DE69000335T2 - Butalactin, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung als arzneimittel. - Google Patents

Butalactin, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung als arzneimittel.

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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine als Butalactin bezeichnete Verbindung auf ein Verfahren zu seiner Herstellung durch Vermehren einer Spezies mit der Kultur Nummer HIL Y-86,36923 (Str. sp. Y-86,36923), deren Mutanten oder Varianten sowie auf die Verwendung von Butalactin als Arzneimittel und biosynthetischer Regulator.
  • Der Stamm Str. sp. Y-86,36923 wurde aus in Pune, Maharashtra, Indien gewonnenem Boden isoliert und ist unter den Bedingungen des Budapester Vertrages bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen am 25. Mai 1989 hinterlegt worden (DSM 5372). In bekannter Weise können Varianten und Mutanten des Stammes Str. sp. Y-86,36923 erhalten werden, wie unter Anwendung von N-Methyl-N-nitro-N'- nitrosoguanidin oder von Ultraviolettlicht. Der Mikroorganismus Str. sp. Y-86,36923 gehört zur Ordnung Actinomycetales Familie Streptomycetaceae und Gattung Streptomyces.
  • Str. sp. Y-86,36923 wird als ein neuer Stamm angesehen, da er sich von den bekannten Stämmen in einigen seiner morphologischen, Kultur- und physiologischen Eigenschaften unterscheidet, wie aus der nachfolgenden Beschreibung ersichtlich ist. Er wird auch deshalb als ein neuer Stamm angesehen, weil er eine neue antibiotische Verbindung, hier als Butalactin bezeichnet ausbildet, wie aus der nachfolgenden Beschreibung ersichtlich ist.
  • Wie aus der anschließen eingehenden Beschreibung der Erfindung ersichtlich, ist Butalactin gemäß der vorliegenden Erfindung ein 2,3-disubstituiertes Butanolid-Antibioticum, unterscheidet sich aber von allen bekannten disubstituierten Butanolid-Metaboliten wie A-Faktor (Bioorg. Khim 2, 1142-1147, 1976), Anthracyclin-induzierenden Faktoren (J.Antibiotics, 35, 1722-1723, 1982; Biotechnology Lett. 5, 591-596, 1983), Virginieae-Butanoliden (J.Antibiotics, 40, 496-504, 1987) und verschiedenen razemischen Analoga (J.Antibiotics, 41, 1828-1837, 1988).
  • Butalactin ist eine Verbindung mit der Formel I
  • Gemäß der IUPAC-Nomenklatur lautet die chemische Bezeichnung der erfindungsgemäßen Verbindung 2-(4',5'-Epoxy-1'-oxo-2'(E)hexen)-yl-2-hydroxy-3-hydroxymethyl-2,3-(Z)-butanolid oder alternativ 2-(4',5'-Epoxy-hex-2'(E)-en)oyl-2-hydroxy-4-hydroxymethyl-2,3-(Z)-butanolid.
  • Eine mit den Suchbegriffen des Molekulargewichtes und der Molekularformel ausgeführte Literaturrecherche im Chemical Abstract Service (CAS) bestätigte ebenfalls, daß Butalactin eine neue Verbindung ist.
  • Das neue Antibiotikum der vorliegenden Erfindung ist in vitro gegen eine Anzahl Gram-positiver und Gram-negativer Mikroorganismen wirksam. Es ist auch in der Regulierung der Biosynthese von Sekundärmetaboliten wirksam. Demgemäß kann es als ein therapeutisches Mittel und als biochemischer Regulator in der Kontrolle von antitiotischer Biosynthese verwendet werden.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird auch ein Verfahren zur Isolierung von Str. sp. Y-86,36923 aus dem Boden unter Einsatz eines Nährmediums bei einem pH-Wert von 6,5 bis 8,5 in bekannter Weise geschaffen.
  • Das zur Isolierung des Mikroorganismus aus dem Boden verwendete Nährmedium besteht aus Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, anorganischen Nährsalzen und Verfestigungsmitteln. Kohlenstoffquellen können beispielsweise Glucose, Stärke, Dextrin, Glycerin, Saccharose oder Melassen sein. Stickstoffquellen können beispielsweise Pepton, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Kasein oder Aminosäuren wie Arginin oder Asparagin sein. Das Verfestigungsmittel kann beispielsweise Agar sein. Die anorganischen Nährsalze können beispielsweise Salze von Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium, Phosphor oder Schwefel sein.
  • Der Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung zeigt ein Längenwachstum zu farblosem Luftmycel aus verzweigtem Substratmycel. Auf dem Luftmycel werden spiralförmige Sporenketten gebildet. Die Spiralen sind offen. Kurze Sporenketten, repräsentativ für Sektion RA, sind ebenfalls häufig. Weder Quirl- noch Ascosporen werden festgestellt. Die reifen Sporenketten enthalten 10 bis 20 Sporen je Kette. Die Kultureigenschaften des Mikroorganismus auf verschiedenen Agarmedien sind nachfolgend angegeben:
    • 1. Hefeextrakt: Malzextrakt-Agar
  • Wachstum : gut, faltig, trocken
  • Luftmycel : dürftig, pulverig, hellgrau
  • Rückseite : gelblichweiß
  • lösliches Pigment : keines
    • 2. Hafermehl-Agar
  • Wachstum : gut, flach, trocken
  • Luftmycel : mäßig, pulverig, weiß
  • Rückseite : hellgelb
  • lösliches Pigment : keines
    • 3. Anorganische Salze : Stärke-Agar
  • Wachstum : gut, erhaben, trocken
  • Luftmycel : gut, pulverig, grau
  • Rückseite : grauoliv
  • lösliches Pigment : keines
    • 4. Glycerin: Asparagin-Agar
  • Wachstum : gut, faltig, trocken
  • Luftmycel : schwach, pulverig, weiß
  • Rückseite : hellgelb
  • lösliches Pigment : keines
    • 5. Pepton: Hefeextrakt-Eisenagar
  • Wachstum : mäßig, flach, sandförmig
  • Luftmycel : keines
  • Rückseite : hellbraun
  • lösliches Pigment : keines
    • 6. Tyrosin-Agar
  • Wachstum : gut, faltig, trocken
  • Luftmycel : keines
  • Rückseite : hellgelb
  • lösliches Pigment : keines
    • 7. Saccharose: Nitrat-Agar
  • Wachstum : gut, faltig, sandförmig
  • Luftmycel : dürftig, pulverig, weißlich
  • Rückseite : hellgelb
  • lösliches Pigment : keines
    • 8. Glucose : Asparagin-Agar
  • Wachstum : gut, faltig, trocken
  • Luftmycel : schwach, pulverig, hellgrau
  • Rückseite : hellgelb
  • lösliches Pigment : keines
  • Die optimale Vermehrungstemperatur für den Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung liegt bei 25ºC bis 37ºC. Dieser Mikroorganismus verflüssigt Gelatine in Glucose-Pepton-Gelatinemedium, hydrolysiert Stärke in Stärke-anorganische Salze-Agar, koaguliert Magermilch, bildet kein H&sub2;S aus und reduziert nicht Nitrat. Str. sp. Y-86,36923 vermehrt sich gut auf Czapeks Lösungsagar.
  • Keine Bildung von Melanoidpigment tritt in Tyrosinagar, Pepton-Hefeextrakt- Eisenagar oder Trypton-Hefeextraktbrühe ein.
  • Das Kohlenstoffquellen-Assimilationsmuster dieses Mikroorganismus ist wie folgt (in Pridham-Gottliebs Medium):
  • Positiv: : D-Glucose, L-Arabinose, D-Xylose, m-Inosit, D-Mannit, D-Fructose, Galactose, Maltose, Cellobiose, Na-Glutamat, Mannose, Lactose, Saccharose.
  • Schwach : Rhamnose, Raffinose.
  • Negativ : Cellulose.
  • Str. sp. Y-86,36923 wird durch Streptomycin bei Konzentrationen von der 6,25 ug/ml inhibiert, kann NaCl bei Konzentrationen von über 6%, eher unter 7% tolerieren und hat einen pH-Toleranzbereich von 6,0 bis 9,0.
  • Str. sp. Y-86,36923 unterscheidet sich wesentlich von den bekannten Mikroorganismen, die Cineromycin B und die verwendete Verbindung Albocyclin produzieren. Diese sind Streptomyces cinerochromogenes, Streptomyces brunneogriseus, Streptomyces roseocinereus und Streptomyces roseochromogenes var albocyclini.
  • Die veröffentlichte Information bezuglich der Kultureigenschaften und der physiologischen Eigenschaften anderer bekannter Mikroorganismen zeigt klare Unterschiede gegenüber dem Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung.
  • Darüberhinaus bildet Str. sp. Y-86,36923 bei seinem Kultivieren das neue Antibiotikum Butalactin aus, zusätzlich zu dem bekannten Antibiotikum Cineromycin B.
  • Aus den vorstehenden Ausführungen ist ersichtlich, daß der Mikroorganismus gemäß dieser Erfindung eine neue Streptomyces-Spezies ist.
  • Für den Fachmann ist es klar, daß die vorliegende Erfindung nicht auf den oben spezifizierten besonderen Organismus beschränkt ist, sondern alle jene spontanen und künstlichen Nutanten und von diesem Mikroorganismus abgeleiteten Varianten einschließt, die zur Ausbildung des neuen Antibiotikums Butalactin befähigt sind.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfähren zur Herstellung von Butalactin, welches Verfahren ein Kultivieren von Str. sp. Y-86,36923 durch Züchten bei einem pH-Wert zwischen 6,0 und 9,0, vorzugsweise zwischen 6 und 7, und bei einer Temperatur zwischen 18 und 40ºC, vorzugsweise zwischen 20 und 37ºC, unter aeroben Bedingungen in einem Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen, anorganische Nährsalze und Spurenelemente enthaltenden Nährmedium und ein Isolieren der Verbindung aus der Kulturbrühe in bekannter Weise umfaßt, wie hier beschrieben wird.
  • Die im Nährmedium zur Herstellung der neuen Antibiotika verwendeten Kohlenstoffquellen können beispielsweise Glucose, Stärke, Dextrin, Glyzerin, Saccharose, Melassen oder Öl sein. Die im Nährmedium zur Herstellung der neuen Antibiotika verwendeten Stickstoffquellen können beispielsweise Sojabohnenmehl, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Pepton, Gelatine oder Kasein sein. In dem Nährmedium zur Herstellung der neuen Antibiotika verwendete anorganische Nährsalze/Mineralsalze können beispielsweise Natriumchlorid, Magnesiumsulfat, Ammoniumsulfat oder Calciumcarbonat sein. Als Spurenelemente können beispielsweise Eisen, Mangan, Kupfer, Zink oder Kobalt verwendet werden.
  • Vorzugsweise wird Str. sp. Y-86,36923 bei etwa 27ºC (± 1ºC) und bei einem pH-Wert von etwa 7,0 vermehrt. Das Kultivieren wird vorzugsweise nach 23 bis 48 Stunden abgebrochen, wenn die Maximalausbeuten der Verbindungen erzielt werden. Die Fermentation kann vorzugsweise eine Submersfermentation sein. Der Fermentationsprozeß und die Bildung von Butalactin können durch die antibakterielle Aktivität der Kulturflüssigkeit und des Mycels gegen Staphylococcus aureus 209 P und gegen Escherichia coli 9632 auf Agarmedium und durch Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatten mit Ethylacetat als Entwicklungslösungsmittel überwacht werden.
  • Gewünschtenfalls kann ein Schaum-unterdrückendes Mittel wie Desmophen® (Polyole, Bayer AG, Leverkusen, DE) im Nährmedium während der Fermentation der Kultur verwendet werden.
  • Das Butalactin kann aus der Kulturbrühe durch Extraktion erhalten werden, vorzugsweise mit einem wasserunmischbaren Lösungsmittel nach Einstellen des pH-Wertes auf 6,5 bis 7,5. Die Lösungsmittel könnten Ethylacetat oder Chloroform sein, vorzugsweise ist das Lösungsmittel Ethylacetat, und der bevorzugte pH-Wert beträgt etwa 7,0. Der Lösungsmittelextrakt wird eingeengt, um das Lösungsmittel abzutrennen, und wird dann weiter chromatographiert. Das Butalactin kann auch aus der Kulturbrühe durch direkte Adsorption an geeignete Adsorbentien wie Amberlite® XAD-4 oder 7 (poröses Adsorptionsharz auf Polystyrol- oder Acrylsäureesterbasis, Rohm and Haas Co., US) oder Diaion® HP-20 (hoch poröses Adsorptionsharz auf der Basis Polystyrol-Divinylbenzolcopolymer, Mitsubishi Chemical Industries, Japan) erhalten werden, wobei das bevorzugte Adsorbens Diaion® HP-20 ist. Die Verbindung gemäß der Erfindung wird vom Adsorbens unter Anwendung geeigneter mobiler Phasen wie Chloroform, Methanol oder Aceton, entweder allein, in Kombination untereinander oder mit Wasser, eluiert und die Eluate werden dann zur Trockene eingedampft. Das bevorzugte Elutionsmittel ist Methanol. Die solcherart erhaltenen aktiven Eluate werden vereinigt und eingeengt.
  • Die vorstehend erwannten eingeengten Eluate oder Extrakte mit einem Gehalt an Butalactin können in verschiedener Weise weiter gereinigt werden. Beispielsweise können eine Re-Adsorption und Elutionsverfahren mit Aktivkohle, Amberlite® XAD-4 und 7, Diaion® HP-20, Gelfiltration mit Sephadex® HP-20-Gel (Gel mit definierter Porösität auf Agarose, Pharmacia Fine Chemicals AB, Schweden) und deren Äquivalenten; Adsorptionschromatographie an Aluminiumoxid und Silicagel, für die weitere Reinigung zweckmäßig kombiniert werden. Darüberhinaus können Dünnschichtchromatographie, Mitteldruck und Hochdruckflüssigkeitschromatographie unter Verwendung geeigneter Adsorbentien wie Silicagel und modifiziertes Silicagel-C&sub1;&sub8; mit geeigneten Lösungsmittelsystemen angewendet werden. Darüberhinaus kann für diesen Zweck eine Gegenstromchromatographie mit einem speziellen Lösungsmittelsystem gut geeignet sein. Vorzugsweise wird wiederholte Silicagelchromatographie mit Ethylacetat und Petrolether (40 bis 60ºC) als Elutionslösungsmittel angewendet. Während dieser Chromatographie wird auch die bekannte Verbindung Cineromycin B abgetrennt.
  • Butalactin ist ein hellgelber dicker Sirup bei Raumtemperatur (25ºC). Es ist in Wasser, Methanol, Ethanol, Propylenglykol, Dimethylsulfoxid, Methylenchlorid, Ethylacetat und Chloroform löslich. Es ist in Hexan und Petrolether (40 bis 60ºC) unlöslich.
  • In den nachstehend angegebenen dünnschichtchromatographsichen Systemen zeigt Butalactin die folgenden Werte:
  • Dünnschichtplatte: Artikel Nr. 554 von E. Merck, Darmstadt.
  • Rf-Wert von EtOAc
  • Butalactin 0,44
  • Cineromycin B 0,51
  • Das Ergebnis der analytischen Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) ist in Fig. 1 dargestellt. Die HPLC wurde in folgender Weise ausgeführt:
  • Säulenpackung: ODS-Hypersil®-10 u, 4·(30+100) mm (Säulenmaterial auf Basis von Octadecylsilan, Shandon Labortechnik, Frankfurt/Main, DE)
  • Strömungsgeschwindigkeit: 0,5 ml/min
  • Detektion : 240 m
  • Lösungsmittel : MeOH:Wasser (1:3)
  • Die spektroskopischen Daten von Butalactin sind nachstehend angeführt:
  • 1. UV max in Methanol und in 0,1 N HCl-Methanol bei 242 nm, in 0,1 N NaOH-Methanol Verschiebung auf 206 m. Das Absorptionsspektrum werde im Bereich 200 bis 800 m mit einem Wikon 810 Spektrophotometer gemessen.
  • 2. Das IR-Spektrum (rein) wurde an einem Perkin Elmer P.E.521 IR Spektrometer bestimmt, siehe Fig. 2.
  • 3. Das ¹H-NMR-Spektrum wurde an einem 90 MHz JEOL-FX-90Q-Instrument mit CDCl&sub3; als Lösungsmittel bestimmt, siehe Fig. 3.
  • 4. Das ¹³C-NMR-Spektrum wurde an einem 90 MHz JEOL FX-90Q Instrument mit CDCl&sub3; als Lösungsmittel bestimmt, siehe Fig. 4 der beigeschlossenen Zeichnungen.
  • 5. Die Massenspektroskopie wurde an einem VG ZAB 3F Instrument unter Anwendung von Elektronenstoß (Electron Impact, EI), chemischer Ionisation (Chemical Ionization, CI) und Ionisierung mit schnellen Atomen (Fast Atom Bombardment, FAB) als Ionisationsmethoden ausgeführt. Das Molekulargewicht wurde mit 242,0857 ermittelt, was einer Molekülformel von C&sub1;&sub1;H&sub1;&sub4;O&sub6;entspricht.
  • Die vorstehenden Daten zusammen mit der chemischen Analyse weisen darauf hin, daß Butalactin die in Formel I gezeigte Struktur aufweist.
  • Butalactin ist gegen gram-positive und grau-negative Bakterien wirksam. Beim Testen mit der Agar-Vertiefungsmethode im antibiotischen Versuchsmedium zeigt es die in der nachfolgenden Tabelle I angegebene Aktivität: TABELLE I Testorganismus Konzentration 1. Staphylococcus aureus 209 P 2. Staphylococcus epidermidis 823 3. Staphylococcus haemolyticus 809 4. Streptococcus faecalis 21777 5. Streptococcus faecalis Eder 6. Escherichia coli 9632 7. Enterobacter cloacae 8. Citrobacter freundii 9. Citrobacter 2046 E 10. Proteus vulgaris 11. Proteus mirabilis 12. Pseudomonas aeruginosa 13. Candida albicans 14. Aspergillus niger *Inhibierungszone in mm
  • Zusätzlich zu seiner antibakteriellen Aktivität inhibiert Butalactin auch die Biosynthese von Sekundärmetaboliten, wie Antibiotika, bei Konzentrationen, die das Wachstum des produzierenden Organismus nicht inhibieren.
  • Die Erfindung wird nachstehend durch bevorzugte Beispiele weiter veranschaulicht, soll jedoch nicht als durch diese Beispiele beschränkt angesehen werden.
    • Beispiel I Isolierung von Streptomyces sp. Y-86,36923 aus dem Boden (a) Herstellung der Isoliernährmedien
  • Medium 1: Glucose . . . 1,0 g
  • Glycerin . . . 1,0 g
  • L-Arginin . . . 0,3 g
  • K&sub2;HPO&sub4; . . . 0,3 g
  • MgSO&sub4;·7H&sub2;O . . . 0,2 g
  • NaCl . . . 0,3 g
  • Hefeextrakt . . . 2,0 g
  • FeSO&sub4;·7H&sub2;O . . . 10,0 mg
  • CuSO&sub4;·5H&sub2;O . . . 1,0 mg
  • ZnSO&sub4;·7H&sub2;O . . . 1,0 mg
  • MnSO&sub4;·7H&sub2;O . . . 1,0 mg
  • Agar . . . 15,0 g
  • destilliertes Wasser . . . 1 l
  • pH . . . 6,5
  • Medium 2: Glucose 2,0 g
  • L-Asparagin 1,0 g
  • K&sub2;HPO&sub4; . . . 0,5 g
  • MgSO&sub4;·7H&sub2;O . . . 0,5 g
  • Bodenextrakt . . . 200 ml
  • Agar . . . 15,0 g
  • destilliertes Wasser . . . 800 ml
  • pH . . . 8,0
  • Medium 3: Stärke . . . 10,0 g
  • Casein . . . 0,3 g
  • KNO&sub3; . . . 2,0 g
  • NaCl . . . 2,0 g
  • K&sub2;HPO&sub4; 2,0 g
  • MgSO&sub4;·7H&sub2;O . . . 0,05 g
  • CaCO&sub3; . . . 0,02 g
  • FeSO&sub4;·7H&sub2;O . . . 0,01 g
  • Agar . . . 15,0 g
  • destilliertes Wasser . . . 1 l
  • pH . . . 7,2-7,5
  • Die Medien wurden 30 Minuten lang bei 121ºC sterilisiert. In allen Fällen wurden die sterilisierten Medien auf 45ºC abgekühlt, in Petrischalen gegossen und erstarren gelassen.
    • (b) Herstellung von Bodensuspensionen
  • 1 g Boden wurde eine Stunde lang in einem Heißluftofen auf 110ºC erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde er in destilliertem Wasser suspendiert und gut geschüttelt. Der Boden wurde absetzen gelassen und die verstehende Flüssigkeit wurde zum Beimpfen jedes der vorstehend erwähnten Medien verwendet.
    • (c) Beimpfung des Isolierungsmediums
  • 1 ml Bodensuspension wurde auf Petrischalen überimpft, die 50 ml eines der vorstehend erwähnten Isolierungsnährmedien enthielten.
    • (d) Isolierung von Streptomyces sp. Y-86,36923
  • Die beimpfte Petrischale wurde 10 Tage lang bei 37ºC inkubiert und Streptomyces sp. Y-86,36923 wurde unter den wachsenden Mikroorganismen isoliert.
    • Beispiel II Kultivierung von Streptomyces sp. Y-86,36923 für die fermentative Herstellung von Butalactin
  • Streptomyces sp. Y-86,36923 wurde auf Hefeextrakt-Malzextrakt mit der folgen den Zusammensetzung gehalten:
  • Malzextrakt . . . 10,0 g
  • Hefeextrakt . . . 4,0 g
  • Glucose . . . 4,0 g
  • Agar . . . 15,0 g
  • destilliertes Wasser . . . 1 l
  • pH . . . 7,0
  • Das Medium wurde auf Teströhrchen verteilt und 30 Minuten bei 121ºC sterilisiert. Die Röhrchen wurden in Schrägstellung abgekühlt, um Schrägagar auszubilden. Die Schrägagarröhrchen wurden mit der Kultur beimpft und 10 bis 15 Tage bei 28ºC inkubiert, wobei eine gute Vermehrung und Sporenbildung beobachtet wurde. Eine Suspension der Sporen in destilliertem Wasser von einer Schrägagarkultur wurde zum Beimpfen von 5 Erlenmeyer-Kolben mit je 500 ml Fassungsvermögen verwendet, die jeweils 100 ml Saatkulturmedium enthielten.
  • Das Saatkulturmedium hat die folgende Zusammensetzung:
  • Glucose . . . 15,0 g
  • Sojabohnenmehl . . . 15,0 g
  • Maisquellwasser . . . 5,0 g
  • CaCO&sub3; . . . 2,0 g
  • NaCl . . . 5,0 g
  • destilliertes Wasser . . . 1 l
  • pH . . . 6,5
  • Das vorstehende Medium wurde in 100 ml-Mengen auf 500 ml Erlenmeyer-Kolben verteilt und 30 Minuten bei 121ºC sterilisiert. Die Kolben wurde gekühlt, mit Sporensuspension oder Mycelpfropfen beimpft und 72 Stunden lang bei 27ºC (± 1ºC) auf einem Rotationsschüttler mit einem Hub von 1,5 Zoll und 240 Umdrehungen pro Minute geschüttelt. Das erhaltene Vermehrungsgut wurde zum Beimpfen von zweihundert 500 ml Kolben verwendet, die jeweils 100 ml des Produktionskulturmediums enthielten, und zwar mit 2 bis 4% (Volumen/Volumen).
    • Zusammensetzung des Produktionsmediums:
  • Glucose . . . 10,0 g
  • lösliche Stärke . . . 10,0 g
  • Malzextrakt . . . 7,5 g
  • Pepton . . . 7,5 g
  • MgSO&sub4;·7H&sub2;O . . . 1,0 g
  • NaCl . . . 3,0 g
  • CuSO&sub4;·5H&sub2;O . . . 7,0 mg
  • FeSO&sub4;·7H&sub2;O . . . 1,0 mg
  • MnCl&sub1;·4H&sub2;O . . . 8,0 mg
  • ZnSO&sub4;·7H&sub2;O . . . 2,0 mg
  • destilliertes Wasser . . . 1 l
  • pH-Wert . . . 6,5
  • Die Fermentation wurde bei 27 (± 1ºC) auf einem Rotationsschüttler mit einem Hub von 1,5 Zoll und 240 Umdrehungen pro Minute ausgeführt. Bei Abbruch der Fermentation nach 45 bis 48 Stunden betrug der Durchmesser der Inhibierungszone gegen Staphylococcus aureus 209 P 16 mm und gegen Escherichia coli 13 mm, wenn das Kulturfiltrat nach der Agar-Vertiefungs-Methode (6 mm Durchmesser) getestet wurde, und der pH-Wert der Kulturflüssigkeit lag im Bereich von 6,8 bis 7,0. Das gepackte Zellvolumen lag bei 20% (Volumen/Volumen). Die das Antibiotikum enthaltende geerntete Kulturbrühe wurde zum Trennen von Mycel und Kulturflüssigkeit zentrifugiert und aufgearbeitet, wie in Beispiel IV beschrieben.
    • Beispiel III Vermehrung von Streptomyces sp. Y-86,36923 für die fermentative Produktion von Butalactin
  • Die Vorgangsweise von Beispiel II wurde mit den folgenden Unterschieden wiederholt:
  • Str. sp. Y-86,36923 wurde auf einem Agarmedium mit der folgenden Zusammensetzung vermehrt:
  • lösliche Stärke . . . 10,0 g
  • K&sub2;PO&sub4; . . . 1,0 g
  • MgSO&sub4;·7H&sub2;O . . . 1,0 g
  • NaCl . . . 1,0 g
  • (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; . . . 2,0 g
  • CaCO&sub3; . . . 2,0 g
  • FeSO&sub4;·7H&sub2;O . . . 0,1 mg
  • MnCl&sub2;·4H&sub2;O . . . 0,1 mg
  • ZnSO&sub4;·7H&sub2;O . . . 0,1 mg
  • Agar . . . 15,0 g
  • destilliertes Wasser . . . 1 l
  • pH . . . 7,2
  • Die Zusammensetzung des Saatkulturmediums ist derjenigen in Beispiel II ähnlich.
    • Zusammensetzung des Produktionsmediums:
  • Glucose . . . 20,0 g
  • Pepton . . . 5,0 g
  • Fleischextrakt . . . 5,0 g
  • CeCO&sub3; . . . 3,0 g
  • destilliertes Wasser . . . 1 l
  • pH . . . 7,0
  • 2 ml Desmophen® wurden als Schaumunterdrücker zugesetzt. 10 l des vorstehend genannten Mediums wurden in einen 15 l-Fermenter überführt. Das Medium wurde durch Direktdampf und Indirektdampf 20 Minuten lang bei 121ºC sterilisiert. Der Fermenter wurde abgekühlt und mit Saatkultur beimpft (9% Volumen/Volumen). Die Fermentation wurde bei 27 (± 1ºC) unter Rührbedingungen bei 120 Umdrehungen je Minute mit einer Belüftung im Ausmaß von 60 bis 70 l je Minute ausgeführt. Bei Beendigung der Fermentation nach 23 bis 27 Stunden lag der pH-Wert der Kulturbrühe bei 7,4, und der Durchmesser der Inhibierungszone gegen Staphylococcus aureus 209 P betrug 22 mm und gegenüber Escherichia coli 14 mm, wenn das Kulturfiltrat nach der Agar-Vertiefungs-Methode getestet wurde (6 mm Durchmesser). Das gepackte Zellvolumen lag bei 15 % (Volumen/Volumen). Die Kulturbrühe wurde wie in Beispiel V aufgearbeitet.
    • Beispiel IV Isolierung und Reinigung von Butalactin
  • Annähernd 16 l des Kulturfiltrats, erhalten aus Beispiel II, wurden zweimal mit jeweils 10 l Etylacetat extrahiert, nachdem der pH-Wert auf 7,0 eingestellt worden war. Die wäßrigen Phasen wurden verworfen und die vereinigten Ethylacetatextrakte wurden unter Vakuum zur Trockene eingedampft. Es wurden etwa 6,4 g Rohextrakt erhalten. Dieser Rohextrakt wurde trocken auf eine 5·20 cm Silicagelsäule (Größe 230-400 mesh) aufgetragen und eluiert, wobei mit einem Petrolether (40 bis 60ºC)/Ethylacetat-Gemisch (1:1) begonnen und mit einer stufenweisen Erhöhung (10%) der Ethylacetatkonzentration bis auf 100% fortgesetzt wurde. Diese Vorgangsweise führte zu 1,7 g Fraktion A, die bei einem Petrolether/Ethylacetat-Gradienten von 1:1 eluiert wurde, und zu 3,2 g Fraktion B, die bei einem Petrolether-Ethylacetat-Gradienten von 3:7 eluiert wurde. Die Fraktion A wurde weiter gereinigt, indem sie auf eine 5·25 cm Silicagelsäule (Größe 230-400 mesh) aufgebracht und mit einem CHCl&sub3;-EtOAc- Gradienten (1:1 bis 3:7) eluiert wurde. Die aktiven Fraktionen, die mit einer CHCl&sub3;-EtOAc-Konzentration von 8:2 erhalten wurden, wurden konzentriert und an einer 2,4·90 cm Sephadex® LH 20-Säule in Methanol chromatographiert und führten zu 400 mg antibiotischer Verbindung. Diese wurde weiter an einer 3·35 cm MPLC-Silicagelsäule (30 u) chromatographiert und mit einem Durchsatz von 10 ml/min mit einem Chloroform bis 2% Methanol in Chloroform-Gradienten stufenweise (0,5%) eluiert. Sobald die Methanolkonzentration zwischen 1 und 1,5% betrug, wurde die aktive Verbindung eluiert und dann eingeengt und führte zu 150 mg einer reinen Verbindung, die als das bekannte Antibiotikum Cineromycin B identifiziert wurde.
  • Die Fraktion B wurde in 3 gleichen Anteilen auf 4,5·45 cm MPLC-Silicagelsäulen (30 u) aufgebracht, die mit einem Petrolether-Ethylacetat-Gradienten (5:5 bis 3:7) eluiert wurden. Die Strömungsgeschwindigkeit wurde auf 15 ml/min gehalten und die Elution wurde mit einem Knauer-UV-Detektor bei 240 nm verfolgt. Das Butalactin wird mit einem Petrolether-Ethylacetat-Gemisch (4:6) eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden unter Vakuum eingeengt und ergaben 650 mg Reinprodukt.
    • Beispiel V Isolierung und Reinigung von Butalactin
  • Die Kulturfiltrate aus zwei Fermenter-Ansätzen, wie in Beispiel III angeführt, wurden vereinigt und ergaben ein Volumen von 17 Liter. Dieses Volumen wurde durch eine Säule geführt, die 1 l Diaion® HP-20 enthielt; die Säule wurde mit 10 l entmineralisiertem Wasser gewaschen und mit 5 l Methanol eluiert. Die aktiven Methanoleluate wurden im Vakuum zur Trockene eingeengt und führten zu 8,8 g Rohprodukt. Dieses Produkt wurde auf zwei 5·25 cm Silicagelsäulen (230-400 mesh) aufgetragen, mit einem Chloroform-Ethylacetat-Gradienten (9:1 bis 3:7) eluiert, unter Ausbildung von zwei aktiven Fraktionen Fraktion A (2,3 g), mit einem Gehalt an Cinercoycin B, die mit Chloroform-Ethylacetat (8:2) eluiert wurde; und Fraktion B (4,3 g), mit einem Gehalt an Butalactin, die mit einem Chloroform/Ethylacetatverhältnis von 5:5 eluiert wurde. Die Fraktion B wurde in zwei Ansätzen durch wiederholte Chromatographle an 5·60 cm Silicagel HPLC-Kolonnen (30 u) mit einem Petrolether-Ethylacetat-Gradienten (von 5:5 bis 3:7) gereinigt. Die Strömungsgeschwindigkeit wurde auf 20 ml/Minute gehalten, die Überwachung der Elution erfolgte mit einem Knauer-UV- Detektor bei 240 nm. Das Konzentrieren der aktiven Eluate, die mit einem Petrolether/Ethylacetatverhältnis von 4:6 erhalten wurden, ergab 550 mg Reinverbindung.

Claims (10)

1. Butalactin, eine Verbindung der Formel I
2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, welches ein Kultivierung von Streptomyces-Spezies Y-86,36923 (DSM 5372), der Mutanten und/oder Varianten hiervon, unter aeroben Bedingungen in einem Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, anorganische Nährsalze und Spurenelemente enthaltenden Nährmedium und ein Isolieren und Reinigen der Verbindung aus der Kulturbrühe in üblicher Weise umfaßt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, worin das Kultivieren bei einer Temperatur zwischen etwa 18 und 40ºC und bei einem pH-Wert zwischen etwa 6 und 9 ausgeführt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, worin das Kultivieren bei 27ºC (± 1ºC) und bei einem pH-Wert von etwa 7,0 ausgeführt wird.
5. Verfahren nach eine oder mehreren der Ansprüche 2 bis 4, worin die Fermentation während 23 bis 48 Stunden ausgeführt wird.
6. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 2 bis 5, worin die Fermentation als Submersfermentation ausgeführt wird.
7. Pharmazeutisches Mittel, welches eine Verbindung nach Anspruch 1 enthält, erforderlichenfalls unter Zusatz von Hilfsmitteln und/oder Exzipientien, die für die Herstellung von pharmazeutischen Mitteln üblich sind.
8. Verwendung der Verbindung nach Anspruch 1 zur Herstellung von pharmazeutischen Mitteln mit antibiotischer Wirkung.
9. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 als biochemischer Regulator in der Kontrolle von antibiotischer Biosynthese.
10. Streptomyces-Spezies Y-86,36923 (DSM 5372).
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