hergestellt, der von WOOD et coll. im Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry, Vol 21, 1983, pp. 789-797 beschrieben wurde.
Die Reagenzien R&sub2; oder Konjugierten wurden nach dem Arbeitsmodus analog jenem hergestellt, der von AVRAMEAS in Immunochemistry, 5, 43, 1969 beschrieben wurde.
Als Markierung wurde Alkaliphosphatase (PAL) verwendet. Das Substrat zur Sichtbarmachung ist Para-Nitrophenylphosphatat (PNPP).
Die folgende Tabelle I enthält die Zusammensetzung und Konzentration der verwendeten Reagenzien. Tabelle I zu bestimmende Substanz Reagens R&sub1; Reagens R&sub2; Prolactin Toxo G Rubor Chlamydia Toxo M ESTAPOR Kugeln, F(ab')&sub2; eines monoklonalen Anti-hCG Antikörpers ESTAPOR Kugeln, F(ab')&sub2; eines monoklonalen Anti-Prolactin Antikörpers ESTAPOR Kugeln, Toxoplasmose-Antigen ESTAPOR Kugeln, Chlamydia-Antigen ESTAPOR Kugeln, F(ab')&sub2; eines monoklonalen Anti-Toxoplasmose-Antikörpers *Lösung %P/V Fragment polyklonaler menschlicher Anti IgG-PAL-Antikörper gereinigtes Toxoplasmose Antigen, markiert mit tierischem Ig-PAL * Lösung enthält 1g Trockengewicht Kugeln pro Liter Puffer PBS 0,1 M - pH 7,3 (BSA 5g/l-NaN&sub3; 1g/l). ** Puffer Tris 0,1M - pH 8 (BSA 5g/l-MgCl&sub2; 1g/l NaN&sub3; 1g/l).
Die folgende Tabelle II enthält die erforderlichen Mengen, ausgedrückt in µl, der unterschiedlichen zu verteilenden Produkte in Abhängigkeit von der zu bestimmenden Substanz: TabelleII Substanz Serum Flush Reagens 1 Reagens 2 Prolactin Toxo G Rubor Chlamydia Toxo M
Bei diesem Beispiel enthält das Reagenzienmodul E folgendes:
- An Position 1 das Monoreagens hCG mit "ESTAPOR" Kugeln, die mit einem Fragment F(ab')&sub2; eines gegen hCG gerichteten, monoklonalen Antikörpers und einem konjugierten Alkaliphosphatase (PAL)-Fragment F(ab')&sub2; eines gegen hCG gerichteten, monoklonalen Antikörpers bedeckt sind, der von dem vorhergehenden unterschiedlich ist.
- An Position 2 das Prolactin Monoreagens mit "ESTAPOR" Kugeln, die mit einem Fragment F(ab')&sub2; eines gegen Prolactin gerichteten, monoklonalen Antikörpers und einem konjugierten Alkaliphosphatase (PAL)-Fragment F(ab')&sub2; eines gegen Prolactin gerichteten, monoklonalen Antikörpers bedeckt sind, der von dem vorhergehenden unterschiedlich ist.
- An Position 3 das Reagens R&sub1; zur Bestimmung von IgG Anti-Toxoplasmose mit "ESTAPOR" Kugeln, die mit einem toxoplasmotischen Antigen bedeckt sind.
- An Position 4 das Reagens R&sub4; zur Bestimmung von IgG Anti-Toxoplasmose, bestehend aus einem konjugierten Alkaliphosphatase (PAL)-polyklonalen, menschlichen Anti-IgG Antikörper.
- An Position 5 das Reagens R&sub1; gegen Rubor mit magnetischen Kugeln, die mit einem Rubor-Antigen bedeckt sind.
- An Position 6 das Reagens R&sub2; gegen Rubor, bestehend aus einem konjugierten Alkaliphosphatase (PAL)-polyklonalen, menschlichen Anti-IgG Antikörper.
- An Position 7 das Reagens R&sub1; Anti-Chlamydia mit magnetischen Kugeln, die mit einem Chlamydia-Antigen bedeckt sind.
- An Position 8 das Reagens R&sub2; Anti-Chlamydia, bestehend aus einem konjugierten Alkaliphosphatase (PAL)-polyklonalen, menschlichen Anti-IgG Antikörper.
- An Position 9 das Reagens R&sub1; zur Bestimmung von IgM Anti-Toxoplasmose, bestehend aus magnetischen Kugeln, die mit einem Fragment F(ab')&sub2; eines monoklonalen Anti- Toxoplasmose-Antikörpers bedeckt sind.
- An Position 10 das Reagens R&sub2; zur Bestimmung von IgM Anti-Toxoplasmose, bestehend aus einem Komplex, der aus einem gereinigten, toxoplasmotischen Antigen gebildet wird, welches mittels eines tierischen Ig markiert ist, welches durch Alkaliphosphatase konjugiert ist.
Das Probenmodul enthält die Röhre mit dem zu analysierenden Serum.
Sechs Reaktionsröhren werden nacheinander an Position 1 des Reaktionsmoduls gebracht, wo eine geeignete Menge des Serums und eine geeignete Menge von "Flush" durch den Arm B zum Entnehmen und Verteilen von Proben eingebracht wird. Danach, wenn jede der Röhren an Position 4 des Reaktionsmoduls C einlangt, enthält sie eine geeignete Menge:
- des Monoreagens hCG für die Röhre 1,
- des Monoreagens Prolactin für die Röhre 2,
- das Reagens R&sub1; IgG Anti-Toxoplasmose für die Röhre 3,
- das Reagens R&sub1; IgG Anti-Rubor für die Röhre 4,
- das Reagens R&sub1; IgG Anti-Chlamydia für die Röhre 5 und
- das Reagens R&sub1; IgM Anti-Toxoplasmose für die Röhre 6.
Zur Bestimmung des hCG und des Prolactin ist eine einzelne immunologische Inkubation ausreichend, sodaß die analytische Sequenz sogleich nach Verteilung des Substrates erfolgen kann, wenn die Röhren an der Position 98 des Reaktionsmoduls einlangen, was einer kompletten Drehung des Moduls entspricht. Im Laufe der nachfolgenden Drehung wird an Position 82 eine Vormagnetisierung und an Position 83 das Ablesen jeder Reaktion an drei unterschiedlichen Wellenlängen (405, 450 und 604nm) vorgenommen.
Für die Bestimmungen, die zwei immunologische Inkubationen erfordern, wird die erste Inkubation wie oben beschrieben ausgeführt, außer daß an Position 98 keine Verteilung des Substrates erfolgt. Wenn die Röhren bei ihrer zweiten Umdrehung an die Position 4 gelangen, erhalten sie eine geeignete Menge des folgenden:
- R&sub2; - IgG Anti-Toxoplasmose für die Röhre 3,
- R&sub2; - IgG Anti-Rubor für die Röhre 4,
- R&sub2; - IgG Anti-Chlamydia für die Röhre 5 und
- R&sub2; - IgM Anti-Toxoplasmose für die Röhre 6
Zur Herstellung einer zweiten immunologischen Inkubation, welche bis zur Verteilung des Substrates an Position 98 der zweiten Umdrehung des Reaktionsmoduls vor sich geht, wonach eine Vormagnetisierung und Ablesung des Ergebnisses an den Positionen 82 und 83 der dritten Umdrehung erfolgt.
Die folgende Tabelle III zeigt den analytischen Zyklus jeder Substanz: Tabelle III Positionen des Reaktionsmoduls hCG (Röhre 1) Prolactin (Röhre2) Toxo G (Röhre 3) Toxo M (Röhre 4) Chlamydia (Röhre 5) Rubor (Röhre 6) erste Drehung des Reaktionsmoduls zweite Drehung des Reaktionsmoduls Probe + Flush einbringen Monoreagens (R&sub1;+R&sub2;) einbringen Vormagnetisierung Magnetisierung Spülen Substrat einbringen Vormagnetisieren Ablesen des Ergebnisses Reagens R&sub1; einbringen Reagens R2 einbringen dritte Drehung des Reaktionsmoduls Zeitdauer für das erste Ergebnis Minuten Vormagnetisierung Magnetisierung Spülen Substrat einbringen Vormagnetisieren Ablesen des Ergebnisses
Für eine Verweildauer der Reaktionsröhren an jeder Position des Reaktionsmoduls C von zehn Sekunden wird das erste Ergebnis nach dreißig Minuten erhalten, wenn die Bestimmung eine einzelne immunologische Inkubation erfordert und nach siebenundvierzig Minuten, wenn zwei immunologische Inkubationen erforderlich sind.
So beträgt die für hundert Bestimmungen mit einer immunologischen Inkubation erforderliche Zeit ca. 50 Minuten und die für hundert Bestimmungen mit zwei immunologischen Inkubationen erforderliche Zeit ca. 65 Minuten.
Das im folgenden beschriebene Beispiel bezieht sich auf die Bestimmung mehrerer unterschiedlicher Substanzen in einer einzelnen Serumprobe. Es versteht sich, daß es nicht nur möglich ist, eine einzelne Substanz, wie beispielsweise das Prolactin, in einer Probe zu bestimmen. Daher eignet sie sich gut für eine Vielfachparameter-Bestimmung mit willkürlichem Zugriff, bei welcher das Detektieren einer Anzahl unterschiedlicher Substanzen in jeder Probe möglich ist.
Es ist anzumerken, daß das oben beschriebene Verfahren, welches in der erfindungsgemäßen Vorrichtung durchgeführt wird, den Vorteil besitzt, daß die Inkubationszeiten unabhängig von der gesuchten Substanz gleich sind, wobei die Konzentration des zu jeder Substanz Konjugierten in der Weise eingestellt wird, daß die Inkubationsschritte effektiv gleich lang sind.

Beispiel 2: Bestimmung von 15 unterschiedlichen Parametern.

Die untenstehende Tabelle IV zeigt die unterschiedlichen Mengen der unterschiedlichen beizumengenden Substanzen. Tabelle IV *Serum *Flush *Reagens 1 *Reagens 2 *Substrat Chlamydia Cortisol Rubor Toxo G Toxo M * alle Volumina sind in µl angegeben.
In allgemeiner Weise wird für die Bestimmung von Substanzen, die nur eine einzelne Inkubation erfordern, ein Reagens mit Kugeln verwendet, welches mit einem Fragment F(ab')&sub2; eines monoklonalen Antikörpers, welcher gegen die zu bestimmende Substanz gerichtet ist, und dem Konjugierten PAL-F(ab')&sub2; eines vom ersten unterschiedlichen monoklonalen Antikörper, der gegen die zu bestimmende Substanz gerichtet ist, bedeckt sind.
Zu den Substanzen, die zwei immunologische Inkubationen erfordern, ist folgendes zu bemerken:
- Cortisol: das erste Reagens besteht aus Kugeln, die mit einem monoklonalen Anti-Cortisol- Antikörper bedeckt sind, und das zweite Reagens besteht aus Cortisol, welches mit PAL markiert ist;
- T3 gebunden, T3 frei, T4 gebunden und T4 frei: das erste Reagens besteht aus Kugeln, die mit einem monoklonalen T3 oder T4 Antikörper in der Form F(ab')&sub2; bedeckt sind, und das zweite Reagens besteht aus T3 oder T4, das mit PAL markiert ist.
- TSH: das erste Reagens besteht aus Kugeln, die mit monoklonalen Anti-TSH Antikörper in der Form F(ab')&sub2; bedeckt sind, und das zweite Reagens besteht aus dem Fragment F(ab')&sub2; eines gegen TSH gerichteten monoklonalen Antikörper, der mit PAL markiert ist.
Wie bei dem Beispiel 1 kann man die Bestimmung einer Anzahl unterschiedlicher Parameter für jede zu analysierende Probe programmieren.

Beispiel 3: Rolle der magnetisierbaren Masse des Reagens bei der Ausführung des Verfahrens.

Wenn man die in Beispiel 1 beschriebene Bestimmung mit magnetischen Kugeln (DYNAL S.A.) durchführt, welche die folgenden Eigenschaften aufweisen:
Durchmesser: 2,8µm ± 0,2µm
Streuung: 5% (gewöhnlich < 2%)
Masse der magnetisierbaren Materie: 12 ± 2%
werden diese letzteren, deren magnetisierbare Masse 12% beträgt, nach der Spülung abgesaugt, sodaß folglich kein Ergebnis erzielt werden kann. Im Gegensatz dazu, erlauben die erfindungsgemäßen magnetischen Kugeln, deren magnetisierbare Masse größer 45% beträgt, das Erzielen von Ergebnissen innerhalb sehr kurzer Zeiten.

Claims

1. Spüleinrichtung zur Durchführung eines immunologischen, heterogenphasigen Testverfahrens, welche einen festen Träger in Form von magnetischen Kugeln aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß sie folgendes aufweist:

(1) vier Mittel zum Erzeugen eines magnetischen Feldes in dem unteren Bereich von Reaktionsröhren (Tr), welche die zu analysierenden Proben enthalten, und ein oder mehrere für die Bestimmung geeignete Reagenzien, von welchen eines dieser Reagenzien aus magnetischen Kugeln besteht, die von einer Substanz bedeckt sind, die sich spezifisch mit der zu detektierenden Substanz als eine Suspension in einer geeigneten Flüssigkeit verbindet, und eine organische Matrix bilden, welche eine magnetische Ladung umschließt, wobei das Verhältnis von magnetisierbarer zu nicht magnetisierbarer Masse dieser Kugeln größer oder gleich 45% beträgt, jedes Mittel zum Erzeugen eines magnetischen Feldes vorzugsweise aus einem Magnetenpaar besteht, die gegenüberliegend zu beiden Seiten von zwei aufeinanderfolgenden Reaktionsröhren angeordnet sind, und jedes Magnetenpaar (50) eine metallische Umhüllung zur Ausrichtung der magnetischen Feldlinien aufweist, sodaß die Erzeugung des magnetischen Feldes immer nur auf zwei aufeinanderfolgende Röhren begrenzt ist, und

(2) einen Spülkopf(L) welcher an einer Halterung folgendes aufweist:

(i) vier Mittel zum Absaugen der in den Röhren enthaltenen Flüssigkeit,

(ii) drei Mittel zum Verteilen einer Spülflüssigkeit auf diese Röhren,

(iii) ein Mittel zum Verteilen eines geeignetes Substrates,

wobei diese Mittel an der Halterung in der Weise angeordnet sind, daß das erste notwendigerweise ein Mittel zum Absaugen und das letztere notwendigerweise ein Mittel zum Verteilen eines Substrates ist und

die Spülvorrichtung entlang ihrer Vertikalachse bewegbar ist.

2. Vorrichtung zum automatischen immunologischen Bestimmen von zumindest einer Substanz in einer Mehrzahl von zu analysierenden heterogenphasigen Proben in mehreren aufeinanderfolgenden Schritten, die einen analytischen Zyklus bilden, welche einen festen Träger in Form magnetischer Kugeln umfaßt und die Vorrichtung weiters folgendes aufweist:

(1) ein Probemodul (A), das aus einer Mehrzahl von Trägern für Röhren (Te) besteht, welche die Proben enthalten,

(2) ein Reaktionsmodul (C), das aus folgendem besteht:

(i) einer Mehrzahl von Trägern für Röhren (Tr), die bestimmt sind, um aufeinanderfolgend eine aliquote Menge der Proben und eine aliquote Menge eines geeigneten Reagens aufzunehmen und

(ii) einer Mehrzahl von sequentiellen Behandlungspositionen dieser Reaktionsröhren, welche einen analytischen Zyklus bilden;

(3) ein Reagenzmodul (E), das aus einer Mehrzahl von Trägern für Röhren besteht, welche das geeignete/die geeigneten Reagenzien für die verschiedenen Bestimmungen enthalten, die verwirklicht werden sollen, wobei zumindest eines der Reagenzien in Form von magnetischen Kugeln vorhanden ist, die mit einer Substanz bedeckt sind, weiche sich spezifisch mit der zu detektierenden Substanz als Suspension in einer geeigneten Flüssigkeit verbindet;

(4) ein Mittel (B) zum Entnehmen und zum Verteilen der Proben in die Röhren (Tr) des Reaktionsmoduls,

(5) ein Mittel (D) zum Entnehmen und zum Verteilen der Reagenzien in die Röhren des Reaktionsmoduls,

(6) ein geeignetes Mittel zum Ablesen der in dem Reaktionsmodul ablaufenden Reaktion.

und die Vorrichtung, durch folgendes gekennzeichnet ist:

(a) das Reaktionsmodul (C), das mit einem Steuerungsmikroprozessor verbunden ist, weist eine Einrichtung nach Anspruch 1 zum Spülen der magnetischen Kugeln auf, die aus einer organischen Matrix gebildet werden, welche eine magnetische Ladung umgibt, wobei das Verhältnis von magnetisierbarer zu nicht magnetisierbarer Masse dieser Kugeln größer oder gleich 45% ist und

(b) die Vorrichtung weist ein Informationssystem auf, das aus einem Steuerrechner für die verschiedenen Module und die Mittel (1) bis (6) besteht und das Durchführen einer Aufeinanderfolge analytischer Zyklen ermöglicht.

3. Einrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß jedes Reaktions-, Proben- und Reagenzienmodul eine in Drehung versetzbare Trommel aufweist, wobei die Drehungen der verschiedenen Trommeln durch das Informationssystem synchronisiert sind.

4. Einrichtung nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsmodul eine Anzahl von Positionen für Röhren aufweist, welche der Verwirklichung zumindest eines analytischen Zyklus entsprechen, welcher die folgende Reihenfolge aufeinanderfolgender Stufen aufweist:

- Einbringen der Probe, die analysiert werden soll in Position 1,

- Einbringen der geeigneten Reagens in Position 4,

- Vormagnetisieren in Position 86,

- Magnetisieren und Ansaugen in Position 87,

- Spülen in Position 88,

- Vormagnetisieren in Position 89,

- Magnetisieren und Ansaugen in Position 90,

- Spülen in Position 91,

- Vormagnetisieren in Position 92,

- Magnetisieren und Ansaugen in Position 93,

- Spülen in Position 94,

- Vormagnetisieren in Position 95,

- Magnetisieren und Ansaugen in Position 96,

- etwaiges Verteilen des Substrats in Position 98,

- Vormagnetisieren in Position 82,

- Ablesen des Ergebnisses in Position 83.

5. Einrichtung nach irgend einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Haltezeit einer Reaktionsröhre in einer Position ungefähr zwischen 5 und 20 Sekunden liegt.

6. Einrichtung nach irgend einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsmodul darüber hinaus einer Einrichtung zum Regeln der Temperatur zugeordnet ist.

7. Einrichtung nach irgend einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung darüber hinaus zumindest ein Mittel (101-110) zum Dekontaminieren mittels einer Spülung der Mittel (B) und (D) zum Entnehmen und zum Verteilen der Proben und der Reagenzien aufweist.

8. Verfahren zur immunologischen, heterogenphasigen Bestimmung einer Substanz, insbesondere mittels eines Konkurrenzverfahrens oder einer Zweilagen-Methode, in mehreren aufeinanderfolgenden Schritten an einer Mehrzahl von zu analysierenden Proben unter Verwendung von geeigneten magnetischen Kugeln als festen Träger, welches folgende Schritte aufweist:

- aufeinanderfolgende Verteilung von Proben und Reagenzien,

- immunologische Inkubation,

- Spülen und,

- Messen dieser Substanz,

wobei die automatisierten Schritte einen analytischen Zyklus bilden, welcher eine Mehrzahl von sequentiellen Behandlungspositionen der Reaktionsröhren bildet und durch synchrone Rotation von Proben-, Reagenzien- und Reaktionsmodule bestimmt ist, welche die Röhren mit den zu analysierenden Proben tragen, nämlich die Reagenzienröhren und die Reaktionsröhren, und dieses Verfahren durch folgendes gekennzeichnet ist:

(a) die magnetischen Kugeln, welche mit einer Substanz bedeckt sind, die sich spezifisch mit der zu detektierenden Substanz als eine Suspension in einer geeigneten Flüssigkeit verbindet, werden durch eine organische Matrix gebildet, welche eine magnetische Ladung umschließt, und besitzen ein Verhältnis zwischen magnetisierbarer und nicht magnetisierbarer Masse von größer oder gleich 45%,

(b) die Dauer der immunologischen Inkubation ist für alle zu detektierenden Substanzen gleich und entspricht einer Drehung des Reaktionsmoduls zwischen den Behandlungspositionen 5 und 85,

(c) das Spülen dieser magnetischen Kugeln erfolgt mit Hilfe einer Spülvorrichtung nach Anspruch 1 und

(d) der Meßschritt weist die folgende Sequenz von Behandlungspositionen auf:

Position 95: Vor-Magnetisieren,

Position 96: Magnetisieren und Absaugen,

Position 98: Verteilen des Substrates,

Position 82: Vor-Magnetisieren,

Position 83: Ablesen des Ergebnisses.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der analytische Zyklus eine einzige immunologische Inkubation und eine Entwicklungsinkubation umfaßt, die aus einer enzymatischen Inkubation besteht, wobei diese Inkubationen die folgenden Stufen aufweisen:

I. Immunologische Inkubation:

a) Die Verteilung einer aliquoten Menge einer zu analysierenden Probe in einer Reaktionsröhre,

b) die Verteilung einer aliquoten Menge eines geeigneten Reagens in der Reaktionsröhre,

c) die Herstellung eines Kontakts zwischen Probe und Reagens während einer geeigneten Zeit, welche der Dauer einer vollständigen Drehung einer Reaktionsröhre entspricht,

d) eine erste Sedimentation der magnetischen Kugeln, der eine Ansaugung des Aufschwimmenden, sodann eine erste Spülung folgt,

e) eine zweite Sedimentation der magnetischen Kugeln, der eine Ansaugung des Aufschwimmenden, sodann eine zweite Spülung folgt,

f) eine dritte Sedimentation der magnetischen Kugeln, der eine Ansaugung des Aufschwimmenden, sodann eine dritte Spülung folgt,

g) eine vierte Sedimentation der magnetischen Kugeln, der eine Ansaugung des Aufschwimmenden folgt, sodann

II. Enzymatische Inkubation:

h) Eine Verteilung des Substrats und die Herstellung eines Kontakts der magnetischen Kugeln mit dem Substrat während einer geeigneten Zeit, die von der Dauer einer Drehung der Reaktionsröhre zwischen der Verteilung des Substrats und der Stufe des Ablesens des Ergebnisses abhängt, der eine Sedimentation der magnetischen Kugeln folgt,

i) sodann die Ablesung des Ergebnisses,

wobei jede der Stufen einer Anzahl sequentieller Positionen einer Reaktionsröhre entspricht.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubation unter Anwesenheit eines Monoreagens verwirklicht wird, das aus einer Vormischung eines ersten Reagens R&sub1;, das magnetische Kugeln enthält, die von einer Substanz S&sub1; bedeckt sind, die sich spezifisch mit der Substanz bindet, die erfaßt werden soll, und eines zweiten Reagens R&sub2;, "konjugiert" genannt besteht, das aus einer geeigneten Markierung besteht, die mit einer Substanz S&sub2; gekoppelt ist, die unterschiedlich oder identisch mit S&sub1; ist und die mit S&sub1; nicht reagiert.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Monoreagens aus einer Vormischung des folgenden besteht: eines ersten Reagens R&sub1;, das magnetische Kugeln enthält, die von einer Substanz S&sub1; bedeckt sind, die aus einer Gruppe gewählt ist, die folgendes umfaßt: die geeigneten monoklonalen Antikörper, die Fragmente F (ab')&sub2; eines geeigneten monoklonalen Antikörpers, die geeigneten polyklonalen Antikörper, wobei die Antikörper gegen die Substanz gerichtet werden, die bestimmt werden soll und die geeigneten Antigene, insbesondere die Substanz, die bestimmt werden soll oder eines ihrer Fragmente; und eines zweiten Reagens R&sub2; oder ein "konjugiertes", das aus der alkalischen Phosphatase besteht, die einer Substanz S&sub2; zugeordnet ist, die aus der Gruppe gewählt ist, welche folgendes umfaßt: die geeigneten monoklonalen Antikörper, die Fragmente F(ab')&sub2; eines geeigneten monoklonalen Antikörpers, die geeigneten polyklonalen Antikörper, wobei die Antikörper gegen die Substanz gerichtet werden, die bestimmt werden soll, und die geeigneten Antigene, insbesondere die Substanz, die bestimmt werden soll oder eines ihrer Fragmente und die Antigen- Immunoglobulin-Komplexe.

12. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der analytische Zyklus zwei immunologische Inkubationen und eine Entwicklungsinkubation umfaßt, die aus einer enzymatischen Inkubation besteht, wobei dieser Zyklus die folgenden Stufen aufweist:

I. Erste immunologische Inkubation:

a) Das Einbringen einer aliquoten Menge einer zu analysierenden Probe in einer Reaktionsröhre,

b) das Einbringen einer aliquoten Menge eines geeigneten Reagens in der Reaktionsröhre,

c) die Herstellung eines Kontakts zwischen Probe und des Reagens während einer geeigneten Zeit, welche der Dauer einer vollständigen Drehung einer Reaktionsröhre entspricht,

II. Zweite immunologische Inkubation:

die Stufen b) bis g) werden ein zweites Mal ausgeführt, sodann

III. Enzymatische Inkubation:

h) Eine Verteilung des Substrates und die Herstellung eines Kontakts der magnetischen Kugeln mit dem Substrat während einer geeigneten Zeit, die von der Dauer einer Drehung zwischen der Verteilung des Substrats und der Stufe des Ablesens des Ergebnisses abhängt, der eine Sedimentation der magnetischen Kugeln folgt,

i) sodann die Ablesung des Ergebnisses,

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die erste immunologische Inkubation in Anwesenheit eines ersten Reagens R&sub1; bewirkt wird, das aus magnetischen Kugeln besteht, die von einer Substanz S&sub1; bedeckt sind, die sich spezifisch mit der Substanz bindet, die erfaßt werden soll, und die zweite immunologische Inkubation im Beisein eines zweiten Reagens R&sub2; - "konjugiert" genannt - bewirkt wird, das aus einer geeigneten Markierung besteht, die mit einer Substanz S&sub2; gekoppelt ist, die unterschiedlich oder identisch mit S&sub1; ist, und die mit S&sub1; nicht reagiert.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die erste immunologische Inkubation in Anwesenheit eines ersten Reagens R&sub1; bewirkt wird, das aus magnetischen Kugeln besteht, die von einer Substanz S&sub1; bedeckt sind, die aus der Gruppe gewählt ist, welche folgendes umfaßt: die geeigneten monoklonalen Antikörper, die Fragmente F (ab')&sub2; eines geeigneten monoklonalen Antikörpers, die geeigneten polyklonalen Antikörper, wobei die Antikörper gegen die Substanz gerichtet werden, die bestimmt werden soll und die geeigneten Antigene, insbesondere die Substanz, die bestimmt werden soll oder eines ihrer Fragmente; und die zweite immunologische Inkubation in Anwesenheit eines zweiten Reagens R2 oder eines konjugierten bewirkt wird, das aus der alkalischen Phosphatase besteht, die einer Substanz S2 zugeordnet ist, die aus der Gruppe gewählt ist, welche folgendes umfaßt: die geeigneten monoklonalen Antikörper, die Fragmente F (ab')&sub2; eines geeigneten monoklonalen Antikörpers, die geeigneten polyklonalen Antikörper, wobei die Antikörper gegen die Substanz gerichtet werden, die bestimmt werden soll, und die geeigneten Antigene, insbesondere die Substanz, die bestimmt werden soll, oder eines ihrer Fragmente und die Antigen-Immunoglobulin-Komplexe.

15. Verfahren nach irgend einem der Ansprüche 8 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß dieses darüber hinaus eine Stufe des Kalibrierens mittels mehrerer Parameter umfaßt, die vor der Bestimmung der Proben durchgeführt wird.

16. Verfahren nach irgend einem der Ansprüche 8 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Dauer einer immunologischen Inkubation unabhängig von der zu bestimmenden Substanz im wesentlichen einer vollständigen Drehung des Reaktionsmoduls entspricht.