DE69006221T2

DE69006221T2 - Verfahren zur behandlung von septischem schock.

Info

Publication number: DE69006221T2
Application number: DE91902317T
Authority: DE
Inventors: John Abrams; H Starnes
Original assignee: FLETCHER STARNES H; Schering Corp
Current assignee: FLETCHER STARNES H; Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 1989-12-04
Filing date: 1990-11-30
Publication date: 1994-05-05
Anticipated expiration: 2010-12-01
Also published as: EP0504307A1; CA2070424A1; AU648777B2; HUT64481A; ATE100331T1; HU9201859D0; EP0504307B1; ES2062762T3; AU7179491A; DK0504307T3; JPH05504058A; WO1991007986A1; DE69006221D1; FI922551A0; FI922551A; WO1991007986A8; JPH0747547B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Behandeln eines septischen Schocks durch Verabreichen van Antagonisten gegen Interleukin-6 (IL-6).

HINTERGRUND

Schwere Infektionen, insbesondere mit gramnegativen Bakterien, können tiefgreifende physiologische und metabolische Änderungen einschließlich Fieber, Bluthochdruck, metabolischer Azidose, ausgedehnter Organfunktionsstörungen und schließlich den Tod zur Folge haben. Derartige Veränderungen werden häufig als septischer Schock bezeichnet. Es ist kürzlich gezeigt worden, daß das vom Wirt stammende Protein, der Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), viele der schädlichen Wirkungen der gramnegativen Septikämie hervorruft und daß die passive Immunisierung gegen TNF mit Antiseren die tödlichen Wirkungen der gramnegativen Bakteriämie oder Endotoxämie verhüten kann: z.B. Tracey et al., Science, Bd. 234, S. 470 (1986); Beutler et al.; Nature, Bd. 320, S. 584 (1986), und Tracey et al., Nature, Bd. 330, S. 662 (1987). Hohe Serumspiegel von TNF sind bei mehreren Infektionskrankheiten einschließlich Meningokokkenmeningitis, Malaria und Leishmaniasis beobachtet worden und Patienten mit hohen TNF-Spiegeln im Kreislauf besitzen vermehrt Organfunktionsstörungen zusammen mit einer höheren Sterblichkeit: z.B. Waage et al., Lancet, S. 355 (1987); Girardin et al., New Engl. J. Med., Bd. 319, S. 397 (1988); Scuderi et al., Läncet, S. 1364 (1988), und Kern et al., Am. J. Med., Bd. 87, S. 139 (1989).
Es ist berichtet worden, daß die Verabreichung von TNF entweder an Tiere oder menschliche Personen zwei bis sechs Stunden später zu nachweisbaren IL-6-Serumspiegeln führt: McIntosh et al., J. Immunol., Bd. 143, S. 162 (1989); Jablons et al., J. Immunol., Bd. 142, S. 1542 (1989), und Brouckaert et al., J. Exp. Med., Bd. 169, S. 2257 (1989). IL-6, auch als B-Zellen stimulierender Faktor-2, Interferon-β2 und Hepatozyten stimulierender Faktor bekannt, ist als ein von T-Zellen stammendes Glykoprotein erkannt worden, welches eine Reifung der B-Zellen hervorruft, z.B. Kishimoto, Blood, Bd. 74, S. 1 (1989). Kürzlich ist von IL-6 gezeigt worden, daß es pleotrope biologische Wirkungen einschließlich einer Induktion von Akute-Phase-Proteinen in Hepatozyten und Wirkungen auf Blutbildungsvorläuferzellen und T-Zellen besitzt: z.B. Geiger et al., Eur. J. Immunol., Bd. 18, S. 717 (1988), Marinjovic et al., J. Immunol., Bd. 142, S. 808 (1989), Morrone et al., J. Biol. Chem., Bd. 263, S. 12554 (1988), und Perlmutter et al., J. Clin. Invest., Bd. 84, S. 138 (1989).
Derzeit werden septische Zustände, wie etwa Bakteriämie und dergleichen, mit antimikrobiellen Verbindungen behandelt. Wenn derartige Zustände jedoch mit Schock verbunden sind, gibt es in der Therapie zum Bessern des Schocksyndroms keine wirksamen begleitenden Maßnahmen: z.B. Young, S. 468-470, in Mandell et al., Hrsg., Principles and Practice of Infectious Diseases, 2. Ausg. (John Wiley & Sons, New York, 1985). Im Hinblick darauf könnte die Verfügbarkeit von Techniken zum Behandeln eines mit einer Sepsis verbundenen Schocks einen bedeutenden klinischen Nutzen besitzen.

KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Verwendung eines Antagonisten gegen Human-IL-6 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verfügung, die bei der Behandlung eines septischen Schocks von Nutzen ist. Vorzugsweise sind die Antagonisten gegen IL-6 monoklonale Antikörper oder durch Standardtechniken davon abgeleitete bindende Zusammensetzungen.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figur 1 veranschaulicht die Überlebensdaten männlicher BALB/c- Mäuse, welchen intraperitoneal lebende E. coli injiziert wurden und die mit verschiedenen monoklonalen Antikörpern behandelt wurden.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung beruht auf dem Befund, daß eine erhöhte Produktion von IL-6 ein Bindeglied in der Ursachenkette der physiologischen Ereignisse ist, die bei massiven Mikroorganismeninfektionen wie etwa Septikämie zu einem Schock führen. Das Verfahren der Erfindung umfaßt die Verwendung eines Antagonisten gegen Human-IL-6 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die bei der Behandlung eines septischen Schocks von Nutzen ist.
Vorzugsweise stammen die bei der Erfindung verwendeten Antagonisten von Antikörpern, die für Human-IL-6 spezifisch sind. Bevorzugter umfassen die bei der Erfindung verwendeten Antagonisten für IL-6 spezifische Fragmente oder bindende Zusammensetzungen. Antikörper umfassen eine Zusammensetzung von Polypeptidketten, welche durch Disulfidbrücken miteinander verknüpft sind. Zwei Polypeptidhauptketten, welche als die leichte Kette und die schwere Kette bezeichnet werden, bilden alle Antikörper-Hauptstrukturklassen (Isotypen). Sowohl die schweren Ketten als auch die leichten Ketten werden weiter in Unterbereiche aufgeteilt, die als variable Bereiche und konstante Bereiche bezeichnet werden. Schwere Ketten umfassen einen einzigen variablen Bereich und drei verschiedene konstante Bereiche und leichte Ketten umfassen einen einzigen variablen Bereich (von demjenigen der schweren Kette verschieden) und einen einzigen konstanten Bereich (von denjenigen der schweren Kette verschieden). Die variablen Bereiche der schweren Kette und der leichten Kette sind für die Bindungsspezifität des Antikörpers verantwortlich.
Wenn der Ausdruck "variabler Bereich der schweren Kette" hier verwendet wird, bedeutet er ein Polypeptid, welches (1) 110 bis 125 Aminosäuren lang ist und (2) dessen Aminosäurensequenz ausgehend von der N-terminalen Aminosäure der schweren Kette derjenigen einer schweren Kette eines monoklonalen Antikörpers der Erfindung entspricht. Desgleichen bedeutet der Ausdruck "variabler Bereich der leichten Kette" ein Polypeptid, welches (1) 95 bis 115 Aminosäuren lang ist und (2) dessen Aminosäurensequenz ausgehend von der N-terminalen Aminosäure der leichten Kette derjenigen einer leichten Kette eines monoklonalen Antikörpers der Erfindung entspricht.
Wenn der Ausdruck "monoklonaler Antikörper" hier verwendet wird, bezieht er sich auf homogene Immunglobulinpopulationen, die zum spezifischen Binden an Human-IL-6 befähigt sind.
Wenn der Ausdruck "bindende Zusammensetzung" hier verwendet wird, bedeutet er eine Zusammensetzung, die zwei Polypeptidketten umfaßt, die (1), wenn sie funktionell verbunden sind, eine Konformation mit einer hohen Bindungsaffinität für Human-IL-6 annehmen, und die (2) von einem Hybridom stammen, das auf Human- IL-6 spezifische monoklonale Antikörper produziert. Der Ausdruck "funktionell verbunden" ist dazu bestimmt, anzugeben, daß die beiden Polypeptidketten zum Binden durch eine Vielzahl Mittel zu einander angeordnet sein können, zum Beispiel ein Verbund in einem natürlichen Antikörperfragment, wie etwa Fab oder Fv, oder mittels gentechnisch hergestellter cysteinhaltiger Peptidlinker an den Carboxyl-Termini. Normalerweise entsprechen die beiden Polypeptidketten dem variablen Bereich der leichten Kette und der variablen Region der schweren Kette eines für Human-IL-6 spezifischen monoklonalen Antikörpers. Vorzugsweise stammen die Antagonisten der Erfindung aus für Human-IL-6 spezifischen monoklonalen Antikörpern. Zum Blockieren oder Neutralisieren von IL- 6 bef ähigte monoklonale Antikörper werden durch ihre Fähigkeit zum Hemmen von durch IL-6 hervorgerufenen Wirkungen in Standard- IL-6-Biotests ausgewählt: wie z.B. bei Sehgal et al., Science, Bd. 235, S. 731-732 (1987), Billiau, Immunol. Today, Bd. 8, S. 84-87 (1987), und Wong et al., Immunol. Today, Bd. 9, S. 137-139 (1988), beschrieben. Vorzugsweise wird die Hemmung der folgenden biologischen Aktivitäten zum Screenen auf monoklonale Antikörper verwendet, die zum Neutralisieren von IL-6 befähigt sind: (i) antivirale Wirksamkeit, (ii) Verstärkung der Immunglobulinsekretion und (iii) Stimulation des Wachstums bestimmter EBV- transformierter Zellinien. Die Hemmung der antiviralen Wirksamkeit kann in Standardtests der Hemmung der zytopathischen Wirkung gemessen werden, wie etwa den von Armstrong, Meth. Enzymol., Bd. 78, S. 381-387 (1981), und Familletti et al., Meth. Enzymol., Bd. 78, S. 387-399 (1981), beschriebenen, welche beide durch Verweis inbegriffen sind. Neutralisierende Antikörper werden auf der Grundlage ihrer Fähigkeit zum Entgegenwirken oder unwirksam Machen der Hemmung zytopathischer Wirkungen einer Standardkonzentration von IL-6 ausgewählt. Neutralisierende Antikörper können auch durch ihre Fähigkeit zum Verhindern des durch IL-6 stimulierten Wachstums bestimmter Plasmazytom-Zellinien, wie etwa MOPC-315, ausgewählt werden, z.B. Chiu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 85, S. 7099-7103 (1988). MOPC- 315 ist von der American Type Culture Collection unter der Zugangsnummer TIB 23 erhältlich. Ein weiteres Mittel zum Auswählen neutralisierender Antikörper ist die Hemmung der durch IL-6 stimulierten Immunglobulinsekretion EBV-transformierter Zellinien, wie etwa CESS und SKW6.4 (erhältlich von der ATCC unter den Zugangsnummern TIB 190 beziehungsweise TIB 215), z.B. Hirano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 82, S. 5490-5494 (1985). Die Antikörpersekretion wird geeigneterweise durch einen isotopenspezifischen ELISA mittels im Handel erhältlicher isotopenspezifischer monoklonaler Antikörper gemessen. Zum Beispiel werden (4-6) x 10³ CESS- oder SKW 6.4-Zellen in 200 ul Kulturmedium, z.B. RPMI 1640 mit etwa 3-30 pM IL-6 kultiviert. Nach etwa 3 Tagen wird bei den Überständen die IgG-Konzentration (CESS) oder die IgM-Konzentration (SKW 6.4) bestimmt.
Hybridome werden durch wohlbekannte Techniken hergestellt. Üblicherweise umfaßt das Verfahren die Fusion einer immortalisierten Zellinie mit einem B-Lymphozyten, welcher den gewünschten Antikörper produziert. Wahlweise sind Nicht-Fusionstechniken zum Erzeugen immortalisierter, Antikörper produzierender Zellinien möglich und fallen unter den Umfang der vorliegenden Erfindung, z.B. eine viral ausgelöste Transformation: Casali et al., "Human Monoclonals from Antigen-Specific Selection of B Lymphocytes and Transformation by EBV", Science, Bd. 234, S. 476-479 (1986).
Immortalisierte Zellinien sind üblicherweise transformierte Säugerzellen, insbesondere Myelomzellen vom Nagetier, Rind und menschlichen Ursprungs. Am häufigsten werden Ratten- oder Mäusemyelomzellinien aus Gründen der Bequemlichkeit und der Verfügbarkeit eingesetzt. Techniken zum Erhalten der geeigneten Lymphozyten aus Säugern, denen das Zielantigen injiziert wurde, sind wohlbekannt. Im allgemeinen werden entweder periphere Blutlymphozyten (PBLs) verwendet, falls Zellen menschlichen Ursprungs gewünscht werden, oder Milzzellen oder Lymphknotenzellen werden verwendet, falls nicht-menschliche Säugerquellen gewünscht werden. Einem Wirtssäuger werden wiederholte Dosen des gereinigten Antigens injiziert und dem Säuger wird gestattet, die gewünschten Antikörper produzierenden Zellen zu erzeugen, bevor diese zur Fusion mit der immortalisierenden Zellinie geerntet werden. Techniken zur Fusion sind in der Technik ebenfalls wohlbekannt und umfassen im allgemeinen das Mischen der Zellen mit einem Fusionsmittel wie etwa Polyethylenglykol. Hybridome werden durch Standardverfahren wie etwa HAT-Selektion ausgewählt. Unter diesen Hybridomen werden diejenigen, welche den gewünschten Antikörper, d.h. einen auf Human-IL-6 spezifischen, sekretieren, durch Untersuchen ihres Kulturmediums durch Standardimmuntests, wie etwa Western-Blotting, ELISA, RIA, die Fähigkeit zum Neutralisieren von IL-6 oder dergleichen ausgewählt. Antikörper werden aus dem Medium mittels Proteinstandardreinigungsverfahren gewonnen, z.B. Tijssen, Practise and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985). Viele Zitate sind zur Anleitung beim Anwenden einer der vorstehenden Techniken verfügbar: z.B. Kohler et al., Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980); Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985); Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984); Hurrell, Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications (CRC Press, Boca Raton, FL, 1982), und dergleichen. Hybridome, die für Human-IL-6 spezifische monoklonale Antikörper produzieren, werden anschließend einem zweiten Screening mittels der vorstehend beschriebenen IL-6-Bestimmungen unterzogen, um solche auszuwählen, die zum Blockieren oder Neutralisieren der biologischen Aktivität von IL-6 befähigt sind.
Die Verwendung und Erzeugung von Fragmenten von Antikörpern ist ebenfalls gut bekannt, z.B. Fab-Fragmente: Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985), und Fv-Fragmente: Hochman et al., Biochemistry, Vol. 12, S. 1130- 1135 (1973), Sharon et al., Biochemistrv, Bd. 15, S. 1591-1594 (1976), und Ehrlich et al., US-Patent 4 355 023, und Antikörper- Molekülhälften: Auditore-Hargreaves, US-Patent 4 470 925.
Hybridome und monoklonale Antikörper werden entweder gegen glykosylierte oder unglykosylierte Varianten von rekombinant erzeugtem, reifem humanem IL-6 gebildet. Im allgemeinen werden die unglykosylierten Varianten von Human-IL-6 in E. coli gebildet und die glykosylierten Varianten werden in Säugerwirtszellen, z.B. CV1- oder COS-Affenzellen, Maus-L-Zellen oder dergleichen gebildet. Rekombinant erzeugtes reifes Human-IL-6 wird durch Einschleusen eines Expressionsvektors in eine Wirtszelle unter Verwendung von Standardvorschriften gebildet: z.B. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982); Okayama und Berg, Mol. Cell. Biol., Bd. 2, S. 161-170 (1982), und Bd. 3, S. 280-289 (1983), Takebe et al., Mol. Cell. Biol., Bd. 8, S. 466-472 (1988), US-Patent 4 599 308, US-Patent 4 675 285, Kaufman et al., Mol. Cell. Biol., Bd. 2, S. 1304-1319 (1982), oder dergleichen. Wenn erst die Nukleotidsequenz, welche für ein gewünschtes Protein kodiert, bekannt oder auf andere Weise verfügbar ist, ist der Aufbau von Expressionsvektoren aus Bakterien oder Säugern in der Technik gut bekannt: z.B. offenbart DeBoer im US-Patent 4 551 433 Promotoren zur Verwendung bei bakteriellen Expressionsvektoren; Goeddel et al. offenbaren im US-Patent 4 601 980 und Riggs im US-Patent 4 431 739 die Herstellung von Säugerproteinen durch E. coli-Expressionssysteme und Riggs (vorstehend zitiert), Ferretti et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 83, S. 599-603 (1986), Sproat et al., Nucleic Acids Research, Bd. 13, S. 2959-2977 (1985) und Mullenbach et al., J. Biol. Chem., Bd. 261, S. 719- 722 (1986) offenbaren, wie synthetische Gene zur Expression in Bakterien aufgebaut werden. Dementsprechend sind diese Zitate durch Verweis inbegriffen. Die Aminosäuresequenz von reifem Human-IL-6 wird von Hirano et al., Nature, Bd. 324, S. 73-76 (1986) und Zilberstein et al., EMBO J., Bd. 5, Seiten 2529-2537 (1986) offenbart; für Human-IL-6 kodierende synthetische Gene sind im Handel von Beckman Instruments (Fullerton, CA) erhältlich und gereinigtes Human-IL-6 ist im Handel von Genzyme Corp. (Boston, MA) erhältlich. Viele bakterielle Expressionsvektoren und Wirte sind im Handel und durch die ATCC erhältlich.
Für Hybridome kennzeichnende Antikörper und Antikörperfragmente können auch durch rekombinante Mittel durch Extrahieren von Messenger-RNA, Aufbauen einer cDNA-Bank und Auswählen von Klonen, die für Segmente des Antikörpermoleküls kodieren, hergestellt werden: z.B. Wall et al., Nucleic Acids Research, Bd. 5, S. 3113-3128 (1978), Zakut et al., Nucleic Acids Research, Bd. 8, S. 3591-3601 (1980), Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 81, S. 3273-3277 (1984), Boss et al., Nucleic Acids Research, Bd. 12, S. 3791-3806 (1984), Amster et al., Nucleic Acids Research, Bd. 8, S. 2055-2065 (1980), Moore et al., US- Patent 4 642 334, und Skerra et al., Science, Bd. 240, S. 1038- 1041 (1988). Insbesondere können solche Techniken zum Erzeugen interspezifischer monoklonaler Antikörper verwendet werden, bei welchen der bindende Bereich einer Art mit dem nicht-bindenden Bereich des Antikörpers einer anderen Art zum Verringern der Immunogenität kombiniert wird, z.B. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 84, S. 3439-3443 (1987).
Bei der Erfindung verwendete Antagonisten werden als pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht. Derartige Zusammensetzungen enthalten eine therapeutische Menge eines derartigen Antagonisten, z.B. wenigstens einen der monoklonalen Antikörper oder Fragmente desselben, in einem pharmazeutischen Träger. Ein pharmazeutischer Träger kann jede verträgliche, nicht-toxische Substanz sein, die zur Abgabe der Zusammensetzungen der Erfindung an einen Patienten geeignet sind. Steriles Wasser, Alkohol, Fette, Wachse und inerte Feststoffe können in einem Träger enthalten sein. Pharmazeutisch annehmbare Zusatzstoffe (Puffer, Dispergiermittel) können ebenfalls in die pharmazeutische Zusammensetzung eingearbeitet sein. Im allgemeinen sind zur parenteralen Verabreichung derartiger Wirkstoffe brauchbare Zusammensetzungen gut bekannt, z.B. Remington's Pharmaceutical Science, 15. Ausg. (Mack Publishing Company, Easton, PA, 1980). Wahlweise können Zusammensetzungen der Erfindung durch ein implantierbares oder injizierbares Wirkstoffzuführungssystem in den Körper eines Patienten eingeführt werden: z.B. Urquhart et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., Bd. 24, S. 199-236 (1984), Lewis, Hrsg., Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals (Plenum Press, New York, 1981), US-Patent 3 773 919, US-Patent 3 270 960 und dergleichen.
Bei der Erfindung verwendete, von Antikörpern stammende Antagonisten werden normalerweise parenteral, vorzugsweise intravenös verabfolgt. Da derartige Protein- oder Peptidantagonisten immunogen sein können, werden sie vorzugsweise langsam, entweder durch eine herkömmliche Anordnung zur i.v.-Verabfolgung oder aus einem subkutanen Depot verabfolgt, wie z.B. von Tomasi et al., US-Patent 4 732 863, gelehrt. Wenn die Antikörper oder Fragmente parenteral verabfolgt werden, werden sie in Form einer injizierbaren Einzeldosis (z.B. Lösung, Suspension oder Emulsion) zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren, parenteralen Träger formuliert. Derartige Träger sind selbst nicht-toxisch und nicht-therapeutisch. Beispiele derartiger Träger sind normale Kochsalzlösung, Ringersche Lösung, Dextroselösung und Hanksche Lösung. Nichtwäßrige Träger, wie etwa pflanzliche Öle und Ölsäureethylester können ebenfälls verwendet werden. Ein bevorzugter Träger ist 5% Dextrose/Kochsalzlösung. Der Träger kann untergeordnete Menge von Zusatzstoffen enthalten, wie etwa Substanzen, welche die Isotonie und chemische Stabilität erhöhen, z.B. Puffer und Konservierungsmittel. Der Antikörper wird vorzugsweise in gereinigter Form, die im wesentlichen frei von Aggregaten, anderen Proteinen, Endotoxinen und dergleichen ist, in Konzentrationen von etwa 5 bis 30 mg/ml, vorzugsweise 10 bis 20 mg/ml, formuliert. Vorzugsweise sind die Endotoxingehalte geringer als 2,5 IU/ml.
Das Auswählen einer Verabreichungsvorschrift für einen Antagonisten hängt von mehreren Faktoren ab, einschließlich der Serumumwandlungsrate des Antagonisten, des Serumspiegels des mit der Septikämie verbundenen IL-6, der Immunogenität des Antagonisten, der Zugänglichkeit des Ziel-IL-6 (z.B. wenn nicht-serales IL-6 blockiert werden soll), der Affinität des IL-6 zu seinem (seinen) Rezeptor(en) bezogen auf diejenige von IL-6 gegenüber dem Antagonisten und dergleichen. Vorzugsweise bringt die Verabreichungsvorschrift die Menge Antagonist, welche dem Patienten verbunden mit einem annehmbaren Maß Nebenwirkungen zugeführt wird, auf ein Höchstmaß. Dementsprechend hängt die Menge an zugeführtem Antagonisten teilweise von dem jeweiligen Antagonisten und der Schwere des behandelnden Zustandes ab. Eine Anleitung zum Auswählen geeigneter Dosen wird in der Literatur über therapeutische Anwendungen von Antikörpern gefunden: z.B. Bach et al., Kapitel 22 in Ferrone et al., Hrsg., Handbook of Monoclonal Antibodies (Noges Publications, Park Ridge, NJ, 1985) und Russell, S. 303-357, und Smith et al., S. 365-389, bei Haber et al., Hrsg., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy (Raven Press, New York, 1977). Wann immer der Antagonist monoklonale Antikörper oder Fragmente davon in Fab-Größe (einschließlich bindender Zusammensetzungen) umfaßt, liegt die Dosis vorzugsweise im Bereich von etwa 1-20 mg/kg je Tag. Bevorzugter liegt die Dosis im Bereich von etwa 1-10 mg/kg je Tag.

BEISPIELE

Die folgenden Beispiele dienen zum Veranschaulichen von Aspekten der vorliegenden Erfindung. Die ausgewählten Vektoren, Wirte, Fusionspartner, Reagenzienkonzentration, Temperaturen und die Werte anderer Variablen dienen nur als Beispiel für die Erfindung und sollten nicht als deren Begrenzungen angesehen werden.

Beispiel I. Herstellung eines IL-6 neutralisierenden monoklonalen Antikörpers

Eine männliche Lewis-Ratte wurde mit halbgereinigten Zubereitungen von in COS7-Zellen exprimiertem Maus-IL-6 (dieses Expressionssystem wird von Lee et al., Annals N. Y. Acad. Sci., Bd. 557, S. 215-229 (1989), und von Chui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 85, 7099-7103 (1988) beschrieben) immunisiert. Die Ratte wurde zuerst mit ungefähr 50 ug Maus-IL-6 in Freundschem vollständigem Adjuvans immunisiert und anschließend wurde zwei Mal mit derselben Materialmenge in Freundschem unvollständigem Adjuvans verstärkt. Es wurde Testblut entnommen. Dem Tier wurde eine Schlußverstärkung von 25 ug in phosphatgepufferter Kochsalzlösung gegeben und vier Tage später wurde die Milz zur Fusion erhalten.
Ungefähr 3 x 10&sup8; Ratten-Splenozyten wurden mit der gleichen Zahl P3X63-AG8 . 653-Maus-Myelomzellen (erhältlich von der ATTC unter der Zugangsnummer CRL 1580) fusioniert. 3480 Mikrotiterplattennäpfchen wurden mit 5,7 x 10&sup4; Eltern-Myelomzellen je Näpfchen beimpft. Die Hälfte dieser Näpfchen wurde anfänglich mit ungefähr 22 Einheiten/Näpfchen rekombinantem Human-IL-6 kultiviert. Wie bei Chiu et al. beschrieben (vorstehend zitiert), sind die Einheiten in Bezug auf dar Wachstum der Zellinie NFS-60 als Antwort auf das Human-IL-6 definiert. Weitere 576 Näpfchen wurden mit 1,9 x 10&sup5; Eltern je Näpfchen beimpft. Standardvorschriften zur Fusion und dem darauffolgenden Kultivieren von Hybriden, welche im wesentlichen dieselben wie die von Chretien et al., J. Immunol. Meth., Bd. 117, S. 67-81 (1989), beschriebenen waren, wurde gefolgt. Zwölf Tage nach der Fusion wurden die Überstände geerntet und (1) durch indirekten ELISA auf PVC- Platten, die mit durch COS7 hergestelltem Maus-IL-6 beschichtet waren, und (2) durch ihre Fähigkeit, das Wachstum von NFS-60- Zellen, welche von IL-6 abhängig sind, zu hemmen, gescreent. Die vorstehende Screeningvorschrift wurde wegen der IL-6 zugeschriebenen Hybridom-Wachstumsfaktoraktivität verwendet. Es wurde daraus gefolgert, anfänglich durch diese Hybridome hergestellte neutralisierende anti-IL-6-Antikörper könnten ihr Wachstum durch Abreichern des IL-6 in dem Kulturmedium verhindern. So wurden einige Näpfchen mit Human-IL-6 (hIL-6) beimpft, welches bei Mauszellen aktiv ist. Wie nachstehend in der Tabelle gezeigt, wurde in jedem Fall etwa derselbe Anteil neutralisierender Antikörper erzeugt. TABELLE 1 Anfangsimpfbedingung Zahl der Näpfchen, die neutralisierendes anti-IL-6 enthalten Zahl der beimpften Näpfchen Prozent beimpfte Näpfchen mit neutralisierendes den Mabs kein hIL-6; 5,7x10&sup4; Zellen/Näpfchen 22 E/Näpfchen hIL-6;
Monoklonale Antikörper aus einem MP5-20F3 bezeichneten Hybridom wurden in den Experimenten von Beispiel II verwendet.

Beispiel II. Prophylaktische Wirkung von neutralisierendem anti-IL-6-Mab auf Mäuse, denen eine lethale Dosis E. coli injiziert wurde

Männliche BALB/c-Mäuse (19-21 g) wurden in zufälliger Weise fünf verschiedenen Behandlungsgruppen A - E zugeordnet und die Gruppen einschließende Experimente wurden an fünf verschiedenen Tagen angesetzt. In Gruppe A (30 Mäuse) wurden jeder Maus durch intraperitoneale Injektion 0,75 bis 1,00 mg monoklonaler Antikörper (Mab) gegen rekombinantes Maus-IL-6 (anti-rekombinanter Maus-IL-6 monoklonaler Antikörper) gegeben. In Gruppe B (30 Mäuse) wurden jeder Maus durch intraperitoneale Injektion 0,1 bis 1,0 mg anti-rekombinantes Kaninchen-Maus-TNFα IgG gegeben. In Gruppe C (30 Mäuse) wurden jeder Maus durch intraperitoneale Injektion 0,5 bis 1,0 mg Isotyp-Kontroll-Mab GL113 gegeben. In Gruppe D (5 Mäuse) wurde jeder Maus durch intraperitoneale Injektion ein Isotyp-Kontroll-Mab mit einem zweifach höheren Endotoxingehalt als derjenige des Anti-IL-6-Mab gegeben. Schließlich wurde in Gruppe E (6 Mäuse) jeder Maus durch intraperitoneale Injektion eine 100fach niedrigere Dosis antirekombinantes Maus-IL-6 gegeben, als das, welches den Mäusen in Gruppe A gegeben wurde. Bei jeder Gruppe wurden jeder Maus zwei Stunden nach der ersten Injektion durch intraperitoneale Injektion 1,2 x 10&sup8; lebende E. coli (von der ATTC unter der Zugangsnummer 25922 erhalten) in 0,2 bis 0,3 ml Kochsalzlösung gegeben. Die E. coli wurden auf Trypticase-Sojaagarplatten mit 5% Schafsblut kultiviert und durch spektrophotometrische Bestimmung gezählt. Die Wirkungen der verschiedenen experimentellen Vorschriften auf das Überleben der Mäuse wird in Figur 1 gezeigt, wo die Y-Achse den Prozentanteil der überlebenden Mäuse zeigt und die X-Achse die Zeit in Stunden zeigt, nachdem den Mäusen E. coli injiziert wurde. Nur die Mäusegruppen, die eine hohe Dosis anti-IL-6-Antikörper oder anti-rekombinantes Kaninchen-Maus- TNFα-IgG erhielten, zeigten ein Überleben von mehr als 24 Stunden nach der Injektion mit E. coli. Diese beiden Mäusegruppen zeigten selbst 72 Stunden nach der Injektion mit E. coli eine bedeutende Überlebensrate.

Claims

1. Verwendung eines Antagonisten gegen Human-IL-6 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die bei der Behandlung eines septischen Schocks von Nutzen ist.

2. Verwe-ndung nach Anspruch 1, worin der Antagonist gegen Human-IL-6 ein monoklonaler Antikörper, der die biologische Aktivität von Human-IL-6 zu blockieren vermag, ein Fragment eines monoklonalen Antikörpers, der die biologische Aktivität von Human-IL-6 zu blockieren vermag, oder eine bindende Zusammensetzung, die einen variablen Bereich der schweren Kette und einen variablen Bereich der leichten Kette eines monoklonalen Antikörpers enthält, der die biologische Aktivität von Human-IL-6 zu blockieren vermag, ist.

3. Verwendung nach Anspruch 2, worin das Fragment des monoklonalen Antikörpers ein Fab-Fragment ist.

4. Verwendung nach Anspruch 2, worin der monoklonale Antikörper durch ein Human-Human-Hybridom erzeugt wird.

5. Verwendung nach Anspruch 4, worin das Fragment des monoklonalen Antikörpers ein Fab-Fragment ist.

6. Verwendung nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, worin die pharmazeutische Zusammensetzung zur intravenösen Verabreichung in einer Menge des Antagonisten im Bereich von etwa 1 bis 20 mg/kg Körpergewicht des Individuums pro Tag geeignet ist.