DE69108554T2

DE69108554T2 - Analyse der varianten von analyten.

Info

Publication number: DE69108554T2
Application number: DE69108554T
Authority: DE
Inventors: Erling Sundrehagen
Original assignee: Axis Biochemicals AS
Current assignee: Axis Biochemicals AS
Priority date: 1990-06-21
Filing date: 1991-06-20
Publication date: 1995-08-31
Anticipated expiration: 2011-06-21
Also published as: EP0535162A1; CZ374392A3; NO924912L; WO1991019983A1; HU215555B; HUT65621A; SK374392A3; ES2069902T3; FI925781A; CZ283072B6; SK279009B6; HU9204073D0; DE69108554D1; NO924912D0; NO303852B1; EP0535162B1; JPH06502912A; JP2517187B2; ATE120551T1; FI925781A0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration einer Teilmenge von Analytvarianten innerhalb einer Gruppe verschiedener Analytvarianten sowie Testkits und Reagenszusammensetzungen zur Verwendung in einem solchen Verfahren.
Biologische Moleküle, wie Enzyme, Antigene und andere biologisch wichtige Proteine liegen häufig in Form einer Population von Varianten vor, die zwar eine gemeinsame biologische Funktion oder Eigenschaft, z.B. Antigenizität oder enzymatische Aktivität, besitzen, aber dennoch leichte strukturelle Unterschiede aufweisen. Diese strukturelle Abweichung kann durch Unterschiede in der Primär-, Sekundär- oder Tertiärstruktur der Aminosäuresequenzen von Proteinen oder Polypeptiden oder durch Unterschiede in den Kohlenhydratgruppen oder der Lipidzusammensetzung des Moleküls bedingt sein. Obwohl eine gemeinsame, charakterisierende Eigenschaft oder Funktion zwischen den Variantenmolekülen in einer bestimmten Population erhalten bleibt, führen solche Unterschiede oft zu einer Veränderung der anderen Eigenschaften der Varianten, z. B. Größe, Ladung, isoelektrischer Punkt (pI), wodurch sich wiederum ihr Verhalten in verschiedenen Fraktionierungs- und Trennungssystemen ändert. Sie können als Grundlage für die Isolierung einer oder mehrerer solcher Varianten aus einem Gemisch von Varianten verwendet werden.
Enzyme liegen häufig als Varianten, z. B. als Isoenzyme, vor und es ist nun bekannt, daß viele andere biologische Proteine in zwei oder mehreren Variantenformen vorliegen, die sich häufig durch den Glykosylierungsgrad des Proteins oder durch die Kohlenwasserstoffzusammensetzung unterscheiden. Die relativen Konzentrationen solcher Varianten in Körpergewebe oder - flüssigkeit sind im allgemeinen konstant. Sie können jedoch durch bestimmte Krankheiten oder pathologische Zustände oder als Folge von anderen Störungen des Körpers beeinträchtigt werden. So ist z. B. bekannt, daß das Verhältnis von glykosyliertem zu nicht-glykosyliertem Hämoglobin im Serum von Patienten, die an Diabetes leiden, höher ist. Gleichermaßen können bestimmte Strukturproteine von analytischem Interesse, z. B. Myoglobine, in verschiedenen Organen leichte strukturelle Unterschiede aufweisen und können infolge einer durch Krankheit oder Verletzung verursachten Zellschädigung in die Blutbahn gelangen.
Somit kann durch Messung der Mengen der verschiedenen Varianten im Blut oder in anderen Körpergeweben oder -flüssigkeiten eine Diagnose oder Bestimmung (Assessment) des Stadiums einer Krankheit oder Zellschädigung durchgeführt werden. Von besonderer Bedeutung ist in dieser Hinsicht die Bestimmung (Assessment) der Mengen verschiedener Varianten des Proteins Transferrin im Serum. Transferrin liegt üblicherweise in sialylierten Formen, d.h. mit drei oder mehreren Sialylresten, vor. Bei chronischen Alkoholikern ist jedoch der Gehalt an desialyliertem Transferrin, d.h. an Transferrin mit zwei oder weniger Sialylresten, iin Vergleich zu Nichtalkoholikern relativ erhöht, z. B. von einem Normalgehalt von etwa 1-3 % bis auf etwa 6-25 % des Gesamttransferringehaltes im Patientenserums. Desialyliertes Transferrin, oft als Kohlenhydratdefizientes Transferrin (CDT) bezeichnet, wird inzwischen allgemein als klinisch zuverlässiger Marker für chronischen Alkoholismus betrachtet. Die gegenwärtigen Methoden zur Quantifizierung der Transferrinvarianten sind jedoch zeitaufwendig und erfordern modernste biochemische Ausrüstung. Da es keinen einfachen und bequemen Test für den desialylierten Transferrin- Marker gibt, wird chronischer Alkoholmißbrauch daher gegenwärtig noch ausgehend von der Krankengeschichte, den Informationen von den Patienten selbst bezüglich ihres Alkoholkonsums und einer Reihe von Labortests, die allesamt begrenzte Sensitivität und Spezifität besitzen, diagnostiziert. Der Blutalkoholspiegel ist nur dann ein zuverlässiges Maß, wenn das Blut innerhalb von 24 Stunden nach der Alkoholaufnahme entnommen wird. Bei allen gegenwärtigen chemischen Tests sind Sensitivität und Spezifität zu gering, um alle Individuen mit Alkoholmißbrauch in verläßlicher Weise zu identifizieren.
Die Mikroheterogenität von Transferrin und deren Korrelation mit Alkoholmißbrauch wurden 1980 zum ersten Mal festgestellt (Stibler H., Sydow O., Borg S., "Quantitative estimation of abnormal microheterogeneity of serum transferrin in alcoholics", Pharmac. Biochem. Behav., 1980, 13 Suppl. 1,47- 51). Die klinische Bedeutung dieser Mikroheterogenität ist weiter erforscht worden und es sind isoelektrische Fokussierungsund Chromatofokussierungsverfahren zur quantitativen Auftrennung der verschiedenen Transferrin-Varianten untersucht worden (Vesterborg O., Petren S. und Schmidt E.: "Increased concentrations of a transferrin variant after alcohol abuse", Clinical Chemica Acta, 141 33-39, 1984; Storey E.L., Mack U., Powell L.W. und Halliday J.W.: "Use of chromatofocusing to detect a transferrin variant in the serum of alcoholic subjects", Clin. Chem. 31: 1543-1545, 1985). Joustra und Blanche meldeten 1984 in Schweden ein Verfahren zum Patent an, und Stibler, Borg und Joustra veröffentlichten 1984 ein Minisäulen-Anionenaustauscherchromatographie-Verfahren zur quantitativen Filtration von Kohlenhydrat-defizientem Transferrin im Serum im Zusammenhang mit Alkoholkonsum (Stibler H. Borg S. und Joustra M.: Alcoholism 10: 535-544, 1986; Joustra M. & Blanche c., Schwedische Patentanmeldung 8400587-5). Diese Verfahren basieren auf der Trennung der Transferrinvarianten-Fraktionen in Serumproben durch isokratische Ionenaustauscherchromatographie, gefolgt von einer doppelten Antikörper-Radioimmunoassay-Quantifizierung des Transferringehaltes der verschiedenen Fraktionen. Bei diesem Ionenaustauscherchromatographieverfahren werden alle Transferrinkomponenten, die 2 oder weniger Sialinsäurereste aufweisen und somit über einem ph von 5,65 isoelektrisch sind, getrennt. Unter Anwendung dieses Verfahrens konnten 77 Patienten als Alkoholiker deutlich von den 80 gesunden "normalen Konsumenten" und den 33 absoluten Nichtalkoholikern dadurch unterschieden werden, daß sie erhöhte Mengen an Transferrin-Varianten mit isoelektrischen Punkten (pl) oberhalb pH 5,65 aufwiesen.
Die Hauptschwierigkeit bei diesen Verfahren besteht darin, daß ihre Durchführung umständlich und zeitaufwendig ist. Es ist ein Zweistufen-Verfahren nötig, wobei eine chromatographische 35 Trennung der Transferrin-Varianten in den Serumproben durchgeführt wird, gefolgt von einer Quantifizierung der so getrennten Transferrin-Varianten durch einen Immunoassay.
Daher besteht ein Bedarf an einem zuverlässigen und einfachen Test auf verschiedene Analytvarianten innerhalb einer Mischpopulation von Analytvarianten und insbesondere an einem verbesserten Verfahren zur Detektion der verschiedenen Varianten von Transferrin.
Solche klinisch interessanten Analytvarianten sind normalerweise von proteinartiger Beschaffenheit und besitzen häufig einen leicht identifizierbaren proteinartigen Bindungspartner, mit dem sie einen Komplex bilden. Meist ist die Analytvariante ein Antigen und der Bindungspartner ist daher ein Antikörper, obwohl von vielen Proteinen insbesondere bekannt ist, daß sie an andere Proteine oder Peptide binden und daher als Bindungspartner in Betracht kommen. So ist z. B. das Protein Haptoglobin ein spezifischer Bindungspartner für Hämoglobin. Diese Bindungspartner können, z. B. mit einem Enzym oder einem anderen Reporter-Atom oder -Rest, markiert und dann in Testverfahren zur Markierung der interessierenden Analytvarianten verwendet werden.
Der vorliegenden Erfindung liegt der Gedanke zugrunde, daß proteinartige Analytvarianten vor der Trennung unter Verwendung markierter Bindungspartner markiert werden können, so daß nach der Trennung durch Bestimmung (assessment) der Markierung in den getrennten Fraktionen ein quantitativer Hinweis auf die relativen Variantenmengen erhalten wird. Es wurde jedoch für wichtig befunden, daß die Analytvarianten mit einer Population markierter Bindungspartner umgesetzt werden, die gegenüber allen der verschiedenen, zu analysierenden Analytvarianten reaktiv sind, aber eine im wesentlichen einheitliche Verteilung oder Mobilität in dem gewählten Fraktionierungs- oder Trennungssystem aufweisen.
Ein derartiges Verfahren ist wesentlich einfacher durchführbar als bisherige Systeme unter Anwendung einer Trennung, gefolgt von herkömmlichen Immunoassays mit den einzelnen Fraktionen.
Somit stellt die Erfindung gemäß einem Aspekt ein Verfahren zur Bestimmung (assessment) der Konzentration einer Teilmenge von Varianten in einer Population von Varianten proteinartiger Analyten, die durch ein Fraktionierungssystem getrennt werden kann, zur Verfügung, wobei die Population von Varianten mit einer Population markierter, proteinartiger, spezifischer Bindungspartner davon in Kontakt gebracht wird, um markierte Bindungspartner-Analyt-Komplexe damit zu bilden, die dann einer Trennung durch das Fraktionierungssystem in eine oder mehrere Fraktionen, welche die Teilmenge von Analytvarianten in komplexierter Form enthalten, unterzogen werden, und wobei man die Menge an Markierung in einer oder mehreren der erhaltenen Fraktionen bestimmt, wobei die Population spezifischer Bindungspartner vor der Reaktion eine im wesentlichen einheitliche Verteilung oder Mobilität in dem Fraktionierungssystem aufweist. Der Begriff "proteinartig" soll, so wie er hier verwendet wird, alle Moleküle miteinschließen, die von der Beschaffenheit her im wesentlichen Proteine sind, einschließlich sowohl Peptiden als auch Polypeptiden, die jedoch zusätzliche Gruppen nicht-proteinartiger Beschaffenheit, z. B. Lipid- oder Kohlenhydratgruppen, aufweisen können.
Da der Bindungspartner in dem Varianten-/Bindungspartner- Komplex eine im wesentlichen einheitliche Verteilung oder Mobilität in dem gewählten Fraktionierungssystem aufweist, sind die Unterschiede zwischen der Mobilität oder Verteilung der Varianten-/Bindungspartner-Komplexe durch die Unterschiede zwischen den Varianten in diesen Komplexen, mit anderen Worten durch die Varianz der Analyten, bedingt. Eine oder mehrere Fraktionen dieser so erhaltenen Varianten-/Bindungspartner-Komplexe können durch das gewählte Fraktionierungssystem getrennt und die Menge an Markierung in jeder getrennten Fraktion kann bestimmt werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt wird erfindungsgemäß auch eine Zusammensetzung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Verfügung gestellt, umfassend markierte, proteinartige Bindungspartner, z. B. Antikörper oder immunreaktive Fragmente davon, die im wesentlichen einheitliche Mobilität oder Verteilung in einem oder mehreren auf Ladung oder isoelektrischem Punkt basierenden Fraktionierungssystemen aufweisen.
Gemäß einem weiteren Aspekt wird ein analytischer Testkit, umfassend die Zusammensetzung zusammen mit den Reagenzien und/oder Materialien, die zur Durchführung der Fraktionierung erforderlich sind, bereitgestellt.
Zweckmäßigerweise unterscheiden sich die Analytvarianten durch ihre Ladung in einem vorgegebenen Puffersystem und können somit leicht durch ein auf Ladung ausgelegtes System, wie z. B. Ionenaustauscherchromatographie oder Elektrophorese, getrennt werden. Die Analytvarianten können sich auch in ihrem isoelektrischen Punkt (pi) unterscheiden und durch isoelektrische oder Chromatofokussierung getrennt werden. So können z. B. das "Mono-P"-Säulen- und das "Polypuffer"-Chromatofokussierungssytem von Pharmacia, Schweden verwendet werden. Die isoelektrische Fokussierung der Komplexe kann in zweidimensionalen Gel-Sheets erfolgen, oder alternativ dazu können die Komplexe durch einfache Elektrophorese in Agarosgel getrennt werden. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann ein breites Spektrum von Ionenaustauschermedien und Festphasen verwendet werden. Die ionisierbaren chemischen Reste auf diesen Medien können aus Aminresten oder sulfonierten oder carboxylierten Resten bestehen, ohne auf diese beschränkt zu sein, und können auf Perlen, Partikel, Gele, Membranen, Filter oder auf jede andere geeignete Festphase aufgebracht werden. Obwohl solche Fraktionierungssysteme einfach anzuwenden sind und gute Ergebnisse liefern und somit erfindungsgemäß bevorzugt sind, kann jedes andere Fraktionierungssystem verwendet werden, das eine Eigenschaft nützt, die bei dem Analyten variiert und die bei dem gewählten Bindungspartner daher konstant ist.
Harze oder Partikel können als Batch-Aufschlämmung oder in Säulen verwendet werden. Die Säulen können mit Salz oder pH- Gradienten oder durch isokratische Elution eluiert werden. Aus praktischer Sicht sind Batch-Aufschlämmung und isokratische Elution bevorzugt. Magnetisierbare Partikel haben sich als besonders vorteilhaft erwiesen. Die Ionenaustauscher-Festphase kann auch aus starren dreidimensionalen Strukturen oder aus Ionenaustauscherfiltern bestehen. Bei Verwendung eines Filters kann die Filtration parallel zur Oberfläche, z. B. radial oder entlang eines Filtrierstreifens, erfolgen.
Zweckmäßigerweise werden alle oder einige der verschiedenen, zur Durchführung des Trennungsschritts erforderlichen Reagenzien und Komponenten in Form eines Kits zusammen mit der markierten Bindungspartnerzusammensetzung bereitgestellt. Wie oben erwähnt, stellt dies einen weiteren erfindungsgemäßen Aspekt dar.
Solche Reagenzien und Materialien umfassen im allgemeinen Puffersalze oder -lösungen, oberflächenaktive Agenzien, z. B. Tween und dergleichen, Konservierungsmittel, z. B. Natriumazid, die verschiedenen Gele, Harze oder anderen Medien, die zur Durchführung des Fraktionierungsschritts erforderlich sind, gegebenenfalls gebrauchsfertig hergerichtet, z. B. als Säulen, usw.
Nach der Bildung der Analytvarianten-/Bindungspartner-Komplexe werden diese Komplexe, wie oben erwähnt, isoliert und die Menge der in der (den) Komplexfraktion(en) vorhandenen Markierung wird bestimmt.
Bei den Markierungssubstanzen kann es sich um jedes herkömmliche, dem Fachmann bekannte Markierungssystem handeln. So können die Markierungssubstanzen fluoreszierender, farbiger, radioaktiver oder enzymatischer Art sein und in bekannter Weise bestimmt werden. Radioaktive Markierungen sind im allgemeinen unter den üblicherweise in Radioimmunoassays verwendeten Radioisotopen, z. B. ¹²&sup5;I, ausgewählt, und es sind viele fluoreszierende oder Farbmarkierungssubstanzen beschrieben worden. So gehören zu den geeigneten fluoreszierenden Markierungen Dimetyhlaminonaphthalin, Fluorescein, Dichlortriazinyl-aminofluorescein oder fluoreszierende Metallverbindungen. Beispiele für Farbmarkierungssubstanzen sind 4-Dimethylaminobenzol, 4-N,N- Dimethylaminoazobenzol, Trinitrobenzol, Benzofurazine, Tetramethylrhodamin, Texasrot, Morpholinorhodamin und Derivate davon, Azobenzole, Anthrachinone, Oxazine, Thiazine, Triazine, Porphyrine, Phycobiline, Chlorophylle, Indigofarbstoffe und Analoga oder Derivate davon.
Wie oben erwähnt, kann jeder beliebige proteinartige Bindungspartner für den jeweiligen Analyten verwendet werden, unter der Voraussetzung, daß er einheitliche Mobilität oder Verteilung in den gewählten Fraktionierungssystemen aufweist. Antikörper sind im allgemeinen bevorzugte Bindungspartner für Antigene und Haptene. Situationsbedingt können jedoch auch andere Bindungspartnersysteme, z. B. Haptoglobin-Hämoglobin- oder Hormon-Rezeptor-Systeme, eingesetzt werden.
Immunreaktive Antikörperfragmente, z. B. F(ab)- oder F(ab')&sub2;-Fragmente, können ebenfalls verwendet werden, solange das Verhalten des Fragments in dem Fraktionierungssystem einheitlich bleibt. Solche Fragmente können zweckmäßigerweise S- blockiert sein, z. B. mit S-Carboxymethylgruppen.
F(v)-Fragmente, d.h. die hypervariablen Regionen von F(ab)-Fragmenten können ebenfalls verwendet werden und können durch rekombinante DNA-Technologie oder chemische Synthese hergestellt worden sein.
Es wurde gefunden, daß es aufgrund der divalenten Reaktivität des markierten Reagens zu einer signifikanten Vernetzung kommt, wenn das markierte Antikörper- oder F(ab)&sub2;-Fragment in annähernd gleicher molarer Menge wie der Analyt oder in molarem Überschuß dazu vorliegt. Dadurch ergibt sich ein niedriger Wert für die Anzahl der Analytmoleküle. Daher ist es in vielen Fällen bevorzugt, monovalente markierte Analytbindungspartner, insbesondere F(ab)- oder F(v)-Fragmente geeigneter Antikörper, zu verwenden.
Es ist zu beachten, daß solche monovalenten Fragmente, insbesondere synthetisch produzierte, einer geringeren Variabilität unterliegen und daß bei sorgfältiger, einheitlicher Markierung kein Fraktionierungsschritt zur Erfüllung des Kriteriums der einheitlichen Mobilität oder Verteilung in dem gewählten Fraktionierungssystem erforderlich ist.
Im folgenden umfaßt die Bezeichnung "Antikörper" der Einfachheit halber, sofern nicht anders angegeben, auch Fragmente von Antikörpern.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere zur Analyse des Spiegels verschiedener Varianten von Transferrin geeignet. Gemäß einer besonderen erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein Verfahren zur Bestimmung von oft als Isotransferrine bezeichneten Varianten von Transferrin in Blutplasma, Serum, Gesamtblut oder Hämolysat zur Verfügung gestellt. Wie bereits erwähnt, unterscheiden sich die Transferrinvarianten hauptsächlich in der unterschiedlichen Anzahl von Sialinsäureresten auf den Transferrinmolekülen. Das neue erfindungsgemäße Verfahren umfaßt vorzugsweise die Kontaktierung der Probe mit einer Population markierter Antikörper, die mit Humantransferrin reaktiv sind und eine im wesentlichen einheitliche Mobilität oder Verteilung in einem Fraktionierungssystem aufweisen, das ausgewählt ist unter einem Elektrophorese-, Ionenaustauscher-, Chromatofokussierungs- oder isoelektrischen Fokussierungs-System. Vorzugsweise erfolgt der Antikörperbindungsschritt in einer Eisen-III-ionen-enthaltenden Pufferlösung, welche die Bildung von Antigen-Antikörper-Komplexen ermöglicht. Solche Antigen-Antikörper-Reaktionen erfolgen vorzugsweise bei annähernd neutralem ph, vorzugsweise bei pH 5 bis pH 9, und bei einer Salzkonzentration und -zusammensetzung, welche die Bildung solcher Antigen-Antikörper-Komplexe nicht verhindert.
Bei den markierten Antikörpern handelt es sich vorzugsweise um monoklonale Antikörper. Es können aber auch polyklonale Antikörper verwendet werden, da die hier beschriebenen Reinigungsverfahren einheitliche Eigenschaften gewährleisten.
Markierte F(ab)- oder F(v)-Fragmente von Anti-Transferrin- Antikörpern sind neue Substanzen, die besonders brauchbar sind zur Analyse von Transferrinvarianten. Selbst bei relativer Uneinheitlichkeit können mit ihnen bessere Ergebnisse erhalten werden als mit ganzen Antikörpern. Fraktionierte, markierte F(ab)- und F(v)-Fragmente mit einheitlicher Mobilität oder Zusammensetzung in einem oder mehreren Fraktionierungssystemen werden besonders bevorzugt.
Die Transferrine der Probe können vor oder während oder nach Kontaktierung mit den Antikörpern mit Eisen-III-ionen gesättigt werden. Die Sättigung der Transferrine mit Eisen-III- ionen vor oder während der Trennung der Antigen-Antikörper-Komplexe durch die Trennungssysteme ist zur Analyse der Transferrinvarianten durch dieses Verfahren im allgemeinen erforderlich, da durch Unterschiede im Eisen-II-ionengehalt der Varianten das aufgrund der Unterschiede im Sialinsäuregehalt erhaltene Verteilungsmuster in den Trennungssystemen zerstört wird.
Bei der erfindungsgemäß bevorzugten Methode zur Analyse von Transferrinvarianten ist es erforderlich, das Gemisch aus Varianten-/Antikörper-Komplexen einem Chromatofokussierungs-, Ionenaustauscher-, Elektrophorese- oder isoelektrischen Fokussierungs-Trennungssystem zu unterziehen. Da die markierten Antikörper eine im wesentlichen einheitliche Mobilität oder Verteilung in einem dieser Trennungssysteme aufweisen, bilden diese markierten Antikörper Antigen-Antikörper-Komplexe mit den Transferrinvarianten (Isotransferrinen), wobei die Unterschiede in der Mobilität oder der Verteilung in einem der Trennungssysteme den Mobilitäts- oder Verteilungsunterschieden zwischen den Transferrinvarianten entsprechen, aber nicht unbedingt damit identisch sind. Monoklonale Antikörper, die allgemein gegenüber Humantransferrin reaktiv sind und eine im wesentlichen einheitliche Mobilität oder Verteilung in einem der Trennungssysteme aufweisen, können durch herkömmliche Hybridomtechniken produziert und gegebenenfalls durch chemische Methoden modifziert werden. Die Reinigung der erwünschten Antikörper ist üblicherweise erforderlich und erfolgt vorzugsweise unter Verwendung eines der Systeme, z. B. durch Chromatofokussierung, Ionenaustauscherchromatographie, isoelektrische Fokussierung oder Elektrophorese.
Ein erfindungsgemäßer Testkit zur Verwendung bei der Transferrinanalyse umfaßt vorzugsweise markierte Anti-Transferrin-Antikörper, oder besonders bevorzugt markierte Fab-Fragmente solcher Antikörper zusammen mit wenigstens einem Eisen-III- ionensalz oder einer Lösung davon.
Gemäß mehrerer erfindungsgemäßer Ausführungsformen werden markierte Antikörper oder andere proteinartige Bindungspartner mit einem isoelektrischen Punkt innerhalb eines ausgewählten Bereichs oder mit spezieller Verteilung oder Mobilität in den Trennungssystemen bevorzugt. Um solche modifizierten Proteine zu erhalten, können die Proteine vor oder nach dem Markierungsschritt modifiziert werden. Im allgemeinen ändert sich durch solche Modifikationen die Anzahl der geladenen Gruppen, z. B. der sauren oder basischen Gruppen, in dem Molekül. Solche Modifikationen können durch die Verwendung von Reagenzien erfolgen, die mit den Seitenketten der Aminosäuren der Protein reagieren, wie z. B. in Glazer, Delange und Sigman: "Chemical modification of proteins", Elsevier Biomedical Press, Amsterdam, New York, Oxford, 1975, und anderer relevanter Literatur beschrieben. Aminreste können beispielsweise durch Carbamylierung, Acetylierung, Benzylierung oder Succinylierung modifiziert werden, und Carbonsäurereste können durch Veresterung und Kopplung an Nucleophile durch Verwendung von Carbodiimiden oder anderen Kopplungsagenzien modifiziert werden.
In ähnlicher Weise können die Kohlenhydratreste von Antikörpern oder anderen proteinartigen Bindungspartnern modifiziert werden.
Ein zweckmäßiges Verfahren für die Modifikationen, die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Glycoproteinbindungspartner- Zusammensetzungen oft erforderlich sind, ist die Periodat-Oxidation der Kohlenhydratgruppen der Glycoproteine, gefolgt von einer Umsetzung des resultierenden Aldehyds mit Reagenzien zur Einführung saurer oder basischer Gruppen. Eine weitere zweckmäßige, für Proteine mit Disulfidbrücken geeignete Methode ist die partielle Reduktion der Cystin-Disulfidbrücken zwischen den Aminosäurepolypeptidketten der Proteine. Insbesondere Antikörper enthalten mehrere solcher Disulfidbindungen und mehrere, aber nicht alle, der Disulfidbindungen können ohne Verlust der Affinität der Antikörper gegenüber den Antigenen zu freien Thiolen reduziert werden. Diese Bindungen und somit auch die resultierenden Thiole befinden sich in der Hinge-Region der Antikörper, weit entfernt von den Antigenbindungsstellen der Antikörper. 2-Thioethanol und Dithiothreitol sind, allerdings nicht in einschränkendem Sinne, Beispiele für solche Reduktionsmittel. Nach Entfernung des Reduktionsmittels werden in einem einstufigen oder zweistufigen Verfahren Reagenzien, die saure oder basische Gruppen einführen, an die freien Thiole gebunden, und zwar durch bifunktionelle Kopplungsagenzien, die mit Thiolgruppen und nukleophilen Gruppen reagieren, z. B. Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexan-1-carboxylat, Sulfosuccinimidyl (4-iodacetyl) aminobenzoat oder andere Succinimidylmaleimid-enthaltende Reagenzien. Alternativ dazu kann das die sauren oder basischen Gruppen einführende Reagens durch substituierte Pyridyldisulfide oder Thiol-enthaltende Reagenzien gebunden werden, welche die Disulfidbindung wiederherstellen, aber eine chemische Einheit mit sauren oder basischen chemischen Eigenschaften aufweisen.
Gemäß einer besonderen erfindungsgemäßen Ausführungsform kann das nukleophile Reagens aus einem sauren Polymer, z. B. Polypeptiden mit einer oder mehreren sauren Seitenketten an den Aminosäuren, gebildet sein.
Der Vorteil der Kohlenhydratmodifizierung und/oder der Modifizierung durch Reduktion des Cystins in der Hinge-Region besteht in der geringen Interferenz mit den Antigenbindungsstellen der so erhaltenen Antikörper. Saure Polypeptide können jedoch auch an Lysinreste oder andere Reste der Polypeptidstruktur der Antikörper gebunden sein.
Im Falle der Transferrinvarianten-Analyse sind Transferrinvarianten, die zwei oder weniger Sialinsäurereste aufweisen und einen pI-Wert besitzen, der höher ist als derjenige der Transferrinvarianten mit drei oder mehr Sialinsäureresten, von besonderem Interesse. Gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform werden Anionenaustauscherharze bei einem ph und einer Puffersalzkonzentration und -zusammensetzung verwendet, wobei die Antigen-Antikörper-Komplexe von Transferrinvarianten mit drei oder mehr Silinsäureresten an die Anionenaustauscher-Festphase binden, während die Antigen-Antikörper-Komplexe mit Transferrinvarianten, die 2 oder weniger Sialinsäurereste aufweisen, im Gegensatz dazu nicht binden. Gemäß dieser Ausführungsform werden markierte, gegebenenfalls modifizierte Antikörper, die an die Anionenaustauscher-Festphase binden, bevorzugt, so daß nur derjenige markierte Antikörper in Lösung vorliegt, der mit den Transferrinvarianten, die 2 oder weniger Sialinsäurereste aufweisen, Komplexe gebildet hat. Dies ist in Figur 1 schematisch dargestellt. Der tatsächliche pH-Wert und die Pufferzusammensetzung für die Trennung werden ausgehend von dem pi der markierten, monoklonalen Antikörper und der gebildeten Komplexe gewählt. Nach der Trennung, z. B. durch Zentrifugation oder Filtration, wenn die feste Phase als Batch-Aufschlämmung vorliegt, oder durch magnetische Trennung, wenn die feste Anionenaustauscherphase magnetisierbar ist, oder durch Elution, wenn die feste Phase in starrer Form oder in Form einer Säule vorliegt, werden Messungen der in der Lösung verbleibenden Markierung zur Abschätzung (assessment) der Konzentration von denjenigen Antigen-Antikörper-Komplexen durchgeführt, die mit der Konzentration der Transferrinvarianten mit zwei oder weniger Sialinsäureresten korrespondiert.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann mit markierten Bindungspartnern bei einer Konzentration im Überschuß, bezogen auf die Analyt-Gesamtmenge (alle Varianten), oder mit einem Analyt- Überschuß, bezogen auf die Bindungspartner, durchgeführt werden. Verwendet man die Bindungspartner im Überschuß, so erhält man Signale, die der Gesamtkonzentration der verschiedenen Varianten entsprechen. Ist das Analyt im Überschuß vorhanden, erhält man Signale, die der relativen Menge der verschiedenen Varianten, relativ zur Gesamtkonzentration aller Varianten, entsprechen.
Soll der markierte Bindungspartner im Überschuß verwendet werden, so ist er vorzugsweise monovalent. Wie oben erwähnt, neigen divalente Bindungspartner, wie z. B. Antikörper, zur Vernetzung mit zwei verschiedenen Analytmolekülen, insbesondere bei Verwendung in etwa äquimolaren Mengen. Daher sind für diesen Zweck F(ab)- oder F(v)-Fragmente bevorzugt.
Im Falle eines Bindungspartnersystems unter Verwendung von Antikörpern oder Fragmenten davon gegen Antigen-Analyte können gegebenenfalls, wenn ein Überschuß an Antigen eingesetzt wird, markierte, gegebenenfalls modifizierte Antikörper, gereinigt durch Affinitätschromatographie unter Verwendung immobilisierter Antigene, verwendet werden. So können annähernd 100 % der Antikörper oder -fragmente immunreaktiv sein, wodurch die Fraktion freier, nicht-komplexierter Antikörper oder -fragmente im Test auf eine sehr niedrige Menge reduziert wird. Auf diese Weise können mögliche Wechselwirkungen im Rahmen des Antigenvarianten-Analyseverfahrens verringert oder vermieden werden.
Der Vorteil dieser Erfindung besteht in der Kombination der immunologischen Quantifizierung und Fraktionierung in einem Verfahrensschritt, durch Trennung der zwischen den markierten Bindungspartnern und den verschiedenen Analytvarianten gebildeten Komplexe, gefolgt von einer immunologischen Quantifizierung. Somit wird es erfindungsgemäß ermöglicht, Transferrine und andere Analytvarianten leichter zu messen als gemäß dem Stand der Technik, insbesondere zum Zwecke der Messung von Transferrinvarianten mit niedrigem Sialinsäuregehält im Blutserum des Plasmas von Personen, die Untersuchungen im Hinblick auf Alkoholkonsum unterzogen werden.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung in nicht-limitierender Weise, unter Bezugnahme auf die Zeichnungen, wobei:
Figur 2 ein isoelektrisches Fokussierungsgel darstellt und den pi der modifizierten und markierten Antikörper gegen Humantransferrin zeigt;
Figur 3 die Trennung von Anti-Transferrin-FITC-Derivaten durch ionenaustauscherchromatographie auf einer starken Anionenaustauschersäule (Puffer: 20 mM Natriumphosphat, pH 6,5) graphisch darstellt. Die durchgezogene Linie zeigt die UV-Extinktion bei 280 nm, die gepunktete Linie den Salzgradienten (M NaCl);
Figur 4 die weitere Trennung von 3 benachbarten Fraktionen von Anti-Transferrin-FITC-Derivaten, die durch die in Figur 3 dargestellte Präparation erhalten wurden, durch Rechromatographie auf einer starken Anionenaustauschersäule graphisch darstellt. (Puffer: 20 mM Natriumphosphat, pH 6,5);
Figur 5 die Fluoreszenz-Signale von Fraktionen aus Serumproben im Gemisch mit FITC-markierten monoklonalen Anti-Transferrin-Antikörpern, erhalten durch Ionenaustauscherchromatographie graphisch darstellt (Dsteht für das Serum eines Alkoholikers, + für das Serum eines Nichtalkoholikers).
Figur 6 die Fluoreszenz-Signale von Fraktionen graphisch darstellt, die durch Ionenaustauscherchromatographie von Komplexen aus monoklonalen Anti-Transferrin-Antikörpern und Disialo- ( ) und Tetrasialo- (+)-Human-Transferrin erhältlich sind;
Figur 7 die Ergebnisse einer präparativen Anionenaustauscherchromatographie einer markierten, nicht gereinigten Präparation monoklonaler Anti-Transferrin-Antikörper graphisch darstellt;
Figur 8 die Mobilität einer Einzelfraktion, erhalten durch die Chromatographie gemäß Figur 7, in einem Anionenaustauschersystem graphisch darstellt;
Figur 9 die Fluoreszenz von Fraktionen von FICT-Fab-Transferrin-Komplexen aus Serumproben eines Individuums mit schwerem Alkohlmißbrauch (-Δ-) und eines normalen Individuums (... ...), die von einer Anionenaustauschersäule (Mono Q) eluiert wurden, graphisch darstellt.

BEISPIEL 1

Von käuflich erhältlicher Ascites-Flüssigkeit, produziert in Mäusen mit einem Anti-Transferrin-IgG-produzierenden Hybridom, wurden monoklonale Antikörper mit Hilfe der Ionenaustauscherchromatographie und der Gelchromatographie in Phosphatpuffer gereinigt. Die Immunoaff inität der Antikörper wurde mit Hilfe eines Mikrotiter-ELISA-Systems unter Verwendung von immobilisiertem Human-Transferrin und Peroxidase-konjugierten, po- Iyklonalen Anti-Maus-IgG-Antikörpern in Lösung getestet. Die gereinigten Anti-Transferrin-Antikörper wurden gegen 0,1 M Essigsäurepuffer, pH 5,6, dialysiert und mit Hilfe von Periodationen (50 mM Endkonzentration) oxidiert. Nach der Entfernung der Periodationen durch Gelchromatographie wurden die Antikörper mit dem sauren Polypeptid N-Ala-Ala-Ala-Ala-Glu-Glu-Glu- Glu-Glu-COOH in 50-fachem molarem Überschuß über die Antikörper umgesetzt. Anschließend wurde die Bindung mit Hilfe von Cyanoborhydridionen in Lösung (Endkonzentration = 15 mM) stabilisiert. Die resultierenden modifizierten Antikörper wurden gegen 0,1 M Natriumcarbonatpuffer, pH 9,5, dialysiert und mit 2-Thioethanol bei einer Endkonzentration von 10 mM 30 Minuten bei Zimmertemperatur umgesetzt, gefolgt von einer Entfernung des 2- Thioethanols durch Gelchromatographie in Phosphatpuffer bei pH 7,4. N-Ala-Ala-Ala-Ala-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-COOH wurde mit den resultierenden freien Thiolgruppen des Proteins unter Verwendung von Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1- carboxylat bei einem molaren Verhältnis von 1:33:40 von Antikörper:Kupplungsreagens: Peptid umgesetzt. Nach anschließender Dialyse gegen Carbonatpuffer wurden die modifizierten Antikörper mit Fluoresceinisothiocyanat umgesetzt und anschließend durch Gelchromatographie gereinigt. Bei jeder Stufe dieser Modifikationen wurde die Antigenaff inität getestet und es wurde nur eine sehr geringe Verringerung festgestellt. Figur 2 zeigt die Ergebnisse einer isoelektrischen Fokussierung, durchgeführt im Rahmen einer Gelelektrophorese (Phast System, Pharmacia) und veranschaulicht die erreichte Verringerung des pI-Werts. Ein wesentlicher Anteil der modifizierten und markierten Antikörper weist einen ähnlichen oder niedrigeren pI-Wert wie die Isotransferrine mit zwei oder weniger Sialinsäureresten auf. In dieser Figur bezeichnen die Buchstaben (a) bis (e) folgendes:
a) Human-Transferrin
b) Unmodifiziertes monoklonales Anti-Transferrin-IgG
c) Wie b), wobei jedoch Ala-Ala-Ala-Ala-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu- an die Kohlenhydratgruppen gekoppelt wurde.
d) Wie c), wobei jedoch Ala-Ala-Ala-Ala-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu- zusätzlich an die Hinge-Region gekoppelt wurde.
e) Wie d), wobei jedoch Fluorescein-Isothiocyanat mit dem Protein umgesetzt wurde.
Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist eine im wesentlichen einheitliche Verteilung oder Mobilität der Antikörper in dem jeweiligen Trennsystem erforderlich. Anderenfalls macht die Heterogenität der Antikörperkomplexe die Trennung und Quantifizierung der Komplexe aus Antikörpern mit den verschiedenen Antigenvarianten unmöglich.
Figur 3 veranschaulicht die Heterogenität der modifizierten monoklonalen Antikörper nach präparativer Anionenaustauscherchromatographie. Die gepunkteten vertikalen Linien veranschaulichen die gesammelten 20 Fraktionen dieser präparativen Anionenaustauscherchromatographie, um Fraktionen mit engem pH- Bereich zu erhalten.
Figur 4 zeigt die Ergebnisse einer analytischen Chromatographie von Proben dreier verschiedener benachbarter Fraktionen, die aus der präparativen Chromatographie erhalten wurden, wobei veranschaulicht wird, daß annähernd einheitliche Mobilitäten für jede Fraktion erhalten wurden. Noch einheitlichere Fraktionen kann man erhalten unter Verwendung eines weniger steilen Gradientenprofils bei der Elution, repetitiver Chromatographien oder anderer chromatographischer Techniken. Als Alternative dazu oder in Kombination damit können präparative isoelektrische Fokussierung oder Chromatofokussierung angewendet werden.
Wird die Testprobe mit den markierten monoklonalen Anti- Human-Transferrin-Antikörpern mit gleichmäßiger oder annähernd gleichmäßiger Mobilität oder Verteilung vermischt, werden Antigen-Antikörperkomplexe mit unterschiedlicher Mobilität oder Verteilung in dem entsprechenden Trennsystem gebildet und reflektieren die Unterschiede zwischen den Transferrinvarianten. Die verschiedenen Antigen-Antikörperkomplexe werden durch Ionenaustauscherchromatographie, Chromatofokussierung oder isoelektrische Fokussierung oder durch Elektrophorese oder andere chemische Techniken unter Ausnutzung der Unterschiede in der elektrischen Ladung der gebildeten Komplexe getrennt.

BEISPIEL 2

Analyse von Proben von Seren aus Alkoholikern und Nichtalkoholikern

Festphase:
Eine 1 ml-Säule mit Polystyrolpartikeln mit quaternären, Amin-substituierten Oberflächenresten (Mono-Q-Säule von Pharmacia, Uppsala, Schweden).
Eluent:
20 mM Bis-Tris-Puffer mit 100 mM Natriumchlorid, pH 6,50.
Prozedur:
Eine 10 ul Serumprobe wurde mit Eisen-III-citratlösung in 20-fachem molarem Überschuß zum Transferrin-Gehalt der Probe vermischt und anschließend wurde ein monoklonaler Maus-Anti- Human-Transferrin-Antikörper zugesetzt, der mit sämtlichen Varianten von Human-Transferrin reagiert und der modifiziert und mit Fluorescein markiert und gereinigt worden war, um eine sehr homogene Mobilität auf dem Ionenaustauschersystem aufzuweisen. Die Zugabe erfolgt in dem Elutionspuffer in einer molaren 1:1- Konzentration, bezogen auf die Serumkonzentration von Transferrin. Anschließend an eine kurze Inkubationszeit bei Zimmertemperatur (5-10 Minuten) wurde das Gemisch durch die Säule eluiert, gefolgt von einer weiteren Elution mit Elutionspuffer. 1,0 ml-Fraktionen wurden gesammelt und die Fluoreszenz der Fraktionen wurde gemessen (Anregung 485 nm, Emission 520 nm, gemessen auf einem Shimadzu Spektrophotometer RF-540). Figur 5 zeigt ein typisches Diagramm, das man mit Hilfe von Seren aus Alkoholikern und Nichtalkoholikern erhält. Zum Vergleich ist in Figur 6 ein entsprechendes Diagramm gezeigt, das man mit Proben einer Lösung von gereinigtem Disialo- und Tetrasialo-Transferrin an Stelle von Serum erhält.

BEISPIEL 3

Analyse der in Beispiel 2 verwendeten Antikörperfraktion

Figur 7 zeigt ein Chromatogramm, das die Ergebnisse einer prä.parativen Anionenaustauscherchromatographie einer markierten, nicht-gereinigten Präparation monoklonaler Antikörper gemäß Beispiel 2 zeigt. Von diesen Chromatographie-Fraktionen wurden jeweils 0,5 ml entnommen und Figur 8 zeigt ein Chromatogramm, aus welchem hervorgeht, daß jede Fraktion eine sehr gleichmäßige oder homogene Mobilität in den Anionenaustauscherchromatographiesystemen aufweist. Die Chromatographie wurde auf einer Pharmacia Mono Q HRS-Anionenaustauschersäule, äquilibriert mit 20 mM Tris-Puffer, pH 8,0 (Puffer A), durchgeführt. Die Elution erfolgte unter Verwendung eines Elutionsgradienten mit Puffer B (Puffer A, enthaltend 0,7 M NaCl).

BEISPIEL 4

Herstellung von Fluorescein-markierten monoklonalen Fab-Fragmenten mit im wesentlichen gleichmäßiger Mobilität auf einer Anionenaustauschermatrix

Aus käuflich erhältlicher Ascitesflüssigkeit, produziert in Mäusen mit Hilfe bekannter Techniken unter Verwendung eines Anti-Transferrin-IgG-produzierenden Hybridoms, wurden monoklonale Antikörper mit Hilfe der Anionenaustauscherchromatographie und anschließender Größenausschlußgelchromatographie in einem Phosphatpuffer gereinigt. Der Puffer wurde anschließend gegen einen Carbonatpuffer ausgetauscht, bevor man die IgG-Antikörper zu Fab-Antikörperfragmenten unter Verwendung von Papa in in Kombination mit Dithiothreitol verdaute.
Nach dieser enzymatischen Modifikation wurden freie Thiolgruppen (einschließlich der freien Thiolgruppen auf dem Antikörper) mit Iodacetamid blockiert, wodurch auch die enzymatische Aktivität abgestoppt wurde. Die gebildeten Fab-Fragmente wurden durch kombinierte Dialyse und Anionenaustauscherchromatographie gereinigt.
Die gereinigten Antikörperfragmente (Fab) wurden anschließend gegen einen Carbonatpuffer, ph 9,5, dialysiert, bevor sie mit Fluorescein-Isothiocyanat modifiziert wurden. Fluorescein bindet an Aminogruppen auf dem Antikörper und Fluorescein-markiertes Fab wurde durch Größenausschlußchromatographie gereinigt, bevor man schließlich eine Fraktion des markierten Fab von einer Anionenaustauscherchromatographiesäule isolierte. Diese Fraktion wies hinsichtlich des isoelektrischen Punkts einen hohen Homogenitätsgrad auf und besaß somit auf einer Anionenaustauschermatrix gleichmäßige Mobilität.
Die Immunoaffinität von markiertem Fab wurde mit Hilfe eines Mikro-Titer-ELISA-Systems unter Verwendung von immobilisiertem Human-Transferrin und Peroxidase-konjugierten, polyklonalen Anti-Maus-IgG-Antikörpern in Lösung getestet.

BEISPIEL 5

Herstellung von AMCA-markierten monoklonalen Fab-Fragmenten mit im wesentlichen gleichmäßiger Mobilität auf einer Anionenaustauschermatrix

Aus käuflich erhältlicher Ascitesflüssigkeit, produziert in Mäusen mit Hilfe bekannter Techniken unter Verwendung eines Anti-Transferrin-IGG-produzierenden Hybridoms wurden monoklonale Antikörper mit Hilfe der Anionenaustauscherchromatographie und anschließender Größenausschlußgelchromatographie in einem Phosphatpuffer gereinigt. Der Puffer wurde anschließend gegen einen Carbonatpuffer ausgetauscht, bevor man die IGG-Antikörper zu Fab-Antikörperfragmenten unter Verwendung von Papa in in Kombination mit Dithiothreitol verdaute.
Nach dieser enzymatischen Modifikation wurden freie Thiolgruppen (einschließlich der freien Thiolgruppen auf dem Antikörper) mit Iodacetamid blockiert, wodurch auch die enzymatische Aktivität abgestoppt wurde. Die gebildeten Fab-Fragmente wurden durch kombinierte Dialyse und Anionenaustauscherchromatographie gereinigt.
Die gereinigten Antikörperfragmente wurden gegen einen Boratpuffer, ph 8,0, dialysiert, bevor die Zugabe von 7-Amino-4-methyl-coumarin-3-essigsäure-N-hydroxy-succinimid (AMCA-NHS) erfolgte. AMCA-NHS wurde in einer DMSO-Lösung zugesetzt und reagiert mit freien Aminogruppen des Fab-Moleküls. AMCA-Fab wurde durch molekulare Größenausschlußchromatographie und abschließend durch eine Anionenaustauscherchromatographie gereinigt, um eine Fraktion zu erhalten, die gleichmäßige Mobilität in einer Anionenaustauschermatrix aufweist.
Die Immunoaff inität des markierten Fab wurde in einem Mikro-Titer-ELISA-System unter Verwendung von immobilisiertem Human-Transferrin und Peroxidase-konjugierten, polyklonalen Anti-Maus-IGG-Antikörpern in Lösung getestet.

BEISPIEL 6

Herstellung von RESOS-markierten monoklonalen Fab-Fragenten mit im wesentlichen gleichmäßiger Mobilität in einer Anionenaustauschermatrix

Aus käuflich erhältlicher Ascitesflüssigkeit, produziert in Mäusen mit Hilfe bekannter Techniken unter Verwendung eines Anti-Transferrin-IgG-produzierenden Hybridoms, wurden monoklonale Antikörper mit Hilfe der Anionenaustauscherchromatographie und anschließender Größenausschlußgelchromatographie in einem Phosphatpuffer gereinigt. Der Puffer wurde anschließend gegen einen Carbonatpuffer ausgetauscht, bevor man die IgG-Antikörper zu Fab-Antikörperfragmenten unter Verwendung von Papain in Kombination mit Dithiothreitol verdaute.
Nach dieser enzymatischen Modifikation wurden freie Thiolgruppen (einschließlich der freien Thiolgruppen auf dem Antikörper) mit Iodacetamid blockiert, wodurch auch die enzymatische Aktivität abgestoppt wurde. Die gebildeten Fab-Fragmente wurden durch kombinierte Dialyse und Anionenaustauscherchromatographie gereinigt.
Das gereinigte Antikörperfragment wurde gegen einen 0,1 M Carbonatpuffer, pH 8,5, dialysiert. N-(Resorufin-4-carbonyl)piperidin-4-carbonsäure-N'-hydroxysuccinimidester (RESOS) wurde in einer DMSO-Lösung in molarem Überschuß zugesetzt und reagiert mit Amino-Gruppen des Antikörpers während der Inkubation bei Zimmertemperatur. Das markierte Fab wird mit Hilfe einer Molekülgrößenausschlußsäule, gefolgt von einer Anionenaustauscherchromatographie, gereinigt. Eine Fraktion mit gleichmäßiger Mobilität auf der Anionenaustauschermatrix wird erhalten.
Die Immunoaffinität des markierten Fab-Fragments wird mit Hilfe eines Mikro-Titer-ELISA-Systems unter Verwendung von immobilisiertem Human-Transferrin und Peroxidase-konjugierten, polyklonalen Anti-Maus-IGG-Antikörpern in Lösung bestimmt.

BEISPIEL 7

Bestimmung von desialvlierten Transferrinen in Patientenseren

Der Test auf desialyliertes Transferrin wird mit Eisengesättigten Serumproben durchgeführt. Die Eisensättigung erfolgt durch Zugabe von 5 ul FeCl&sub3;, 0,25 mg/ml, ein einer 0,2 M Tris-Maleat-Lösung, pH 7,0, zu 20 ul Serum und 20-minütige Inkubation bei Zimmertemperatur.
Die Testlösung besteht aus 10,2 ul Eisen-gesättigtem Serum, zugesetzt zu 500 41 20 mM Tris-HCl, 70 mM NaCl, 0,05 % Tween-20 , pH 8,0, enthaltend 5*10&supmin;&sup8; M FITC-Fab (Fluoresceinmarkiertes Anti-Transferrin-Fab, gemäß obigem Beispiel 4). Diese Lösung wird 15 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert, bevor sie auf einer starken Anionenaustauschersäule aufgetrennt wird. 500 ul der FITC-Fab-Transferrin-Komplex-enthaltenden Lösung werden aufgetrennt durch Elution mit 20 mM Tris-HCl, 70 mM NaCl, 0,05 % Tween , pH 8,0 auf einer MonoQ -Säule (Pharmacia). Figur 9 zeigt die Ergebnisse einer Elution der FITC-Fab-Transferrin-Komplexe aus Serumproben eines starken Alkoholikers und eines normalen Individuums. Die Fluoreszenz in Fraktion 1 stellt ungebundenes Fab dar, die Fluoreszenz in den Fraktionen 3 bis 7 repräsentiert FITC-Fab, gebunden an desialyliertes Transferrin und die Fluoreszenz in den Fraktionen über Fraktion 9 stammt von FITC-Fab, gebunden an normales Transferrin. Unterschiede in der Fluoreszenz in den Fraktionen unterhalb von Nr. 7 dienen zur Unterscheidung zwischen starken Alkoholikern und Individuen ohne Alkoholmißbrauch.

BEISPIEL 8

Bestimmung von desialyliertem Transferrin in Seren von Patienten unter Verwendung von Einweg-Minisäulen

Mit Hilfe eines starken Anionenaustauschergels (Q-Sepharose, Pharmacia) stellt man Einwegsäulen her, indem man 0,5 ml des Gels in einer Säule mit einem Innendurchmesser von 0,7 cm verwendet. Die Säule äquilibriert man mit 20 mM Tris-HCl, 70 mM NaCl, 0,05 % Tween-20 , pH 8,0.
Der Test auf der Minisäule für desialyliertes Transferrin wird mit Eisen-gesättigten Serumproben durchgeführt. Die Eisensättigung erreicht man durch Zugabe von 5 41 FeCl&sub3; 0,25 mg/ml in einer 0,2 M Tris-Maleat-Lösung, pH 7,0, zu 20 41 Serum und 20-minütige Inkubation bei Zimmertemperatur.
Die Testlösung besteht aus 10,2 41 Eisen-gesättigtem Serum, zugesetzt zu 500 41 20 mM Tris-HCl, 70 mM NaCl, 0,05 % Tween-20 , pH 8,0, enthaltend 5*10&supmin;&sup8; M FITC-Fab (Fluoresceinmarkiertes Anti-Transferrin-Fab gemäß obigem Beispiel 4). Diese Lösung wird 15 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert, bevor man sie auf einer starken Anionenaustauschersäule auftrennt. 100 41 der FITC-Fab-Transferrin-Komplex-enthaltenden Lösung gibt man auf die Säule und verwendet 3,0 ml 20 mM Tris-HCl, 70 mM NaCl, 0,05 % Tween-20 , pH 8,0, zur Elution der desialylierten Transferrin-FITC-Fab-Komplexe. Das Gesamteluat wird gesammelt und die Fluoreszenz von Fluorescein wird gemessen und mit einer Standardverdünnung von Fluorescein-markierten Fab-Fragmenten verglichen. Die Ergebnisse verwendet man zur Unterscheidung zwischen Alkoholikern und Individuen ohne Alkoholmißbrauch.
Die folgende Tabelle enthält Ergebnisse für mehrere Alkoholiker und normale Individuen. TABELLE Serum Ethanol-Verbrauch Gemessene Fluoreszenz % von Gesamt Alkoholmißbrauch Kein Alkoholmißbrauch

BEISPIEL 9

Test auf desialyliertes Transferrin (CDT) in Serum (1)

MATERIALIEN

i. Lösung A:

150 kBg/ml ¹²&sup5;I-Antitransferrin-Fab, 20 mM Bis- Tris, 3.7*10&supmin;&sup5; M Fe³&spplus;-Citrat, 66 mM NaCl, 5,9 mM HCl, 3,1 mM Na-Azid, 0,05 % Tween 20, pH 7,0.

ii. Lösung B:

20 mM Bis-Tris, 55 mM NaCl, 5,9 mM HCl, 3,1 mM Na-Azid, 0,05 % Tween-20, pH 7,0.

iii. Säulen für Trennung:

0,5 ml starkes Anionenaustauschergel (Q-Sepharose Fast Flow, Pharmacia), äquilibriert mit Lösung B.

iv. Teströhrchen.

Reagenzien und Säulen werden über längere Zeiträume bei 4-8ºC aufbewahrt.
Lösungen und Säulen werden vor der Verwendung auf Zimmertemperatur eingestellt.

PROZEDUR

1: HERSTELLUNG DER TESTLÖSUNG
1.1: 30 ul Serum gibt man zu 220 ul Lösung A in ein Teströhrchen. Nur gewöhnliche Serumproben werden verwendet.
1.2: Die Proben inkubiert man 1-10 Min. bei Zimmertemperatur.

2: SÄULENTRENNUNG

2.1: Aus der Säule entleert man überschüssige Lösung, indem man zuerst den oberen und anschließend den unteren Stöpsel entfernt. Die Lösung läßt man durch die Säule laufen und verwirft das Eluat.
2.2: Ein Röhrchen wird unter die Säule gestellt.
2.3: Man trägt 200 ul der Testlösung auf. Es wird darauf geachtet, daß die Testprobe direkt auf den oberen Filter in der Säule aufgetragen wird. Die Probe läßt man in den oberen Filter einsinken, bevor man durch Zugabe von 3,0 ml Lösung B eluiert. Die Säule wird so lange eluiert, bis der Auslauf stoppt.

3: MESSUNG

3.1: Die isolierte Lösung wird in einem gamma-Zähler gemessen.
3.2: Eine Eichkurve wird auf der Basis von Eichproben mit bekanntem prozentualem CDT-Gehalt erstellt.
3.3 Die % CDT-Werte in den unbekannten Proben berechnet man unter Verwendung der Eichkurve.

BEISPIEL 10

Test auf desialyliertes Transferrin (CDT) in Serum (2)

MATERIALIEN

i: Lösung A:

0,14 mg/ml Fluorescein-markiertes Antitransferrin-Fab, 5 mM Tris, 55 mM NaCl, pH 8,0, 3,1 mM Natriumazid.

ii: Lösung B:

20 mM Bis-Tris, 3,7*10&supmin;&sup5; M Fe³&spplus;-Citrat, 66 mM Nacl, 5,9 mM HCl, 3,1 mM Na-Azid, 0,05 % Tween 20, pH 7,0.

iii: Lösung C:

20 mM Bis-Tris, 66 mM NaCl, 5,9 mM HCl, 3,1 mM Na-Azid, 0,05 % Tween 20, pH 7,0.

iv: Lösung D:

1,0 M Tris-Base, 3,1 mM Na-Azid.

v: Säulen für die Trennung:

0,5 ml starkes Anionenaustauschergel (Q-Sepharose Fast Flow, Pharmacia), äquilibriert mit Lösung C.

vi: Teströhrchen.

Reagenzien und Säulen werden über längeren Zeitraum bei 4-8ºC aufbewahrt.
Lösungen und Säulen werden vor ihrer Verwendung auf Zimmertemperatur eingestellt.
Lösung A und Lösungen, die A enthalten, sollten vor Licht geschützt werden.

PROZEDUR

1: TÄGLICHE HERSTELLUNG DER INKUBATIONSLÖSUNG

1.1: Lösung B mischt man mit Lösung A, indem man
Teil Lösung A mit
Teilen Lösung B
vermischt.
1.2: Eine Inkubationslösung stellt man in einer für einen Tag ausreichenden Menge her. Man benötigt ein Minimum von 230 ul für jeden Test, sowie 20 ul für eine Eichmessung.

2: TESTVORBEREITUNG

2.1: 30 ul Serum gibt man zu 220 ul Inkubationslösung (siehe oben) in einem Teströhrchen. Lediglich gewöhnliche Serumproben sollten verwendet werden.
2.2: Die Proben inkubiert man 1-10 Minuten bei Zimmertemperatur.

3: SÄULENTRENNUNG

3.1: Aus der Säule entleert man überschüssige Lösung, indem man zunächst den oberen und dann den unteren Stöpsel entfernt. Man läßt die Lösung durch die Säule aus laufen und verwirft das Eluat.
3.2: Man stellt eine Küvette unter die Säule.
3.3: 200 ul der Testlösung werden zugegeben. Es ist darauf zu achten, daß die Testprobe direkt auf den oberen Filter in der Säule aufgetragen wird. Man läßt die Probe in den oberen Filter einsinken, bevor die Elution durch Zugabe von 3,0 ml Lösung C erfolgt. Man wartet das Ende der Elution ab.
3.4: 0,1 ml Lösung D setzt man zu dem aufgefangenen Eluat hinzu und mischt durch Invertieren der Küvette.

4: MESSUNG

4.1: Man bestimmt die Fluoreszenz der aufgefangenen Lösung. Anregung 485 nm (Bereich 480-490) und Emission 520 nm (Bereich 515-525)
4.2: Probe für Nullpunktseinstellung:
3,0 ml Lösung C +
0,1 ml Lösung D.
4.3: Der % CDT-Wert in einer unbekannten Probe kann aus einer Standardkurve bestimmt werden, die durch Messung von Standardseren erstellt wurde.

BEISPIEL 11

Batch-Fraktionierung

Testlösung:

300 ul 20 mM Bis-Tris mit 50 mM NaCl und 0,05 % Tween , pH 7,0 + 1,3 ul 50 mM Tris-Maleat 9,25 mmol/l Fe³+-Citrat + 9 ul einer Lösung, umfassend 0,5 ug Fluorescein-markierte Fab-Fragmente.

Partikel:

Quaternäre AQ-Aminpartikel von Dyno Particles, Norwegen.

PROZEDUR:

1. Zu der Testlösung gibt man 4 ul Serumprobe.
2. Eine Partikelsuspension in 20 mM Bis-Tris-Puffer mit 50 mM NaCl und 0,05 % Tween , pH 7,0, gibt man bis zu einem Endvolumen entsprechend 40 Vol.-% Partikelsuspension hinzu. Die Suspension rührt man 10 Minuten, gefolgt von einer 5- minütigen Zentrifugation bei 1500 g.
3. Man bestimmt die Fluoreszenz des Überstandes.

BEISPIEL 12

Fluoreszenzmarkierung der Antikörper-Fab-Fragmente

1. 2,5 mg Fag in 50 mM Carbonatpuffer, pH 9,5, gibt man zu 25 ug Fluorescein-Isothiocyanat (FITC). FITC stellt man her aus FITC auf Celite (10 %), gelöst in Dimethylsulfoxid.
2. Die Fab- und FITC-Lösungen inkubiert man im Dunkeln bei Zimmertemperatur 18-24 Stunden.
3. Fluorescein-Fab reinigt man durch Molekülgrößen-Gelchromatographie (Superose 6 PrepGrade, Pharmacia, 1,30 cm). Das markierte Fab-Fragment wird eluiert mit einem 10 mM Natriumphosphatpuffer, 0,5 M NaCl, pH 7,4. Die Antikörperfraktion wird isoliert.
4. In der isolierten Fluorescein-Fab-Lösung wird ein Pufferaustausch gegen 2,5 mM Tris-HCl, pH 8,0, durchgeführt. Die Lösung wird anschließend über einen starken Anionenaustauscher weiterbehandelt.
Das obige Verfahren wurde eingesetzt, um Fab-Fragmente zu markieren, die aus monoklonalen Antikörpern hergestellt wurden, welche mit sämtlichen Varianten von Transferrin reagierten. Anti-Transferrin-Antikörper (IGG) wurden aus käuflich erhältlicher Ascites-Flüssigkeit gereinigt, die IGG-Moleküle wurden unter Verwendung von Papa in verdaut und die dabei gebildeten Thiolgruppen wurden unter Verwendung von Iodacetamid unter Anwendung herkömmlicher Verfahren blockiert. Die resultierenden Fab-Fragmente wurden durch Anionenaustauscherchromatographie gereinigt und obigem Markierungsverfahren unterzogen.

BEISPIEL 13

¹²&sup5;I-Markierunq von Antikörper-Fab-Fragmenten

1. 5 mCi ¹²&sup5;I-Bolton Hunter-Reagens, gelöst in Benzol, werden unter Stickstoffgas zur Trockene eingedampft.
2. 0,65 mg Fab, gelöst in 0,1 M Boratlösung, pH 8,5, Volumen 0,96 ml, gibt man zu dem ¹²&sup5;I-Bolton Hunter-Reagens und inkubiert/schüttelt 30 Minuten in Eis.
3. 50 mM Glycin in 0,1 M Borat, pH 8,5, 0,5 ml gibt man hinzu, um die Reaktion zu stoppen. Die Lösung inkubiert man weitere 10 Minuten in Eis.
4. Die Reaktionslösung wird anschließend auf einer Größenausschluß-Säule (Superose 6 PrepGrade, Pharmacia, 1x30 cm) chromatographiert. Das markierte Fab-Fragment wird mit einem 10 mM Na-Phosphat-Puffer, 0,1 M NaCl, pH 7,4, eluiert. Die Antikörperfraktion wird isoliert.
5. In dem isolierten ¹²&sup5;I-Fab wird der Puffer gegen 2,5 mM Tris-HCl, pH 8,0, durch Ultrazentrifugation bei einer molekularen Ausschlußgrenze von 10 000 ausgetauscht und auf 1,5 ml aufkonzentriert.
6. Anschließend wird durch Chromatographie über einen starken Anionenaustauscher weiter bearbeitet.
Die in der in Beispiel 12 beschriebenen Weise erhaltenen Anti-Transferrin-Fab-Fragmente werden unter Anwendung obiger Prozedur markiert.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der Konzentration einer Teilmenge von Varianten in einer Population von Varianten proteinartiger Analyten, die durch ein Fraktionierungssystem getrennt werden kann, wobei die Population von Varianten mit einer Population markierter, proteinartiger, spezifischer Bindungspartner davon in Kontakt gebracht wird, um markierte Bindungspartner-Analyt- Komplexe damit zu bilden, die dann einer Trennung durch das Fraktionierungssystem in eine oder mehrere Fraktionen, welche die Teilmenge von Analytvarianten in komplexierter Form enthalten, unterzogen werden, und man die Menge an Markierung in einer oder mehreren der erhaltenen Fraktionen bestimmt, wobei die Population spezifischer Bindungspartner vor der Reaktion eine im wesentlichen einheitliche Verteilung oder Mobilität in dem Fraktionierungssystem aufweist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der spezifische Bindungspartner für die Analytvariante ein Antikörper oder Fragment davon ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin der spezifische Bindungspartner monovalent ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin der spezifische Bindungspartner ein F(ab)-Fragment eines Antikörpers ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Fraktionierungssystem auf Ladung oder isoelektrischem Punkt ausgelegt ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Bestimmung von Transferrinvarianten.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin das Fraktionierungssystem ausgewählt ist unter einem Elektrophorese-, Ionenaustausch-, Chromatofokussierungs- oder isoelektrischem Fokussierungssystem.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, welches zusätzlich die Sättigung der Population von Transferrinvarianten mit Eisen(III)-Ionen vor oder während des Trennungsschrittes umfaßt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin die im wesentlichen gleichmäßige Verteilung oder Mobilität der Population der spezifischen Bindungspartner in dem Fraktionierungssystem erreicht wird durch Modifikation und/oder Fraktionierung.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin die Population von Analytvarianten im Überschuß zur Bindungspartner- Population vorliegt, wobei eine Bestimmung der relativen Menge von einem oder mehreren verschiedenen Varianten relativ zur Gesamtkonzentation aller Varianten erreicht wird.

11. Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, umfassend markierte, proteinartige Bindungspartner für den interessierenden Analyten, wobei die Bindungspartner im wesentlichen gleichmäßige Mobilität oder Verteilung in einem oder mehreren auf Ladung oder isoelektrischem Punkt basierenden Fraktionierungssystemen aufweisen.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, umfassend markierte F(ab)oder F(v)-Fragmente von Anti-Transferrin-Antikörpern.

13. Analytischer Testkit, umfassend eine Zusammensetzung nach Anspruch 11 oder Anspruch 12 zusammen mit den Reagenzien und/oder Materialien, die zur Durchführung der Fraktionierung erforderlich sind.

14. Analytischer Testkit nach Anspruch 13, umfassend eine Zusammensetzung nach Anspruch 11 oder Anspruch 12, zusammen mit einem Fraktionierungsmedium und einem oder mehreren Agenzien, ausgewählt unter Puffersalzen oder Lösungen davon, oberf lächenaktiven Mitteln und Konservierungsmitteln.

15. Analytischer Testkit nach Anspruch 14 zur Verwendung bei der Bestimmung von Varianten von Transferrin, welcher zusätzlich wenigstens ein Eisen(III)-Salz oder eine Lösung davon umfaßt.