DE69016079T2 - Methode zur Extraktion, Amplifikation und zum Nachweis einer Nukleinsäure aus einer Fraktion mononuklearer Zellen von peripherem Blut. - Google Patents

Methode zur Extraktion, Amplifikation und zum Nachweis einer Nukleinsäure aus einer Fraktion mononuklearer Zellen von peripherem Blut.

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum raschen Extrahieren einer Nukleinsäure, wie DNA, aus Vollblut oder aus der mononuklearen Zellfraktion von peripherein Blut. Sie betrifft auch ein Verfahren zur Amplifikation oder zum Nachweis der extrahierten Nukleinsäure für diagnostische Zwecke.
  • Auf dem Gebiet der biologischen Diagnostik machen Forschung und analytische Verfahren die Untersuchung von Nukleinsäuren aus biologischen Proben, wie Vollblut oder Fraktionen davon, erforderlich. Derartige in vitro-Verfahren erfordern als einen ersten Schritt die Isolierung der Nucleinsäuren. Beispielsweise sind relativ reine Proben von genomischer DNA erforderlich, um Tests für genetische Erkrankungen durchzuführen, und die rekombinante Technologie erfordert die Isolierung sowohl der Vektor-DNA als auch der zu klonierenden DNA. Beim Nachweis infektiöser Agentien, wie Bakterien und viral infizierte Zellen, machen diagnostische DNA-Verfahren im allgemeinen eine Zell-Lyse erforderlich, wobei anschließend die freigesetzte DNA nachgewiesen wird.
  • Im allgemeinen liegt die DNA in einer Zelle nicht als ein freies Molekül vor, sondern liegt stattdessen als eine komplexe Assoziation von DNA, RNA und Proteinen vor. Dies ist eine Folge der Rolle der DNA als dem Träger der genetischen Information und ihrer Beziehung zur RNA und verschiedenen Proteinen in dieser Funktion.
  • Aufgrund dieser komplexen Assoziation von DNA mit anderen Substanzen in einer Probe ist es für eine wirksame DNA- Extraktion erforderlich, daß die DNA durch aufgebrochene Zellwände und -membranen freigesetzt wird, DNA-Protein- Komplexe durch Denaturierung oder Proteolyse dissoziiert werden und die DNA von anderen Makromolekülen abgetrennt wird. In der Technik sind verschiedene Mittel verwendet worden, um eines oder mehrere dieser Ergebnisse zu erreichen. Zell-Lyse kann beispielsweise durch Einfrieren und Auftauen, Ultraschallvorrichtungen, Scheren und andere mechanische Techniken oder durch Behandeln mit Enzymen, Surfactantien oder chelatbildenden Mitteln erreicht werden. Proteasen und andere hydrolysierende Agentien können verwendet werden, um die DNA von Proteinen zu dissoziieren. Zurückbleibende Proteine und andere Makromoleküle können unter Verwendung verschiedener Lösungsmittel wie Phenol oder anderer Alkohole extrahiert werden.
  • Einige DNA-Isolierungstechniken sind beispielsweise in der EP-A-0 145 356, EP-A-0 240 191 und EP-A-0 245 945 beschrieben, wobei in jeder ein Alkohol und ein enzymatisches Proteinzersetzungsmittel in bestimmten Schrittfolgen verwendet wird. Im allgemeinen sind diese Verfahren auf die Extraktion von viraler DNA ausgerichtet und umfassen eine Reihe von komplizierten Schritten, die mit Präzision ausgeführt werden müssen, um die gesamte verfügbare DNA zu erhalten. Daher sind viele der bekannten Verfahren arbeitsintensiv, erfordern die Verwendung von unerwünschten Lösungsmitteln und können nicht ohne weiteres automatisiert werden.
  • Die Isolierung oder Extraktion der interessierenden Nukleinsäure ist notwendig, um die Vorteile der jüngsten Entwicklungen zur Amplifikation und zum Nachweis von Nukleinsäuren unter Verwendung von Polymerase- Kettenreaktionen zu nutzen. In der US-A-4,683,195 und US- A-4,683,202 sind brauchbare Verfahren zur Amplifikation und zum Nachweis für Nukleinsäuren beschrieben, die in verschiedenen biologischen Proben gefunden werden, wobei eine Polymerase verwendet wird. Standardtechniken der Nukleinsäureextraktionen sind bei Maniatis et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1982), Seiten 280 - 281 angeführt. Diese Literaturstelle betrifft ein Standardextraktionsverfahren, bei dem eine Protease zum Lysieren von Zellen und Phenol/Chloroform zur Extraktion verwendet wird, wobei die Durchführung des gesamten Verfahrens im allgemeinen viele Stunden in Anspruch nimmt und gefährliche organische Lösungsmittel verwendet werden. Es wird auch zum Extrahieren von DNA verwendet: aus Eierstockzellen von Hamstern von Nunberg et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75(11), Seiten 5553 - 5556 (1978), aus dem Gerinnungshäutchen von Vollblutproben von Saiki et al, Bio/Technology, 3, Seiten 1008 - 1012 (1985), und aus Vollblut von Bell et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78(9), S. 5759 - 5763 (1981).
  • Damit diagnostische Tests kommerziell durchführbar sind, müssen sie auch ökonomisch wettbewerbsfähig sein. D. h., daß jeder Aspekt des Verfahrens einfach, leicht anzuwenden und zu einem gewissen Grad automatisierbar sein muß. Die Extraktion der DNA aus einer Probe ist ein Aspekt, bei dem eine sorgfältige Durchführung erforderlich ist, um maximale Mengen an DNA aus der Probe sowie ökonomische Vorteile zu erhalten. Darüber hinaus muß in Situationen, in denen ein rasches diagnostisches Ergebnis notwendig ist, das Extraktionsverfahren schnell sein.
  • Es sind daher beachtliche Anstrengungen unternommen worden, um verbesserte Verfahren zur DNA-Extraktion zu entwickeln, bei denen die zuvor genannten mühsamen und zeitaufwendigen Schritte und die Verwendung organischer Lösungsmittel vermieden werden. So beschreiben Kogan et al, N.Eng.J.Med., 317(16), S. 985 - 990 (1987) die Extraktion von DNA, um genetische Störungen nachzuweisen, indem Zellen gekocht werden, die durch Zentrifugieren aus Vollblut entfernt worden sind. Die extrahierte DNA wird dann einer Amplifikation unterzogen.
  • In ähnlicher Weise beschreiben Saiki et al, Nature, 324, S. 163- 166 (1986) das Kochen von gepufferten Gerinnungshäutchen (die mononukleare Zellen von peripherem Blut und Granulozyten miteinschließen) von Vollblut, um β-Globin- DNA zu amplifizieren. Eine ähnliche Arbeit ist in der EP-A-O 237 362 zum Nachweis von Sichelzellen und HLA-DNA dargestellt. In einigen Fällen werden die Zellen der Gerinnungshäutchen vor dem Erwärmungsschritt mit Mineralöl überschichtet.
  • Obwohl bei diesen Verfahren die zuvor beschriebene mühsame Phenol/Chloroform-Extraktion vermieden wird und sie rasch zu sein scheinen (in wenigen Minuten durchgeführt), sind sie hauptsächlich lediglich zur Extraktion von DNA brauchbar, die in großen Mengen in einer Vollblutprobe vorliegt, wie HLA- oder β-Globin-DNA. Wenn die gewünschte DNA in sehr geringen Mengen vorliegt, wie dies bei vielen infektiösen Agentien (wie Viren) der Fall ist, sind weitere Verbesserungen der Extraktion aus Vollblut oder einer Gerinnungshäutchen-Fraktion für einen empfindlichen Nachweis notwendig. Darüber hinaus gibt es viele die Polymeraseaktivität störende Substanzen, die ebenfalls vor der Amplifikation aus dem Vollblut entfernt werden müssen.
  • Eine noch neuere Verbesserung des Stands der Technik umfaßt die Verwendung einer Zusammensetzung, die ein nicht-ionisches lysierendes Detergens und ein proteolytisches Enzym enthält. Einer der Hauptvorteile dieses Verfahrens ist die Verkürzung der Dauer der DNA- Extraktion auf weniger als zwei Stunden.
  • Obwohl diese Verbesserung von der Fachwelt begrüßt wird, ist es weiterhin ein Bedürfnis, DNA-Extraktionsverfahren noch weiter zu vereinfachen, insbesondere, wenn die DNA in der Probe in sehr geringen Konzentrationen vorliegt. Insbesondere besteht ein Bedürfnis für ein rasches und wirksames Verfahren zum Extrahieren von HIV-I-DNA aus Vollblut oder aus einer mononuklearen Fraktion von peripherem Blut.
  • Die Probleme der bekannten Verfahren zur Extraktion von DNA werden mit einem Verfahren zur raschen Extraktion einer Nukleinsäure aus einer wäßrigen Probe von mononuklearen Zellen von peripheren Blut überwunden, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß es alleine die Schritte aufweist:
  • A. Einwirkenlassen von Wärme bei oder nahe dem Siedepunkt von Wasser auf eine wäßrige Probe von mononuklearen Zellen von peripherem Blut, von denen angenommen wird, daß sie eine Nukleinsäure eines infektiösen Agens oder eines menschlichen Genoms enthalten, 2 - 15 Minuten lang, um die Zellen in der Probe zu lysieren und die Nukleinsäure aus den Zellen freizusetzen, und
  • B. Gewinnung der Nukleinsäure aus der erhitzten Probe.
  • Darüber hinaus umfaßt ein Verfahren zur Amplifikation einer vorbestimmten Nukleinsäure unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion:
  • A. Extrahieren einer Nukleinsäure aus einem infektiösen Agens oder einem menschlichen Genom in einer wäßrigen Probe von mononuklearen Zellen peripheren Blutes und
  • B. Amplifizieren der extrahierten Nukleinsäure unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion,
  • wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß das Extraktionsverfahren alleine aus den Schritten besteht:
  • 1. Einwirkenlassen von Wärme bei oder nahe dem Siedepunkt von Wasser auf eine wäßrige Probe von mononuklearen Zellen von peripherem Blut, 2 - 15 Minuten lang, um die Zellen in der Probe zu lysieren und die Nukleinsäure aus den Zellen freizusetzen, und
  • 2. Gewinnung der Nukleinsäure aus der erhitzten Probe.
  • Ein Verfahren zum Nachweis einer Nukleinsäure, die zwei komplementäre Stränge aufweist, umfaßt:
  • A Ein Extraktionsverfahren, bestehend allein aus den Stufen:
  • 1. Einwirkenlassen von Wärme bei oder nahe dem Siedepunkt von Wasser auf eine wäßrige Probe von mononuklearen Zellen von peripherem Blut, von denen angenommen wird, daß sie eine Nukleinsäure von einem infektiösen Agens oder einem menschlichen Genom enthalten, 2 - 15 Minuten lang, um die Zellen in der Probe zu lysieren, und die Nukleinsäure aus den Zellen freizusetzen, und um die Nukleinsäure zu denaturieren, und
  • 2. der Gewinnung der denaturierten Nukleinsäure aus der erhitzten Probe,
  • B. In Kontakt-bringen der gewonnenen denaturierten Nukleinsäure mit ersten und zweiten Primern, die komplementär gegenüber den getrennten Strängen der Nukleinsäure sind, unter Bildung von hybridisierten Produkten der Primer und der komplementären Stränge,
  • C. Bildung von ersten und zweiten Extensionsprodukten der Primer in den hybridisierten Produkten, wobei die Extensionsprodukte, wenn sie von ihren Komplementen getrennt sind, als Matrizen für die Synthese von Extensionsprodukten der Primer wirken können,
  • D. Trennung der Primer-Extensionsprodukte von den Matrizensträngen, auf denen sie synthetisiert wurden,
  • E. In Kontakt-bringen der getrennten Extensionsprodukte und der vorbestimmten Nukleinsäure mit zusätzlichen ersten und zweiten Primern, wobei die Nukleinsäure durch Bildung von komplementären Produkten amplifiziert wird,
  • F. Trennung der Primerextensionsprodukte von den komplementären Produkten, die in Stufe E erzeugt wurden, und
  • G. Bestimmung der amplifizierten Nukleinsäure als Nachweis des Vorliegens der Nukleinsäure in der wäßrigen Probe.
  • Das erfindungsgemäße Extraktionsverfahren bewirkt eine rasche und effektive Extraktion von DNA aus der mononuklearen Zellfraktion von peripherem Blut (PBMC- Fraktion), die aus Vollblut erhalten wird. Dieses Verfahren kann in wenigen Minuten durchgeführt werden und es werden die mühsamen, komplizierten und teuren Verfahren vermieden, die aus dem Stand der Technik bekannt sind. Daruber hinaus werden unerwünschte organische Solventien vermieden und das Verfahren kann automatisiert werden, beispielsweise in einem beliebigen, geeigneten Sicherheitsgefäß. Die Verwendung teurer Lyseenzyme, wie Proteinase K, wird also vermieden. Es ist ebenfalls offensichtlich, daß es durch die Durchführung dieser Erfindung ermöglicht wird, eine Nukleinsäure zu erhalten, selbst wenn sie in sehr kleinen Mengen vorliegt, wie dies bei infektiösen Erkrankungen wie AIDS oder anderen viralen Infektionen wahrscheinlich ist.
  • Diese Vorteile werden alleine dadurch erreicht, daß man die PBMC-Fraktionen bei oder nahe am Siedepunkt von Wasser mindestens 2 Minuten lang und im allgemeinen bis zu 15 Minuten lang erhitzt. Dieser einfache Schritt ermöglicht das gewünschte Ergebnis, nämlich die Extraktion der DNA aus dem Zellmaterial, in dem sie aller Wahrscheinlichkeit nach enthalten ist, löst DNA-Protein-Komplexe auf und kann auch die komplementären Stränge von DNA für eine spätere Amplifikation oder Bestimmung denaturieren. Die extrahierte DNA kann aus den Proben unter Verwendung geeigneter Techniken abgetrennt werden. Hämoglobin (ein potentieller Störfaktor bei der Amplifikation) und andere Vollblutkomponenten, die mit Amplifikationsreagentien inkompatibel sind, werden bei diesem Verfahren vermieden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Extraktion, die Amplifikation oder die Bestimmung von einer oder mehreren vorbestimmten (d. h. anvisierten bzw. gewünschten) Nukleinsäuren der mononuklearen Zellfraktion von peripherem Blut (PBMC). Obwohl das primäre Ziel der Erfindung die Diagnose ist, kann extrahierte DNA in verschiedenen Untersuchungen und medizinischen Studien verwendet werden, zum Klonieren von DNA oder Messenger-RNA oder zum Sequenzieren genomischer DNA. Andere Verwendungen für extrahierte DNA sind dem Fachmann ohne weiteres ersichtlich.
  • DNA kann aus menschlichem oder aus tierischem Blut extrahiert werden und kann genomische DNA sein oder DNA, die durch infektiöse Agentien wie Bakterien, Viren oder Hefen in Zellen oder Körperflüssigkeiten gebildet werden. Wenn die behandelte Probe Vollblut ist, ist die extrahierte Nukleinsäure normalerweise genomische DNA. Diese Erfindung ist jedoch insbesondere zum Extrahieren und Bestimmen von DNA aus Zellen geeignet, in die infektiöse Agentien eingedrungen sind (meistens Viren wie Herpes, Cytomegalovirus, Epstein-Barr-Virus, Hepatitis, Rubella und Retroviren wie HIV-I, HIV-II und HTLV-I). Erfindungsgemäß werden vorzugsweise die DNA von Cytomegalovirus, virale Epstein-Barr-DNA und virale HIV-I-DNA extrahiert und nachgewiesen, wobei die Extraktion und der Nachweis von viraler HIV-I-DNA am meisten bevorzugt ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die extrahierte Nukleinsäure amplifiziert oder nachgewiesen, wobei die Polymerasekettenreaktion verwendet wird (im folgenden ausführlicher beschrieben).
  • Die mononukleare Zellfraktion von peripheren Blutzellen (PBMC) wird durch Zentrifugieren auf ein Ficoll- Paque -Kissen aus Vollblut erhalten, wobei Standardverfahren angewendet werden. Es wird angenommen, daß sie aus Monozyten und Lymphozyten zusammengesetzt ist.
  • Beim Arbeiten mit PBMC liegt der kritische Schritt im erfindungsgemäßen Extraktionsverfahren im Einwirkenlassen von Wärme bei oder nahe dem Siedepunkt von Wasser auf eine wäßrige Probe der Zellen für eine Zeit, die ausreicht, um die Proteine abzubauen und sämtliche Zellen in der Probe zu lysieren. Die Probe kann einen Puffer als das Medium enthalten, aber in einigen Fällen ist das Medium lediglich Wasser. Die Temperatur für diesen Schritt variiert je nach Atmosphärendruck, Kochzeit und anderen umgebungsbedingten Faktoren. Im allgemeinen liegt die Temperatur in Höhe des Meeresspiegels bei oder nahe 100 ºC, kann jedoch 80 ºC niedrig und 120 ºC hoch sein.
  • Die Zeit, die die Probe bei der zuvor angegebenen Temperatur gehalten wird, ist diejenige, die zum Denaturieren der Proteine und zum Lysieren der Zellen in der Probe, um die DNA freizusetzen, benötigt wird. Diese kann ohne weiteres dadurch bestimmt werden, daß Teile der Probe während des Erwärmungsschritts entnommen werden und bestimmt wird, ob noch ganze Proteine vorliegen. Die Zeit variiert ebenfalls mit der angewendeten Temperatur, d. h. je niedriger die Temperatur, desto länger der Erwärmungszeitraum. Im allgemeinen wird die Probe bei der gewünschten Temperatur mindestens zwei Minuten lang und bis zu 15 Minuten lang erhitzt, und vorzugsweise 4 - 12 Minuten, wobei 10 Minuten optimal sind.
  • PBMC werden vorzugsweise bei einer Temperatur von 80 - 120 ºC erhitzt. Es ist besonders bevorzugt, das Erhitzen 4 - 12 Minuten lang bei einer Temperatur von 95 - 120 ºC durchzuführen.
  • Das Erhitzen kann in jedem beliebigen, geeigneten Gefäß durchgeführt werden, das eine ausreichende Größe aufweist, um die Probe aufzunehmen und die dem Erwärmungsprozeß standhalten kann. Es kann beispielsweise in Kolben, Teströhrchen, Zentrifugenröhrchen, Kapillarröhrchen, Bechergläsern, Cuvetten und anderer Laborstandardausrüstung durchgeführt werden. Vorzugsweise wird es in einem in sich absgeschlossenen Reaktionsgefäß durchgeführt, das für verschiedene Verfahren einschließlich Erhitzen und chemische Reaktionen ausgestaltet ist. Aus dem Stand der Technik sind viele solcher Gefäße bekannt.
  • Nach dem Erhitzen, um das PBMC in der Probe zu lysieren, wird die freigesetzte Nukleinsäure (im allgemeinen DNA) auf geeignete Weise gewonnen. Zellmaterial und andere koagulierte Trümmer werden auf beliebige geeignete Weise aus der Flüssigkeit, die lösliche DNA-Moleküle enthält, abgetrennt, einschließlich Filtration, Zentrifugation, Dekantieren oder Absaugen. Das Filtrieren kann unter Verwendung einer Filtrierstandardausrüstung oder verschiedener Vorrichtungen mit Filtrationsmembranen durchgeführt werden. Besonders brauchbare Abtrennvorrichtugen sind mikroporöse Filtermembranen wie die Polyamidmembranen Loprodyne - oder Biodyne -Membranen Sie können unbeschichtet oder mit Sufactantien oder anderen Materialien, die die analytischen Verfahren erleichtern, vorbeschichtet verwendet werden.
  • Die Membranen können mit geeigneten Behältern als ein separates Substrat zum Durchführen anderer Testschritte verwendet werden. Vorzugsweise sind sie jedoch als ein Teil einer Testvorrichtung angebracht. Aus dem Stand der Technik sind verschiedene Testvorrichtungen bekannt, einschließlich der in der US-A-3,825,410, der US- A-3,888,629, der US-A-3,970,429 und der US-A-4,446,232 beschriebenen bekannt. Besonders brauchbare Vorrichtungen sind in der EP-A-0 308 231 beschrieben.
  • Der hier bezüglich Primer, Sonden oder Nukleinsäurefragmenten, die nachzuweisen sind, verwendete Begriff "Oligonukleotide" bezeichnet ein Molekül, das zwei oder mehr Desoxyribonukleotide oder Ribonukleotide, und vorzugsweise mehr als drei, umfaßt. Die exakte Größe ist nicht kritisch, hängt jedoch von vielen Faktoren ab, einschließlich der letztendlichen Verwendung oder Funktion der Oligonukleotide. Das Oligonukleotid kann synthetisch oder durch Klonen erhalten werden.
  • Der Begriff "Primer" bezeichnet ein Oligonukleotid, gleichgültig ob natürlich vorkommend oder synthetisch erzeugt, das in der Lage ist, als ein Initiationspunkt für die Synthese zu wirken, wenn er unter Bedingungen angebracht wird, bei denen die Synthese eines Primer- Extensionsprodukts, das zu einem Nukleinsäurestrang komplementär ist, induziert wird.
  • Derartige Bedingungen schließen das Vorliegen von Nukleotiden (beispielsweise der vier Standard-Desoxyribonukleoidtriphosphate) und eines Agens zur Polymerisation, wie beispielsweise eine DNA-Polymerase, und eine geeignete Temperatur und pH, mit ein.
  • Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung sind Primer, Sonden und Fragmente im wesentlichen komplementär zu einer spezifischen Nukleinsäuresequenz der aus Vollblut oder einer PBMC-Fraktion extrahierten gewünschten Nukleinsäure. Mit "im wesentlichen komplementär" ist gemeint, daß eine ausreichende Anzahl von Basen auf komplementären Materialien vorliegen, die paaren, so daß eine Hybridisierung stattfindet. Dies bedeutet jedoch nicht, daß jedes Basenpaar sich paaren wird.
  • Bei den erfindungsgemäßen Amplifikations- und Nachweisverfahren können brauchbare Primer aus einer Reihe von Quellen erhalten werden oder unter Verwendung bekannter Techniken und Ausstattungen hergestellt werden, einschließlich beispielsweise einem ABI-DNA-Synthesizers (erhältlich von Applied Biosystems) oder einem Biosearch 8600 Series oder 8800 Series Synthesizer (erhältlich von Milligen-Biosearch, Inc.) und bekannte Verfahren zu ihrer Verwendung. Natürlich vorkommende, aus biologischen Quellen isolierte Primer sind ebenfalls brauchbar (wie beispielsweise Restriktionsendonuklease-Verdauungen).
  • In einigen Ausführungsformen ist zumindest einer der Primer (oder Sätze davon), die in dem Nachweisverfahren verwendet werden, mit einem spezifisch bindenden Liganden markiert. Der Begriff "markiert" bezieht sich auf die Tatsache, daß der Ligand an diesen Primer auf solche Weise gebunden ist, daß er nicht ohne weiteres abgelöst bzw. entfernt werden kann. Der spezifisch bindende Ligand kann Biotin oder eines seiner Derivate sein, Avidin, Streptavidin oder eines seiner Derivate, ein Lectin, ein Zucker, ein Protein, ein Hapten, ein Arzneistoff, oder eine immunologische Spezies, wie beispielsweise ein Antikörper oder ein antigenes Material.
  • Die vorliegende Erfindung ist zur Amplifikation oder zum Nachweis einer gewünschten Nukleinsäure verwendbar, die zwei komplementäre Stränge aufweist. Die meisten interessierenden Nukleinsäuresequenzen sind bereits doppelsträngig, wie die in DNA gefundenen. Einzelsträngige Nukleinsäuresequenzen, wie mRNA, können jedoch auf ähnliche Weise amplifiziert und nachgewiesen werden.
  • Eine spezifische Nukleinsäuresequenz wird erzeugt, indem die Nukleinsäure, die diese Sequenz enthält, als ein Matrizenstrang verwendet wird. Wenn die Nukleinsäure zwei Stränge enthält, ist es notwendig, die Stränge aufzutrennen (als Denaturierung bezeichnet), und zwar entweder als einen separaten Schritt oder gleichzeitig mit der Bildung von Primerextensionsprodukten. Das Denaturieren kann erreicht werden, indem beliebige geeignete physikalische, chemische oder enzymatische Mittel, wie sie im Stand der Technik beschrieben sind, verwendet werden. Erwärmen auf eine geeignete Temperatur ist ein bevorzugtes Mittel. Denaturierung kann auftreten, wenn die Vollblutprobe oder die PBMC-Probe erhitzt wird, um DNA zu extrahieren.
  • Wenn die getrennten Stränge zur Verwendung verfügbar sind, kann die Synthese zusätzlicher Nukleinsäurestränge durchgeführt werden, wobei zwei oder mehr Primer (markiert oder unmarkiert) in einer gepufferten, wäßrigen Lösung bei einem pH von normalerweise 7 - 9, verwendet werden. Vorzugsweise wird zu der gepufferten Lösung ein molarer Überschuß der beiden Primer zugegeben; spezifische Mengen sind im Stand der Technik beschrieben (z. B. US- A-4,683,202). Die Desoxyribonukleosid-Triphosphate dATP, dCTP, dGTP und dTTP werden ebenfalls zu dem Synthesegemisch in adäquaten Mengen zugegeben und die erhaltene Lösung wird bis zu 10 Minuten lang auf 90 - 100 ºC erhitzt, vorzugsweise 1 - 4 Minuten lang. Enzymcofaktoren, wie Magnesium- oder Manganionen, liegen ebenfalls bevorzugt in molarem Überschuß zu den Triphosphaten vor. Nach dem Erwärmen wird die Lösung vorzugsweise auf Raumtemperatur abgekühlt und ein geeignetes Agens zum Induzieren (oder Katalysieren) der Bildung von Primerextensionsprodukten wird eingeführt. Dieses induzierende Agens ist im allgemeinen im Stand der Technik als ein Polymerisierungsmittel bekannt. Die Reaktion zum Bilden dieser Produkte wird unter bekannten Bedingungen durchgeführt (im allgemeinen von Raumtemperatur bis zu derjenigen Temperatur, bei der keine Polymerisation mehr stattfindet).
  • Das Polymerisierungsagens kann jede Verbindung oder Kombination von Reagenzien sein, die bewirkt, daß die Synthese von Primerextensionsprodukten, einschließlich Enzymen (beispielsweise E coli-DNA-Polymerase I, T4-DNA-Polymerase, Klenow-Polymerase, reverse Transkriptase und andere aus dem Stand der Technik bekannte) erreicht wird. Besonders brauchbare Enzyme sind thermisch stabile Enzyme, die kloniert sein können oder natürlich vorkommen können, wie solche, die aus verschiedenen Thermus-Bakterienspezies erhalten werden. Andere Polymerisierungsagenzien sind in der US-A-4,683,202 beschrieben.
  • Bevorzugte thermisch stabile Enzyme sind DNA-Polymerasen von Thermus aquaticus, wie die in der EP-A-0 258 017 (veröffentlicht am 02. März 1988) beschriebenen. Andere brauchbare Enzyme wurden von Rossi et al, Syst. Appl. Microbiol. 7(2-3), S. 337 - 341, 1986 beschrieben. Einige brauchbare Polymerasen sind im Handel erhältlich. Im allgemeinen wird die Synthese der Extensionsprodukte am 3'-Ende eines jeden Primers initiiert und schreitet in der 5'- zur 3'-Richtung entlang des Matrizenstrangs fort, bis die Synthese beendet ist. Einige Polymerisierungsagenzien (beispielsweise Reverse Transcriptase) können in der 3'- zur 5'-Richtung entlang des Matrizenstrangs fortschreiten.
  • Die neu gebildeten Primerextensionsprodukte umfassen die neu synthetisierten Stränge, und deren jeweilige Primer formen doppelsträngige Moleküle mit den ursprünglichen Zielsträngen, die in den nachfolgenden Schritten des Verfahrens verwendet werden. Diese Stränge werden dann durch Denaturierung wie zuvor beschrieben getrennt, wobei einzelsträngige Moleküle erhalten werden, auf denen neue Nukleinsäuren wie zuvor beschrieben synthetisiert werden. Es können zusätzliche Reagenzien notwendig sein, um das Amplifikationsverfahren am Laufen zu halten, nach dem die meisten der Extensionsprodukte aus der spezifischen Nukleinsäuresequenz bestehen, die durch die beiden Primer gebunden ist (d. h. komplementäre Produkte).
  • Die Schritte der Strangauftrennung und der Synthese des Extensionsprodukts können so oft wie nötig wiederholt werden, um die gewünschte Menge der spezifischen Nukleinsäure zu erzeugen, die für die Verwendung, beispielsweise den Nachweis, benötigt wird. Im allgemeinen wird die Schrittfolge mindestens einmal wiederholt und vorzugsweise mindestens 10 - 50 mal.
  • Wenn mehr als eine gewünschte extrahierte Nukleinsäure erzeugt werden soll, wird die geeignete Anzahl von Primersätzen in dem allgemeinen zuvor beschriebenen Verfahren verwendet.
  • Es können verschiedene Nachweisverfahren verwendet werden, um das Vorliegen des nachweisbaren Hybrids festzustellen, einschließlich Southern-Blot, Gelelektophorese, Anfärben und andere aus dem Stand der Technik bekannte.
  • An jedem Punkt des erfindungsgemäßen Verfahrens kann, nach der Bildung von mindestens einem Primerextensionsprodukt, dieses Produkt mit einer nachweisbar markierten Sonde (im folgenden beschrieben) hybridisiert werden.
  • Wenn eine gewünschte Menge der interessierenden Nukleinsäuresequenz erzeugt worden ist, und die Primerextensionsprodukte zum letzten Mal getrennt worden sind, wird im allgemeinen das erste Primerextensionsprodukt mit einer Oligonukleotidsonde in Kontakt gebracht, die zum Nachweis markiert ist und die komplementär dazu ist, um ein Produkt zu bilden. Die Sonde umfaßt ein Oligonukleotid, das mit der gewünschten Nukleinsäuresequenz komplementär ist. Die Sonden können jede beliebige Nukleinsäurelänge aufweisen, weisen jedoch vorzugsweise 15 - 40 Nukleinsäuren auf. Sie sind mit einem beliebigen geeigneten nachweisbaren Material markiert (üblicherweise am 5'-Ende), das die Komplexierung des spezifisch bindenden Liganden und seines Rezeptors nicht stört. Verfahren zum Anheften von Markern und zum Herstellen von Sonden sind aus dem Stand der Technik bereits bekannt, beispielsweise die von Agrawal et al, Nucleic Acid Res.1 14, S. 6227 - 45 (1986) und in den zuvor angegebenen Literaturstellen zum Anheften eines spezifisch bindenden Liganden an einen Primer beschriebenen. Brauchbare Marker schließen Radioisotope, Reagenzien mit Elektronendichte, Chromogene, Fluorogene, phosphoreszierende Gruppen, Ferritin und andere magnetische Teilchen, chemilumineszente Gruppen und Enzyme (die bevorzugt sind) mit ein. Brauchbare Enzyme umfassen Glukoseoxidase, Peroxidase, Uricase, alkalische Phosphatase und andere aus dem Stand der Technik bekannte. Substrate und farbstoffbildende Zusammensetzungen für derartige Enzyme sind ebenfalls bereits bekannt.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Marker Peroxidase und an einem bestimmten Punkt des Tests werden Wasserstoffperoxid und geeignete farbstoffbildende Zusammensetzungen zugegeben, um einen nachweisbaren Farbstoff zu erhalten. Brauchbare farbstoffliefernde Reagenzien umfassen beispielsweise Tetramethylbenzidin und seine Derivate, und Leukofarbstoffe, wie Triarylimidazol- Leuko-Farbstoffe (wie in der US-A-4,089,747 beschrieben, oder andere Verbindungen, die in Gegenwart von Peroxidase und Wasserstoffperoxid unter Bildung eines Farbstoffes reagieren. Besonders brauchbare farbstoffliefernde Zusammensetzungen sind in der WO-A-0 88/02806 und 88/02807 und in der EP-A-0 308 236 (veröffentlicht am 22. März 1989), beschrieben).
  • Der Nachweis des Vorliegens der Sonde, die in dem komplementären Produkt vorliegt, kann durch Verwendung geeigneter und bekannter Nachweisvorrichtungen und -Verfahren erreicht werden. Bestimmte Sonden sind auch ohne den Einsatz von Nachweisvorrichtungen für das Auge sichtbar.
  • Damit die Sonde in dem komplementären Produkt nachgewiesen werden kann, ist es oftmals wichtig, daß das komplementäre Produkt von den anderen Materialien in dem Reaktionsmedium abgetrennt wird. Dies kann durch geeignete unlöslich machende Mittel erreicht werden, indem man beispielsweise an einem bestimmten Punkt des Verfahrens einen Primer oder eine Sonde einsetzt, die an ein festes Material gebunden sind oder sonst in der Lage sind, an dieses zu binden. Das erhaltene unlöslich gemachte komplexierte Produkt kann von nichtkomplexierten Materialien durch Filtrieren, Zentrifugieren oder andere geeignete Trennungstechniken abgetrennt werden.
  • Besonders hilfreiche Abtrennungsmittel sind mikroporöse Filtermembranen, wie die Polyamidmembranen, die von Pall Corp. auf dem Markt sind (zuvor beschrieben). Die Membranen können als ein Abtrennsubstrat mit geeigneten Behältern zum Durchführen anderer Schritte des Tests verwendet werden. Vorzugsweise sind sie jedoch als Teil einer Testvorrichtung angebracht, wie zuvor beschrieben wurde.
  • Das hier beschriebene Verfahren kann verwendet werden, um den Nachweis oder die Charakterisierung spezifischer Nukleinsäuresequenzen zu ermöglichen, die mit infektiösen Erkrankungen, genetischen Störungen oder Zellstörungen, wie Krebs, verbunden sind, die in biologischen Proben gefunden werden. Es kann auch in forensischen Untersuchungen, zum Feststellen des DNA-Typs und des Gewebetyps, verwendet werden. Für die erfindungsgemäßen Ziele umfassen genetische Erkrankungen spezifische Deletionen oder Mutationen in menschlicher genomischer DNA aus einem beliebigen Organismus, wie Sichelzellenanämie, zystische Fibrose, α-Thalassämie, β-Thalassämie und anderen dem Fachmann ohne weiteres ersichtliche. Verschiedene infektiöse Erkrankungen können durch das Vorliegen von Zellen mit geringen Mengen spezifischer DNA-Sequenzen, die für den Organismus charakteristisch sind, diagnostiziert werden, gleichgültig ob es ein Hefepilz, ein Bakterium oder ein Virus ist. Solche Bakterien, die nachgewiesen werden können, umfassen Salmonella, Chlamydia, Gonorrhea, Shigella und Listeria, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Viren, die nachweisbar sind, umfassen Herpes, Cytomegalovirus, Epstein-Barr-Virus, Hepatitis und Retroviren, wie HTLV-I und HIV-I, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Protozoische Parasiten, Hefe- und Schimmelpilze sind ebenfalls nachweisbar. Andere nachweisbare Spezies sind dem Fachmann ohne weiteres ersichtlich.
  • In dem Beispiel wurden folgende Materialien verwendet:
  • Der "TE"-Puffer war zusammengesetzt aus Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Hydrochlorid-Puffer (10 mmolar) und Ethylendiamintetraessigsäure (1 mmolar), und der pH wurde mit Salzsäure auf 8 eingestellt.
  • Der "Laufpuffer" (pH 8), der für die Elektrophorese verwendet wurde, war zusaminengesetzt aus Tris(hydroxymethyl)aminomethan (39 mmolar), Borsäure (89 mmolar) und Ethylendiamintetraessigsäure (2 mmolar).
  • Die balancierte Salzlösung nach Hanks wurde von Sigma Chemical Co. erhalten.
    • Beispiel 1: Extraktion von HIV-I-DNA aus der PBMC-Fraktion von Vollblut
  • Dieses Beispiel veranschaulicht, wie eine Nukleinsäure aus einer PBMC-Fraktion von Vollblut extrahiert werden kann. Es zeigt das Standardverfahren, um die PBMC-Fraktion zu erhalten, und demonstriert dann die Extraktion, die Amplifikation und die Nachweisverfahren der Erfindung.
  • Mononukleare Zellen von peripherem Blut (PBMC) wurden aus Vollblutproben von Patienten erhalten, von denen angenommen wurde, daß sie HIV-I-Träger sind. Dabei wurde das folgende Verfahren eingesetzt:
  • Vollblut (10 ml), gesammelt in Heparinröhrchen, wurde zu 15 ml Zentrifugenröhrchen zugegeben und 10 Minuten lang bei 1200 UpM zentrifugiert. Sämtliche Schichten wurden entfernt und aufbewahrt, mit Ausnahme von etwa 0,5 ml der Plasmaschicht. Unter Zurücklassung von so vielen roten Blutzellen wie möglich, wurde soviel wie möglich von den Gerinnungshäutchen entfernt und in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen übertragen. Balancierte Salzlösung nach Hanks (HBSS, 5 ml) wurde dann zu den Zellen der Gerinnungshäutchen zugegeben, die dann mit Ficoll-Paque (3,5 ul) unterschichtet wurden. Das erhaltene Gemisch wurde bei 1900 UpM 16 Minuten lang zentrifugiert, dann wurde der PBMC-Ring über der Ficoll-Schicht entfernt und in ein anderes 15 ml Zentrifugenröhrchen übertragen. HBSS (5 ml) wurde zugegeben und das Gemisch wurde 10 Minuten lang bei 1200 UpM zentrifugiert. Das erhaltene Pellet, das das Aquivalent von 250 - 300 ul PBMC enthielt, wurde in ein 2 ml- Mikroröhrchen mit Schraubverschluß übertragen und bei -70 ºC aufbewahrt.
  • Eine Probe (1 ml) PBMC, die etwa 2 - 3 Millionen Zellen/ml enthielt, wurde in ein 1,5 ml-Eppendorf-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben und 10 Minuten lang bei 14000 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde in "TE"-Puffer (1 ml) resuspendiert. Die Probe wurde 10 Minuten lang bei 100 ºC erhitzt, dann 2 Sekunden lang bei 14000 UpM zentrifugiert. Proben (50 ul) des Überstandes wurden mit 100 ul des folgenden Polymerase- Kettenreaktions-Gemisch gemischt. Die Amplifikation wurde wie im folgenden beschrieben durchgeführt.
  • Das Polymerase-Kettenreaktions-Gemisch enthielt folgendes: Tris(hydroxymethyl)aminomethan-hydrochlorid-Puffer (pH 8, 10 mmolar), Kaliumchlorid (50 mmolar), Magnesiumchlorid (10 mmolar), Gelatine (100 ug/ml), Desoxyribonucleosid- Triphosphate (dNTPs, jeweils 0,17 mmolar) und DNA- Polymerase, die aus Thermus aauaticus isoliert wurde (7,5 Einheiten). Die verwendeten Primer (jeweils 1 umolar) wiesen die folgenden Nucleotidsequenzen auf:
  • SEQ ID Nr 1 5'-ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT-3'
  • SEQ ID Nr: 2 5'-N-TTTGGTCCT TGTCTTATGT CCAGAATGC-3'
  • wobei N einen Biotin-Tetraethylenglykol-Spacer-Arm darstellt, der wie in der WO-A-89/02931 beschrieben hergestellt und an die Nucleinsäuresequenz gebunden wurde.
  • Das Reaktionsgemisch und die PBMC-Fraktion wurden gemischt und durch Polymerase-Kettenreaktion über 35 Zyklen amplifiziert, wobei der Zyklus wiederholt wurde: 97 ºC für 0,5 Minuten (Denaturieren), 55 ºC für 0, 5 Minuten (Hybridisieren) und 70 ºC für 1 Minute (Bildung des Primer-Extensionsprodukts).
  • Es wurden Aliquote (6 ul) entnommen und auf 4 %-iges Agarose-Gel (3 % Nusieve und 1 % Seakem ) von FMA BioProducts aufgetragen. Das Gel wurde mit 4 ul einer Ethidiumbromid-Lösung (10 mg/ml) in Wasser vorgefärbt. Der Laufpuffer (600 ul) enthielt 24 ul Ethidiumbromid. Das Gel wurde bei 120 V eine Stunde lang einer Elektrophorese unterzogen, dann photographiert und die Banden wurde sichtbar gemacht. Die Ergebnisse zeigten starke Banden, die die Isolierung und Amplifikation der HIV-I-DNA der PBMC-Fraktion anzeigten. Bei der Kontrollösung, von der bekannt war, daß sie keine HIV-I-DNA enthält, waren keine Banden sichtbar.

Claims (6)

1. Verfahren zur raschen Extraktion einer Nukleinsäure aus einer wäßrigen Probe von mononuklearen Zellen von peripherem Blut, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist daß es allein die folgenden Schritte aufweist:
A. Einwirkenlassen von Wärme bei oder nahe dem Siedepunkt von Wasser auf eine wäßrige Probe von mononuklearen Zellen von peripheren Blut, von denen angenommen wird, daß sie eine Nukleinsäure eines infektiösen Agens oder eines menschlichen Genoms enthalten, 2 bis 15 Minuten lang, um die Zellen in der Probe zu lysieren und die Nukleinsäure aus den Zellen freizusetzen, und
B. Gewinnung der Nukleinsäure aus der erhitzten Probe.
2. Verfahren zur Amplifikation einer vorbestimmten Nukleinsäure unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion, umfassend:
A. die Extraktion einer Nukleinsäure aus einem infektiösen Agens oder menschlichem Genom in einer wäßrigen Probe von mononuklearen Zellen von peripherem Blut, und
B. die Amplifikation der extrahierten Nukleinsäure unter Anwendung einer Polymerasekettenreaktion,
dadurch gekennzeichnet, daß das Extraktionsverfahren allein aus den folgenden Schritten besteht:
1) Einwirkenlassen von Wärme bei oder nahe dem Siedepunkt von Wasser auf die wäßrige Probe der mononuklearen Zellen von peripherem Blut, 2 bis 15 Minuten lang, um die Zellen in der Probe zu lysieren und die Nukleinsäure aus den Zellen freizusetzen, und
2) Gewinnung der Nukleinsäure aus der erhitzten Probe.
3. Verfahren zur Bestimmung einer Nukleinsäure mit zwei komplementären Strängen, umfassend:
A. ein Extraktionsverfahren, bestehend allein aus den Schritten:
1) Einwirkenlassen von Wärme bei oder nahe dem Siedepunkt von Wasser auf eine wäßrige Probe von mononuklearen Zellen von peripherem Blut, von denen angenomivien wird, daß sie eine Nukleinsäure von einem infektiösen Agens oder einem menschlichen Genom enthalten, 2 bis 15 Minuten lang, um die Zellen in der Probe zu lysieren und die Nukleinsäure aus den Zellen freizusetzen, und die Nukleinsäure zu denaturieren, und
2) der Gewinnung der denaturierten Nukleinsäure aus der erhitzten Probe,
B. In Kontakt-bringen der gewonnenen denaturierten Nukleinsäure mit ersten und zweiten Primern, die komplementär gegenüber den getrennten Strängen der Nukleinsäure sind, unter Bildung von hybridisierten Produkten der Primer und der komplementären Stränge,
C. Bildung von ersten und zweiten Extensionsprodukten der Primer in den hybridisierten Produkten, wobei die Extensionsprodukte, wenn sie von ihren Komplementen getrennt sind- als Matrizen für die Synthese von Extensionsprodukten der Primer dienen können-
D. Trennung der Primer-Extensionsprodukte von den Matrizensträngen, auf denen sie synthetisiert wurden,
E. In Kontakt-bringen der getrennten Extensionsprodukte und der vorbestimmten Nukleinsäure mit zusätzlichen ersten und zweiten Primern, wobei die Nukleinsäure durch Bildung von komplementären Produkten amplifiziert wird,
F. Trennung der Primer-Extensionsprodukte von den komplementären Produkten, die in Stufe E erzeugt wurden, und
G. Bestimmung der amplifizierten Nukleinsäure als Nachweis für das Vorliegen der Nukleinsäure in der wäßrigen Probe.
4. Verfahren nach Anspruch 3 für die Extraktion, die Amplifikation und den Nachweis von HIV-I DNA.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die Gewinnung der Nukleinsäure durch Zentrifugieren der Probe nach dem Erhitzen erfolgt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem das Erhitzen 4 bis 12 Ninuten lang bei einer Temperatur von 95º bis 120ºC erfolgt.
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