DE69833758T2 - Verfahren zur erkennung von genpolymorphismen und allelexpression unter verwendung von sondenchips - Google Patents

Verfahren zur erkennung von genpolymorphismen und allelexpression unter verwendung von sondenchips Download PDF

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    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/911—Microorganisms using fungi

Description

    • Die vorliegende Anmeldung weist eine Priorität der USSN 60/049,612, eingereicht am 13. Juni 1987 auf.
  • HINTERGRUND
  • Die Genome aller Organismen werden im Verlauf ihrer kontinuierlichen Evolution spontanen Mutationen unterzogen, welche Varianten-Formen von Progenitor-Sequenzen (Gusella, Ann. Rev. Biochem. 55, 831–854 (1986)) erzeugen. In einigen Fällen wird eine Variantenform einen tödlichen Nachteil verleihen und nicht auf nachfolgende Generationen des Organismus übertragen werden. In anderen Fällen verleiht eine Variantenform einen evolutionären Vorteil für die Spezies und wird evtl. in die DNA von vielen oder den meisten Mitgliedern der Spezies eingebracht und wird effektiv die Progenitor-Form. In vielen Fällen überleben sowohl Progenitor- als auch Variantenform(en) und koexistieren in einer Spezies-Population. Die Koexistenz von multiplen Formen einer Sequenz führt zu Polymorphismen.
  • Von verschiedenen, unterschiedlichen Typen von Polymorphismen wurden berichtet. Ein Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus (RFLP) bedeutet eine Variation in der DNA-Sequenz, welche die Länge eines Restriktionsfragments verändert; dies wird beschrieben in Botsein et al. Am. J. Hum. Genet. 32, 314–331 (1980). Andere Polymorphismen nehmen die Form von kurzen Tandem-Wiederholungen (short tandem repeats (STRs)) ein, welche Di-Tri- und Tetra-Nukleotid-Wiederholungsmotive einschließen. Solche Polymorphismen nehmen die Form von Einzel-Nukleotidvarianten zwischen den Individuen der gleichen Spezies ein. Solche Polymorphismen sind weit häufiger als RFLPs, STRs und VNTRs. Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (single nucleotide polymorphisms) können irgendwo in proteinkodierenden Sequenzen auftreten, in Intron-Sequenzen, regulatorischen Sequenzen, oder intergenomischen Regionen.
  • Viele Polymorphismen haben wahrscheinlich wenig oder eine phenotypische Wirkung. Einige Polymorphismen, im Prinzip diejenigen, die innerhalb von kodierten Sequenzen auftreten, sind als direkte Ursache von ernsthaften genetischen Erkrankungen bekannt, wie z.B. Sichelzell-Anemie.
  • Polymorphismen, welche innerhalb einer kodierenden Sequenz auftreten, üben ihre phenotypische Wirkung durch Führen zu einem verkürzten oder einem veränderten Expressionsprodukt aus. Andere Polymorphismen, insbesondere diejenigen, in Promotorregionen und anderen regulatorischen Sequenzen, können den Bereich einer Erkrankungs-Empfänglichkeit beeinflussen, Verhaltensweisen und andere Phenotypmerkmale, und zwar durch ihre Wirkung auf Gen-Expressionsspiegel. Das heißt, solche Polymorphismen können zu erhöhten und verminderten Spiegel der Genexpression führen, ohne dass sie notwendigerweise die Natur des Expressionsprodukts beeinträchtigen.
  • Chee et al. Science 274(25), 610–614 (1996) stellt die Verwendung von Oligonukleotidarrays allgemein dar. Eine dieser Anwendungen betrifft genomische Polymorphismen. Eine andere Anwendung ist zum Vergleich der Expressionspiegel von Genen zwischen Proben. Lockhart et al., Nature Biotechnology 14(13), 1675–1680 (1996) ist ein anderer Artikel, welcher die Verwendung von Arrays zum Vergleich von Expressionsspiegeln von Genen zwischen Proben diskutiert. Guo et al., Nucleic Acids Research 22(24), 5456–5465 (1994) ist ein weiterer Artikel, welcher die Verwendung von Arrays, um genomische Polymorphismen zu detektieren, diskutiert. Vervoort et al., Am. J. of Human Genetics 58, 457–471 (1996) diskutiert Experimente, in welchen verschiedene Mutanten des Beta-Glucuronidase-Gens identifiziert werden und in welchem Expressionsspiegel auf der Proteinebene gemessen werden. Kashiwagi et al., Thrombosis and Haemostasis 74(2), 758–763 (1995) weist verschiedene Allel-Formen eines Gens in mRNA nach, wobei die verschiedenen Formen unterschieden werden durch verschiede Restriktionsmuster aufgrund des Verlusts einer Restriktionsschnittstelle auf einem Allel. Orkin et al., Nucleic Research 11(14), 4727–4734 (1983) identifiziert eine homozygote Mutation in der Promotorregion eines Gens und charakterisiert dann die Wirkung der Mutation auf die Expression.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung stellt Verfahren zum Überwachen der Expressionsspiegel von verschiedenen polymorphen Formen eines Gens zur Verfügung, umfassend
    • (a) Hybridisieren genomischer DNA oder eines Amplifikationsproduktes davon aus einem Individuum mit einer ersten Sonden- Gruppe umfassend eine oder mehrere Sonden, exakt komplementär zu einer ersten polymorphen Form des Gens, und einer zweiten Sonden- Gruppe umfassend eine oder mehrere Sonden, exakt komplementär zu einer zweiten polymorphen Form des Gens, um das Vorliegen von heterozygoten polymorphen Formen an einer polymorphen Stelle innerhalb einer transkribierten Sequenz eines Gens von Interesse zu bestimmen;
    • (b) Hybridisieren von RNA oder einem Amplifikationsprodukt davon, aus einem Gewebe des Individuums, in welchem das Gen exprimiert wird, mit den ersten und zweiten Sondengruppen;
    • (c) Vergleichen einer genomischen DNA-Hybridisierungs-Intensität der ersten Sondengruppe mit der zweiten Sondengruppe, um ein genomisches Hybridisierungs-Verhältnis zu bestimmen, und Vergleichen einer RNA-Hybridisierungsintensität der ersten Gruppe mit der zweiten Gruppe, um ein RNA-Hybridisierungs-Verhältnis zu bestimmen, wobei ein Unterschied in den genomischen DNA- und RNA-Verhältnissen anzeigt, dass die polymorphen Formen des Gens in verschiedenen Spiegeln im Individuum exprimiert werden.
  • Folglich bringen solche Verfahren das Analysieren der genomischen DNA aus einem Individuum mit sich, um das Vorliegen von heterozygoten polymorphen Formen an einer polymorphen Stelle innerhalb einer transkribierten Sequenz eines betrachteten Gens zu bestimmen. RNA aus einem Gewebe des Individuums, in welchem das Gen exprimiert wird, wird dann analysiert, um die relativen Anteile der polymorphen Formen im Transkript des Gens zu bestimmen.
  • In einigen Verfahren wird die genomische DNA durch das Amplifizieren eines Segments von genomischer DNA aus einer Probe analysiert und durch Hybridisieren der amplifizierten genomischen DNA mit einem Array von immobilisierten Sonden. In einigen Verfahren werden die Arrays zum Analysieren von genomischer DNA verwendet und sie umfassen eine erste Sondengruppe umfassend eine oder mehrere Sonden, welche exakt komplementär mit einer ersten polymorphen Form des Gens sind und eine zweite Sondengruppe umfassend eine oder mehrere Sonden, welche exakt komplementär mit einer zweiten polymorphen Form des Gens sind. In einigen Verfahren wird die RNA durch reverse Transkription analysiert bzw. durch Amplifizieren der mRNA, welche aus dem Gen exprimiert wird, um eine amplifizierte Nukleinsäure zu erzeugen sowie durch Hybridisieren der amplifizierten Nukleinsäure mit einem Array von immobilisierten Sonden. In einigen solcher Verfahren ist die Nukleinsäure eine cDNA. In einigen Verfahren umfasst das Array von immobilisierten Sonden zum Analysieren von RNA eine erste Sondengruppe umfassend eine oder mehrere Sonden, welche exakt komplementär zu einer ersten polymorphen Form des Gens ist und eine zweite Sondengruppe umfassend eine oder mehrere Sonden, welche exakt komplementär zu einer zweiten polymorphen Form des Gens ist.
  • In einigen Verfahren werden genomische DNA und die RNA analysiert durch Hybridisieren der genomischen DNA oder eines Amplifikationsproduktes davon und der RNA oder des Amplifikationsproduktes davon an dasselbe Array von immobilisierten Sonden, umfassend eine erste Sondengruppe umfassend eine oder mehrere Sonden, exakt komplementär zu einer ersten polymorphen Form des Gens und eine zweite Sondengruppe umfassend eine oder mehrere Sonden, exakt komplementär zu einer zweiten polymorphen Form des Gens.
  • In einigen Verfahren tragen genomische DNA oder das Amplifikationsprodukt, und die RNA oder das Amplifikationsprodukt, verschiedene Label und werden gleichzeitig mit dem Array hybridisiert.
  • Die Verfahren der Erfindung umfassen das Vergleichen einer genomischen DNA-Hybridisierungs-Intensität der ersten Sondengruppe mit der zweiten Sondengruppe, um ein genomisches Hybridisierungsverhältnis zu bestimmen, sowie das Vergleichen einer RNA-Hybridisierungsintensität der ersten Gruppe mit der zweiten Gruppe, um ein RNA-Hybridisierungsverhältnis zu bestimmen, wobei der Unterschied der genomischen DNA- und RNA-Verhältnisse anzeigt, dass die polymorphen Formen der Gene in verschiedenen Spiegeln in dem Individuum exprimiert werden.
  • Einige Verfahren umfassen des weiteren das Sequenzieren einer nicht transkribierten Region des Gens, um eine zweite polymorphe Stelle in einem Promotor oder einer Enhancer-Region des Gens zu identifizieren.
  • Die Erfindung stellt des weiteren Verfahren zum Überwachen von Expressionsspiegeln verschiedener polymorpher Formen einer Kollektion von Genen zur Verfügung. In solchen Verfahren wird die genomische DNA oder ein Amplifikationsprodukt davon von einem Individuum mit einem Array von immobilisierten Sonden hybridisiert, umfassend ein Sub-Array von Sonden für jedes Gen in der Sammlung, wobei jedes Sub-Array eine erste Gruppe von einer oder mehreren Sonden umfasst, welche exakt komplementär zu einer ersten polymorphen Form des Gens sind, sowie eine zweite Gruppe von einer oder mehreren Sonden, exakt komplementär zu einer zweiten polymorphen Form des Gens. Die relative Hybridisierung der ersten und zweiten Gruppe von Sonden mit der genomischen DNA oder mit dem Amplifikationsprodukt davon werden für jedes Sub-Array analysiert, um heterozygote Gene in dem Individuum zu identifizieren. RNA oder ein Amplifikationsprodukt davon von dem Individuum wird hybridisiert mit dem Array von immobilisierten Sonden. Die Hybridisierungsintensitäten der ersten und zweiten Gruppen von Sonden mit der RNA oder dem Amplifikationsprodukt werden verglichen, um eine Untergruppe der heterozygoten Gene zu identifizieren, für welche unterschiedliche polymorphe Formen in verschiedenen Spiegeln exprimiert werden. Solche Verfahren können durchgeführt werden, um große Kollektionen von Genen, beispielsweise 100, 1000 oder 100.000 zu screenen. Einige solcher Verfahren umfassen des weiteren das Sequenzieren einer nicht transkribierten Region eines Gens in der Untergruppe, um einen weiteren Polymorphismus in einem Promotor, Enhancer oder einer Intron-Sequenz des Gens zu bestimmen.
  • DEFINITIONEN
  • Eine Nukleinsäure ist ein Deoxyribonukleotid- und ein Ribonukleotid-Polymer, entweder in einzel- oder doppelsträngiger Form, einschließend bekannte Analoge von natürlichen Nukleotiden, solange nichts anderes angegeben wird.
  • Ein Oligonukleotid ist eine einzelsträngige Nukleinsäure, welche von ungefähr 2 bis 500 Basen an Länge reicht. Oligonukleotide werden häufig synthetisch hergestellt, können aber auch aus natürlich auftretenden Polynukleotiden erzeugt werden.
  • Eine Sonde ist ein Oligonukleotid, welches in der Lage ist, an eine Target-Nukleinsäure der komplementären Sequenz durch eine oder mehrere Typen an chemischen Bindungen zu binden, üblicherweise durch komplementäres Basenpaaren, üblicherweise durch Ausbildung von Wasserstoffbrücken.
  • Oligonukleotid-Sonden sind häufig 10–50 oder 15–30 Basen lang.
  • Eine Oligonukleotidsonde kann natürliche (d.h. A, G, C oder T) oder modifizierte Basen (7-Deazaguanosin, Inosin, etc.) einschließen. Darüber hinaus können die Basen in der Oligonukleotidsonde durch einen Spacer verknüpft sein, welcher von einer Phosphodiesterbindung verschieden ist, solange diese nicht mit der Hybridisierung wechselwirkt. Folglich können die Oligonukleotid-Sonden Peptid-Nukleinsäuren sein, in welchen die konstituierenden Basen durch Peptidbindungen verknüpft sind, anstelle der Phosphodiester-Verknüpfungen.
  • Spezifische Hybridisierung bezieht sich auf das Binden, Verdoppeln oder Hybridisieren eines Moleküls, nur mit einer speziellen Nukleinsäuresequenz unter stringenten Bedingungen, wenn diese Sequenz in einer komplexen Mischung (beispielsweise gesamte zelluläre) von DNA oder RNA vorliegt. Stringente Bedingungen sind Bedingungen, unter welchen eine Sonde mit einer Targetsubsequenz hybridisieren wird, jedoch nicht mit anderen Sequenzen. Stringente Bedingungen sind sequenzabhängig und verschieden unter verschiedenen Umständen. Längere Sequenzen hybridisieren spezifisch bei höheren Temperatur. Im allgemeinen werden stringente Bedingungen so gewählt, dass sie ungefähr 5°C niedriger liegen, als der thermische Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH. Der Tm ist die Temperatur (unter definierter Ionenstärke, pH und Nukleinsäurekonzentration), bei welcher 50% der Sonden komplementär zur Target-Sequenz mit der Target-Sequenz im Gleichgewicht hybridisieren. (Da die Target-Sequenzen im allgemeinen im Überschuss vorliegen, sind am Tm 50% der Sonden im Gleichgewicht belegt). Typischerweise schließen stringente Bedingungen eine Salzkonzentration von zumindest 0,01 bis 1,0 M Na-Ionen-Konzentration (oder andere Salze) bei pH 7,0 bis 8,3 ein, und die Temperatur ist zumindest 30°C für kurze Sonden (beispielsweise 10 bis 50 Nukleotide). Stringente Bedingungen können auch erzielt werden durch Zugabe von destabilisierenden Wirksubstanzen, wie z.B. Formamid. Beispielsweise sind Bedingungen von 5x SSPE (750 mM NaCl, 50 mM NaPhosphat, 5 mM EDTA, pH 7,4) und eine Temperatur von 25–30°C geeignet für Allel-spezifische Sonden-Hybridisierungen.
  • Eine perfekt passende Sonde hat eine Sequenz, welche vollständig komplementär mit einer speziellen Target-Sequenz ist. Die Testsonde ist typischerweise pertekt komplementär zu einem Teil (einer Subsequenz) der Target-Sequenz. Die Bezeichnung "Mismatch-Sonde" bezieht sich auf Sonden, deren Sequenz mit Absicht so gewählt ist, dass sie nicht vollständig komplementär zu einer speziellen Target-Sequenz ist. Obwohl der (die) Mismatch(es) irgendwo in der Mismatch-Sonde lokalisiert sein kann, sind terminale Mismatches weniger wünschenswert, da ein terminaler Mismatch weniger wahrscheinlich die Hybridisierung einer Target-Sequenz verhindert. Folglich werden Sonden häufig designed, so dass sie in den Mismatch am oder in der Nähe des Zentrums der Sonde aufweisen, so dass der Mismatch am wahrscheinlichsten den Duplex mit der Target-Sequenz unter Test-Hybridisierungsbedingungen destabilisiert.
  • Transkriptionsspiegel können absolut oder relativ quantifiziert werden. Absolute Quantifizierung kann realisiert werden durch Einschluss von einer bekannten Konzentration (von bekannten Konzentrationen) von einer oder mehreren Targetnukleinsäuren (beispielsweise Kontroll-Nukleinsäuren, wie z. B. Bio B oder mit bekannten Mengen der Target-Nukleinsäuren selbst) und Vergleichen der Hybridisierungsintensität von unbekannten mit den bekannten Target-Nukleinsäuren (beispielsweise durch Erzeugung einer Standardkurve). Alternativ kann die relative Quantifizierung realisiert werden durch Vergleich der Hybridisierungssignale zwischen zwei oder mehr polymorphen Formen eines Transkripts.
  • Ein polymorpher Marker oder eine Stelle ist die Stelle, an welche eine Divergenz auftritt. Bevorzugte Marker haben zumindest zwei Allele, welche jeweils in Häufigkeiten von mehr als 1% auftreten und mehr bevorzugt in einer Häufigkeit von mehr als 10% oder 20% in einer ausgewählten Population. Eine polymorphe Stelle kann so klein wie ein Basenpaar sein. Polymorphe Marker schließen Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismen, eine variable Anzahl von Tandem-Wiederholungen (variable number of tandem repeats, VNTR's) hypervariable Regionen, Minisatelliten, Dinukleotid-Wiederholungen, TrinukleotidWiederholungen, Tetranukleotid-Wiederholungen, Einzelsequenz-Wiederholungen sowie Insertions-Elemente, wie z.B. Alu ein. Die erste identifizierte Allel-Form wird zufällig als eine Referenzform bezeichnet und andere Allel-Formen werden als Alternative oder Varianten-Allele bezeichnet. Die Allel-Form, welche am häufigsten in einer ausgewählten Population auftritt, wird manchmal als die Wildtyp-Form bezeichnet. Diploide Organismen können homozygot oder heterozygot mit Blick auf Allel-Formen sein. Ein Diallel-Polymorphismus hat zwei Formen. Ein Triallel-Polymorphismus hat drei Formen.
  • Ein Einzelnukleotid- Polymorphismus (Single Nucleotid Polymorphism, SNP) tritt an einer polymorphen Stelle auf, die durch ein einzelnes Nukleotid belegt ist, welches die Stelle der Variation zwischen Allel-Sequenzen ist. Der Stelle gehen üblicherweise hochkonservierte Sequenzen des Allels voran und ebenso folgen der Stelle hochkonservierte Sequenzen des Allels (beispielsweise Sequenzen, welche in weniger als 1/100 oder 1/1000 der Mitglieder der Population variieren).
  • Ein Single Nucleotide Polymorphism tritt üblicherweise aufgrund der Substitution eines Nukleotids anstelle eines anderen an der polymorphen Stelle auf. Ein Übergang ist das Ersetzen eines Purins durch ein anderes Purin oder eines Pyrimidins durch ein anderes Pyrimidin. Eine Transversion ist das Ersetzen eines Pyridins durch ein Pyrimidin oder umgekehrt. Single Nucleotid Polymorphisms können auch von einer Deletion eines Nukleotids und einer Insertion eines Nukleotids relativ zum Referenz-Alle) herrühren.
  • BESCHREIBUNG
  • 1. Allgemeines
  • Eine substantielle Anzahl von polymorphen Stellen in Menschen und anderen Spezies wurden in der veröffentlichten Literatur beschrieben und viele polymorphe Stellen in menschlicher genomischer DNA werden in gemeinsam in Besitz befindlichen, gleichzeitig anhängigen Patentanmeldungen, wie z.B. WO98/388846, eingereicht am 5. März 1998, beschrieben. Die genomischen Stellen dieser Stellen sind bekannt, wie auch die Natur der polymorphen Formen, welche an diesen Stellen auftritt. Viele der bekannten polymorphen Stellen sind innerhalb sogenannter "expressed sequence tags" und sind daher in dem Transkript der genomischen DNA, wie auch der genomischen DNA selbst repräsentiert. Die vorliegende Erfindung verwendet Polymorphismen innerhalb der transkribierten Region eines Gens als Mittel, um die relative Expression verschiedener Allel-Formen des Gens zu untersuchen. Sobald die Allele eines Gens, welche in verschiedenen Spiegeln exprimiert werden, identifiziert worden sind, können die Allele weiter analysiert werden, um einen zweiten Polymorphismus zu lokalisieren, welcher eine kausative Rolle bei verschiedenen Expressionsspiegeln aufweist. Häufig findet sich der kausative Polymorphismus außerhalb der kodierenden Sequenz eines Gens, beispielsweise in einem Promotor, anderen regulatorischen Sequenzen oder einer Intronsequenz.
  • In den vorliegenden Verfahren werden die Nukleinsäure-Proben aus Individuen sowohl auf genomischen als auch transkriptionellen Ebenen charakterisiert. Die genomische Analyse screent die genomische DNA aus einem Individuum, um eines oder mehrere Gene zu identifizieren, welche heterozygot für einen Polymorphismus sind, der innerhalb einer transkribierten Region eines Gens auftritt. RNA von dem Individuum wird dann analysiert, um die relativen Spiegel der polymorphen Formen in dem Transkript der heterozygoten Gene, identifiziert durch die genomische Analyse zu bestimmen. Falls die Spiegel der polymorphen Formen in dem Transkript des Gens signifikant voneinander unterschiedlich sind, wird eine weitere Analyse durchgeführt, um die Ursache der verschiedenen Spiegel zu identifizieren. Es ist möglich, dass der Polymorphismus innerhalb des Transkripts, welche zum Studium der Expressionsspiegel verwendet wird, selbst die Expressionsspiegel beeinträchtigen kann. Jedoch ist es wahrscheinlicher dass der Unterschied in den Expressionsspiegeln von anderen polymorphen Unterschieden zwischen den Allelen herrührt. Solche Polymorphismen sind insbesondere wahrscheinlicherweise in Promotorsequenzen, Enhancem, Intron-Splice-Stellen oder anderen regulatorischen Sequenzen enthalten.
  • II. Analyse von polymorphen Formen auf der genomischen Ebene
  • Strategien zum Identifizieren und zum Nachweis von Polymorphismen werden in den gemeinsam in Besitz befindlichen EP730663 , EP 717,113 und in WO99/29212, eingereicht am 7. Februar 1997, beschrieben.
  • Die vorliegenden Verfahren setzen üblicherweise bereits charakterisierte Polymorphismen ein. Das heißt, das Genotypisieren, welches diese Verfahren benötigen, wird üblicherweise durchgeführt, nachdem die Lokalisierung und Natur der polymorphen Formen, welche an einer Stelle vorliegt, bereits bestimmt worden sind. Die Verfügbarkeit dieser Information ermöglicht, dass ein Satz von Sonden konzipiert werden kann zur spezifischen Identifikation der bekannten polymorphen Formen.
  • In der einfachsten Form der Analyse können Biallel-Polymorphismus-Formen charakterisiert werden unter Verwendung eines Paars von Allel-spezifischen Sonden, welche jeweils an die beiden polymorphen Formen hybridisieren. Jedoch ist die Analyse genauer unter Verwendung eines spezialisierten Arrays von Sonden, welche aufgebracht worden sind, basierend auf den verschiedenen polymorphen Formen. Das Aufbringen bezieht sich auf die Verwendung der Gruppen von verwandten immobilisierten Sonden, wobei einige von diesen eine perfekte Komplementarität zu einer Referenzsequenz zeigen und andere davon Mismatches mit der Referenzsequenz zeigen (siehe EP 730,663 ). Ein typisches Array zum Analysieren eines bekannten Biallel-Single-Nucleotide-Polymorphism enthält zwei Gruppen an Sonden aufgebracht basierend auf ihren beiden Referenzsequenzen, welche die jeweiligen polymorphen Formen konstituieren.
  • Die erste Gruppen von Sonden schließt zumindest einen ersten Satz von einer oder mehrerer Sonden ein, welche die polymorphe Stelle aufspannen und exakt komplementär zu einer der polymorphen Formen sind.
  • Die Gruppe von Sonden kann auch zweite, dritte und vierte weitere Sätze von Sonden enthalten, welche Sonden enthalten, die identisch mit Sonden in dem ersten Probensatz sind, außer an einer Position, welche als Abfrageposition bezeichnet wird. Wenn eine Sondengruppe mit der polymorphen Form hybridisiert wird, welche die Referenzsequenz konstituiert, zeigen alle Sonden in dem ersten Sondesatz eine perfekte Hybridisierung und alle der Sonden in dem anderen Sondensatz zeigen Hintergrundhybridisierung aufgrund von Mismatches.
  • Wenn eine Sondengruppe mit der anderen polymorphen Form hybridisiert, wird ein anderes Muster erhalten; alle bis auf eine Sonde in dem Array zeigen einen Mismatch mit dem Target und erzeugen nur Hintergrundhybridisierung. Die eine Sonde, welche perfekte Hybridisierung zeigt, ist eine Sonde, aus dem zweiten, dritten oder vierten Sondensatz, der in Abfrageposition mit der polymorphen Stelle aligned und durch eine Base okkupiert wird, die komplementär mit der anderen polymorphen Form ist.
  • Wenn die Sonde mit einer heterozygoten Probe hybridisiert, in welcher beide polymorphen Formen vorliegen, werden die Muster für die homozygoten polymorphen Formen überlagern. Folglich zeigt die Sondengruppe unterschiedliche und charakteristische Hybridisierungsmuster, abhängend davon, welche polymorphen Formen vorliegen und ob ein Individuum homozygot oder heterozygot ist.
  • Typischerweise enthält ein Array eine zweite Gruppe von Sonden angeordnet unter den gleichen Prinzipien wie die erste Gruppe, jedoch mit einer Referenzsequenz, welche die andere polymorphe Form konstituiert. Das heißt das erste Sondenset in der zweiten Gruppe überspannt die polymorphe Stelle und zeigt eine perfekte Komplementarität mit der anderen polymorphen Form. Die Hybridisierung der zweiten Sondengruppe mit homozygoten und heterozygoten Targetsequenzen führt zu einem Spiegelbild der Hybridisierungsmuster von der ersten Gruppe. Durch Analysieren der Hybridisierungsmuster von beiden Sondengruppen kann man mit einer hohen Genauigkeit bestimmen, welche polymorphe Formen) in einem Individuum vorliegen.
  • Die Prinzipien der Sonden-Auswahl und des Array-Design können leicht erweitert werden, um komplexere Polymorphismen zu analysieren (siehe EP 730,663 ). Beispielsweise können drei Gruppen von Sonden konzipiert werden abgestimmt auf die drei polymorphen Formen wie oben beschrieben, um Triallel SNP Polymorphismen zu charakterisieren. Als ein weiteres Beispiel kann man eine erste Gruppe von Sonden basierend auf den undeletierten polymorphen Formen als Referenzsequenz anordnen und eine zweite Gruppe von Sonden, basierend auf den deletierten Formen als Referenzsequenz, um Diallelpolymorphismen involvierend eine Deletion eines Nukleotids zu analysieren.
  • Arrays können auch konzipiert werden, um viele verschiedene Polymorphismen in vielen verschiedenen Genen zur gleichen Zeit zu analysieren, einfach durch Einschließen von multiplen Subarrays an Sonden. Jedes Subarray weist erste und zweite Gruppen von Sonden auf, konzipiert zum Analysieren eines speziellen Polymorphismus gemäß der Strategie wie oben beschrieben.
  • Für den Assay einer genomischen DNA kann im Prinzip jegliche biologische Probe (verschieden von reinen roten Blutzellen) verwendet werden. Beispielsweise schließen geeignete Gewebsproben Vollblut, Spermien, Speichel, Tränen, Urin, Fäkalmaterial, bukkales Material, Haut und Haare ein. Genomische DNA wird typischerweise vor der Analyse amplifiziert. Die Amplifikation wird üblicherweise durch PCR realisiert unter Verwendung von Primern welche ein geeignetes Fragment flankieren, beispielsweise 50–500 Nukleotiden, enthaltend die Stelle des Polymorphismus, welche analysiert werden soll. Das Target wird üblicherweise gelabellt im Zuge der Amplifikation. Das Amplifikationsprodukt kann RNA oder DNA, einzelsträngig oder doppelsträngig, sein. Falls es doppelsträngig ist, wird das Amplifikationsprodukt typischerweise vor der Anwendung an ein Array denaturiert. Falls genomische DNA ohne Amplifikation analysiert wird, kann es wünschenswert sein, die RNA aus der Probe zu entfernen bevor diese auf das Array angewandt wird. Dies kann realisiert werden durch Verdauen mit DNase freier RNase.
  • III. Expressionsüberwachung
  • Die Erfindung überwacht die Spiegel der RNA-Transkripte, exprimiert aus Genen von Interesse. Das RNA-Transkript kann nukleare RNA, mRNA, rRNA oder tRNA sein. Nukleäre RNA enthält Intronsequenzen, welche aus mRNA gespliced worden sind. Die Analyse von nukleärer RNA kann bedeutsam sein bei der Analyse von Effekte auf die Expression von Polymorphismen welche innerhalb von Intronregionen auftreten. In einigen Verfahren wird RNA direkt überwacht und in anderen Verfahren wird RNA indirekt über ein Amplifikationsprodukt wie zum Beispiel cDNA oder cRNA überwacht.
  • Strategien zur Analyse und Quantifikationen von Transkripten werden im Detail in den gemeinsam besessen WO 97/10365 und WO 97/27319 beschrieben. Im allgemeinen können die gleichen Sonden-Arrays, welche zum Analysieren von polymorphen Formen in genomische DNA verwendet werden zum Analysieren von polymorphen Formen des Transkript verwendet. Die Hybridisierungsmuster der Sonden-Arrays können analysiert werden in der gleichen Art und Weise für genomische und RNA (oder RNA-abgeleitete) Targets. Vergleich der Hybridisierungsintensitäten der ersten Sondengruppe welche pertekt mit einer polymorphen Form zusammenpassen mit den Hybridisierungsintensitäten der zweiten Sondengruppe, welche pertekt mit der zweiten polymorphen Form zusammenpassen, zeigt in etwa die relativen Anteile der polymorphen Formen in dem Transkript.
  • In einigen Fällen kann es bedeutsam sein, das Verhältnis der Hybridisierungsintensitäten von pertekt passenden Sonden von den ersten und zweiten Sondengruppe für genomische DNA und RNA-Targets (oder Amplifikationsprodukte davon) zu vergleichen. Vorzugsweise wird der Vergleich durchgeführt zwischen ähnlichen Formen von Amplifiktationsprodukten (d.h. jeweils DNA oder jeweils RNA). Bei genomischer DANN, also in dem diploiden Individuum erwartet man, dass die polymorphen Formen in einem heterozygoten Gen im gleichen molaren Verhältnis vorliegen.
  • Jedoch können in der Praxis die Verhältnisse der Hybridisierungsintensitäten etwas vom erwarteten molaren Verhältnis abweichen, beispielsweise auf Grund von Basen-Zusammensetzungs-Effekten auf die Hybridisierungsintensität. Durch Vergleich der Verhältnisse der Hybridisierungsintensitäten für genomische DNA und RNA (oder Amplifikationsprodukte davon) mit den gleichen Gruppen von Sonden können Faktoren, verschieden vom molaren Verhältnis der polymorphen Formen, welche die Hybridisierungsintensität beeinflussen könnten, weitgehend aus der Analyse eliminiert werden. Falls das Verhältnis der Hybridisierungsintensitäten signifikant von den genomischen und RNA-Targets unterschiedlich ist (oder Amplifikationsprodukten davon) kann geschlussfolgert werden, dass die polymorphen Formen unterschiedlich in den Transkripten expremiert werden.
  • Einige Arrays enthalten weitere Sonden zum Messen der Spiegel des Transkripts eines Gens ohne, dass zwischen den polymorphen Formen unterschieden wird. Diese Sonden zeigen perfekte Komplementarität mit einem Segment verschieden von dem Polymorphismus, verwendet um polymorphe Formen zu unterscheiden. Das Vorliegen und die Menge des Transkripts kann von den Hybridisierungs-Intensitäten dieser Sonden abgeleitet werden, optional relativ zu Kontroll-Sonden, welchen die Komplementarität mit dem Target fehlt und welche konzipiert worden sind, um den Hintergrundspiegel der Hybridisierungsintensität zu messen.
  • Das RNA-Transkript zur Analyse wird aus einer biologischen Probe isoliert, welche aus einem biologischen Gewebe oder biologischen Flüssigkeit erhalten wurde, in welchem(r) das Gen von Interesse exprimiert wird. Beispiele schließen Sputum, Blut, Blutzellen (beispielsweise weiße Blutzellen), Gewebe oder mit feiner Nadel erhaltene Biopsieproben, Urin, peritonale Flüssigkeit und pleurale Flüssigkeit oder Zellen davon ein. Biologische Proben können auch Schnitte von Geweben wie zum Beispiel gefrorene Schnitte, genommen aus histologischen Zwecken, einschließen.
  • Verfahren zum Isolieren der gesamten mRNA werden beschrieben in Kapitel 3 von Laboratory Techniques in Biochemie und molekularer Biologie: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Teil I, Theory and Nucleic Acid Preparation, P. Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993) und Kapitel 3 von Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Teil I. Theory and Nucleic Acid Preparation, P. Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993).
  • Häufig ist es wünschenswert, RNA vor der Hybridisierung zu amplifizieren. Das Amplifikationsprodukt kann RNA oder DNA, einzelsträngig oder doppelsträngig sein. In einer anderen Prozedur kann die mRNA revers transkribiert werden mit einer Reversen Transkriptase und einem Primer bestehend aus Oligo dT und einer Sequenz kodierend den Phagen T7 Promotor, um ein einzelsträngiges DNA-Templat bereitzustellen. Der zweite DNA-Strang wird polymerisiert unter Verwendung einer DNA- Polymerase. Nach der Synthese der doppelsträngigen cDNA wird T7 RNA Polymerase hinzu gegeben und die RNA wird von dem cDNA- Templat transkribiert. Nachfolgende Runden der Transkription von jedem einzelnen cDNA-Templat resultieren in amplifizierte RNA. Alternativ kann cDNA amplifiziert werden, um ein doppelsträngiges Amplikon zu erzeugen und ein Strang des Amplikons kann isoliert werden, d.h. unter Verwendung eines biotinylierten Primers, welche das Einfangen des ungewünschten Stranges auf Streptavidinbeads ermöglicht. Alternativ kann asymmetrische PCR verwendet werden, um ein einzelsträngiges Target zu erzeugen.
  • Typischerweise wird das Amplifikationsprodukt entweder im Zuge der Amplifikation oder nachfolgend gelabelt. Falls das RNA-Amplifikationsprodukt zugleich mit genomischer DNA hybridisiert werden soll oder einem Amplifikationsprodukt davon, an ein Array, dann werden die beiden Targets unterschiedlich gelabelt. Eine Vielzahl von unterschiedlichen fluoreszierenden Labels sind verfügbar. Beispielsweise kann eine Probe gelabelt werden mit Fluorescein und die andere mit Biotin, welches mit Phycoerythrinstreptavidin nach Hybridisierung angefärbt werden kann. Zwei Target-Proben können verdünnt werden, falls gewünscht, vor der Hybridisierung, um die Fluoreszensintensitäten gleichzusetzen.
  • Detaillierte Protokolle für die PCR werden bereitgestellt in PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Academic Press, Inc. N.Y. (1990). Andere geeignete Amplifikationsverfahren schließen die Ligase Kettenreaktion (LCR) siehe WU and Wallace, Genomics, 4:560 (1989), Landegren, et al., Science, 241:1077 (1988) and Barringer, et al., Gene 89:117 (1990), Transkriptionsamplifikation (Kwoh, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:1173 (1989), und selbsttragende Replikation (Guatelli, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87:1874 (1990) ein.
  • In einigen Verfahren wird eine bekannte Menge der Kontrollsequenz koamplifiziert unter Verwendung der gleichen Primer, um einen internen Standard zur Verfügung stellen, welcher verwendet werden kann, um die PCR-Reaktion zu kalibrieren, um sicher zu stellen, dass die Amplifikationsprodukte in etwa dem gleichen molaren Anteil wie dem Start-Anteil der Template erzeugt werden. Das Sonden-Array enthält dann Sonden, spezifisch für den internen Standard zur Quantifizierung der amplifizierten Nukleinsäure.
  • IV. Korrelation des Genotyps mit dem exprimierten Spiegel
  • Wenn man die Allele eines Gens identifiziert hat, welche in verschiedenen Spiegeln exprimiert werden, können die Allele weiter analysiert werden, um einen Unterschied zwischen Ihnen zu identifizieren, welcher für die unterschiedliche Expressionsspiegel verantwortlich sind. Der Unterschied kann in dem gleichen Polymorphismus liegen, welcher verwendet wurde, um die unterschiedlichen Allelformen in den Analysen wie oben beschrieben zu unterscheiden. Jedoch liegt eher typisch der Unterschied in den Expressionsspiegeln in einem zweiten Polymorphismus, lokalisiert in einem Promotor, Enhancer oder anderen regulatorischen Regionen. Solche Polymorphismen können identifiziert werden durch Sequenzieren der regulatorischen Regionen der unterschiedlich exprimierten Allele und Identifizieren von Sequenzunterschieden zwischen den Allelen.
  • Ein mögliche kausale Rolle des Polymorphismus innerhalb einer regulatorischen Sequenz bei der differenziellen Expression von Allelen kann analysiert werden sowohl durch molekularbiologische als auch genetische Ansätze. Beispielsweise können, falls differenziell exprimierte Allele an einer polymorphen Stelle innerhalb eines Promotors unterschiedlich sind, verschiedene Formen des Promotors kloniert werden und in operable Verknüpfung mit einem Reportergen verknüpft werden. Falls das Reportergen in verschiedenen Spiegeln von den zwei Formen des Promotors exprimiert wird, ist es wahrscheinlich, dass der Polymophismus innerhalb des Promotors eine kausative Rolle in den beobachteten differenziellen Expressions-Spiegel der Allel- Formen des Gens, mit welchen er normalerweise assoziiert ist, spielt. Ähnliche Reporter-Assays können entwickelt werden, um den Effekt von Polymorphismen in anderen regulatorischen Sequenzen zu bewerten.
  • Polymorphismen innerhalb von Promotoren und anderen regulatorischen Sequenzen können auch charakterisiert werden durch Assoziationsanalyse. Assoziationsanalyse identifiziert Korrelationen zwischen polymorphen Formen und einer Population von Individuen, welche untersucht worden ist auf das Vorliegen oder nicht Vorliegen eines Phenotypen-Merkmals von Interesse und auf polymorphe Marker-Sets. Um solch eine Analyse durchzuführen, wird das Vorliegen oder die Abwesenheit eines Polymophismus für einen Satz der Individuen bestimmt, wobei einige davon ein spezielles Merkmal zeigen und einige davon dieses Merkmal nicht aufweisen. Die Allele des Polymorphismus werden dann untersucht, um zu bestimmen, ob das Vorliegen oder die Abwesenheit eines speziellen Allels mit dem Merkmal von Interesse assoziiert ist. Korrelation kann durchgeführt werden durch übliche statistische Verfahren wie z. B. dem K-Quadrat-Test und statistisch signifikanten Korrelationen zwischen einer polymorphen Form und Phenotyp-Charakteristika werden aufgezeichnet.
  • V. Alternatives Verfahren zum Korrelieren von Expressionsspiegeln mit Genotyp
  • In einem alternativen oder zusätzlichen Ansatz wird eine Population von Individuen an einer oder mehreren polymorphen Stellen innerhalb eines Gens einschließend flankierende Sequenzen genotypisiert. Expressionsspiegels des Gen-Transkipt werden dann bestimmt in Individuen ohne Unterscheidung zwischen den polymorphen Formen. Optional können Expressionsspiegel aus verschiedenen Individuen in Gruppen oder Clustern klassifiziert werden, welche durch die Daten nahe gelegt werden, nicht a priori definiert sind, so dass Isolate in einem gegebenen Cluster dazu tendieren ähnlich zu sein und Isolate in verschiedenen Clustern dazu tendieren nicht ähnlich zu sein. Siehe die gemeinsam besessene WO 97/29212. Die Population der Individuen, mit Bezug auf welche die Analyse durchgeführt wird, sollte vorzugsweise auf Charakteristika passen, welche möglicherweise indirekten Einfluss auf die Expressionsspiegel aufweisen, z.B. Alter, Geschlecht und ethnische Abstammung und die Expressionsspiegel sollten bestimmt werden aus dem gleichen Gewebetyp. Die Genotypen eines Individuums mit Blick auf ein oder mehrere Polymorphismen innerhalb des Gens werden dann mit dem Expressionsspiegel des Gentranskripts in dem gleichen Individuum über die Population hinweg korreliert. Polymorphe Formen, welche starke Korrelationen mit dem Expressionsspiegel an Transkript zeigen können eine kausative Rolle bei der Bestimmung des Expressionsspiegels haben. Diese Rolle kann des weiteren untersucht werden unter Verwendung von molekularbiologischen und genetischen Ansätzen, wie oben beschrieben.
  • VI. Assoziationsanalyse
  • Phenotypen- Merkmale geeignet zur Assoziationsanalyse schließen Erkrankungen ein, welche bekannte, aber bislang nicht kartierte genetische Komponenten aufweisen (beispielsweise Agammaglobulimenia, Diabetes insipidus, Lesch-Nyhan Syndrom, muskuläre Dystrophie, Wiskott-Aldrich Syndrom, Fabry-Krankheit, familiäre Hypercholesterolamie, polyzystische Nieren-Erkrankung, erbliche Spherocytosis, von Willebrand's Krankheit, Tuberous Sclerosis, erbliche hemorrhagische Telangiectasia, familiäre Darm- Polyposis, Ehlers- Danlos Syndrom, Osteogenesis imperfecta, und akute periodische Porphyrie. Phenotyp-Merkamle schließen auch Symptome ein von oder empfänglich für multifaktorielle Erkrankungen, von welchen eine Komponente genetisch ist oder genetisch sein kann, wie z.B. Autoimmunerkrankungen, Entzündungen, Krebs, Erkrankungen des Nervensystems und Infektion durch pathogene Mikroorganismen. Einige Beispiele der Autoimmunerkrankungen schließen rheumatuide Arthritis, Multiple Sklerose, Diabetes (insulinabhängig und nicht abhängig), systemische Lupus erythematosus und die Graves Erkrankung ein. Einige Beispiele von Krebs schließen Krebs der Blase, des Gehirns, der Brust, des Darms, der Speiseröhre, der Niere, Leukämie, der Leber, der Lunge, der Mundhöhle, der Eierstöcke, des Pankreas, der Prostata, der Haut, des Magens und des Uterus ein. Phenotypen-Merkmale schließen auch Charakteristika ein wie zum Beispiel Dauer, Erscheinung (Alopezie, Fettleibigkeit), Stärke, Geschwindigkeit, Dauerhaftigkeit, Fruchtbarkeit und Empfänglichkeit oder Aufnahmefähigkeit für spezielle Wirkstoffe oder therapeutische Behandlungen.
  • Solche Korrelationen können auf verschiedene Art und Weisen genutzt werden. In dem Fall einer starken Korrelation zwischen einer polymorphen Form und einer Erkrankung, für welche eine Behandlung verfügbar ist, kann der Nachweis des polymorphen Formen-Satzes in einem Menschen oder einem tierischen Patienten die sofortige Verabreichung der Behandlung rechtfertigen oder zumindest die Maßnahme der regulären Überwachung des Patienten. Der Nachweis einer polymorphen Form, korreliert mit ernsthaften Erkrankungen in einem Paar, welches eine Familie gründen will, kann auch wertvoll sein für das Paar bzgl. ihrer Entscheidung für Kinder. Beispielsweise kann der weibliche Partner wählen, sich einer in vitro Fertilisation zu unterziehen, um die Möglichkeit des Übertragens solche als Polymorphismus von ihrem Mann auf ihre Nachkommen zu vermeiden. Im Falle einer schwächeren, jedoch immer noch statistisch signifikanten Korrelation zwischen einem Polymorphen-Satz und einer menschlichen Erkrankung kann eine sofortige therapeutische Intervention oder Überwachung nicht gerechtfertigt sein. Nichtsdestotrotz kann der Patient motiviert sein, einfache Änderungen des Lebensstiles zu beginnen (beispielsweise Diät, Training), welche mit geringen Kosten für den Patienten realisierbar werden können, jedoch mögliche hilfreiche Effekte bei der Reduktion des Risikos für Zustände verleihen, auf welche der Patient eine erhöhte Empfänglichkeit auf Grund von Varianten-Allelen haben kann. Die Identifikation eine polymorphen Satzes in einem Patienten, korreliert mit erhöhter Empfänglichkeit für eine oder mehrere Behandlungs-Pläne für eine Erkrankung zeigt, dass dieser Behandlungsplan verfolgt werden sollte.
  • VII. Sonden-Array-Design und Konstruktion
  • Die VLSIPSTM-Technologie stellt Verfahren zum Synthetisieren von Arrays von vielen verschiedenen Oligonukleotiden-Sonden zur Verfügung, welche eine sehr kleine Oberflächenfläche okkupieren. Siehe US 5,143,54 und WO 90/15070. Beispielsweise können hochdichte Arrays erzeugt werden welche mehr als ungefähr 100, vorzugsweise mehr als ungefähr 1.000, 16.000, 65.000, 250.000 oder 1.000.000 verschiedener Olegonukleotid-Sonden umfassen. Die Oligonukleotid-Sonden reichen von ungefähr 5 bis ungefähr 50 oder ungefähr 5 bis ungefähr 45 Nukleotiden, mehr bevorzugt ungefähr 10 bis ungefähr 40 Nukleotiden und am meisten bevorzugt von ungefähr 15 bis ungefähr 40 Nukleotiden an Länge. In einigen Ausführungsformen sind die Olegonukleotid-Sonden 20 oder 25 Nukleotide an Länge. Die Olegonukleotid-Sonden sind üblicherweise weniger als 50 Nukleotide lang, üblicherweise weniger als 46 Nukleotide noch üblicher weniger als 41 Nukleotide, am meisten üblich weniger als 36 Nukleotide, vorzugsweise weniger als 31 Nukleotide, mehr bevorzugt weniger als 26 Nukleotide und am meisten bevorzugt weniger als 21 Nukleotide an Länge. Die Sonden können auch weniger als 16 Nukleotide oder weniger als 11 Nukleotide Länge sein.
  • Die Lokalisierung und die Sequenz einer jeden Olegonukleotid-Sonden-Sequenz in dem Array sind im allgemeinen bekannt. Darüber hinaus kann die große Anzahl verschiedener Sonden eine relativ kleine Fläche okkupieren was ein hochdichtes Array zur Verfügung stelle mit einer Sonden-Dichte von im allgemeinen mehr als 60, 100, 600, 1.000, 5.000, 10.000, 40.000, 100.000 oder 400.000 verschiedenen Olegonukleotid-Sonden pro cm2. Die kleine Oberflächen-Fläche des Arrays (oft weniger als ungefähr 10 cm2, vorzugsweise weniger als ungefähr 5 cm2, mehr bevorzugt weniger als ungefähr 2 cm2 und am meisten bevorzugt weniger als 1,6 cm2) ermöglicht die einheitlichen Hybridisierungsbedingungen, wie zum Beispiel Temperaturregulierung und Salzgehalt.
  • Des weiteren kann die Hybridisierung wegen der durch hochdichte Arrays okkupierten kleinen Fläche in extrem kleinen Flüssigkeitsvolumina durchgeführt werden (beispielsweise 250 μl oder weniger, mehr bevorzugt 100 μl oder weniger und am meisten bevorzugt 10 μl oder weniger). In kleinen Volumina kann die Hybridisierung sehr schnell voranschreiten. Darüber hinaus sind die Hybridisierungsbedingungen extrem einheitlich über die gesamte Probe hinweg und das Hybridisierungsformat ist kompatibel für die automatisierte Verarbeitung.

Claims (11)

  1. Ein Verfahren zum Überwachen von Expressionsspiegeln von verschiedenen polymorphen Formen eines Gens umfassend: (a) Hybridisieren genomischer DNA oder eines Amplifikationsproduktes davon aus einem Individuum mit einer ersten Sonden- Gruppe umfassend eine oder mehrere Sonden, exakt komplementär zu einer ersten polymorphen Form des Gens, und einer zweiten Sonden- Gruppe umfassend eine oder mehrere Sonden, exakt komplementär zu einer zweiten polymorphen Form des Gens, um das Vorliegen von heterozygoten polymorphen Formen an einer polymorphen Stelle innerhalb einer transkribierten Sequenz eines Gens von Interesse zu bestimmen; (b) Hybridisieren von RNA oder einem Amplifikationsprodukt davon, aus einem Gewebe des Individuums, in welchem das Gen exprimiert wird, mit den ersten und zweiten Sondengruppen; (c) Vergleichen einer genomischen DNA-Hybridisierungs- Intensität der ersten Sondengruppe mit der zweiten Sondengruppe, um ein genomisches Hybridisierungs- Verhältnis zu bestimmen, und Vergleichen einer RNA-Hybridisierungsintensität der ersten Gruppe mit der zweiten Gruppe, um ein RNA-Hybridisierungs- Verhältnis zu bestimmen, wobei ein Unterschied in den genomischen DNA- und RNA-Verhältnissen anzeigt, dass die polymorphen Formen des Gens in verschiedenen Spiegeln im Individuum exprimiert werden.
  2. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Analysieren der genomischen DNA das Amplifizieren einer Segments von genomischer DNA aus einer Probe umfasst und das Hybridisieren der amplifizierten genomischen DNA mit einem Array von immobilisierten Sonden.
  3. Das Verfahren von Anspruch 1, wobei das Analysieren der RNA das reverse Transkribieren und Amplifizieren von mRNA, exprimiert aus dem Gen, umfasst, um eine amplifizierte Nukleinsäure zu erzeugen und das Hybridisieren der amplifizierten Nukleinsäure mit einem Array von immobilisierten Sonden.
  4. Das Verfahren von Anspruch 3, wobei die amplifizierte Nukleinsäure eine cDNA ist.
  5. Das Verfahren von Anspruch 1, wobei die genomische DNA oder das Amplifikationsprodukt und die RNA oder das Amplifikationsprodukt verschiedene Markierungen Vagen und zur gleichen Zeit mit dem Array hybridisiert werden.
  6. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, desweiteren umfassend nach dem Vergleichsschritt das Sequenzieren einer nicht transkribierten Region des Gens, um eine zweite polymorphe Stelle in einer Promotor- oder einer Enhancer-Region des Gens zu identifizieren.
  7. Das Verfahren nach Anspruch 1 zum Überwachen der Expressionsspiegel von verschiedenen polymorphen Formen einer Sammlung von Genen, wobei: Schritt (a) das Hybridisieren genomischer DNA oder eines Amplifikationsproduktes davon aus einem Individuum mit einem Array von immobilisierten Sonden, umfassend ein Unterarray von Sonden für jedes Gen in der Sammlung, umfasst, wobei jedes Unterarray eine erste Gruppe von einer oder mehreren Sonden umfasst, welche exakt komplementär zu einer ersten polymorphen Form des Gens sind, und eine zweite Gruppe von einer oder mehreren Sonden, exakt komplementär zu einer zweiten polymorphen Form des Gens; und das Analysieren der relativen Hybridisierung der ersten und zweiten Gruppen von Sonden mit der genomischen DNA oder dem Amplifikationsprodukt davon für jedes Unterarray, um heterozygote Gene in dem Individuum zu identifizieren; Schritt (b) das Hybridisieren von RNA oder einem Aplifikationsprodukt davon aus einem Individuum mit dem Array von immobilisierten Sonden umfasst; und Schritt (c) für jedes Unter-Array von Sonden, für welches ein heterozygotes Gen in dem Analyseschritt identifiziert worden ist, das Vergleichen einer genomischen DNA-Hybridisierungs-Intensität der ersten Sondengruppe mit der zweiten Gruppe umfasst, um ein genomisches Hybridisierungs- Verhältnis zu bestimmen, und das Vergleichen einer RNA-Hybridisierungs- Intensität der ersten Gruppe mit der zweiten Gruppe, um ein RNA-Hybridisierungs- Verhältnis zu bestimmen, wobei ein Unterschied in den genomischen DNA- und RNA-Verhältnissen anzeigt, dass die polymorphen Formen des Gens in verschiedenen Spiegeln im Individuum exprimiert werden.
  8. Das Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die Sammlung von Genen zumindest 100 Gene umfasst.
  9. Das Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die Sammlung von Genen zumindest 1000 Gene umfasst.
  10. Das Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Sammlung von Genen zumindest 100 000 Gene umfasst.
  11. Das Verfahren gemäß Anspruch 7, des weiteren umfassend das Sequenzieren einer nicht-transkribierten Region eines Gens in der Untergruppe, um einen weiteren Polymorphismus in einer Promotor-, Enhancer- oder einer Intron-Sequenz des Gens zu bestimmen.
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