DE69001429T2

DE69001429T2 - Zusammensetzung mit gehalt an einem nichtsteroiden entzuendungshemmenden mittel und einem nichtbakterizidwirksamen tetracyclin.

Info

Publication number: DE69001429T2
Application number: DE9090203190T
Authority: DE
Inventors: Lorne M Golub; Robert A Greenwald; Thomas F Mcnamara; Nangavarum S Ramamurthy
Original assignee: Research Foundation of State University of New York; New York University NYU
Current assignee: Research Foundation of State University of New York; New York University NYU
Priority date: 1989-12-04
Filing date: 1990-12-03
Publication date: 1993-07-29
Anticipated expiration: 2010-12-04
Also published as: DE69001429D1; ATE88346T1; US5321017A; CA2031368A1; EP0435362B1; JP3016587B2; JPH03227931A; ES2055309T3; EP0435362A1; CA2031368C; DK0435362T3; US5459135A

Description

Die Erfindung betrifft eine zur Behandlung von rheumatoider Arthritis und anderen gewebsschädigenden Zuständen, die mit übermäßiger kollagenolytischer Aktivität assoziiert sind, geeignete antikollagenolytische Zusammensetzung.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Tetracycline sind eine Familie sehr bekannter natürlicher und synthetischer Breitbandantibiotika. Die Grundverbindung Tetracyclin besitzt folgende allgemeine Struktur:
Die Numerierung des Ringkerns ist dabei wie folgt:
In der Natur treten neben Tetracyclin auch 5-OH- (Terramycin) und 7-Cl-Derivate (Aureomycin) auf. Dies sind sehr bekannte Antibiotika. Natürliche Tetracycline können modifiziert sein, ohne daß sie ihre antibiotischen Eigenschaften verlieren. Es müssen aber gewisse Strukturelemente vorhanden sein. Die an der Tetracyclingrundstruktur vor- und nicht-vornehmbaren Modifikationen sind besprochen bei Mitscher in "The Chemistry of Tetracyclines" Kapitel 6. Nach Mitscher können die Substituenten in den Position 5-9 des Tetracyclinringsystems modifiziert werden, ohne daß ein vollständiger Verlust der antibiotischen Eigenschaften auftritt. Änderungen am Grundringsystem oder ein Austausch der Substituenten an den Positionen 1-4 und 10-12 führen gewöhnlich jedoch zu synthetischen Tetracyclinen mit wesentlich geringerer oder keiner antibakteriellen Wirkung. So gilt z.B. das 4- Desdimethylaminotetracyclin allgemein als nicht-antibakteriell.
Die Verwendung von Tetracyclin-Antibiotika kann trotz der Wirksamkeit mit unerwünschten Nebenwirkungen verbunden sein. Zum Beispiel kann die Langzeitverabreichung von Tetracyclin- Antibiotika eine gesunde Flora, bspw. die Darmflora, reduzieren oder töten und zum Entstehen von Antibiotika-resistenten Organismen oder zu einem Überwachsen mit Hefen und Pilzen führen.
Neben den antibiotischen Eigenschaften inhibieren Tetracycline bekanntlich auch die Aktivität von Kollagen-zerstörenden Enzymen, bspw. von Säugetier-Kollagenase, Makrophagen-Elastase und bakterieller Kollagenase [Golub et al., J. Periodont. Res. 20, 12-23 (1985) und Golub et al., J. Periodont. Res. 1989 (zur Veröffentlichung eingereicht)]. Kollagen ist eine Hauptkomponente der Bindegewebsmatrix, wie z.B. der Knochen, des Synoviums, des Auges, der Haut, der Sehnen und der Gingiva. Die Kollagenase baut Kollagen ab. Kollagenase wird in der Natur von nur wenigen Bakterienarten und einer Zahl von Säugetier-Geweben und -Zellen produziert.
Der Kollagenabbau durch Säugetier-Kollagenase ist ein natürlicher Teil des im normalen Bindegewebe ablaufenden Wachstum-Abbau-Regenerations-Prozesses. Die Kollagenase-Produktion kann jedoch übermäßig sein. Eine solche übermäßige Kollagenaseproduktion bewirkt dann oft eine pathologische und schwächende Zerstörung des Bindegewebes.
Das U.S. Patent Nr. 4,704,383 (McNamara et al.) offenbart, daß Tetracycline, die im wesentlichen nicht antibateriell sind, in Ratten die kollagenolytischen Enzymaktivität hemmen. McNamara et. al. berichten auch, daß in Organkulturen nicht-antibakterielle Tetracycline die Knochenresorption verringern, obwohl keine klinischen Studien beschrieben werden.
Das U.S. Patent Nr. 4,666,897 (Golub et al.) offenbarte ferner bereits, daß Tetracycline im allgemeinen eine übermäßige Knochenresorption hemmen; dies betrifft auch die kommerziell erhältlichen antimikrobiellen Tetracycline.
Es gibt auch Hinweise, daß Tetracycline - einschließlich der nicht-antibakteriellen - in Ratten wirksam zur Behandlung von Arthritis verwendet werden können. Siehe bspw. Golub et al.: "Tetracyclines (TCs) Inhibit Metalloproteinases (MPs): In Vivo Effects In Arthritic And Diabetic Rats, And New In Vitro Studies", Abstrakt vorgestellt auf der Matrix Metalloproteinase Konferenz, Destin, Florida, 11-15 September 1989; Breedveld: "Supression Of Collagen And Adjuvant Arthritis By A Tetracycline", Northeastern Regional Meeting of the Amer. Rheum. Assoc., Atlantic City, New Jersey, 23-24 Okt. 1987. Ähnliche Kommentare zur Wirkung von nicht-antbakteriellen Tetracyclinen auf den Knochenschwund, siehe Sipos et al. "The Effect Of Collagenase Inhibitors On Alveolar Bone Loss Due To Periodontal Disease In Desalivated Rats", Abstrakt, vorgestellt auf der Matrix Metalloproteinase Konferenz, Destin, Florida, 11-15 September 1989.
Eine von der antibiotischen Wirkungen unabhängige Tetracyclinwirkung ist jedoch für menschliche Patienten mit rheumatoider Arthritis nicht erwiesen. So beschreibt Skinner et al., Arthritis and Rheumatism 14, 727-732 (1971), daß eine Tetracyclin-Therapie bei Menschen mit rheumatoider Arthritis keine deutlichen Vorteil mit sich bringt. Greenwald et al. hingegen berichten, J. Rheumatol. 14, 28-32 (1987), daß die orale Verabreichung von Tetracyclin bei Menschen mit schwerer rheumatoider Arthritis die Kollagenase-Aktivität in den Gelenkgeweben vermindert.
Es ist bekannt, daß nicht-steroide anti-inflammatorische Agentien, anders als Tetracycline, sowohl zur symptomatischen Behandlung von rheumatoider Arthritis als auch bei anderen Entzündungskrankheiten hilfreich sind. Solche Mittel verhindern jedoch nicht wirksam eine Langzeitschädigung der Gelenk-Bindegewebe, einschließlich der Sehnen, der Knorpel und der Knochen. Die Schädigung wird durch die Anwesenheit übermäßiger großer Kollagenasemengen hervorgerufen.
Eine übermäßige Kollagenase-Aktivität wurde auch in Verbindung mit bestimmten Hautkrankheiten gebracht. So beschreibt White, Lancet, 29. April 1989, S. 966 (1989), daß das Tetracyclin Minocyclin bei der Behandlung von dystropher Epidermolyse bullosa wirksam ist. Dies ist eine lebensbedrohlicher Hauterkrankung, die vermutlich mit einem Übermaß an Kollagenase zusammenhängt.
Die Wirksamkeit von Tetracyclinen bei Hautkrankheiten wurde auch von Elewski et al. untersucht, Journal of the American Academy of Dermatology 8, 807-812 (1983). Elewski et al. offenbaren, daß Tetracyclin-Antibiotika in der Haut anti-inflammatorische Wirkung besitzen können. Sie vermuten, daß die therapeutische Wirkung bei einer Hautkrankheiten, wie Akne, die mit Bakterien zusammenhängt, auch teilweise auf der Hemmung der von den Bakterien hervorgerufenen Entzündung beruht und nicht nur auf dem unmittelbaren anti-bakteriellen Effekt.
Plewig et al., Journal of Investigative Dermatology 65, 532-532 (1975), beschreiben ähnliche Experimente. Diese waren zum Überprüfen der Hypothese gedacht, ob Antimikrobia bei der Behandlung von entzündlichen Dermatosen wirksam sind. Die Versuche von Plewig et al. zeigen, daß Tetracycline anti-inflammatorische Eigenschaften besitzen bei der Behandlung von Pusteln, die durch Kaliumjodid-Pflaster hervorgerufen wurden.
Es hat auch Überlegungen gegeben, daß die Kollagenase an der Knochen-Resorption beteiligt ist. Bspw. stellen Cowen et al., Biochemistry International 11, 273-280 (1985), die Hypothese auf, daß die osteoblastische Kollagenasebildung ein einleitendes Ereignis bei der Knochen-Resorption sein könnte, wobei Mineralien zurückbleiben, die von den Osteoblasten phagocytiert werden.
Dellaissé et al., Biochemical and Biophysical Research Communication133, 483-490 (1985) schlagen ferner vor, daß die Kollagenase eine kritische Rolle bei der Knochen-Resorption besitzt. Die Arbeit von Dellaissé et al. zeigt, daß die Inhibierung der Säugetier-Kollagenase und verwandter Gewebs- Metalloproteinasen den Abbau des Knochenkollagens verhindert. Sie hemmen somit die Resorption von Mausknochen-Explantaten in Gewebekultur.
Die Verwendung der Tetracycline in Verbindung mit nicht-steroiden anti-inflammatorischen Agentien ist untersucht worden bei der Behandlung von entzündlichen Hautkrankheiten, die von Akne vulgaris hervorgerufen werden. Wong et al., Journal of American Academy of Dermatology 11, 1076-1081 (1984), untersuchten die Kombination aus Tetracyclin und Ibuprofen. Sie fanden, daß Tetracyclin ein wirksames Agens gegen Akne vulgaris ist. Ibuprofen hingegen war hilfreich zur Verminderung der hervorgerufenen Entzündung, indem es die Cyclooxygenase inhibierte. Funt, Journal of the American Academy of Dermatology 13, 524-525 (1985), offenbart ähnliche Ergebnisse, wobei das Tetracyclin Minocyclin und Ibuprofen kombiniert wurden.
Bei den meisten der obigen Studien glaubte man, daß das Tetracyclin wegen seiner antibiotischen Wirkung nützlich sei. Daher wurden - ausgenommen in der Beschreibung des Patent von McNamara et al. - trotz der unerwünschten Nebenwirkungen antibakterielle Tetracycline verwendet.
Trotz der obigen Studien war es daher attraktiv, eine wirksame Langzeitbehandlung für rheumatoide Arthritis und andere gewebsschädigende Zustände, die mit einem Übermaß an Kollagenase-Aktivität einhergehen, zu entwickeln. Es ist Aufgabe der Erfindung, eine solche Behandlung bereitzustellen. Eine weiteres Ziel der Erfindung ist, eine solche Behandlung bereitzustellen und dabei die Nebenwirkungen der antibakteriellen Tetracyclin-Therapie zu vermeiden.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es wurde nunmehr gefunden, daß diese und weitere Ziele durch die Bereitstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung erreicht werden. Sie dient zur Behandlung von Säugetieren, die an rheumatoider Arthritis und anderen gewebsschädigenden Zuständen leiden, die mit einem Übermaß an Metalloproteinase-Aktivität einhergehen. Die Zusammensetzung umfaßt: (a) eine Menge eines Tetracyclins, das gegen Kollagenase, aber nicht anti-mikrobiell wirksam ist, und (b) eine Menge eines nicht-steroiden anti-inflammatorisch wirksamen Agens, das eine deutliche Reduzierung des Knochenschwundes bewirkt, wird es mit einer gegen Kollagenase wirksamen Menge Tetracyclin kombiniert. Die Menge Tetracyclin, die nach der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist eine, die bei Patienten nicht-antibakteriell wirksam ist. Deshalb sind auch Tetracycline, die allgemein für antibakterielle Zwecke verwendet werden, hierbei in nicht anti-bakteriell wirksamen Mengen verwendbar.

KURZBESCHRElBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figur 1 zeigt die unerwartet gute Entzündungsbehandlungs-Charakteristik bei einer erfindungsgemäßen Verwendung.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft die Behandlung von gewebsschädigenden Zuständen, die mit der übermäßigen Aktivität Matrix-zerstörender Proteinasen, wie Metalloproteinasen, einhergehen. Typische Metalloproteinasen umfassen bspw. Kollagenase und Gelatinase. Gewebsschädigende Zustände, die sich erfindungsgemäß behandeln lassen, umfassen rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, corneale Ulceration, Epidermolyse bullosa; metabolische Knochenkrankheiten, einschließlich Osteoporose; Krankheiten, wo eine Schädigung der Basalmembran auftritt, wie diabetische Nierenerkrankungen; Krankheiten, wo die zelluläre Passage durch Basalmembranen betroffen ist, wie metastatischer Krebs und periodontale Krankheiten.
Die erfindungsgemäß behandelbaren Zustände treten bei Säugetieren auf. Der Begriff Säugetier umfaßt menschliche Individuen und Labortiere, wie Mäuse und Ratten.
Es gibt Berichte, daß chemisch modifizierte nicht-antimikrobielle Tetracyclin-Analoga bei Ratten in vivo die Metalloproteinasen hemmen; daß chemisch modifizierte Tetracycline den alveolaren Knochenschwund in Verbindung mit periodontalen Krankheiten bei desalivierten Ratten verringern; daß antimikrobielle und nicht-antimikrobielle Tetracycline die Knochenresorption in Gewebekultur verhindern; daß das Tetracyclin Minocyclin das Auftreten und die Schwere der Arthritis bei Ratten verringert; und daß antibakterielle Tetracycline in vivo die Knochenresorption verringern (Golub et al., U.S Patent 4.666.897). Diese Berichte legen nahe, daß die Verabreichung nicht-anti-mikrobieller Dosen an Tetracyclin voraussichtlich den Knochenschwund bei arthritischen Tieren verringern. Die Erfinder haben jedoch überraschend gefunden, daß dies nicht der Fall ist. Werden arthritische Ratten mit nicht-antimikrobiellen Dosen des chemisch modifizierten Tetracyclins 4-Desdimethylaminotetracyclin behandelt, so tritt keine signifikante Verringerung des Knochenschwundes auf.
Ebenso unerwartet fanden die Erfinder, daß der Knochenschwund deutlich vermindert ist, werden an Arthritis leidende Säugetiere mit einer zwar nicht antimikrobiellen, aber gegen Metalloproteinase wirksamen Tetracyclin-Menge in Verbindung mit einem nicht-steroiden anti-inflammatorischen Agens behandelt. Der Knochenschwund kann entweder durch Verminderung der Knochenresorption oder durch Anregen neuer Knochenbildung verhindert werden.
Das Tetracyclin kann irgendein Tetracyclin sein. Es wird einem Säugetier in einer Dosis verabreicht, die im Säugetier nicht anti-mikrobiell wirkt. Vorzugsweise ist das Tetracyclin modifiziert, so daß seine anti-mikrobiellen Eigenschaften verringert sind. Methoden zum Herabsetzen der anti-mikrobiellen Eigenschaften eines Tetracyclins sind offenbart in "The Chemistry of the Tetracyclines", Kapitel 6, Mitscher, Hrsg.,S. 211. Mitscher zeigt daß Modifikationen an den Positionen 1, 2, 3, 4, 10 und 12a zu einem Verlust der Bioaktivität führen., Die Verwendung von so modifizierten Tetracyclinen ist erfindungsgemäß bevorzugt da sie gegenüber anti-mikrobiellen Tetracyclinen in höheren Mengen und mit geringeren Nebenwirkungen eingesetzt werden können.
Bevorzugt sind Tetracycline, denen die Dimethylamino-Gruppe in Position 4 fehlt. Chemisch so modifizierte Tetracycline umfassen bspw. 4-Desdimethylaminotetracyclin, 4-Desdimethylamino-5-oxytetracyclin, 4-Desdimethylamino-7-chlortetracyclin, 4-Hydroxy-4-desdimethylaminotetracyclin, 5a, 6- Anhydro-4-hydroxy-4-desdimethylaminotetracyclin, 6-Desmethyl-6-deoxy-4-des-dimethylaminotetracyclin und 6- -Desoxy-5-hydroxy-4-des-dimethylaminotetracyclin.
Auch Tetracycline, die an der 2-Kohlenstoff-Position verändert sind - zur Darstellung eines Nitrils, bspw. des Tetracyclinonitrils - sind geeignet als nicht-antimikrobielle anti-Metalloproteinase-Agentien.
Weitere Tetrayclinbeispiele mit einer verminderten (geänderten) anti-mikrobiellen Aktivität umfassen 6- -Benzylthiomethylentetracyclin, das 2-Nitrilanalog des Tetracyclins, das mono-N-alkylierte Amid des Tetracyclins, 6-Fluor-6-desmethyltetracyclin und 11 -Chlortetracyclin.
Die verwendete Tetracyclinmenge ist eine Menge, die gegen Kollagenase wirksam ist, aber nicht gegen Mikroben. Eine Tetracyclinmenge ist dann gegen Kollagenase wirksam, wenn sie deutlich die Kollagenase-Aktivität verringert. Ein Tetracyclin ist anti-mikrobiell, wenn es deutlich das Wachstum von Mikroben verhindert. Die Maximaldosis für Menschen ist die höchste Dosis, die keine Nebenwirkungen verursacht. Bei der vorliegenden Erfindung umfaßt der Begriff "Nebenwirkungen" sowohl klinisch signifikante anti-mikrobielle Wirkungen als auch toxische Effekte. Bspw. würde eine Überdosis von 50 mg/kg/Tag wahrscheinlich bei den meisten Säugetieren, einschließlich beim Menschen, Nebeneffekte verursachen.
Das nicht-steroide anti-inflammatorische Agens kann aus den verschiedenen Klassen solcher Verbindungen ausgewählt sein. In den Klassen enthalten sind: Salicylate, bspw. Acetylsalicylsäure und Diflunisal; Acetatsäuren, bspw. Indomethacin, Sulindac, Tolmetin, Diclofenac und Etodolac; Propionsäuren, bspw. Flurbiprofen, Naproxen und Ketoprofen; Fenamate, bspw. Meclofenamat; und Oxicame, bspw. Piroxicam.
Bevorzugte nicht-steroide anti-inflammatorische Agentien umfassen Flurbiprofen, Piroxicam, Natrium- Tolmetin, Ibuprofen, Naproxen und Indomethacin.
Die Menge des nicht-steroiden anti-inflammatorischen Agens, wird sie mit einer anti-Kollagenase-wirksamen Tetracyclinmenge vereinigt, ist eine Menge, die eine deutliche Verkleinerung des Knochenschwunds bei Säugetieren hervorruft; d.h., bei Säugetieren, die an gewebsschädigenden Zuständen leiden, die mit einem Übermaß an Metalloproteinase-Aktivität einhergehen. Die Menge hängt ab von dem jeweils verwendeten anti-inflammatorischen Agens, dem Säugetier, dem das Gemisch verabreicht wird sowie der Tetracyclinmenge in dem Gemisch. Übliche Dosen für den Routinegebrauch beim Menschen umfassen 20 mg/Tag Piroxicam, 150 mg/Tag Indomethacin, 1600- 1800 mg/Tag Tolmetin, 1000 mg/Tag Naproxen und 3200 mg/Tag Ibuprofen.
Eine geeignete Menge 4-Desdimethylaminotetracyclin ist 15 mg/kg. Eine geeignete anti-inflammatorische Agensmenge in Verbindung mit 30 mg/kg 4-Desdimethylaminotetracyclin wäre 1-8 mg/kg Flurbiprofen, 0,3 mg/kg Piroxicam und 40 mg/kg Ibuprofen.
Eine geeignete anti-inflammatorisches Agensmenge zur Ausführung der vorliegenden Erfindung kann festgelegt werden nach der Faustregel, daß die verabreichte Menge 20% bis 80% der herkömmlichen anti-inflammatorischen Dosis zur Behandlung von Arthritis ausmachen sollte. Die Dosis liegt somit zwischen 10 mg/Person/Tag für Piroxicam und 3200 mg/Person/Tag für Ibuprofen. Der Fachmann auf diesem Gebiet kann somit aufgrund seines Wissens und seiner Erfahrung eine wirksame Dosis zur Erreichung der gewünschten Wirkung festlegen.
Eine bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der Erfindung umfaßt eine Kombination aus einem Tetracyclin und einem anti-inflammatorischen Agens in einem geeigneten pharmazeutischen Träger. Die Abgabeform des pharmazeutischen Trägers mit dem Wirkmittel kann für eine orale Verabreichung an Säugetiere sein: Kapsel, gepreßte Tablette, Pille, Lösung oder Suspension. Weitere Abgabemittel umfassen: Gel zur örtlichen Anwendung bei cornealen Ulceri, peridontalen Krankheiten, etc. Es werden auch Träger und Formen in Betracht gezogen, die geeignet sind zur oralen oder topical Verabreichung, zur Injektion in ein Gelenk und für andere ausgewählte Verabreichungsformen.

ERFINDUNGSGEMÄßE BEISPIELE

BEISPIEL I

Der nachstehende Versuch erfolgte, um die Wirkung eines nicht-steroiden anti-inflammatorischen Heilmittels (Flurbiprofen), eines chemisch modifizierten nicht-antimikrobiellen Tetracyclins (4- Desdimethylaminotetracyclin; CMT) sowie einer Flurbiprofen/CMT-Kombination zu testen auf (i) Kollagenase- und Gelatinase-Aktivität, (ii) klinisch ermittelte Schwere der Entzündung und (iii) ermittelter Knochenschwund, der festgestellt wurde durch Radiographie der Gewebe und Gelenke der Ratte mit experimenteller Arthritis.
36 erwachsene Lewis-Ratten wurden durch Injektion von Freundschem Adjuvans arthritisch gemacht. Die Tiere wurden wie folgt in Versuchsgruppen aufgeteilt: Gruppe I: unbehandelte arthritische Ratten; Gruppe II: arthritische Ratten, denen täglich oral Flurbiprofen verabreicht wurde (1,0 mg pro Ratte); Gruppe III: arthritische Ratten, denen täglich oral CMT verabreicht wurde (3 mg pro Ratte); Gruppe IV: arthritische Ratten, denen beide Heilmittel verabreicht wurden. Nach einer Versuchsperiode von 2-3 Wochen (2 Wochen bei den 6 Ratten der Gruppe, wo die Enzymaktivität bestimmt wurden; 3 Wochen bei den 3 Ratten der Gruppe, wo die Enzymaktivität bestimmt wurde; 3 Wochen bei den 3 Ratten der Gruppe, wo der Knochenschwund durch Röntgen bestimmt wurde) wurden die Ratten getötet, die Hinterpfoten entnommen, die Haut entfernt und die entzündeten subcutanen Gewebe, die die arthritischen Gelenke überdecken, seziert (alle Sezierungen und Extraktionen erfolgten bei 4ºC). Die Gewebe wurden zerkleinert, gewogen, extrahiert und die Extrakte stufenweise durch Amoniumsulfat-Präzipitation gereinigt, wofür bereits bekannte Verfahren verwendet wurden [Ramamurthy und Golub, J Periodontal Res. 17, 455, (1983)]. Die Extrakte von den erkrankten Geweben wurden dann 5fach konzentriert und (a) Aliquote davon 4 Stunden zur Messung der Gelatinase-Aktivität bei 37ºC mit [³H-Methyl]-Gelatine (denaturiertem Typ1-Ratten-Hautkollagen) inkubiert. Die unverdaute Gelatine wurde mit Trichloressigsäure präzipitiert, abzentrifugatiert und Aliquote der Überstände mit den Abbauprodukten in einem Flüssigkeits-Scintillations-Spectrometer gemessen; (b) für den Kollagenase-Test wurden die Extrakte 18 Stunden bei 22ºC mit [³H-Methyl]- Kollagen inkubiert und die radioaktiv markierten Kollagenkomponenten ( -Ketten) und Abbauprodukte ( A) analysiert, wie vorstehend beschrieben [Golub et al. J. Periodontal Res. 20, 12 (1985)], mit einer Kombination aus SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Fluorographie.

Ergebnisse

1. Die unbehandelten arthritischen Ratten zeigten den höchsten Spiegel gewebsschädigender (gelatinolytischer und kollagenolytischer) Metalloproteinase-Aktivität, die auch mit der größten Entzündungschwellung der Pfote und dem stärksten Knochenschwund in den Gelenken - letzteres wurde durch Röntgen bestimmt - einherging.
2. Die arthritischen Ratten, die nur mit Flurbiprofen behandelt wurden, besaßen eine geringere Schwellung der Pfoten, eine leichte Verminderung der Metalloproteinase-Aktivität - obwohl die Verringerung der gelatinolytischen Aktivität statistisch nicht signifikant war - sowie eine leichte Verringerung des Knochenschwundes in den Gelenken (Anmerkung: die fluorographisch ermittelte kollagenolytische Aktivität wurde nicht weiter statistisch analysiert).
3. Die arthritischen Ratten, die nur mit CMT behandelt wurden, besaßen eine deutliche verminderte Metalloproteinase-Aktivität, einen leicht verminderten Knochenschwund im Gelenk und es war keine anti-inflammatorisch Wirkung (keine erkennbare Verminderung der Pfotenschwellung) feststellbar.
4. Die arthritischen Ratten, die mit CMT sowie Flurbiprofen behandelt wurden, zeigten eine völlige Inhibierung der kollagenolytischen Aktivität und die größte Reduzierung der gelatinolytischen Aktivität; die größte Reduzierung des Knochenschwundes in den Gelenken; und eine verminderte Pfotenschwellung, wobei der Verminderung so groß oder größer war als nur mit Flurbiprofen allein. TABELLE I Die Wirkung von Flurbiprofen und CMT - sowohl einzeln als auch gemeinsam - auf die gelatinolytische Aktivität im entzündeten Pfotengewebe von arthritischen Ratten* Versuchsgruppe % [³H-Methyl]-Gelatineabbau Statistische Signifikanz vs. Gruppe I Unbehandelte Arthritis-Ratten Arthritis-Ratten + Flurbiprofen Arthritis-Ratten + CMT Arthritis-Ratten + beide Heilmittel nicht signifikant; signifikant; *Jeder Wert stellt das Mittel + S.E.M. für 8 Ratten/Gruppe dar.
Aus den obigen Ergebnissen ist ersichtlich, daß die Behandlung von Arthritis-Ratten mit CMT oder mit Flurbiprofen allein jeweils eine gewisse Besserung der pathologischen Gelenkveränderungen bewirkte. Die Behandlung der Arthritis mit den zwei Heilmitteln in Kombination ergab jedoch die größte Verminderung der gewebszerstörenden entzündlichen Gelenkveränderungen.

BEISPIEL II

Trotzdem wurde noch ein Experiment durchgeführt, um die Wirksamkeit der Erfindung durch Vergleich der Ergebnisse zu bestimmen. Hierfür wurde chemisch modifiziertes nicht-antibakterielles Tetracyclin (4-Desdemethylaminotetracyclin) alleine, das nicht-steroide anti-inflammatorischen Heilmittel Flurbiprofen alleine sowie eine Kombination aus Flurbiprofen und CMT bei induzierter arthritischer Knochen- und Gelenkszerstörung eingesetzt. Bei diesem Versuch verwendeten die Erfinder erwachsene Lewis-Ratten mit einem Startkörpergewicht von jeweils etwa 120 Gramm. Die Ratten wurden in fünf Gruppen aufgeteilt, wovon eine eine Kontrollgruppe mit sechs nicht-injizierten (die Injektion diente zur Induktion einer Arthritis) Ratten war. Achtundvierzig erwachsene Lewis-Ratten wurden durch Injektion mit Freudschem Adjuvans arthritisch gemacht. Die arthritischen Ratten wurden wie folgt in Versuchsgruppen aufgeteilt: Gruppe I - unbehandelte arthritischen Ratten, denen allein der Träger oral verabreicht wurde, d.h. 2% Carboxymethylzellulose; Gruppe II - arthritische Ratten, denen täglich oral chemisch modifiziertes Tetracyclin (CMT) in einer Dosis von 4 mg pro Tag und Ratte intubiert wurde; Gruppe III - arthritische Ratten, denen täglich oral nicht-steroides anti-inflammatorisches Heilmittel Flurbiprofen (0,5 mg pro Tag und Ratte) intubiert wurde; Gruppe IV - arthritische Ratten, denen eine Kombination aus CMT und Flurbiprofen in Dosen verabreicht wurde, wie zuvor bei der Behandlung mit nur einer Wirksubstanz.
Dreiundzwanzig Tage nach der Induktion der Arthritis wurde die Hälfte der Ratten einer jeden Gruppe getötet. Die Hinterpfoten wurden seziert und Radiographien der Knochen und Gelenke unter Verwendung hochempfindlicher Röntgenfilme aufgenommen. Die Röntgenaufnahmen wurden im Blindversuch von zwei unabhängigen Experten beurteilt, wobei das Ausmaß der arthritischen Knochenzerstörung in den fünf verschiedenen Rattengruppen bestimmt wurde. Die Bewertung erfolgte nach folgender Knochenschädigungs-Skala: 1 = normal, 2 = schwach, 3 = mäßig und 4 = schwer. Ein weiterer Experte beurteilte die Ergebnisse nach der Anfangsuntersuchung. Die Ergebnisse sind in Tabelle II aufgeführt. TABELLE II Versuchsgruppe Knochenschädigung gemäß der Skala CMT-Konzentration im Serum (µg/ml)* Nicht-arthritische Ratten (Kontrolle) Arthritis-Ratten + Träger Arthritis-Rattten + CMT Arthritis-Ratten + Flurbiprofen Arthritis-Ratten + Kombination *Die Serumwerte wurden von den nach 14 Tagen getöteten Ratten bestimmt.
Die obigen Werte stellen das Mittel der Bewertung (durch die drei Experten) von sechs Knochen pro Gruppe dar. Davon ausgenommen sind die fünf Knochen der Gruppe, die mit einer Kombination aus CMT und NSAID behandelt wurde.

ERGEBNISSE

1. Im 23Tage-Protokoll besaßen die Wirkmittel CMT und Flurbiprofen jeweils allein nur eine geringe inhibitorische Wirkungen auf die induzierte Knochenarthritis und die Gelenksschädigung. Dieses Ergebnis ist in Anbetracht früherer Annahmen in der Literatur sehr überraschend. Sie machten den Forscher nämlich glauben, daß jedes der Bestandteile unabhängig voneinander wirksam sein könne.
2. Die Kombination aus CMT und Flurbiprofen kann außergewöhnlich gut bei Ratten die für den Versuch induzierte arthritische Knochen- und Gelenksschädigung verhindern.
3. Die Versuchsergebnisse zeigen ferner, daß der CMT-Blutspiegel durch die kombinierte orale Verabreichung von CMT und Flurbiprofen nicht reduziert wird.
Ferner wurden die Pfotendurchmesser vor und während des Protokolls physikalisch gemessen, um den Entzündungsgrad zu bestimmen. Die Ergebnisse in Figur 1 zeigen deutlich, daß die gemeinsame Verwendung von CMT und Flurbiprofen die Entzündung dramatisch verkleinert.
In der Tat bewirkte die den Arthritis-Ratten verabreichte Kombination aus CMT und Flurbiprofen Pfotendurchmesser, die im wesentlichen identisch mit denen normaler nicht-arthritischer Ratten waren. Entnommene Pfoten von mit CMT alleine behandelten Ratten waren stark entzündet. Entnommene Pfoten von mit Flurbiprofen allein behandelten Ratten zeigten andererseits, wie erwartet, deutlich die anti-inflammatorische Wirkung. Die Pfoten unbehandelter arthritischer Ratten besaßen die üblichen Durchmesser entzündeter Pfoten. Dieses zeigt klar die Wirksamkeit der Wirkmittelkombination.
Das zweite Experiment bestätigt grundsätzlich die Ergebnisse des ersten Experimentes. Es bestätigt damit die starke Wirksamkeit der Erfindung bei der Behandlung von gewebsschädigenden Zuständen.

Claims

1. Zusammensetzung zur Behandlung von Säugetieren, die an rheumatoider Arthritis und anderen gewebsschädigenden Zuständen, die mit übermäßiger Metalloproteinase-Aktivität assoziiert sind, leiden, umfassend:

(a) eine anti-Kollagenase-, aber nicht anti-mikrobiell-wirksame Menge eines Tetracyclins und

(b) eine Menge eines nicht-steroiden anti-inflammatorischen Agens, das in Verbindung mit der anti-Kollagenase-wirksamen Tetracyclinmenge eine deutliche Herabsetzung des Knochenschwundes bewirkt.

2. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Tetracyclin Desdimethylaminotetracyclin ist.

3. Verbindung gemäß Anspuch 2, wobei das Desdimethylaminotetracyclin 4-Des(dimethylamino)-tetracyclin, 4-Des(dimethylamino)-5-oxytetracyclin, 4-Des(dimethylamino)-7-chlortetracyclin, 6-Desoxy-6-desmethyl-4-desdimethylamino-tetracyclin und 6- -Desoxy-5-hydroxy-4- desdimethylamino-tetracyclin ist.

4. Zusammensetzung gemäß Anspruch 3, wobei das Tetracyclin 6 -Benzylthiomethylentetracyclin, das 2-Nitril-Analog des Tetracyclins, das mono-N-alkylierte Amid des Tetracyclins, 6-Fluor-6-desmethyltetracyclin oder 11 -Chlortetracyclin ist.

5. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das nicht-steroide anti-inflammatorische Agens ausgewählt ist aus den Salicylaten, Acetatsäuren, Propionsäuren, Fenematen, Pyrazolen und Oxicamen.

6. Zusammensetzung gemäß Anspruch 5, wobei die Salicylate ausgewählt sind aus Acetylsalicylsäure und Diflunisal; die Acetatsäure ausgewählt ist aus Indomethacin, Sulindac, Tolmethin, Diclofenac und Etodolac; die Propionsäure ausgewählt ist aus Flurbiprofen, Naproxen, Ketoprofen und Ibuprofen; das Oxicam ausgewählt ist aus Piroxicam und Isoxicam; und das Fenamat ausgewählt ist aus Meclofenamat und Flufenamsäure.

7. Verwendung von (a) einer anti-Kollagenase-, aber nicht anti-mikrobiell wirksamen Menge eines Tetracyclins und (b) einer Menge eines nicht-steroiden anti-inflammatorischen Agens, das in Verbindung mit der anti-Kollagenase-wirksamen Menge des Tetracyclins zu einer deutlichen Herabsetzung des Knochenschwundes führt, zur Zubereitung eines pharmazeutischen Produkts, das (a) und (b) in einer Kombinationszubereitung zur gleichzeitigen, getrennten oder aufeinanderfolgenden Verwendung enthält und zwar zur Behandlung von Säugetieren, die an rheumatoider Arthritis oder anderen gewebsschädigenden Zuständen, die mit einer übermäßigen Metalloproteinase-Aktivität assoziiert sind, leiden.