DE654490C

DE654490C - Verfahren zur Herstellung von cellulose- und hemicellulosespaltenden Enzymen

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Publication number: DE654490C
Application number: DEK128782D
Authority: DE
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1933-01-27
Filing date: 1933-01-27
Publication date: 1937-12-24

Description

Verfahren zur Herstellung von cellulose- und hemicellulosespaltenden Enzymen Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung hochwirksamer cellulose- und hemicellulosespaltender Enzyme, welches eine Gewinnung dieser insbesondere für therapeutische, aber auch für verschiedene technische Zwecke geeigneten Stoffe in technischem Ausmaß ermöglicht.
Man hat bereits aus 'Malz und Schneckendarm cellulose- und heinicellulosespaltende Enzyme gewinnen können. Auch im Pansen des Rindes wurde eine Aspergillusart, der Aspergillus celltilosac, gefunden, der cellulose- und hemicellulosespaltende Enzyme liefert. Ferner wurden aus Aspergillus oryzae Präparate gewonnen, die Cellulase und Hemicellulase enthalten.
Diese Verfahren sind jedoch durchweg zur technischen Gewinnung der in Frage stehenden Enzyme. ungeeignet. Zum einen Tvil sind die Ausgangsmaterialien nur schwer zu b.@-schaffen und ihr Gehalt an wirksamer Substan7 so gering, daß eine wirtschaftliche Gcwinnung der Enzyme ganz ausschaltet; will anderen Teil sind zwar die Ausgangsmaterialien geeinnet, jedoch die bisher getroffenen 14aßnahinen so unzulänl;lich, daßPräparate von nur ganz geringer Wirksamkeit erzielt werden.
Es wurde nun gefunden, daß man aus Scliiinmelpilzen, insbesondere Aspergillusarten, 'wie z. B. Asperriillus oryzae, auf technisch gangbare Weise relltilose- und liemirellulosespaltende Enzyme hoher Wirksamkeit erhalten kann, wenn man (las Pilzwachstum bis zu eli1ei11 ganz 1)c#stiillnitci1 Staditn11 durchführt. Es ist bekannt, daß man aus Aspergillus oryzae ein hauptsächlich aus Amylase bestehendes Enzymgemisch erhält, wenn man das Pilzwachstum in .einer Entwicklungsstufe unterbricht, in der die Mycelbildung ihr Maximum erreicht hat ,und eben die Bildung von Konidie nträger beginnt ; in diesem Stadium, das bei den gegenwärtig zumeist üblichen Züchtungsbedingungen nach etwa -.2 bis 48 Stunden eintritt, hat die Amylasemenge ein Optimum erreicht. Sie geht bei weiterer Züchtung wieder langsam zurück. Die vorliegende Erfindung besteht nun darin, daß man die Züchtung des Pilzes über dieses Amylaseoptimum hinaustreibt. Es ergibt sich dabei der überraschende Effekt, daß die ,Menge und Wirksamkeit der Cellulase und der Hemicellulasen bei 'weiterer Züchtung ständig ansteigt, um schließlich etwa den doppelten Wert zu erreichen.
Für clie Kontrolle des Entwicklungszustandes sind folgende leicht erkennbare äußere 1Ierl:male wesentlich: Gegen Ende des sogenannten Mycelst<iclitnns findet man die ganze Masse von weif3eni llycel durchwachsen. Es befinden sich bereits Iionidienträger im Stadium der Iionidienbildung. Im Verlaufe der weiteren Züchtung, auf die es hier ankommt, wird die reichliche Bildung von Sporen daran erkenntlich, daß .in der ganzcit 14Iasse die Farbe der Sporen (im Falle von Aspergillus oryzae gell) bis gelbgrün) erscheint. Wenn der Farbumschlag erreicht ist, kann die Züchtung abgebrochen werden. Die Zeit, welche der Pilz zum Wachstum bis zu dein eben gekennzeichneten Stadium braucht, ist sehr verschieden und hängt im wesentlichen von den V ersuchsb-cdingungen, z. B. Temperatur, Nährböden, Zusatz von Nährsalzen. Aktivatoren u. dgl., ab, «-elche die Züchtungsdauer wesentlich beeinflussen können.
Zur Kontrolle dieser Vorgänge und zur Einhaltung der optimalen Züchtungszeiten kann man das Optimum der Amylasebildung nach Willstätter-Schudel, Ber. d. deutsch. chem. Ges. 51, -,So (ISIS), mittels Stärke als Substrat und das Optimum an gebildeten cellulose- und hemicellulosespaltenden Enzymen mittels umgefällter Cellulose als Substrat bestimmen. Auch die Methoden von Karrer (P. Karrer, B. Joos und \T. Staub. :Zur Kenntnis des Lichenins;<, Helv. chim. acta VI, 1923, S. Sool haben sich zur Bestimmung des Lichenasewertes als brauchbar bewährt. Nach dem vorliegenden Verfahren lassen sich Enzymgemische mit einem Lichenasewert von etwa o,7 gcwinnen. Man geht dabei erfindungsgemäß so vor, da13 man fortlaufend die Lichenasewerte bestimmt und die Züchtung erst dann unterbricht, wenn Lichenasewerte von über o, i erreicht sind.
Die gewonnenen Enzymgemische enthalten Cellulase und mehrere Hemieellulasen, z. B. auch solche, welche Xylan, Pektin, Mannane, Chitin u. a. angreifen. Ferner sind Amylase, Lellobiase. Glukosidasen. Protcasen und 1'hosphatasen vorhanden.
Alle diese Enzyme können in ihrer Ge--amthcit durch Fitraktion mittels \\'assers gewonnen und nach üblicher Methode aufgearbeitet werden.
Eine Trennung einzelner Enzyme aus dem 1?nzymgemisch kann wie üblich vorgenommen werden, z. B. durch Adsorption und darauffolgende Elution, wobei man nicht nur die üblichen Adsorptionsmittel, wie Kohle, Kieselsäure, Kaolin, Metalloxyde und -hydroxc-dc, sondern auch natürliche oxydische \Iiueralii#n, wie Bauxit und Diaspor. verwenden kann. Durch Dialyse erreicht man eine weitgehende Beseitigung indifferenter Ballaststoffe, ebenso auch ein Verschwinden des inulin- und mannanspaltenden Fermentes.
Eine Isolierung der Enzyme kann auch mittels Alkohols vorgenommen werden, wobei gleichzeitig eine Abtrennung von Ballaststoffen und von unangenehmen Geschmackstoffen erreicht wird.
Eine Reinigung von diesen Stoffen kann man auch durch Behandeln des gewonnenen Enzympulvers mit verdünntem Alkohol erreichen.
Ausführungsbeispiel 1, 5 kg Kleie werden mit 1 1 Wasser angerührt, evtl. unter Zusatz von 15g eines aus Salzen des Kaliums, Calciums, :Magnesiums und Ammoniums und der Phosphor- und Schwefelsäure bestehenden üblichen Nährsalzgemisches. Die Kleie wird sterilisiert und nach dem Abkühlen mit Aspergillus oryzae geimpft. Man läßt die Kulturen unter Lüftung 3 bis 6 Tage lang in üblicher Weise sich entwickeln, bis die gesamte Masse von einem gleichmäßigen gelbgrünen Sporenrasen überzogen ist. Wenn dabei der oben angegebene Lichenasewert von über o, i erreicht ist,-extrahiert man die Pilzmasse mit Wasser, dampft die wäßrigen Extrakte ein oder bringt das Material in trockene Form.
Das Produkt eignet sich für tcclinische und pharmazeutische Zwecke.

Claims

P<\TI:NTA-2',SPR1; C lt Verfahren zur Herstellung von cellulose-und hemicellulosespaltenclcn I?nzymen durch Züchtung von Schimmelpilzen, wie Aspergillus oryzae, auf einem üblichen \Tährboden bis zur Sporenbildung, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung der Schimmelpilze so weit über das Amylascoptimum hinaustreibt, bis eine Probe einen Lichenasewert von über o, i aufweist, hierauf die Pilzmasse mit Wasser extrahiert und - aus dem Extrakt die l:iizytne in üblicher Weise gewinnt.