DE68919688T2

DE68919688T2 - Verfahren zur kristallisation von subtilisin.

Info

Publication number: DE68919688T2
Application number: DE68919688T
Authority: DE
Inventors: Todd Becker; Bryan Virgil
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1988-03-18
Filing date: 1989-03-17
Publication date: 1995-04-13
Anticipated expiration: 2009-03-18
Also published as: JP2886921B2; EP0404817A1; JPH03504320A; DE68919688D1; ATE114714T1; EP0404817B1; WO1989008703A1

Description

GEBIET AUF DEM DIE ERFINDUNG LIEGT

Die vorliegende Erfindung betrifft die Enzymgewinnung und Reinigung und insbesondere ein Verfahren zur Reinigung von Subtilisin durch Kristallisation.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Subtilisin ist eine Protease mit einem breiten Anwendungsbereich, wozu gehören die Verwendung in Wäscherei- Detergenzien, bei der Silbergewinnung, bei der Herstellung von Fischmehl und anderen Produkten und Verfahren. Die kristalline Form des Subtilisins ist aus einer Anzahl von Gründen die bevorzugte Form. Kristallines Subtilisin ist von höherer Reinheit als andere Formen des Subtilisins, hergestellt auf anderen Wegen, wie z. B. durch Ausfällung von amorphem Subtilisin. Subtilisinkristalle weisen einen hohen Stabilitätsgrad auf, wie auch eine Flexibilität in der Auswahl von Medien und Formulierungen für verschiedene erwünschte End- Verwendungen. Subtilisin, gleichgültig ob in kristalliner oder in einer durch Ausfällung gewonnenen amorphen Form, kann getrocknet und in verschiedenen granularen oder pulverförmigen Produkten verwendet werden. Es wird jedoch des öfteren gelöst und zu verschiedenen flüssigen Produkten verarbeitet, z. B. in wäßrigen Lösungen, Glyzerin-, Sorbitol- und Propylenglykollösungen usw., zur Verwendung in flüssigen Produkten, oder zur Verwendung bei der Herstellung von flüssigen oder festen Produkten. Auf Grund seiner höheren Reinheit finden kristallines Subtilisin und flüssige Produkte, hergestellt aus der kristallinen Form, eine Anzahl von Verwendungen im Falle höherer Gütestufen, wie beispielsweise im Falle der Verwendung in medizinischen Anwendungsfällen und in Marken- Nahrungsmittelprodukten.
Die Subtilisinkristalle selbst sind rhomboidförmige Plättchen, die gewöhnlich eine Größe von etwa 5 bis etwa 50 Mikron aufweisen. Die Kristalle haben eine Löslichkeit von etwa 4 Gramm pro Liter (g/l) in Wasser, von etwa 8 g/l in Salzlauge und über etwa 500 g/l in Propylenglykol.
Subtilisinkristalle sind erhalten worden durch Fermentation von Bacillus subtilis in praktisch der gleichen Weise, wie Kristalle von anderen Enzymen durch bestimmte Fermentationen gewonnen werden. Eine Fermentationsmischung wird zunächst einer Trennungsstufe unterworfen, in der bakterielle Zellen und suspendierte Feststoffe entfernt werden, unter Bildung einer Lösung oder Brühe, die frei von Feststoffen ist. Die erhaltene Lösung wird oftmals konzentriert, um einen bestimmten Mindest-Konzentrationsgrad des gewünschten Enzymes zu erhalten. Die Kristallisation erfolgt dann gewöhnlich unter Zuhilfenahme von Kristallkeimen, und das hochreine kristalline Produkt wird von der Lösung abgetrennt.
Wie in der Literaturstelle "Preparation And Crystallization Of The Enzymes", von Northrup und Mitarbeitern, Crystalline Enzymes, (1948), Verlag Columbia Vine Press, New York, New York, auf Seiten 253 - 254 diskutiert wird, sind konzentrierte Proteinlösungen, d. h. 1 - 10%-ige Lösungen, wesentlich für eine Proteinkristall-Produktion, da Proteine in verdünnten Proteinlösungen nur sehr schwer, wenn überhaupt, abgetrennt werden können, wohingegen die gleichen Proteine in konzentrierten Lösungen in typischer Weise viel leichter abzutrennen sind. Es ist ferner erforderlich, das Protein ohne Bildung von Niederschlägen, die zu weniger reinen amorphen Formen führen, zu kristallisieren. Die Kristallisation wird durch Einstellung der relativen Konzentrationen von Protein, Salz, Lösungsmittel und/oder organischen Lösungsmitteln in der Lösung induziert. Wichtig ist, daß die Lösung nicht zu stark bezüglich Salz oder Lösungsmittel übersättigt ist, da eine Übersättigung die Bildung der weniger wünschenswerten amorphen Form des Proteins durch Ausfällung begünstigt. Infolgedessen ist eine optimale Bedingung für die Gewinnung eines kristallinen Enzymproduktes eine konzentrierte Salz/ Enzymlösung von sehr geringer Übersättigung.
Derartige optimale Bedingungen einer geringfügigen Übersättigung sind häufig nur schwer zu erreichen, und insbesondere schwierig während der Verarbeitung unter Anwendung üblicher Kristallisationstechniken aufrechtzuerhalten. Genauer gesagt schließt das übliche Verfahren zur Kristallisierung von Enzymen die Zugabe eines Fällungsmittels ein, wie beispielsweise Ammoniumsulfat oder Natriumsulfat, bis sich gerade ein Niederschlag bildet. Jedoch tritt oftmals ein Niederschlag nicht auf, bevor die Lösung zu hoch übersättigt ist, weshalb das Verfahren stets ein Risiko einschließt, daß die amorphe Form des Enzyms durch die Ausfällung erzeugt wird.
Selbst in Fällen, in denen die optimale geringfügige Übersättigung erreicht wird, verändern sich solche idealen Bedingungen rasch in nicht-ideale Bedingungen. Genauer gesagt, verliert die verbleibende Lösung bei Entfernung von Protein aus der Lösung, wenn sich die Kristalle bilden, leicht ihre nahezu Sättigungskonzentration, und es wird immer schwieriger, daß sich mehr Kristalle bilden. Dies führt zu beträchtlichen Verlusten an Proteinprodukt, da ein großer Anteil des Proteins in der überstehenden Flüssigkeit verbleiben kann. Um dies Problem zu überwinden, ist es erforderlich, die Lösungsbedingungen kontinuierlich einzustellen, und zwar durch Zugabe zusätzlicher Mengen von Salzen, derart, daß die Lösung in einem geringfügig übersättigten Zustand gehalten wird, bis nahezu sämtliches Protein aus der Lösung auskristallisiert ist.
Wie sich aus der obigen Diskussion ergibt, sind die zum gegenwärtigen Zeitpunkt bekannten Methoden für die Herstellung von kristallinem Subtilisin oftmals unzuverlässig und schwierig zu steuern. So muß der Fachmann nicht nur in der Lage sein, den Punkt zu bestimmen, bei dem die Subtilisinlösung schwach übersättigt ist, sondern der Fachmann muß auch, wenn die Kristallisation beginnt, das Lösungssystem kontinuierlich einstellen, um die gewünschte Konzentration aufrechtzuerhalten, um Verluste an dem wertvollen Subtilisinprodukt zu vermeiden, und um zu vermeiden, daß zu hoch übersättigte Bedingungen auftreten, und infolgedessen die Bildung der amorphen Form des Subtilisins.
Im Hinblick auf die vorerwähnten Beschränkungen und Nachteile von bekannten enzymatischen Kristallisationstechniken, wie auch anderen hier oben nicht erwähnten Nachteilen, ist offensichtlich, daß ein Bedürfnis nach einem Verfahren zur Reinigung von Subtilisin durch Kristallisation besteht, das nicht abhängt von der Aufrechterhaltung einer geringfügig übersättigten Konzentration der Enzymlösung, damit eine Kristallisation erfolgt, und das eine effektive und zuverlässige Herstellung von kristallinem Subtilisin ermöglicht. Ein Gegenstand dieser Erfindung besteht somit darin, dies Bedürfnis zu befriedrigen, und zwar durch Bereitstellung eines Verfahrens zur Reinigung von Subtilisin-Enzym durch Kristallisation unter Verwendung von Salzen, die eine Kristallisation des Subtilisin-Enzyms induzieren, wenn die Enzymlösung schwach übersättigt ist, unter Vermeidung der Bildung von amorphen Niederschlägen, die sich bilden können, wenn die Subtilisin- Enzymlösung hoch übersättigt ist.
Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Reinigung von Subtilisin-Enzym bereitzustellen durch Kristallisation, bei der die Verwendung von Ammoniumsulfat als Fällungsmittel nicht erforderlich ist, so daß Umweltprobleme und Abfallbeseitigungsprobleme vermieden werden, die bei der Verwendung von Ammoniumsulfat auftreten.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Reinigung von Subtilisin durch Kristallisation mit geringen Rohmaterial- und Verfahrenskosten.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Reinigung von Subtilisin durch Kristallisation mit hohen Ausbeuten und hohen Durchsätzen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Reinigung von Subtilisin durch Kristallisation, bei dem ein Subtilisinprodukt erzeugt wird, das eine hohe Reinheit aufweist und das praktisch frei von Mikroorganismen ist.
Mit den vorstehenden und anderen Gegenständen, Vorteilen und Merkmalen der Erfindung, die sich aus dem folgenden ergeben, läßt sich die Natur der Erfindung eindeutiger verstehen durch Bezugnahme auf die folgende Beschreibung der Erfindung, die beigefügten Ansprüche und die Zeichnungen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Gemäß einem Aspekt wird durch die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Subtilisinkristallen bereitgestellt, das umfaßt:
(i) die Herstellung einer Subtilisinlösung durch Entfernung von Zellen und suspendierten Feststoffen aus einer Fermentationsmischung, erhalten durch Fermentation eines Subtilisin erzeugenden Bakteriums;
(ii) die Herstellung einer konzentrierten Lösung durch Konzentrieren der Subtilisinlösung derart, daß das Subtilisin in einer Konzentration von mindestens etwa 40 g/l vorliegt;
(iii) Zugabe eines Halogenidsalzes in einer Menge, die effektiv ist, um die Bildung von Subtilisinkristallen zu bewirken; und
(iv) die Ermöglichung der Bildung von Kristallen des Subtilisins.
Das Verfahren dieser Erfindung weist verschiedene Vorteile gegenüber dem Stande der Technik auf, einschließlich bstimmter unerwarteter Vorteile im Vergleich zu den Verfahren des Standes der Technik. Zusätzlich zu den Vorteilen, die erfindungsgemäß erreicht werden und die oben angegebenen Gegenstände befriedigen, besteht ein anderer Vorteil, der durch die Verwendung von Halogenidsalzen erreicht wird, die im Rahmen des Verfahrens dieser Erfindung verwendet werden, darin, daß sich die Subtilisinkristalle dann am besten bilden, wenn die Salz/Subtilisinlösung sich nicht nahe dem Sättigungsgrad befindet. Infolgedessen ist es nicht erforderlich (oder sogar wünschenswert), die Konzentration nahe oder geringfügig oberhalb des Sättigungsgrades zu halten. Das vorliegende Verfahren ist leicht durchführbar und zu steuern, da der Salzgehalt aufrechterhalten und eingestellt werden kann über einen breiten, weniger kritischen Bereich während des Verfahrens, ohne daß die Gesamtlösung auf Sättigungsniveau oder nahe Sättigungsniveau gehalten werden muß.
Ein überraschender und unerwarteter Vorteil, der durch die vorliegende Erfindung erreicht wird, besteht darin, daß im Gegensatz zu bekannten Verfahren, selbst dann, wenn die Halogenidsalz/Subtilisinlösung übersättigt wird, beispielsweise durch Zugabe von überschüssigem Salz zur Lösung oder durch Vermindung der Teperatur der Lösung, die amorphe Form des Subtilisins nicht auftritt. Überraschenderweise wird, selbst bei Salzkonzentrationen von so hoch wie 2M oder sogar 4M, nur die kristalline Form des Subtilisins erzeugt, so daß im Einklang hiermit hochreines kristallines Subtilisin über einen breiten Bereich von Verfahrensbedingungen erzeugt wird.
Ein anderer Vorteil, der durch das Verfahen der vorliegenden Erfindung erzielt wird, besteht darin, daß optimale Kristallisationsgrade des Subtilisins normalerweise bei einer Salzkonzentration auftreten, die weit unter Sättigung liegt, z. B. bei 0,05M bis 0,6 M.
Andere Vorteile ergeben sich aus der Flexibilität des Verfahrens dieser Erfindung dadurch, daß das Halogenidsalz zur konzentrierten Subtilisinlösung zugegeben werden kann oder dadurch, daß es zu einem früheren Zeitpunkt des Verfahrens zugegeben werden kann, bevor die Subtilisinlösung konzentriert worden ist. Überdies kann das Halogenidsalz sogar noch früher während des Verfahrens zugesetzt werden, d. h. zur Fermentationsmischung. Das Verfahren ermöglicht dadurch verschiedene Möglichkeiten, je nach der Verfahrensdurchführung, die im Falle der kommerziellen Anwendung des Verfahrens der Erfindung angewandt wird, um kristallines Subtilisin aus der konzentrierten Lösung zu gewinnen. Die Zugabe des Halogenidsalzes zur konzentrierten Lösung kann in manchen Fällen bevorzugt angewandt werden, um eine präzisere Steuerung der Kristallbildung zu erreichen. In anderen Fällen kann es vorteilhafter sein, das Halogenidsalz während des Verfahrens früher zuzusetzen, und zwar insbesondere dann, wenn das Halogenidsalz einen stabilisierenden Effekt auf das Subtilisin ausübt, das verarbeitet wird, wodurch die Gesamtausbeute des Verfahrens erhöht werden kann.
Gemäß einem anderen Aspekt liefert die Erfindung eine Zusammensetzung mit einer Subtilisinlösung, die ein Halogenidsalz in einer Menge enthält, die wirksam ist, um eine Kristallisation von Subtilisin aus der Lösung zu bewirken.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figur 1 ist ein schematisches Diagramm einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens dieser Erfindung.
Figur 2 ist eine graphische Darstellung, welche den Prozentsatz der Kristallgewinnung im Falle verschiedener Konzentrationen an Natriumchlorid und Calciumchlorid veranschaulicht.
Figur 3 ist eine graphische Darstellung, welche die Abhängigkeit des Subtilisinkristallwachstums in Natriumchlorid als Funktion der Zeit darstellt.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG SOWIE AUSFÜHRUNGSFORMEN HIERVON

Die Herstellung von kristallinem Subtilisin gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt durch Herstellung einer Fermentation von B. subtilis, durch Entfernung von Zellen und suspendierten Feststoffen aus der Fermentationsmischung unter Erzeugung einer Subtilisinlösung, durch Konzentrieren der Lösung derart, daß das Subtilisin- Enzym in einer Konzentration von mindestens etwa 40 Gramm pro Liter (g/l) vorliegt, durch Zugabe eines Halogenidsalzes zur konzentrierten Lösung, in einer Menge, die wirksam ist, um Subtilisinkristalle zu bilden, und durch Ermöglichung der Bildung von Kristallen des Subtilisins. Diese Ausführungsform des Verfahrens dieser Erfindung ist in dem in Figur 1 schematisch dargestellten Gesamtverfahren veranschaulicht, das die grundlegenden Stufen der Fermentation eines Subtilisin erzeugenden Bakteriums, die Trennung der Zellen und suspendierten Feststoffe von der Fermentationsmischung, und die Konzentration der erhaltenen Subtilisinlösung bis zu dem gewünschten Grade veranschaulicht. Diese Fermentations-, Trennungs- und Konzentrationsstufen sind allgemein bekannt, und es können konventionelle Methoden in der Praxis angewandt werden in Verbindung mit der Praxis dieser Ausführungsform der Erfindung. Nächstfolgend werden bei dieser Ausführungsform das Halogenidsalz und Kristallkeime zugesetzt, um die Kristallisationsstufe durchzuführen, unter Bildung einer Kristallaufschlämmung. Die Kristalle können dann nach üblichen Filterpressen-Methoden gewonnen und gewaschen werden, um das gewünschte Produkt zu erhalten, das in Form eines trockenen Pulvers oder in Granulatform vorliegen kann oder in der üblicheren Form einer flüssigen Lösung.
Die fermentierte Mischung, die Zellen enthält, verschiedene suspendierte Feststoffe und die gewünschte Lösung des Subtilisinproduktes, wird zunächst behandelt, um derartige Zellen und suspendierte Feststoffe von der Subtilisinlösung abzutrennen. In dieser Hinsicht können übliche Feststoff-Flüssigkeits-Trenntechniken angewandt werden, wie beispielsweise Filtration, Zentrifugation, Mikrofiltration, Rotations-Vakuum-Filtration und dergleichen. Nachdem die Zellen und Feststoffe von der Lösung oder Brühe mit dem gelösten Subtilisin abgetrennt worden sind, wobei das Subtilisin gewöhnlich in einer Konzentration von etwa 3 bis 20 g/l vorliegt, ist es danach erforderlich, das Subtilisin in der Lösung auf eine Konzentration von mindestens etwa 40 g/l, vorzugsweise mindestens etwa 60 g/l und in besonders vorteilhafter Weise auf eine Konzentration von mindestens etwa 80 g/l zu konzentrieren. Konzentrationen von unter etwa 40 g/l sind weniger wünschenswert, da gewöhnlich schlechte oder nicht zufriedenstellende Ausbeuten bei der Kristallisation erhalten werden, während das Verfahren ganz allgemein am besten und mit größter Wirksamkeit bei höheren Konzentrationen arbeitet. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, die höchsten Konzentrationen an Subtilisin zu verwenden, die in der konzentrierten Lösung erhalten werden, die in der Kristallisationsstufe eingesetzt wird. Jedoch sind Konzentrationen über etwa 100 g/l schwierig aus vielen Subtilisinlösungen zu erzielen; der optimale Operationsbereich für die meisten Subtilisinlösungen liegt gewöhnlich bei etwa 90 bis etwa 100 g/l oder darüber, wenn dies praktisch ist. Die Konzentrierung der Lösung kann nach den verschiedensten üblichen Methoden erreicht werden, einschließlich Ultrafiltration, Verdampfung, Extraktion, Chromatographie oder Ausfällung, gefolgt von einer Wiederauflösung. Die Auswahl der Konzentrationstechnik oder des Konzentrationsprozesses, die bzw. der angewandt wird, kann teilweise davon beeeinflußt werden, ob das Halogenidsalz gemäß der Erfindung zugegeben wurde zur Fermentationsmischung oder zu der zu konzentrierenden Lösung.
Im Falle eines bestimmten Satzes von Bedingungen wurde festgestellt, daß die Menge an Subtilisin, das in der Mutterlauge verbleibt, nach Vervollständigung der Kristallisationsstufe, abnimmt, wenn höhere Ausgangskonzentrationen an Subtilisin in der konzentrierten Lösung vorliegen, die der Kristallisationsstufe zugeführt wird. Dies bedeutet, daß umso höher die Ausgangskonzentration des Subtilisins in der konzentrierten Lösung zu Beginn der Kristallisation ist, umso höher ist der Prozentsatz an Gesamtsubtilisin, der durch Kristallisation gewonnen wird, unter Lieferung der höchsten Gesamtausbeuten an kristallinem Subtilisin und den geringsten Verlusten an nicht kristallisiertem Subtilisin, das in der Mutterlauge verbleibt. Beispielsweise erzeugt eine in eine Kristallisiervorrichtung eingespeiste Lösung mit einer Konzentration von 100 g Subtilisin/l nach der Kristallisation etwa 22 % v/v Kristall-Feststoffe in Form einer Aufschlämmung, die in einer Gleichgewichts-Mutterlauge suspendiert ist mit einer Konzentration von etwa 15 g/l verbleibendem Subtilisin, was zu einer maximalen Gewinnung von etwa 100 - (100-22) (15/100) oder einer Gesamtausbeute von 88,3 % führt. Zum Vergleich führt eine Einspeislösung mit einer Konzentration von 80 g Subtilisin/l zu etwa 20 % v/v Kristall- Feststoffen in der Kristallisationsstufe in einer Gleichgewichts-Mutterlauge mit einer Konzentration von etwa 18 g/l verbleibendem Subtilisin, was einer maximalen Gewinnung von etwa 100 - (100-20) (18/80) oder einer Gesamtausbeute von 82 % führt.
Die Kristallisation von Subtilisin aus der konzentrierten Lösung wird erreicht durch Zugabe einer Menge eines Halogenidsalzes, die effektiv ist, um die Bildung von Subtilisinkristallen zu bewirken. Zu den Halogenidsalzen, die erfindungsgemäß geeignet sind, gehören Natriumchlorid, Calciumchlorid, Natriumbromid, Natriumiodid, Kaliumchlorid, Kaliumiodid, Natriumfluorid und andere Halogenidsalze und Mischungen hiervon, die mit dem zu kristallisierenden Subtilisin verträglich sind. Die Halogenidsalze, die zum gegenwärtigen Zeitpunkt für den praktischen Gebrauch am geeignetsten sind, sind Natriumchlorid und Calciumchlorid. Die Menge an Halogenidsalz, welche wirksam ist, um die Bildung von Subtilisinkristallen herbeizuführen, hängt von dem speziellen Subtilisin in der Lösung ab, von anderen in der Lösung vorhandenen Materialien, von der Konzentration des Subtilisins in der Lösung, wie auch von dem speziellen Halogenidsalz oder den speziellen verwendeten Halogenidsalzen. Die Auswahl von einer mindestens wirksamen Menge und einer optimalen Menge von Halogenidsalz für das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist für den Fachmann bei Beachtung dieser Faktoren bei Befolgung der Lehre der vorliegenden Erfindung möglich. Im allgemeinen sollte die Salzkonzentration bei mindestens etwa 0,01M (10mM) liegen, vorzugsweise bei etwa 0,01 bis etwa 2M, und in besonders vorteilhafter Weise bei etwa 0,02 bis etwa 1,5M und in ganz besonders vorteilhafter Weise bei etwa 0,03 bis etwa 1M. Optimale Bereiche für einige Lösungs/Salzkombinationen liegen im Bereich bei etwa 0,02 bis etwa 0,18M, während andere im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 0,7M liegen. Diese Mengen oder Konzentrationen an Salz sind in gleicher Weise auf die Zusammensetzung dieser Erfindung anwendbar und effektiv bezüglich der Bewirkung einer Kristallisation von Subtilisin aus der Lösung.
Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, daß die Halogenidsalze, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, eine Kristallisation von Subtilisin in einer Weise induzieren, die verschieden ist von klassischen Fällungsmitteln für Subtilisin, wie z. B. Ammoniumsulfat. Spezieller ausgedrückt induzieren Fällungsmittel, wie Ammoniumsulfat die Kristallisation der Subtilisinkristalle, wenn die Konzentration der Lösung nahe Sättigungsniveau liegt. Bei höheren Konzentrationen können sie zur Ausfällung von amorphem Subtilisin führen. Im Gegensatz zu klassischen Fällungsmitteln induzieren die Halogenidsalze, die gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, die Kristallisation von Subtilisin bei einer relativ niedrigen Salzkonzentration. Überdies induziert, wie oben erwähnt, die Verwendung von Halogenidsalzen gemäß dieser Erfindung nicht die Ausfällung der amorphen Form von Subtilisin, und zwar selbst bei Salzkonzentrationen nicht, die so hoch wie 2M oder sogar 4M sind. Bei sehr hohen Salzkonzentrationen fällt die Kristallisation von Subtilisin ab, doch wird lediglich kristallines Subtilisin erzeugt, und es wird kein amorphes Subtilisin ausgefällt. Diese Erfindung beseitigt das Risiko der Ausfällung der amorphen Form von Subtilisin. Wie oben bemerkt, tritt beim Verfahren der vorliegenden Erfindung eine optimale Kristallisation bei niedrigeren Salzkonzentrationen auf, während die Gesamtausbeuten bei sehr hohen Salzkonzentrationen niedriger sind.
Während ansteigende Konzentrationen an üblichen Fällungsmitteln möglicherweise eine Ausfällung von amorphen Subtilisinniederschlägen verursachen, induziert eine Erhöhung der Konzentrationen an Halogenidsalzen der vorliegenden Erfindung eine steigende Kristallbildung bis zu einem optimalen Punkt, worauf ein allmählicher Abfall der Kristallbildung jenseits dieses Punktes auftritt. Unter Bezugnahme auf Figur 2 ist ersichtlich, daß eine maximale Kristallgewinnung im Falle von Natriumchlorid bei etwa 200 - 600 mM auftritt und im Falle von Calciumchlorid bei etwa 50 - 200 mM, welches optimale Salzkonzentrationsbereiche für diese speziellen Salze sind, um die beste Ausbeute an kristallisiertem Subtilisin zu erreichen. Die Daten in Figur 2 beruhen auf einer Beschickung mit einem Ultrafiltrationskonzentrat (konzentriert auf 80 g Subtilisin/l), das einer Diafiltration unterworfen wurde mit vier Volumina von deionisiertem Wasser zur Entfernung von Salzen vor der Zugabe des Halogenidsalzes und von Kristallisationskeimen. Wie Figur 2 entnehmbar ist, führt Natriumchlorid zu einer höheren möglichen Ausbeute über einen breiten optimalen Operationsbereich und ist infolgedessen ein bevorzugtes Salz für die Durchführung des Verfahrens dieser Erfindung. Jenseits dieser optimalen Bereiche im Falle dieser speziellen Salze nimmt die prozentuale Gewinnung an kristallisiertem Subtilisin ab. Jedoch wurde die Bildung von amorphen Niederschlägen von Subtilisin nicht bei beliebigen Konzentrationen dieser Salze beobachtet. Die optimale Konzentration von Natriumchlorid kann zwischen etwa 200 und etwa 600 mM liegen und liegt vorzugsweise zwischen etwa 400 und etwa 500 mM, das etwa 1,2 % bis 3,5 % und vorzugsweise etwa 2,3 % bis etwa 2,9 % entspricht. Die Konzentration an Calciumchlorid kann zwischen etwa 50 und etwa 200 mM und vorzugsweise zwischen etwa 100 und etwa 150 mM liegen, das etwa 0,7 % bis etwa 2,9 % und vorzugsweise etwa 1,5 % bis etwa 2,2 % entspricht.
Obgleich nicht erforderlich, werden Subtilisin- Kristallkeime vorzugsweise in einer Menge bis zu etwa 10 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht der Lösung, zugesetzt, um den Kristallisationsprozeß zu fördern. Die Verwendung von Kristallkeimen verbessert die Kinetik der Kristallisation und scheint die Gesamtausbeute an kristallinem Subtilisin zu erhöhen. Die Keimbildung kann ferner gefördert werden, indem Kristallisationsgefäße verwendet werden, die Oberflächeneigenschaften aufweisen, die für die Kristallisation förderlich sind, wobei diese Eigenschaften dem Fachmann bekannt sind. Die Verwendung der Minimummenge, jedoch effektiven Menge an Kristallkeimen für eine bestimmte Subtilisinlösung, die Größe der Operation, Verfahrensbedingungen usw. sind für den Fachmann offensichtlich, wie im Falle von üblichen Kristallisationsverfahren. Auch wirken, wenn dies Verfahren in Form eines kontinuierlichen Verfahrens durchgeführt wird, die in der Kristallisiervorrichtung vorhandenen Kristalle als Kristallkeime für frische konzentrierte Lösung, die in die Kristallisiervorrichtung eingespeist wird.
Ein Kristallwachstum wird gewöhnlich weiter gefördert durch eine schwache oder vorsichtige Bewegung der Kristallisiervorrichtung. Der Fachmann wird ferner erkennen, daß jegliches Material, das eine Kristallisation zu inhibieren vermag, wie z. B. Propylenglykol, Natriumformiat, Natriumsulfat usw. den Lösungen des Verfahrens dieser Erfindung nicht zugegeben werden soll, bis der erwünschte Kristallisationsgrad erzielt worden ist.
Die Temperatur während der Kristallisation sollte im allgemeinen zwischen etwa 1 und etwa 10ºC und vorzugsweise zwischen etwa 3 und etwa 5ºC liegen. Der pH-Wert, bei dem die Kristallisation durchgeführt wird, hängt von der Spezies des Enzyms ab, sollte jedoch in einem Bereich liegen, in dem das Enzym stabil ist, z. B. sollte der pH-Wert im Falle von Natriumchlorid und B. amyloliquefaciens-Subtilisin im allgemeinen bei etwa 5,2 bis 5,8 und vorzugsweise zwischen 5,3 und 5,6 liegen. Bei pH-Werten unterhalb etwa 5,2 oder oberhalb etwa 5,8 kann das Subtilisin instabil sein. Die Zeitspanne, die erforderlich ist, damit das Kristallisationsverfahren praktisch vollständig abläuft oder das erwünschte Gleichgewicht erreicht, hängt natürlich nicht nur von den verschiedenen Verfahrensbedingungen ab, sondern auch, ob Kristallkeime zugesetzt wurden oder nicht. Werden keine Kristallkeime verwendet, so werden in typischer Weise etwa 48 Stunden benötigt, um ein Gleichgewicht zu erreichen, was einer verbleibenden Subtilisinkonzentration in der Lösung von unterhalb etwa 20 g/l entspricht. Werden Kristallkeime verwendet, so wird die Zeitspanne in typischer Weise auf weniger als etwa 18 Stunden vermindert, um das gleiche Gleichgewicht zu erreichen.
Figur 3 veranschaulicht eine typische Kristallisations-Zeitkurve für Subtilisin, kristallisiert aus einer konzentrierten Lösung mit etwa 80 g Subtilisin/l, in welchem Falle Natriumchlorid zur konzentrierten Lösung als Fällungssalz zugegeben wurde, und in welchem Falle Kristallkeime verwendet wurden. Der Grad an zusätzlichem Kristallwachstum nach etwa 16 Stunden war unwesentlich.
Nachdem die Kristallisation im wesentlichen vollständig abgelaufen ist, können übliche Kristallgewinnungstechniken angewandt werden. Dies bedeutet, daß das Produkt aus der die Kristalle enthaltenden Aufschlämmung durch Zentrifugieren, Sedimentieren oder durch Filtration gewonnen werden kann. Alternativ kann die Aufschlämmung als Ausgangsmaterial für ein Verfahren zur Herstellung eines festen Produktes eingesetzt werden.
Die allgemein bekannten Techniken, die zu einer Gewinnung des Produktes in großem Maßstab eingesetzt werden können, sind eine Feststoff-Tank-Zentrifugation und Filtration in einer Platten-Rahmen-Filterpresse. Im Falle beider Techniken wird die Kristallaufschlämmung zunächst mit Wasser verdünnt, um die Viskosität zu reduzieren und um die Trennung von der Mutterlauge zu steigern. Im Falle des Zentrifugations- Verfahrens werden die Kristalle in Form eines dichten Kuchens innerhalb des Tanks erhalten, und der Kuchen wird dann durch Resuspendierung in Wasser und Rezentrifugierung gewaschen. Der erhaltene Kuchen wird in typischer Weise in einer Zusammensetzung gelöst, die Propylenglykol, Natriumformiat und Wasser enthält, um Subtilisin in einer wünschenswerten Form eines flüssigen Produktes zu erhalten.
Im Falle des Filterpressen-Gewinnungsverfahrens wird zunächst ein Filterhilfsmittel zur verdünnten Kristallaufschlämmung zugegeben, worauf diese Mischung in eine vorbeschichtete Platten-Rahmen-Filterpresse gepumpt wird. Das von Kristallen freie Mutterlaugenfiltrat wird abgetrennt. Mehrere Volumina Wasser oder Pufferlösung können dann durch die Presse gepumpt werden, wodurch die Kristalle wirksam gewaschen werden, unter geeigneten Plug-Flow-Bedingungen. Sind die Strömungsgeschwindigkeiten einer Waschpufferlösung hoch genug, so ist der Grad an enzymatischem Aktivitätsverlust unbedeutend auf Grund der niedrigen Löslichkeit (3 - 8 g/l) der Proteasekristalle in Wasser. Das kristalline Enzym wird mit einem Puffer, enthaltend Propylenglykol, Natriumformiat und Wasser gewonnen. Diese Chemikalien führen in Kombination mit einer wirksamen Wäsche des Kristallkuchens zu sehr niedrigen Mikroorganismus-Belastungen im Produkt.
Die folgenden Beispiele sollen das erfindungsgemäße Verfahren veranschaulichen und sind in keiner Weise als den Gegenstand des beanspruchten Verfahrens beschränkend zu verstehen.

Beispiel 1

Eine Mischung von B. amyloliquifaciens-Subtilisin, hergestellt durch Fermentation von B. subtilis, wurde filtriert, um Zellen und suspendierte Feststoffe zu entfernen, unter Gewinnung einer partiell konzentrierten Brühe oder Lösung von Subtilisin, die mittels einer 900 ml Pharmacia "Sephadex" G-25 Kolonne entsalzt und mit 14 mM (0,206 %) Calciumchloriddihydrat auf ein Gleichgewicht eingestellt wurde. Die ursprüngliche Brühe hatte eine Leitfähigkeit von 44 mS/cm, jedoch fiel die Leitfähigkeit nach der Entsalzung auf 3,9 mS/cm ab. Die Lösung wurde mit Wasser von 15,8 g/l auf 12,3 g/l Subtilisin verdünnt und dann unter Rühren in Amicon UF-Zellen unter Gewinnung von Konzentraten mit etwa 65 g/l Subtilisin-Enzym konzentriert. Proben von 1 ml des Konzentrates wurden matrixweise mit verschiedenen Mengen an Natriumchlorid und Calciumchlorid in Mikroschmelzröhrchen kombiniert, die in ein Eisbad gebracht wurden, und den Proben wurde ermöglicht, daß sie sich ohne Rühren absetzen konnten.
Die Mikroschmelzröhrchen mit dem kristallisierten Subtilisin wurden in einer klinischen Zentrifuge bei etwa 5000 Umdrehungen pro Minute 4 - 5 Minuten lang geschleudert, und die überstehende Flüssigkeit wurde mittels einer Pasteur- Pipette dekantiert. Die Pellets wurden zunächst in 100 % Propylenglykol aufgenommen, worauf genügend 14 mM wäßriges CaCl&sub2; zugegeben wurde, um eine Gesamtkonzentration von 20 % Propylenglykol einzustellen. Die Volumina von überstehender Flüssigkeit und der Pellets wurden ausgewogen.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt. TABELLE Pellet-Gewinnung von kristallinem Subtilisin aus einer Lösung, die 65 g Subtilisin/l enthielt, unter Verwendung von NaCl oder CaCl&sub2; als Fällungsmittel Fällungsmittel Fällungsmittel-Konzentration (mM) % Gesamt-Subtilisin, das im Pellet gewonnen wurde
In der obigen Tabelle bedeutet ein (-), daß keine ins Gewicht fallende Gewinnung an Kristallisationsprodukt erfolgte.
Das obige Beispiel zeigt, daß die optimalen Konzentrationen an Natriumchlorid und Calciumchlorid in diesem Falle bei etwa 500 mM bzw. etwa 250 mM lagen.

Beispiel 2

Eine Enzym-Variante der B. amyloliquilofaciens- Protease (hergestellt durch Substitution der Aminosäure Leucin in der Position 217 im Subtilisinmolekül) wurde fermentiert, filtriert, konzentriert und nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 beschrieben kristallisiert.
Eine zellfreie Lösung der Protease wurde in diesem Falle durch Ultrafiltration auf 69 g Subtilisin/l konzentriert. Es wurden unterschiedliche Konzentrationen an Natriumchlorid und natürlichen Enzym-Kristallkeimen zum Konzentrat zugegeben, wobei die folgenden Ausbeuten an Kristallen des modifizierten Enzyms erhalten wurden: % v/v zugesetzte Keime NaCl (mM) % Gewonnene Aktivität

Beispiel 3

Eine Subtilisinlösung von einer Ultrafiltration wurde auf 99 g/l konzentriert. Verschiedene Halogenidsalze wurden in Konzentrationen von 400 mM zu der üblichen Lösung zugegeben, und ferner wurde 1 % v/v an Enzym-Kristallkeimen zugesetzt. Die erzielten Kristallausbeuten nach einer 6-tägigen Inkubation bei 4ºC waren wie folgt: % Feststoffe Salz % Feststoffe bei l Tag % Aktivität bei 6 Tagen Gewonnen ohne
Obgleich lediglich bevorzugte Ausführungsformen besonders veranschaulicht und hier beschrieben wurden, ist offensichtlich, daß viele Veränderungen und Variationen der vorliegenden Erfindung im Lichte der obigen Lehren möglich sind und innerhalb des Wirkungsbereiches der beigefügten Ansprüche, ohne daß vom Inhalt und Bereich der Erfindung abgewichen wird.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Subtilisinkristallen, bei dem man:

(i) eine Subtilisinlösung herstellt durch Entfernung von Zellen und suspendierten Feststoffen aus einer Fermentationsmischung, erhalten durch Fermentation eines Subtilisin erzeugenden Bakteriums;

(ii) eine konzentrierte Lösung herstellt durch Konzentration der Subtilisinlösung derart, daß das Subtilisin in einer Konzentration von mindestens etwa 40 g/l vorliegt;

(iii) ein Halogenidsalz in einer Menge zusetzt, die effektiv ist, um die Bildung von Subtilisinkristallen zu bewirken; und bei dem man

(iv) die Bildung von Subtilisinkristallen ermöglicht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem Halogenidsalz zur Fermentationsmischung zugesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem Halogenidsalz zur Subtilisinlösung zugegeben wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem Halogenidsalz zur konzentrierten Lösung zugegeben wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Konzentrationsstufe (ii) in der Weise durchgeführt wird, daß die Konzentration des Subtilisins mindestens etwa 80 g/l beträgt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Salz Natriumchlorid oder Calciumchlorid ist.

7. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem das Salz Natriumchlorid ist und zugegeben wird, um eine Lösung mit etwa 400 bis etwa 500 mM Natriumchlorid zu bilden.

8. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem das Salz Calciumchlorid ist und zugegeben wird, um eine Lösung mit etwa 50 bis etwa 200 mM Calciumchlorid zu bilden.

9. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem weiterhin Impfkristalle von Subtilisin zu der konzentrierten Lösung zugegeben werden.

10. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Stufe (iii) der Bildung von Subtilisinkristallen bei einem pH-Wert zwischen etwa 5,2 und etwa 5,8 durchgeführt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Bakterium ein Bazillus ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem der Bazillus B. subtilis ist.

13. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die Konzentration an Subtilisin zwischen etwa 80 und etwa 100 g/l liegt.

14. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Salz Natriumiodid, Kaliumchlorid oder Kaliumiodid ist.

15. Verfahren zur Reinigung von Subtilisin, bei dem man ein Halogenidsalz zu einer Subtilisinlösung zugibt, wobei die Menge an Halogenidsalz eine Menge ist, die wirksam ist, um die Kristallisation von Subtilisin aus der Lösung zu bewirken.

16. Verfahren nach Anspruch 15, bei dem man weiterhin eine konzentrierte Subtilisinlösung erzeugt mit einer Subtilisinkonzentration von mindestens etwa 40 g/l.

17. Verfahren nach Anspruch 15, bei dem die Halogenidsalzkonzentration in der Lösung bei etwa 0,01 bis etwa 2M liegt, und die Subtilisinkonzentration in der Lösung bei mindestens etwa 40 g/l.

18. Zusammensetzung, die eine Subtilisinlösung umfaßt, die ein Halogenidsalz in einer Menge enthält, die wirksam ist, um die Kristallisation von Subtilisin aus der Lösung zu bewirken.

19. Zusammensetzung nach Anspruch 18, in der die Salzkonzentration in der Lösung bei etwa 0,01 bis etwa 2M liegt, und die Subtilisinkonzentration in der Lösung bei mindestens etwa 40 g/l.