GEBIET DER ERFINDUNG
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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Behandeln eines
septischen Schocks durch Verabreichen van Antagonisten gegen
Interleukin-6 (IL-6).
HINTERGRUND
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Schwere Infektionen, insbesondere mit gramnegativen Bakterien,
können tiefgreifende physiologische und metabolische Änderungen
einschließlich Fieber, Bluthochdruck, metabolischer Azidose,
ausgedehnter Organfunktionsstörungen und schließlich den Tod zur
Folge haben. Derartige Veränderungen werden häufig als
septischer Schock bezeichnet. Es ist kürzlich gezeigt worden, daß das
vom Wirt stammende Protein, der Tumor-Nekrose-Faktor (TNF),
viele der schädlichen Wirkungen der gramnegativen Septikämie
hervorruft und daß die passive Immunisierung gegen TNF mit
Antiseren die tödlichen Wirkungen der gramnegativen Bakteriämie
oder Endotoxämie verhüten kann: z.B. Tracey et al., Science, Bd.
234, S. 470 (1986); Beutler et al.; Nature, Bd. 320, S. 584
(1986), und Tracey et al., Nature, Bd. 330, S. 662 (1987). Hohe
Serumspiegel von TNF sind bei mehreren Infektionskrankheiten
einschließlich Meningokokkenmeningitis, Malaria und
Leishmaniasis beobachtet worden und Patienten mit hohen TNF-Spiegeln im
Kreislauf besitzen vermehrt Organfunktionsstörungen zusammen mit
einer höheren Sterblichkeit: z.B. Waage et al., Lancet, S. 355
(1987); Girardin et al., New Engl. J. Med., Bd. 319, S. 397
(1988); Scuderi et al., Läncet, S. 1364 (1988), und Kern et al.,
Am. J. Med., Bd. 87, S. 139 (1989).
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Es ist berichtet worden, daß die Verabreichung von TNF entweder
an Tiere oder menschliche Personen zwei bis sechs Stunden später
zu nachweisbaren IL-6-Serumspiegeln führt: McIntosh et al., J.
Immunol., Bd. 143, S. 162 (1989); Jablons et al., J. Immunol.,
Bd. 142, S. 1542 (1989), und Brouckaert et al., J. Exp. Med.,
Bd. 169, S. 2257 (1989). IL-6, auch als B-Zellen stimulierender
Faktor-2, Interferon-β2 und Hepatozyten stimulierender Faktor
bekannt, ist als ein von T-Zellen stammendes Glykoprotein
erkannt worden, welches eine Reifung der B-Zellen hervorruft, z.B.
Kishimoto, Blood, Bd. 74, S. 1 (1989). Kürzlich ist von IL-6
gezeigt worden, daß es pleotrope biologische Wirkungen
einschließlich einer Induktion von Akute-Phase-Proteinen in
Hepatozyten und Wirkungen auf Blutbildungsvorläuferzellen und T-Zellen
besitzt: z.B. Geiger et al., Eur. J. Immunol., Bd. 18, S. 717
(1988), Marinjovic et al., J. Immunol., Bd. 142, S. 808 (1989),
Morrone et al., J. Biol. Chem., Bd. 263, S. 12554 (1988), und
Perlmutter et al., J. Clin. Invest., Bd. 84, S. 138 (1989).
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Derzeit werden septische Zustände, wie etwa Bakteriämie und
dergleichen, mit antimikrobiellen Verbindungen behandelt. Wenn
derartige Zustände jedoch mit Schock verbunden sind, gibt es in der
Therapie zum Bessern des Schocksyndroms keine wirksamen
begleitenden Maßnahmen: z.B. Young, S. 468-470, in Mandell et al.,
Hrsg., Principles and Practice of Infectious Diseases, 2. Ausg.
(John Wiley & Sons, New York, 1985). Im Hinblick darauf könnte
die Verfügbarkeit von Techniken zum Behandeln eines mit einer
Sepsis verbundenen Schocks einen bedeutenden klinischen Nutzen
besitzen.
KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Verwendung eines
Antagonisten gegen Human-IL-6 zur Herstellung einer
pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verfügung, die bei der Behandlung
eines septischen Schocks von Nutzen ist. Vorzugsweise sind die
Antagonisten gegen IL-6 monoklonale Antikörper oder durch
Standardtechniken davon abgeleitete bindende Zusammensetzungen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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Figur 1 veranschaulicht die Überlebensdaten männlicher BALB/c-
Mäuse, welchen intraperitoneal lebende E. coli injiziert wurden
und die mit verschiedenen monoklonalen Antikörpern behandelt
wurden.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die Erfindung beruht auf dem Befund, daß eine erhöhte Produktion
von IL-6 ein Bindeglied in der Ursachenkette der physiologischen
Ereignisse ist, die bei massiven Mikroorganismeninfektionen wie
etwa Septikämie zu einem Schock führen. Das Verfahren der
Erfindung umfaßt die Verwendung eines Antagonisten gegen Human-IL-6
zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die bei
der Behandlung eines septischen Schocks von Nutzen ist.
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Vorzugsweise stammen die bei der Erfindung verwendeten
Antagonisten von Antikörpern, die für Human-IL-6 spezifisch sind.
Bevorzugter umfassen die bei der Erfindung verwendeten
Antagonisten für IL-6 spezifische Fragmente oder bindende
Zusammensetzungen. Antikörper umfassen eine Zusammensetzung von
Polypeptidketten, welche durch Disulfidbrücken miteinander verknüpft sind.
Zwei Polypeptidhauptketten, welche als die leichte Kette und die
schwere Kette bezeichnet werden, bilden alle
Antikörper-Hauptstrukturklassen (Isotypen). Sowohl die schweren Ketten als auch
die leichten Ketten werden weiter in Unterbereiche aufgeteilt,
die als variable Bereiche und konstante Bereiche bezeichnet
werden. Schwere Ketten umfassen einen einzigen variablen Bereich
und drei verschiedene konstante Bereiche und leichte Ketten
umfassen einen einzigen variablen Bereich (von demjenigen der
schweren Kette verschieden) und einen einzigen konstanten
Bereich (von denjenigen der schweren Kette verschieden). Die
variablen Bereiche der schweren Kette und der leichten Kette
sind für die Bindungsspezifität des Antikörpers verantwortlich.
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Wenn der Ausdruck "variabler Bereich der schweren Kette" hier
verwendet wird, bedeutet er ein Polypeptid, welches (1) 110 bis
125 Aminosäuren lang ist und (2) dessen Aminosäurensequenz
ausgehend von der N-terminalen Aminosäure der schweren Kette
derjenigen einer schweren Kette eines monoklonalen Antikörpers
der Erfindung entspricht. Desgleichen bedeutet der Ausdruck
"variabler
Bereich der leichten Kette" ein Polypeptid, welches (1)
95 bis 115 Aminosäuren lang ist und (2) dessen
Aminosäurensequenz ausgehend von der N-terminalen Aminosäure der leichten
Kette derjenigen einer leichten Kette eines monoklonalen
Antikörpers der Erfindung entspricht.
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Wenn der Ausdruck "monoklonaler Antikörper" hier verwendet wird,
bezieht er sich auf homogene Immunglobulinpopulationen, die zum
spezifischen Binden an Human-IL-6 befähigt sind.
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Wenn der Ausdruck "bindende Zusammensetzung" hier verwendet
wird, bedeutet er eine Zusammensetzung, die zwei
Polypeptidketten umfaßt, die (1), wenn sie funktionell verbunden sind, eine
Konformation mit einer hohen Bindungsaffinität für Human-IL-6
annehmen, und die (2) von einem Hybridom stammen, das auf Human-
IL-6 spezifische monoklonale Antikörper produziert. Der Ausdruck
"funktionell verbunden" ist dazu bestimmt, anzugeben, daß die
beiden Polypeptidketten zum Binden durch eine Vielzahl Mittel zu
einander angeordnet sein können, zum Beispiel ein Verbund in
einem natürlichen Antikörperfragment, wie etwa Fab oder Fv, oder
mittels gentechnisch hergestellter cysteinhaltiger Peptidlinker
an den Carboxyl-Termini. Normalerweise entsprechen die beiden
Polypeptidketten dem variablen Bereich der leichten Kette und
der variablen Region der schweren Kette eines für Human-IL-6
spezifischen monoklonalen Antikörpers. Vorzugsweise stammen die
Antagonisten der Erfindung aus für Human-IL-6 spezifischen
monoklonalen Antikörpern. Zum Blockieren oder Neutralisieren von IL-
6 bef ähigte monoklonale Antikörper werden durch ihre Fähigkeit
zum Hemmen von durch IL-6 hervorgerufenen Wirkungen in Standard-
IL-6-Biotests ausgewählt: wie z.B. bei Sehgal et al., Science,
Bd. 235, S. 731-732 (1987), Billiau, Immunol. Today, Bd. 8, S.
84-87 (1987), und Wong et al., Immunol. Today, Bd. 9, S. 137-139
(1988), beschrieben. Vorzugsweise wird die Hemmung der folgenden
biologischen Aktivitäten zum Screenen auf monoklonale Antikörper
verwendet, die zum Neutralisieren von IL-6 befähigt sind: (i)
antivirale Wirksamkeit, (ii) Verstärkung der
Immunglobulinsekretion und (iii) Stimulation des Wachstums bestimmter EBV-
transformierter Zellinien. Die Hemmung der antiviralen
Wirksamkeit kann in Standardtests der Hemmung der zytopathischen
Wirkung gemessen werden, wie etwa den von Armstrong, Meth.
Enzymol., Bd. 78, S. 381-387 (1981), und Familletti et al., Meth.
Enzymol., Bd. 78, S. 387-399 (1981), beschriebenen, welche beide
durch Verweis inbegriffen sind. Neutralisierende Antikörper
werden auf der Grundlage ihrer Fähigkeit zum Entgegenwirken oder
unwirksam Machen der Hemmung zytopathischer Wirkungen einer
Standardkonzentration von IL-6 ausgewählt. Neutralisierende
Antikörper können auch durch ihre Fähigkeit zum Verhindern des
durch IL-6 stimulierten Wachstums bestimmter
Plasmazytom-Zellinien, wie etwa MOPC-315, ausgewählt werden, z.B. Chiu et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 85, S. 7099-7103 (1988). MOPC-
315 ist von der American Type Culture Collection unter der
Zugangsnummer TIB 23 erhältlich. Ein weiteres Mittel zum
Auswählen neutralisierender Antikörper ist die Hemmung der durch
IL-6 stimulierten Immunglobulinsekretion EBV-transformierter
Zellinien, wie etwa CESS und SKW6.4 (erhältlich von der ATCC
unter den Zugangsnummern TIB 190 beziehungsweise TIB 215), z.B.
Hirano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 82, S. 5490-5494
(1985). Die Antikörpersekretion wird geeigneterweise durch einen
isotopenspezifischen ELISA mittels im Handel erhältlicher
isotopenspezifischer monoklonaler Antikörper gemessen. Zum Beispiel
werden (4-6) x 10³ CESS- oder SKW 6.4-Zellen in 200 ul
Kulturmedium, z.B. RPMI 1640 mit etwa 3-30 pM IL-6 kultiviert. Nach etwa
3 Tagen wird bei den Überständen die IgG-Konzentration (CESS)
oder die IgM-Konzentration (SKW 6.4) bestimmt.
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Hybridome werden durch wohlbekannte Techniken hergestellt.
Üblicherweise umfaßt das Verfahren die Fusion einer immortalisierten
Zellinie mit einem B-Lymphozyten, welcher den gewünschten
Antikörper produziert. Wahlweise sind Nicht-Fusionstechniken zum
Erzeugen immortalisierter, Antikörper produzierender Zellinien
möglich und fallen unter den Umfang der vorliegenden Erfindung,
z.B. eine viral ausgelöste Transformation: Casali et al., "Human
Monoclonals from Antigen-Specific Selection of B Lymphocytes and
Transformation by EBV", Science, Bd. 234, S. 476-479 (1986).
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Immortalisierte Zellinien sind üblicherweise transformierte
Säugerzellen, insbesondere Myelomzellen vom Nagetier, Rind und
menschlichen Ursprungs. Am häufigsten werden Ratten- oder
Mäusemyelomzellinien aus Gründen der Bequemlichkeit und der
Verfügbarkeit eingesetzt. Techniken zum Erhalten der geeigneten
Lymphozyten aus Säugern, denen das Zielantigen injiziert wurde,
sind wohlbekannt. Im allgemeinen werden entweder periphere
Blutlymphozyten (PBLs) verwendet, falls Zellen menschlichen
Ursprungs gewünscht werden, oder Milzzellen oder
Lymphknotenzellen werden verwendet, falls nicht-menschliche Säugerquellen
gewünscht werden. Einem Wirtssäuger werden wiederholte Dosen des
gereinigten Antigens injiziert und dem Säuger wird gestattet,
die gewünschten Antikörper produzierenden Zellen zu erzeugen,
bevor diese zur Fusion mit der immortalisierenden Zellinie
geerntet werden. Techniken zur Fusion sind in der Technik
ebenfalls wohlbekannt und umfassen im allgemeinen das Mischen der
Zellen mit einem Fusionsmittel wie etwa Polyethylenglykol.
Hybridome werden durch Standardverfahren wie etwa HAT-Selektion
ausgewählt. Unter diesen Hybridomen werden diejenigen, welche
den gewünschten Antikörper, d.h. einen auf Human-IL-6
spezifischen, sekretieren, durch Untersuchen ihres Kulturmediums durch
Standardimmuntests, wie etwa Western-Blotting, ELISA, RIA, die
Fähigkeit zum Neutralisieren von IL-6 oder dergleichen
ausgewählt. Antikörper werden aus dem Medium mittels
Proteinstandardreinigungsverfahren gewonnen, z.B. Tijssen, Practise and Theory
of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985). Viele Zitate
sind zur Anleitung beim Anwenden einer der vorstehenden
Techniken verfügbar: z.B. Kohler et al., Hybridoma Techniques (Cold
Spring Harbor Laboratory, New York, 1980); Tijssen, Practice and
Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985);
Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam,
1984); Hurrell, Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and
Applications (CRC Press, Boca Raton, FL, 1982), und dergleichen.
Hybridome, die für Human-IL-6 spezifische monoklonale Antikörper
produzieren, werden anschließend einem zweiten Screening mittels
der vorstehend beschriebenen IL-6-Bestimmungen unterzogen, um
solche auszuwählen, die zum Blockieren oder Neutralisieren der
biologischen Aktivität von IL-6 befähigt sind.
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Die Verwendung und Erzeugung von Fragmenten von Antikörpern ist
ebenfalls gut bekannt, z.B. Fab-Fragmente: Tijssen, Practice and
Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985), und
Fv-Fragmente: Hochman et al., Biochemistry, Vol. 12, S. 1130-
1135 (1973), Sharon et al., Biochemistrv, Bd. 15, S. 1591-1594
(1976), und Ehrlich et al., US-Patent 4 355 023, und Antikörper-
Molekülhälften: Auditore-Hargreaves, US-Patent 4 470 925.
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Hybridome und monoklonale Antikörper werden entweder gegen
glykosylierte oder unglykosylierte Varianten von rekombinant
erzeugtem, reifem humanem IL-6 gebildet. Im allgemeinen werden die
unglykosylierten Varianten von Human-IL-6 in E. coli gebildet
und die glykosylierten Varianten werden in Säugerwirtszellen,
z.B. CV1- oder COS-Affenzellen, Maus-L-Zellen oder dergleichen
gebildet. Rekombinant erzeugtes reifes Human-IL-6 wird durch
Einschleusen eines Expressionsvektors in eine Wirtszelle unter
Verwendung von Standardvorschriften gebildet: z.B. Maniatis et
al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor
Laboratory, New York, 1982); Okayama und Berg, Mol. Cell. Biol.,
Bd. 2, S. 161-170 (1982), und Bd. 3, S. 280-289 (1983), Takebe
et al., Mol. Cell. Biol., Bd. 8, S. 466-472 (1988), US-Patent 4
599 308, US-Patent 4 675 285, Kaufman et al., Mol. Cell. Biol.,
Bd. 2, S. 1304-1319 (1982), oder dergleichen. Wenn erst die
Nukleotidsequenz, welche für ein gewünschtes Protein kodiert,
bekannt oder auf andere Weise verfügbar ist, ist der Aufbau von
Expressionsvektoren aus Bakterien oder Säugern in der Technik
gut bekannt: z.B. offenbart DeBoer im US-Patent 4 551 433
Promotoren zur Verwendung bei bakteriellen Expressionsvektoren;
Goeddel et al. offenbaren im US-Patent 4 601 980 und Riggs im
US-Patent 4 431 739 die Herstellung von Säugerproteinen durch E.
coli-Expressionssysteme und Riggs (vorstehend zitiert), Ferretti
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 83, S. 599-603 (1986),
Sproat et al., Nucleic Acids Research, Bd. 13, S. 2959-2977
(1985) und Mullenbach et al., J. Biol. Chem., Bd. 261, S. 719-
722 (1986) offenbaren, wie synthetische Gene zur Expression in
Bakterien aufgebaut werden. Dementsprechend sind diese Zitate
durch Verweis inbegriffen. Die Aminosäuresequenz von reifem
Human-IL-6 wird von Hirano et al., Nature, Bd. 324, S. 73-76
(1986) und Zilberstein et al., EMBO J., Bd. 5, Seiten 2529-2537
(1986) offenbart; für Human-IL-6 kodierende synthetische Gene
sind im Handel von Beckman Instruments (Fullerton, CA)
erhältlich und gereinigtes Human-IL-6 ist im Handel von Genzyme Corp.
(Boston, MA) erhältlich. Viele bakterielle Expressionsvektoren
und Wirte sind im Handel und durch die ATCC erhältlich.
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Für Hybridome kennzeichnende Antikörper und Antikörperfragmente
können auch durch rekombinante Mittel durch Extrahieren von
Messenger-RNA, Aufbauen einer cDNA-Bank und Auswählen von
Klonen, die für Segmente des Antikörpermoleküls kodieren,
hergestellt werden: z.B. Wall et al., Nucleic Acids Research, Bd. 5,
S. 3113-3128 (1978), Zakut et al., Nucleic Acids Research, Bd.
8, S. 3591-3601 (1980), Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, Bd. 81, S. 3273-3277 (1984), Boss et al., Nucleic Acids
Research, Bd. 12, S. 3791-3806 (1984), Amster et al., Nucleic
Acids Research, Bd. 8, S. 2055-2065 (1980), Moore et al., US-
Patent 4 642 334, und Skerra et al., Science, Bd. 240, S. 1038-
1041 (1988). Insbesondere können solche Techniken zum Erzeugen
interspezifischer monoklonaler Antikörper verwendet werden, bei
welchen der bindende Bereich einer Art mit dem nicht-bindenden
Bereich des Antikörpers einer anderen Art zum Verringern der
Immunogenität kombiniert wird, z.B. Liu et al., Proc. Natl.
Acad. Sci., Bd. 84, S. 3439-3443 (1987).
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Bei der Erfindung verwendete Antagonisten werden als
pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht. Derartige Zusammensetzungen
enthalten eine therapeutische Menge eines derartigen
Antagonisten, z.B. wenigstens einen der monoklonalen Antikörper oder
Fragmente desselben, in einem pharmazeutischen Träger. Ein
pharmazeutischer Träger kann jede verträgliche, nicht-toxische
Substanz sein, die zur Abgabe der Zusammensetzungen der
Erfindung an einen Patienten geeignet sind. Steriles Wasser, Alkohol,
Fette, Wachse und inerte Feststoffe können in einem Träger
enthalten sein. Pharmazeutisch annehmbare Zusatzstoffe (Puffer,
Dispergiermittel) können ebenfalls in die pharmazeutische
Zusammensetzung eingearbeitet sein. Im allgemeinen sind zur
parenteralen Verabreichung derartiger Wirkstoffe brauchbare
Zusammensetzungen gut bekannt, z.B. Remington's Pharmaceutical Science,
15. Ausg. (Mack Publishing Company, Easton, PA, 1980). Wahlweise
können Zusammensetzungen der Erfindung durch ein implantierbares
oder injizierbares Wirkstoffzuführungssystem in den Körper eines
Patienten eingeführt werden: z.B. Urquhart et al., Ann. Rev.
Pharmacol. Toxicol., Bd. 24, S. 199-236 (1984), Lewis, Hrsg.,
Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals (Plenum
Press, New York, 1981), US-Patent 3 773 919, US-Patent 3 270 960
und dergleichen.
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Bei der Erfindung verwendete, von Antikörpern stammende
Antagonisten werden normalerweise parenteral, vorzugsweise intravenös
verabfolgt. Da derartige Protein- oder Peptidantagonisten
immunogen sein können, werden sie vorzugsweise langsam, entweder
durch eine herkömmliche Anordnung zur i.v.-Verabfolgung oder aus
einem subkutanen Depot verabfolgt, wie z.B. von Tomasi et al.,
US-Patent 4 732 863, gelehrt. Wenn die Antikörper oder Fragmente
parenteral verabfolgt werden, werden sie in Form einer
injizierbaren Einzeldosis (z.B. Lösung, Suspension oder Emulsion)
zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren, parenteralen Träger
formuliert. Derartige Träger sind selbst nicht-toxisch und
nicht-therapeutisch. Beispiele derartiger Träger sind normale
Kochsalzlösung, Ringersche Lösung, Dextroselösung und Hanksche
Lösung. Nichtwäßrige Träger, wie etwa pflanzliche Öle und
Ölsäureethylester können ebenfälls verwendet werden. Ein bevorzugter
Träger ist 5% Dextrose/Kochsalzlösung. Der Träger kann
untergeordnete Menge von Zusatzstoffen enthalten, wie etwa Substanzen,
welche die Isotonie und chemische Stabilität erhöhen, z.B.
Puffer und Konservierungsmittel. Der Antikörper wird
vorzugsweise in gereinigter Form, die im wesentlichen frei von
Aggregaten, anderen Proteinen, Endotoxinen und dergleichen ist, in
Konzentrationen von etwa 5 bis 30 mg/ml, vorzugsweise 10 bis 20
mg/ml, formuliert. Vorzugsweise sind die Endotoxingehalte
geringer
als 2,5 IU/ml.
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Das Auswählen einer Verabreichungsvorschrift für einen
Antagonisten hängt von mehreren Faktoren ab, einschließlich der
Serumumwandlungsrate des Antagonisten, des Serumspiegels des mit der
Septikämie verbundenen IL-6, der Immunogenität des Antagonisten,
der Zugänglichkeit des Ziel-IL-6 (z.B. wenn nicht-serales IL-6
blockiert werden soll), der Affinität des IL-6 zu seinem
(seinen) Rezeptor(en) bezogen auf diejenige von IL-6 gegenüber dem
Antagonisten und dergleichen. Vorzugsweise bringt die
Verabreichungsvorschrift die Menge Antagonist, welche dem Patienten
verbunden mit einem annehmbaren Maß Nebenwirkungen zugeführt wird,
auf ein Höchstmaß. Dementsprechend hängt die Menge an
zugeführtem Antagonisten teilweise von dem jeweiligen Antagonisten und
der Schwere des behandelnden Zustandes ab. Eine Anleitung zum
Auswählen geeigneter Dosen wird in der Literatur über
therapeutische Anwendungen von Antikörpern gefunden: z.B. Bach et al.,
Kapitel 22 in Ferrone et al., Hrsg., Handbook of Monoclonal
Antibodies (Noges Publications, Park Ridge, NJ, 1985) und
Russell, S. 303-357, und Smith et al., S. 365-389, bei Haber et
al., Hrsg., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy (Raven
Press, New York, 1977). Wann immer der Antagonist monoklonale
Antikörper oder Fragmente davon in Fab-Größe (einschließlich
bindender Zusammensetzungen) umfaßt, liegt die Dosis
vorzugsweise im Bereich von etwa 1-20 mg/kg je Tag. Bevorzugter liegt
die Dosis im Bereich von etwa 1-10 mg/kg je Tag.
BEISPIELE
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Die folgenden Beispiele dienen zum Veranschaulichen von Aspekten
der vorliegenden Erfindung. Die ausgewählten Vektoren, Wirte,
Fusionspartner, Reagenzienkonzentration, Temperaturen und die
Werte anderer Variablen dienen nur als Beispiel für die
Erfindung und sollten nicht als deren Begrenzungen angesehen werden.
Beispiel I. Herstellung eines IL-6 neutralisierenden
monoklonalen Antikörpers
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Eine männliche Lewis-Ratte wurde mit halbgereinigten
Zubereitungen von in COS7-Zellen exprimiertem Maus-IL-6 (dieses
Expressionssystem wird von Lee et al., Annals N. Y. Acad. Sci., Bd.
557, S. 215-229 (1989), und von Chui et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, Bd. 85, 7099-7103 (1988) beschrieben) immunisiert. Die
Ratte wurde zuerst mit ungefähr 50 ug Maus-IL-6 in Freundschem
vollständigem Adjuvans immunisiert und anschließend wurde zwei
Mal mit derselben Materialmenge in Freundschem unvollständigem
Adjuvans verstärkt. Es wurde Testblut entnommen. Dem Tier wurde
eine Schlußverstärkung von 25 ug in phosphatgepufferter
Kochsalzlösung gegeben und vier Tage später wurde die Milz zur
Fusion erhalten.
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Ungefähr 3 x 10&sup8; Ratten-Splenozyten wurden mit der gleichen Zahl
P3X63-AG8 . 653-Maus-Myelomzellen (erhältlich von der ATTC unter
der Zugangsnummer CRL 1580) fusioniert. 3480
Mikrotiterplattennäpfchen wurden mit 5,7 x 10&sup4; Eltern-Myelomzellen je Näpfchen
beimpft. Die Hälfte dieser Näpfchen wurde anfänglich mit
ungefähr 22 Einheiten/Näpfchen rekombinantem Human-IL-6 kultiviert.
Wie bei Chiu et al. beschrieben (vorstehend zitiert), sind die
Einheiten in Bezug auf dar Wachstum der Zellinie NFS-60 als
Antwort auf das Human-IL-6 definiert. Weitere 576 Näpfchen
wurden mit 1,9 x 10&sup5; Eltern je Näpfchen beimpft.
Standardvorschriften zur Fusion und dem darauffolgenden Kultivieren von
Hybriden, welche im wesentlichen dieselben wie die von Chretien
et al., J. Immunol. Meth., Bd. 117, S. 67-81 (1989),
beschriebenen waren, wurde gefolgt. Zwölf Tage nach der Fusion wurden die
Überstände geerntet und (1) durch indirekten ELISA auf PVC-
Platten, die mit durch COS7 hergestelltem Maus-IL-6 beschichtet
waren, und (2) durch ihre Fähigkeit, das Wachstum von NFS-60-
Zellen, welche von IL-6 abhängig sind, zu hemmen, gescreent. Die
vorstehende Screeningvorschrift wurde wegen der IL-6
zugeschriebenen Hybridom-Wachstumsfaktoraktivität verwendet. Es wurde
daraus gefolgert, anfänglich durch diese Hybridome hergestellte
neutralisierende anti-IL-6-Antikörper könnten ihr Wachstum durch
Abreichern des IL-6 in dem Kulturmedium verhindern. So wurden
einige Näpfchen mit Human-IL-6 (hIL-6) beimpft, welches bei
Mauszellen aktiv ist. Wie nachstehend in der Tabelle gezeigt,
wurde in jedem Fall etwa derselbe Anteil neutralisierender
Antikörper erzeugt.
TABELLE 1
Anfangsimpfbedingung
Zahl der Näpfchen, die neutralisierendes anti-IL-6 enthalten
Zahl der beimpften Näpfchen
Prozent beimpfte Näpfchen mit neutralisierendes den Mabs
kein hIL-6;
5,7x10&sup4; Zellen/Näpfchen
22 E/Näpfchen hIL-6;
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Monoklonale Antikörper aus einem MP5-20F3 bezeichneten Hybridom
wurden in den Experimenten von Beispiel II verwendet.
Beispiel II. Prophylaktische Wirkung von neutralisierendem
anti-IL-6-Mab auf Mäuse, denen eine lethale Dosis
E. coli injiziert wurde
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Männliche BALB/c-Mäuse (19-21 g) wurden in zufälliger Weise fünf
verschiedenen Behandlungsgruppen A - E zugeordnet und die
Gruppen einschließende Experimente wurden an fünf verschiedenen
Tagen angesetzt. In Gruppe A (30 Mäuse) wurden jeder Maus durch
intraperitoneale Injektion 0,75 bis 1,00 mg monoklonaler
Antikörper (Mab) gegen rekombinantes Maus-IL-6 (anti-rekombinanter
Maus-IL-6 monoklonaler Antikörper) gegeben. In Gruppe B (30
Mäuse) wurden jeder Maus durch intraperitoneale Injektion 0,1
bis 1,0 mg anti-rekombinantes Kaninchen-Maus-TNFα IgG gegeben.
In Gruppe C (30 Mäuse) wurden jeder Maus durch intraperitoneale
Injektion 0,5 bis 1,0 mg Isotyp-Kontroll-Mab GL113 gegeben. In
Gruppe D (5 Mäuse) wurde jeder Maus durch intraperitoneale
Injektion ein Isotyp-Kontroll-Mab mit einem zweifach höheren
Endotoxingehalt als derjenige des Anti-IL-6-Mab gegeben.
Schließlich wurde in Gruppe E (6 Mäuse) jeder Maus durch
intraperitoneale Injektion eine 100fach niedrigere Dosis
antirekombinantes Maus-IL-6 gegeben, als das, welches den Mäusen in
Gruppe A gegeben wurde. Bei jeder Gruppe wurden jeder Maus zwei
Stunden nach der ersten Injektion durch intraperitoneale
Injektion 1,2 x 10&sup8; lebende E. coli (von der ATTC unter der
Zugangsnummer 25922 erhalten) in 0,2 bis 0,3 ml Kochsalzlösung gegeben.
Die E. coli wurden auf Trypticase-Sojaagarplatten mit 5%
Schafsblut kultiviert und durch spektrophotometrische Bestimmung
gezählt. Die Wirkungen der verschiedenen experimentellen
Vorschriften auf das Überleben der Mäuse wird in Figur 1 gezeigt,
wo die Y-Achse den Prozentanteil der überlebenden Mäuse zeigt
und die X-Achse die Zeit in Stunden zeigt, nachdem den Mäusen E.
coli injiziert wurde. Nur die Mäusegruppen, die eine hohe Dosis
anti-IL-6-Antikörper oder anti-rekombinantes Kaninchen-Maus-
TNFα-IgG erhielten, zeigten ein Überleben von mehr als 24
Stunden nach der Injektion mit E. coli. Diese beiden Mäusegruppen
zeigten selbst 72 Stunden nach der Injektion mit E. coli eine
bedeutende Überlebensrate.