DE68905578T2

DE68905578T2 - Verbindung ks-505 und verfahren zur herstellung davon.

Info

Publication number: DE68905578T2
Application number: DE8989312810T
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Kase; Isao Kawamoto; Satoshi Naknishi; Keiko Ohsawa; Yutaka Saito; Hiroshi Sano; Shizuo Shiozaki; Katsuichi Shutoh; Tohru Yasuzawa
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1988-12-09
Filing date: 1989-12-08
Publication date: 1993-07-01
Anticipated expiration: 2009-12-09
Also published as: US5079232A; DE68905578D1; EP0372986A3; EP0372986B1; EP0372986A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neuartige Verbindung, die aus einem Mikroorganismus stammt und physiologische Aktivität besitzt, pharmazeutisch verträgliche Salze davon, Verfahren zu ihrer Herstellung und pharmazeutische Mittel, welche diese Verbindung enthalten.
Aus dem Stand der Technik ist bekannt, daß beispielsweise verschiedene Mikroorganismen aus dem Genus Streptomyces zur Produktion physiologisch aktiver Substanzen befähigt sind. Jedoch war bisher nichts über eine Substanz bekannt, die aus Mikroorganismen des Genus Streptomyces stammt und zur Verbesserung der zerebralen Funktion befähigt ist.
Überraschenderweise wurde nunmehr festgestellt, daß eine neuartige Verbindung mikrobiellen Ursprungs zur Verbesserung der zerebralen Funktion befähigt ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit eine neuartige Verbindung zur Verbesserung der zerebralen Funktion, pharmazeutisch verträgliche Salze davon, Verfahren zu deren Herstellung und pharmazeutische Mittel, welche diese enthalten.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Verbindung (im folgenden bezeichnet als KS-505) der folgenden Formel (I): und pharmazeutisch verträgliche Salze davon.
Die erfindungsgemäße Verbindung KS-505 dient der Verbesserung der zerebralen Funktion und kann beispielsweise verwendet werden zur Heilung und Prävention zerebraler Erkrankungen, wie Amnäsie und Demenz.
Gemäß einem weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von KS-505 bereitgestellt, wobei man einen Mikroorganismus des Genus Streptomyces, der zur Produktion von KS-505 befähigt ist, in einem Medium zur Anhäufung von KS-505 in der Kulturbrühe kultiviert und man die resultierende Verbindung KS-505 daraus in Form der freien Säure oder als pharmazeutisch verträgliches Salz isoliert.
Gemäß einem weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfindung wird ein pharmazeutisches Mittel zur Verbesserung der zerebralen Funktion bereitgestellt, welches als aktiven Bestandteil eine wirksame Menge von KS-505 und/oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon, in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Exzipienten, umfaßt.
Die vorliegende Erfindung wird nun genauer beschrieben.
I) Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Verbindung KS-505 sind folgende:
1. Beschaffenheit: Weißes Pulver. Saure Substanz.
2. FAB-Massenspektrum: m/z 1075 (M+H-H&sub2;O)&spplus; [*1] und 1115 (M+Na)&spplus; [*2]
3. Hochauflösendes FAB-Massenspektrum: m/z 1115.5903 (*2)
Berechnet für C&sub6;&sub1;H&sub8;&sub8;O&sub1;&sub7;Na: 1115.5920
[Anmerkungen: *1 bestimmt ohne Zugabe von NaCl.
*2 bestimmt bei Zugabe von NaCl in herkömmlicher Weise]
4. Molekülformel: C&sub6;&sub1;H&sub8;&sub8;O&sub1;&sub7;.
5. ¹H NMR-Spektrum: (400MHz, 10mg/0.4ml CD&sub3;OD)
δ (ppm); 0.77(s). 0.80(br s). 1.05(d), 1.10(s), 1.37(s), 1.52(m), 1.83(m), 2.31(m), 2.45(m), 2.79 (br t),2.94(dd), 3.34(s), 3.52(s), 3.61(br s), 3.72(m), 3.81(d), 3.90(d), 4.36(d). 7.16(d), 7.29(d)
6. ¹³C NMR-Spektrum: (100MHz, 10mg/0.4ml CD&sub3;OD)
δ (ppm); 11.4(q), 15.0(q). 16.3(q), 17.4(q), 18.2(t), 18.7(q), 18.9(t), 20.2(t), 20.9(t), 22.0(t), 22.6(t), 23.0(q), 23.1(q), 24.5(q), 29.6(t). 34.1(t), 35.4(t), 36.7(t), 38.4(t), 39.5(s), 39.7(t), 39.8(s), 40.5(s), 42.8(s), 43.1(s), 43.3(d), 43.4(t), 44.1(t), 44.2(s), 44.4(d), 45.1(t), 50.5(s), 52.3(q), 53.9(d), 59.1(d), 60.3(t), 61.2(q), 62.7(d), 63.2(t), 64.1(d), 64.3(d), 65.1(d), 65.7(d), 73.2(d), 76.7(d), 77.0(d), 81.1(s), 84.7(d), 88.2(d), 107.3(d), 107.6(s) & 108.0(s), 122.0(d), 123.5(s), 125.4(d), 126.0(s), 142.6(s) & 142.8(s), 156.1(s), 170.2(s), 172.4(s), 174.9(s), 177.7(s)
7. Infrarot-Absorptionsspektrum: (KBr-Methode). 3450, 2950, 1730, 1715, 1460, 1385, 1270, 1240, 1120, 1045 cm&supmin;¹
8. Ultraviolett-Absorptionsspektrum (λmax in Methanol) 221nm(log&epsi; =4.47), 308nm(log &epsi; =3.63)
9. Spezifische Drehung: [ α ]25D= -63.5º (c 0.1, in Methanol) unmittelbar nach dem Auflösen bestimmt.
10. Schmelzpunkt: Unbestimmt. Allmähliches Braunwerden.
11. Farbreaktionen:
Positive Reaktionen mit Anisaldehyd, Schwefelsäure, Jod und Bromcresol-Grün. Negative Reaktionen mit Ninhydrin. Dinitrophenylhydrazin; Eisen (III)-chlorid und Anilin- Phthalsäure; Rydon-Smith's-Reaktion und Dragendorff's- Reaktion.
12. Löslichkeit in verschiedenen Lösungsmitteln: Löslich in Methanol, Dimethylsulfoxid, Ethylacetat und wäßriger Base. Geringe Löslichkeit in Hexan, Chloroform und wäßriger Säure.
KS-505 ist eine Verbindung, die ein γ-Hydroxy-γ-lacton umfaßt, das seinen Ring öffnen kann um eine Verbindung der folgenden Formel (II) zu bilden, die mit KS-505 chemisch äquivalent ist. In Lösung befindet sich die letztgenannte Verbindung im Gleichgewicht mit KS-505, wobei das Verhältnis der beiden Formen, beispielsweise in Abhängigkeit von der Acidität des verwendeten Lösungsmittels variiert:
Bezugnahmen auf Formel (I) umfassen hierin selbstverständlich Formel (II) sowie Gemische aus Formeln (I) und (II).

II) Salze von KS-505:

Pharmazeutisch verträgliche Salze von KS-505 sind beispielsweise diejenigen, die mit geeigneten organischen oder anorganischen Basen gebildet werden. Beispiele für geeignete organische Basen sind primäre Amine, wie Methylamin, Ethylamin und Anilin; sekundäre Amine, wie Dimethylamin, Diethylamin, Pyrrolidin, Piperidin, Morpholin und Piperazin; und tertiäre Amine, wie Trimethylamin, Triethylamin, N,N-Dimethylanilin und Pyridin.
Geeignete anorganische Basen sind beispielsweise Alkalimetalle wie Natrium und Kalium; und Erdalkalimetalle, wie Magnesium und Calcium.
Diese Salze können in herkömmlicher Weise hergestellt werden.
Beispielsweise wird das Natriumsalz von KS-505 durch folgende Formel (III) dargestellt:
Die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Natriumsalzes gemäß Formel (III) sind folgende:
1. Beschaffenheit: Weißes Pulver. Neutrale Substanz.
2. Massenspektrum (SIMS): m/z 1115 (C&sub6;&sub1;H&sub8;&sub8;O&sub1;&sub7;Na)&spplus;
3. Molekülformel: C&sub6;&sub1;H&sub8;&sub5;O&sub1;&sub7;Na&sub3;
4. ¹H NMR-Spektrum: (400MHz), 7mg/0.4ml CD&sub3;OD)
δ (ppm); 0.78(s), 0.81(br s), 0.97(d), 1.09(s), 1.39(s), 1.52(m), 1.85(m), 2.27(m), 2.48(m), 2.72(m), 2.94(t), 3.35(s), 3.53(s), 3.64(s), 3.73(m), 3.80(d), 3.92(d), 4.40(d), 7.05(d), 7.43(d)
5. ¹³C NMR-Spektrum: (100MHz, 20mg/0.4ml D&sub2;O)
δ (ppm); 11.3 (q), 14.8 (q), 15.9 (q), 17.1 (q), 17.6 (t), 17.7 (t), 18.4 (q), 20.0 (t), 20.7 (t), 21.2 (t), 21.8 (t), 22.9 (q) X 2, 24.9 (q), 29.3 (t), 32.7 (t), 33.4 (t), 34.8 (t), 36.0 (t), 36.3 (t), 37.8 (s), 38.8 (s), 39.1 (s), 39.2 (t), 42.1 (s) X 2, 42.3 (t), 42.5 (s), 43.2 (d), 43.9 (d), 44.6 (t), 51.0 (s), 53.2 (q), 53.4 (d), 59.0 (d), 59.2 (t), 61.2 (q), 62.5 (d), 63.2 (d), 63.2 (t), 63.7 (d), 65.1 (d), 65.2 (d), 73.1 (d), 76.0 (d), 77.1 (d), 81.1 (s), 83.5 (d), 90.4 (d), 105.9 (d), 116.5 (d), 119.6 (s), 125.6 (s), 130.0 (d), 144.1 (s), 157.3 (s), 176. 1 (s), 177.2 (s) X 2, 182.4 (s), 201.6 (s)
6. Infrarot-Absorptionsspektrum: (KBr-Methode)
3430, 2920, 1715, 1600, 1570, 1435, 1380, 1240, 1040 cm&supmin;¹
7. Ultraviolett-Absorptionsspektrum: λmax (in Methanol) 216nm(log&epsi; =4.15), 280nm(log &epsi; =4.01)
8. Schmelzpunkt: Unbestimmt. Allmähliches Braunwerden.
9. Löslichkeit in verschiedenen Lösungsmitteln: Gut löslich in Wasser, Methanol und Dimethylsulfoxid.
Die oben erwähnten physikalisch-chemischen Eigenschaften wurden mit Hilfe folgender Apparaturen bestimmt:
NMR-Spektrum:
AM-400 (Handelsprodukt von Bruker, West-Deutschland) Massenspektrum:
JMS-HX110 (Handelsprodukt von Nihon Denshi K.K., Japan) und M-80-B (Handelsprodukt von Hitachi Ltd., Japan) IR-Absorptionsspektrum:
IR-27G (Handelsprodukt von Shimadzu Co., Japan) UV-Absorptionsspektrum:
Doppelstrahlspektrophotometer Typ 200-20 (Handelsprodukt von Hitachi Ltd., Japan)
Spezifische Drehung:
Modell 141 (Handelsprodukt von Perkin-Elmer Copn., U.S.A.) Schmelzpunkt:
Mikro-Schmelzpunkt-Messvorrichtung (Handelsprodukt von Yanagimoto Seisakusho, Japan).
Tabelle I gibt Rf-Werte von KS-505 wieder, die man mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie unter Verwendung verschiedener Lösungsmittelsysteme erhält, wobei KS-505 durch UV-Licht bei 254 nm detektiert und sichtbar gemacht wurde. TABELLE 1 Silicagel-Platte Lösungsmittel-System Anmerkungen: A Chloroform/Methanol/Ethanol/Wasser=10:4:4:2 B Chloroform/Methanol/Ethanol/Wasser/Essigsäure= 10:4:4:1:1 C Chloroform/Methanol/Ethanol/Wasser/conc. wäßriger Ammoniak = 10:4:4:1:1 D 70% Methanol * Art 5628 (Merck) ** Art 13724 (Merck) Aufsteigende Entwicklung bei Zimmertemperatur; 15-40 Minuten.

III) Herstellung von KS-505:

KS-505 erhält man durch Kultivierung eines Mikroorganismus des Genus Streptomyces, der zur Produktion von KS-505 befähigt ist, in einem Medium, wobei KS-505 in der Kulturbrühe angehäuft und KS-505 daraus isoliert wird.
Vorzugsweise verwendet man für das erfindungsgemäße Verfahren Streptomyces argenteolus A-2 (im folgenden bezeichnet als Stamm A-2) der aus dem Erdreich in der Nähe von Shojiko, Yamanashi-ken, Japan, isoliert worden ist. Es können auch sämtliche anderen Stämme verwendet werden, vorausgesetzt sie gehören zum Genus Streptomyces und sind zur Produktion von KS- 505 befähigt.
Der Stamm A-2 besitzt folgende mykologischen Eigenschaften:

(1) Morphologische Eigenschaften:

Stamm A-2 wächst normal oder reichlich auf verschiedenen synthetischen und organischen Medien bekannten Typs und bildet ein graues Luftmycel aus. Vegetative Hyphen sind üblicherweise hellgelb gefärbt. Eine Fragmentierung des Mycels wird nicht beobachtet. Sporangiophoren liegen in Form gerader Ketten vor, die einfach vom Luftmycel abgezweigt sind. Sporen liegen spiralförmig vor. 10 oder mehr Sporen bilden eine Kette. Gewachsene Sporen sind ei- oder kugelförmig und weisen die Abmessungen 0,7-0,9 um x 1,0-1,1 um auf. Die Sporen besitzen glatte Oberflächen und kein Flagellum.

(2) Kultureigenschaften auf verschiedenen Medien:

Die folgende Tabelle 2 faßt die Kultureigenschaften zusammen, die man bei Kultivierung auf verschiedenen Medien bei 28ºC beobachtet. In dieser Tabelle sind Farbe und Farbton einer jeden Kultur unter Bezugnahme auf Color Harmony Manual, 4. Auflage, publiziert von Container Corpn. of America, Chicago, U.S.A. (1958) beschrieben. Die Ergebnisse erhält man 2 Wochen nach Beginn der Kultivierung. TABELLE 2 Medium Kultur-Eigenschaften Glucose-Asparagin-Agar Sucrose-Nitrat-Agar Anorganischer Stärke-Agar Tyrosin-Agar Nähr-Agar Malzextrakt-Hefe-Agar G: Moderat AM: Moderat, Perlmutt (3ba) R: Gelbton (1ba)-Creme (1 1/2 ca) SP: Nicht gefunden R: Creme (1 1/2 ca) SP: Hellgelb R: Elfeinbeinton (2cb) SP: Nicht gefunden R: Schale (3ca) AM: Reichlich, Sand (3cb) R: Creme (1 1/2 ca) - Bambus (2gc) G: Stark AM: Reichlich, Sand (3cb) R: Nelkenbraun (3ni)-Zimt (3 l e) Hafermehl-Agar Pepton-Hefe-Eisen-Agar Hickey-Tresner's-Agar G: Moderat AM: Wenig, Sand (3cb) R: Farblos SP: Nicht gefunden G: Stark AM: Wenig, Natur (3dc) R: Hellbernsteingelb (3ic) AM: Moderat, Perlmutt (3ba) R: Bambus (2gc)-Hellelfenbeinweiß (2ca) Anmerkungen: G... Wachstum, AM...Flächenmyzel R...Rückseite SP... Lösliches Pigment
(3) Physiologische Eigenschaften:
(a) Wachstumstemperatur (Optimum) 28-35ºC
(b) Verflüssigung von Gelatine: negativ
(c) Hydrolyse von Stärke: positiv
(d) Coagulation oder Peptonisierung von Magermilch: negativ
(e) Bildung von Melanoid-Pigment negativ
(f) Assimilierbarkeit von Kohlenstoffquellen (anorganisches Bridham- Gottlieb-Medium bzw. ISP Nr. 9- Medium) Assimilierbar: D-Xylose, D-Glucose, D-Fructose, Sucrose, L-Rhamnose und D-Mannitol. Nicht assimilierbar: L-Arabinose, i-Inositol und Raffinose.
(g) Zersetzung von Cellulose: negativ
(h) pH-Optimum 6,5 ~ 7,8
(i) Bildung von Tyrosinase negativ

(4) Chemische Analyse der Zellwand:

Bei Hydrolyse ganzer Zellen wurde festgestellt, daß die Zellwände L,L-Diaminopimelinsäure enthalten.
Beispielsweise unter Berücksichtigung der Merkmale der Sporenkette auf dem Luftmyzel und des Diaminopimelinsäure-Typus kann der vorliegende Stamm dem Genus Streptomyces zugeordnet werden. Unter Berücksichtigung verschiedener Merkmale, beispielsweise
1. gräuliches Luftmyzel,
2. spiralförmige Sporen,
3. glatte Oberfläche der Sporen,
4. fehlende Bildung von Melanoid-Pigment,
5. fehlende Bildung von löslichem Pigment oder fehlende Bildung von hellgelblichem löslichem Pigment und
6. Assimilierbarkeit von Kohlenstoffquellen,
sowie unter Bezugnahme auf die verschiedenen bekannten Mikroorganismen, die von der American Society of Bacteriology [vgl. zum Beispiel Int. J. Syst. Bacteriol. 30, 225 (1980], beschrieben und identifiziert wurden, wird davon ausgegangen, daß der vorliegende Stamm identisch ist mit Streptomyces argenteolus mit Ausnahme davon, daß der letztgenannte Stamm nicht Sucrose aber L-Arabinose assimiliert. Deshalb wurde der vorliegende Stamm als Streptomyces argenteolus A-2 bezeichnet.
Dieser Stamm wurde bei Bikoken (The Fermentation Research Institute of Industrial Science and Technology) 1-3, Higashi 1- chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan am 21. September 1988 unter der Bezeichnung FERM BP-2065 gemäß Budapester Vertrag hinterlegt.
Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendbaren Mikroorganismen können in herkömmlicher Weise, wie für verschiedene Mikroorganismen des Genus Streptomyces beschrieben, unter Verwendung synthetischer oder organischer Medien kultiviert werden, die geeignete Mengen assimilierbarer Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und organische Substanzen enthalten.
Beispiele für Kohlenstoffquellen, welche für diesen Zweck verwendet werden können, sind verschiedene Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose, Sucrose, Lactose, Stärke, Dextrin, Mannose, Maltose, Melasse und Kartoffelbrei; organische Säuren, wie Zitronensäure, Essigsäure und Fumarsäure; Alkohole, wie Methanol und Ethanol; Kohlenwasserstoffe, wie Methan, Äthan und n-Propan; Aminosäuren, wie Glutamin; Glycerin und Baumwollsamenöl. Diese Verbindungen können alleine oder in Kombination verwendet werden.
Beispiele für geeignete Stickstoffquellen sind Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat und andere Ammoniumsalze; Aminosäuren, wie Asparaginsäure, Glutaminsäure, Cystin und Alanin; Harnstoff, Malzextrakt, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Trockenhefe, Maisquellwasser, Sojabohnenpulver, Baumwollsamenöl, Casaminosäure, Pharmamedia (Handelsprodukt von Procter & Gamble, U.S.A.), lösliches Pflanzenprotein, Pflanzensaft und Fruchtsaft, wobei diese Substanzen alleine oder in Kombination verwendet werden können.
Beispiele für geeignete anorganische Substanzen sind Kaliumdihydrogenphosphat, Natriumdihydrogenphosphat, Magnesiumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisen(II)-Sulfat, Mangansulfat, Kobaltsulfat, Zinksulfat, Ammoniummolybdat, Kaliumaluminiumsulfat, Bariumcarbonat, Calciumcarbonat, Kobaltchlorid, Magnesiumchlorid, Kaliumchlorid und Natriumchlorid, wobei diese Verbindungen alleine oder in Kombination verwendet werden können.
Gewünschtenfalls kann das Medium außerdem beispielweise Vitamine enthalten, wie Panthothensäure und Puffer, wie 3-(N- Morpholino)-propansulfonsäure, um das Wachstum des Mikroorganismus oder die Produktion von KS-505 zu fördern oder zu stabilisieren. Für den Fall, daß der verwendete Mikroorganismus zum Wachstum spezielle Substanzen benötigt, besteht die Möglichkeit, diese Substanzen dem Medium zuzusetzen.
Vorzugsweise kultiviert man den Mikroorganismus unter Schütteln oder Rühren. Besonders gute Ergebnisse erzielt man durch Kultivierung unter Rühren und Belüften. Die Kultivierung kann gewöhnlicherweise bei einer Temperatur von 20-40ºC, vorzugsweise bei 25 bis 30ºC und bei einem pH von etwa 6 bis 8 erfolgen. Die Kultivierung kann üblicherweise über einen Zeitraum von 3 bis 10 Tagen erfolgen, um eine große Menge an KS-505 in der Kulturflüssigkeit und in den Zellen anzuhäufen.
Nach Beendigung der Fermentation kann man KS-505 mit Hilfe von herkömmlichen Techniken isolieren und reinigen, wie zum Beispiel durch Extraktion von KS-505 aus den Zellen mit geeigneten Lösungsmitteln, wie Ethanol und Aceton; Entfernung der Zellen durch Filtration oder Zentrifugation; Verteilung unter Verwendung eines geeigneten Lösungsmittelsystems; Säulenchromatographie oder Dünnschichtchromatographie, unter Verwendung von Absorptionsharz, Silicagel, Aluminiumoxid, Cellulose, Diatomeenerde oder Gelfiltrations-Mitteln. Auf diese Weise ist es möglich, KS-505 zu isolieren.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kann KS-505 aus der Kulturbrühe wie folgt isoliert und gereinigt werden:
Die Kulturbrühe wird filtriert oder zentrifugiert, um die Zellen zu entfernen. Das resultierende Filtrat oder den Überstand gibt man über eine Säule, die mit einem Adsorptionsharz, wie zum Beispiel Diaion HP-20 (Handelsprodukt von Mitsubishi Kasei Corporation, Japan) bepackt ist, um das aktive Material zu adsorbieren, gefolgt von einer Elution mit Hilfe eines geeigneten Lösungsmittels (wie zum Beispiel Methanol). Das Eluat konzentriert man bei vermindertem Druck und löst in einem geeigneten Lösungsmittel, wie zum Beispiel einem Gemisch aus Chloroform/Methanol/Ethanol/Wasser (10:4:4:1 v/v).
Mit der Lösung führt man dann eine Silicagel- Säulenchromatographie unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems der gleichen Zusammensetzung durch. Gewünschtenfalls kann die chromatographische Behandlung zweioder mehrmalig unter Verwendung eines geeigneten Lösungsmittelsystems wiederholt werden. Aktive Fraktionen werden gesammelt, kombiniert und bei vermindertem Druck konzentriert.
Aus der konzentrierten Lösung kann man KS-505 unter sauren Bedingungen mit Hilfe eines geeigneten Lösungsmittels extrahieren, welches mit Wasser nicht mischbar ist (zum Beispiel Ethylacetat). Die extrahierte Lösung wird anschließend konzentriert und einer Silicagel-Säulenchromatographie unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems, ähnlich dem oben beschriebenen, unterzogen. Gewünschtenfalls kann die chromatographische Behandlung wiederholt werden. Die Fraktionen, die ungereinigtes KS-505 enthalten, werden gesammelt, vereinigt und in einem geeigneten sauren Lösungsmittel gelöst, wie zum Beispiel einem Gemisch aus Methanol/Wasser/Essigsäure (7:3 v/v). Anschließend führt man damit eine präparative Hochdruckflüssigkeitschromatographie durch, wobei man eine gepufferte Lösung eines Gemisches aus Methanol/Ammoniumacetat (7:3 v/v) verwendet, um KS-505 in Form eines weißen Pulvers zu erhalten.
Im Verlauf des Reinigungsschrittes kann KS-505 durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung einer Fluoresceingefärbten Silicagel-Platte und durch anschließende Visualisierung mit UV bei 254 nm detektiert werden.

IV) Pharmazeutische Zusammensetzung:

Das erfindungsgemäße pharmazeutische Mittel umfaßt eine wirksame Menge der Verbindung KS-505 oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Exzipienten. Aufgrund der Amnesie-inhibierenden Aktivität von KS-505 können die pharmazeutischen Mittel zur Heilung und Prävention von Störungen der zerebralen Funktion, wie zum Beispiel Amnäsie und Demenz verwendet werden.
Bevorzugte Dosierungsraten der Zusammensetzung variieren in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren, wie zum Beispiel den gewünschten Wirkungen, Verfahren und Zeit der Verabreichung, Alter und Körpergewicht der Patienten. Um jedoch einen allgemeinen Hinweis zu geben wird vorgeschlagen, daß üblicherweise 0,01-100 mg/kg KS-505, für erwachsene Patienten auf oralem oder parenteralem Weg (zum Beispiel durch Injektion, intravenöse Tropfeninfusion, rektale Verabreichung mit Hilfe von Suppositorien, perkutane Salben usw.) verwendet werden können.
KS-505 ist gut verträglich und das Na-Salz zeigte keine lethale Wirkung bei Verabreichung von 1000 mg/kg per os an männliche ddy-Mäuse. Bei intraperitonealer Verabreichung beobachtet man einen LD&sub5;&sub0;-Wert von 417,5 mg/kg.
Obwohl die Möglichkeit besteht, KS-505 per se zu verabreichen, wird KS-505 üblicherweise in Form von Tabletten, Pillen, Pulvern, Granula, Kapseln, Suppositorien, Injektionen und Tropfeninfusionen formuliert. Verschiedene Methoden für derartige Formulierungen sind aus dem Stand der Technik bekannt.
Das erfindungsgemäße pharmazeutische Mittel kann beispielsweise verschiedene Exzipienten, Gleitmittel, Bindemittel, zerfallsbeschleunigende Mittel, Dispergiermittel, isotonisierende Mittel, Emulgiermittel und Absorptionsbeschleunigende Mittel enthalten.
Beispiele für zu diesem Zweck geeignete Träger sind Wasser, destilliertes Wasser zur Injektion, physiologische Kochsalzlösung, Glucose, Fructose, weißer Zucker, Mannitol, Lactose, Stärke, Maisstärke, Cellulose, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Alginsäure, Talk, Natriumcitrat, Calciumcarbonat, einbasiges Calciumphosphat, Magnesiumstearat, Harnstoff, Silikonharz, Sorbitan-Fettsäureester und Glycerin-Fettsäureester.
Das pharmazeutische Mittel kann beispielsweise KS-505 in einer Menge von 0,01-85 Gew.-% enthalten.
Die folgenden Beispiele und Experimente veranschaulichen die vorliegende Erfindung.

BEISPIEL 1

Streptomyces argenteolus A-2 (FERM BP-2065) verwendet man zum Animpfen. Ein Medium, enthaltend Glucose (1,0 g/dl), lösliche Stärke (1,0 g/dl), Fleischextrakt (0,3 g/dl; Handelsprodukt von Kyokuto Pharmaceutical Industries, Japan), Stärkeextrakt (0,5 g/dl; Handelsprodukt von Daigo Eiyou Kagaku K.K., Japan), Pepton (0,5 g/dl; Handelsprodukt von Difco, U.S.A.) und Calciumcarbonat (0,2 g/dl) mit einem pH von 7,2 verwendet man als Impfmedium.
Den Impfstamm transferiert man in das Impfmedium (10 ml) in einem Teströhrchen und kultiviert unter Schütteln bei einer Temperatur von 28ºC über einen Zeitraum von 5 Tagen. Die Impfkultur (4 ml) inokuliert man in ein Impfmedium (40 ml) der gleichen Zusammensetzung in einem Erlenmeyer Kolben (300 ml) und kultiviert 2 Tage unter Schütteln bei einer Temperatur von 28ºC. Die resultierende Impfkultur (1,8 l) inokuliert man in ein Fermentationsmedium (18 l) in einem 30 l Glasfermentor, wobei das Fermentationsmedium folgende Zusammensetzung aufweist:
Glucose (1,0 g/dl), Maltose (4g/dl), 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure (1,0 g/dl), Magnesiumsulfat 7H&sub2;O (0,05 g/dl), Sojabohnenpulver (1,5 g/dl), Pharmamedia (1,5 g/dl, Procter & Gamble, U.S.A.) und Calciumcarbonat (0,5 g/dl) [pH 7,0].
Die Kultivierung erfolgt unter Rühren (300 U.p.m.) und Belüften (181 /min.) bei einer Temperatur von 28ºC über einen Zeitraum von 5 Tagen. Nach Beendigung der Kultivierung zentrifugiert man die Kultur (7000 U.p.m.) und isoliert den Überstand. Den Überstand gibt man über eine Säule (2 l) bepackt mit Diaion HP-20 (Handelsprodukt von Mitsubishi Kasei Corporation, Japan) und wäscht der Reihe nach mit 6 l Wasser, 6 l 50 % Methanol und 10 l Methanol. Dann erfolgt die Eluierung mit Methanol, enthaltend 1 % Ammoniak (10 l). Die Methanolfraktionen, die 1 % Ammoniak enthalten, werden gesammelt, vereinigt und unter vermindertem Druck konzentriert, wobei man ein braunes Öl (etwa 2,7 g) erhält, das man in einem Gemisch (10 ml) aus Chloroform/Methanol/Ethanol/Wasser (10:4:4:1 v/v) auflöst. Die Lösung trägt man auf das obere Ende einer Silicagel-Säule auf (500 ml; bepackt mit Wako Gel C-200 [Wako-Gel ist ein Handelsprodukt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan], gefüllt mit einem Gemisch der oben erwähnten Zusammensetzung). Die Entwicklung erfolgt mit Hilfe eines Lösungsmittelsystems mit der oben erwähnten Zusammensetzung (1500 ml) und Methanol (1000 ml) in dieser Reihenfolge.
Das Eluat wird anschließend gesammelt und unter vermindertem Druck aufkonzentriert, wobei man ein Öl erhält (1,5 g), das man in einem Gemisch aus
Chloroform/Methanol/Ethanol/Wasser /4ml, 10:4:4:1 v/v) löst, und anschließend auf das obere Ende einer Silikagel-Säule aufträgt (200 ml; bepackt mit Wako Gel C-200 und gefüllt mit einem Gemisch der oben erwähnten Zusammensetzung). Das Eluat wird gesammelt und in kleine Fraktionen (von jeweils 10 ml) aufgeteilt. Die aktiven Fraktionen (Nrn. 17-42) werden vereinigt und bei vermindertem Druck aufkonzentriert, wobei man ein braunes Öl (etwa 460 mg) erhält. Das Öl suspendiert man in etwa 50 ml 10%igem Methanol und stellt mit 2N Salzsäure auf pH 2 ein.
Anschließend führt man eine Extraktion mit drei 400 ml- Portionen Ethylacetat durch. Die Ethylacetat-Schichten werden gesammelt, vereinigt und bei vermindertem Druck aufkonzentriert, wobei man einen braunen Feststoff (266 mg) erhält.
Dieses Material löst man in einem Gemisch aus Chloroform/Methanol/Ethanol/Wasser (1 ml; 10:4:4:1 v/v) und trägt es auf das obere Ende einer Silicagel-Säule auf (50 ml; bepackt mit Wako Gel C-300 und befüllt mit einem Gemisch der oben erwähnten Zusammensetzung). Die Entwicklung erfolgt unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems mit der oben erwähnten Zusammensetzung. Das Eluat wird gesammelt und in kleine Fraktionen (von jeweils 5 ml) aufgeteilt.
Die aktiven Fraktionen (Nrn. 13-25) werden gesammelt, kombiniert und unter vermindertem Druck konzentriert, wobei man ein leicht bräunliches festes Material (etwa 256 mg) erhält, das man anschließend in einem Gemisch (1 ml) aus Chloroform/Methanol/Ethanol/Wasser (10:4:4:1 v/v) löst. Diese Lösung trägt man auf eine Lobar-Säule (Lichroprep Si60, Größe B, Handelsprodukt von Merck AG., West-Deutschland) auf, die mit einem Gemisch der oben erwähnten Zusammensetzung äquilibriert wurde.
Ein Lösungsmittelsystem (1000 ml) der oben erwähnten Zusammensetzung wird zur Entwicklung verwendet. Zur weiteren Entwicklung verwendet man ein Gemisch (900 ml) aus Chloroform/Methanol/Ethanol/Wasser (10:4:4:2 v/v). Das Eluat teilt man in kleine Fraktionen (jeweils 10 ml) auf. Die aktiven Fraktionen (Nrn. 14-34) werden gesammelt, vereinigt und bei vermindertem Druck konzentriert, wobei man ein hellbraunes Pulver (56 mg) erhält.
Das Pulver löst man in einem ähnlichen Gemisch aus Methanol/Wasser/Essigsäure (28 ml). Mit der Lösung führt man mehrere Male eine präparative Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie unter den folgenden Bedingungen durch:
Apparatur: LC6A System (Handelsprodukt von Schimadzu Co., Japan)
Säule: RadialPak (8 x 100 mm) gefüllt mit Nova-Pak (ODS, 4 um) (Handelsprodukte von Waters, U.S.A.)
Eluent: Methanol/0,2 M Ammoniumacetat, gepufferte Lösung in (pH 7,0) 7:3 v/v)
Probenvolumen: 1 mg, einmalig
Elutionsgeschwindigkeit: 3,0 ml/min.
Die Fraktionen mit einer Retentionszeit von 3,0-4,3 Minuten werden gesammelt, vereinigt und bei vermindertem Druck konzentriert. Das konzentrierte Material wird gefrier- getrocknet, wobei man ein weißes Pulver (40 mg) erhält, das man in 1N Salzsäure (20 ml) löst. Die Lösung extrahiert man dreimal mit 60 ml Portionen Ethylacetat. Die organischen Schichten werden gesammelt, vereinigt und mit einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abgedampft. Man erhält KS-505 (33 mg) in Form eines weißen Pulvers.
Im Verlauf der Reinigung detektiert man KS-505 durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung einer Fluoresceingefärbten Silicagel-Platte (60F&sub2;&sub5;&sub4; Platte: Art 5715, Handelsprodukt der Merck AG.), die mit Hilfe eines Lösungsmittelsystems aus Chloroform/Methanol/Ethanol/Wasser (10:4:4:2 v/v) entwickelt wurde und wobei die Visualisierung anschließend im UV-Licht bei 254 nm erfolgt.

BEISPIEL 2

KS-505 (96 mg; hergestellt mit Hilfe des Verfahrens gemäß Beispiel 1) und Natriumbicarbonat (22 mg) löst man in Wasser (15 ml). Die Lösung wird gefriergetrocknet, wobei man das Natriumsalz von KS-505 (101 mg) erhält.

BEISPIEL 3

Tablette:

Zu einem Gemisch aus KS-505 (100 g), Lactose (35 g), Maisstärke (18 g) und Carboxymethylcellulose-Calcium (10 g) gibt man eine 10%ige Lösung von Hydroxypropylcellulose (50 g).
Nach ausgiebigem Kneten behandelt man das Material in einer Tablettiermaschine, die mit einem Gitter mit 0,1 mm Öffnungen ausgerüstet ist. Zu dem resultierenden Material gibt man Magnesiumstearat (2g) hinzu und behandelt das Gemisch in herkömmlicher Weise, um Tabletten zu erhalten, wobei jede davon (170 mg; Durchmesser 8 mm) 100 mg KS-505 enthält.

BEISPIEL 4

Kapsel:

Zu einem Gemisch aus KS-505 (50 g) Lactose (75 g) und Kartoffelstärke (38 g) gibt man eine 10%ige Lösung von Hydroxypropylcellulose (50 g). Das Material wird sorgfältig geknetet und in ähnlicher Weise wie in Beispiel 3 beschrieben granuliert. Nach Zugabe von Magnesiumstearat (2g) füllt man das Material in Kapseln in herkömmlicher Weise, um die gewünschten Kapseln (jeweils 170 mg), enthaltend 50 mg KS-505, herzustellen.

BEISPIEL 5

Softkapsel:

KS-505 (10 g) gibt man zu 100 g Sojabohnenöl.
Die resultierende Lösung gibt man in Kapseln in herkömmlicher Weise, um die gewünschten Softkapseln (jeweils 110 mg) herzustellen, die 10 mg KS-505 enthalten.

EXPERIMENT

Die Amnesie-inhibierende Aktivität von Verbindung KS-505 wird in folgender Weise bestimmt:
Als Testtiere verwendet man männliche Mäuse(ddy-Stamm; Körpergewicht 24-28 g; jede Gruppe bestehend aus 15 Mäusen). Mit Hilfe der passiven Ausweichreaktion (Stepthrough Type 1) der Tiere wird der Einfluß von KS-505 auf die Lernfähigkeit der Tiere in folgender Weise getestet:
Ein Dunkel-Adaptometer, umfassend einen Lichtraum (15 x 9 x 11 cm; beleuchtet mit einer weißen 4W Fluoreszenzlampe) und einem Dunkelraum (15 x 14 x 18 cm) verwendet man in diesem Experiment. Zwischen den beiden Räumen verwendet man eine Schiebetür (3 x 3cm) als Trennung. Jeder Raum besitzt einen Gitterboden aus Edelstahl. Im Dunkelraum kann ein schwacher elektrischer Strom auf das Tier über den Boden des Dunkelraums angelegt werden.
Es werden jeweils physiologische Lösungen von Natriumchlorid (20 ul), enthaltend 5, 20 oder 50 ug KS-505 (Natriumsalz) als Testlösung verwendet; eine physiologische Natriumchloridlösung, die kein KS-505 Hatriumsalz enthält, wird als Kontrolle verwendet.
Eine Testlösung (20 ul) verabreicht man in das linke Ventrikel des Testtiers mit Hilfe einer two-step-Nadel. 30 Minuten später wird ein Lern-Test wie folgt durchgeführt:
Das Tier wird in den Lichtraum gebracht. Zehn Sekunden später öffnet man die Tür. Unmittelbar nachdem das Tier vollständig in den Dunkelraum eingetreten ist, wird ein elektrischer Strom am Gitterboden des Dunkelraums angelegt, um auf das Tier einen Fußschock (0,18 mA, zwei Sekunden, 2000V) auszuüben. Unmittelbar darauf nimmt man das Tier aus dem Dunkelraum.
Tiere, die mehr als 60 Sekunden benötigen, um in den Dunkelraum zu gelangen, werden von der anschließenden Behandlung ausgeschlossen.
Unmittelbar nach dem Lern-Test induziert man eine Amnesie bei dem Tier, indem man einen Elektroschock (25 mA, 2,5 x 10&supmin;³ Sekunden, 2000 V) ausübt. 24 Stunden später bringt man das Tier erneut in den Lichtraum ein. 10 Sekunden später öffnet man die Tür. Eine Latenz, bzw. ein Intervall zwischen dem Zeitpunkt der Türöffnung und dem Zeitpunkt für den vollständigen Eintritt des Tiers in den Dunkelraum wird bestimmt. Die Messung erfolgt über einen Zeitraum von 600 Sekunden. Ein Intervall von mehr als 600 Sekunden wird als 600 Sekunden bewertet.
Aus Tabelle 3 ist ersichtlich, daß man im Falle einer Verabreichung des Natriumsalzes von KS-505 an das Tier in einer Menge von 5 ug pro Tier eine signifikante Amnesie-inhibierende Aktivität beobachtet. In dieser Tabelle bezeichnet Gruppe I unbehandelte Tiere bzw. Tiere, denen das Natriumsalz von KS-505 nicht verabreicht wurde und die keiner Amnesie-Behandlung (Elektroschock) unterzogen wurden. Die Tiere der Gruppe II wurden einer Amnesiebehandlung ohne vorherige Verabreichung des Natriumsalzes unterzogen. Sämtlichen Tieren der Gruppen III bis V wurde das Natriumsalz von KS-505 vor der Amnesiebehandlung verabreicht. Die verabreichten Mengen an KS-505 Natriumsalz sind in der Tabelle angegeben. TABELLE 3 Gruppe Dosis Latenz (Sekunden) (*1) Kontrollgruppen Testgruppen Anmerkungen: *1- Mittelwert ± Standardabweichung. *2- Vergleich mit Gruppe I, p < 0,0001 *3- Vergleich mit Gruppe II, p < 0,02

Claims

1. Verbindung KS-505 der Formel (I): und die pharmazeutisch verträglichen Salze davon.

2. Salz nach Anspruch 1, gebildet mit einer Verbindung ausgewählt unter Methylamin, Ethylamin, Anilin, Dimethylamin, Diethylamin, Pyrrolidin, Piperidin, Morpholin, Piperazin, Trimethylamin, Triethylamin, N,N-Dimethylanilin und Pyridin, Natrium, Kalium, Magnesium und Calcium.

3. Natriumsalz gemäß Anspruch 2 der folgenden Formel (III):

4. Verfahren zur Herstellung der Verbindung KS-505 der Formel (I), wobei man einen Mikroorganismus kultiviert, der unter den Genus Streptomyces einzuordnen ist und zur Produktion der Verbindung KS-505 in einem Medium und zur Anhäufung der Verbindung KS-505 in dem Medium befähigt ist, und man die gewünschte Verbindung daraus isoliert.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin der Mikroorganismus Streptomyces argenteolus A-2 (FERM BP-2065) oder eine KS- 505-produzierende Mutante davon ist.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei man die Kultivierung bei einer Temperatur von 20 bis 40ºC und bei einem pH-Wert von 6 bis 8 drei bis zehn Tage durchführt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, worin man die Isolierung mit Hilfe von Säulenchromatografie durchführt.

8. Pharmazeutisches Mittel zur Verbesserung der zerebralen Funktion, umfassend eine wirksame Menge der Verbindung KS- 505 oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon gemäß Anspruch 1 in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Exzipienten.

9. Pharmazeutisches Mittel nach Anspruch 8, worin das Salz gebildet wird mit einer Verbindung, ausgewählt unter Methylamin, Ethylamin, Anilin, Dimethylamin, Diethylamin, Pyrrolidin, Piperidin, Morpholin, Piperazin, Trimethylamin, Triethylamin, N,N-Dimethylanilin und Pyridin, Natrium, Kalium, Magnesium und Calcium.

10. Biologisch reine Kultur des Stamms Streptomyces argenteolus A-2, hinterlegt als FERM BP-2065 und Mutanten davon, welche zur Produktion der Verbindung KS-505 gemäß Anspruch 1 durch Fermentation befähigt sind.

11. Verbindung mit anti-amnestischen Wirkungen bei Säugetieren, wobei die Verbindung durch Fermentation mit Hilfe von Streptomyces argenteolus A-2 (FERM BP-2065) herstellbar ist, wobei die Verbindung die folgenden physikalisch- chemischen Eigenschaften in Form der freien Säure aufweist:

1) Beschaffenheit: Weißes Pulver. Saure Substanz.

2) FAB Massenspektrum: m/z 1075 (M+H-H&sub2;O)&spplus;, gemessen ohne Zugabe von Natriumchlorid und 1115 (M+Na)&spplus;, gemessen bei Zugabe von Natriumchlorid.

3) Hochauflösendes FAB Massenspektrum: m/z 1115. 5903, gemessen bei Zugabe von Natriumchlorid.

Berechnet als C&sub6;&sub1;H&sub8;&sub8;O&sub1;&sub7;Na: 1115.5920

4) Molekülformel: C&sub6;&sub1;H&sub8;&sub8;O&sub1;&sub7;

5) ¹H HMR Spektrum: (400MHz, 10 mg/0,4ml CD&sub3;OD)

δ (ppm); 0.77(s), 0.80(br s), 1.05(d), 1.10(s), 1.37(s), 1.52(m), 1.83(m), 2.31(m), 2.45(m), 2.79 (br t),2.94(dd), 3.34(s), 3.52(s), 3.61(br s), 3.72(m), 3.81(d), 3.90(d), 4.36(d), 7.16(d), 7.29(d)

6) ¹³C NMR Spektrum: (100 MHz, 10mg/0,4ml CD&sub3;OD)

δ (ppm); 11.4(q), 15.0(q), 16.3(q), 17.4(q), 18.2(t), 18.7(q), 18.9(t), 20.2(t), 20.9(t), 22.0(t), 22.6(t), 23.0(q), 23.1(q), 24.5(q), 29.6(t), 34.1(t), 35.4(t), 36.7(t), 38.4(t), 39.5(s), 39.7(t), 39.8(s), 40.5(s), 42.8(s), 43.1(s), 43.3(d), 43.4(t), 44.1(t), 44.2(s), 44.4(d), 45.1(t), 50.5(s), 52.3(q), 53.9(d), 59.1(d), 60.3(t), 61.2(q), 62.7(d), 63.2(t), 64.1(d), 64.3(d), 65.1(d), 65.7(d), 73.2(d), 76.7(d), 77.0(d), 81.1(s), 84.7(d), 88.2(d), 107.3(d), 107.6(s) & 108.0(s), 122.0(d), 123.5(s), 125.4(d), 126.0(s), 142.6(s) & 142.8(s), 156.1(s), 170.2(s), 172.4(s), 174.9(s), 177.7(s)

7) Infrarot-Absorptionsspektrum: (KBr Methode) 3450, 2950, 1730, 1715, 1460, 1385, 1270, 1240, 1120, 1045 cm&supmin;¹

8) Ultraviolett-Absorptionsspektrum: ( λ max in Methanol) 221nm(log &epsi; = 4.47), 308 nm(log &epsi; = 3.63)

9) Spezifische Drehung: [α]25D = -63,5º (c 0.1 in Methanol) unmittelbar nach dem Auflösen gemessen.

10) Schmelzpunkt: Unbestimmt. Allmähliches Braunwerden.

11) Farbreaktionen:

Positive Reaktionen mit Anisaldehyd, Schwefelsäure, Jod und Bromkresolgrün. Negative Reaktionen mit Ninhydrin, Dinitrophenylhydrazin, Eisen-III-chlorid und Anilin- Phthalsäure; Rydon-Smith Reaktion und Dragendorff Reaktion.

12) Löslichkeit in verschiedenen Lösungesmitteln: Löslich in Methanol, Dimethylsulfoxid, Ethylacetat und wässriger Base. Schlecht löslich in Hexan, Chloroform und wässriger Säure;

und die pharmazeutisch verträglichen Salze davon.