DE69626027T2

DE69626027T2 - Verfahren zur elimination der interferenz des rheumatoiden faktors in diagnostischen tests

Info

Publication number: DE69626027T2
Application number: DE69626027T
Authority: DE
Inventors: A Macioszek; M Robinson
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1995-08-18
Filing date: 1996-08-09
Publication date: 2003-11-20
Anticipated expiration: 2016-08-10
Also published as: EP0846268B1; JP3675837B2; US5698393A; WO1997007401A1; ES2192611T3; DE69626027D1; CA2230644A1; EP0846268A1; JPH11511255A; ATE231973T1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft diagnostische Assays, und spezieller ein Verfahren zur Eliminierung der Interferenz, die aus Rheumafaktoren in biologischen Proben resultiert.

2. Erörterung des Fachgebiets

Toxoplasma gondii (T. gondii) ist ein obligat intrazellulärer Parasit, der in der Lage ist, eine breite Vielfalt von Zwischenwirten einschließlich Mensch zu infizieren. Infizierte Endwirte (Katzen) scheiden Oozysten mit dem Kot aus, welche schnell im Boden reifen und infektiös werden. Wenn sie von Zwischenwirten mit der Nahrung aufgenommen werden, bilden sich Tachyzoiten und vervielfachen sich schnell mit eventueller Bildung von Zysten, die langsamer wachsende, aber infektiöse Bradyzoiten enthalten. Diese Toxoplasmose wird vom Menschen erworben durch Aufnahme von Katzenkot oder von zu kurz gekochtem oder gebratenem Fleisch, das mit Zysten infiziert ist.
Die Infektion des normalen Erwachsenen ist für gewöhnlich asymptomatisch. In jenen Fällen mit klinischen Manifestationen ist das häufigste der Symptome Lymphadenopathie, welche von einer Reihe anderer Symptome begleitet sein kann, was die Differentialdiagnose schwierig macht Andererseits treten ernsthafte bis fatale Infektionen bei Erwachsenen auf, deren Immunsystem durch Krebs-Chemotherapie oder immunsuppressive Behandlung beeinträchtigt ist, und bei Patienten mit AIDS. Für Infektionen bei Erwachsenen mit geschwächtem Immunsystem wird angenommen, dass sie eine Reaktivierung latenter erworbener Infektionen sind und normalerweise das zentrale Nervensystem einschließen, obwohl die Involvierung von anderen Stellen berichtet worden ist.
Transplazentare Übertragung des Parasiten, die zu angeborener Toxoplasmose führt, kann während der akut erworbenen mütterlichen Infektion vorkommen. Das Risiko der Fötusinfektion ist eine Funktion der Zeit, zu der die akute mütterliche Infektion während der Schwangerschaft vorkommt. Mütterliche Infektionen, die vor der Empfängnis erworben wurden, stellen, falls überhaupt, ein sehr kleines Risiko für den Fötus dar. Jedoch steigt die Häufigkeit für angeborene Toxoplasmose mit fortschreitender Schwangerschaft; umgekehrt ist die Schwere der angeborenen Toxoplasmose am größten, wenn eine mütterliche Infektion früh während der Schwangerschaft erworben wurde. Eine Mehrzahl von Kindern, die in utero infiziert wurden, sind asymptomatisch bei der Geburt, insbesondere wenn die mütterliche Infektion während des letzten Drittels auftritt, mit Folgeerscheinungen später im Leben. Angeborene Toxoplasmose führt zu schweren allgemeinen oder neurologischen Störungen bei ungefähr 20-30% der Kinder, die in utero infiziert wurden; ungefähr 10% zeigen lediglich ein Betroffensein der Augen, und der Rest (ungefähr 70%) sind asymptomatisch bei der Geburt. Subklinische Infektion kann zu vorzeitiger Geburt und nachfolgenden neurologischen, geistigen und audiologischen Defekten führen.
Vorausschauende Untersuchungen von Schwangerschafen haben gezeigt, dass pränatale Diagnose der Infektion gefolgt von pränataler Therapie die Häufigkeit und die Schwere von angeborener Toxoplasmose verringert. Serologische Tests können verwendet werden, um solche risikobehafteten Schwangerschaften zu identifizieren; Frauen, die zum Zeitpunkt der Diagnose einer Schwangerschaft seronegativ sind, können während der Schwangerschaft überwacht werden. Serokonversion zeigt eine T. gondii-Infektion an und weist das Schwangerschaftsalter nach, wann die mütterliche Infektion auftrat.
Serologische Tests, die für T. gondii-IgM-Antikörper spezifisch sind, sind nützliche Hilfen bei der Diagnose von sowohl angeborener als auch akut erworbener Toxoplasmose. Die Spiegel von IgM-Antikörpern steigen nach akut erworbenen Infektionen schnell an und beginnen nach mehreren Monaten abzufallen, können aber ein Jahr oder länger bei nachweisbaren Spiegeln verharren. Da verharrende IgM-Spiegel lange nach dem Beginn der erworbenen Infektion nachgewiesen werden können, muss das Ergebnis eines einzelnen serologischen Tests mit Vorsicht verwendet werden in jenen Fällen, wo es kritisch ist, die Zeit der Infektion festzusetzen. Das betrifft die Diagnose von akuter T. gondii-Infektion, die während der Schwangerschaft erworben wurde. Eine Bestimmung des Zeitpunkts der Infektion allein beruhend auf den Ergebnissen von nachweisbarem IgM-Antikörper für T. gondii wird nicht empfohlen. Diese Bestimmung sollte Krankheitsgeschichte und vorausgehende Serologie einschließen, da geringe Spiegel von IgM-Antikörper ein Jahr oder länger verharren können. Die Verwendung eines Tests zur Bestimmung eines Anstiegs von IgM-Antikörper für T. gondii kann zusätzliche Informationen, wie z. B. den Zeitpunkt der Infektion, bereitstellen.
Eine primäre Rubella-Infektion ist bei den meisten Personen typischerweise eine leichte selbstbegrenzende Erkrankung, gekennzeichnet durch makulopapulösen Ausschlag, Fieber, Unwohlsein und Lymphadenopathie. Bei schwangeren Frauen kann eine primäre Infektion ernsthafte medizinische Konsequenzen haben. In Utero-Infektionen können den Fötus schwer schädigen, besonders, wenn sie während der ersten vier Monate der Schwangerschaft auftreten. Der bereits bei der Geburt infizierte Säugling kann einen oder mehrere von einer Vielfalt von Defekten zeigen, die zusammen als das angeborene Rubella-Syndrom (CRS) bekannt sind. Darunter befinden sich geringes Geburtsgewicht, Linsentrübungen, Taubheit, angeborene Herzerkrankung und geistige Retardierung.
Obwohl Rubella eine typische Symptomologie aufweist, kann das klinische Bild ziemlich variabel sein. Die Krankheit ist oft schwierig oder unmöglich aus Symptomen allein genau zu diagnostizieren. Mit dem Erscheinen von Hämagglutinationshemmungs(HAH)-Tests waren Laboratorien in der Lage, einen serologischen Beweis einer jüngsten Rubella- Infektion zu liefern, indem steigende Spiegel von Antikörperaktivität zwischen gepaarten akuten und rekonvaleszenten Seren gezeigt werden. Da jedoch HAH-Titer vom Zeitpunkt des Beginns der Krankheit an schnell ansteigen, muss das akute Serum früh gesammelt werden, damit eine signifikante Zunahme des Titers im Vergleich zu dem rekonvaleszenten Serum nachgewiesen wird. Zusätzlich steigen HAH-Titer signifikant im Anschluss sowohl an eine primäre Infektion als auch eine Reinfektion, so dass HAH nicht verwendet werden kann, um zwischen den beiden zu unterscheiden. Die Detektion von Rubella- IgM-Antikörper in einer einzelnen Serumprobe wurde möglich gemacht durch die Verwendung von HAH-Prüfung gekoppelt mit 2- Mercaptoethanol-Behandlung oder Saccharosedichtegradienten- Fraktionierung. Die Fähigkeit, die IgM-Klasse von Anti-Rubella- Antikörper in einer einzelnen Probe zu bestimmen, überwindet einige der Probleme die mit gepaarter Serenanalyse verbunden sind, und stellt ein deutlicheres Serodiagnosebild bereit.
Asymptotische Reinfektion von immunen schwangeren Frauen, allgemein als harmlos für den Fötus betrachtet, ist serologisch gekennzeichnet durch einen Anstieg des IgG-Antikörpers in der Abwesenheit von nachweisbarem IgM-Antikörper. Eine primäre Infektion ist verbunden mit einer ausgeprägten IgM- Antikörperreaktion auf das Rubella-Virus-Antigen. IgM- Antikörper, der reaktiv mit Rubella-Virus-Antigen ist, ist nach einer Reinfektion beobachtet worden jedoch sind die Spiegel gering und nicht durch alle IgM-Assays nachweisbar. In Fällen von akuter Primärinfektion während der Schwangerschaft ist IgM 4 bis 15 Tage nach dem Erscheinen des Ausschlags in nahezu 100% der Fälle nachgewiesen worden. IgM-Spiegel beginnen nach 36 bis 70 Tagen abzufallen und werden selten nach 180 Tagen nachgewiesen.
Auch wenn die klinische Nützlichkeit der Rubella-IgM- Detektion normalerweise verbunden ist mit der Prüfung schwangerer Frauen, ist die Prüfung von nicht schwangeren Personen auf IgM-Antikörper gegen Rubella-Virus-Antigen eine nützliche Hilfe bei der Diagnose einer akuten Infektion.
Rheumafaktoren, die in einigen Seren vorhanden sind, können falsche positive Ergebnisse bei IgM-Assays für T. gondii und Rubella verursachen. Um dieses Problem anzusprechen, verlangen einige IgM-Assayprotokolle, dass alle Proben, die positiv getestet wurden, mit Rheumafaktor- Neutralisationsreagenzien (RFNR) behandelt und wieder geprüft werden. RFNR umfasst eine Suspension von Mikropartikeln, die mit menschlichem Gammaglobulin beschichtet sind. RFNR absorbiert Rheumafaktoren, da Rheumafaktoren eine Affinität für den Fc- Abschnitt des menschlichen IgG-Moleküls haben. Wenn eine Rheumafaktor-positive menschliche Probe mit FRNR inkubiert wird, binden Rheumafaktoren an die beschichteten Mikropartikel, und die gebundenen Rheumafaktoren werden durch Zentrifugation entfernt. Die behandelte Probe wird dann erneut mit einem anderen Verdünnungsprotokoll getestet, um die Wirkung der Verdünnung zu kompensieren, die durch das RFNR-Verfahren verursacht wurde. Nach erneuter Prüfung werden die Proben nur dann als positiv für die spezifischen IgM-Antikörper interpretiert, wenn diese Proben nach der Adsorption mit dem RFNR positiv bleiben.
Es wäre wünschenswert, die Notwendigkeit zur Behandlung von Proben mit RFNR und die Notwendigkeit zum erneuten Prüfen von Proben, die anfänglich positiv waren, zu eliminieren.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Diese Erfindung stellt ein Verfahren bereit zur Behandlung biologischer Proben, z. B. menschlicher Seren oder Plasma, von denen vermutet wird, dass sie Rheumafaktoren enthalten, um Kreuzreaktivität und falsche positive Assayergebnisse in IgM-Immunoassays zu elimineren, die durch die Anwesenheit von Rheumafaktoren in diesen biologischen Proben verursacht werden.
In einem Aspekt der Erfindung umfasst das Verfahren Einbringen einer ausreichenden Menge von Rheumafaktor- Neutralisationspuffer in ein Festphasenmaterial, das einen Komplex enthält, der einen Antikörper und ein Bindeglied umfasst, das für diesen Antikörper spezifisch ist, z. B. ein Antigen, wobei der Puffer einen pH besitzt, der niedrig genug ist, um zu verursachen, dass Rheumafaktoren, die an IgG- Antikörper gebunden sind, an das Festphasenmaterial binden, um deren Affinität für die IgG-Antikörper in einem solchen Ausmaß zu reduzieren, dass die Bindung der Rheumafaktoren an die IgG- Antikörper brechen wird und die Rheumafaktoren von dem Festphasenmaterial vor der Detektionsphase eines diagnostischen Assays weggewaschen werden können. Jedoch darf der pH des Rheumafaktor-Neutralisationspuffers nicht so niedrig sein, dass die Bindung der IgM-Antikörper, z. B. Anti-Rubella-IgM-Antikörper oder Anti-T. gondii-IgM-Antikörper, die an Bindeglieder, z. B. Antigene, gebunden sind, die auf dem Festphasenmaterial immobilisiert sind, nachteilig beeinträchtigt wird. Unter diesem speziellen Aspekt wird der Rheumafaktor-Neutralisationspuffer typischerweise einen pH unter ungefähr 6,5 besitzen. Vorzugsweise besitzt der Rheumafaktor-Neutralisationspuffer einen pH von ungefähr 3,0 bis ungefähr 5,5, und am besten von ungefähr 3,5 bis ungefähr 5,0.
Unter einem anderen Aspekt umfasst das Verfahren das Einbringen einer ausreichenden Menge an Rheumafaktor- Neutralisationspuffer in eine biologische Probe oder in ein Reagenz, das ein Festphasenmaterial umfasst, worauf ein Bindeglied, das spezifisch ist für IgM-Antikörper, immobilisiert ist, oder sowohl in die Probe als auch in das Reagenz, wobei der Puffer einen pH besitzt, der niedrig genug ist, um zu verursachen, dass der pH der resultierenden Mischungen, die Rheumafaktoren enthalten, niedrig genug ist, um zu verursachen, dass Rheumafaktoren in diesen Mischungen ihre Affinität für IgG- Antikörper in einem solchen Ausmaß reduzieren, dass sie keinen Komplex mit IgG-Antikörpern bilden, die an das Festphasenmaterial gebunden sind, wodurch sie die Entfernung dieser Rheumafaktoren aus den Mischungen vor der Detektionsphase eines diagnostischen Assays erleichtern. Jedoch darf der pH des Rheumafaktor-Neutralisationspuffers nicht so niedrig sein, dass die Bindung der IgM-Antikörper, z. B. Anti-Rubella-IgM-Antikörper oder Anti-T. gondii-IgM-Antikörper, die an Bindeglieder, z. B. Antigene, gebunden sind, die auf dem Festphasenmaterial immobilisiert sind, nachteilig beeinträchtigt wird. Unter diesem speziellen Aspekt wird der Rheumafaktor-Neutralisationspuffer typischerweise einen pH nicht höher als 6,5 besitzen. Vorzugsweise besitzt der Rheumafaktor-Neutralisationspuffer einen pH von ungefähr 3,0 bis ungefähr 5,5, und am besten von ungefähr 3,5 bis ungefähr 5,0.
Unter jedem Aspekt schließen Klassen von Puffern, die für das Verfahren dieser Erfindung geeignet sind, ionische, nichtionische und zwitterionische Puffer ein, die vorzugsweise einen pKa-Wert nicht höher als ungefähr 6,5 haben. Repräsentative Beispiele für Puffer, die für das Verfahren dieser Erfindung geeignet sind, umfassen, sind aber nicht begrenzt auf, Essigsäure, Citronensäure, Ameisensäure, Bernsteinsäure und Glycin.
Der Rheumafaktor-Neutralisationspuffer kann verwendet werden, um Interferenzen von Rheumafaktoren in IgM-Immunoassays in mindestens einer der beiden Weisen zu eliminieren. Bei einer Möglichkeit kann der Puffer verwendet werden, um Komplexe zu behandeln, die an das Festphasenmaterial angelagert sind. Der Puffer bricht die Bindungen zwischen den Rheumafaktoren und den IgG-Antikörpern auf, die an das Festphasenmaterial gebunden sind, und spült die Rheumafaktoren heraus. Bei einer anderen Möglichkeit kann der Puffer direkt zu der Probe hinzugegeben werden, von der vermutet wird, dass sie Rheumafaktoren enthält, oder zu einem Reagenz, das ein Festphasenmaterial enthält, worauf ein Bindeglied, das spezifisch für einen IgM-Antikörper ist, immobilisiert ist, oder sowohl zu der Probe als auch zu dem Reagenz. Wenn die Probe mit dem Reagenz kombiniert wird, senkt der Puffer den pH der Mischung, die die Probe und das Reagenz enthält, und stört die Bindung von Rheumafaktoren mit IgG- Antikörpern in der Probe, die an das Festphasenmaterial binden.
Die Erfindung ist besonders nützlich zur Verwendung mit automatisierten Analysensystemen mit kontinuierlichem und randomisierten Zugriff, wie das System, das in US-Patent Nr. 5.358.691 beschrieben ist, hierin durch Bezugnahme eingeschlossen.
Diese Erfindung minimiert falsche positive Assayergebnisse, die aus der Anwesenheit von Rheumafaktoren in menschlichen Serum- oder Plasmaproben auftreten können. Ein primärer Vorteil dieser Erfindung ist deren Einfachheit und die Fähigkeit, diesen Schritt in das Assayprotokoll eines Assays einzugliedern, der auf einem automatisierten Analysensystem mit fortlaufendem und wahlfreien Zugriff ausgeführt werden soll. Diese Erfindung macht es möglich, die Notwendigkeit einer Behandlung aller anfänglich positiven Proben mit RFNR außerhalb des Analysensystems und das erneute Prüfen zu eliminieren, wodurch das Assayverfahren vereinfacht wird und die Assayzeit, die notwenig ist, um die Anwesenheit von IgM-Antikörpern zu T. gondii-Antigen oder Rubella-Virus-Antigen zu bestimmen, reduziert wird.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG

Wie hier verwendet bedeutet "Testprobe" oder "Probe" eine Substanz, von der vermutet wird, dass sie den Analyten enthält. Die Testprobe kann direkt, wie sie von der Quelle erhalten wird, verwendet werden, oder im Anschluss an eine Vorbehandlung zum Modifizieren des Charakters der Probe. Die Testprobe kann abgeleitet werden von jeder beliebigen biologischen Quelle, wie zum Beispiel einer physiologischen Flüssigkeit wie zum Beispiel Blut, Speichel, Augenlinsenflüssigkeit, Zerebrospinalflüssigkeit, Schweiß, Harn, Milch, Aszites- Flüssigkeit, Gelenkflüssigkeit, Peritonealflüssigkeit, Fruchtwasser und dergleichen. Die Testprobe kann vor der Verwendung vorbehandelt werden, wie durch Herstellen von Plasma aus Blut, Verdünnen viskoser Flüssigkeiten und dergleichen. Verfahren zur Behandlung können Filtration, Destillation, Extraktion, Konzentration, Inaktivierung störender Komponenten, die Zugabe von Reagenzien und dergleichen einschließen. Andere flüssige Proben neben physiologischen Flüssigkeiten können verwendet werden, z. B. Wasser, Nahrungsprodukte und dergleichen, zur Durchführung von Umwelt- oder Nahrungsproduktionstests. Zusätzlich kann ein festes Material, von dem vermutet wird, dass es den Analyten enthält, als die Testprobe verwendet werden. In manchen Fällen kann es vorteilhaft sein, eine feste Testprobe zu modifizieren, um ein flüssiges Medium zu bilden oder um den Analyten freizusetzen.
Wie hier verwendet bedeutet "Bindeglied" ein Glied eines spezifischen Bindungspaares, d. h. von zwei unterschiedlichen Molekülen, wobei eines der Moleküle durch chemische oder physikalische Mittel spezifisch an das zweite Molekül bindet. Ein Beispiel für solche Bindeglieder eines spezifischen Bindungspaares sind ein Antigen und ein Antikörper, der spezifisch an dieses Antigen bindet. Ein anderes Beispiel derartiger Bindeglieder eines spezifischen Bindungspaares sind ein erster Antikörper und ein zweiter Antikörper, der spezifisch an den ersten Antikörper bindet.
Wie hier verwendet bedeutet "Konjugat" ein Bindeglied, z. B. ein Antigen oder einen Antikörper, das an eine detektierbare Komponente gebunden ist.
Wie hier verwendet bedeutet "detektierbare Komponente" eine Komponente eines Konjugats, die an ein Bindeglied, z. B. einen Antikörper oder ein Antigen, gebunden ist. Die detektierbare Komponente macht die Reaktion zwischen dem Bindeglied und seinem komplementären Bindeglied detektierbar. Repräsentative Beispiele für detektierbare Komponenten umfassen Enzyme, radioaktive Marker, Fluorescein und Chemikalien, die Licht produzieren. Eine detektierbare Komponente ist jede Substanz, die an einen Analyten angelagert werden kann und die in der Lage ist, ein Signal zu erzeugen, das visuell oder durch instrumentelle Mittel detektierbar ist. Verschiedene detektierbare Komponenten, die für die Verwendung in dieser Erfindung geeignet sind, umfassen Katalysatoren, Enzyme, Liposome und andere Bläschen, die signalerzeugende Substanzen enthalten wie Chromogene, Katalysatoren, fluoreszente Verbindungen, chemilumineszente Verbindungen, Enzyme und dergleichen. Mehrere Enzyme, die zur Verwendung als Marker geeignet sind, sind offenbart in US-Patent Nr. 4.275.149. Solche Enzyme umfassen Glukosidasen, Galaktosidasen, Phosphatasen, und Peroxidasen, wie alkalische Phosphatase und Merrettichperoxidase, welche in Verbindung mit Enzymsubstraten verwendet werden, wie Fluorescein, Di(galaktopyranosid), Nitroblautetrazolium, 3,5',5,5'- Tetranitrobenzidin, 4-Methoxy-1-naphthol, 4-Chlor-1-naphthol, 4- Methylumbelliferylphosphat, 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat, chemilumineszente Enzymsubstrate wie die Dioxetane, die in WO 88100694 und EP 0-254-051-A2 beschrieben sind, und Derivate und Analoga davon. Vorzugsweise ist die detektierbare Komponente ein Enzym, und am besten ist das Enzym alkalische Phosphatase.
Wie hier verwendet bedeutet "Festphasenmaterial" jedes Material, welches unlöslich ist oder durch eine nachfolgende Reaktion unlöslich gemacht werden kann. Repräsentative Beispiele für Festphasenmaterialien umfassen Polymer- oder Glaskügelchen, Mikropartikel, Röhrchen, Bögen, Platten, Objektträger, Vertiefungen, Bänder, Reagenzröhrchen oder dergleichen.
Wie hier verwendet bedeutet "Substrat" ein Material, das in eine fluoreszente Verbindung, wie 4-Methylumbelliferon, durch ein geeignetes Enzym umgewandelt werden kann. Die Geschwindigkeit, mit der die fluoreszente Verbindung gebildet wird, ist ein Hinweis auf die Menge von Enzym, die in dem Reaktionsgemisch vorhanden ist. Wenn das Enzym eine detektierbare Komponente ist, wie in einem Enzymimmunoassay, wird die Menge von vorhandenem Enzym in Zusammenhang gebracht mit der Menge an Analyt, die in der Testprobe vorhanden ist. Folglich kann die Messung der Fluoreszenz verwendet werden, um die Menge an Analyt zu bestimmen, die in der Testprobe vorhanden ist.
Wie hier verwendet bedeutet "Analyt" die Verbindung, die bestimmt oder gemessen werden soll. Das Analyt hat mindestens ein Epitop oder eine Bindungsstelle.
Wie hier verwendet bedeuten "Rheumafaktoren" Autoantikörper, die gegen menschliches IgG gerichtet sind. Rheumafaktoren gehören am häufigsten zu der IgM-Klasse. Sie werden primär bei Patienten gefunden, die an rheumatoider Arthritis leiden, und können in Immunoassays stören, indem sie falsche positive Ergebnisse verursachen. Immunoassays, die besonders anfällig sind für Störungen durch Rheumafaktoren, sind indirekte IgM-Assays, worin ein Festphasenmaterial, das mit dem spezifischen Antigen überzogen ist, spezifische IgM-Antikörper einfängt. Der IgM-Antikörper-Antigen-Komplex wird durch ein Anti-Human-IgM-Enzymkonjugat nachgewiesen.
Wie hier verwendet bedeutet "Toxo-IgM-Assay" ein qualitatives Verfahren zur Detektion von T. gondii-spezifischen IgM-Antikörpern in menschlichem Serum und Plasma (z. B. EDTA, Heparin oder Natriumcitrat).
Wie hier verwendet bedeutet "Rubella-IgM-Assay" ein qualitatives Verfahren zur Detektion von Rubella-spezifischen IgM-Antikörpern in menschlichem Serum und Plasma (z. B. EDTA, Heparin oder Natriumcitrat). In Fällen, wo eine primäre Infektion vermutet wird, wurde für die optimale Zeit zur Probensammlung berichtet, dass sie 1 bis 2 Wochen nach dem Beginn des Ausschlags ist.
Für ein klareres Verständnis der Signifikanz und der Funktionsweise der vorliegenden Erfindung ist es wichtig, sich der Natur der Immunoassays bewusst zu sein, die auf einem Apparat des Typs, der in US-Patent Nr. 5.358.691 beschrieben ist, ausgeführt werden können. Viele Arten von Immunoassays können auf einem Apparat des Typs, der in US-Patent Nr. 5.358.691 beschrieben ist, ausgeführt werden. Im Allgemeinen können Immunoassays in zwei Hauptkategorien klassifiziert werden - homogene und heterogene. Homogene und heterogene Immunoassays sind abhängig von der Fähigkeit eines ersten Bindeglieds eines Bindungspaares, z. B. eines Antigens, spezifisch an ein zweites Bindeglied eines Bindungspaares, z. B. einen Antikörper, zu binden. Ein Konjugat, bestehend aus einem solchen Bindeglied, markiert mit einer detektierbaren Komponente, wird eingesetzt, um das Ausmaß einer solchen Bindung zu bestimmen. Zum Beispiel können solche Bindegliedpaare ein Antigen und ein Antikörper zu einem solchen Antigen sein. Das Konjugat, welches den Antikörper umfassen kann, nimmt entweder an einer Bindungsreaktion mit dem Antigen teil oder nimmt an einer solchen Reaktion nicht teil. Die Menge der detektierbaren Komponente, die nach der Reaktion detektiert und gemessen wird, kann korreliert werden mit der Menge an Antikörper, die in der Testprobe vorhanden ist.
Heterogene Assays können in einem kompetitiven Immunoassayformat oder in einem Sandwich-Immunoassayformat durchgeführt werden. In dem kompetitiven Immunoassayformat kann ein Antigen auf einem Festphasenmaterial immobilisiert werden. Die Menge detektierbarer Komponente, die an das Festphasenmaterial bindet, kann detektiert, gemessen und mit der Menge an Antikörper, die in der Testprobe vorhanden ist, korreliert werden. Beispiele von Festphasenmaterialien umfassen Kügelchen, Partikel, Mikropartikel und dergleichen.
Die vorliegende Erfindung befasst sich primär mit dem Sandwich-Immunoassayformat. In einem Beispiel des Sandwich- Immunoassayformats wird eine Testprobe, die einen Antikörper enthält, in Kontakt gebracht mit einem Antigen, z. B. einem Protein, das auf einem Festphasenmaterial immobilisiert worden ist, wodurch ein Antigen-Antikörper-Komplex gebildet wird. Beispiele für Festphasenmaterialien umfassen Kügelchen, Partikel, Mikropartikel und dergleichen. Das Festphasenmaterial, das den Antigen-Antikörper-Komplex enthält, wird typischerweise zum Beispiel mit einem zweiten Antikörper behandelt, der mit einer detektierbaren Komponente markiert worden ist. Der zweite Antikörper wird dann an den Antikörper der Probe gebunden, welcher an das Antigen gebunden ist, das auf dem Festphasenmaterial immobilisiert ist. Dann wird nach einem oder mehreren Waschschritten zum Entfernen allen ungebundenen Materials ein Indikatormaterial wie eine chromogene Substanz eingebracht, um mit der detektierbaren Komponente zu reagieren, um ein detektierbares Signal zu produzieren, z. B. eine Farbänderung. Die Farbänderung wird dann detektiert, gemessen und mit der Menge an Antikörper, die in der Probe vorhanden ist, korreliert. Es sollte auch beachtet werden, dass außerdem verschiedene Verdünnungsmittel und Puffer benötigt werden, um die Funktion der Mikropartikel, Antigene, Konjugate und anderer Komponenten des Assays, die an chemischen Reaktionen teilnehmen, zu optimieren. Es sollte weiter beachtet werden, dass andere Arten von Sandwich-Assays genutzt werden können, wie zum Beispiel solche, bei denen der erste Antikörper auf dem Festphasenmaterial immobilisiert ist.
Ein heterogener Immunoassay, der mit dem Apparat von US- Patent Nr. 5.358.691 entweder in einem kompetitiven oder Sandwich-Immunoassayformat durchgeführt werden kann, ist ein Mikropartikeleinfang-Enzymimmunoassay, so wie der, der beschrieben ist in Clinical Chemistry, Volume 34, Nr. 9, Seite 1726-1732 (1988), der Mikropartikel als das Festphasenmaterial verwendet.
Eine Schritt-für-Schritt-Beschreibung eines Mikropartikeleinfang-Enzymimmunoassayverfahrens ist ausgeführt in Spalte 35, Zeile 60 bis Spalte 44, Zeile 22 von US-Patent Nr. 5.358.691.
Ein Aspekt des Verfahrens der vorliegenden Erfindung kann auf die folgende Art und Weise durchgeführt werden. Zuerst wird eine biologische Probe bereitgestellt. Dann wird die Probe mit einem Festphasenmaterial kombiniert, worauf ein Bindeglied spezifisch für einen Antikörper immobilisiert worden ist. Ein Beispiel für ein solches Bindeglied ist ein Antigen, z. B. Rubella-Virus-Antigen, T. gondii-Antigen. Antikörper in der Probe, falls vorhanden, für welche das immobilisierte Bindeglied spezifisch ist, werden an das immobilisierte Bindeglied binden gelassen, um einen Bindeglied-Antikörper-Komplex zu bilden. Antikörper von besonderem Interesse in dieser Erfindung umfassen den IgM-Antikörper für Rubella-Virus-Antigen und den IgM- Antikörper für T. gondii-Antigen. Dann wird das Festphasenmaterial von der Probe abgetrennt, vorzugsweise durch Aufbringen der Mischung von Festphasenmaterial und Probe auf eine poröse Matrix. Das Festphasenmaterial wird dann auf der Matrix gewaschen mit einer ausreichenden Menge eines Rheumafaktor-Neutralisationspuffers, wobei der Puffer einen pH besitzt, der niedrig genug ist, um zu verursachen, dass Rheumafaktoren, falls vorhanden, von IgG-Antikörpern dissoziieren, die an das Festphasenmaterial gebunden sind. Dann wird bevorzugt, dass alles weitere ungebundene Material von dem Festphasenmaterial entfernt wird durch Waschen auf der Matrix, typischerweise mit einem Puffer, z. B. einem neutralen pH-Puffer. Das Festphasenmaterial wird dann einem Antikörper-Enzym-Konjugat unterworfen, das an den Bindeglied-Antikörper-Komplex binden wird, der auf dem Festphasenmaterial immobilisiert ist. Dann wird ungebundenes Material von dem Festphasenmaterial entfernt mittels Waschen auf der Matrix, typischerweise mit einem Puffer, z. B. einem neutralen pH-Puffer. Ein Substrat für das Enzym wird zu der Matrix hinzugegeben. Die Geschwindigkeit der Bildung eines detektierbaren Produkts, z. B. eines fluoreszenten Produkts, wird dann gemessen und der Spiegel von TgM-Antikörpern in der Probe wird bestimmt. Es sollte beachtet werden, dass der Ausdruck "IgG-Antikörper gebunden an das Festphasenmaterial", wie hier verwendet, beabsichtigt, sowohl (1) IgG-Antikörper einzuschließen, die direkt an das Festphasenmaterial gebunden sind, als auch (2) IgG-Antikörper, die an ein Bindeglied gebunden sind, das direkt an das Festphasenmaterial gebunden ist.
Der pH des Rheumafaktor-Neutralisationspuffers muss genügend niedrig sein, um die Bindung von Rheumafaktoren an die Immunkomplexe zu reduzieren, noch besser zu eliminieren, die aus IgG-Antikörpern bestehen, z. B. Anti-Rubella-IgG-Antikörpern oder Anti-T. gondii-IgG-Antikörpern, die an das Festphasenmaterial gebunden sind, aber nicht so niedrig, dass die Bindung der IgM- Antikörper, z. B. Anti-Rubella-IgM-Antikörper oder Anti-T. gondii-IgM-Antikörper, die an Bindeglieder, z. B. Antigene, gebunden sind, die auf dem Festphasenmaterial immobilisiert sind, nachteilig beeinträchtigt wird. Als ein Ergebnis der Verwendung einer ausreichenden Menge von Rheumafaktor- Neutralisationspuffer mit einem geeignet niedrigen pH werden biologische Proben, die Rheumafaktoren enthalten, keine falschen positiven Assayergebnisse erzeugen in Assays auf IgM-Antikörper.
Ein anderer Aspekt des Verfahrens der vorliegenden Erfindung kann auf die folgende Art und Weise durchgeführt werden. Zuerst wird eine biologische Probe bereitgestellt. Dann wird ein Reagenz bereitgestellt, das ein Festphasenmaterial umfasst, worauf ein Bindeglied immobilisiert ist, das spezifisch für einen interessierenden Antikörper ist. Ein Beispiel für ein derartiges Bindeglied ist ein Antigen, z. B. Rubella-Virus- Antigen, T. gondii-Antigen. Dann wird die Probe oder das Reagenz, oder sowohl Probe als auch Reagenz verdünnt in einer ausreichenden Menge von Rheumafaktor-Neutralisationspuffer, welcher einen genügend niedrigen pH besitzt, um Rheumafaktoren, falls vorhanden, am Binden an IgG-Antikörper zu hindern, die an das Festphasenmaterial gebunden sind. Dann wird die Probe kombiniert mit dem Reagenz, welches das Festphasenmaterial enthält. Antikörpern in der Probe, falls vorhanden, für welche das immobilisierte Bindeglied spezifisch ist, wird erlaubt, an das Bindeglied zu binden, das auf dem Festphasenmaterial immobilisiert ist, um einen Bindeglied-Antikörper-Komplex zu bilden. Antikörper von besonderem Interesse in dieser Erfindung umfassen den IgM-Antikörper für Rubella-Virus-Antigen und den IgM-Antikörper für T. gondii-Antigen. Dann wird das Festphasenmaterial von der Probe abgetrennt, vorzugsweise durch Aufbringen der Mischung von Festphasenmaterial und Probe auf eine poröse Matrix. Dann ist es bevorzugt, dass alles ungebundene Material von dem Festphasenmaterial mittels Waschen auf der Matrix entfernt wird, typischerweise mit einem Puffer, z. B. einem neutralen pH-Puffer. Das Festphasenmaterial wird dann einem Antikörper-Enzym-Konjugat unterworfen, das an den Bindeglied-Antikörper-Komplex binden wird. Dann wird ungebundenes Material von dem Festphasenmaterial entfernt mittels Waschen auf der Matrix, typischerweise mit einem Puffer, z. B. einem neutralen pH-Puffer. Ein Substrat für das Enzym wird zu der Matrix hinzugegeben. Die Geschwindigkeit der Bildung eines detektierbaren Produkts, z. B. eines fluoreszenten Produkts, wird dann gemessen und der Spiegel von IgM-Antikörpern in der Probe wird bestimmt. Wie zuvor angegeben ist beabsichtigt, dass der Ausdruck "IgG-Antikörper gebunden an das Festphasenmaterial", wie er hier verwendet wird, sowohl (1) IgG- Antikörper einschließt, die direkt an das Festphasenmaterial angelagert sind, als auch (2) IgG-Antikörper, die an ein Bindeglied gebunden sind, das direkt an das Festphasenmaterial angelagert ist.
Der pH des Rheumafaktor-Neutralisationspuffers muss genügend niedrig sein, um den pH der resultierenden Reaktionsgemische, die Rheumafaktoren enthalten, dazu zu bringen, die Bindung von Rheumafaktoren an die Immunkomplexe, die aus IgG-Antikörpern bestehen, z. B. Anti-Rubella-IgG- Antikörpern oder Anti-T. gondii-IgG-Antikörpern, die an das Festphasenmaterial gebunden sind, zu reduzieren, noch besser zu verhindern, aber nicht zu niedrig, dass die Bindung von IgM- Antikörper, z. B. Anti-Rubella-IgM-Antikörper oder Anti-T. gondii-IgM-Antikörper, an Bindeglieder, z. B. Antigene, auf dem Festphasenmaterial nachteilig beeinträchtig wird. Als ein Ergebnis der Verwendung einer ausreichenden Menge von Rheumafaktor-Neutralisationspuffer mit einem geeignet niedrigen pH werden biologische Proben, die Rheumafaktoren enthalten, keine falschen positiven Assaysergebnisse erzeugen in Assays auf IgM-Antikörper.
Unter jedem Aspekt umfassen Klassen von Puffern, die für das Verfahren dieser Erfindung geeignet sind, ionische, nichtionische und zwitterionische Puffer mit einem pKa-Wert nicht höher als ungefähr 6,5. Zusätzliche Einzelheiten zu der Bedeutung von pH und pKa sind zu finden in "Buffers - A guide for the preparation and use of buffers in biological systems", Donald E. Gueffroy, Herausgeber, Calbiochem-Novablochem (1975) Repräsentative Beispiele für Puffer, die für das Verfahren dieser Erfindung geeignet sind, umfassen, sind aber nicht begrenzt auf, Essigsäure, Citronensäure, Ameisensäure, Bernsteinsäure und Glycin.
Puffer, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, besitzen vorzugsweise einen pH im Bereich von ungefähr 3,0 bis ungefähr 6,5, noch besser von ungefähr 3,5 bis ungefähr 5,5, am besten von ungefähr 3,5 bis ungefähr 5.0. Falls der pH des Rheumafaktor-Neutralisationspuffers zu niedrig ist, werden die interessierenden Bindeglieder nicht binden, um Komplexe zu bilden. Falls der pH des Rheumafaktor-Neutralisationspuffers zu hoch ist, werden Rheumafaktoren an IgG-Antikörper binden, die an das Festphasenmaterial gebunden sind, und ein falsches positives Testergebnis ergeben. Es ist ebenfalls bevorzugt, dass antimikrobielle Wirkstoffe in dem Puffer eingeschlossen sind.
Während der Verwendung sollte der Rheumafaktor- Neutralisationspuffer in einer Konzentration vorhanden sein, die den geeigneten pH-Wert ergeben wird. Wenn der Rheumafaktor- Neutralisationspuffer verwendet wird, um den Bindeglied- Antikörper-Komplex auf einem Festphasenmaterial auf einer porösen Matrix zu waschen, wird der pH des Puffers nicht variieren, da der Puffer durch die biologische Probe nicht beeinträchtigt werden wird. Falls die Rheumafaktoren an ein komplementäres Bindeglied gebunden sind, wie IgG-Antikörper, die an das Festphasenmaterial gebunden sind, wird Unterwerfen des Komplexes, der die Rheumafaktoren enthält, einem Rheumafaktor- Neutralisationspuffer mit dem geeigneten pH dazu führen, dass die Komplexe, die Rheumafaktoren enthalten, herunterbrechen, wodurch es möglich wird, dass die ungebundenen Rheumafaktoren weggewaschen werden. Wenn jedoch der Rheumafaktor- Neutralisationspuffer in einer Mischung verwendet wird, die die biologische Probe enthält, kann die biologische Probe verursachen, dass sich der pH der Mischung verändert.
Entsprechend ist es in dieser Situation wünschenswert, sich auf pKa-Werte zu berufen als ein Mittel zur Regulierung des pH der Umgebung zur Eliminierung von Rheumafaktoren. Falls die Rheumafaktoren in einer Probe nicht an ein komplementäres Bindeglied gebunden sind, z. B. IgG-Antikörper, die an das Festphasenmaterial gebunden sind, wird ein Beibehalten der Rheumafaktoren in einer Umgebung mit dem geeigneten pH sie daran hindern, an ein komplementäres Bindeglied zu binden.
Da geeignete Konzentrationen des Rheumafaktor- Neutralisationspuffers über einen weiten Bereich variieren können, ist es schwierig, die genaue Menge von Rheumafaktor- Neutralisationspuffer anzugeben, die für einen bestimmten Assay benötigt wird. Allgemein ist unter dem Aspekt, dass das Festphasenmaterial, das den Bindeglied-Antikörper-Komplex enthält, gewaschen wird, die erforderliche Menge von Rheumafaktor-Neutralisationspuffer abhängig von der Oberfläche des porösen Materials. Unter dem Aspekt, dass die Probe oder das Reagenz, welches das Festphasenmaterial enthält, oder sowohl Probe als auch Reagenz verdünnt werden, ist die erforderliche Menge von Rheumafaktor-Neutralisationspuffer abhängig von der Dynamik des Assayprotokolls, z. B. von Reagenzvolumina. In IgM- Assays, z. B. in dem Toxo-IgM-Assay und in dem Rubella-IgM-Assay, die auf dem AxSYM Messgerät durchgeführt werden, können geeignete Mengen von Rheumafaktor-Neutralisationspuffer und der pH davon durch Kalibrieren gegen bekannte Proben berechnet werden. Eine solche Kalibrierung kann von einem Durchschnittsfachmann ohne weiteres ausgeführt werden.
Der Rheumafaktor-Neutralisationspuffer kann in das Assayverfahren an jedem beliebigen von mehreren Punkten eingebracht werden. Zum Beispiel kann der Puffer zu Beginn des Verfahrens in eine unbehandelte biologische Probe eingebracht werden oder in ein Reagenz, das ein Festphasenmaterial enthält, woran ein spezifisches Bindeglied, z. B. ein Antigen, gebunden ist, oder sowohl in Probe als auch Reagenz. Es ist bevorzugt, die Probe allein zu verdünnen. Jedoch ist es möglich, das Reagenz allein zu verdünnen, oder beide, die Probe und das Reagenz, zu verdünnen. Ungeachtet, welche Komponente des Assays durch den Rheumafaktor-Neutralisationspuffer verdünnt wird, ist das Prinzip Eliminieren von Rheumafaktoren das gleiche. Wenn natürlich nur das Reagenz verdünnt wird, findet keine Eliminierung von Rheumafaktoren aus der Probe statt, bis die Probe mit dem Reagenz kombiniert wird. Alternativ kann der Puffer verwendet werden, um Festphasenmaterialien zu waschen, die Komplexe enthalten, die Bindegliederpaare umfassen, z. B. Antigen-Antikörper-Komplexe, die sich gebildet haben über die Reaktion von Bindegliedern in der Probe, z. B. Antikörpern, mit Bindegliedern, die an das Festphasenmaterial angelagert sind, z. B. Antigene.
In dem Toxo-IgM-Asay und in dem Rubella-IgM-Assay werden falsche positive Ergebnisse häufig verursacht durch die Anwesenheit von Rheumafaktoren in menschlichen Seren oder Plasma. Für den Toxo-IgM-Assay kann der Rheumafaktor- Neutralisationspuffer vorzugsweise bei einem pH von ungefähr 4,0 bis ungefähr 5,0 auf die Matrix aufgebracht werden, nachdem das Reaktionsgemisch bestehend aus Mikropartikeln, die mit T. gondii-Antigen überzogen sind, und biologischer Probe auf die Matrix aufgebracht ist. Rheumafaktoren, die gebunden sind an Anti-T. gondii-IgG-Antikörper, die durch die Mikropartikel gefangen sind, werden herausgespült.
Für den Rubella-IgM-Assay kann der Rheumafaktor- Neutralisationspuffer vorzugsweise bei einem pH von ungefähr 4,0 bis ungefähr 5,0 auf die Matrix aufgebracht werden, nachdem das Reaktionsgemisch bestehend aus Mikropartikeln, die mit Rubella- Virus-Antigen überzogen sind, und biologischer Probe auf die Matrix aufgebracht ist. Rheumafaktoren, die gebunden sind an Anti-Rubella-IgG-Antikörper, die durch die Mikropartikel gefangen sind, werden herausgespült.
Alternativ können sowohl für den Toxo-IgM-Assay als auch für den Rubella-IgM-Assay Proben, die menschliche Seren oder Plasma enthalten, oder andere biologische Flüssigkeiten mit Rheumafaktor-Neutralisationspuffer verdünnt werden vor dem Mischen der Probe mit den Mikropartikeln, die mit dem interessierenden Antigen überzogen sind.
Wenden wir uns jetzt den Einzelheiten des Mikropartikeleinfang-Enzymimmunoassays zu, der typischerweise in dem Toxo-IgM-Assay und in dem Rubella-IgM-Assay verwendet wird, so wird die Anwesenheit von IgM-Antikörpern gemessen unter Verwendung eines Festphasenmaterials, worauf ein Bindeglied, das für interessierende IgM-Antikörper spezifisch ist, gebunden ist. Ein Beispiel eines Festphasenmaterials ist ein Mikropartikel, das mit einem Antigen überzogen ist, das in der Lage ist, mit dem interessierenden spezifischen Antikörper zu binden. Die Probe wird mit dem Festphasenmaterial kombiniert, um eine Mischung zu bilden; die Mischung wird inkubiert, wodurch sich das Antigen mit dem interessierenden Antikörper vereinigt. Das Festphasenmaterial und die Testprobe werden getrennt, so dass die Menge von IgM-Antikörper, die an das Antigen-überzogene Festphasenmaterial gebunden ist, bestimmt werden kann. Die Menge von IgM-Antikörper, die an das Festphasenmaterial gebunden ist, wird vorzugsweise bestimmt durch Enzymimmunoassay, worin ein Anti-Human-IgM-Antikörper, der mit einem Enzym markiert ist, als das Konjugat verwendet wird. Ein Material, das als ein Enzymsubstrat bezeichnet wird, kann durch ein geeignetes Enzym in eine fluoreszente Verbindung wie 4-Methylumbelliferon umgewandelt werden. Die Geschwindigkeit, mit der die fluoreszente Verbindung gebildet wird, ist ein Hinweis auf die Menge von Enzym, die in dem Reaktionsgemisch vorhanden ist. Wenn das Enzym die detektierbare Komponente ist, wie in einem Enzymimmunoassay, wird die Menge von vorhandenem Enzym in Zusammenhang gebracht mit der Menge an Konjugat, die in der Testprobe vorhanden ist. Folglich kann die Messung der Fluoreszenz verwendet werden, um die Menge von IgM-Antikörper zu bestimmen, die in der Testprobe vorhanden ist. Die Menge von Anti-Human-IgM-Konjugat auf dem Festphasenmaterial kann korreliert werden mit der Konzentration von IgM-Antikörper in der Testprobe mittels einer Auftragung, die die Enzymaktivität als eine Funktion der Konzentration von IgM-Antikörper zeigt, die typischerweise als eine Standardkurve bezeichnet wird. Eine Standardkurve kann hergestellt werden durch Durchführen des Assays unter Verwendung von Kalibratoren, welche dem Durchschnittsfachmann bekannt sind. Alternativ wird, besonders in dem Fall von Assays für IgM-Antikörper, ein einzelner Index- Kalibrator verwendet, um die Cutoff-Werte für den Assay zu bestimmen. Kontrollen werden verwendet, um zu prüfen, ob die Kalibration gültig ist. Wenn eine Probe mit einem unbekannten Spiegel von IgM-Antikörper untersucht wird, wird das gemessene Assaysignal verglichen mit dem Index-Kalibrator, und der Indexwertspiegel, der dem Messsignal entspricht, ist der Spiegel von IgM-Antikörper in der Probe.
Ein spezifisches Bindeglied kann an die feste Phase durch physikalische oder chemische Mittel gebunden werden, vorzugsweise mittels einer kovalenten Bindung oder durch hydrophobe Wechselwirkung. Das spezifische Bindeglied sollte an die feste Phase dermaßen gebunden sein, dass sich im Wesentlichen keines der spezifischen Bindeglieder während der nachfolgenden Reaktionen und Waschschritte ablöst. Unabhängig von dem spezifischen Bindeglied und dem gewählten Kopplungsverfahren muss das spezifische Bindeglied in der Lage sein, an die IgM-Antikörper in der Probe zu binden, nachdem es an das Festphasenmaterial gekoppelt ist.
Ein Festphasenmaterial gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine Mischung von Mikropartikeln sein, wobei Bindeglieder, die für den interessierenden Analyten spezifisch sind, chemisch oder physikalisch an die Mikropartikel gebunden sind. Mikropartikel, die in dieser Erfindung verwendet werden können, sind vorzugsweise hergestellt aus Polymermaterial, und umfassen noch besser Mikropartikel, die von Polymeren mit Styroleinheiten oder Polymeren mit Acrylateinheiten abgeleitet sind. Die Mikropartikel sind vorzugsweise im Wesentlichen kugelförmig und haben vorzugsweise Radien im Bereich von ungefähr 0,1 um bis ungefähr 0,25 Inch. Ein bevorzugtes Verfahren zum Abtrennen dieser Partikel von der Testprobe umfasst Einfangen des Mikropartikels auf einer porösen Matrix wie einer Glasfaser.
Eine poröse Matrix, die zur Verwendung in dieser Erfindung nützlich ist, kann jedes beliebige geeignete poröse Material sein. Wie hier verwendet bedeutet "poröses Material" ein Material, wodurch Flüssigkeiten fließen können und das diese leicht passieren können. Repräsentative Beispiele von geeigneten Materialien für die poröse Matrix umfassen, sind aber nicht begrenzt auf, Olefinpolymere, z. B. Polypropylen, Polyethylen, fluorierte Olefinpolymere, z. B. Polytetrafluorethylen, Glasfaser, Cellulose oder Nylon.
Bevorzugte Materialien für die poröse Matrix umfassen ein poröses Glasfasermaterial wie ein Filterpapier "Whatman 934-AH", welches eine Nenndicke von 0,33 mm besitzt, oder die IMx®- Wegwerfpatrone und TestPackTM(Fasermatrix)-Vorrichtungen (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL 60064), Die Dicke eines solchen Materials ist nicht kritisch und wird eine Sache der Wahl sein, beruhend auf den Eigenschaften der Testprobe oder des Analyten, die zu untersuchen sind, wie der Fluidität der Testprobe.
Zusätzlich sind bevorzugte Materialien kommerziell erhältlich in Matrixzellen von Abbott Laboratories, Abbott Park, IL 60064 unter Katalognummer 4B25-20 (AxSYM®-Toxo-IgM Reagenzpackung) und 4B46-20 (AxSYM®-Rubella-IgM Reagenzpackung).
Wie zuvor angegeben, kann ein Enzymsubstrat in eine fluoreszente Verbindung wie 4-Methylumbelliferon durch ein geeignetes Enzym umgewandelt werden. Die Geschwindigkeit, mit der die fluoreszente Verbindung gebildet wird, ist ein Hinweis auf die Menge von Enzym, die in dem Reaktionsgemisch vorhanden ist. Wenn das Enzym das detektierbare Material ist, wird die Menge von vorhandenem Enzym in Zusammenhang gebracht mit der Menge an IgM-Antikörpern, die in der Testprobe vorhanden ist. Folglich kann die Messung der Fluoreszenz, die aus der Enzymaktivität in einem Enzymimmunoassay resultiert, verwendet werden, um die Menge von IgM-Antikörpern zu bestimmen, die in der Testprobe vorhanden ist. Fluoreszenz kann gemessen werden durch jedes beliebige Verfahren, das auf dem Gebiet bekannt ist. Zum Beispiel kann ein Fluoreszenzspektrometer verwendet werden. Das Fluoreszenzspektrum kann außerdem beobachtet werden mittels eines visuellen Spektrometers oder durch ein Foto mit einem Spektrograph mit hoher Lichtstärke.
Die folgenden Beispiele sind illustrativ für die Erfindung und sollen nicht interpretiert werden als Begrenzung des Umfangs der Erfindung, wie sie in den Ansprüchen definiert ist.

Beispiel 1

Toxoplasmosis gondii-IaM-AssaV

AxSYM®-Assayformat

Der Toxoplasmosis gondii-IgM-Assay wurde auf einem AxSYM®-Messgerät, d. h. dem Messgerät, das in US-Patent Nr. 5.358.691 beschrieben ist, gemäß dem folgenden Verfahren durchgeführt. Serum- oder Plasmaproben und alle für einen Test erforderlichen Reagenzien wurden durch die Dosierungssonde (siehe erster Transferpipettenmechanismus 6 von US-Patent 5.358.691) in die geeigneten Vertiefungen eines Reaktionsgefäßes in dem Dosierungszentrum pipettiert (siehe Vorverarbeitungskarussell 4, Probenschalenkarussell 28, Reaktionsgefäßkarussell 36 und Reagenzpackungskarussell 32 von US-Patent 5.358.691). Das Reaktionsgefäß wurde sofort in das Verarbeitungszentrum überführt (siehe Prozesskarussell 46 von US-Patent 5.358.691). Weitere Pipettierung wurde in dem Verarbeitungszentrum durchgeführt an der Verarbeitungssonde (siehe zweiter Transferpipettenmechanismus 50 von US-Patent 5.358.691).
Anfänglich wurde Serum oder Plasma (10 ul) in einem Verhältnis von 1 : 27 mit AxSYM® Leitungsverdünner (0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,5) durch die Dosierungssonde verdünnt. Ein Aliquot, das die verdünnte Probe und AxSYM® T. gondii-Überzogene Mikropartikel (Stamm RH) enthält, wurde an eine Inkubationsvertiefung des Reaktionsgefäßes abgegeben, um ein Reaktionsgemisch zu bilden. Die verdünnte Probe wurde von einer Verdünnungsvertiefung abgezogen und die überzogenen Mikropartikel wurden von einer Reagenzpackung abgezogen. Das Reaktionsgemisch wurde ungefähr acht (8) Minuten lang bei einer Temperatur von 35ºC inkubiert.
AxSYM® Assayverdünner (0,05 M Tris, 25% Kalbserum, pH 7,5) wurde zu dem Reaktionsgemisch hinzugegeben und ein Aliquot der Mikropartikel, die den Antigen-Antikörper-Komplex enthalten, wurde zu der Matrixzelle des AxSYM®-Messgerätes überführt. Die Mikropartikel banden irreversibel an die Glasfasermatrix der Matrixzelle. Die Matrixzelle wurde mit Rheumafaktor- Neutralisationspuffer (RF-Neutralization Buffer, 100 ul, 0,1 M Citrat, pH 4,8) gewaschen, um Rheumafaktor- Interferenzantikörper, falls vorhanden, von den Mikropartikeln zu entfernen, die den Antigen-Antikörper-Komplex enthalten. Die Matrixzelle wurde gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen.
Ziegen-Anti-Human-IgM-Antikörper : alkalische Phosphatase- Konjugat (25 ul bei einer Konzentration von 1 ug/ml in Konjugatpuffer (0,05 M Tris, 5% Mausserum, pH 7,2)) wurde auf die Matrixzelle abgegeben und die resultierende Kombination wurde ungefähr acht (8) Minuten lang bei einer Temperatur von 35ºC inkubiert. Die Matrixzelle wurde gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen.
Eine Lösung des Substrates, 4-Methylumbelliferylphosphat (MUP) in Aminomethylphosphatpuffer (1,2 mM), wurde zu der Matrixzelle hinzugegeben, und die Geschwindigkeit der Bildung von 4-Methylumbelliferon wurde durch Fluoreszenzreflektionsvermögen gemessen. Das fluoreszente Produkt, 4-Methylumbelliferon, wurde durch die Mikropartikel- Enzymimmunoassay(MEIA)-Optikbaugruppe des AxSYM®-Messgerätes gemessen.
Das AxSYM®-System berechnete einen Indexwert für den Toxo-IgM-Assay beruhend auf dem Verhältnis der Probengeschwindigkeit zu der mittleren Geschwindigkeit des Indexkalibrators für jede Probe und jede Kontrolle.
Indexwert = Probengeschwindigkeit/mittlere Indexkalibratorgeschwindigkeit
Die zuvor genannten Geschwindigkeiten beruhen auf der Geschwindigkeit der Bildung von fluoreszentem Produkt, typischerweise gemessen in Zählungen pro Sekunde pro Sekunde. Proben mit einem Indexwert kleiner als 0,500 wurden als negativ für IgM-Antikörper zu T. gondii-Antigen nach den Kriterien des AxSYM®-Toxo-IgM-Assays angesehen. Proben mit einem Indexwert von 0,500 bis 0,599 wurden als doppeldeutig angesehen. Proben, die als doppeldeutig interpretiert wurden, können sehr niedrige Spiegel von IgM enthalten. Proben mit einem Indexwert größer oder gleich 0,600 wurden als positiv für IgM-Antikörper zu T. gondii-Antigen nach den Kriterien des AxSYM® Togo IgM-Assays angesehen.
Materialien, die für den Assay benötigt werden, einschließlich AxSYM® RF-Neutralisationspuffer (Citrat mit antimikrobiellen Wirkstoffen), AxSYM® T. gondii-überzogene Mikropartikel (in Puffer mit Proteinstabilisatoren und mit antimikrobiellen Wirkstoffen), Anti-Human-IgM- Antikörper : alkalische Phosphatase-Konjugat (in Puffer mit Proteinstabilisatoren und mit 0,2% Natriumazid), AxSYM® Assayverdünner (Puffer mit Proteinstabilisatoren und mit antimikrobiellen Wirkstoffen), 4- Methylumbelliferylphosphatsubstrat (1,2 mM, in Puffer, und mit 0,1% Natriumazid), AxSYM® Leitungsverdünner (0,1 M Phosphatpuffer und mit antimikrobiellen Wirkstoffen), AxSYM®- Messgeräte und Gebrauchsartikel waren kommerziell erhältlich von Abbott Laboratories, Abbott Park, IL (Katalog Nr. 4B25-20).

IMx®-Assay-Format

Der Toxo gondii-IgM-Assay wurde auf dem IMx®-Messgerät gemäß den Anweisungen des Herstellers ausgeführt (Katalog-Nr. 7A82-20). Der Zweck der Verwendung dieses Formats ist zu zeigen, dass der Assay der vorliegenden Erfindung eine gleich gute oder bessere Leistung erbringt wie ein gut bekannter Assay auf dem Gebiet.
Dieses Analysengerät enthält eine Optikbaugruppe, die ein Fluorometer umfasst, das eine Quecksilberlichtbogenlampe als Lichtquelle verwendet. Dieses Messgerät wird beschrieben von Fiore et al. (Clin. Chem., 34/9: 1726-1732, 1988), dessen technischen Bestandteile hier durch Literaturverweis eingegliedert sind. Das Messgerät nutzt IMx®-Wegwerfpätronen (kommerziell erhältlich von Abbott Laboratories, Abbott Pärk, IL), welche eine poröse Matrix enthalten, um Mikropartikel einzufangen, die Komplexe enthalten, die aus der Reaktion von Antigenen mit Antikörpern aus der Probe resultieren. Die gebundenen IgM-Antikörper werden dann mit dem Ziegen-Anti-Human- IgM : Enzymkonjugat detektiert. Der Marker, der in dem Konjugat verwendet wird, ist vorzugsweise alkalische Phosphatase. Die Mikropartikel werden von dem Reaktionsgemisch abgetrennt, Konjugat wird zu den Mikropartikeln hinzugegeben, Konjugat bindet an verfügbare IgM-Antikörper, und die Menge von Konjugat, die auf den Mikropartikeln vorhanden ist, wird bestimmt aus der Geschwindigkeit, mit der 4-Methylumbelliferylphosphat in 4- Methylumbelliferon umgewandelt wird. Die Menge an IgM- Antikörpern in der Probe kann bestimmt werden aus einer Standardkurve der Geschwindigkeit der 4- Methylumbelliferonbildung als eine Funktion der IgM-Antikörper- Konzentration.
Der Indexkalibrator, der die Geschwindigkeit der Bildung von 4-Methylumbelliferon zu der IgM-Antikörper-Konzentration in Beziehung bringt, ist ähnlich dem, der für den AxSYM® Toxo-IgM- Assay beschrieben ist. Ein Durchschnittsfachmann würde in der Lage sein, Kalibrator- und Kontrollformulierungen zu konstruieren, die für den IMx®-Toxo-IgM-Assay geeignet sind.
Kurz gesagt, eine Serum- oder eine Plasmaprobe wurde in einem Verhältnis von 1 : 30 mit IMx® MEIA-Puffer (0,05 M Tris, pH 7,5) verdünnt und mit T. gondii-überzogenen Mikropartikeln gemischt. Das Reaktionsgemisch wurde ungefähr acht (8) Minuten lang bei einer Temperatur von 35ºC inkubiert.
Ein Aliquot von den Mikropartikeln, die den Antigen- Antikörper-Komplex enthalten, wurde zu der Matrixzelle des IMx®- Messgerätes überführt. Die Mikropartikel banden irreversibel an die Glasfasermatrix der Matrixzelle. Die Matrixzelle wurde gewaschen, um ungebundene Materialien zu entfernen.
Ziegen-Anti-Human-IgM-Antikörper: alkalische Phosphatase- Konjugat (25 ul bei einer Konzentration von 1 ul/ml in Konjugatpuffer (0,05 M Tris, 5% Mausserum, pH 7,2)) wurde auf die Matrixzelle abgegeben und die resultierende Kombination wurde ungefähr acht (8) Minuten lang bei einer Temperatur von 35ºC inkubiert. Die Matrixzelle wurde gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen.
Eine Lösung des Substrates, 4-Methylumbelliferylphosphät (MUP) in Aminomethylphosphatpuffer (1,2 mM), wurde zu der Matrixzelle hinzugegeben, und die Geschwindigkeit der Bildung von 4-Methylumbelliferon wurde durch Fluoreszenzreflexionsvermögen gemessen. Das fluoreszente Produkt, 4-Methylumbelliferon, wurde durch die Mikropartikel- Enzymimmunoassay(MEIA)-Optikbaugruppe des IMx®-Messgerätes gemessen.
Das IMx®-System berechnete einen Indexwert für den Toxo- IgM-Assay beruhend auf dem Verhältnis der Probengeschwindigkeit zu der mittleren Geschwindigkeit des Indexkalibrators für jede Probe und jede Kontrolle.
Indexwert = Probengeschwindigkeit/mittlere Indexkalibratorgeschwindigkeit
Die zuvor genannten Geschwindigkeiten beruhen auf der Geschwindigkeit der Bildung von fluoreszentem Produkt, typischerweise gemessen in Zählungen pro Sekunde pro Sekunde. Proben mit einem Indexwert kleiner als 0,500 wurden als negativ für IgM-Antikörper zu T. gondii-Antigen nach den Kriterien des IMx®-Toxo-IgM-Assays angesehen. Proben mit einem Indexwert von 0,500 bis 0,599 wurden als doppeldeutig angesehen. Proben, die als doppeldeutig interpretiert wurden, können sehr niedrige Spiegel von IgM enthalten. Proben mit einem Indexwert größer oder gleich 0,600 wurden als positiv für IgM-Antikörper zu T. gondii-Antigen nach den Kriterien des IMx®-Toxo-IgM-Assays angesehen.
Alle positiven und doppeldeutigen Proben, d. h. jene Proben, die einen Indexwert größer als 0,500 haben, wurden mit dem IMx® Rheumafaktor-Neutralisationsreagenz (Human-IgGüberzogene Mikropartikel; Katalog Nr. 1A14-22) behandelt und erneut getestet.

Ergebnisse

1. Puffer-pH Optimierung

Drei Aliquote Citratpuffer mit pH-Werten im Bereich von pH 4,0 bis pH 5,6 und drei Aliquote Phosphatpuffer mit pH 7,5 wurden hergestellt und gegen vier Proben bewertet unter Verwendung des zuvor beschriebenen AxSYM®-Toxo-IgM-Assays. Die IMx®-Toxo-IgM-negative Kontrolle (NC) und die IMx®-Toxo-IgMpositive Kontrolle (PC) wurden erhalten von Abbott Laboratories, Abbott Park, IL (Katalog Nr. 7A82-10). Die Proben RF 1, RF 2, RF 3 und RF 4 waren hergestellte Proben, die Rheumafaktoren und T. gondii-IgG-Antikörper enthielten. Diese Proben wurden anfänglich durch den IMx®-Toxo-IgM-Assay als positiv und dann nach Behandlung mit IMx® Rheumafaktor-Neutralisationsreagenz als negativ bestimmt. Die Ergebnisse der Tests unter Verwendung des Rheumafaktor-Neutralisationspuffers mit dem AxSYM®-Messgerät sind in Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle I
Die Daten in Tabelle I zeigen, dass mit einem Index- Cutoff für positive Proben von 0,600 der pH-Bereich für den Citratpuffer, der am wirksamsten bei der Verhinderung von Rheumafaktor-Interferenz war, pH 4,0 bis pH 5,0 war. Die einzige Probe, die positiv für IgM-Antikörper zu T. gondii-Antigen war, war die PC-Probe. Die vier Rheumafaktor-positiven Proben (RF 1, RF 2, RF 3 und RF 4) wurden richtig identifiziert als negativ für IgM-Antikörper zu T. gondii-Antigen, wenn der pH des Puffers nicht höher als pH 5,0 war.

2. Probenbewertung

A. Klinische Rheumafaktor-Proben

Fünf klinische Rheumafaktor-Proben wurden über das IMx®-Toxo- IgM-Assayformat bewertet mit und ohne Behandlung durch IMx® Rheumafaktor-Neutralisationsreagenz (Katalog Nr. 1A14-22). Zusätzlich wurden die Proben durch den AxSYM®-Toxo-IgM-Assay bewertet. Tabelle II zeigt die Indexwerte, die für den Probensatz erhalten wurden. Tabelle II
Die Ergebnisse dieses Experimentes zeigten, dass der AxSYM®-Toxo-IgM-Assay bei Verwendung des Rheumafaktor- Neutralisationspuffers mit niedrigem pH innerhalb des Analysensystems ähnliche Ergebnisse ergab wie der IMx®-Toxo-IgM- Assay, der Behandlung mit IMx® Rheumafaktor- Neutralisationsreagenz außerhalb des Analysensystems einsetzte.

B. Hergestellte Rheumafaktor-Proben

Neun Proben, die Rheumafaktoren enthielten, wurden hergestellt durch Mischen von T. gondii-IgG-Antikörperpositiven Proben mit Rheumafaktor-positiven Proben, um falsche positive Proben für den IMx®-Toxo-IgM-Assay zu bilden. Zusätzlich wurde der Rheumafaktor-Neutralisationspuffer (pH 4,5), der in dem AxSYM®- Toxo-IgM-Assay verwendet wurde, substituiert durch den MEIA- Puffer (pH 7,5), der in dem IM4x®-Toxo-IgM-Assay verwendet wurde. Diese Proben wurden bewertet und die Ergebnisse sind in Tabelle III angezeigt. Tabelle III
Die Ergebnisse dieses Experimentes zeigten, dass die Waschung mit Puffer mit pH 4,5 die Rheumafaktoren eliminierte, aber die Waschung mit Puffer mit pH 7,5 spülte die Rheumafaktoren nicht heraus. Folglich halfder Rheumafaktor- Neutralisationspuffer mit niedrigem pH, die Zahl der falschen positiven Testergebnisse zu minimieren.

Beispiel 2

Rubella-IpM-Assay

AxSYM®-Assayformat

Der Rubella-IgM-Assay wurde auf dem AxSYM®-Messgerät gemäß dem folgenden Verfahren durchgeführt. Serum- oder Plasmaproben und alle für einen Test notwendigen Reagenzien wurden durch die Dosierungssonde (siehe erster Transferpipettenmechanismus 6 von US-Patent 5.358.691) in die geeigneten Vertiefungen eines Reaktionsgefäßes in dem Dosierungszentrum pipettiert (siehe Vorverarbeitungskarussell 4, Probenschalenkarussell 28, Reaktionsgefäßkarussell 36 und Reagenzpackungskarussell 32 von US-Patent 5.358.691). Das Reaktionsgefäß wurde sofort in das Verarbeitungszentrum überführt (siehe Prozesskarussell 46 von US-Patent 5.358.691). Weitere Pipettierung wurde in dem Verarbeitungszentrum durchgeführt an der Verarbeitungssonde (siehe zweiter Transferpipettenmechanismus 50 von US-Patent 5.358.691).
Serum oder Plasma wurde in einem Verhältnis von 1 : 30 in Rheumafaktor-Neutralisationspuffer (AxSYM® RF Neutralization Buffer, 0,5 M Citrat, pH 4,5) durch die Dosierungssonde verdünnt. Ein Aliquot verdünnter Probe und AxSYM® Rubella Virusüberzogene Mikropartikel (Stamm HPV 77) wurden an eine Inkubationsvertiefung des Reaktionsgefäßes abgegeben, um ein Reaktionsgemisch zu bilden. Die verdünnte Probe wurde von einer Verdünnungsvertiefung abgezogen und die überzogenen Mikropartikel wurden von einer Reagenzpackung abgezogen. Das Reaktionsgemisch wurde ungefähr acht (8) Minuten lang bei einer Temperatur von 35ºC inkubiert.
AxSYM® Assayverdünner (0,05 M Tris, 25% Kalbserum, pH 7,5) wurde zu dem Reaktionsgemisch hinzugegeben und ein Aliquot der Mikropartikel, die den Antigen-Antikörper-Komplex enthalten; wurde zu der Matrixzelle des AxSYM®-Messgerätes überführt. Die Mikropartikel banden irreversibel an die Glasfasermatrix der Matrixzelle. Die Matrixzelle wurde mit AxSYM® Leitungsverdünner (0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,2) gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen.
Ziegen-Anti-Human-IgM-Antikörper: alkalische Phosphatase- Konjugat (25 ul bei einer Konzentration von 1 ug/ml in Konjugatpuffer (0,05 M Tris, 5% Fetalserum vom Kalb, pH 7,2)) wurde an die Matrixzelle abgegeben und ungefähr acht (8) Minuten lang bei einer Temperatur von 35ºC inkubiert. Die Matrixzelle wurde gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen.
Eine Lösung des Substrates, 4-Methylumbelliferylphosphat (MUP) in Aminomethylphosphatpuffer (1,2 mM, 50 ul), wurde zu der Matrixzelle hinzugegeben, und die Geschwindigkeit der Bildung von 4-Methylumbelliferon wurde durch Fluoreszenzreflektionsvermögen gemessen. Das fluoreszente Produkt, 4-Methylumbelliferon, wurde durch die MEIA- Optikbaugruppe gemessen.
Das AxSYM®-System berechnete einen Rubella-IgM-Indexwert beruhend auf dem Verhältnis der Probengeschwindigkeit zu der mittleren Geschwindigkeit des Indexkalibrators für jede Probe und jede Kontrolle.
Indexwert = Probengeschwindigkeit/mittlere Indexkalibratorgeschwindigkeit
Die zuvor genannten Geschwindigkeiten beruhen auf der Geschwindigkeit der Bildung von fluoreszentem Produkt, typischerweise gemessen in Zählungen pro Sekunde pro Sekunde. Proben mit einem Indexwert kleiner als 0,600 wurden als negativ für IgM-Antikörper zu Rubella-Virus-Antigen nach den Kriterien des AxSYM®-Rubella-IgM-Assays angesehen. Proben mit einem Indexwert von 0,600 bis 0,799 wurden als doppeldeutig angesehen. Proben, die als doppeldeutig interpretiert wurden, können sehr niedrige Spiegel von Rubella-IgM enthalten. Proben mit einem Indexwert größer oder gleich 0,800 wurden als positiv für IgM- Antikörper zu Rubella-Virus-Antigen nach den Kriterien des AxSYM®-Rubella-IgM-Assays angesehen.
Materialien, die für den Assay benötigt werden, einschließlich AxSYM® RF Neutralisationspuffer (Citrat mit antimikrobiellen Wirkstoffen), AxSYM® Assayverdünner (Puffer mit Proteinstabilisatoren und mit antimikrobiellen Wirkstoffen), AxSYM® Rubella-Virus-überzogene Mikropartikel (in Puffer mit Proteinstabilisatoren und mit antimikrobiellen Wirkstoffen), Anti-Human-IgM(Ziege) : alkalische Phosphatase-Konjugat (in Puffer mit Proteinstabilisatoren und mit 0,1% Natriumazid), 4- Methylumbelliferylphosphatsubstrat (1,2 mM, in Puffer und mit 0,1% Natriumazid), AxSYM® Leitungsverdünner (0,1 M Phosphatpuffer und mit antimikrobiellen Wirkstoffen), AxSYM®- Messgeräte und Gebrauchsartikel waren kommerziell erhältlich von Abbott Laboratories, Abbott Park, IL (Katalog Nr. 4B46-20).

IMx®-Assay-Format

Der Rubella-Virus-IgM-Assay wurde auf dem IMx®-Messgerät gemäß den Anweisungen des Herstellers ausgeführt (Katalog-Nr. 7A24-20). Die Funktion des Messgerätes wurde zuvor in Beispiel 1 beschrieben. Der Zweck der Verwendung dieses Formats ist zu zeigen, dass der Assay der vorliegenden Erfindung eine gleich gute oder bessere Leistung erbringt wie ein gut bekannter Assay auf dem Gebiet.
Kurz gesagt, eine Serum- oder eine Plasmaprobe wurde in einem Verhältnis von 1 : 10 mit IMxs MEIA-Assaypuffer (0,05 M Tris, pH 7,5) verdünnt und mit AxSYM® Rubella-Virus-überzogenen Mikropartikeln (Stamm HPV 77) gemischt, um ein Reaktionsgemisch zu bilden. Das Reaktionsgemisch wurde ungefähr acht (8) Minuten lang bei einer Temperatur von 35ºC inkubiert.
Ein Aliquot von den Mikropartikeln, die den Antigen- Antikörper-Komplex enthalten, wurde zu der Matrixzelle des IMx®- Messgerätes überführt. Die Mikropartikel banden irreversibel an die Glasfasermatrix der Matrixzelle. Die Matrixzelle wurde gewaschen, um ungebundene Materialien zu entfernen.
Ziegen-Anti-Human-IgM-Antikörper: alkalische Phosphatase- Konjugat (25 ul bei einer Konzentration von 1 ul/ml in Konjugatpuffer (0,05 M Tris, 25% Fetalserum vom Kalb, pH 7,2)) wurde auf die Matrixzelle abgegeben und die resultierende Kombination wurde ungefähr acht (8) Minuten lang bei einer Temperatur von 35ºC inkubiert. Die Matrixzelle wurde gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen.
Eine Lösung des Substrates, 4-Methylumbelliferylphosphat (MUP) in Aminomethylphosphatpuffer (1,2 mM), wurde zu der Matrixzelle hinzugegeben, und die Geschwindigkeit der Bildung von 4-Methylumbelliferon wurde durch Fluoreszenzreflexionsvermögen gemessen. Das fluoreszente Produkt, 4-Methylumbelliferon, wurde durch die Mikropartikel- Enzymimmunoassay(MEIA)-Optikbaugruppe des IMx®-Messgerätes gemessen.
Das IMx®-System berechnete einen Rubella-Virus-Indexwert beruhend auf dem Verhältnis der Probengeschwindigkeit zu der mittleren Geschwindigkeit des Indexkalibrators für jede Probe und jede Kontrolle.
Indexwert = Probengeschwindigkeit/mittlere Indexkalibratorgeschwindigkeit
Die zuvor genannten Geschwindigkeiten beruhen auf der Geschwindigkeit der Bildung von fluoreszentem Produkt, typischerweise gemessen in Zählungen pro Sekunde pro Sekunde. Proben mit einem Indexwert kleiner als 0,800 wurden als negativ für IgM-Antikörper zu Rubella-Virus-Antigen nach den Kriterien des IMx®-Rubella-IgM-Assays angesehen. Proben mit einem Indexwert von 0,800 bis 0,999 wurden als doppeldeutig angesehen. Proben, die als doppeldeutig interpretiert wurden, können sehr niedrige Spiegel von Rubella-IgM-Antikörpern enthalten. Proben mit einem Indexwert größer oder gleich 1,000 wurden als positiv für IgM-Antikörper zu Rubella-Virus-Antigen nach den Kriterien des IMx®-Rubella-IgM-Assays angesehen und können eine primäre Rubellainfektion anzeigen.
Alle positiven und doppeldeutigen Proben, d. h. jene Proben, die einen Indexwert größer oder gleich 0,800 haben, wurden mit dem IMx® Rheumafaktor-Neutralisationsreagenz (Human- IgG-überzogene Mikropartikel; Katalog Nr. 1A14-22) behandelt und erneut getestet.

Ergebnisse

1. Puffer-pH Optimierung

Citratpuffer mit pH-Werten im Bereich von pH 3,5 bis pH 5,5 und Phosphatpuffer mit pH 7,5 wurden hergestellt und unter Verwendung von fünf Proben bewertet unter Verwendung des zuvor beschriebenen AxSYM®-Rubella-IgM-Assays. Die IMx®-Rubella-IgM- positiven Kontroll(PC)- und die IMx®-Rubella-TgM-negativen Kontroll(NC)-Proben wurden erhalten von Abbott Laboratories, Abbott Park, IL (Katalog Nr. 7A24-10). Die Proben RF P4, RF FY3 und RF FY4 waren klinische Proben, die Rheumafaktoren und Rubella-IgG-Antikörper enthielten. Diese Proben wurden anfänglich durch den IMx®-Rubella-IgM-Assay als positiv und dann nach Behandlung mit IMx® Rheumafaktor-Neutralisationsreagenz als negativ bestimmt. Die Ergebnisse der Tests bei Verwendung des Rheumafaktor-Neutralisationspuffer mit dem AxSYM®-Messgerät sind in Tabelle IV aufgeführt. Tabelle IV
Die Daten in Tabelle IV zeigen, dass mit einem Index- Cutoff für positive Proben von 0,600 der pH-Bereich für den Citratpuffer, der am wirksamsten bei der Verhinderung von Rheumafaktor-Interferenz war, pH 3,5 bis pH 5,0 war. Die einzige Probe, die positiv für IgM-Antikörper für Rubella-Virus-Antigen war, war die IgM-positive Probe. Die drei Rheumafaktor-positiven Proben (RF P4, RF FYB und RF FY4) wurden richtig identifiziert als negativ für IgM-Antikörper zu Rubella-Virus-Antigen, wenn der pH des Puffers nicht höher als pH 5,0 war.

2. Probenbewertung

A. Klinische Rheumafaktor-Proben

Einhundertsiebenundfünfzig (157) klinische Rheumafaktor-positive Proben wurden über das IMx®-Assayformat und das AxSYM®-Rubella- IgM-Assayformat bewertet. Zusätzlich wurde der Rheumafaktor- Neutralisationspuffer (pH 4,5), der in dem AxSYM®-Rubella-IgM- Asay verwendet wurde, substituiert durch den MEIA-Puffer (pH 7,5), der in dem IMx®-Rubella-IgM-Assay verwendet wurde. Sechsunddreißig (36) Proben waren Rheumafaktor-positiv oder doppeldeutig und wurden nach Behandlung mit IMx® Rheumafaktor- Neutralisationsreagenz (Human-IgG-überzogene Mikropartikelr Katalog Nr. 1A14-22) über den IMx®-Rubella-IgM-Assay wieder getestet. Um die Wirksamkeit des AxSYM®-Rubella-IgM-Assayformats mit niedrigem pH zu zeigen, wurden die 36 Proben außerdem über das AxSYM®-Rubella-IgM-Assayförmat unter Verwendung des MEIA- Puffers (pH 7,5) zum Verdünnen der Probe bewertet. Tabelle V zeigt die Indexwerte, die für den Probensatz erhalten wurden. Tabelle V
Die Ergebnisse dieser Bewertung zeigten, dass Verdünnen der Proben in Rheumafaktor-Neutralisationspuffer mit einem pH von 4,5 die falsche positive Reaktion eliminiert, die bei Proben zu erwarten wäre, die Rheumafaktoren enthalten. Die Verwendung des MEIA-Puffers in dem AxSYM®-Rubella-IgM-Assay ergab Ergebnisse ähnlich denen, die mit dem IMx®-Rubella-IgM-Assay erhalten wurden, der nicht die Rheumafaktor-Neutralisation mit IMx® Rheumafaktor-Neutralisationsreagenz (Human-TgG-überzogene Mikropartikel; Katalog Nr. 1A14-22) benutzte.

Claims

1. Ein Verfahren zur Eliminierung der Interferenz in einem diagnostischen Assay für IgM Antikörper, wobei die Interferenz aus der Anwesenheit von Rheumafaktoren resultiert, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:

(a) Bereitstellen eines Reagenzes, das ein Festphasenmaterial umfaßt, worauf ein Bindeglied spezifisch für diese IgM Antikörper immobilisiert ist;

(b) Kombinieren einer biologischen Probe und des Reagenzes unter Bedingungen, bei welchen das Bindeglied, das auf dem Festphasenmaterial immobilisiert ist, mit den IgM Antikörpern reagieren wird, um einen Bindeglied-IgM Antikörper-Komplex zu bilden; und

(c) Einbringen einer ausreichenden Menge an Rheumafaktor- Neutralisationspuffer, welcher einen pH im Bereich von 3,0 bis 5,5 besitzt, auf das Festphasenmaterial, um die Dissoziation der Rheumafaktoren von IgG-Antikörpern, welche an das Festphasenmaterial gebunden sind, zu bewirken.

2. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der Rheumafaktor-Neutralisationspuffer verwendet wird, um das Festphasenmaterial zu waschen, nachdem die biologische Probe mit dem Reagenz zur Reaktion gebracht wurde.

3. Ein Verfahren zur Eliminierung der Interferenz in einem diagnostischen Assay für IgM Antikörper, wobei die Interferenz aus der Anwesenheit von Rheumafaktoren resultiert, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:

(a) Bereitstellen eines Reagenzes, das ein Festphasenmaterial umfaßt, worauf ein Bindeglied spezifisch für diese IgM Antikörper immobilisiert ist; und

(b) Einbringen in die biologische Probe oder in das Reagenz von (a) oder in sowohl die biologische Probe als auch das Reagenz von (a) einer ausreichenden Menge an Rheumafaktor- Neutralisationspuffer, welcher einen pH im Bereich von 3,0 bis 5,5 besitzt, um die Bindung der Rheumafaktoren an IgG- Antikörper, welche an das Festphasenmaterial gebunden sind, zu verhindern.

4. Das Verfahren gemäß Anspruch 3, worin der Rheumafaktor-Neutralisationspuffer verwendet wird, um die biologische Probe zu verdünnen, bevor die biologische Probe mit dem Reagenz in Kontakt gebracht wird.

5. Das Verfahren gemäß Anspruch 3, worin der Rheumafaktor-Neutralisationspuffer verwendet wird, um das Reagenz zu verdünnen, bevor das Reagenz mit der biologischen Probe in Kontakt gebracht wird.

6. Ein Verfahren zur Entfernung von Rheumafaktoren aus einer biologischen Probe, das folgende Schritte umfaßt:

(a) Kombinieren einer biologischen Probe mit einem Festphasenmaterial, worauf ein Bindeglied spezifisch für IgM- Antikörper immobilisiert ist;

(b) Den IgM-Antikörpern, falls vorhanden, die spezifisch sind für das Bindeglied, das auf dem Festphasenmaterial immobilisiert ist, erlauben, an das immobilisierte Bindeglied zu binden, um einen Bindeglied-IgM-Antikörper-Komplex zu bilden;

(c) Abtrennen des Festphasenmaterials von der Probe;

(d) Waschen des abgetrennten Festphasehmaterials mit einer ausreichenden Menge an Rheumafaktor-Neutralisationspuffer, welcher einen pH im Bereich von 3,0 bis 5,5 besitzt, um die Rheumafaktoren von IgG-Antikörpern, welche an das Festphasenmaterial gebunden sind, zu dissoziieren.

(e) Unterwerfen des Festphasenmaterials nach Schritt (d) einem Antikörper-Enzym-Konjugat, welches an den Bindeglied-IgM- Antikörperkomplex binden wird, falls vorhanden, um einen Immunkomplex zu bilden;

(f) Entfernen von ungebundenem Material von dem Festphasenmaterial nach Schritt (e);

(g) Hinzufügen eines Substrates für das Enzym zu dem Immunkomplex; und

(h) Messen der Geschwindigkeit der Bildung von detektierbarem Produkt, welches aus der Reaktion des Enzyms mit dem Substrat resultiert.

7. Das Verfahren gemäß Anspruch 6, das weiterhin den Schritt Entfernen von ungebundenen Materialien von dem gewaschenen, abgetrennten Festphasenmaterial nach Schritt (d) umfaßt.

8. Ein Verfahren zur Entfernung von Rheumafaktoren aus einer biologischen Probe, das folgende Schritte umfaßt:

(b) Verdünnen einer biologischen Probe oder des Reagenzes von Schritt (a) oder sowohl der biologischen Probe als auch des Reagenzes von Schritt (a) mit einer ausreichenden Menge an Rheumafaktor-Neutralisationspuffer, welcher einen pH im Bereich von 3,0 bis 5,5 besitzt, um die Bindung der Rheumafaktoren an IgG-Antikörper, welche an das Festphasenmaterial gebunden sind, zu verhindern;

(c) Kombinieren der biologischen Probe und des Reagenzes unter Bedingungen, bei welchen IgM Antikörper spezifisch für das Bindeglied, falls vorhanden, an das immobilisierte Bindeglied binden, um einen Bindeglied-IgM-Antikörper-Komplex zu bilden;

(d) Abtrennen des Festphasenmaterials von der Probe;

(e) Unterwerfen des Festphasenmaterials nach Schritt (d) einem Antikörper-Enzym-Konjugat, welches an den Bindeglied-IgM- Antikörper-Komplex binden wird, falls vorhanden, um einen Immunkomplex zu bilden;

(g) Hinzufügen eines Substrates für das Enzym zu dem Immunkomplex; und

9. Das Verfahren gemäß Anspruch 8, das weiterhin den Schritt Entfernen von ungebundenen Materialien von dem Festphasenmaterial nach Schritt (e) umfaßt.

10. Das Verfahren gemäß Anspruch 6 oder 8, worin das Festphasenmaterial ein Mikropartikel ist.

11. Das Verfahren gemäß Anspruch 6 oder 8, worin das Enzym alkalische Phosphatase ist.

12. Das Verfahren gemäß Anspruch 6 oder 8, worin das Substrat für das Enzym 4-Methylumbelliferylphosphat ist.

13. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, 3, 6 oder 8, worin der Rheumafaktor-Neutralisationspuffer gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus ionischen, nichtionischen und zwitterionischen Puffern.

14. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, 3, 6 oder 8, worin der Rheumafaktor-Neutralisationspuffer einen pH im Bereich von 3,5 bis 5,0 besitzt.

15. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, 3, 6 oder 8, worin das Bindeglied, das auf dem Festphasenmaterial immobilisiert ist, ein Rubella Virus Antigen ist.

16. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, 3, 6 oder 8, worin das Bindeglied, das auf dem Festphasenmaterial immobilisiert ist, ein Taxoplasmosis gondii Antigen ist.

17. Das Verfahren gemäß Anspruch 2 oder 6 in einem Assay zur Detektion von Rubella-spezifischen IgM-Antikörpern in menschlichem Serum oder Plasma, worin das Bindeglied, das auf der festen Phase immobilisiert ist, ein Rubella Virus Antigen ist, das auf Mikropartikel aufgeschichtet ist, und der Rheumafaktor-Neutralisationspuffer einen pH im Bereich von 4,0 bis 5,0 besitzt.

18. Das Verfahren gemäß Anspruch 2 oder 6 in einem Assay zur Detektion von Taxoplasmosis gondii-spezifischen IgM- Antikörpern in menschlichem Serum oder Plasma, worin das Bindeglied, das auf der festen Phase immobilisiert ist, ein Taxoplasmosis gondii Antigen ist, das auf Mikropartikel aufgeschichtet ist, und der Rheumafaktor-Neutralisationspuffer einen pH im Bereich von 4,0 bis 5,0 besitzt.