DE3779522T2

DE3779522T2 - Ein neuer amylasetyp.

Info

Publication number: DE3779522T2
Application number: DE8787307560T
Authority: DE
Inventors: Matti Korhola; Hannes Melasniemi
Original assignee: Alko Oy AB
Current assignee: Alko Oy AB
Priority date: 1986-08-27
Filing date: 1987-08-26
Publication date: 1992-12-24
Anticipated expiration: 2007-08-27
Also published as: FI863484A; JPH0714356B2; FI81112B; DK164461C; DK164461B; DK448887A; FI81112C; EP0258050A2; US4971906A; JPH0364106B2; JPH03244388A; EP0258050B1; DK448887D0; DE3779522D1; JPS63102678A; JPH0576380A; FI863484A0; EP0258050A3

Description

Die vorliegende Erfindung stellt eine Amylase eines neuen Typs bereit, d.h. ein α-Amylase-Pullulanase-Enzym, welches bei hohen Temperaturen aktiv und stabil ist, wodurch es möglich ist, Maltosesirup aus Stärke herzustellen. Dieses lösliche Enzym wird im Kulturmedium bestimmter Clostridium thermohydrosulfuricum-Stämme gebildet, wenn sie auf einem Kulturmedium kultiviert werden, welches Dextrin oder niedermolekulare lösliche Stärke enthält.
Die Glukoseeinheiten der Stärke sind miteinander hauptsächlich durch α-1,4-glykosidische Bindungen unter Bildung langer Ketten verbunden. Ferner weist Stärke α-1,6-glykosidische Bindungen auf, wobei eine derartige Bindung an jeder Verzweigungsstelle der Ketten auftaucht.
α-Amylasen spalten 1,4-Bindungen der Stärke wahllos entlang der Ketten, wohingegen β-Amylasen dieselben Bindungen an den nichtreduzierenden Enden der Ketten spalten. Die Pullulanasen sind aufzweigende Enzyme, die die 1,6-Bindungen an den Verzweigungsstellen spalten.
Maltosesirups werden durch Hydrolysieren von Stärke mittels pflanzlicher β-Amylasen oder dadurch hergestellt, daß man eine verzuckernde α-Amylase aus Schimmelpilzen Stärke, die unter Verwendung von bakterieller α-Amylase verflüssigt worden ist, weiter hydrolysieren läßt. Durch beide Vorgehensweisen wird ein Maltosesirup erhalten, der etwa 60 % Maltose enthält. Höhere Maltoseausbeuten als diese werden unter Verwendung von β-Amylase zusammen mit Pullulanase erhalten. Maltosesirups werden hauptsächlich in der Kandier- und Backindustrie verwendet, da sie einen typischen mild-süßen Geschmack, eine niedrige Viskosität, eine niedrige Hygroskopizität und eine hohe thermische Stabilität aufweisen.
Es ist vorteilhaft für das Verfahren der Stärkehydrolyse, wenn das verwendete Enzym bei hohen Temperaturen aktiv und stabil ist. β-Amylasen, α-Amylasen aus Schimmelpilzen und im Handel erhältliche Pullulanasen aus Klebsiella pneumoniae und Bacillus sp. können jedoch bei Temperaturen von über 60ºC nicht verwendet werden. Daher wäre ein maltogenes Enzym mit hoher Thermostabilität bei der Herstellung von Maltosesirup vorteilhaft.
Wenn mehrere Enzyme in dem Verfahren eingesetzt werden, ist es gewöhnlich notwendig, hinsichtlich der Aktivitätsanforderungen der Enzyme Kompromisse zu machen, oder alternativ die Enzyme nacheinander zu verwenden und das Verfahren zwischendurch anzupassen. Hinsichtlich der Einfachheit und Wirtschaftlichkeit wäre es besser, wenn für das Verfahren ein einziges Enzym ausreichend wäre. Aus diesem Grunde sollte das zur Herstellung von Maltosesirup verwendete ideale Enzym verflüssigende, verzuckernde und Stärke-aufzweigende Aktivität aufweisen.
Hyun und Zeikus (1985; J. Bacteriol. 49, 1168) untersuchten den Abbau von Stärke durch den Clostridium thermohydrosulfuricum- Stamm E39 (ATCC 33223), der aus der heißen Octopus-Quelle im Yellowstone National Park in den Vereinigten Staaten isoliert wurde. Dieser Stamm produzierte zellgebundene Pullulanase und Glucoamylase aber keine α-Amylase. Die aus dem Stamm E39 erhaltenen Präparationen hydrolysierten Stärke unter Bildung von Glucose, ohne daß Maltose, Maltotriose oder Maltotetrose als Zwischenprodukte beobachtet wurden.
Das in der vorliegenden Erfindung beschriebene Enzym unterscheidet sich von den zuvor beschriebenen Amylasen, da das Enzym eine Amylase eines vollständig neuen Typs, α-Amylase-Pullulanase, ist, in welchem zwei separate Enzymaktivitäten, eine α-Amylase- und eine Pullulanase-Aktivität in demselben Proteinmolekül vorhanden sind. Das in der vorliegenden Erfindung beschriebene α- Amylase-Pullulanase-Enzym baut Stärke zu Maltose und Maltotriose ab, wobei das Temperatur-Optimum beider Enzymaktivitäten zwischen 80 und 90ºC liegt.
Die erfindungsgemäße Herstellung von α-Amylase-Pullulanase wurde mit den Clostridium thermohydrosulfuricum-Stämmen E 101-69 (DSM 3783) und E 100-69 (DSM 567), die 1969 von den österreichischen Zuckerrübenwerken isoliert wurden (Hollaus & Klaushofer, 1973; Int. Sugar J., 75, 237-241 und 271-275), beobachtet. Der Stamm E 100-69 ist ein neuartiger Stamm des Bacteriums Clostridium thermohydrosulfuricum. Der C. thermohydrosulfuricum-Stamm E 101- 69 wurde am 3. Juli 1986 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der oben genannten Hinterlegungsnummer DSM 3783 hinterlegt. Der Stamm E 100-69 wurde zuvor von seinen Entdeckern bei derselben Sammlung hinterlegt.
Verschiedene Stämme der Hefe Saccharomyces cerevisiae sind in der Lage, Maltose und Maltotriose als ihre Kohlenstoffquelle zu verwenden, um Ethanol zu bilden (Stewart & Russel, 1983; in Yeast Genetics, Fundamental and Applied Aspects, Seite 461, Herausgeber J. Spencer, D. Spencer und A. Smith, Springer-Verlag, New York). Da α-Amylase-Pullulanase Stärke spezifisch in eine Mischung dieser Zucker abbaut, kann Ethanol aus Stärke mittels Hefe unter Verwendung von α-Amylase-Pullulanase als Maischenzym hergestellt werden.

Beispiele

Die die Beispiele betreffenden begleitenden Figuren stellen die Eigenschaften der erfindungsgemäßen α-Amylase-Pullulanase wie folgt dar:
Figur 1. Wirkung der Temperatur auf die Aktivität von α-Amylase- Pullulanase.
Figur 2. Wirkung des pH-Wertes auf die Aktivität von α-Amylase- Pullulanase, bei 85ºC (A) und 60ºC (B).
Figur 3. Inaktivierung von α-Amylase-Pullulanase bei verschiedenen Temperaturen in einem Puffer, ohne Substrat und Calcium.
Figur 4. Stabilisierung der α-Amylase-Pullulanase durch Calcium bei hohen Temperaturen.
Figur 5. Hydrolyse von Stärke durch gereinigte α-Amylase-Pullulanase bei verschiedenen Temperaturen.
Figur 6. Ein Dünnschichtchromatogramm der durch α-Amylase-Pullulanase gebildeten Endprodukte.

Bestimmung der Enzymaktivitäten

Die α-Amylase- und Pullulanase-Aktivitäten wurden bestimmt, indem die Geschwindigkeit der Reduktion von Zuckern gemessen wurde, die durch sie aus reiner Amylose (Typ III: aus Kartoffel, Sigma Chemical Co. Ltd., St. Louis, MO 63178, USA) und aus Pullulan (Sigma) freigesetzt wurden. 25 ul des Enzyms wurden 1 ml eines 0,5 %-igen Substrats in einem 100 mM Natriumacetatpuffer zugesetzt, der auf einen pH-Wert von 5,6 eingestellt war und 2 mM CaCl&sub2;, 0,1 mM Na&sub2;-EDTA und 50 mM NaCl enthielt. Die reduzierenden Zucker wurden durch das Verfahren von Nelson-Somogyi (Nelson, 1944; J. Biol. Chem., 153, 375; Somogyi, 1952; J. Biol. Chem., 195, 19) bestimmt, nachdem die Röhrchen für 15 Minuten bei 85ºC inkubiert worden waren. Bei der oben genannten Analyse entspricht der durch eine α-Amylase- oder eine Pullulanase-Enzymeinheit freigesetzte reduzierende Zucker einem Nanomol wasserfreier Glukose. Die Amylose wurde mittels 1 M NaOH in Lösung gebracht, mit HCl neutralisiert, der Puffer wurde zugegeben, und die Lösung wurde schließlich unter Verwendung eines 1,2 um RAWP- Membranfilters (Millipore Corp., Ashby Road, Bedford, MA 01730, USA) filtriert.
Das Protein wurde nach der Methode von Lowry (Lowry et al., 1952; J. Biol. Chem., 193, 256) mit Ovalbumin (Fraktion V, Sigma) als Standard bestimmt. Zusammensetzung des verwendeten Mediums Bestandteil: Lösliche Stärke (nach Zulkowsky), (E. Merck, Darmstadt, Bundesrepublik Deutschland) Hefeextrakt (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA) Trypton (Difco) Fleischextrakt (Lab-Lemco), (Oxoid Ltd., Basingstoke, Hampshire, England)

Charakterisierung des Rohenzyms

Der Stamm E 101-69 wurde in einem zwei-Liter-Kolben ohne Rühren 30 Stunden lang unter anaeroben Bedingungen bei 68ºC im oben beschriebenen Medium, welchem 1 mg l&supmin;¹ Resazurin und 200 ul l&supmin;¹ Thioglykolsäure zugegeben worden waren, kultiviert. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation entfernt, wonach die Rohpräparation der α-Amylase-Pullulanase aus dem Überstand des Kulturmediums ausgefällt wurde, wobei die α-Amylaseaktivität 520 Einheiten ml&supmin;¹ und die Pullulanaseaktivität 1550 Einheiten ml&supmin;¹ betrugen, indem es mit Ammoniumsulfat zu 70 % gesättigt wurde. Einige der wesentlichen Eigenschaften des Enzyms wurden charakterisiert durch Verwendung dieser Rohpräparation mit einer α-Amylaseaktivität von 12 000 Einheiten ml&supmin;¹ und einer Pullulanaseaktivität von 37 000 Einheiten ml&supmin;¹.
Beide Aktivitäten des Enzyms hatten ihr Temperatur-Optimum bei 85ºC (Figur 1), wenn die α-Amylase- und Pullulanaseaktivitäten von verdünntem Rohenzym (1200 Einheiten ml&supmin;¹ α-Amylase und 3700 Einheiten ml&supmin;¹ Pullulanase) gemäß dem oben beschriebenen Vorgehen (Seite 4) aber unter Anwendung unterschiedlicher Temperaturen bestimmt wurden.
Das pH-Optimum beider Aktivitäten betrug 5,6, wenn die Bestimmungen bei 85ºC (Figur 2A) durchgeführt wurden und 5,2, wenn die Bestimmungen bei 60ºC (Figur 2B) erfolgten; ein Wert von 100 wurde in der Figur für die höchsten Aktivitäten bei beiden Temperaturen angegeben. 25 ul des verdünnten Rohenzyms (30 Einheiten α-Amylase und 90 Einheiten Pullulanase) wurden 1 ml eines auf verschiedene pH-Werte eingestellten 100 mM Natriumcitratpuffers, enthaltend 0,5 % Amylose oder Pullulan, 50 mM NaCl und 10 mM CaCl&sub2;, zugegeben. Die Röhrchen wurden anschließend für 15 Minuten bei 85ºC oder 60ºC inkubiert, und die freigesetzten reduzierenden Zucker wurden bestimmt.
Beide Aktivitäten waren bei 60ºC stabil, aber sie wurden beide in derselben Weise bei höheren Temperaturen inaktiviert, wenn sie in einem 100 mM Natriumacetatpuffer, pH 5,6, bei verschiedenen Temperaturen inkubiert wurden, wobei die Endkonzentration von α-Amylase 800 Einheiten ml&supmin;¹ und die von Pullulanase 2400 Einheiten ml&supmin;¹ betrug. Die verbleibenden α-Amylase- und Pullulanaseaktivitäten wurden durch das oben beschriebene Verfahren (Seite 4) unter Verwendung von 50 ul Proben, die zu den in der Figur dargestellten Zeiten entnommen wurden, bestimmt.
Calciumionen stabilisierten beide Aktivitäten in derselben Weise bei hohen Temperaturen (Figur 4). Rohenzym wurde einem 100 mM Natriumacetatpuffer, pH 5,6, enthaltend verschiedene Mengen an Calcium, zugegeben, um eine Endkonzentration von 800 Einheiten ml&supmin;¹ α-Amylase und 2400 Einheiten ml&supmin;¹ Pullulanase, zu ergeben. Der Ansatz wurde 2 Stunden lang bei Temperaturen von 85ºC, 90ºC und 95ºC inkubiert. Die verbleibenden α-Amylase- und Pullulanaseaktivitäten wurden durch das oben beschriebene Verfahren (Seite 4) unter Verwendung von 50 ul Proben bestimmt.

Reinigung des Enzyms

Das lösliche α-Amylase-Pullulanase-Enzym wurde aus der Kulturbrühe des Stammes E 101-69 wie folgt gereinigt. Der Stamm wurde anaerob 40 Stunden lang bei 68ºC in einem 22-Liter-Kolben ohne Rühren in dem auf Seite 5 beschriebenen Medium kultiviert. Nachdem die Zellen mittels Zentrifugation entfernt worden waren, wurden dem kalten Überstand 15 g l&supmin;¹ Weizenstärke (BDH Chemicals Ltd., Broom Road, Poole BH12 4NN, England) und 200 mg l&supmin;¹ Natriumazid zugegeben, und es wurde anschließend in der Kälte 90 Stunden lang gerührt, um das Enzym an die Stärke zu adsorbieren. Danach ließ man die Stärke 24 Stunden lang absetzen, der Überstand wurde entfernt, und der Stärkekuchen, welcher sich auf dem Boden abgesetzt hatte, wurde mittels Aufschlämmen in zwei Litern eiskaltem Wasser und mittels Zentrifugation gewaschen. Das adsorbierte Enzym wurde von der Stärke durch Extrahieren in einem heißen Bad getrennt, indem es zweimal mit einem halben Liter 60ºC heißen Wassers vermischt und zentrifugiert wurde.
Die Extrakte wurden unter Verwendung von konzentriertem Natriumacetat, eingestellt auf pH 5,6, 20 mM gemacht und auf eine 2,6 x 15 cm DEAE-Cellulosesäule (DE 52; Whatman Ltd., Springfield Mill. Maidstone, Kent, England) aufgetragen, die mit demselben Puffer equilibriert war. Die Säule wurde mit dem equilibrierten Puffer gewaschen und anschließend zunächst mit 100 mM und danach mit 200 mM Natriumchlorid in demselben Puffer eluiert. Die unter Verwendung des konzentrierten Salzes erhaltenen Eluate wurden kombiniert und unter Verwendung einer Ultrafiltrationskammer (Amicon Corp., Damvers, Massachusetts, USA), bestückt mit einer PM 10-Membran, auf 21 ml konzentriert.
Die Probe wurde gegen einen 10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0, dialysiert und auf eine 2,6 x 13 cm Hydroxyapatitsäule (Bio Gel HT, Bio Rad, 1414 Harbour Way South, Richmond, California 94804, USA) aufgetragen, die mit demselben Puffer equilibriert war. Die Säule wurde zunächst mit dem Equilibrierungspuffer gewaschen und anschließend unter Verwendung eines 10-400 mM Kaliumphosphatgradienten, pH 7,0, eluiert. Das Enzym wurde als ein Peak eluiert, welchem eine Schulter mit einer deutlich niedrigeren spezifischen Aktivität folgte. Die eluierten Fraktionen des Peaks wurden kombiniert und wie oben auf ein Volumen von 1 ml konzentriert.
Die konzentrierte Probe wurde in Portionen von je 200 ul durch kombinierte Superose 12 und 6 Gelfiltrationssäulen (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) in einem 50 mM Ammoniumacetatpuffer, pH 6,5, bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 6 ml pro Stunde laufen gelassen. Das in Form zweier benachbarter Peaks eluierte Enzym und das in ihnen enthaltene Material (I und II) wurde lyophilisiert. Die spezifische α-Amylaseaktivität der Präparation I betrug auf dieser Stufe 39 000 Einheiten mg&supmin;¹ und dessen spezifische Pullulanaseaktivität 101 000 Einheiten mg&supmin;¹, die entsprechenden spezifischen Aktivitäten der Präparation II betrugen 36 000 Einheiten mg&supmin;¹ bzw. 90 000 Einheiten mg&supmin;¹.
Beide Präparationen wurden anschließend unter Verwendung einer Superose 6 Säule unter denaturierenden Bedingungen in Anwesenheit von 6 M Guandinhydrochlorid und β-Mercaptoethanol gelfiltriert. Es ist beobachtet worden, daß Proteine unter diesen Bedingungen im allgemeinen ihre nicht-kovalente Struktur vollständig verlieren und in ihre Untereinheiten dissoziieren (Tanford, 1968, Advan. Protein Chem., 23, 121). Vor der Gelfiltration wurden die Proben in einem Probenpuffer der folgenden Zusammensetzung gelöst: 7,3 M Guanidinhydrochlorid, 0,1 M Natriumacetat, 0,02 M EDTA, 0,5 M β-Mercaptoethanol bei einem pH-Wert von 8,1. Die Proben wurden 4 Stunden lang bei 50ºC inkubiert, der pH-Wert wurde auf 5,0 eingestellt, und die Proben wurden anschließend in Portionen von je 200 ul bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1 ml pro Stunde laufen gelassen, wobei der Puffer aus 6 M Guanidinhydrochlorid, 100 mM Natriumacetat, 20 mM β-Mercaptoethanol bestand und einen pH-Wert von 5,0 aufwies. Die Fraktionen, in denen das Enzym eluierte, wurden kombiniert und sorgfältig gegen einen 20 mM Ammoniumhydrogencarbonatpuffer, pH 7,9, dialysiert. Die somit erhaltenen renaturierten Enzympräparationen (I und II), die sowohl gemäß SDS-Polyacrylamid- Gradientengelelektrophorese (vgl. Broschüre, "Calibration kits for molecular weight determination using electrophoresis"; Pharmacia Fine Chemical Uppsala, Schweden, 1982) als auch gemäß in Guanidinhydrochlorid durchgeführter Gelfiltration homogen waren, wurden zur weiteren Charakterisierung des Enzyms verwendet.

An das Enzym gebundenes Kohlenhydrat

Die gereinigte α-Amylase-Pullulanase enthielt Kohlenhydrat. Bei der Hydrolyse setzte das Enzym Zucker frei, die bei einer Dünnschichtchromatographie auf einer Silicagel-60-Platte (Nr. 5553, E. Merck), gesättigt mit 0,2 M NaH&sub2;PO&sub4;, mit einer Mischung aus n- Butanol, Aceton und Wasser (4:5:1, v/v) als Elutionsmittel, dieselbe Mobilität aufweisen, wie Mannose, Glucose, Galactose und Ramnose. Die Menge an neutralen Hexosen wurde auf 10 % der Gesamtmenge an Protein und neutralen Hexosen geschätzt, sofern die neutralen Hexosen durch das Verfahren von Antron (Spiro, 1965; Methods in Entzymology, Band 8, Seite 3) mit Mannose als Standard bestimmt wurden.

Molekulargewicht des Enzyms

Eine SDS-Polyacrylamid-Gradientengelelektrophorese mit PAA 4/30- Gelen (Pharmacia Fine Chemicals) zeigte, daß die α-Amylase-Pullulanase aus Untereinheiten lediglich eines Typs mit einem außergewöhnlich hohen Molekulargewicht bestand. Das für die Enzymuntereinheit erhaltene relative Molekulargewicht betrug unter Verwendung der Präparation I 190 000 ± 30 000 und unter Verwendung der Präparation II 180 000 ± 30 000. Unter nativen Arbeitsbedingungen betrug das für die renaturierte α-Amylase-Pullulanase mit denselben Gelen erhaltene relative Molekulargewicht unter Verwendung der Präparation I 370 000 ± 85 000 und unter Einsatz der Präparation II 330 000 ± 85 000. Die von dem Enzym mittels Gradienten-Gelelektrophorese erhaltenen Banden waren sehr diffus. Andererseits wurde durch Guanidinhydrochlorid-Gelfiltration ein scharfer, symmetrischer Peak an einem Punkt erhalten, der einem relativen Molekulargewicht von 275 000 ± 50 000 entspricht. Dieses Verfahren führte zu keiner Unterscheidung der Präparationen I und II in einer Probe, welche beide enthielt.

Hydrolyse von Stärke bei verschiedenen Temperaturen

Die Anwesenheit von Substrat stabilisierte die α-Amylase-Pullulanase, so daß es möglich war, das Enzym zur Hydrolyse von Stärke bei sowohl 80ºC als auch bei 60ºC zu verwenden (Figur 5). Gereinigte α-Amylase-Pullulanase wurde mit 480 Einheiten ml&supmin;¹ α- Amylase und 1100 Einheiten ml&supmin;¹ Pullulanase in Röhrchen überführt, die in einem 100 mM Natriumacetatpuffer 0,5 % Maisstärke (Sigma), 2 mM CaCl&sub2;, 0,1 mM Na&sub2;-EDTA und 50 mM NaCl enthielten und einen pH-Wert von 5,6 besaßen. Die Röhrchen wurden bei Temperaturen von 60ºC, 70ºC und 80ºC inkubiert, und ihre reduzierenden Zucker wurden in den Proben bestimmt, die zu den in der Figur angegebenen Zeiten entnommen worden waren. Der Prozentgehalt der Hydrolyse wurde durch Vergleich der Menge an in den Proben anwesenden reduzierenden Zuckern mit der Menge an in dem Substrat anwesenden reduzierenden Zuckern, hydrolysiert zu Glucose unter Verwendung von verdünnter Säure (0,5 N HCl, 100ºC, 3 Stunden), verglichen.

Durch das Enzym gebildete Endprodukte

Die von α-Amylase-Pullulanase gebildeten Endprodukte wurden wie folgt bestimmt. 0,5 %-ige Lösungen wurden aus Amylose (Typ III: aus Kartoffeln), Pullulan und Maisstärke (alles von Sigma) in einem Puffer (100 mM Natriumacetat, 2 mM CaCl&sub2;, 0,1 mM Na&sub2;-EDTA, 50 mM NaCl, pH 5,6) hergestellt, gereinigte α-Amylase-Pullulanase-Präparation I oder II wurde den Lösungen zugegeben, und sie wurden bei 80ºC inkubiert. Das Enzym wurde in zwei Konzentrationen eingesetzt, 480 Einheiten ml&supmin;¹ α-Amylase und 1100 Einheiten ml&supmin;¹ Pullulanase (= 1X) und 10fach stärker (= 10X). Aus den Hydrolysaten nach 24 Stunden und 48 Stunden entnommene Proben wurden auf Silikagel-60-Platten (Nr. 5553, E. Merck) pipettiert und mit einer Mischung aus 2-Propanol, Aceton und Wasser (2:2:1, v/v) eluiert.
Gereinigte α-Amylase-Pullulanase (1X) baute das Pullulan in Maltotriose ab, wohingegen sowohl die Kartoffel-Amylose als auch die Maisstärke in Maltose und Maltotriose abgebaut wurden (Figur 6). Wenn die höhere Enzymkonzentration (10X) eingesetzt wurde, wurde beobachtet, daß die Maltotriose weiter abgebaut wurde (Figur 6). In diesem Fall wurden aus Maisstärke innerhalb einer 48-stündigen Hydrolyse 77 % Maltose, 15 % Glucose und 4 % Maltotriose gebildet. Die Maltose und die Maltotriose wurden mittels Flüssigchromatographie mit einer Säule quantifiziert, die mit Nucleosil 5 C&sub1;&sub8; Reversed-Phase-Material (Macherey-Nagel,D-5160 Düren, Bundesrepublik Deutschland) gepackt war und mit Wasser eluiert wurde, während die Glucose enzymatisch quantifiziert wurde (UV Testkit Nr.716 251, Boehringer-Mannheim, Mannheim, Bundesrepublik Deutschland). Die Prozentgehalte der Hydrolyseprodukte wurden durch Vergleich ihrer Mengen mit der Menge an Substrat, das mit verdünnter Säure (0,5 N HCl, 100ºC, 3 Stunden) zu Glucose hydrolysiert wurde, verglichen.

Vergleich der Stämme E 101-69 und E 100-69

Die Stämme E 101-69 und E 100-69 wurden anaerob und ohne Schütteln 24 Stunden lang bei 68ºC in dem oben beschriebenen Medium kultiviert, welchem 1 mg l&supmin;¹ Resazurin und 200 ul l&supmin;¹ Thioglykolsäure zugegeben worden waren. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation entfernt und aus den Überständen wurden mit dem Stamm E 101-69 partiell gereinigte α-Amylase-Pullulanase-Präparationen mit einer spezifischen α-Amylaseaktivität von 21 000 Einheiten mg&supmin;¹ und einer spezifischen Pullulanaseaktivität von 63 000 Einheiten mg&supmin;¹ und mit dem Stamm E 100-69 entsprechende spezifische Aktivitäten von 20 000 Einheiten mg&supmin;¹ und 56 000 Einheiten mg&supmin;¹ erhalten. Nachdem man mit diesen Präparationen SDS-Polyacrylamidgele gefahren hatte, zeigten beide lediglich ein paar deutlich schwächere Banden und zusätzlich eine starke diffuse Bande, die mit derselben Mobilität wie die α-Amylase-Pullulanase des Stammes E 101-69 lief, die zuvor bis zu einem homogenen Zustand gereinigt worden war.

Claims

1. Amylaseenzym, dadurch gekennzeichnet, daß ein und dasselbe Proteinmolekül sowohl α-Amylaseaktivität als auch Pullulanaseaktivität aufweist, unter deren Einwirkung Stärke zu Maltose und Maltotriose abgebaut wird, daß das Enzym oder die dafür kodierende DNA-Sequenz aus einem Stamm der Gattung Clostridium gewonnen wird, und daß das Temperaturoptimum für die beiden Enzymaktivitäten etwa zwischen 80 und 90ºC liegt.

2. Enzym gemäß Anspruch 1, dadurch charakterisiert, daß sein relatives Molekulargewicht, bestimmt durch Gradientenpolyacrylamidgelelektrophorese, in Anwesenheit von Natriumdodecylsulfat 185 000 ± 40 000 ist.

3. Enzym gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch charakterisiert, daß das besagte Temperatur-Optimum ungefähr 85ºC, das pH-Optimum bei 85ºC pH 5-6, vorzugsweise etwa 5,6, und bei 60ºC pH 4,5- 5,5, vorzugsweise etwa 5,2 ist.

4. Enzym gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch charakterisiert, daß es durch Verwendung eines Clostridium thermohydrosulfuricum-Stammes hergestellt werden kann.

5. Verfahren zur Herstellung eines α-Amylase-Pullulanase-Enzyms gemäß Anspruch 1, dadurch charakterisiert, daß ein Clostridium thermohydrosulfuricum-Stamm auf einem Substrat, das Stärke oder ein Stärkehydrolysat enthält, bei einer Temperatur von 42ºC - 78ºC und einem pH von 6-8 kultiviert und das gebildete Enzym gewonnen wird.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch charakterisiert, daß der Stamm bei 55ºC bis 75ºC und bei einem pH-Wert von etwa 7 kultiviert wird.

7. Verfahren zur Herstellung von Maltose und Maltotriose aus Stärke oder einem Stärkehydrolysat, dadurch charakterisiert, daß ein Enzym gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 verwendet wird, wobei das Enzym bei einer Temperatur von über 60ºC und einem pH von 4-6,5 mit der Stärke oder dem Stärkehydrolysat zur Reaktion gebracht wird.