CN102964426B - 用于预防和/或治疗癌症的肿瘤抗原 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于预防和/或治疗癌症的肿瘤抗原。具体地，本发明涉及编码多肽的核酸，和核酸或多肽在预防和/或治疗癌症中的应用。更具体地，本发明涉及改进的用于***和表达编码肿瘤抗原的外来基因的载体，所述的载体用于免疫治疗性处理癌症。

Description

用于预防和/或治疗癌症的肿瘤抗原

本申请是申请日为2004年5月15日的中国专利申请200480020256.3“用于预防和/或治疗癌症的肿瘤抗原”的分案申请。相关申请 

本申请要求享有2003年5月16日提交的系列号60/471,119和2003年5月16日提交的60/471,193的优先权。 

技术领域

本发明涉及编码多肽的核酸，和核酸或多肽在预防和/或治疗癌症中的应用。更具体地，本发明涉及改进的用于***和表达编码肿瘤抗原的外来基因的载体，所述的载体用于免疫治疗性处理癌症。 

背景技术

近几年来，由于在高密度微阵列、SEREX、免疫组织化学(IHC)、RT-PCR、原位杂交(ISH)和激光捕获显微术等数项技术的辅助下，基于原发肿瘤和正常细胞的表达谱分析的分子鉴定的巨大进展，在用肿瘤相关抗原(TAA)开发癌症疫苗方面取得了巨大进步(Rosenberg，Immunity，1999；Sgroi等，1999，Schena等，1995，Offringa等，2000)。TAA是肿瘤细胞表达的或超量表达的抗原，且对一种或几种肿瘤是特异性的，例如CEA抗原在结直肠癌、乳腺癌和肺癌中表达。Sgroi等(1999)组合使用激光捕获显微解剖和cDNA微阵列，鉴定出了在侵入性和转移性癌细胞中差异表达的几种基因。可以使用几种送递***(象DNA或病毒)来针对人癌症治疗性地接种疫苗(Bonnet等，2000)，且可以引起免疫应答，也可以中断针对TAA的免疫耐受。通过***编码尤其是T细胞共刺激分子(例如B7.1)或细胞因子(例如IFN-γ，IL2，或GM-CSF)的转基因，可以为肿瘤细胞提供更多的免疫原性。已经证实，TAA和细胞因子或共刺激分子的共表达可以用于开发有效的治疗性疫苗(Hodge等，95，Bronte等，1995，Chamberlain等，1996)。 

本领域需要能用于刺激免疫应答的试剂和方法来预防或治疗癌症。本发明提供了这样的试剂和方法，这克服了其它人在尝试治疗癌症时遇到的许多困难。 

发明内容

本发明提供了用于施用给患者以预防和/或治疗癌症的免疫原性靶。更具体地，免疫原性靶是肿瘤抗原(″TA″)和/或血管发生相关抗原(″AA″)。在一个实施方案中，免疫原性靶由SEQ ID NO.：29或SEQ ID NO.：31编码，或具有SEQ ID NO.：30或SEQ ID NO.：32的氨基酸序列。在某些实施方案中，将TA和/或AA作为包含在质粒或其它送递载体(例如重组病毒)中的核酸施用给患者。也可以将TA和/或AA与免疫刺激物(例如共刺激分子或佐剂)组合施用。 

附图说明

图1.A.AAC2-1和AAC2-2的核苷酸序列。B.预测的AAC2-1和AAC2-2的氨基酸序列的比对。缺失的核苷酸或氨基酸标记为″＊″。序列之间的差异标有下划线。 

图2.A.人淋巴细胞应答于源自AAC2-2蛋白的肽而分化成能分泌IFN-γ的效应细胞。用表III所示的肽组(组1-9)刺激了T细胞。刺激3轮后，通过ELISPOT分析了淋巴细胞的肽-特异性的IFN-γ生产。B.***的图表明，由肽组#6刺激的活化的细胞能抗原-特异性的CTL活性地杀伤肽加载的T2靶细胞。肽EC5会引起诱导CTL活性和IFN-γ分泌的显性活性。 

图3.用编码人AAC2-2的DNA质粒进行DNA免疫，会使来自HLA-A2-Kb转基因小鼠的鼠T细胞能识别和分泌IFN-γ。用不同组的肽，重新刺激了来自pEF6-hAAC2-2-免疫的小鼠的脾细胞。6天后，收获细胞，并测试每个肽组或对照HLA-A2-结合的9-聚物HIV肽引起的IFN-γ分泌。将ELISPOT平板孵育过夜，并显色。每组反应于PMA和用作阳性对照的伊屋诺霉素而产生高水平的IFN-γ(超过250个斑点)。至今测试的来自HLA-A-0201⁺供体的人淋巴细胞也识别出了高反应性肽组中的一个(组6)。 

图4.用编码人AAC2-2的基因进行DNA接种，可以完全阻止植 入的B16F10黑素瘤细胞的生长。该作用不是由于非特异性的免疫应答，这是由编码流感-NP蛋白和人flkl的质粒(VEGFR-2)不能阻止肿瘤生长所证实的。 

图5.将B16F10黑素瘤细胞植入C57BL/6小鼠后的小鼠存活率证实了，用人AAC2-2载体进行DNA接种，可以完全保护免受肿瘤生长的作用。该保护作用是抗原-特异性的，且不能通过接种其它基因来引起。 

图6.用pEF6-hAAC2-2表达质粒进行DNA接种后，人AAC2-2的肽能引起来自C57BL/6小鼠的T淋巴细胞表现出效应细胞活性，并分泌IFN-γ。这些肽可以表现出B6MHC I类的交叉反应性。组1和组5中的肽能诱导C57BL/6T细胞的强反应性。 

图7.BFA4cDNA序列。 

图8.BFA4氨基酸序列。 

图9.针对BFA4肽的免疫应答。 

图10.BCY1核苷酸(A)和氨基酸(B)序列。 

图11.针对特异性的BCY1肽的免疫应答。 

图12.BFA5cDNA序列。 

图13.BFA5氨基酸序列。 

图14.针对BFA5-衍生的肽的免疫应答。 

图15.BCZ4cDNA和氨基酸序列。 

图16.针对BCZ4-衍生的肽的免疫应答。 

图17.BFY3cDNA和氨基酸序列。 

图18.针对BFY3-衍生的肽的免疫应答。 

具体实施方式

本发明提供了用于治疗和/或预防癌症的试剂和方法。在本申请中引用的所有文献都引作参考。 

在一个实施方案中，本发明涉及诱导或增强针对一种或多种肿瘤抗原(″TA″)的免疫应答，以预防和/或治疗癌症。在某些实施方案中，可以组合一种或多种TA。在优选的实施方案中，例如施用编码肿瘤抗原的核酸载体或肽或多肽形式的肿瘤抗原自身后，TA在宿主细胞中的表达引起免疫应答。 

如本文所使用的，″抗原″是一种分子，例如多肽或其部分，其能在已经施用了该抗原的宿主中产生免疫应答。免疫应答可以包括能结合至少一个抗原表位的抗体的生成和/或针对能表达抗原表位的细胞的细胞免疫应答的生成。该反应可以是现有免疫应答的增强，例如通过造成增强的抗体生产、具有增强的抗原亲合力的抗体的生成或增强的或更有效的细胞应答(即，增加的T细胞或具有更高的抗肿瘤活性的T细胞)。将能产生免疫应答的抗原可替换地称作是免疫原性的或免疫原。在本发明的描述中，可以将TA称作″免疫原性靶″。 

TA包括肿瘤相关抗原(TAA)和肿瘤-特异性的抗原(TSA)，其中癌细胞是抗原的来源。TAA是一种抗原，它在肿瘤细胞表面上表达的量高于在正常细胞上观察到的，或者是在胚胎发育过程中在正常细胞上表达的抗原。TSA是肿瘤细胞特有的抗原，且在正常细胞上不表达。TA还包括TAA或TSA、其抗原性片段和保留了它们的抗原性的修饰形式。 

典型地，根据它们的表达图谱、功能或遗传起源，将TA分成5类：睾丸癌(CT)抗原(即，MAGE，NY-ESO-1)；黑素细胞分化抗原(即，Melan A/MART-1，酪氨酸酶，gap100)；突变的抗原(即，MUM-1，p53，CDK-4)；超量表达的“自身”抗原(即，HER-2/neu，p53)；和病毒抗原(即，HPV，EBV)。为了实现本发明的目的，合适的TA是能在表达该TA的宿主中诱导或增强抗肿瘤免疫应答的任意TA。合适的TA包括，例如，gap100(Cox等.，Science，264：716-719(1994))，MART-1/Melan A(Kawakami等.，J.Exp.Med.，180：347-352(1994))，gp75(TRP-1)(Wang等.，J.Exp.Med.，186：1131-1140(1996))，酪氨酸酶(Wolfel等.，Eur.J.Immunol.，24：759-764(1994)；WO 200175117；WO 200175016；WO 200175007)，NY-ESO-1(WO 98/14464；WO 99/18206)，黑素瘤蛋白多糖(Hellstrom等.，J.Immunol.，130：1467-1472(1983))，MAGE家族抗原(即，MAGE-1，2，3，4，6，12，51；Van der Bruggen等.，Science，254：1643-1647(1991)；美国专利号6,235,525；CN 1319611)，BAGE家族抗原(Boel等.，Immunity，2：167-175(1995))，GAGE家族抗原(即，GAGE-1，2；Van den Eynde等.，J.Exp.Med.，182：689-698(1995)；美国专利号6,013,765)，RAGE家族抗原(即，RAGE-1；Gaugler等， Immunogenetics，44：323-33O(1996)；美国专利号5,939,526)，N-乙酰基葡萄糖氨酰基转移酶-V(Guilloux等，J.Exp.Med.，183：1173-1183(1996))，pl5(Robbins等.，J Immunol.154：5944-5950(1995))，β-连环蛋白(Robbins等.，J.Exp.Med.，183：1185-1192(1996))，MUM-1(Coulie等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：7976-7980(1995))，细胞周期蛋白依赖性激酶-4(CDK4)(Wolfel等.，Science，269：1281-1284(1995))，p21-ras(Fossum等，Int.J.Cancer，56：40-45(1994))，BCR-abl(Bocchia等.，Blood，85：2680-2684(1995))，p53(Theobald等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：11993-11997(1995))，p185HER2/neu(erb-Bl；Fisk等.，J.Exp.Med.，181：2109-2117(1995))，表皮生长因子受体(EGFR)(Harris等.，Breast Cancer Res.Treat，29：1-2(1994))，癌胚抗原(CEA)(Kwong等.，J.Natl.Cancer Inst.，85：982-990(1995)美国专利号5,756,103；5,274,087；5,571,710；6,071,716；5,698,530；6,045,802；EP 263933；EP 346710；和EP 784483)；与癌相关的突变的粘蛋白(即，MUC-1基因产物；Jerome等.，J.Immunol.，151：1654-1662(1993))；EBV的EBNA基因产物(即，EBNA-1；Rickinson等.，Cancer-Surveys，13：53-80(1992))；人***瘤病毒的E7，E6蛋白(Ressing等.，J.Immunol，154：5934-5943(1995))；***特异性的抗原(PSA；Xue等.，The Prostate，30：73-78(1997))；***特异性的膜抗原(PSMA；Israeli，等.，Cancer Res.，54：1807-1811(1994))；独特型表位或抗原，例如，免疫球蛋白独特型或T细胞受体独特型(Chen等.，J.Immunol.，153：4775-4787(1994))；KSA(美国专利号5,348,887)，驱动蛋白2(Dietz，等.Biochem Biophys Res Commun 2000Sep 7；275(3)：731-8)，HIP-55，TGF β-1抗凋亡因子(Toomey，等.Br J Biomed Sci 2001；58(3)：177-83)，肿瘤蛋白D52(Bryne J.A.，等.，Genomics，35：523-532(1996))，H1FT，NY-BR-1(WO 01/47959)，NY-BR-62，NY-BR-75，NY-BR-85，NY-BR-87，NY-BR-96(Scanlan，M.Serologic and Bioinfbrmatic Approaches to the Identification of Human Tumor Antigens，in Cancer Vaccines 2000，Cancer Research Institute，New York，NY)，BFA4(SEQ ID NOS.：23和24)，BCY1(SEQ ID NOS.：25和26)，BFA5(SEQ ID NOS.：27和28)，BCZ4(SEQ ID NOS.： 29和30)，和BFY3(SEQ ID NOS.31和32)，包括″野生型″(即，由通常由基因组编码的，天然存在的)、修饰的和突变的形式以及其它片段和其衍生物。这些TA中的任一种都可以单独地或彼此组合地用于共免疫方案中。 

在某些情况下，用TA和其它抗原例如血管发生相关抗原(″AA″)共免疫患者是有益的。AA是与参与血管的诱导和/或继续发育的细胞有关的免疫原性分子(即，肽，多肽)。例如，AA可以在内皮细胞(″EC″)上表达，它是血管的基本结构组分。针对癌症的治疗，优选地在供给肿瘤的血管内或附近发现了AA。对患者进行针对AA的免疫，优选地产生抗-AA免疫应答，由此预防和/或抑制了发生在肿瘤附近或内部的血管发生过程。 

示例性的AA包括，例如，血管内皮生长因子(即，VEGF；Bernardini，等.J Urol.，2001，166(4)：1275-9；Starnes，等.J.Thorac.Cardiovasc.Surg.，2001，122(3)：518-23；Dias，等.Blood，2002，99：2179-2184)，VEGF受体(即，VEGF-R，flk-1/KDR；Starnes，等.J.Thorac.Cardiovasc.Surg.，2001，122(3)：518-23)，EPH受体(即，EPHA2；Gerety，等.1999，Cell，4：403-414)，表皮生长因子受体(即，EGFR；Ciardeillo，等.Clin.Cancer Res.，2001，7(10)：2958-70)，碱性成纤维细胞生长因子(即，bFGF；Davidson，等.Clin.Exp.Metastasis 2000，18(6)：501-7；Poon，等.Am J.Surg.，2001，182(3)：298-304)，血小板-衍生的细胞生长因子(即，PDGF-B)，血小板-衍生的内皮细胞生长因子(PD-ECGF；Hong，等.J.Mol.Med.，2001，8(2)：141-8)，转化生长因子(即，TGF-a；Hong，等.J.Mol.Med.，2001，8(2)：141-8)，endoglin(Balza，等.Int.J.Cancer，2001，94：579-585)，Id蛋白(Benezra，R.Trends Cardiovasc.Med.，2001，11(6)：237-41)，蛋白酶例如uPA，uPAR，和基质金属蛋白酶(MMP-2，MMP-9；Djonov，等.J.Pathol.，2001，195(2)：147-55)，一氧化氮合酶(Am.J.Ophthalmol.，2001，132(4)：551-6)，氨肽酶(Rouslhati，E.Nature Cancer，2：84-90，2002)，血小板反应蛋白(即，TSP-1，TSP-2；Alvarez，等.Gynecol.Oncol.，2001，82(2)：273-8；Seki，等.Int.J.Oncol.，2001，19(2)：305-10)，k-ras(Zhang，等.Cancer Res.，2001，61(16)：6050-4)，Wnt(Zhang，等.Cancer  Res.，2001，61(16)：6050-4)，细胞周期蛋白-依赖性激酶(CDKs；Drug Resist.Updat.2000，3(2)：83-88)，微管(Timar，等.2001.Path.Oncol.Res.，7(2)：85-94)，热休克蛋白(即，HSP90(Timar，同上))，肝素结合因子(即，肝素酶；Gohji，等.Int.J.Cancer，2001，95(5)：295-301)，合酶(即，ATP合酶，thymidilate合酶)，胶原受体，整联蛋白(即，αυβ3，αυβ5，α1β1，α2β1，α5β1)，表面蛋白多糖NG2，AAC2-1(SEQ ID NO.：1)，或AAC2-2(SEQ ID NO.：2)，等等，包括″野生型″(即，由基因组正常编码的，天然存在的)、修饰的和突变的版本以及其它片段和其衍生物。这些靶中的任一种都可以单独地或彼此组合地或与其它试剂组合地用于实现本发明。 

在某些实施方案中，使用了编码免疫原性靶的核酸分子。该核酸分子可以包含编码一种或多种免疫原性靶、或其片段或衍生物的核苷酸序列，或由其组成，例如包含在ATCC保藏物中的DNA***物中的。术语″核酸序列″或″核酸分子″指DNA或RNA序列。该术语包含由DNA和RNA的任意的已知碱基类似物形成的分子，例如但不限于4-乙酰基胞嘧啶，8-羟基-N6-甲基腺苷，氮丙啶基-胞嘧啶，假异胞嘧啶，5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶，5-羧基-甲基氨基甲基尿嘧啶，二氢尿嘧啶，肌苷，N6-异戊烯基腺嘌呤，1-甲基腺嘌呤，1-甲基伪尿嘧啶，1-甲基鸟嘌呤，1-甲基肌苷，2，2-二甲基-鸟嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鸟嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-甲基腺嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，5-甲基氨基甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨基-甲基-2-硫尿嘧啶，β-D-mannosylqueosine，5′-甲氧基羰基-甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲基硫-N6-异戊烯基腺嘌呤，尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯，尿嘧啶-5-氧乙酸，oxybutoxosine，假尿嘧啶，queosine，2-硫胞嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯，尿嘧啶-5-氧乙酸，假尿嘧啶，queosine，2-硫胞嘧啶，和2，6-二氨基嘌呤，等。 

分离的核酸分子是这样的：(1)当总核酸是分离自源细胞时，它分离自至少约50％蛋白、脂类、碳水化合物或天然伴随它的其它物质；(2)它不连接核酸分子天然连接的多核苷酸的全部或一部分；(3)它可操作地连接到天然状态下不连接的多核苷酸上；和/或，(4)天然不 作为更大的多核苷酸序列的一部分而产生。优选地，本发明的分离的核酸分子基本上不含有任何其它的污染核酸分子或在它的天然环境中发现的其它污染物，后者会妨碍它在多肽生产中的应用或它的治疗、诊断、预防或研究应用。如本文所使用的，当与生物材料(例如核酸分子、多肽、宿主细胞等)组合使用时，术语″天然存在的″或″天然的″或″天然发现的″指在没有人工操作的情况下天然发现的物质。类似地，如本文所使用的，″非天然存在的″或″非天然的″指非天然发现的物质，或已经在结构上人工修饰或合成的物质。 

通过比较序列，确定两种或更多核酸或多肽分子的同一性。如本领域已知的，″同一性″指通过组成分子的单元(即，核苷酸或氨基酸残基)之间的匹配确定的核酸分子或多肽之间的序列相关性程度。同一性通过有空位的比对(如果存在)测量两种或更多种序列之间的相同匹配的百分比，所述有空位的比对是通过特定的数学模型或计算机程序(即，算法)解决的。通过相关序列与核酸序列或分离的核酸分子杂交的能力，也可以确定核酸序列之间的同一性。在定义这样的序列时，术语″高度严格的条件″和″中等严格的条件″指能允许序列互补的核酸链杂交的方法，且排除了明显错配的核酸的杂交。杂交和洗涤的″高度严格的条件″的实例是0.015M氯化钠，0.0015M乙酸钠，65-68℃或0.015M氯化钠，0.0015M乙酸钠，和50％甲酰胺，42℃(见，例如，Sambrook，Fritsch&Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，1989)；Anderson等.，Nucleic Acid Hybridisation：A Practical Approach Ch.4(IRL Press Limited))。术语″中等严格的条件″指能形成具有比在″高度严格的条件″下更高的碱基对错配度的DNA双链体的条件。中等严格的条件的实例是0.015M氯化钠，0.0015M乙酸钠，50-65℃或0.015M氯化钠，0.0015M乙酸钠，和20％甲酰胺，37-50℃。作为实例，50℃、在0.015M钠离子中的中等严格的条件能允许约21％的错配。在杂交过程中，为了减少非特异性的杂交和/或背景杂交，可以将其它试剂包含在杂交和洗涤缓冲液中。实例是0.1％牛血清白蛋白，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，0.1％焦磷酸钠，0.1％十二烷基硫酸钠，NaDodSO₄，(SDS)，ficoll，Denhardt氏溶液，超声处理的鲑鱼***DNA(或另一种非互补的DNA)，和硫酸葡聚糖，尽管也可以使用其它合适的试 剂。可以改变这些添加剂的浓度和类型，而基本上不影响杂交条件的严格性。通常在pH 6.8-7.4进行杂交实验；但是，在典型的离子强度条件，杂交速度几乎不依赖于pH。 

在本发明的某些实施方案中，使用载体来将编码多肽的核酸序列转移给细胞。载体是用于将核酸序列转移给宿主细胞的任意分子。在某些情况下，使用表达载体。表达载体是核酸分子，其适用于转化宿主细胞，且含有能指导和/或控制转移的核酸序列的表达的核酸序列。表达包括但不限于，转录、翻译和剪接(如果存在内含子)等过程。表达载体典型地包含一个或多个可操作地连接到编码多肽的异源核酸序列上的侧翼序列。侧翼序列可以是例如同源的(即，来自与宿主细胞相同的种和/或株)、异源的(即，来自与宿主细胞种或株不同的种)、杂合体(即，来自超过一个来源的侧翼序列的组合)或合成的。 

侧翼序列优选地能实现编码序列的复制、转录和/或翻译，且可操作地连接到编码序列上。如本文所使用的，术语“可操作地连接”指多核苷酸元件的功能上有关系的连接。例如，如果能影响编码序列的转录，则启动子或增强子是可操作地连接到编码序列上。但是，侧翼序列无需与编码序列邻接，只要它能正确地起作用即可。因而，例如，可以在启动子序列和编码序列之间存在间插的未翻译的但是转录的序列，仍然认为启动子序列可操作地连接到编码序列上。类似地，增强子序列可以位于编码序列的上游或下游，并影响序列的转录。 

在某些实施方案中，侧翼序列优选地是转录调节区，其能驱动靶细胞内的高水平的基因表达。转录调节区可以包含，例如，启动子、增强子、沉默子、阻遏元件或其组合。转录调节区可以是组成性的、组织特异性的、细胞类型特异性的(即，该区域在一种类型的组织或细胞中能驱动比在另一种中更高水平的转录)或可调节的(即，能对与化合物的相互作用作出反应)。转录调节区的来源可以是任意的原核生物或真核生物，任意的脊椎动物或非脊椎动物，或任意的植物，只要侧翼序列能通过导致细胞内核酸的转录而在细胞中起作用即可。可以使用许多种类的转录调节区来实现本发明。 

合适的转录调节区包括，例如，CMV启动子(即，CMV-立即早期启动子)；来自真核生物基因的启动子(即，***-可诱导的鸡卵清蛋白基因，干扰素基因，糖皮质激素-可诱导的酪氨酸氨基转移酶基因， 和胸苷激酶基因)；和主要的早期和晚期腺病毒基因启动子；SV40早期启动子区域(Bernoist和Chambon，1981，Nature 290：304-10)；包含在劳氏肉瘤病毒(RSV)的3′长末端重复(LTR)中的启动子(Yamamoto，等.，1980，Cell22：787-97)；单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)启动子(Wagner等.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.SA.78：1444-45)；金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster等.，1982，Nature296：39-42)；原核生物表达载体例如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等.，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，75：3727-31)；或tac启动子(DeBoer等.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80：21-25)。组织-和/或细胞-类型特异性的转录控制区包括，例如，弹性蛋白酶I基因控制区，它在胰腺腺泡细胞中是有活性的(Swift等.，1984，Cell 38：639-46；Ornitz等.，1986，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50：399-409(1986)；MacDonald，1987，Hepatology 7：425-515)；胰岛素基因控制区，它在胰腺β细胞中是有活性的(Hanahan，1985，Nature 315：115-22)；免疫球蛋白基因控制区，它在淋巴细胞中是有活性的(Grosschedl等.，1984，Cell 38：647-58；Adames等.，1985，Nature 318：533-38；Alexander等.，1987，Mol.Cell.Biol.，7：1436-44)；在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区(Leder等.，1986，Cell 45：485-95)；肝中的白蛋白基因控制区(Pinkert等.，1987，Genes和Devel.1：268-76)；肝中的甲胎蛋白基因控制区(Krumlauf等.，1985，Mol.Cell.Biol.，5：1639-48；Hammer等.，1987，Science 235：53-58)；肝中的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等.，1987，Genes和Devel.1：161-71)；骨髓细胞中的β-珠蛋白基因控制区(Mogram等.，1985，Nature 315：338-40；Kollias等.，1986，Cell 46：89-94)；脑中的少突胶质细胞的髓磷脂碱性蛋白基因控制区(Readhead等.，1987，Cell 48：703-12)；骨骼肌中的肌球蛋白轻链-2基因控制区(Sani，1985，Nature 314：283-86)；下丘脑中的促性腺释放激素基因控制区(Mason等.，1986，Science 234：1372-78)，和黑素瘤细胞中的酪氨酸酶启动子(Hart，I.Semin Oncol 1996Feb；23(1)：154-8；Siders，等.Cancer Gene Ther 1998Sep-Oct；5(5)：281-91)，等。也可以使用例如在存在某些化合物或条件(例如光、热、辐射、四环素或热休克蛋白)下会活化的可诱导的启动子(见，例如， WO 00/10612)。其它的合适的启动子是本领域已知的。 

如上所述，增强子也可以是合适的侧翼序列。增强子是DNA的顺式作用元件，通常长约10-300碱基对，其作用于启动子上，以增强转录。增强子典型地是不依赖于方向和位置的，已经被鉴别出了在控制的编码序列的5′和3′。已知可以从哺乳动物基因得到的几种增强子序列(即，珠蛋白，弹性蛋白酶，白蛋白，甲胎蛋白和胰岛素)。类似地，SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒增强子和腺病毒增强子可以与真核生物启动子序列一起使用。尽管可以将增强子在核酸编码序列的5′或3′位置剪接进载体中，它典型地位于启动子的5′位置。本领域已知其它合适的增强子，且可以应用于本发明。 

在制备本发明的试剂时，可能需要转染或转化细胞。转染指细胞摄入外来的或外源的DNA，当外源DNA已经被导入细胞膜内时，则细胞已经被转染。许多转染技术是本领域众所周知的(即，Graham等.，1973，Virology 52：456；Sambrook等.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratories，1989)；Davis等.，Basic Methods in Molecular Biology(Elsevier，1986)；和Chu等.，1981，Gene 13：197)。这样的技术可以用于将一个或多个外源DNA部分导入合适的宿主细胞。 

在某些实施方案中，细胞的转染优选地会导致该细胞的转化。当细胞的特征有变化时，该细胞是转化的，当它已经被修饰成含有新的核酸时，细胞被转化。转染后，转染的核酸可以通过物理地整合进细胞的染色体中，与细胞的核酸重组，其可以作为不经复制的游离基因元件瞬时存在，或者可以作为质粒独立地复制。当核酸随着细胞的***而复制时，则稳定地转化了细胞。 

本发明还提供了分离的多肽形式的免疫原性靶。在下述情况时，认为多肽是分离的：(1)当从源细胞分离时，它已经从至少约50％多核苷酸、脂类、碳水化合物或天然伴随它的其它物质中分离出来；(2)它不连接(通过共价的或非共价的相互作用)“分离的多肽”天然连接的多肽的全部或一部分；(3)它可操作地连接(通过共价的或非共价的相互作用)到天然不连接的多肽上；或，(4)天然不产生。优选地，分离的多肽基本上不含有任何其它的污染多肽或在它的天然环境中发现的其它污染物，后者会妨碍它的治疗、诊断、预防或研究应用。 

免疫原性靶多肽可以是成熟的多肽，如本文所定义的，且根据制备它们的方法，可以具有或不具有氨基末端甲硫氨酸残基。还包括相关的多肽，例如，片段、变体(即，等位基因的，剪接)、直向同源物、同源物和衍生物，例如，具有免疫原性靶的至少一个特征或活性(即，活性，抗原性)的那些。另外相关的是肽，它指一系列邻接的氨基酸残基，其具有与它的序列所来源多肽的至少一部分相对应的序列。在优选的实施方案中，肽包含约5-10个氨基酸，10-15个氨基酸，15-20个氨基酸，20-30个氨基酸，或30-50个氨基酸。在一个更优选的实施方案中，肽包含9-12个氨基酸，其适用于呈递到例如I类MHC分子上。 

核酸或多肽的片段包含在氨基末端(有或没有前导序列)和/或羧基末端的序列(即，核酸或多肽)截短。片段也可以包含变体(即，等位基因的，剪接)、直向同源物、同源物和与亲本序列相比具有一个或多个氨基酸添加或取代或内部缺失的其它变体。在优选的实施方案中，截短和/或缺失包含约10个氨基酸，20个氨基酸，30个氨基酸，40个氨基酸，50个氨基酸，或更多。这样生产的多肽片段会包含约10个氨基酸，25个氨基酸，30个氨基酸，40个氨基酸，50个氨基酸，60个氨基酸，70个氨基酸，或更多。这种多肽片段可以任选地包含氨基末端甲硫氨酸残基。应当明白，可以使用这样的片段，例如生成针对免疫原性靶多肽的抗体或细胞免疫应答。 

变体是与目标序列相比具有一个或多个序列取代、缺失和/或添加的序列。变体可以是天然存在的或人工构建的。可以从对应的核酸分子制备出这种变体。在优选的实施方案中，变体具有1-3、或1-5、或1-10、或1-15、或1-20、或1-25、或1-30、或1-40、或1-50、或超过50个氨基酸的取代、***、添加和/或缺失。 

等位基因变体是占据生物或生物群体的染色体上的特定基因座的基因的几个可能的天然存在的替代形式之一。剪接变体是由剪接初级转录物产生的几种RNA转录物之一生成的多肽。直向同源物来自另一物种的类似的核酸或多肽序列。例如，可以认为小鼠和人形式的免疫原性靶多肽是彼此的直向同源物。序列的衍生物是从亲本序列衍生出的，这些序列具有取代、添加、缺失或化学修饰的变体。变体也可以包含融合蛋白，它指在至少一种其它序列(例如异源肽)的氨基或羧 基末端的一个或多个第一种序列(例如肽)的融合体。 

″相似性″是与同一性有关的一个概念，只是相似性指相关性的度量，所述相关性包含相同的匹配和保守取代匹配。如果2个多肽序列具有例如10/20个相同的氨基酸，且剩余的都是非保守的取代，则同一性和相似性的百分比都是50％。如果在同样的实例中，多了5个保守取代的位置，则同一性的百分比仍然是50％，而相似性的百分比却是75％(15/20)。因此，在有保守取代的情况下，2个多肽之间的相似性百分比会高于这2个多肽之间的同一性百分比。 

取代可以是保守的、或非保守的、或其任意组合。多肽序列的保守的氨基酸修饰(和对应的对编码核苷酸的修饰)会产生具有与亲本多肽类似的结构和化学特征的多肽。例如，“保守的氨基酸取代”可以包含用非天然残基取代天然氨基酸残基，以便对该位置的氨基酸的大小、极性、电荷、疏水性或亲水性的影响较少或无影响，更具体地，不会产生降低的免疫原性。合适的保守的氨基酸取代如表I所示。 

表I

使用众所周知的技术，技术人员能够确定合适的多肽变体。为了识别出合适的可以改变的、且不会破坏生物活性(即，MHC结合，免疫原性)的分子区域，本领域的技术人员可以靶向认为对于活性不重要的区域。例如，当已知了来自相同物种或其它物种的具有类似活性的类似多肽时，本领域的技术人员可以将多肽的氨基酸序列与这样的类似多肽进行对比。通过进行这样的分析，可以鉴定出在类似多肽之间保守的分子的残基和部分。应当明白，在相对于这样的类似多肽不保守的分子区域的变化，不太可能负面影响多肽的生物学活性和/或结构。类似地，已知了结合MHC所需的残基，且可以修饰它们来改善结合。但是，在大多数情况下，导致降低的与MHC的结合的修饰是不合适的。本领域的技术人员也知道，即使在相对保守的区域，也可以用化学上类似的氨基酸取代天然存在的残基，同时保持活性。因此，甚至可以对生物活性或结构重要的区域进行保守的氨基酸取代，而不破坏生物活性，或者不负面影响多肽结构。 

其它优选的多肽变体包括糖基化变体，其中，与主题氨基酸序列 相比，已经改变了糖基化位点的数目和/或类型。在一个实施方案中，多肽变体包含比主题氨基酸序列更多或更少数目的N-连接的糖基化位点。N-连接的糖基化位点的特征在于序列Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中命名为X的氨基酸残基可以是脯氨酸以外的任意氨基酸残基。取代氨基酸残基来建立该序列，会提供用于添加N-连接的碳水化合物链的潜在新位点。或者，能消除该序列的取代会去除存在的N-连接的碳水化合物链。还提供了N-连接的碳水化合物链的重排，其中消除了一个或多个N-连接的糖基化位点(典型地，是天然存在的那些)，并建立了一个或多个新的N-连接的位点。为了影响多肽的O-连接的糖基化，可以修饰丝氨酸和/或苏氨酸残基。 

其它优选的变体包括半胱氨酸变体，其中与主题氨基酸序列组相比，缺失了一个或多个半胱氨酸残基，或者被另一种氨基酸(例如，丝氨酸)取代。当多肽必须重新折叠成生物活性的构象时，例如，在分离不溶的包涵体后，半胱氨酸变体是有用的。半胱氨酸变体通常具有比天然蛋白更少的半胱氨酸残基，且典型地具有偶数个，以使未配对的半胱氨酸产生的相互作用最小化。 

在其它的实施方案中，本发明的分离的多肽包括融合多肽片段，其能辅助多肽的纯化。可以在其主题多肽变体的氨基端或羧基端产生融合。融合可以是直接的，没有连接体或接头分子，或可以通过连接体或接头分子。连接体或接头分子可以是一个或多个氨基酸残基，典型地约20至约50个氨基酸残基。也可以将连接体或接头分子设计成具有DNA限制性核酸内切酶或蛋白酶的切割位点，以允许分离融合的部分。应当明白，一旦构建出来，就可以根据本文所述的方法衍生出融合多肽。合适的融合片段包括，但不限于，金属结合域(例如多组氨酸片段)，免疫球蛋白结合域(即，蛋白A，蛋白G，T细胞，B细胞，Fc受体，或补体蛋白抗体结合域)，糖结合域(例如，麦芽糖结合域)，和/或″标志″域(即，至少一部分α-半乳糖苷酶，strep标志肽，T7标志肽，FLAG肽，或可以使用能结合该域的化合物例如单克隆抗体纯化的其它域)。典型地，在多肽表达时，将标志融合到多肽上，且可以用作从宿主细胞亲合纯化目标多肽序列的方法。例如，通过使用针对标志的抗体作为亲合基质的柱色谱，可以实现亲合纯化。任选地，随后可以通过多种方式，例如使用某些肽酶进行剪切，从纯化的目标 多肽序列中去除标志。如下所述，也可以在例如TA和共刺激组分例如趋化因子CXC10(IP-10)，CCL7(MCP-3)，或CCL5(RANTES)之间进行融合。 

融合基序可以增强免疫原性靶向MHC加工室(例如内质网)的运输。这些称作转导或转胞吞序列的序列，包括源自HIV tat(见Kim等.1997J.Immunol.159：1666)，Drosophila antennapedia(见Schutze-Redelmeier等.1996J.Immunol.157：650)，或人周期-1蛋白(hPERl；更具体地，SRRHHCRSKAKRSRHH)的序列。 

另外，多肽或其变体可以融合到同源多肽上，形成同二聚体，或融合到异源多肽上，形成异二聚体。异源肽和多肽包括但不限于：用于检测和/或分离融合多肽的表位；跨膜受体蛋白或其部分，例如胞外域或跨膜域和胞内域；能结合跨膜受体蛋白的配体或其部分；具有催化活性的酶或其部分；能促进寡聚的多肽或肽，例如亮氨酸拉链域；能提高稳定性的多肽或肽，例如免疫球蛋白恒定区；和具有与多肽或其变体不同的治疗活性的多肽。 

在某些实施方案中，可以有利地将编码免疫原性靶、多肽或其衍生物的核酸序列与一种或多种共刺激组分(例如细胞表面蛋白、细胞因子或趋化因子)组合在本发明的组合物中。例如，共刺激组分可以作为多肽或编码多肽的核酸包含在组合物中。合适的共刺激分子包括，例如，能结合CD28家族的成员(即，CD28，ICOS；Hutloff，等.Nature1999，397：263-265；Peach，等.JExp Med 1994，180：2049-2058)的多肽，例如CD28结合多肽B7.1(CD80；Schwartz，1992；Chen等，1992；Ellis，等.J.Immunol.，156(8)：2700-9)和B7.2(CD86；Ellis，等.J.Immunol.，156(8)：2700-9)；能结合整联蛋白家族成员(即，LFA-1(CDlla/CD18)；Sedwick，等.J Immunol 1999，162：1367-1375；Wulfing，等.Science 1998，282：2266-2269；Lub，等.Immunol Today 1995，16：479-483)，包括ICAM家族的成员(即，ICAM-1，-2或-3)的多肽；能结合CD2家族成员(即，CD2，信号传递淋巴细胞活化分子(CDw150或″SLAM″；Aversa，等.J Immunol1997，158：4036-4044))的多肽，例如CD58(LFA-3；CD2配体；Davis，等.Immunol Today 1996，17：177-187)或SLAM配体(Sayos，等.Nature 1998，395：462-469)；能结合热稳定抗原(HSA或CD24； Zhou，等.Eur J Immunol 1997，27：2524-2528)的多肽；能结合TNF受体(TNFR)家族成员的多肽(即，4-1BB(CD137；Vinay，等.Semin Immunol 1998，10：481-489)，OX40(CD134；Weinberg，等.Semin Immunol 1998，10：471-480；Higgins，等.J Immunol 1999，162：486-493)，和CD27(Lens，等.Semin Immunol 1998，10：491-499))例如4-1BBL(4-1BB配体；Vinay，等.Semin Immunol 1998，10：481-48；DeBenedette，等.J Immunol 1997，158：551-559)，TNFR相关因子-1(TRAF-1；4-1BB配体；SaouHi，等.JExp Med 1998，187：1849-1862，Arch，等.Mol Cell Biol 1998，18：558-565)，TRAF-2(4-1BB和OX40配体；Saoulli，等.J Exp Med 1998，187：1849-1862；Oshima，等.Int Immunol 1998，10：517-526，Kawamata，等.J Biol Chem 1998，273：5808-5814)，TRAF-3(4-1BB和OX40配体；Arch，等.Mol Cell Biol1998，18：558-565；Jang，等.Biochem Biophys Res Commun 1998，242：613-620；Kawamata S，等.J Biol Chem 1998，273：5808-5814)，OX40L(OX40配体；Gramaglia，等.J Immunol 1998，161：6510-6517)，TRAF-5(OX40配体；Arch，等.Mol Cell Biol 1998，18：558-565；Kawamata，等.JBiol Chem 1998，273：5808-5814)，和CD70(CD27配体；Couderc，等.Cancer基因Ther.，5(3)：163-75)。CD154(CD40配体或″CD40L″；Gurunathan，等.J Immunol.，1998，161：4563-4571；Sine，等.Hum.Gene Ther.，2001，12：1091-1102)也可以是合适的。 

一种或多种细胞因子也可以是合适的共刺激组分或″佐剂″，无论是作为包含在本发明的组合物中的多肽还是由其中的核酸编码(Parmiani，等.Immunol Lett 2000Sep 15；74(1)：41-4；Berzofsky，等.Nature Immunol.1：209-219)。合适的细胞因子包括，例如，白介素-2(IL-2)(Rosenberg，等.Nature Med.4：321-327(1998))，IL-4，IL-7，IL-12(综述见Pardoll，1992；Harries，等.J.Gene Med.2000Jul-Aug；2(4)：243-9；Rao，等.J.Immunol.156：3357-3365(1996))，IL-15(Xin，等.Vaccine，17：858-866，1999)，IL-16(Cruikshank，等.J.Leuk Biol.67(6)：757-66，2000)，IL-18(J.Cancer Res.Clin.Oncol.2001.127(12)：718-726)，GM-CSF(CSF(Disis，等.Blood，88：202-210(1996))，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，或干扰素例如IFN-α 或INF-γ。其它细胞因子也可以用于实现本发明，如本领域已知的。 

也可以使用趋化因子。例如，已经证实了包含融合到肿瘤自身-抗原上的CXCL10(IP-10)和CCL7(MCP-3)的融合蛋白会诱导抗肿瘤的免疫(Biragyn，等.Nature Biotech.1999，17：253-258)。趋化因子CCL3(MIP-1α；)和CCL5(RANTES)(Boyer，等.Vaccine，1999，17(Supp.2)：S53-S64)也可以用于实现本发明。其它的合适的趋化因子是本领域已知的。 

本领域还知道，可以阻断抑制性的或负调节的免疫机理，产生增强的免疫应答。例如，已经证实，用下述物质治疗：抗-CTLA-4(Shrikant，等.Immunity，1996，14：145-155；Sutmuller，等.J.Exp.Med.，2001，194：823-832)，抗-CD25(Sutmuller，同上)，抗-CD4(Matsui，等.J.Immunol.，1999，163：184-193)，融合蛋白IL13Ra2-Fc(Terabe，等.Nature Immunol.，2000，1：515-520)，和其组合(即，抗-CTLA-4和抗-CD25，Sutmuller，同上)，会上调节抗肿瘤免疫应答，且适用于实现本发明。 

可以单独地或与其它试剂组合地使用这些组分中的任一种。例如，已经证实，CD80，ICAM-1和LFA-3的组合(″TRICOM″)可以加强抗癌免疫应答(Hodge，等.Cancer Res.59：5800-5807(1999)。其它有效的组合包括，例如，IL-12+GM-CSF(Ahlers，等.J.Immunol.，158：3947-3958(1997)；Iwasaki，等.J.Immunol.158：4591-4601(1997))，IL-12+GM-CSF+TNF-α(Ahlers，等.Int.Immunol.13：897-908(2001))，CD80+IL-12(Fruend，等.Int.J.Cancer，85：508-517(2000)；Rao，等.同上)，和CD86+GM-CSF+IL-12(Iwasa ki，同上)。本领域的技术人员能够明白用于实现本发明的其它组合。另外，技术人员能够明白可以用于调控这种机理的其它试剂或方法。这些试剂或方法，以及本领域的技术人员已知的其它的试剂或方法，可以用于实现本发明。 

也可以使用提高基于核酸的免疫的效率的其它方法，包括，例如，使用能自我复制的病毒复制子(Caley，等.1999.Vaccine，17：3124-2135；Dubensky，等.2000.Mol.Med.6：723-732；Leiter，等.2000.Cancer Res.60：51-55)，密码子优化(Liu，等.2000.Mol.Ther.，1：497-500；Dubensky，同上；Huang，等.2001.J.Virol.75：4947-4951)， 体内电穿孔(Widera，等.2000.J.Immunol.164：4635-3640)，CpG刺激基序的整合(Gurunathan，等.Ann.Rev.Immunol.，2000，18：927-974；Leitner，同上；Cho，等.J.Immunol.168(10)：4907-13)，靶向内吞或泛素加工途径的序列(Thomson，等.1998.J.Virol.72：2246-2252；Velders，等.2001.J.Immunol.166：5366-5373)，马立克氏病病毒1型VP22序列(J.Virol.76(6)：2676-82，2002)，激发-加强方案(Gurunathan，同上；Sullivan，等.2000.Nature，408：605-609；Hanke，等.1998.Vaccine，16：439-445；Amara，等.2001.Science，292：69-74)，和使用粘膜送递载体，例如沙门氏菌属(Darji，等.1997.Cell，91：765-775；Woo，等.2001.Vaccine，19：2945-2954)。其它方法是本领域已知的，其中的一些如下所述。 

在使用免疫原性靶治疗和/或预防癌症时，还可以使用化疗剂、辐射、抗血管发生的化合物或其它试剂(Sebti，等.Oncogene 2000Dec 27；19(56)：6566-73)。例如，在治疗转移性乳腺癌时，有用的化疗剂包括环磷酰胺，阿霉素，紫杉醇，多西他赛，诺维本，卡培他滨，和丝裂霉素C，以及其它。另外已经证实的有效的组合化疗方案包括例如，环磷酰胺+氨甲蝶呤+5-氟尿嘧啶；环磷酰胺+阿霉素+5-氟尿嘧啶；或环磷酰胺+阿霉素。出于各种原因，已经使用了其它化合物例如强的松，紫杉烷，诺维本，丝裂霉素C，或长春花碱。许多乳腺癌患者具有***-受体阳性的(ER+)肿瘤，且在这些患者中，内分泌疗法(即，三苯氧胺)是优于化疗的。对于这样的患者，三苯氧胺或者作为二线治疗的孕酮(醋酸甲羟孕酮或醋酸甲地孕酮)是优选的。芳香酶抑制剂(即，氨鲁米特和其类似物例如来曲唑)会降低维持肿瘤生长所需的***的利用度，且可以用作某些患者的二线或三线内分泌疗法。 

其它癌症可能需要不同的化疗方案。例如，典型地，单独地或彼此组合地用Camptosar(伊立替康或CPT-11)，5-氟尿嘧啶或亚叶酸治疗转移性结直肠癌。蛋白酶和整联蛋白抑制剂例如作为MMP抑制剂的马马司他(British Biotech)，COL-3(Collagenex)，Neovastat(Aeterna)，AG3340(Agouron)，BMS-275291(Bristol Myers Squibb)，CGS 27023A(Novartis)或整联蛋白抑制剂Vitaxin(Medimmune)，或MED1522(Merck KgaA)也可以适用于该用途。这样，可以与使 用这些化疗剂的治疗相组合，进行与结直肠癌有关的免疫原性靶的免疫靶向。类似地，用于治疗其它类型的癌症的化疗剂是本领域众所周知的，且可以与本文所述的免疫原性靶相组合。 

许多抗血管发生剂是本领域已知的，且适用于与免疫原性靶疫苗共同施用(见，例如，Timar，等.20010.Pathology Oncol.Res.，7(2)：85-94)。这样的试剂包括，例如，生理试剂，例如生长因子(即，ANG-2，NK1，2，4(HGF)，转化生长因子β(TGF-β)，细胞因子(即，干扰素例如IFN-α，-β，-γ，血小板因子4(PF-4)，PR-39)，蛋白酶(即，切割的AT-III，胶原XVIII片段(Endostatin))，高分子量激肽释放酶-d5纤溶酶片段(制管张素)，凝血酶原-Fl-2，TSP-1)，蛋白酶抑制剂(即，金属蛋白酶的组织抑制剂，例如TIMP-1，-2，或-3；maspin；纤溶酶原活化剂-抑制剂例如PAI-1；色素上皮衍生的因子(PEDF))，Tumstatin(可从ILEX，Inc.得到)，抗体产物(即，胶原-结合抗体HUIV26，HUI77，XL313；抗-VEGF；抗-整联蛋白(即，Vitaxin，(Lxsys)))，和糖苷酶(即，肝素酶-I，-III)。已知或认为具有抗血管发生潜力的“化合物”或修饰的生理试剂包括，例如，长春花碱，紫杉醇，酮康唑，沙立度胺，dolestatin，combrestatin A，雷帕霉素(Guba，等.2002，Nature Med.，8：128-135)，CEP-7055(可从Cephalon，Inc.得到)，黄酮乙酸，Bay 12-9566(Bayer Corp.)，AG3340(Agouron，Inc.)，CGS 27023A(Novartis)，四环素衍生物(即，COL-3(Collagenix，Inc.))，Neovastat(Aeterná)，BMS-275291(Bristol-Myers Squibb)，低剂量的5-FU，低剂量的氨甲蝶呤(MTX)，irsofladine，根赤壳菌素，环孢霉素，卡托普利，塞来昔布，D45152-硫酸化的多糖，阳离子蛋白(鱼精蛋白)，阳离子肽-VEGF，苏拉明(多磺化的萘基脲)，能妨碍VEGF的功能或生成的化合物(即，SU5416或SU6668(Sugen)，PTK787/ZK22584(Novartis))，司他霉素，Angiozyme(核糖酶)，异黄酮，staurosporine衍生物，染料木黄酮，EMD121974(Merck KcgaA)，酪氨酸磷酸化抑制剂，isoquinolones，视黄酸，羧基酰氨基***，TNP-470，奥曲肽，2-甲氧基***，aminosterol(即，squalamine)，谷胱甘肽类似物(即，N-乙酰基-L-半胱氨酸)，combretastatin A-4(Oxigene)，Eph受体阻遏剂(Nature，414：933-938，2001)，Rh-制管张素，Rh-Endostatin(WO 01/93897)，环状-RGD肽，accutin- 二整联蛋白，benzodiazepenes，人源化的抗-avb3抗体，Rh-PAI-2，氨氯吡嗪脒，对酰氨基苯甲脒，抗-uPA抗体，抗-uPAR抗体，L-phanylalanin-N-甲酰胺(即，Batimistat，马马司他)，AG3340，和二甲胺四环素。许多其它的合适的试剂是本领域已知的，且足以用于实现本发明。 

本发明也可以与治疗癌症的“非传统的”方法组合使用。例如，近来已经证实，施用某些厌氧细菌可以辅助减慢肿瘤生长。在一项研究中，修饰了诺维梭菌以消除携带在噬菌体游离体上的毒素基因，并施用给患有结直肠肿瘤的小鼠(Dang，等.P.N.A.S.USA，98(26)：15155-15160，2001)。与化疗相结合，证实了该治疗会造成动物中的肿瘤坏死。本申请中所述的试剂和方法可以与这样的治疗方法相组合。 

通过几种可得到的技术中的任一种，可以将编码免疫原性靶的核酸施用给患者。已经成功地用于将核酸导入宿主中的多种病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、疱疹病毒和痘病毒，等。本领域能够明白，在本领域可以得到许多这样的病毒载体。使用本领域的技术人员可以广泛地得到的标准重组技术，可以构建出本发明的载体。在普通的分子生物学文献中可以发现这样的技术，例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Sambrook，等.，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press)，Gene Expression Technology(Methods in Enzymology，Vol.185，D.Goeddel编，1991.Academic Press，San Diego，CA)，和PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(Innis，等.1990.Academic Press，San Diego，CA)。 

优选的逆转录病毒载体是慢病毒的衍生物以及鼠和鸟逆转录病毒的衍生物。合适的逆转录病毒载体的实例包括，例如，Moloney鼠白血病病毒(MoMuLV)，Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV)，鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)，SIV，BIV，HIV和劳氏肉瘤病毒(RSV)。许多逆转录病毒载体可以整合多个外源核酸序列。由于重组的逆转录病毒是有缺陷的，它们需要辅助，以生产感染性的载体颗粒。通过例如编码逆转录病毒结构基因的辅助细胞系，可以提供该辅助。合适的辅助细胞系包括ψ2，PA317和PA12，等等。然后，可以使用这样的细胞系生产的载体病毒粒子以感染组织细胞系，例如NIH 3T3细胞，以生产大量的嵌合逆转录病毒的病毒粒子。通过传统方法(即，注射)，或通 过将“生产细胞系”植入到靶细胞群体附近，可以施用逆转录病毒载体(Culver，K.，等.，1994，Hum.Gene Ther.，5(3)：343-79；Culver，K.，等.，Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.，59：685-90)；Oldfield，E.，1993，Hum.Gene Ther.，4(1)：39-69)。可以对生产细胞系进行工程化来生产病毒载体，并将病毒颗粒释放到靶细胞附近。一部分释放的病毒颗粒会接触靶细胞，并感染这些细胞，从而将本发明的核酸送递进靶细胞。随着靶细胞的感染，发生载体核酸的表达。 

已经证实，腺病毒载体可以特别地用于将基因转移进真核细胞(Rosenfeld，M.，等.，1991，Science，252(5004)：431-4；Crystal，R.，等.，1994，Nat.Genet.，8(1)：42-51)、研究真核生物基因表达(Levrero，M.，等.，1991，Gene，101(2)：195-202)、疫苗开发(Graham，F.和Prevec，L.，1992，Biotechnology，20：363-90)，和动物模型(Stratford-Perricaudet，L.，等.，1992，Bone Marrow Transplant.，9(Suppl.1)：151-2；Rich，D.，等.，1993，Hum.Gene Ther.，4(4)：461-76)。将重组抗体体内地施用给不同组织的实验途径已经包含了气管内滴注法(Rosenfeld，M.，等.，1992，Cell，68(1)：143-55)，注射进肌肉(Quantin，B.，等.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89(7)：2581-4)，外周静脉内注射(Herz，J.，和Gerard，R.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，90(7)：2812-6)和立体定位接种到脑中(Le Gal La Salle，G.，等.，1993，Science，259(5097)：988-90)，等等。 

腺伴随病毒(AAV)证实了高水平的感染性、广泛的宿主范围和整合进宿主细胞基因组中的特异性(Hermonat，P.，等.，1984，Proc.Natl.acid.Sci.U.S.A.，81(20)：6466-70)。单纯疱疹病毒1型(HSV-1)是另一种吸引人的载体***，特别是用于神经***中，因为它的亲神经性能(Geller，A.，等.，1991，Trends Neurosci.，14(10)：428-32；Glorioso，等.，1995，Mol.Biotechnol.，4(1)：87-99；Glorioso，等.，1995，Annu.Rev.Microbiol.，49：675-710)。 

痘病毒是另一种有用的表达载体(Smith，等.1983，Gene，25(1)：21-8；Moss，等，1992，Biotechnology，20：345-62；Moss，等，1992，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158：25-38；Moss，等.1991.Science，252：1662-1667)。证实了有用的痘病毒包括牛痘，NYVAC，鸟痘 (avipox)，禽痘(fowlpox)，金丝雀痘(canarypox)，ALVAC，和ALVAC(2)，等等。 

通过去除编码已知的或潜在的毒力因子的基因组的6个非必需的区域，从牛痘病毒的哥本哈根疫苗株衍生了NYVAC(vP866)(见，例如，美国专利号5,364,773和5,494,807)。还工程化了缺失基因座作为用于***外来基因的受体基因座。去除的区域是：胸苷激酶基因(TK；J2R)；出血区(u；B13R+B14R)；一种类型的包涵体区域(ATI；A26L)；血凝素基因(HA；A56R)；宿主范围基因区(C7L-K1L)；和大亚基，核糖核苷酸还原酶(I4L)。NYVAC是遗传工程化的牛痘病毒株，它是通过特异性地去除编码与毒力和宿主范围有关的基因产物的18个开放读码框生成的。已经证实了NYVAC可以用于表达TA(见，例如，美国专利号6,265,189)。NYVAC(vP866)，vP994，vCP205，vCP1433，placZH6H4L反向，pMPC6H6K3E3和pC3H6FHVB也在布达佩斯条约下保藏在ATCC，保藏号分别是VR-2559，VR-2558，VR-2557，VR-2556，ATCC-97913，ATCC-97912，和ATCC-97914。 

基于ALVAC的重组病毒(即，ALVAC-1和ALVAC-2)也适用于实现本发明(见，例如，美国专利号5,756,103)。ALVAC(2)与ALVAC(1)相同，只是ALVAC(2)基因组包含处于牛痘启动子控制下的牛痘E3L和K3L基因(美国专利号6,130,066；Beattie等.，1995a，1995b，1991；Chang等.，1992；Davies等.，1993)。已经证实，ALVAC(1)和ALVAC(2)都可以用于表达外来DNA序列，例如TA(Tartaglia等.，1993a，b；美国专利号5,833,975)。ALVAC在布达佩斯条约下保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209，USA，ATCC保藏号VR-2547。 

另一种有用的痘病毒载体是TROVAC。TROVAC指减毒的禽痘，它是从禽痘病毒的FP-1疫苗株衍生出的噬斑-克隆的分离物，批准它用于1日龄小鸡的疫苗接种。同样地，TROVAC在布达佩斯条约下保藏在ATCC，登记号2553。 

″非病毒的″质粒载体也可以用于实现本发明。优选的质粒载体可以与细菌、昆虫和/或哺乳动物宿主细胞相容。这样的载体包括，例如，PCR-II，pCR3，和pcDNA3.1(Invitrogen，San Diego，CA)，pBSII(Stratagene，La Jolla，CA)，pET15(Novagen，Madison，WI)， pGEX(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)，pE GFP-N2(Clontech，Palo Alto，CA)，pETL(BlueBacII，Invitrogen)，pDSR-α(PCT pub.No.WO 90/14363)和pFastBacDual(Gibco-BRL，Grand Isl和NY)以及 质粒衍生物(高拷贝数的基于COLE1的噬菌粒，Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)，用于克隆Taq-扩增的PCR产物的PCR克隆质粒(例如，TOPO^TM TA 试剂盒， 质粒衍生物，Invitrogen，Carlsbad，CA)。细菌载体也可以用于本发明中。这些载体包括，例如，志贺氏菌属，沙门氏菌数，霍乱弧菌，乳酸杆菌，Bacille calmette guérin(BCG)，和链球菌属(见例如，WO 88/6626；WO 90/0594；WO 91/13157；WO 92/1796；和WO 92/21376)。许多其它非病毒的质粒表达载体和***是本领域已知的，且可以用于本发明中。 

合适的核酸送递技术包括DNA-配体复合物，腺病毒-配体-DNA复合物，DNA的直接注射，CaPO₄沉淀，基因枪技术，电穿孔，和胶体分散***，等等。胶体分散***包括大分子复合物，纳米胶囊，微球，珠子，和基于脂类的***包括水包油乳状液、胶束、混合的胶束和脂质体。优选的本发明的胶体***是脂质体，它是可以用作体外和体内送递载体的人工膜泡囊。可以将RNA、DNA和完整的病毒粒子包封在水性内相中，且可以以生物活性形式送递给细胞(Fraley，R.，等.，1981，Trends Biochem.Sci.，6：77)。脂质体的组成通常是磷脂、尤其是高相转变温度的磷脂的组合，通常与类固醇、尤其是胆固醇组合。也可以使用其它磷脂或其它脂类。脂质体的物理特征依赖于pH、离子强度和二价阳离子的存在。可以在脂质体生产中使用的脂类的实例包括磷脂酰基化合物，例如磷脂酰甘油，磷脂酰胆碱，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰乙醇胺，神经鞘脂类，脑苷脂，和神经节苷脂。特别有用的是二酰基磷脂酰甘油，其中脂部分含有14-18个碳原子，尤其是16-18个碳原子，且是饱合的。示例性的磷脂包括卵磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰磷脂酰胆碱。 

也可以与一种或多种佐剂组合施用免疫原性靶，以增强免疫应答。示例性的佐剂如下面的表II所示： 

表II

免疫佐剂的类型 

也可以使用本发明的免疫原性靶来生成用于筛选实验或免疫疗法的抗体。本领域的技术人员能明白其它的应用。术语″抗体″包括抗体片段，如本领域已知的，包括Fab，Fab₂，单链抗体(例如Fv)，人源化的抗体，嵌合抗体，人抗体，它们是通过本领域已知的方法生产的。制备和使用各种类型的抗体的方法是本领域的技术人员众所周知的，且可以适用于实现本发明(见，例如，Harlow，等.Antibodies：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988；Harlow，等.Using Antibodies：A Laboratory Manual，Portable Protocol No.1，1998；Kohler和Milstein，Nature，256：495(1975))；Jones等.Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等.Nature，332：323-329(1988)；Presta(Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596(1992)；Verhoeyen等.(Science，239：1534-1536(1988)；Hoogenboom等.，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks等.，J.Mol.Biol.，222：581(1991)；Cole等.，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)；Boerner等.，J.Immunol.，147(1)：86-95(1991)；Marks等.，Bio/Technology 10，779-783(1992)；Lonberg等.，Nature 368856-859(1994)；Morrison，Nature 368812-13(1994)；Fishwild等.，Nature Biotechnology 14，845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14，826(1996)；Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.1365-93(1995)；以及美国专利号4,816,567；5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016)。也可以将来自它们的抗体或衍生物连接到治疗部分，例如细胞毒性的药物或毒素，或其活性片段，例如白喉A链，外毒素A链，蓖麻毒蛋白A链，相思豆毒蛋白A链，麻疯树毒蛋白，巴豆毒蛋白，酚霉素，依诺霉素，等等。细胞毒性剂也可以包含放射性化学试剂。可以将抗体和它们的衍生物包含在本发明的组合物中，用于体外或体内使用。 

在检测患者中疾病状态的存在、预测预后或检测化疗或其它治疗方案的有效性的实验中，可以使用代表着免疫原性靶的核酸、蛋白或其衍生物。可以使用如本领域已知的进行的表达方法，来确定免疫原性靶的相对表达水平。然后，可以将表达水平与基础水平相关联，以确定特定疾病是否存在于患者中、患者的预后或特定的治疗方案是否有效。例如，如果用特定的化疗方案治疗患者，患者组织中(即，在 外周血液中)的免疫原性靶的降低的表达水平可以指示该方案能降低该宿主中的癌症负载。类似地，如果表达水平增高，可能需要使用另一种治疗方案。在一个实施方案中，可以将与编码免疫原性靶的核酸相对应的核酸探针结合到生物芯片上，如本领域已知的，用于检测和定量宿主中的表达。 

还可以使用核酸、蛋白、它们的衍生物或其抗体作为药物筛选实验中的试剂。该试剂可以用于确认药物备选品对免疫原性靶在细胞系、或患者的细胞或组织中的表达的作用。可以将表达图谱分析技术与高通量筛选技术相组合，以快速鉴别有用的化合物和监视药物备选品的治疗的有效性(见，例如，Zlokarnik，等.，Science 279，84-8(1998))。药物备选品可以是化合物、核酸、蛋白、抗体或它们的衍生物，无论是天然存在的还是合成地衍生的。除了别的用途外，这样鉴别出的药物备选品还可以用作药物组合物，以施用给患者或用于其它筛选实验。 

使用本领域的技术人员已知的许多技术中的任一种，可以将本发明的组合物施用给宿主。可以根据药学的常规方法加工组合物，生产用于施用给患者、包括人和其它哺乳动物的药剂(即，″药物组合物″)。优选地，将药物组合物制成剂量单位形式，其含有给定量的例如DNA、病毒载体颗粒、多肽或肽。根据患者的状况和其它因素，用于人或其它哺乳动物的合适的日剂量可以较宽地变化，但是，再一次，可以使用常规方法来确定。 

可以在含有常规的药学上可接受的载体、佐剂和介质的剂量单位制剂中，口服地、肠胃外地、通过吸入喷雾剂、直肠地、***内地或局部地施用药物组合物。如本文所使用的，术语″药学上可接受的载体″或″生理学上可接受的载体″指一种或多种制剂化物质，其适用于实现或增强作为药物组合物的核酸、多肽或肽的送递。″药物组合物″是一种组合物，其包含治疗有效量的核酸或多肽。术语″有效量″和″治疗有效量″都指用于诱导或增强有效的免疫应答的核酸或多肽的量。优选地，本发明的组合物能诱导或增强宿主中的抗肿瘤免疫应答，这会保护宿主免于肿瘤的发展和/或允许宿主从体内消除现有的肿瘤。 

对于口服施用，药物组合物可以是任一种形式，包括，例如，胶囊、片剂、悬浮液或液体等等。可以注射施用液体，作为含有合适的载体、包含盐水、葡聚糖或水的组合物。如本文所使用的，术语“肠 胃外的”包括皮下的，静脉内的，肌肉内的，胸骨内的，输注，或腹膜内的施用。通过将药物与合适的无刺激的在常温下是固体、但是在直肠温度下是液体的赋形剂(例如可可油和聚乙二醇)相混合，可以制备出用于直肠给药的栓剂。 

使用本发明的组合物免疫宿主或治疗障碍或疾病的剂量方案是基于许多因素，包括疾病的类型，患者的年龄、重量、性别、医学状况，状况的严重性，给药途径和使用的具体化合物。例如，可以施用痘病毒载体，作为包含1×10⁶感染性颗粒/剂的组合物。因而，剂量方案可以较大地变化，但是可以使用标准方法常规地确定。 

也可以使用激发-加强方案(见，例如，WO 01/30382Al)，其中，在激发步骤中以一种形式初次施用靶向的免疫原，然后在加强步骤中以另一种形式施用靶向的免疫原。在激发和加强步骤中的靶向的免疫原的形式是不同的。例如，如果激发步骤使用了核酸，可以施用肽来加强。类似地，当激发步骤使用了一种类型的重组病毒(即，ALVAC)时，加强步骤可以使用另一种类型的病毒(即，NYVAC)。已经证实，该激发-加强施用方法会诱导强免疫应答。 

尽管本发明的组合物可以作为唯一的活性药剂来施用，它们也可以与一种或多种其它组合物或试剂(即，其它的免疫原性靶，共刺激分子，佐剂)组合使用。当组合施用时，可以将各组分制成分开的组合物，可以同时或在不同的时间施用它们，或者可以将组分制成单一组合物。 

根据已知的方法，使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂，可以制备出可注射的制品，例如无菌的可注射的水性或油性悬浮液。可注射的制品也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌的可注射的溶液或悬浮液。可以使用的合适的介质和溶剂是水、林格溶液和等渗氯化钠溶液等等。例如，可以将病毒载体(例如疸病毒)制备在0.4％NaCl中。另外，常规地使用无菌的、不挥发油作为溶剂或悬浮介质。为此，可以使用任意的温和的不挥发油，包括合成的单或二甘油酯。另外，可以将脂肪酸(例如油酸)用于可注射的制品中。 

对于局部施用，可以每天施用1-4次、优选2或3次合适的局部剂量的组合物。也可以隔日给药，在隔日时不给药。合适的组合物可以占制剂的0.001％至10％重量/重量，例如1重量％-2重量％，尽管它 可以在制剂中高达10％重量/重量，但是优选地不超过5％重量/重量，更优选0.1％-1重量％。适用于局部施用的制剂包括适用于穿透皮肤的液体或半固体制品(例如，擦剂，洗剂，软膏，乳剂，或糊剂)和适用于向眼、耳或鼻给药的滴剂。 

也可以将药物组合物制成固体形式(包括颗粒，粉末或栓剂)。可以对药物组合物进行常规的药学操作，例如灭菌，和/或可以含有常规的佐剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、缓冲剂等。用于口服施用的固体剂型可以包括胶囊、片剂、丸剂、粉末和颗粒。在这样的固体剂型中，可以将活性化合物与至少一种惰性稀释剂相混合，后者例如蔗糖、乳糖或淀粉。作为常用的实践，这样的剂型也可以包含惰性稀释剂以外的其它物质，例如，润滑剂，例如硬脂酸镁。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，该剂型也可以包含缓冲剂。另外，可以给片剂和丸剂制备肠衣。用于口服施用的液体剂型可以包含药学上可接受的乳状液、溶液、悬浮液、糖浆剂和酏剂，其含有本领域常用的惰性稀释剂，例如水。这样的组合物也可以包含佐剂，例如润湿剂、甜味剂、矫味剂和芳香剂。 

包含本发明的核酸或多肽的药物组合物可以采取任意的形式，且可以通过任意的途径施用。在优选的实施方案中，通过肠胃外的(皮内的，肌肉内的或皮下的)途径施用组合物，以诱导宿主中的免疫应答。或者，可以将组合物直接施用给***(***内的)或肿瘤块(即，肿瘤内的施用)。例如，可以在第0，7，和14天，皮下给药。合适的使用包含TA的组合物进行免疫的方法是本领域已知的，如对下列物质所证实的：p53(Hollstein等.，1991)，p21-ras(Almoguera等.，1988)，HER-2(Fendly等.，1990)，黑素瘤相关抗原(MAGE-1；MAGE-2)(van der Bruggen等.，1991)，p97(Hu等.，1988)，黑素瘤相关抗原E(WO 99/30737)和癌胚抗原(CEA)(Kantor等.，1993；Fishbein等.，1992；Kaufman等.，1991)，等等。 

优选的可施用的组合物的实施方案包括，例如，在液体制品(例如悬浮液、糖浆剂或酏剂)中的核酸或多肽。优选的可注射的制品包括，例如，适用于肠胃外、皮下、皮内、肌肉内或静脉内施用的核酸或多肽，例如无菌的悬浮液或乳状液。例如，可以将重组的痘病毒与合适的载体、稀释剂或赋形剂相混合，例如无菌水、生理盐水、葡萄 糖等。也可以将组合物制成冻干形式，用于例如在等渗的水性、盐水缓冲液中重配。另外，可以将组合物与其它的抗赘生物剂、抗肿瘤剂或抗癌剂和/或能减少或减轻抗赘生物剂、抗肿瘤剂或抗癌剂的有害作用的药物共同施用或依次施用。 

还提供了包含本发明的组合物的试剂盒。该试剂盒可以包含分开的容器，其装有合适的载体、稀释剂或赋形剂。该试剂盒也可以包含用于共同施用或依次施用的其它的抗赘生物剂、抗肿瘤剂或抗癌剂和/或能减少或减轻抗赘生物剂、抗肿瘤剂或抗癌剂的有害作用的药物。另外，该试剂盒可以包含关于混合或组合成分和/或施用的说明书。 

从下面的说明性的实施例，可以更好地理解本发明和它的许多优点。 

实施例 

实施例1 

AAC2肿瘤相关抗原 

一位合作者提供了AAC2编码序列(AAC2-1)的一种形式，发现它与鼠bcl-6-相关锌指蛋白(″BAZF″)具有较高的序列相似性。基于该序列信息，设计了如下所示的PCR引物： 

CACCATGGGT TCCCCCGCCG CCCCGGA(正向引物；SEQ ID NO.：6) 

CTAGGGCCCC CCGAGAATGT GGTAGTGCAC TTT(反向引物；SEQ ID NO.：7) 

按照生产商(Life Technologies，Inc.，目录号15596)的指导，使用Trizol^TM，从汇合的HUVEC(BioWhittacker；目录号CC2517，批号1F0141)培养物分离出了RNA。然后，使用正向和反向引物，进行了高保真度RT-PCR(24个循环，在94度，2分钟；94度，30秒；56.8度，30秒；68度，1分40秒；循环25是68度，7分钟)，分离了一个1,447碱基对的cDNA。将该cDNA克隆进了pEF6-TOPO真核生物表达质粒，并称作″pEF6-hAAC2-2″。使用4个引物，对cDNApEF6-hAAC2-2进行测序，并与AAC2-1和鼠BAZF的序列进行比对(图1)。如其中证实的，AAC2-2缺失在AAC2-1的位点245处发现的丝氨酸残基。其次，在AAC2-2的位点298至316处的17个氨基酸 的序列串(SEFFSCQNCEAVAGCSS)仅仅表现出11.8％的与AAC2-1的氨基酸298-316的序列同一性(图1)。有趣的是，位点298至316之间的17个氨基酸的序列串与鼠BAZF100％相同，表明这对于长串丝氨酸(锌指)的转录因子功能是至关重要的。然后，将AAC2-2克隆进了pcDNA3.1-zeo真核生物表达质粒(″pcDNA3.1-hAAC2-2″)。 

实施例2 

针对AAC-2肽的人T-细胞应答性 

使用AAC2-2氨基酸序列，构建了预测会结合HLA-A-0201的9-聚物肽文库(表III；″N″表示在小鼠同源物中没有发现该序列；而″Y″表示在小鼠同源物中发现了该序列)。将23个肽以10mg/ml溶于DMSO中(表IV)，并用于人PBMC培养物，以体外测试它们的引起CD8和CD4αβT-细胞应答的能力。 

表III：预测的人AAC2-2的HLA-A-0201-结合九聚物肽 

使用GM-CSF和IL-4，从能表达HLA-A-0201的血液供体的外周血单核细胞生成了树突细胞(DC)。用表IV所示的不同的9-聚物AAC2-2肽组对DC进行脉冲。 

表IV：AAC2-2肽组 

使用这些DC来刺激自体T-细胞富集的PBMC制品。用自体PBMC再次刺激T细胞，然后用CD40-配体活化的自体B细胞再次刺激。用每个肽组刺激3和4个轮后，ELISPOT分析IFN-γ的生成，表明T细胞对AAC2-2肽组之一的反应最强(肽组6；图2A)。肽组6包括下面的肽：ILTDVTLLV(氨基酸36-44)，TLLVGGQPL(氨基酸41-49)，和FMYTSRLRL(氨基酸95-103)。流式细胞仪分析(FACS)表明，来自该肽-特异性细胞系的淋巴细胞由＞50％具有记忆(CD45RO⁺)表 型的CD8T细胞组成。非常少的细胞(＜2％)被抗-CD56抗体染色，表明观察到的IFN-γ生产不是由于NK细胞活性。 

分析该肽组-特异性的T-细胞系的CTL活性，也证实了活化的T细胞能以HLA-A-0201-限制的方式杀伤肽-加载的TAP-缺乏的T2细胞(图2B)。该分析还揭示，ILTDVTLLV是显性肽，它能刺激大部分肽-特异性的CTL活性。因而，证实了AAC2-2肽在人免疫***中是免疫原性的。 

实施例3 

AAC2-2的体内免疫原性 

使用DNA免疫HLA-A2-Kb转基因小鼠，发现AAC2-2蛋白被加工成了免疫原性肽，且能在体内引起HLA-A-0201-限制的T-细胞应答。在第1天，通过注射pEF6-hAAC2-2免疫了小鼠，并在第21天，用相同的质粒进行加强。加强后21天，从免疫的小鼠收获淋巴细胞，并用表IV所示的不同的AAC2-2肽组体外地重新刺激。使用IFN-γELISPOT分析，发现了针对这些肽的肽-特异性的效应物T-细胞功能(图3)。发现在DNA接种后，以前在人PBMC培养物中表现出强免疫原性的相同的肽组(组6)也引起了显著的T细胞反应性(图3)。因而，作为基于DNA的疫苗施用的AAC2基因产物是体内免疫原性的，且能引起较强的细胞介导的免疫应答，后者的特征在于CTL活性的激活。 

实施例4 

治疗性AAC2-2疫苗 

发现使用pEF6-hAAC2-2DNA疫苗进行针对AAC2-2基因的治疗性接种，会完全阻断实体瘤的生长。用10⁴B16F10黑素瘤细胞、强的和相对非免疫原性的肿瘤细胞系皮下地侵袭了一组8只C57BL/6小鼠。然后，在肿瘤侵袭后6天，开始以每周的间隔免疫小鼠。用编码流感-NP蛋白的质粒或盐水单独处理的对照小鼠(每组8只)都发展了大肿瘤。相反地，用pEF6-hAAC2-2免疫的所有小鼠(8/8)都在50天的时间内没有可检测到的肿瘤(图4)。在80天中，所有小鼠都仍然没有肿瘤(未显示数据)。图5对黑素瘤植入后证实的用不同的DNA载体处理 的小鼠的存活率作图，这再次证实了AAC2-2疫苗在保护小鼠免于黑素瘤生长中的完全有效性。没有观察到用人AAC2-2基因编码载体免疫引起的有害健康的作用(免疫的小鼠和对照小鼠一样有活力，且没有表现出体重减少)。 

如图4和5所示，用编码人VEGFR-2的质粒(pBLAST-hflkl)进行接种，不能保护肿瘤侵袭的小鼠。实际上，肿瘤在这些小鼠中甚至更迅速地生长。通过ELISA分析来自用pBLAST-hflkl质粒免疫的小鼠的血清，发现以显著的滴度诱导了针对VEGFR-2蛋白的IgG(未显示数据)。这些结果表明，基于抗体的针对VEGFR-2的免疫应答不能有效地预防血管发生和实体瘤生长。 

在用pEF6-hAAC2-2免疫的C57BL/6小鼠中的黑素瘤实体瘤生长的抑制与针对该蛋白的免疫应答有关(图6)。如上所述，进行了C57BL/6小鼠的免疫。用与使用HLA-A2-Kb转基因小鼠的实验相同的肽组重新刺激了来自免疫的小鼠的脾细胞(表III)。相当数量的肽能与C57BL/6I类MHC(Kb和Db分子)交叉反应。更具体地，发现2个肽组(组1和组5)能在IFN-γELISPOT实验中引起强效应细胞活性(图6)。这些组中的所有肽都与鼠BAZF蛋白中的对应序列相同。这些结果强烈地表明，用人AAC2-2免疫会在小鼠中活化针对它的鼠直向同源物BAZF的免疫应答，且结果可以抑制肿瘤血管发生。这些结果来自单个实验，并非所有的实验都显示了这些结果。 

实施例5 

BFA4肿瘤抗原 

发现BFA4序列是″毛发、鼻、指(趾)综合征1″(TRPS-1)基因(Genebank ID#6684533；Momeniet等，Nature Genetics，24(1)，71-74，2000)，它是一种已知的转录因子，以前认为它对所有形式的癌症都没有作用。BFA4cDNA序列如图7所示(SEQ ID NO.：23)，推导的氨基酸序列如图8所示(SEQ ID NO.：24)。 

A.BFA4肽和多克隆抗血清 

为了监测目的，制备了兔抗-BFA4多克隆抗体。设计和合成了6个肽(22-聚物)，以引起针对BFA4的抗体反应，如下所示： 

用肽免疫了兔，分离了血清，并观察到了下面的抗体滴度： 

还通过偶联KLH肽，修饰了这些肽，以增强免疫应答，如下所示： 

还使用pcDNA3.2BFA4(3.6mg)进行DNA免疫，在小鸡中生成多克隆血清。 

B.BFA4的克隆 

BFA4的完整cDNA序列是约10kb，并在BT474导管癌细胞中表达了基因。设计了引物7717(正向引物)和7723(反向引物)，以通过RT-PCR扩增4kb，7kb或10kb产物，以扩增全长BFA4基因。引物7717：含有Kozak的BFA4-BamH1/F1(5′端正向)： 

5′CGGGATCCACCATGGTCCGGAAAAAGAACCCC 3′(DNA3.1的BamHI，MP76)引物7723：BFA4-BamHI/R1(3′端反向4kb)： 

5′CGGGATCCCTCTTTAGGTTTTCCATTTTTTTCCAC 3′(DNA3.1的BamHI，MP76) 

在RT-PCR中，使用了按照生产商(Gibco BRL)的指示用Trizol从BT-474细胞分批地分离和冷冻的10mg总RNA，以扩增BFA4基因。使用Taq铂高保真度酶，OPC(Oligo Purification Cartridge；AppliedBiosystems)纯化的引物和纯化的总RNA/polyA mRNA(BT 474细胞)，优化了RT-PCR条件。优化产生了作为单一条带的4.0kb片段。 

为了重新扩增BFA4序列，按照生产商的说明书(Gibco BRL)，用脱氧核糖核酸酶处理了mRNA。使用引物7717和7723引物(10皮摩尔/微升)和Taq铂高保真度聚合酶(GIBCO BRL)酶，通过PCR，再次扩增了4kb DNA。2组反应的温度循环仪条件如下：94℃(2分钟)，然后30个循环：94℃(30秒)，52℃(30秒)，67℃(4分钟)和67℃(5分钟)，和最后40℃持续10分钟。在pCR2.1/TOPO-TA克隆后，鉴定出了3个BFA4克隆。 

在分析BFA4序列的过程中，鉴定出了几个突变。为了校正这些序列，将来自克隆JB-3552-1-2(pCR2.1/TOPO/BFA4)的BFA4基因的BamHI/XhoI片段(5′)替换为来自克隆JB-3552-1-4(pCR2.1/TOPO/BFA4)的BFA4基因的XhoI/BamHI片段(3′)。然后，将该重组片段连接进pMCS5BamHI/CAP。生成了克隆JB-3624-1-5，且发现其含有正确的序列。 

分离的BFA4克隆的核苷酸344不同于报道的序列(在BFA4中是C，在TRPS-1中是T)。该变化导致了从phe向ser的氨基酸变化。为了将该序列变成报道的序列，将来自克隆JB-3552-1-2(pCR2.1/TOPO/BFA4)的BFA4基因的EcoRI/BglII片段(5′)亚克隆进pUC8：2，生成克隆JB-3631-2。该克隆用作Quickchange(Stratagene)诱变的模板，以将BFA4蛋白的氨基酸115从丝氨酸变成苯丙氨酸，象在TRPS1蛋白中一样。选择的克隆是JB-3648-2-3。还使用pMCS5 BFA4(BT474)作为Quickchange(Stratagene)诱变的模板，重复诱变，以将BFA4蛋白的氨基酸115从丝氨酸变成苯丙氨酸，象在TRPS1蛋白中一样。通过DNA测序发现几个克隆是正确的， 将一个克隆(JB-3685-1-18)用于进一步的亚克隆。 

然后，使用JB-3685-1-18，将BFA4编码序列亚克隆进4个不同的表达载体的BamHI位点：1)痘病毒(NYVAC)载体pSD554VC(COPAK/H6；JB-3707-1-7)；2)pcDNA3.1/Zeo(+)(JB-3707-3-2)；3)pCAMycHis(JB-3707-5-1)；和4)Semiliki森林病毒甲病毒复制子载体pMP76(JB-3735-1-23)。通过DNA测序，确认了JB-3707-1-7，JB-3707-5-1，和JB-3735-1-23中的BFA4编码序列。 

将终止密码子导入到了pcDNA3.1/Zeo/BFA4构建体(JB-3707-3-2)中的克隆序列的末端附近。打开并填充了独有的EcoRI位点，以便与BFA4编码序列在同一读框内导入终止密码子。通过EcoRI位点的丧失，鉴定出了几个推定的克隆，但是对3个克隆(JB-3756-1-2；JB-3756-3-1；和JB-3756-4-1)进行了测序。发现所有3个克隆的填充区域都是正确的。鉴定出克隆JB-3756-3-1具有正确的序列和方向。 

使用寡核苷酸，导入了Myc和myc/his标志(Evans等，1985)，将其退火，并连接在pcDNA3.1/Zeo/BFA4构建体(JB-3707-3-2)的EcoRI/EcoRV位点。从这些构建体得到了几个克隆。得到了3个具有正确的序列和方向的克隆：1)PcDNA3.1/Zeo/BFA4/myc-tag(JB-3773-1-2)；2)PcDNA3.1/Zeo/BFA4/mychis-tag(JB-3773-2-1)；和3)PcDNA3.1/Zeo/BFA4/mychis-tag(JB-3773-2-2)。 

C.BFA4的表达 

1.从痘病毒载体表达 

使用pSD554VC(COPAK/H6；JB-3707-1-7)载体来生成NYVAC-BFA4病毒。用质粒COPAK/H6/BFA4和在RK13/CEF细胞中的NYVAC，进行了体外重组。生成了NYVAC-BFA4(vP2033-NYVAC-RK13)，在完成3次最终原液浓度为1.12×10⁹/ml(l0ml)的富集后，扩增至P3水平。以0.5pfu/细胞的M.O.I.，用NYVAC-BFA4感染了Vero细胞。感染后24小时，收获了裂解物和培养基，以确认BFA4蛋白的表达。将1/20的浓缩培养基和1/40的裂解物进行蛋白印迹，并与针对BFA4肽CLP 2589，2591，2598和2594的兔抗血清一起孵育(见上面关于肽序列和抗-BFA4抗血清的制备)。 在NYVAC-BFA4-感染的Vero细胞的裂解物和浓缩培养基中，都检测到了大约120kD的带，它在Vero对照细胞(″假感染的″)、感染了亲本NYVAC病毒的Vero细胞或浓缩培养基中都不明显。 

2.从基于pcDNA3.1的载体表达 

进行了瞬时转染研究，以验证BFA4从基于pcDNA的载体的表达，并分析产生的针对BFA4肽的多克隆血清的量。使用了下面的构建体来研究BFA4基因的表达：pcDNA 3.1zeo^R/BFA4，pMP76/BFA4，pcDNA3.1zeo^R/BFA4/Myc标志和pcDNA 3.1zeo^R/BFA4/MycHis标志。用pGL3荧光素酶(1μg)(Promega)和作为转染剂的Gene porter试剂(Gene Therapy Systems)共同转染了BFA4表达质粒(5μg和10μg)。在转染后48小时，通过在细胞裂解剂(200μl)中研磨细胞和1个周期的冻融(-20℃冷冻，37℃融解)，制备了全细胞提取物。通过一式两份地检测相对荧光素酶单位(RLU)，分析荧光素酶报道基因的表达，对转染效率进行了定量。在有和没有BFA4表达载体的情况下，在用荧光素酶构建体共转染的样品中得到了类似的RLU值。使用不同量(5μg和10μg)的BFA4表达载体，没有观察到毒性或RLU值的显著差异。使用碱性磷酸酶***，对CHOK1细胞提取物(pCDNA3.1/zeo/BFA4/MycHisTag)和抗-BFA4多克隆抗血清进行初步的蛋白印迹分析，揭示了在BFA4载体-转染的细胞的提取物中的约120kDa的带。 

进行了稳定的转染研究，以得到稳定的能表达COS A2细胞的BFA4克隆。这些细胞在体外刺激实验中是有用的。使用pcDNA 3.1zeo^R/BFA4(2.5μg和20μg)，和pcDNA 3.1 zeo^R/BFA4/MycHis标志(2.5μg)来研究BFA4的表达。使用pGL3荧光素酶(2.5μg)作为对照载体，以监测转染效率。使用Gene porter试剂来促进DNA载体的转染。转染后48小时，通过在细胞裂解剂(200μl)中研磨细胞和1个周期的-20℃/37℃冻融，制备了全细胞提取物，用于第一个实验。用胰蛋白酶处理了从第二个实验得到的转染的细胞，建立了冷冻的原液，并将细胞铺板到递增浓度的Zeocin(0，250，500，750和1000μg/ml)中。未转染的CosA2细胞能在100μg/ml(Zeocin)中存活3周60-80％汇合，在250μg/ml(Zeocin)时10％汇合。但是，3周后，在更高药 物浓度(500μg/ml)，在含有未转染的细胞和高Zeocin浓度(500-1000μg/ml)的平板中，没有观察到活细胞。 

3周后，从10cm平板挑取了能在不同药物浓度(Zeocin-250，500，750和1000μg/ml)生长的几个Zeocin-抗性的克隆。在有500，750和1000μg/ml Zeocin存在的情况下，将这些克隆再扩展到3.5cm平板中。制备了这些克隆的冷冻批，在有1mg/ml Zeocin存在的情况下，将来自每个组(pcDNA 3.1 zeo^R/BFA4，和pcDNA 3.1 zeo^R/BFA4/MycHis标志)的几个克隆扩展到T75 cm²烧瓶中。在有1 mg/ml Zeocin存在的情况下，将来自每个组(pcDNA 3.1 zeo^R/BFA4，和pcDNA 3.1zeo^R/BFA4/MycHis标志)的5个克隆扩展到T75cm²烧瓶中。在Zeocin药物(1mg/ml)选择下，维持细胞。在BFA4肽-脉冲的靶实验中，使用了6个克隆，通过免疫学实验发现2个克隆能以中等水平表达BFA4。还用这些载体转染了未贴壁的细胞系K562A2和EL4A2，以生成稳定的细胞系。 

3.原核生物表达载体 

将来自pCDNA3.1/BFA4的编码N-末端54kDa BFDA4的BamHI-Xho-1片段(1.5Kbp)片段克隆进了pGEX4Tl-6His(Veritas)质粒。该载体含有tac启动子，其后是N-末端谷胱甘肽S-转移酶(GST，约26kDa)和GST融合蛋白的C末端的六组氨酸标志。 

将BFA4-N54表达质粒转化进了BL21细胞，并在25℃、在抗生素选择培养基(2L培养物)中生长至OD(600nm)，此后，用1mM IPTG诱导。发现GST-BFA4-N54是可溶蛋白。将可溶级分的澄清提取物分批地吸附到谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B上，并用10mM还原的谷胱甘肽洗脱。估计蛋白浓度和TCA沉淀后，分析了级分。通过SDS-PAGE，确认了洗脱物中的Mr＝85kDa的特定多肽。将通过谷胱甘肽-琼脂糖凝胶纯化的重组蛋白吸附到NiNTA柱上，进一步纯化。用0.25M咪唑洗脱了结合的蛋白。在含有40％甘油的TBS中，渗析蛋白，产生了4.5mgGST-BFA4-N54-6His(N末端BFA4蛋白)蛋白。通过蛋白印迹，使用兔抗-BFA4多克隆抗体，确认了BFA4的表达。 

D.抗-BFA4免疫应答 

1.BFA4肽 

除了BFA4的遗传免疫载体外，已经制备了BFA4的免疫试剂。合成了跨BFA4基因产物的100种九聚物肽的文库。根据它们潜在的结合HLA-A＊0201的能力，选择了肽。表V列出了来自测试的BFA4蛋白的HLA-A＊0201的100种九聚物肽表位(见下文)： 

将肽文库分成了不同的组，每组含有7-10种不同的肽，用于表VI(见下文)所示的免疫学测试。除了跨BFA4的肽文库外，已经合成和从大肠杆菌中纯化了跨N-末端300个氨基酸(1-300位)的重组蛋 白。 

BFA4肽的免疫反应性和人效应物T细胞的生成： 

将BFA4肽分成了不同的组，每组含有7-10种肽，用于免疫学测试。用溶解的肽组脉冲了自体的HLA-A＊0201树突细胞，并用于活化自体的T-细胞富集的PBMC制品。使用CD40L-活化的自体B-细胞，再刺激来自每个肽组刺激的培养物的活化的T细胞3至5次。进行了IFN-γELISPOT分析和CTL杀伤肽-刺激的靶细胞的实验，以证实这些来自BFA4的表位的免疫原性。 

人T细胞证实了针对许多来自BFA4蛋白的肽的组的效应细胞活性，如它们在ELISPOT实验中的分泌IFN-γ的能力所证实的。APC刺激不同轮后，重复这些实验，产生了相同的反应肽组。发现肽组1，2，4，5，6，7，8，9，和10在这些实验中是免疫反应性的(图9A)。随后，在其它的IFN-γELISPOT实验中，测试了这些反应性肽组，其中分别测试了来自每组的单独的肽。在ELISPOT实验中，各肽来自BFA4肽组1，5，6，7，8，9，和10(图9B)。该分析揭示了许多单独的强反应性肽，它们来自通过人T细胞识别出的BFA4蛋白。还观察到，这些单独的肽中的许多也会诱导杀伤肽-加载的人T2淋巴细胞靶的CTL活性。这些肽列在表VII中： 

表VII

来自BFA4的高免疫反应性肽的列表 

D.体内免疫后针对BFA4的免疫应答： 

使用pcDNA3.1/Zeo-BFA4质粒来免疫转基因小鼠，其能表达与C57BL/6小鼠(A2-Kb小鼠)中的鼠Kbα3域相融合的杂合体HLA-A＊0201α1α2域。DNA免疫和去除活化的脾细胞后，使用组的肽组进行IFN-γELISPOT分析，揭示了许多反应性BFA4肽组。这些组中的一些(尤其是组7和8)也在人T-细胞培养物中强烈反应，表明通过人T细胞识别出了重叠的肽组，并在接种疫苗后天然地加工和呈递到HLA-A2上。 

还使用NYVAC-BFA4和MP76-18-BFA4载体，在A2-Kb小鼠中进行了接种实验。用10-20μg MP-76-18-BFA4和1-2×10⁷pfu vP2033(NYVAC-BFA4)皮下地免疫了小鼠，并在28天后，用相同量的每种载体进行加强。用BFA4肽的组重新刺激来自免疫的小鼠的脾细胞，揭示了BFA4肽组2，3，4，5，7，9，和10在ELISPOT实验中引起的IFN-γ生产的诱导。因而，在CMV启动子驱动的真核生物质粒、NYVAC或基于Semliki复制酶的DNA质粒中编码的BFA4基因都能体内诱导针对BFA4蛋白的T-细胞应答。 

实施例6 

BCYl肿瘤抗原 

发现BCYl基因是部分的开放读码框(ORF)，其与称作″晚期表达的母基因-3″(PEM-3)的线虫基因同源，后者在晚期至早期的秀丽新杆线虫胚胎形成中起作用。以前尚未记载该基因会涉及癌症。 

A.BCYl和氨基酸DNA序列 

最初确定了BCYl的部分DNA序列。引物、9616SXC和9617SXC源自BCYl部分DNA序列，并用于RT-PCR，从Calu6总RNA克隆BCYl。设计了引物，使PCR产物在两端具有BamHI位点，且在5′端具有ATG起始密码子和Kozak序列，如下所示： 

9616SXC：5′CAGTACGGATCCACCATGGCCGAGCTGCGCCTGAAGGGC3′ 

9617SXC：5′CCACGAGGATCCTTAGGAGAATATTCGGATGGCTTGCG3′ 

在优化的条件下，使用ThermoScript RT-PCR***(Invitr0gen)，得到了1.2Kb的预期的扩增子。用BamHI消化了来自3个分开的RT-PCR的PCR产物，并分别***pcDNA3.1／Ze0(+)。得到的克隆是：来自第一次RT-PCR的MC50A6，MC50A8和MC50A19；来自第二次RT-PCR的MC54.21和MC55.29；和来自第三次RT-PCR的MC55.32。使用下面的引物对克隆进行测序： 

9620MC：5′TAATACGACTCACTATAGGG3′ 

9621MC：5′TAGAAGGCACAGTCGAGG3′ 

9618MC：5′GAAAACGACTTCCTGGCGGGGAG3′ 

9619MC：5′GCTCACCCAGGCGTGGGGCCTC3′ 

所有6个克隆的DNA测序揭示了共有序列，如图10A和10B所示，其与原始的部分BCYl序列有下述不同：在位点1031的C至G 取代导致了Ala至Gly的氨基酸变化；在位点1032-1034的GC缺失导致了Thr缺失；在位点1177的A至G取代导致了Thr至Ala的氨基酸变化。克隆MC50A8和MC55.29与共有序列相同。BCYl的氨基酸序列如图10B和所示。 

B.BCYl乳腺癌抗原的免疫试剂： 

合成了跨BCYl基因产物的100种九聚物肽的文库。根据它们潜在的结合HLA-A*0201的能力，选择了肽。表VIII列出了来自测试的BCYl蛋白的HLA-A*0201的100种九聚物肽表位(见下文)： 

表VIII

表VIII(续)

表IX显示了用于免疫学测试的肽组： 

C.BCY1肽的免疫反应性和人效应物T细胞的生成 

将来自BCY1的100种肽的文库分成10组，每组7-10种肽，用于免疫学测试。用溶解的肽组脉冲了自体的HLA-A＊0201树突细胞，并用于活化自体的T-细胞富集的PBMC制品。使用CD40L-活化的自体B-细胞，另外刺激来自每个肽组刺激的培养物的活化的T细胞3至 5次。进行了IFN-γELISPOT分析和CTL杀伤肽-刺激的靶细胞的实验，以证实这些来自BCY1的表位的免疫原性。 

人T细胞证实了针对许多来自BCY1蛋白的肽组的效应细胞活性，如它们在ELISPOT实验中的分泌IFN-γ的能力所证实的。APC刺激不同轮后，重复这些实验，产生了相同的反应性肽组。发现肽组1，2，3，4，5，6，和7在这些实验中是免疫反应性的。随后，在其它的IFN-γELISPOT实验中，测试了这些反应性肽组，其中分别测试了来自每组的单独的肽。该分析揭示了许多单独的强反应性肽，它们来自通过人T细胞识别出的BCY1蛋白(图11)。这些单独的肽中的许多也会诱导杀伤肽-加载的人T2淋巴细胞靶的CTL活性。表IX列出了这些肽。 

实施例7 

BFA5/NYBR-1乳腺癌抗原 

A.BFA5的鉴定 

微阵列图谱分析表明，与一系列的52个正常的、无肿瘤的组织相比，BFA5在54个乳腺瘤活组织检查样品中的41个(76％)中以从低至高的水平表达，在54个乳腺瘤的31个(57％)中高水平表达。使用一系列BFA5DNA探针进行了原位杂交(ISH)，并确认了至少61％肿瘤表现出较强信号的微阵列。进一步的生物信息学评价确认了这些基因表达分析的结果。 

BFA5核苷酸序列的序列分析揭示了与2个未鉴定的人基因的高度相似性：KIAA1074(GenBank登记号XM 159732)；和KIAA0565(GenBank登记号AB011137)，它们是从许多胎儿和成人脑cDNA克隆分离出来的(Kikuno，等.The complete sequences of 100 new cDNA clones from brain which code for large proteins in vitro.DNA Res.6：197-205)。发现这些基因含有推定的Zn指区和核定位序列。有人认为BFA5是潜在的乳腺癌抗原(Jager，等.2001.Identification of a tissue-specific putative transcription factor in breast tissue by serological screening of a breast cancer library.Cancer Res.61：2055-2061和WO 01/47959)。在这些文献中的每一篇中，将核苷酸序列BFA5称为NYBR-1(″纽约乳腺癌-1″；GenBank登记号AF269087(核苷酸)和AAK27325(氨基酸)。为了本申请的目的，将该序列称 作BFA-5，术语BFA-5和NYBR-1是可互换的。 

如Jager，等以前证实的和WO 01/47959(同上)所述，BFA5特别地在乳腺中表达，且在12/19分析的乳腺瘤中表达。BFA5/NYBR-1基因的结构已经揭示，它编码150-160kD核转录因子，后者含有bZIP位点(DNA-结合域，其后是亮氨酸拉链基序)。该基因也含有5个串联锚蛋白重复，暗示着在蛋白-蛋白相互作用中的作用。这些锚蛋白重复可能在蛋白的同二聚化中起作用。BFA5cDNA序列如图12和SEQ ID NO.：27所示。BFA5氨基酸序列如图13和SEQ ID NO.：28所示。 

B.BFA5的免疫反应性 

1.人T细胞的活化和IFN-γ在ELISPOT中的分泌。 

使用Rammensee和Parker算法，设计了来自预测会中等至高度结合HLA-A＊0201的BFA5/NYBR-1编码序列的100种肽的文库。将该文库细分成10组，每组10种肽(见表XI)，并在用肽刺激成熟的自体树突细胞后，使用每个组来活化10种不同的T细胞培养物。使用BFA5/NYBR-1肽的文库进行的2个实验证实了在HLA-A＊0201人T细胞中的免疫反应性，如下所述。 

表X

BFA5肽组 

在通过用每个BFA5肽组刺激4轮而活化的人T-细胞培养物上进行了ELISPOT分析。在图14A中，X-轴下的数字指示着每个肽组的编号(1-10)。使用针对CMV pp65肽和流感基质肽的反应性作为实验中T-细胞活化的阳性对照。使用来自称作″AP10″的单一HLA-A＊0201⁺供体的PBMC和树突细胞，进行每个实验。结果表明，尽管BFA4在实验中与高ELISPOT计数/100,000细胞明显是反应性的，BFA5与指示着ELISPOT反应性的9/10组是更具有反应性的。从具有不同的HLA-A＊0201的BFA4和BFA5/NYBR-1，得到了类似的结果。条柱在600个斑点达到最大值，因为超过了该值，ELISPOT读数器不能产生准确的读数。具有600个斑点的读数的培养物具有大于该数的斑点数。 

如高水平的IFN-γ生产所证实的，大量BFA5肽组是反应性的(图14A)。然后将每个反应性的肽组分成单个的肽，并使用ELISPOT实验分析免疫原性，以分离单个的反应性的BFA5肽。如图14B所示，与BFA4相比，BFA5和几种反应性的单个肽是高免疫原性的。在2个独立的PBMC培养实验中，得到了类似的结果。 

除了ELISPOT分析外，测试了BFA5肽活化的人T细胞，以确定它们作为CTL起作用的能力。使用肽-脉冲的树突细胞活化了细胞，然后使用CD40配体-活化的B细胞(刺激5轮)。使用从HLA-A＊0201⁺供体AP31分离的PBMC，进行了所述的实验。使用肽-加载的T2细胞，在⁵¹Cr-释放实验中测试了分离的T细胞。用BFA5/NYBR-1肽组或各个肽脉冲的T2细胞，显示了在细胞/靶比是10∶1，5∶1，和1∶1时的％特异性裂解。该图证实了针对加载了非特异性的HLA-A＊0201-结合HIV肽(对照)的靶诱导的CTL活性，针对肽组(组1等)的CTL活性，然后证实了由来自各组的单个的肽诱导的活性。在1∶1E∶T比时，观察到了一些肽的高水平的细胞毒性。对照HIV肽诱导的CTL活性(％特异性裂解)一般＜10％。从能表达HLA-A＊0201(AP10)的另一种PBMC供体得到了类似的结果。图14C表明，大量的BFA5肽能触发T细胞介导的BFA5肽-加载的靶细胞的细胞毒性。表XI列出了这些具有免疫原性的肽。发现5种肽(LMDMQTFKA，ILIDSGADI，ILSWAKLL，SQYSGQLKV，和ELCSVRLTL)能在来自2个供体的T细胞中诱导IFN-γ分泌和CTL活性。 

表XI

来自BFA5的免疫反应性肽 

C.免疫试剂 

生产了针对下述系列的BFA5的22-至23-聚物肽的多克隆抗血清： 

加工了来自兔的预取血样品，并保存在-20℃。如下免疫兔：1)将肽作为与弗氏完全佐剂(FCA)的乳状液施用；和2)2周后，用钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联肽，并作为与弗氏不完全佐剂(FIA)的乳状液施用。观察到了下面的结果： 

表XII

预出血样品结果证实，所有样品的IgG滴度都小于100。 

为了评价多克隆抗血清的质量，使用抗BFA5的血清进行了蛋白印迹。针对从BT474，MDMB453，MCF-7，Calu-6，和CosA2细胞得到的细胞提取物，分别筛选了血清。大致预测的BFA5蛋白的分子量是153kDa。在含有CLP2980抗体的BT474提取物中观察到了220kD的带，在MDMB453细胞提取物中没有观察到，但是在MDMB453提取物中存在约130kD带。发现2条带都与在该分析中测试的多克隆抗血清一致。2条带都不存在于负对照中。因而，可以得出结论，多克隆 抗血清是对BFA5特异性的。 

实施例8 

BCZ4肿瘤抗原 

A.BCZ4序列 

作为在乳腺癌样品中超量表达的序列，检测了BCZ4序列。BCZ4的核苷酸序列和推导的氨基酸序列如图15，SEQ ID NO.29(BCZ4cDNA)，和SEQ ID NO.30(BCZ4氨基酸序列)所示。 

B.BCZ4乳腺癌抗原的免疫试剂： 

合成了跨BCZ4基因产物的100种九聚物肽的文库。根据它们潜在的结合HLA-A＊0201的能力，选择了肽。表XIII列出了来自测试的BCZ4蛋白的HLA-A＊0201的100种九聚物肽表位(见下文)： 

表XIII

BCZ4肽组 

C.BCZ4肽的免疫反应性和人效应物T细胞的生成 

用来自BCZ4抗原的不同的9-聚物肽的组刺激的自体树突细胞(见表XIII中的列表)，活化了来自称作AP 10的HLA-A2.1阳性供体的人PBMC。12天后，用相同的各肽组另外刺激8-10天的自体CD40-配体 -活化的B细胞，再次刺激活化的T细胞。再次重复第二次活化，达到共3次刺激。第三次刺激后，分离活化的T细胞，ELISPOT分析针对它们各自的所示BCZ4肽组的人IFN-γ生成(图16A)。在图16A中，蓝条显示了针对BCZ4肽组的反应性，红条是作为负对照的HLA-A2.1-结合HIV肽的。对于CMV，使用了阳性对照HLA-A2.1-结合回忆抗原肽，流感作为实验中的阳性对照。标示了标准差。肽刺激另外一轮后，在活化的T细胞上重复该实验，得到了类似的结果。 

使用IFN-γELISPOT实验，测试了肽组(图16B)。用表XIII所示的不同的BCZ4肽的组，刺激了来自供体AP10的人T细胞。按照以前关于其它抗原所描述的，进行了刺激。刺激了4和5个周期后，收获T细胞，并用每个组中的各单个的肽进行IFN-γ生产的ELISPOT分析。条柱显示了每个特定组的各肽的反应性。表XIII鉴定出了每种反应性肽。另外刺激AP10供体T细胞一轮，重复该实验，得到了类似的结果。 

除了ELISPOT分析外，测试了BCZ4肽活化的人T细胞，以确定它们作为CTL起作用的能力。使用肽-脉冲的树突细胞活化了细胞，然后使用CD40配体-活化的B细胞(刺激5轮)。使用从HLA-A＊0201⁺供体AP31分离的PBMC，进行了所述的实验。使用肽-加载的T2细胞，在⁵¹Cr-释放实验中测试了分离的T细胞。用单个的BCZ4肽脉冲的T2细胞，显示了在细胞/靶比是10∶1时的％特异性裂解。观察到了一些肽的高水平的细胞毒性(图16C)。对照HIV肽诱导的CTL活性(％特异性裂解)一般＜10％。从能表达HLA-A＊0201(AP10)的另一种PBMC供体得到了类似的结果。 

表XIV列出了各肽的反应性： 

表XIV

D.BCZ4表达载体 

使用铂Taq(Invitrogen)，使用称作pSporty/BCZ4的质粒作为模 板，PCR扩增了BCZ4。扩增条件如下：1)94℃2分钟；2)35个循环：94℃30秒，53℃30秒，67℃2.5分钟；和3)67℃7分钟。设计的PCR引物包含EcoRI限制位点，且直接侧翼于ORF(即，没有无关的序列)。引物序列如下：AS032F(正向引物)5′GGAATTCAACATGGACATFGAAGCATATCTTGAAAGAATTG3′AS034R(反向引物)5′GGAATTCCTGGTGAGCTGGATGACAAATAGACAAGATTG 3′。还将Kozak序列包含在正向引物中。用EcoRI切割了pcDNA3.1/Zeo(+)，并用CIP处理，以防止自连接。然后，将BCZ4扩增子连接进EcoRI消化的pcDNA3.1/Zeo(+)。对生成的一个克隆(AS-579-5)进行测序，该克隆与表达的BCZ4序列相匹配。然后，使用标准技术，从该表达载体表达了BCZ4蛋白。 

实施例9 

BFY3肿瘤抗原 

A.BFY3序列 

作为在乳腺癌样品中超量表达的序列，检测了BFY3序列。使用AS007F(正向引物)5′GGAATTCACCATGCTTTGGAAATTGACGGAT 3′和AS010R(反向引物)5′GGAATTCCTCACTTTCTGTGCT TCTCCTCTTTGTCA 3′，RT-PCR扩增了BFY3w/EcoRI末端，其来自HTB131总RNA。用EcoRI切割了PCR产物，并通过连接，克隆进EcoRI消化的和CIP处理的pcDNA3.1/Zeo(+)载体。通过限制性消化，识别出了几个阳性克隆，AS-391-2的序列结果与预期的BFY3序列相匹配。BFY3的核苷酸序列和推导的氨基酸序列如图17，SEQ ID NO.31(BFY3cDNA)，和SEQ ID NO.32(BFY3氨基酸序列)所示。 

B.BFY3乳腺癌抗原的免疫试剂 

合成了跨BFY3基因产物的100种九聚物肽的文库。根据它们潜在的结合HLA-A＊0201的能力，选择了肽。表XV列出了来自测试的BFY3蛋白的HLA-A＊0201的100种九聚物肽表位(见下文)： 

表XV：用于活化人T的BFY3肽组 

用来自BFY3抗原的不同的9-聚物肽的组脉冲的自体树突细胞(见表1中的列表)，活化了来自称作AP 31的HLA-A2.1阳性供体的人PBMC。12天后，用相同的各肽组另外脉冲自体CD40-配体-活化的B细胞8-10天，再次刺激活化的T细胞。重复第二次活化2次，达到共4次刺激。第四次刺激后，分离活化的T细胞，ELISPOT分析针对它们各自的所述BFY3肽组的人IFN-γ生成(图16A)。蓝条显示了针对BFY3肽组的反应性，红条是作为负对照的HLA-A2.1-结合HIV肽的。标示了标准差。肽刺激不同轮后，在活化的T细胞上重复该实验2次，得到了类似的结果(图18A)。 

使用IFN-γELISPOT实验，测试了BFY3肽组。用表XV所示的不同的BFY3肽组，刺激了来自供体AP10的人T细胞。按照以前关于其它抗原所描述的，进行了刺激。刺激了4轮后，从每个培养物收获T细胞，并用每个组中的各单个的肽进行IFN-γ生产的ELISPOT分析。图18B说明了对每个特定组的各肽的反应性。 

除了ELISPOT分析外，测试了BFY3肽活化的人T细胞的反应性。使用10个肽组，每个组10种肽，来生成CTL。使用这10组效应物来杀伤用对应的肽组脉冲的靶。发现能识别出来自组1，3，5，6，和7的肽，表明这些组中的肽能生成CTL(图18C)。从这10组中，通过CTL明显识别出了肽3344，3320，3378，2272，和3387(图18D)。″适度识别出的″肽包括3369，3355，和3362(图18D)。从由组1和3生成的CTL杀伤了用BFY3转染了CosA2细胞，表明从这些组加工和呈递的表位是免疫学上相关的(图18E)。负责该细胞毒性的肽是3320和3344。表XVI总结了BFY3肽的性质。 

表XVI

免疫活性BFY3九聚物肽的总结 

C.BFY3表达载体 

为了构建BFY3表达载体，使用AS007F(正向引物)5′GGAATTCACCATGCTTTGGAAATTGACGGAT 3′和AS010R(反向引物)5′GGAATTCCTCACTTTCTGTGCTTCTCCTCTTTGTCA 3′，RT-PCR扩增了BFY3w/EcoRI末端，它来自HTB131总RNA。使用标准技术，进行了PCR。用EcoRI消化了扩增产物，并使用标准技术，通过连接，将其克隆进CIP处理的pcDNA3.1/Zeo(+)载体。通过限制性消化和测序，识别出了几个阳性克隆。测序表明，克隆AS-391-2的序列与预期的BFY3序列相匹配。然后，使用标准技术，从BFY3表达载体表达了BFY3蛋白。 

实施例10 

编码多种肿瘤抗原的表达载体 

在某些情况下，需要构建编码多个肿瘤抗原的表达载体。已经证 实，当组合在单一表达载体中时，抗原的特定组合会包含许多患者在单一载体中的表达谱。例如，来自不同患者的乳腺癌样品的一项研究表明，BFA4和BFA5的组合覆盖了74％样品的表达谱；BCY1和BFA5的组合覆盖了65％样品；BCZ4和BFA5的组合覆盖了69％样品；BFY3和BFA5的组合覆盖了67％样品；BCY1，BFA4和BFA5的组合覆盖了78％样品；BCZ4，BFA4和BFA5的组合覆盖了81％样品；和BFY3，BFA4，和BFA5的组合覆盖了74％样品。因此，可以构建多抗原表达构建体，从而可以使用单一载体，解决乳腺癌患者中最常见的表达谱。使用标准克隆技术，构建了这样的多抗原表达载体，将编码每种肿瘤抗原序列的核酸放置在启动子或其它转录调节序列附近。可以工程化表达载体，使得编码肿瘤抗原的每种核苷酸序列可操作地连接到特定启动子上，或者将肿瘤抗原可操作地集中连接到单一启动子上，并作为单一表达单位进行表达。当构建单一表达单位时，可以将用于在表达后分隔肿瘤抗原序列的核苷酸序列***肿瘤抗原序列之间。有用的序列包括IRES序列、编码与蛋白酶切割位点相对应的氨基酸序列的核苷酸序列，等。合适的用于构建这样的多抗原表达载体的载体包括，例如，痘病毒例如牛痘，鸟痘，ALVAC和NYVAC。 

尽管已经参考优选的实施方案描述了本发明，应当明白，本领域的普通技术人员能进行变动和修改。因此，所附的权利要求书意在包括属于要求保护的发明范围内的所有这样的等同变动。 

Claims (2)

1.分离的肽，其如氨基酸序列MLWKLTDNI所示。

2.权利要求1的肽在制备用于免疫宿主的药物中的用途。