DE60312039T2

DE60312039T2 - Mittel und methoden zur produktion eines proteins durch chromatin-öffner, die chromatin zugänglicher für transkriptionsfaktoren machen können

Info

Publication number: DE60312039T2
Application number: DE60312039T
Authority: DE
Inventors: Arie Pieter Otte; Theodorus Hendrikus KWAKS; Richard George SEWALT
Original assignee: Chromagenics BV
Current assignee: Chromagenics BV
Priority date: 2002-12-20
Filing date: 2003-12-19
Publication date: 2007-11-08
Anticipated expiration: 2023-12-20
Also published as: US20060003416A1; EP1572994B1; EP1572994A2; WO2004056986A2; DE60312039D1; ATE354645T1; WO2004056986A3; US8263393B2; AU2003290453A1; AU2003290453A8; DK1572994T3

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Gebiete Biochemie, Molekularbiologie und Pharmakologie. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Produktion von Proteinen in einer Wirtszelle. In einer Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf Verfahren zur Verbesserung der Vorhersagbarkeit, Ausbeute und/oder Stabilität der Produktion von Proteinen in einer (Wirts)Zelle. Die Verfahren sind hier für die Produktion von einem oder mehreren Proteinen geeignet.
Proteine werden in Systemen für einen weiten Bereich von Anwendungen in der Biologie und Biotechnologie produziert. Dazu gehören die Erforschung der zellulären und molekularen Funktion, die Produktion von Proteinen als Biopharmaka oder diagnostische Reagentien und die Modifikation der Eigenschaften oder Phänotypen von Nutztieren und Kulturpflanzen. Biopharmaka sind gewöhnlich Proteine, die eine extrazelluläre Funktion haben, wie Antikörper für die Immuntherapie oder Hormone oder Cytokine zum Hervorrufen einer zellulären Antwort. Proteine mit extrazellulären Funktionen verlassen die Zelle über einen Sekretionsweg und erfahren während der Sekretion posttranslationale Modifikationen (Chevet et al., 2001). Die Modifikationen (primär Glycosylierung und Bildung von Disulfidbindungen) kommen natürlicherweise in Bakterien nicht vor. Außerdem sind die spezifischen Oligosaccharide, die durch glycosylierende Enzyme an Proteine gebunden werden, typischerweise spezies- und zelltypspezifisch. Diese Betrachtungen beschränken die Wahl von Wirtszellen für die heterologe Proteinproduktion häufig auf eukaryontische Zellen (Kaufman, 2000). Für die Expression von humanen therapeutischen Proteinen können Wirtszellen wie Bakterien, Hefe oder Pflanzen ungeeignet sein. Selbst die subtilen Unterschiede in der Proteinglycosylierung zwischen Nagern und dem Menschen können zum Beispiel ausreichend dafür sein, dass in Nagerzellen produzierte Proteine für die thera peutische Verwendung unannehmbar sind (Sheeley et al., 1997). Zu den Folgen einer falschen (d.h. nichthumanen) Glycosylierung gehören Immunogenität, reduzierte funktionelle Halbwertszeit und Aktivitätsverlust. Für Proteine, bei denen dies ein Problem ist, ist die Auswahl von Wirtszellen weiter auf menschliche Zelllinien oder auf Zelllinien wie CHO-Zellen (Eierstockzellen des Chinesischen Streifenhamsters), die Glycoproteine mit humanartigen Kohlehydratstrukturen produzieren können (Liu, 1992), eingeschränkt.
Einige Proteine von biotechnologischem Interesse sind als Multimere funktionell, d.h. sie bestehen in ihrer biologisch und/oder biotechnologisch aktiven Form aus zwei oder mehr, möglicherweise verschiedenen, Polypeptidketten. Beispiele dafür sind Antikörper (Wright und Morrison, 1997), knochenmorphogenetische Proteine (Groeneveld und Burger, 2000), Zellkern-Hormonrezeptoren (Aranda und Pascual, 2001), heterodimere Zelloberflächenrezeptoren (z.B. T-Zell-Rezeptoren (Chan und Mak, 1989)), Integrine (Hynes, 1999) und die Glycoprotein-Hormonfamilie (Chorion-Gonadotropin, luteinisierendes Hormon der Hypophyse, follikelstimulierendes Hormon und Thyreotropin (Thotakura und Blithe, 1995)). Die Produktion solcher multimerer Proteine in heterologen Systemen ist aufgrund von mehreren Beschränkungen derzeitiger Expressionssysteme technisch schwierig. Zu diesen Beschränkungen gehören (1) Schwierigkeiten bei der Isolierung von rekombinanten Zellen/Zelllinien, die die monomeren Polypeptide auf hohem Niveau (Vorhersagbarkeit und Ausbeute) produzieren und (2) Senkungen der Expressionsniveaus während des industriellen Produktionszyklus der Proteine (Stabilität). Diese Probleme sind im Folgenden ausführlicher beschrieben.

(1) Rekombinante Proteine, wie Antikörper, die als therapeutische Verbindungen verwendet werden, müssen in großen Mengen produziert werden. Die für die Produktion rekombinanter Proteine verwendeten Wirtszellen müssen mit dem Maßstab der eingesetzten industriellen Verfahren verträglich sein. Insbesondere muss das Expressionssystem für das Transgen (oder das Gen, das ein interessierendes Protein codiert, wobei die beiden Ausdrücke hier mit gleicher Bedeutung verwendet werden), das für das heterologe Protein verwendet wird, von den Wirtszellen während der Wachstumsphasen der Hochskalierung und Produktion in einer stabilen und aktiven Form beibehalten werden. Dies wird durch Integration des Transgens in das Genom der Wirtszelle erreicht. Die Schaffung von rekombinanten Zelllinien mit herkömmlichen Mitteln ist jedoch aufgrund der Unvorhersagbarkeit der Transgen-Expression unter den rekombinanten Wirtszellen ein kostspieliger und ineffizienter Vorgang. Die Unvorhersagbarkeit kommt von der hohen Wahrscheinlichkeit, dass das Transgen aufgrund von Gen-Stummschaltung (Silencing) inaktiv wird (McBurney et al., 2002). Bei Verwendung herkömmlicher Technologien liegt der Anteil von rekombinanten Wirtszellen, die ein einziges Polypeptid auf hohem Niveau produzieren, im Bereich von 1-2%. Um eine Zelllinie zu konstruieren, die zwei Polypeptide auf hohem Niveau produziert, werden die beiden Transgene im Allgemeinen unabhängig voneinander integriert. Wenn die beiden Transgene gleichzeitig auf zwei getrennten Plasmiden für die Transfektion verwendet werden, ist der Anteil von Zellen, die beide Polypeptide auf hohem Niveau produzieren, das arithmetische Produkt der Anteile der einzelnen Transgene. Daher liegt der Anteil solcher rekombinanter Zelllinien im Bereich von einer auf 2500 bis eine auf 10 000. Für multimere Proteine mit drei oder mehr Untereinheiten nehmen die Anteile weiter ab. Diese hochproduktiven Zelllinien müssen anschließend identifiziert und aus dem Rest der Population isoliert werden. Die zum Suchen nach diesen seltenen hochexprimierenden Zelllinien erforderlichen Verfahren sind zeitraubend und teuer.
Eine Alternative zur gleichzeitigen Transfektion mit zwei transgentragenden Plasmiden ist die sequentielle Transfektion. In diesem Fall ist der Anteil der Klone, die eine hohe Ausbeute liefern, die Summe der Anteile der einzelnen Transgene, d.h. 2-4%. Die sequentielle Transfektion hat jedoch (größere) Nachteile; dazu gehören hohe Kosten und geringe Stabilität. Die hohen Kosten resultieren aus verschiedenen Faktoren: Insbesondere werden die Zeit und die Ressourcen, die für die Suche nach hochexprimierenden Zelllinien erforderlich sind, verdoppelt, da nach der hohen Expression für jede Untereinheit getrennt gesucht werden muss. Die geringe Gesamtstabilität von Wirtszellen, die zwei Polypeptide exprimieren, ist eine Folge der inhärenten Instabilität von jedem der zwei Transgene.
(2) Die Stummschaltung der Transgen-Expression während einer längeren Wirtszell-Kultivierung ist ein häufig beobachtetes Phänomen. In Vertebratenzellen kann es durch die Bildung von Heterochromatin am Transgen-Locus, das die Transcription des Transgens verhindert, verursacht sein. Die Transgen-Stummschaltung ist stochastisch; sie kann kurz nach der Integration des Transgens in das Genom oder erst nach mehreren Zellteilungen erfolgen. Dies führt nach längerer Kultivierung zu heterogenen Zellpopulationen, wobei einige Zellen das rekombinante Protein weiterhin auf hohem Niveau exprimieren, während andere das Protein auf niedrigem oder nicht nachweisbarem Niveau exprimieren (Martin und Whitelaw, 1996; McBurney et al., 2002). Eine Zelllinie, die für die heterologe Proteinproduktion verwendet wird, ist von einer einzigen Zelle abgeleitet und wird dennoch häufig bis auf Zelldichten von über zehn Millionen Zellen pro Milliliter in Kultivatoren von 1000 Litern oder mehr hochskaliert und lange Zeit in solchen Zelldichten aufrechterhalten. Diese großen Zellpopulationen (10¹⁴ bis 10¹⁶ Zellen) sind anfällig für schwerwiegende Abnahmen der Produktivität aufgrund von Transgen-Stummschaltung (Migliaccio et al., 2000; Strutzenberger et al., 1999).

Die Instabilität der Expression von rekombinanten Wirtszellen ist besonders schwerwiegend, wenn in einem Versuch, die Ausbeuten zu erhöhen, die Kopienzahlen des Transgens amplifiziert werden. Eine Transgen-Amplifikation wird erreicht, indem man ein Selektionsmarker-Gen, wie Dihydrofolat-Reductase (DHFR), während der Integration zusammen mit dem Transgen einführt (Kaufman, 2000). Erhöhte Konzentrationen des Selektionsmittels (im Falle von DHFR des Wirkstoffs Methotrexat) selektieren in Bezug auf Zellen, die die Zahl der DHFR-Gene im Chromosom amplifiziert haben (Kaufman und Sharp, 1982). Da das Transgen und DHFR im Chromosom colokalisiert sind, nimmt die Kopienzahl des Transgens ebenfalls zu. Dies ist mit einer Erhöhung der Ausbeute des heterologen Proteins korreliert (Kaufman, 1990). Die Tandem-Repeats von Transgenen, die aus der Amplifikation resultieren, sind jedoch in hohem Maße anfällig für Stummschaltung (Garrick et al., 1998; Kaufman, 1990; McBurney et al., 2002).
Die oben genannten Probleme, die mit herkömmlichen Transgen-Expressionstechnologien für die Proteinproduktion verbunden sind, zeigen eindeutig, dass es in der Technik ein Bedürfnis nach Systemen gibt, die diese Probleme überwinden. Insbesondere gibt es ein Bedürfnis nach Expressionssystemen, die i) für eine hohe Vorhersagbarkeit der Expression sorgen und eine ausgewogene Expression von mehreren Ketten erlauben, ii) für hohe Ausbeuten sorgen und iii) für Stabilität während einer längeren Zeit sorgen, in der das Protein in großen Mengen produziert werden muss, iv) zu einer erhöhten Zahl von Klonen mit geeigneten Expressionsniveaus führen.
Die vorliegende Erfindung gibt Mittel und Verfahren an, um die Merkmale der Proteinproduktion in einer Zelle zu verbessern. Es hat sich unter anderem gezeigt, dass Chromatin-Modifikationssysteme, um Chromatin für die Transcription zugänglicher zu machen, eine ausgeprägte Wirkung auf die Expressionsmerkmale der Proteinexpression haben, wenn man sie darauf einwirken lässt. In einer Ausführungsform gibt die Erfindung daher ein Verfahren an, um eine Zelle mit einer Protein-Expressionseinheit zu versehen, das das Versehen einer Nucleinsäure, die diese Einheit umfasst, mit einer Nucleinsäure, die eine Bindungsstelle für einen Vertreter eines Chromatin-Modifikationssystems codiert, um Chromatin für die Transcription zugänglicher zu machen (Öffner), umfasst, wobei der Öffner in der Zelle vorhanden ist, wobei das Verfahren weiterhin das Einführen der Expressionseinheit in die Zelle und das Kultivieren der Zelle in einer Weise, die die Expression der Protein-Expressionseinheit ermöglicht, umfasst.
Es hat sich gezeigt, dass Histon-Modifikationssysteme Proteine umfassen, die Chromatin für die Transcription zugänglicher machen können. Ein Öffner der Erfindung ist daher vorzugsweise ein histonmodifizierendes Enzym, das vorzugsweise einen N-terminalen Histonschwanz modifizieren kann. Die Histon-Modifikation spielt sowohl bei der chromatinassoziierten Repression als auch bei der chromatinassoziierten Aktivierung der Genexpression eine wichtige Rolle. Zum Beispiel ist die Acetylierung von spezifischen Lysinresten im Histon-H3- und -H4-Schwanz ein wichtiger Parameter. Normalerweise sind Histone sehr basische Proteine, die fest an die sauren DNA-Stränge binden. Durch Addition einer Acetylgruppe an die Histonschwänze werden die basischen Histone in neutraler geladene Proteine umgewandelt. Dies führt zu einer weniger festen Wechselwirkung zwischen den basischen Histonen und den sauren DNA-Strängen. Daher ist die Acetylierung damit verbunden, das Chromatin offener oder für Transcriptionsfaktoren zugänglicher zu machen. Histon-Acetyltransferasen (HATs), die Acetylgruppen an die Histonschwänze addieren, sind daher bevorzugte Öffner der vorliegenden Erfindung. Bevorzugte Ausführungsformen von HAT-Öffnern sind p300/CBP, P/CAF (Yang et al., 1996) und/oder CBP (Bannister und Kouzarides, 1996) oder ein funktionelles Teil, Derivat und/oder Analogon davon. Jedoch werden auch heute noch weitere HAT-Proteine identifiziert, die eine ähnliche Funktion umfassen. Solche HAT-Proteine sind selbstverständlich ebenfalls Bestandteil der Erfindung. HAT-Proteine wirken wahrscheinlich wenigstens zum Teil im Kontext eines Multiprotein-Komplexes, um eine Spezifität der Wirkung auf bestimmte Bereiche des Chromatins zu ermöglichen. Das Protein Trithorax (trx) aus der Trithorax-Gruppe (TrxG) ist Teil eines Komplexes, der daran beteiligt ist, Gene im aktivierten Zustand zu halten. Es ist daher nicht überraschend, dass der Multiproteinkomplex, von dem das trx-Protein ein Teil ist, auch ein HAT-Protein enthält (Petruk et al., 2001).
Ein funktionelles Teil, Derivat und/oder Analogon eines Öffners der Erfindung umfasst dieselbe Art, wenn auch nicht notwendigerweise dieselbe Menge, an Aktivität wie ein erwähnter Öffner. Diese Aktivität ist eine sequenzspezifische nucleinsäurebindende Aktivität, die für die Bindungsstelle spezifisch ist, und eine chromatinmodifizierende Aktivität, die Chromatin für die Transcription zugänglicher macht. Diese chromatinmodifizierende Aktivität kann dem Öffner immanent sein, oder sie kann dadurch vorhanden sein, dass man ein weiteres Protein auf das Chromatin einwirken lässt. Geeignete Teile können durch Mutation, Deletion und/oder Insertionen bei dem Öffner erzeugt werden. Diese können in einem Verfahren der Erfindung auf Funktionalität als Öffner getestet werden. Häufig können Teile eines Proteins identifiziert werden, die wenigstens bis zu einem gewissen Grad manipuliert werden können, ohne die Funktionsweise des Proteins zu beeinflussen. Solche Öffner, die solche Modifikationen umfassen, fallen selbstverständlich unter die vorliegende Erfindung. Derivate können zum Beispiel durch konservative Aminosäuresubstitutionen erzeugt werden. Bei diesen bleibt dieselbe Art der Funktion typischerweise erhalten. Analoga von Öffnern der vorliegenden Erfindung sind typischerweise Proteine, die dieselbe oder eine ähnliche Art, wenn auch nicht notwendigerweise dieselbe Menge, an chromatinmodifizierender Aktivität aufweisen. Geeignete Analoga können auch in anderen als den genannten Spezies zu finden sein. Solche Analoga können zum Beispiel durch Aminosäure- und/oder Nucleinsäurehomologie ausgewählt werden. Solche Homologen sind selbstverständlich ebenfalls Bestandteile der Erfindung.
Viele verschiedene Proteine können in der vorliegenden Erfindung als Öffner wirken. Der Öffner kann direkt auf die Zugänglichkeit des Chromatins oder indirekt über die Assoziation mit einem in der Zelle vorhandenen Komplex wirken, wobei der Komplex der Zugänglichkeit des Chromatins dienlich ist. Eine wesentliche Komponente des Öffners der vorliegenden Erfindung ist seine sequenzspezifische Assoziation mit der Bindungsstelle an der Nucleinsäure, die die Protein-Expressionseinheit umfasst. Die Bindungsstelle kann eine normale Bindungsstelle für einen Öffner sein. Alternativ dazu wird ein ansonsten funktionsfähiger Öffner mit einer Bindungsspezifität für die Bindungsstelle versehen. In noch einer anderen Ausführungsform wird ein Protein mit einer sequenzspezifischen Nucleinsäurebindungsspezifität für die Bindungsstelle versehen, was zu einem Öffner der vorliegenden Erfindung führt. Es ist möglich, dass Proteine, wenn sie mit einer Bindungsspezifität für die Bindungsstelle versehen werden, für sich allein (d.h. bevor sie mit eine solchen Spezifität versehen wurden) keine sequenzspezifischen Bindungsspezifität aufweisen. Solche Proteine (die weiter "Voröffner" genannt werden) können der Zelle zur Verfügung gestellt werden, um eine allgemeine Wirkung auf die Chromatin-Remodellierung zu erreichen. Dies ist ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung. Die Erfindung stellt also eine Zelle bereit, die eine Protein-Expressionseinheit umfasst, wobei die Zelle mit einem Voröffner der vorliegenden Erfindung versehen ist. Solche Zellen können durch die allgemeine Wirkung auf die Chromatin-Remodellierung günstige Expressionsmerkmale aufweisen. Dies kann zum Beispiel auf eine Verschiebung im Gleichgewicht zwischen aktivierenden und reprimierenden Komplexen zurückzuführen sein.
Ein Öffner kann von der Zelle exprimiert werden, bevor die Zelle mit dem Protein-Expressionskonstrukt versehen wird, zum Beispiel wenn die Zelle den Öffner natürlicherweise exprimiert. Alternativ dazu kann der Öffner der Zelle zur Verfügung gestellt werden, zum Beispiel als Nucleinsäure, die den Öffner codiert. Wenn Öffner verwendet werden, die mit einer spezifischen Nucleinsäurebindungsspezifität für die Bindungsstelle versehen wurden, ist es häufig zweckmäßig, die Zelle mit dem Öffner zu versehen. Es können jedoch auch Zelllinien geschaffen werden, die einen solchen Öffner bereits exprimieren. Solche Zelllinien können dann anschließend verwendet werden, um nach Belieben eine Protein-Expressionseinheit der Erfindung einzuführen. Daher sind Zelllinien, die mit einer Nucleinsäure versehen sind, die einen Öffner umfasst, der mit einer neuen sequenzspezifischen Bindungsaktivität versehen ist, ebenfalls Bestandteil der Erfindung. Solche Zelllinien müssen die Nucleinsäure selbstverständlich in stabiler Form, also vorzugsweise in das Genom der Zelle integriert, tragen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden solche Zelllinien für die Sammlung von Proteinen verwendet, die durch ein Mittel oder ein Verfahren der Erfindung produziert werden. Bevorzugte Öffner für solche Zelllinien umfassen HAT-Proteine, die mit einer neuen sequenzspezifischen Bindungsaktivität versehen sind. Vorzugsweise umfassen die HAT-Proteine ein p300/CBP-Protein, ein P/CAF-Protein und/oder ein CBP-Protein oder ein funktionelles Teil, Derivat und/oder Analogon davon. Die neue sequenzspezifische Bindungsaktivität umfasst vorzugsweise eine nucleinsäurebindende Domäne eines sequenzspezifischen DNA-bindenden Proteins. Nichteinschränkende Beispiele dafür sind die GAL4- oder die LexA-DNA-Bindungsdomäne. Es können jedoch auch viele andere sequenzspezifische Bindungsproteine verwendet werden. Ein Fachmann kann DNA-bindende Domänen einer großen Zahl von verschiedenen Proteinen verwenden und einen Öffner der Erfindung erzeugen. Die erwähnte Person kann die vielen Beispiele für Fusionen von DNA-bindenden Domänen mit anderen funktionellen Proteinen als Richtlinie verwenden. Es ist zum Beispiel ohne Weiteres möglich, zwei Hybridsysteme so zu modifizieren, dass nach der Assoziation der beiden Teile des Hybridsystems ein Öffner der vorliegenden Erfindung entsteht. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Öffner ein Fusionsprotein, das wenigstens ein funktionelles Teil eines erwähnten Öffners und eine sequenzspezifische nucleinsäure bindende Domäne umfasst. Vorzugsweise umfasst der Öffner wenigstens ein funktionelles Teil einer Histon-Acetyltransferase. Vorzugsweise umfasst die Histon-Acetyltransferase ein p300/CBP-Protein, ein P/CAF-Protein oder ein CBP-Protein oder ein funktionelles Teil, Derivat und/oder Analogon davon. Die erwähnten Öffner können mit der DNA-spezifischen Bindungsdomäne eines Zinkfingerproteins, eines bakteriellen DNA-bindenden Proteins, eines Hefe- oder Pilz-DNA-bindenden Proteins fusioniert werden. Vorzugsweise ist das DNA-bindende Protein LexA oder Gal4 oder ein funktionelles Teil, Derivat und/oder Analogon davon. Da Öffner oder Voröffner eine wichtige Aktivität in einer Zelle haben, ist es wichtig, nicht zu viel dieser Proteine in den erwähnten Zelllinien zu exprimieren, da dies toxische Wirkungen haben kann. Diese toxische Wirkung ist erheblich geringer in Fällen, in denen ein Voröffner in einen Öffner umgewandelt wurde, indem man ihn mit einer sequenzspezifischen Bindungsaktivität versah. Dadurch werden die Wirkungen bis zu einem gewissen Grad lokalisiert, obwohl in dieser Situation auch noch Titrationseffekte auftreten können. Eine dosierte Expression ist daher auch von Bedeutung für Zelllinien, die mit einer Expressionseinheit für einen mit einer sequenzspezifischen Bindungsaktivität versehenen (Vor)Öffner versehen sind. Die DNA-bindende Domäne wird typischerweise an das N-terminate oder C-terminate Ende eines Proteins der Erfindung addiert. Gelegentlich kann es auch sein, dass eine dieser Fusionen nicht funktionell ist, doch typischerweise behält wenigstens eine solche Chimäre beide Eigenschaften der Fusionspartner (Domänen) bei.
Protein-Expressionseinheiten können mit wünschenswerten Merkmalen versehen sein, um eine bestimmte gewünschte Funktionalität auszuführen. Zum Beispiel können Enhancer, Introns, geeignete untranslatierte Bereiche usw. verwendet werden. Es können induzierbare Promotoren oder konstitutive Promotoren verwendet werden. Die vorliegende Erfindung gibt also weiterhin ein Verfahren an, bei dem die Expressionseinheit für das interessierende Protein und/oder eine Expressionseinheit, die einen Öffner der Erfindung exprimiert, mit einer zusätzlichen transcriptions/translations-regulierenden und/oder -stimulierenden Sequenz versehen wird. Ein Verfahren der Erfindung sorgt für eine hochgradig vorhersagbare Expression. Es sorgt auch für ein hohes Expressionsniveau.
Außerdem sorgt es auch für stabile Expressionsniveaus. Bei Transfektionen von Protein-Expressionseinheiten sorgt es weiterhin für mehr verschiedene Integrationsereignisse, die (i) das interessierende Protein auf einem hohen Niveau exprimieren, und führt zu (ii) einer höheren Zahl von Kolonien, die eine Expression des interessierenden Proteins aufweisen, und (iii) mehr Kolonien, die ein geeignetes Expressionsniveau für die Proteinproduktion aufweisen. Beide Eigenschaften werden selbstverständlich mit der Transfektion mit derselben Expressionseinheit in Abwesenheit der Bindungsstelle für einen Vertreter eines chromatinmodifizierenden Systems der Erfindung verglichen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird eine Protein-Expressionseinheit mit einem Locus-Kontrollbereich oder einem Teil davon versehen. Beispiele für solche Sequenzen sind in Sequenzen aus dem α- oder β-Globin-Locus, wie sie in US 5,610,053 und WO 96/04390 beschrieben sind, oder dem Igf2-Locus zu finden. Selbstverständlich können auch sogenannte UCOE-Sequenzen, wie sie in WO 00/05393 und WO 02/24930 beschrieben sind, verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst eine Nucleinsäure der Erfindung weiterhin eine sogenannte stabilisierende Anti-Repressor-Sequenz, die auch STAR-Sequenz genannt wird. Beispiele für geeignete STAR-Sequenzen sind in Tabelle 1 angegeben. Weitere STAR-Sequenzen können aus PCT/NL02/00390 erhalten werden, das im Namen der Chromagenics B.V. eingereicht wurde und auf das hier ausdrücklich Bezug genommen wird. Diese Anmeldung enthält auch Verfahren, um andere STAR-Sequenzen zu finden. Solche anderen STAR-Sequenzen können selbstverständlich ebenfalls in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. STAR-Sequenzen können einer damit verknüpften Expressionscassette verbesserte Transcriptionsfähigkeiten verleihen, einschließlich unter anderem eines wenigstens partiellen Schutzes vor repressionsstimulierenden Einflüssen von DNA, die integrierter Fremdnucleinsäure benachbart ist. Die Platzierung der Signalsequenzen und -elemente auf der Nucleinsäure, mit der transfiziert werden soll, hängt von dem besonderen Signal oder Element ab. Eine STAR-Sequenz wird vorzugsweise außerhalb einer Expressionscassette platziert. Vorzugsweise ist eine Expressionscassette von wenigstens zwei STAR-Sequenzen flankiert. Eine STAR-Sequenz verbessert wenigstens zum Teil die Vorhersagbarkeit der Expression einer transfizierten Nucleinsäure, die zu einem größeren Anteil von Zellen mit einem geeigneten Expressionsmuster führt. Dies gilt insbesondere für Ausführungsformen, bei denen zwei oder mehr Expressionscassetten, deren Expression gewünscht wird, übertragen werden. Die Anwesenheit einer STAR-Sequenz, vorzugsweise auf jeder der so transfizierten Cassetten, verbessert die Zahl der Zellen, die mit einem Verfahren der Erfindung selektiert werden. Wie oben erwähnt, ist eine Zunahme der Zahl der Zellen mit geeigneten Expressionsmustern bei der Selektion von Produktionszellen für Polypeptide mit klinischer Qualität sehr wichtig. In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Protein-Expressionseinheit, die die Nucleinsäurebindungsstelle für den Öffner umfasst, also auf einer oder beiden Seiten von einer Nucleinsäure flankiert, die eine stabilisierende Anti-Repressor(STAR)-Sequenz umfasst. Die Bindungsstelle für den Öffner wird selbstverständlich vorzugsweise zusammen mit der Transcriptionseinheit auf der Seite der STAR-Sequenz platziert. Ein STAR-Element verbessert weiterhin die Stabilität, das Niveau und die Vorhersagbarkeit der Expression der Protein-Expressionseinheit. Es erhöht weiterhin signifikant die Zahl der Klone, die eine große Proteinmenge exprimieren. Ohne uns auf eine bestimmte Theorie festlegen zu wollen, glauben wir, dass STAR-Elemente sogenannte Nucleinsäuredomänen mit gemeinsamer Regulation schaffen, wenn auch nur um zu verhindern, dass die Wirkung von Transcriptionsrepressoren, die sich außerhalb der Domäne befinden, die Domäne beeinflusst. Indem man eine Bindungsstelle für einen in der Zelle vorhandenen Öffner in der Domäne platziert, wird diese Domäne bevorzugt geöffnet und aktiv in einem geöffneten Zustand gehalten. Optimale Ergebnisse werden erhalten, wenn die Bindungsstelle funktionell mit einem Promotor verknüpft ist, der sich in der Expressionseinheit befindet. Mit "funktioneller Verknüpfung" ist gemeint, dass ein gebundener Öffner die Zugänglichkeit des Chromatins, das den Promotor umfasst, beeinflussen kann. Vorzugsweise wird die Expressionseinheit stromaufwärts eines darin enthaltenen Promotors mit der Bindungsstelle versehen. Typischerweise, wenn auch nicht notwendigerweise, werden gute Ergebnisse erhalten, wenn sich die Bindungsstelle innerhalb von 10 Basen von dem Promotor entfernt befindet, zusammen mit Bindungsstellen für promotorassoziierten Faktor, vorzugsweise stromaufwärts des Promotors. (Es ist selbstverständlich möglich, in die Protein-Expressionseinheit oder in deren Nähe weitere Bindungsstellen für Öffner einzuführen. Solche zusätzlichen Bindungsstellen können die Expressionsmerkmale weiter verbessern. Alle genannten Vorteile der Erfindung werden selbstverständlich mit derselben Protein-Expressionseinheit verglichen, der aber entweder die Bindungsstelle und/oder das zusätzliche Element, wie die STAR-Sequenz, fehlt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Kombination eines Öffners im Zusammenhang der Erfindung mit einer Transcriptionspausen(TRAP)-Sequenz in der Protein-Expressionseinheit. Diese Kombination verbessert die Vorhersagbarkeit der Expression des interessierenden Proteins weiter. In der Erfindung wird die genannte Kombination verwendet, um ein Proteinexpressionsmerkmal einer Protein-Expressionseinheit zu verstärken. Vermutlich verhindert ein TRAP wenigstens teilweise die Bildung von Antisense-RNA oder verhindert wenigstens teilweise, dass die Transcription in die Protein-Expressionseinheit eintritt. TRAP-Sequenzen sind in PCT/NL03/00850 beschrieben, das im Namen der Chromagenics B.V. eingereicht wurde, und auf diese Literaturstelle wird hier daher ausdrücklich Bezug genommen wegen der Definition von TRAP-Sequenzen und wegen Verfahren, um Protein-Expressionseinheiten mit TRAP-Sequenzen zu versehen. Gewöhnlich werden DNA-Sequenzen wie das SV40-Polyadenylierungssignal verwendet, um die Transcription zu beenden, indem man das SV40-Polyadenylierungssignal unmittelbar stromabwärts eines exprimierten Gens platziert. Mit anderen Worten, es sollte verhindert werden, dass die Transcription stromabwärts des Gens fortgesetzt wird. In der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise Transcriptionsblocker (TRAP) in einer solchen Weise sowohl stromaufwärts als auch stromabwärts der Expressionseinheit platziert, dass sie verhindern, dass die Transcription in ein offenes Leseraster eintritt (wenn sich der TRAP stromabwärts davon befindet) oder dass sie in die Kombination aus dem Promotor und einem davon gesteuerten offenen Leseraster eintritt (wenn er sich stromaufwärts des offenen Leserasters befindet). Die Orientierung eines TRAP, wenn er sich stromabwärts befindet, ist der gewöhnlichen Orientierung der SV40-Polyadenylierungssignale, die stromabwärts von Genen platziert werden, entgegengesetzt. Die Orientierung eines stromaufwärts befindlichen TRAP ist dieselbe Orientierung wie bei den SV40-Polyadenylierungssignalen, die stromabwärts der Gene platziert werden.
In einer Ausführungsform umfasst ein Verfahren der Erfindung weiterhin das Versehen der Zelle mit wenigstens einer Protein-Expressionseinheit, wobei die Einheit einen Promotor umfasst, der funktionell mit einem offenen Leseraster verknüpft ist, das das wenigstens eine interessierende Protein codiert, dadurch gekennzeichnet, dass die Protein-Expressionseinheit weiterhin wenigstens eine Transcriptionspausen(TRAP)-Sequenz umfasst, und wobei sich die TRAP-Sequenz funktionell stromabwärts des offenen Leserasters befindet und wenigstens teilweise die Bildung von Antisense-RNA verhindert. Vorzugsweise befindet sich die wenigstens eine TRAP-Sequenz in einer 3'-5'-Orientierung (in Bezug auf den codierenden Bereich).
Vorzugsweise reduziert die TRAP-Sequenz die Bildung von Antisense-RNA auf ein nicht nachweisbares Niveau. Aufgrund der Anwesenheit des TRAP wird die Bildung von Antisense-RNA wenigstens teilweise verhindert, und daher nimmt die Menge an dsRNA ab. Infolgedessen nimmt das Niveau von kleinen dsRNAs mit 21 bis 23 Basenpaaren (RNAi) ebenfalls ab, und die entsprechende RNA (der vollen Länge), die ein interessierendes Protein codiert, wird nicht abgebaut. Somit führt die Translation der entsprechenden RNA zu einer (erhöhten) Expression eines interessierenden Proteins.
Wie hier im experimentellen Teil offenbart ist, verbessert die Verwendung von TRAP-Sequenzen überraschenderweise die Stabilität der Expression des interessierenden Proteins in der Protein-Expressionseinheit weiter.
In der oben skizzierten Ausführungsform kann die TRAP-Sequenz zum Beispiel eine Terminator- und/oder eine Polyadenylierungssignalsequenz sein, aber in einer Orientierung, die sich von der einer möglicherweise verwendeten Terminatorsequenz hinter einem offenen Leseraster in der Protein-Expressionseinheit unterscheidet. Es ist jedoch ohne Weiteres möglich, dass es TRAP-Sequenzen gibt, die bidirektional sind. Diese können auch in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um wenigstens zum Teil zu verhindern, dass die Transcription in eine Transcriptionseinheit eintritt.
Weiterhin bereitgestellt wird die Verwendung eines TRAP, um die "Inertheit" der Transcriptionseinheiten zu stärken, zum Beispiel wenn auch verhindert wird, dass die CMV-gesteuerte Transcription in den Einheiten von 1A die Transcriptionseinheit verlässt. Normalerweise wird der SV40-Transcriptionsterminator für diesen Zweck verwendet. Dieser Terminator stoppt die Transcription jedoch nicht vollständig. Somit wird eine weitere TRAP-Sequenz stromaufwärts des 3'-STAR-Elements in die Expressionscassette eingebaut (2C). Diese TRAP-Sequenz wird in einer 5'-3'-Orientierung platziert, um die Transcription zu stoppen, die an dem SV40-Transcriptionsterminator vorbeischlüpfen könnte. In dieser Konfiguration ist die gesamte Expressionscassette im Wesentlichen inert gegenüber eindringender sowie entweichender Transcription geworden. In einer weiteren Ausführungsform gibt die Erfindung also die Verwendung einer TRAP-Sequenz an, um ein genetisches Element wenigstens teilweise gegenüber dem Fortschreiten einer Transcription in das Element zu isolieren. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das genetische Element ein STAR-Element. Die Erfindung stellt also weiterhin ein STAR-Element zusammen mit einer TRAP-Sequenz der Erfindung bereit. Vorzugsweise ist das STAR-Element beidseitig von wenigstens zwei STAR-Elementen flankiert. Die Orientierung des TRAP-Elements in diesen Ausführungsformen ist so geartet, dass eine Transcription, die von außerhalb des STAR-Elements in das STAR-Element fortschreitet, wenigstens zum Teil verhindert wird. Diese Ausführungsform ist insbesondere dann relevant, wenn in dem STAR-Element Inverted Repeats vorhanden sein sollten. Diese Inverted Repeats können die Bildung von dsRNA einleiten. Dies würde wiederum zur Stummschaltung benachbarter Gene führen. Diese spezifische Konfiguration von TRAP-STAR-TRAP-Elementen kann also nicht nur die Bildung von dsRNA in dem genetischen Element, d.h. dem STAR-Element, verhindern, sondern sie sorgt auch für einen weiteren Schutz der gesamten Expressionseinheit.
In einer weiteren Ausführungsform gibt die Erfindung ein Verfahren für die Expression (oder Produktion) wenigstens eines interessierenden Proteins in einer Zelle an, das das Versehen der Zelle mit wenigstens einer Protein-Expressionseinheit umfasst, wobei die Einheit einen Promotor umfasst, der funktionell mit einem offenen Leseraster verknüpft ist, das das wenigstens eine interessierende Protein codiert, dadurch gekennzeichnet, dass die Protein-Expressionseinheit weiterhin wenigstens eine TRAP-Sequenz umfasst, und wobei sich die TRAP-Sequenz stromaufwärts des Promotors befindet und wenigstens teilweise verhindert, dass die Transcription in die Protein-Expressionseinheit eintritt. Vorzugsweise befindet sich die wenigstens eine TRAP-Sequenz in einer 5'-3'-Orientierung (in Bezug auf den codierenden Bereich).
Wiederum kann die in der letzteren Ausführungsform verwendete TRAP-Sequenz eine Terminator- und/oder eine Polyadenylierungssignalsequenz sein, aber diesmal befindet sich die TRAP-Sequenz in einer ungewöhnlichen Position in Bezug auf den offenen Leseraster, da sich das TRAP stromaufwärts des Promotors befindet, der die Expression des offenen Leserasters steuert.
In dieser Ausführungsform verhindert die Anwesenheit einer TRAP-Sequenz wenigstens teilweise die von einer Promotorsequenz, die sich außerhalb einer Protein-Expressionseinheit befindet, ausgehende Transcription. Damit braucht die RNA aus der Protein-Expressionseinheit nicht mit anderer RNA zu konkurrieren, und somit wird ein effizienteres Proteinproduktionssystem bereitgestellt.
Die Verwendung eines TRAP, um wenigstens teilweise die Bildung von Antisense-RNA zu verhindern oder um wenigstens teilweise zu verhindern, dass die Transcription in die Protein-Expressionseinheit eintritt, isoliert die Protein-Expressionseinheit gegenüber negativen Wirkungen, wie der Bildung von RNAi, von außerhalb der Einheit.
Eine TRAP-Sequenz ist hier funktionell definiert als eine Sequenz, die wenigstens teilweise die Bildung von Antisense-RNA verhindern kann oder wenigstens teilweise verhindern kann, dass die Transcription in die Protein-Expressions einheit eintritt. Mit anderen Worten, wenn man eine TRAP-Sequenz in einer Transcriptionseinheit platziert, führt sie zu einem reduzierten Transcriptionsniveau der auf der 3'-Seite des TRAP vorhandenen Nucleinsäure im Vergleich zu dem Transcriptionsniveau, das bei der Nucleinsäure auf der 5'-Seite des TRAP beobachtet wird. Wenn in dieser Anmeldung die Orientierung des TRAP in einem besonderen Konstrukt nicht eigens erwähnt ist, liegt es in der Orientierung vor, die einen Eintritt der Transcription in eine (potentielle) Transcriptionseinheit, d.h. die Transcriptionseinheit der interessierenden Nucleinsäure, blockiert. Vorzugsweise ist die TRAP-Sequenz mit der Protein-Expressionseinheit, die sie transcriptional gegenüber allen flankierenden Transcriptionseinheiten zu isolieren trachtet, physikalisch verknüpft, wenigstens bevor die Einheit durch Transfektion in das Genom der Zelle eingeführt wird. Nach Integration der Einheit werden die Einheit und die damit verknüpften Elemente mit Sequenzen im Genom und dem dort vorhandenen Element verknüpft, und im Falle einer Concatemer-Integration kann die integrierte Einheit mit cointegrierten Einheiten oder einer anderen, durch Transfektion eingeführten Nucleinsäure verknüpft werden. In diesen Ausführungsformen kann sich ein TRAP stromaufwärts oder stromabwärts der Transcriptionseinheit, die sie zu isolieren trachtet, befinden. Wenn es sich stromaufwärts befindet, ist die Orientierung des TRAP so geartet, dass es die von stromaufwärts der Transcriptionseinheit und des TRAP ausgehende und zur Transcriptionseinheit hin fortschreitende Transcription wenigstens teilweise reduzieren kann. Wenn es sich stromaufwärts der Transcriptionseinheit befindet, befindet sich das TRAP in diesen Ausführungsformen in einer solchen Orientierung, dass es die von stromabwärts der Transcriptionseinheit ausgehende Transcription, die mit der Transcriptionseinheit verknüpft ist und zu dieser hin fortschreitet, wenigstens teilweise reduziert. Die Orientierungen stromaufwärts oder stromabwärts sind typischerweise Spiegelbilder voneinander. Wie oben erwähnt, ist es jedoch in der Situation, wenn nach der Integration einer Protein-Expressionseinheit in das Genom Concatemere gebildet werden, auch möglich, zu verhindern, dass die Transcription in eine flankierende cointegrierte Transcriptionseinheit eintritt, indem man eine TRAP-Sequenz stromabwärts der Protein-Expressionseinheit in einer solchen Orientierung platziert, dass sie eine Einleitung der Transcription innerhalb der Protein-Expressionseinheit reduziert. In dieser Ausführungsform wird das TRAP vor der Integration physikalisch mit der Transcriptionseinheit verknüpft, deren Transcription in eine flankierende Transcriptionseinheit eintreten kann. Durch die Verknüpfung des TRAP mit der Einheit vor der Integration ist dieses Potential wenigstens zum Teil reduziert. Diese TRAP Sequenz ist zusätzlich zur normalen Transcriptionstermination und/oder einem Polyadenylierungssignal in einer Protein-Expressionseinheit vorhanden. Bezüglich der Platzierung eines TRAP in Bezug auf die Protein-Expressionseinheit, die es vor einer eintretenden Transcription schützen soll, soll gelten, dass das TRAP vorzugsweise in der Nähe der Expressionscassette platziert wird, die es transcriptional isolieren soll. Mit anderen Worten, vorzugsweise gibt es keine potentiell aktiven Promotorelemente, die in die proteincodierende Domäne "feuern", zwischen dem TRAP und der proteincodierenden Domäne der Expressionscassette, die es transcriptional isolieren soll, außer dem Promotor, der dazu bestimmt ist, die Transcription in der Transcriptionseinheit zu steuern (d.h. der für die Expression des interessierenden Proteins notwendig ist).
Wie hier innerhalb des experimentellen Teils offenbart wird, kann eine TRAP-Sequenz zum Beispiel eine Polyadenylierungsstelle und/oder eine Pausenstelle sein, wo die RNA-Polymerase II stecken bleibt. Ein TRAP kann aus einer beliebigen Quelle stammen, solange eine effiziente Termination der Transcription erreicht wird. In einer Ausführungsform wird ein TRAP anhand seiner Fähigkeit identifiziert, wenigstens teilweise die Bildung von Antisense-RNA zu verhindern oder wenigstens teilweise zu verhindern, dass die Transcription in die Protein-Expressionseinheit eintritt. Beispiel 1 gibt ein Verfahren an, um die Wirkung von mutmaßlichen TRAPs auf die Transcription zu testen. Es wird gezeigt, dass die STAR-Elemente 7, 17 und 40 die Transcription nur schlecht blockieren.
Andererseits erfüllen bestimmte Bereiche von Phage λ, intergenische Bereiche, die Histon-H3-Gene voneinander trennen, sowie eine synthetische PolyA-Sequenz die Kriterien eines TRAP, da sie allesamt starke Blocker der Transcription sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform befindet sich die wenigstens eine TRAP-Sequenz stromaufwärts des Promotors, wobei die TRAP-Sequenz in einer 5'-3'-Orientierung vorliegt. In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform befindet sich die wenigstens eine TRAP-Sequenz stromabwärts des offenen Leserasters, wobei die TRAP-Sequenz in einer 3'-5'-Orientierung in Bezug auf die Orientierung des offenen Leserasters vorliegt. Aus den hier offenbarten Beispielen geht hervor, dass das Potential von TRAP-Sequenzen orientierungsabhängig ist. Es ist daher klar, dass die Orientierung, in der ein TRAP zur Flankierung eines Transgens angewendet wird, für seine korrekte Funktion von Bedeutung sein kann. Es ist jedoch klar, dass es auch TRAP-Sequenzen gibt, die unabhängig von ihrer Orientierung wirken.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Protein-Expressionseinheit wenigstens zwei TRAP-Sequenzen. Eine besonders bevorzugte Version der Ausführungsform mit den wenigstens zwei TRAP-Sequenzen ist die Anwesenheit von wenigstens einem TRAP stromaufwärts und wenigstens einem TRAP stromabwärts der interessierenden Transcriptionseinheit. Vorzugsweise sind die wenigstens zwei TRAP-Sequenzen also so angeordnet, dass die TRAP-Sequenzen die von dem Promotor und dem offenen Leseraster gebildete Kombination flankieren.
Wenn sich mehrere Protein-Expressionseinheiten auf ein und demselben Teil genetischer Information befinden, ist es auch möglich, die Transcription von einer Protein-Expressionseinheit in eine andere Protein-Expressionseinheit wenigstens teilweise zu hemmen oder zu blockieren. In diesem Fall wird eine TRAP-Sequenz zwischen (möglicherweise verschiedenen Protein-Expressionseinheiten platziert, und die Orientierung dieser TRAP-Sequenz ist selbstverständlich eine 5'-3'-Orientierung in Bezug auf die Transcription, die man blockieren möchte. Wenn zwei Expressionscassetten in konvergenter Weise miteinander integrieren, können transcriptionsinerte Domänen entstehen, indem man TRAP-Sequenzen in einer solchen Konfiguration platziert, dass ein Eintritt der Transcription in die Transcriptionseinheiten verhindert wird.
Bevorzugte Beispiele für TRAP-Sequenzen sind in Tabelle 2 angegeben. Vorzugsweise umfasst die TRAP-Sequenz die in Tabelle 2 gezeigte Lambda-35711-38103-Sequenz und/oder ein funktionelles Äquivalent und/oder ein funktionelles Fragment davon. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst die TRAP-Sequenz eine PolyA-Sequenz, vorzugsweise eine synthetische PolyA(SPA)-Sequenz, und/oder ein funktionelles Äquivalent und/oder ein funktionelles Fragment davon, zum Beispiel eine in Tabelle 2 gezeigte SPA-Sequenz und/oder ein funktionelles Äquivalent und/oder ein funktionelles Fragment davon. In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst die TRAP-Sequenz eine Kombination aus einem SPA und dem humanen α2-Globin-Gen-Pausensignal und/oder ein funktionelles Äquivalent und/oder ein funktionelles Fragment davon, zum Beispiel eine in Tabelle 2 gezeigte Kombination aus einem SPA und dem humanen α2-Globin-Gen-Pausensignal und/oder ein funktionelles Äquivalent und/oder ein funktionelles Fragment davon.
Ein funktionelles Äquivalent und/oder ein funktionelles Fragment einer in Tabelle 2 gezeigten Sequenz ist hier wie folgt definiert. Ein funktionelles Äquivalent einer in Tabelle 2 gezeigten Sequenz ist eine Sequenz, die aus der in Tabelle 2 angegebenen Information abgeleitet ist, zum Beispiel eine Sequenz, die aus einer Sequenz in Tabelle 2 abgeleitet sein kann, indem man Basen in oder aus einer in Tabelle 2 aufgeführten Sequenz deletiert, modifiziert und/oder inseriert, wobei die abgeleitete Sequenz dieselbe Art, wenn auch nicht notwendigerweise dieselbe Menge, an Aktivität wie eine in Tabelle 2 gezeigte Sequenz umfasst. Ein funktionelles Äquivalent ist weiterhin eine Sequenz, die einen Teil von zwei oder mehr in Tabelle 2 gezeigten Sequenzen umfasst. Ein funktionelles Fragment einer Sequenz in Tabelle 2 kann zum Beispiel durch Deletionen ausgehend vom 5'-Ende oder vom 3'-Ende oder vom Innern dieser Sequenzen oder einer beliebigen Kombination davon erhalten werden, wobei die abgeleitete Sequenz dieselbe Art, wenn auch nicht notwendigerweise dieselbe Menge, an Aktivität umfasst.
Verfahren der Erfindung sorgen für eine verbesserte Vorhersagbarkeit, verbesserte Niveaus (Ausbeute) und eine verbesserte Stabilität der Transgen-Ex pression. STAR-Elemente erhöhen die Vorhersagbarkeit, Ausbeute und Stabilität der Transgen-Expression noch weiter, indem sie die chromatinassoziierte Repression ausgeschaltet halten. Neben einem Schutz vor Chromatin-Stummschaltung mittels STAR-Elementen schafft die vorliegende Erfindung zusätzlich Mittel und Verfahren, um das Chromatin eines Transgens in einen offeneren Zustand umzuwandeln, was die Vorhersagbarkeit, Ausbeute und Stabilität der transgenen Proteinexpression weiter erleichtert. Um dieses Ziel zu erreichen, können Chromatin-remodellierende Proteine, Histon-Acetyltransferase- oder Histon-Methyltransferase-Proteine auf den Promotor des Transgens gelenkt werden. Die Erfindung verhindert also die Stummschaltung der Transgen-Expression durch die kombinierte Wirkung des Ausgeschaltethaltens der Repression und des gleichzeitigen Haltens von Chromatin in einem offenen Zustand. Durch Kombinieren von STAR-Elementen und/oder TRAP-Sequenzen mit chromatinöffnenden Faktoren setzt die vorliegende Erfindung zwei oder mehr verschiedene Typen von DNA-Elementen oder Proteinen ein, die einander synergistisch verstärken, wobei neue (Wirts)Zellen/Zelllinien entstehen, die Proteine effizient und stabil exprimieren. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Öffner, STAR-Elemente und TRAP-Sequenzen, wie sie hier offenbart sind, in Expressionseinheiten miteinander kombiniert. In Kombination mit STAR-Elementen potenzieren TRAP-Sequenzen die Wirkung von STAR-Elementen. Das heißt, der Einbau der STAR-TRAP-Kombination führt zu höheren Expressionsniveaus, als wenn STAR- oder TRAP-Elemente allein eingebaut werden.
Im Prinzip kann jeder Typ von Polypeptid oder Protein mit Hilfe eines Verfahrens der Erfindung produziert werden. Das Verfahren ist besonders gut für die Produktion von multimeren Proteinen geeignet, die die wenigstens zwei Polypeptide umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform sorgt ein Verfahren für die Expression der wenigstens zwei Polypeptide in einem vorbestimmten Verhältnis. Vorzugsweise umfassen die wenigstens zwei Polypeptide eine schwere Kette eines Immunglobulins und eine leichte Kette eines Immunglobulins. Gemäß dieser Ausführungsform wird ein multimeres Protein, ein Antikörper, erhalten. Dem Fachmann ist klar, dass es möglich ist, eine Zelle bereitzustellen, die eine schwere Kette eines Immunglobulins ausgehend von einer Protein-Expressions einheit und eine leichte Kette eines Immunglobulins ausgehend von einer anderen Protein-Expressionseinheit exprimiert, wobei eine dritte Protein-Expressionseinheit eine sekretorische Komponente oder eine verbindende Kette codiert. Auf diese Weise wird die Produktion von zum Beispiel sIgA und pentamerem IgM erzielt. Vorzugsweise umfassen das erste Polypeptid und das zweite Polypeptid wenigstens den variablen Teil einer leichten Kette eines Immunglobulins und einer schweren Kette eines Immunglobulins. Vorzugsweise umfasst das erste Polypeptid wenigstens den variablen Teil einer schweren Kette eines Immunglobulins, während das zweite Polypeptid eine leichten Kette eines Immunglobulins oder ein Derivat und/oder Analogon davon umfasst. Diese Ausführungsform garantiert, dass ein erhöhter Anteil der selektierten Zellen eine Tendenz aufweist, die schwere Kette des Immunglobulins leicht überzuproduzieren, wodurch eine effizientere Produktion des multimeren Proteins ermöglicht wird. Die Immunglobulin-Technologie ist zur Zeit sehr weit fortgeschritten, und es ist möglich, codierende Domänen für Antikörper zu erzeugen, die in der Natur keinen komplementären Antikörper aufweisen, d.h. einen vollständig künstlichen Antikörper. Solche Antikörper liegen ebenfalls innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung. Wegen einer Übersicht über die relevante Technik für Antikörper, ihre Selektion und Produktion verweisen wir auf Chad H.E. und Chamow S.M., 2001, Therapeutic antibody expression technology, Curr. Opin. Biotechn. 12, 188-194; Das R.C., 2001, Proteins und antibodies make advances as therapeutic products, Am. Clin. Lab. 20, 8-14.
Weiterhin wird die Verwendung einer Zelle der Erfindung für die Produktion eines Antikörpers oder eines funktionellen Teils, Derivats und/oder Analogons davon angegeben. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst der produzierte Antikörper einen humanen oder humanisierten Antikörper, während die Zelle, in der der Antikörper produziert wird, eine humane Zelle oder zum Beispiel durch Fusion einer humanen Zelle mit einer humanen Zelle oder einer nichthumanen Zelle davon abgeleitet ist. Im Hinblick auf die Produktion von multimerem Protein umfasst ein Verfahren der Erfindung vorzugsweise weiterhin das Versehen der Zelle mit einer zweiten Protein-Expressionseinheit. Vorzugsweise codiert die Expressionseinheit ein Element eines multimeren Proteins.
Vorzugsweise codiert die Protein-Expressionseinheit eine schwere oder leichte Kette eines Immunglobulins oder ein antigenbindendes Teil, Derivat und/oder Analogon davon.
Ein Verfahren der Erfindung ist besonders gut für die Selektion von Zellen für die Produktion eines interessierenden Polypeptids von klinischer Qualität geeignet. Ein Verfahren umfasst daher vorzugsweise weiterhin das Kultivieren der Zelle und das Ernten des (multimeren) Proteins. Die Erfindung stellt daher weiterhin eine das Protein umfassende Probe bereit, die nach einem Verfahren der Erfindung erhältlich ist, vorzugsweise eine Probe, die wenigstens den variablen Teil einer leichten Kette eines Immunglobulins und einer schweren Kette eines Immunglobulins umfasst, wobei das Protein vorzugsweise eine leichte Kette eines humanen Immunglobulins und eine schwere Kette eines humanen Immunglobulins umfasst oder immunologisch mit einer humanen Immunglobulinkette verwandt ist. Die Erfindung gibt weiterhin die Verwendung einer Probe oder eines Antikörpers der Erfindung für die Herstellung eines Medikaments oder eines Impfstoffs an, vorzugsweise für die Behandlung von Krebs.
Die Protein-Expressionseinheit kann monocistronisch, bicistronisch oder multicistronisch sein. Vorzugsweise umfasst die Protein-Expressionseinheit ein multicistronisches Gen. Einheiten, die mehrere Cistrons umfassen, können als eine einzelne mRNA transcribiert werden. Die Translation des zweiten und weiterer codierender Bereiche, die auf dieser RNA vorhanden sind, können auf verschiedene Weise erreicht werden, einschließlich der Verwendung von Translations-Reinitiationsstellen oder internen Ribosomeneintrittsstellen, wobei letztere bevorzugt ist. Die Vorteile von bi- oder multicistronischen Einheiten sind vielfältig und umfassen die leichte Selektion von Klonen, die ein interessierendes Protein exprimieren, zum Beispiel, indem man die Nucleinsäure, die ein dominantes Selektionsmarker-Protein codiert, stromabwärts einer Nucleinsäure platziert, die ein interessierendes Protein oder Polypeptid codiert.
Jeder Typ von Promotor kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, solange er so funktioniert, dass er die Transcription in der Protein-Expressions einheit zu einem bestimmten Zeitpunkt oder kontinuierlich ermöglicht. Bevorzugte Promotoren umfassen die Promotoren des humanen Cytomegalievirus, des Simianvirus 40, von Ubiquitin C, des Verlängerungsfaktors 1-α oder ein funktionelles Teil, Derivat, Analogon oder eine Kombination davon. Ein funktionelles Teil kann durch Deletion oder Mutation einer Nucleinsäure des Promotors erzeugt werden. Ein Derivat ist zum Beispiel ein Promotor einer anderen Spezies, der aber zu einem oben erwähnten Promotor homolog ist. Solche Promotoren sind unter anderem durch Vergleichen von Sequenzen der verschiedenen Spezies zu finden. Humanes Cytomegalievirus hat ein Homologes in anderen Spezies, und ähnlich hat auch das Simianvirus 40 ein Homologes in anderen Spezies. Promotoren, die man in solchen Homologen findet, sind in der vorliegenden Erfindung ebenfalls bevorzugt. Analoga solcher Promotoren sind Promotoren, die ein oder mehrere Elemente umfassen, die den in den erwähnten Promotoren gefundenen ähnlich sind, aber künstlich oder aus einem anderen Promotor erhalten werden. Solche Elemente können einen bestimmten Transcriptionsstartbereich (TATAA-Box oder ein Äquivalent, wie der Promotor, der hADA steuert) umfassen. Weitere Elemente sind besondere verstärkende Elemente, die in der Nähe des Transcriptionsstartbereichs platziert werden, und dergleichen.
Die Erfindung stellt weiterhin eine Zelle bereit, die nach einem Verfahren der Erfindung erhältlich ist, wobei die Zelle selbstverständlich eine Expressionseinheit umfasst, die eine Bindungsstelle für einen Öffner der Erfindung umfasst. Vorzugsweise ist die Expressionseinheit mit einer Bindungsstelle für den Öffner versehen. Weiterhin wird eine Zelle bereitgestellt, die mit einer Nucleinsäure versehen ist, welche einen Öffner der Erfindung codiert, vorzugsweise einen Öffner, der mit einer neuen DNA-Bindungsspezifität versehen ist. Vorzugsweise ist die Zelle eine Hefezelle, eine Vertebratenzelle oder eine Pflanzenzelle, vorzugsweise eine Säugerzelle und dabei vorzugsweise eine humane Zelle. Selbstverständlich können Verfahren der Erfindung in vitro oder in vivo durchgeführt werden. Vorzugsweise jedoch wird das Verfahren der Erfindung in vitro durchgeführt. Bevorzugte Zelllinien sind Zelllinien, die für die Produktion von Proteinen verwendet werden. Eine bevorzugte Zelle unter diesen ist eine U-2-OS-Osteosarkom-, CHO-, 293-, HuNS-1-Myelom-, WERI-Rb-1-Retinoblastom-, BHK-, Vero-, nichtsezernierende Maus-Myelom-Sp2/0-Ag-14-, nichtsezernierende Maus-Myelom-NSO- oder NCI-H295R-Nebennierenkarzinomzelle. Die Erfindung stellt weiterhin eine Nucleinsäure bereit, die eine Protein-Expressionseinheit umfasst, die mit einer Bindungsstelle für einen Vertreter einer chromatinmodifizierenden Systems versehen ist, um Chromatin für die Transcription zugänglicher zu machen (Öffner), und die vorzugsweise weiterhin eine STAR-Sequenz umfasst. Vorzugsweise umfasst die Expressionseinheit einen Promotor des humanen Cytomegalievirus, des Simianvirus 40, von Ubiquitin C, des Verlängerungsfaktors 1-α oder ein funktionelles Teil, Derivat, Analogon oder eine Kombination davon.
Die Erfindung umfasst weiterhin die Verwendung eines Öffners zum Stabilisieren der Expression einer Expressionseinheit und die Verwendung eines Öffners zur Erhöhung der Zahl der Klone, die nach genetischer Modifikation eine bestimmte Menge eines Proteins exprimieren. Außerdem wird die Verwendung eines Öffners zur Erhöhung der von einer Expressionseinheit produzierten Transcriptkonzentrationen angegeben.
In noch einer anderen Ausführungsform gibt die Erfindung ein Verfahren zur Verbesserung der Funktion einer Protein-Expressionseinheit, die ein STAR-Element umfasst, an, das das Versehen der Protein-Expressionseinheit mit einer Bindungsstelle für einen Vertreter einer chromatinmodifizierenden Systems, um Chromatin für die Transcription zugänglicher zu machen (Öffner), umfasst. Außerdem wird ein Verfahren zur Verbesserung der Funktion eines STAR-Elements in einer Protein-Expressionseinheit angegeben, das das Versehen der Protein-Expressionseinheit mit einer Bindungsstelle für einen Vertreter einer chromatinmodifizierenden Systems, um Chromatin für die Transcription zugänglicher zu machen (Öffner), umfasst.
Die Lenkung von Chromatinöffnern zu einem Transgen oder einem Promotor eines Transgens wird verwendet, um vorhersagbare hohe Ausbeuten und eine stabile Transcription eines Transgens zu erreichen. In der vorliegenden Erfindung werden HAT-Proteine, wie p300, CBP und/oder P/CAF oder funktionell relevante Teile dieser Proteine als Fusionsprotein mit dem LexA-Protein produziert (1A, 1B) (Bunker und Kingston 1994).
Anstelle von LexA-Öffner-Fusionsproteinen, die zu LexA-Bindungsstellen gelenkt werden, können auch GAL4-Öffner-Fusionsproteine verwendet werden. Diese GAL4-Öffner-Fusionsproteine werden zu GAL4-Bindungsstellen gelenkt, die stromaufwärts eines Promotors platziert werden. Im Unterschied zu dem bakteriellen LexA-Protein ist GAL4 ein Hefeprotein. Wie LexA-Protein ist GAL4 ein Transcriptionsfaktor, der eine DNA-Bindungsdomäne und eine trans-wirkende Domäne aufweist, wobei letztere Domäne für die Aktivierung der Genexpression verantwortlich ist. Um ein GAL4-Öffner-Fusionsprotein zu schaffen, wird der Teil des GAL4-Gens, der die Aminosäuren 1 bis 147 codiert (Lillie und Green, 1989), in demselben Leseraster wie das jeweilige Öffnerprotein oder ein funktionelles Teil des Öffnerproteins kloniert. In der vorliegenden Erfindung wird die Expression des GAL4-Öffner-Fusionsproteins durch den SV40-Promotor gesteuert. Das GAL4-Öffner-Fusionsprotein wird zu GAL4-Bindungsstellen gelenkt, die GAL4-Operatoren genannt werden. Üblicherweise werden vier GAL4-Operatoren unmittelbar stromaufwärts eines Promotors platziert. Ein Beispiel für einen GAL4-Operator ist die folgende Sequenz: CGGAGTACTGTCCTCCG.
Diese Fusionsproteine werden unter die Kontrolle eines induzierbaren oder konstitutiven Promotors, wie des SV40-Promotors (1A, B) gestellt. Die Expressionseinheiten für diese Fusionsproteine befinden sich auf demselben Plasmid wie die Expressionseinheit, die das Gen enthält, das das interessierende Protein codiert (Gen 1) (1). Gen 1 wird unter die Kontrolle des CMV-Promotors gestellt. Stromaufwärts des CMV-Promotors werden Bindungsstellen kloniert, zu denen die LexA-HAT-Proteine gelenkt werden (1A). Diese Fusionsproteine werden also in die Nähe des Promotors gelenkt, um die Chromatinstruktur des Promotors offen zu halten und dadurch die Zugänglichkeit des Promotors für Transcriptionsfaktoren zu erleichtern. Es ist auch möglich, ein einziges Plasmid zu schaffen, das drei Expressionseinheiten enthält, die Gen 1, Gen 2 bzw. LexA-HAT codieren (1B). Die Expressionseinheiten, die Gen 1 und Gen 2 codieren, sind in einer solchen Weise divergent orientiert, dass die beiden CMV-Promotoren benachbart, aber unterschiedlich orientiert sind. Zwischen den beiden Promotoren werden LexA-Bindungsstellen platziert, zu denen das LexA-Fusionsprotein gelenkt wird. Auf diese Weise werden Chromatinöffner zu beiden Expressionseinheiten gelenkt.
Dem Fachmann wird auch klar sein, dass es nicht wesentlich ist, dass die LexA-Fusionsproteine oder HAT-Proteine ausgehend von demselben Plasmid exprimiert werden, das die Expressionseinheit mit dem interessierenden Gen enthält. Die LexA-Fusionsproteine oder HAT-Proteine können auch ausgehend von einem getrennten Plasmid produziert werden.
Daher gibt die Erfindung in einer Ausführungsform ein Verfahren zur Gewinnung einer Zelle an, die ein oder mehrere Proteine exprimiert, das das Versehen der Zelle mit einer oder mehreren Protein-Expressionseinheiten, die das eine oder die mehreren Proteine codieren, umfasst und das dadurch gekennzeichnet ist, dass wenigstens eine, aber vorzugsweise wenigstens zwei der Protein-Expressionseinheiten wenigstens einen Chromatinöffner und/oder eine STAR-Sequenz umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform codieren Gen 1 und Gen 2 die leichte und die schwere Kette eines multimeren Immunglobulinproteins.
Die Ausdrücke "Zelle"/"Wirtszelle" und "Zelllinie"/"Wirtszelllinie" sind jeweils typischerweise definiert als eukaryontische Zelle und homogene Populationen davon, die nach in der Technik bekannten Verfahren in Zellkultur gehalten werden und die die Fähigkeit haben, heterologe oder homologe Proteine zu exprimieren. In der vorliegenden Erfindung ist es also möglich, einen Öffner für eine in der Zelle vorhandene Expressionseinheit bereitzustellen, zum Beispiel mittels homologer Rekombination. Die Expressionseinheit in der Zelle kann auch mit anderen Merkmalen versehen werden. Es ist also durchaus möglich, zum Beispiel einen in der Zelle vorhandenen codierenden Bereich zu aktivieren. Zum Beispiel wird das Gen, das Erythropoietin codiert, normalerweise nicht in einer Zelle exprimiert. Indem man das Versehen dieser Protein-Expressionseinheit mit einer Bindungsstelle für einen Öffner der Erfindung einführt, ist es möglich, eine Expression des endogenen Gens zu erhalten. Dies erfordert typischerweise auch den Ersatz des Promotors oder das Hinzufügen von weiteren Promotorelementen, wie Enhancern. In dieser Ausführungsform wird das endogene Gen weiterhin vorzugsweise auf einer Seite, aber vorzugsweise auf beiden Seiten des endogenen Gens, mit einer STAR-Sequenz versehen. Selbstverständlich können Verfahren der Erfindung auch verwendet werden, um die Expression von bereits exprimierten endogenen Genen zu verstärken. Mittel und Verfahren zur Aktivierung oder verstärkten Expression von endogenen Genen mittels homologer oder zielgelenkter Rekombination sind in der Technik bekannt. Die vorliegende Erfindung trägt zu dieser Technologie Bindungsstellen für Öffner, STAR-Elemente und besonders bevorzugte Promotoren bei.
Der Ausdruck "Expression" wird typischerweise verwendet, um die Produktion eines oder mehrerer spezifischer RNA-Produkte oder eines oder mehrerer spezifischer Proteine in einer Zelle zu bezeichnen. Im Falle von RNA-Produkten bezieht er sich auf den Vorgang der Transcription. Im Falle von Proteinprodukten bezieht er sich auf die Vorgänge der Transcription, Translation und gegebenenfalls posttranslationale Modifikationen. Im Falle von sezernierten Proteinen bezieht er sich auf die Vorgänge der Transcription, Translation und gegebenenfalls posttranslationale Modifikation (z.B. Glycosylierung, Bildung von Disulfidbindungen usw.) sowie anschließend Sekretion. Im Falle von multimeren Proteinen umfasst er das Zusammensetzen der multimeren Struktur aus den Polypeptidmonomeren. Die dem Substantiv "Expression" entsprechenden Verben haben eine analoge Bedeutung wie das Substantiv.
Ein Protein oder Polypeptid ist hier definiert als entweder (i) ein Produkt, das durch die Vorgänge der Transcription und Translation erhalten wird, wobei dieses Produkt möglicherweise, aber nicht notwendigerweise Bestandteil eines multimeren Proteins (zum Beispiel eine Untereinheit) ist, und/oder (ii) ein Produkt, das durch die Vorgänge der Transcription, Translation und posttranslationalen Modifikation erhalten wird. Der Ausdruck "Multimer" oder "multimeres Protein" ist typischerweise definiert als ein Protein, das zwei oder mehr, möglicherweise nichtidentische, Polypeptidketten ("Monomere") umfasst. Die verschiedenen Monomere in einem multimeren Protein können in stöchiometrisch gleichen oder ungleichen Zahlen vorhanden sein. In beiden Fällen ist der Anteil der Monomere gewöhnlich durch die funktionelle Struktur des multimeren Proteins festgelegt.
Der Ausdruck "Protein-Expressionseinheit" ist hier definiert als Einheit, die für eine Proteinexpression sorgen kann und die typischerweise einen funktionellen Promotor, ein offenes Leseraster, das ein interessierendes Protein codiert, und einen funktionellen Terminator umfasst, alle in funktionsfähiger Konfiguration. Ein funktioneller Promotor ist ein Promotor, der in einer besonderen Zelle die Transcription einleiten kann, der also normalerweise in der Zelle, die verwendet wird, um die Expression des interessierenden Proteins zu erhalten, transcriptionsaktiv ist. "Normalerweise transcriptionsaktiv" bedeutet, dass der Promotor in der Lage sein muss, die Transcription in der Zelle einzuleiten, was im Falle eines induzierbaren Promotors das Bereitstellen des Induktors für den Promotor beinhalten kann. Somit sind sogenannte Minimalpromotoren, die ihrer assoziierten transcriptionseinleitenden Nucleinsäuresequenzen beraubt wurden, in dem Ausdruck "Promotor", wie er in der vorliegenden Erfindung im Zusammenhang mit einem Promotor, der die Expression des interessierenden Proteins steuert, verwendet wird, nicht mit eingeschlossen. Beispiele für solche Minimalpromotoren sind der SV40-Minimalpromotor (aus Promega pGL3; Zugriffsnummer U47296) und der LBK-AP-Minimalpromotor (D. Ruezinsky, H. Beckman und T. Kadesch, Modulation of the IgH enhancer's cell type specificity through a genetic switch, Genes Dev. 5, 29-37 (1991)).
Bevorzugte Promotoren zur Herbeiführung einer Expression in eukaryontischen Zellen sind der CMV-Promotor, ein Säuger-EF1-α-Promotor, ein Säuger-Ubiquitin-Promotor oder ein SV40-Promotor. Ein funktioneller Terminator ist ein Terminator, der für eine Transcriptionstermination sorgen kann. Ein Beispiel für einen geeigneten Terminator ist ein SV40-Terminator. Der Ausdruck "ein offenes Leseraster, das ein interessierendes Protein codiert (oder ein Transgen)," ist typischerweise definiert als DNA-Fragment, das für ein oder mehrere spezifische RNA-Produkte oder ein oder mehrere Proteine codiert und in das Genom einer Wirtszelle integriert werden kann. Er umfasst DNA-Elemente, die für eine richtige Transcription und Translation des bzw. der codierenden Bereiche des Transgens erforderlich sind. Die DNA, die das interessierende Protein codiert/das Transgen kann entweder eine DNA sein, die ein Produkt, das durch die Vorgänge der Transcription und Translation erhalten wird (und möglicherweise, aber nicht notwendigerweise Bestandteil eines multimeren Proteins, zum Beispiel eine Untereinheit, ist), oder ein Produkt, das durch die Vorgänge der Transcription, Translation und posttranslationale Modifikation erhalten wird, codiert.
Die Ausdrücke "rekombinante Zelle/Wirtszelle" und "rekombinante Zelllinie/Wirtszelllinie" sind jeweils typischerweise definiert als Wirtszelle und homogene Populationen davon, in die das Transgen eingeführt wurde, um ein oder mehrere heterologe Proteine zu produzieren.
Eine STAR-Sequenz (stabilisierende Anti-Repressor-Sequenz) (oder STAR-Element; die Ausdrücke werden hier mit gleicher Bedeutung verwendet) ist ein DNA-Element, das wir zuerst in eukaryontischen Genomen auf der Basis ihrer Fähigkeit, die Transgen-Repression zu blockieren, identifiziert haben. STAR-Sequenzen können identifiziert werden (wie es zum Beispiel in Beispiel 1 von EP 01 202 581.3 offenbart ist), indem man ein Verfahren zum Nachweisen und gegebenenfalls Selektieren einer DNA-Sequenz mit einer die Gentranscription modulierenden Eigenschaft verwendet. Eine STAR-Sequenz umfasst die Fähigkeit, die Transcription von Genen in cis zu beeinflussen und/oder für eine stabilisierende und/oder verstärkende Wirkung zu sorgen. Das Expressionsniveau des Transgens ist über viele Zellgenerationen hinweg stabil und, manifestiert keine stochastische Stummschaltung. Daher verleihen STAR-Sequenzen einen Grad der positionsunabhängigen Expression von Transgenen, der mit herkömmlichen transgenen Systemen nicht möglich ist. Die Positionsunabhängigkeit bedeutet, dass Transgene, die in genomische Loci integriert sind, welche zu einer Stummschaltung des Transgens führen würden, unter dem Schutz von STAR-Elementen in einem transcriptionsaktiven Zustand gehalten werden. Außerdem ist ein STAR-Element in vielen verschiedenen Zelltypen aktiv.
Chromatinöffner oder einfach Öffner (die Ausdrücke werden hier mit gleicher Bedeutung verwendet) sind Histon-Modifikatoren, wie HAT-Proteine oder funk tionell relevante Teile solcher Proteine, die noch in der Lage sind, Acetylgruppen an Histonschwänze zu addieren, was zur Folge hat, dass die enge Assoziation zwischen den basischen Histonen und der sauren DNA gelockert wird. Chromatinöffner, bei denen es sich um spezifische HATs handelt, haben also gemeinsam, dass sie die Bindung von Transcriptionsfaktoren an den Promotor erleichtern und damit die Möglichkeiten der Transcription erhöhen.
Die Transcription kann durch eine direkte Wirkung des regulatorischen Elements (oder des bzw. der daran bindenden Proteine) auf die Transcription eines bestimmten Promotors beeinflusst werden. Die Transcription kann jedoch auch durch eine indirekte Wirkung beeinflusst werden, zum Beispiel weil das regulatorische Element die Funktion von einem oder mehreren anderen regulatorischen Elementen beeinflusst. Eine die Gentranscription modulierende Eigenschaft kann auch die Eigenschaft einer stabilen Gentranscription umfassen. "Stabil" bedeutet, dass sich das beobachtete Transcriptionsniveau über wenigstens 5-60 Zellteilungen hinweg nicht wesentlich ändert. Eine stabile Eigenschaft ist geeignet in Situationen, bei denen Expressionsmerkmale über viele Zellteilungen hinweg vorhersagbar sein sollten. Typische Beispiele dafür sind Zelllinien, die mit Fremd-Genen transfiziert sind. Andere Beispiele sind transgene Tiere und Pflanzen sowie Gentherapien. Sehr häufig funktionieren eingeführte Expressionscassetten nach einer zunehmenden Zahl von Zellteilungen oder Pflanzen- oder Tiergenerationen anders. Vorzugsweise umfasst eine stabile Eigenschaft die Fähigkeit, die Gentranscription in nachfolgenden Generationen einer transgenen Pflanze oder eines transgenen Tiers aufrechtzuerhalten. Wenn die Expression induzierbar ist, umfasst diese Eigenschaft selbstverständlich die Eigenschaft, die Induzierbarkeit der Expression in nachfolgenden Generationen einer transgenen Pflanze oder eines transgenen Tiers aufrechtzuerhalten. Häufig fallen die Expressionsniveaus mit zunehmender Zahl der Zellteilungen dramatisch ab. Die vorliegende Erfindung stellt ein Mittel bereit, um diesem Abfall wenigstens teilweise entgegenzuwirken.
Die vorliegende Erfindung gibt unter anderem ein Verfahren zur Gewinnung einer Zelle an, die ein oder mehrere Proteine exprimiert. Öffner werden zu der Expressionseinheit des interessierenden Gens gegeben, vorzugsweise zusammen mit STAR-Elementen, die so angewendet werden, dass sie die Expressionseinheiten flankieren, wobei die beiden Chromatinöffner und STAR-Elemente die Grundlage für die stabile Expression des Transgen-Proteins über viele Zellgenerationen hinweg bilden. Wir haben nachgewiesen, dass STAR-Elemente einzelne Transgene vor der Stummschaltung schützen können. Expressionseinheiten, die nicht von STAR-Elementen flankiert werden, können nach nur 5-60 Kulturpassagen eine signifikante Stummschaltung erfahren, und während dieser Zeit ist die Stummschaltung der durch das STAR-Element geschützten Einheiten vernachlässigbar.
Die vorliegende Erfindung verwendet Chromatinöffner und STAR-Sequenzen für die Produktion von einem oder mehreren Proteinen, und dadurch sorgt die Erfindung für (1) eine erhöhte Vorhersagbarkeit bei der Schaffung von rekombinanten Zelllinien, die effizient die interessierenden heterologen multimeren Proteine produzieren, (2) eine erhöhte Ausbeute der heterologen multimeren Proteine, (3) eine stabile Expression der heterologen multimeren Proteine, selbst während der längeren Kultivierung in Abwesenheit von Selektionsmittel, und (4) sorgt die Erfindung auch für günstige Transgen-Expressionseigenschaften ohne Amplifikation des Transgens. Die erhöhte Ausbeute an heterologem Protein, für die die Erfindung sorgt, kann bei niedrigen Transgen-Kopienzahlen ohne selektive Coamplifikation zum Beispiel unter Verwendung des DHFR/Methotrexat-Systems erhalten werden. Dies führt zu größerer Stabilität, da die Transgen-Kopienzahl gering ist und nicht aufgrund von Rekombination (McBurney et al., 2002) oder Repeat-induzierter Gen-Stummschaltung (Garrick et al., 1998) abnehmen kann. Fünftens beinhaltet die breite Anwendbarkeit des Verfahrens der Erfindung ihre Nützlichkeit in einem weiten Bereich von Wirtszelllinien. Dies ist zum Beispiel nützlich/wünschenswert, wenn ein bestimmtes multimeres Protein vorzugsweise von einer bestimmten Wirtszelllinie exprimiert wird (z.B. Expression von Antikörpern aus von Lymphocyten abgeleiteten Wirtszelllinien).
Ein Verfahren gemäß der Erfindung sorgt daher für eine Verbesserung der Expression von einem oder mehreren Proteinen in einer (Wirts)Zelle. In einer anderen Ausführungsform gibt die Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren einer Zelle an, wobei die Expression von einem oder mehreren Proteinen in einem vorbestimmten Verhältnis Folgendes umfasst:

– Bereitstellen einer Sammlung von Zellen mit einer oder mehreren Protein-Expressionseinheiten, die das eine oder die mehreren Proteine codieren;
– Auswählen von Zellen, die das eine oder die mehreren Proteine exprimieren; und
– Identifizieren von Zellen aus der erhaltenen Selektion, die die zwei oder mehr Proteine in dem vorbestimmten Verhältnis exprimieren, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens zwei der Protein-Expressionseinheiten wenigstens einen Chromatinöffner umfassen;
– Identifizieren von Zellen aus der erhaltenen Selektion, die die zwei oder mehr Proteine in dem vorbestimmten Verhältnis exprimieren. Vorzugsweise umfasst wenigstens eine der Expressionseinheiten wenigstens eine STAR-Sequenz.

Die Selektion von Zellen, die das eine oder die mehreren Proteine exprimieren, kann zum Beispiel erhalten werden, indem man eine SDS-PAGE-Analyse, eine Western-Blot-Analyse oder einen ELISA durchführt, alles Techniken, die dem Fachmann bekannt sind und daher keine weitere Erläuterung benötigen. Die Identifizierung von Zellen, die die zwei oder mehr Proteine in dem vorbestimmten Verhältnis exprimieren, kann ebenfalls mit diesen Techniken durchgeführt werden.
Die Anwesenheit eines Öffners und einer STAR-Sequenz in wenigstens einer der Protein-Expressionseinheiten sorgt wiederum für die gewünschte Vorhersagbarkeit, Ausbeute, Stabilität des einen oder der mehreren Proteine.
In einer anderen Ausführungsform gibt die Erfindung ein Verfahren an, bei dem wenigstens eine der Protein-Expressionseinheiten ein monocistronisches Gen umfasst, das ein offenes Leseraster umfasst, welches ein interessierendes Protein codiert, und bei dem das monocistronische Gen unter der Kontrolle eines funktionellen Promotors steht.
In noch einer anderen Ausführungsform gibt die Erfindung ein Verfahren gemäß der Erfindung an, bei dem wenigstens eine der Protein-Expressionseinheiten ein bicistronisches Gen umfasst, das ein offenes Leseraster, welches ein interessierendes Protein codiert, eine Proteintranslations-Startstelle mit einer reduzierten Translationseffizienz und einen Selektionsmarker umfasst, und bei dem das bicistronische Gen unter der Kontrolle eines funktionellen Promotors steht.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform gibt die Erfindung ein Verfahren gemäß der Erfindung an, wobei wenigstens eine der Protein-Expressionseinheiten ein bicistronisches Gen umfasst, das ein offenes Leseraster, welches ein interessierendes Protein codiert, eine Proteintranslations-Startstelle mit einer reduzierten Translationseffizienz und einen Selektionsmarker umfasst, und bei dem das bicistronische Gen unter der Kontrolle eines funktionellen Promotors steht, wobei die Protein-Expressionseinheit weiterhin ein monocistronisches Gen umfasst, das ein offenes Leseraster umfasst, welches einen zweiten Selektionsmarker codiert, und wobei das monocistronische Gen unter der Kontrolle eines funktionellen Promotors steht.
Der Ausdruck "bicistronisches Gen" ist typischerweise definiert als Gen, das ein RNA-Molekül ergeben kann, welches zwei Proteine/Polypeptide codiert.
Der Ausdruck "monocistronisches Gen" ist typischerweise definiert als Gen, das ein RNA-Molekül ergeben kann, welches ein einziges Protein/Polypeptid codiert.
Der Ausdruck "Selektionsmarker" oder "selektierbarer Marker" wird typischerweise verwendet, um ein Gen und/oder ein Protein zu bezeichnen, dessen Gegenwart in einer Zelle direkt oder indirekt nachgewiesen werden kann, zum Beispiel ein Gen und/oder ein Protein, das ein Selektionsmittel inaktiviert und die Wirtszelle vor den tödlichen oder wachstumshemmenden Wirkungen des Mittels schützt (z.B. ein Antibiotikum-Resistenz-Gen und/oder Protein). Eine weitere Möglichkeit ist, dass der Selektionsmarker Fluoreszenz oder eine Farbablagerung induziert (z.B. grünes fluoreszentes Protein und Derivate, Luciferase oder Alkalische Phosphatase).
Der Ausdruck "Selektionsmittel" ist typischerweise definiert als Mittel zum Selektieren in Bezug auf die Anwesenheit eines Selektionsmarkers, wie ein Antikörper. Ein "dominantes Selektionsmittel" ist typischerweise definiert als chemische Verbindung, die Wirtszellen abtöten oder ihr Wachstum verzögern kann (z.B. ein Antibiotikum).
Der Ausdruck "dominante Selektion" ist typischerweise definiert als Vorgang der Verwendung eines Selektionsmarkers/selektierbaren Markers und eines dominanten Selektionsmittels, um Wirtszellen mit spezifischen genetischen Eigenschaften zu identifizieren (z.B. dass die Wirtszelle ein in ihr Genom integriertes Transgen enthält).
Die Substantive "Klon" und "Isolat" beziehen sich typischerweise auf eine rekombinante Wirtszelllinie, die mittels Selektion identifiziert und isoliert wurde.
Verbesserungen, zu denen ein Verfahren gemäß der Erfindung führt, haben wenigstens drei Aspekte, die integriert sein können oder auch nicht. (1) Bei bestehenden Systemen können rekombinante Zelllinien, die gleichzeitig annehmbare Mengen der Monomere von multimeren Proteinen exprimieren, nur in sehr geringen Häufigkeiten erzeugt werden; die vorliegende Erfindung erhöht die Vorhersagbarkeit der Schaffung von hohe Ausbeuten liefernden rekombinanten Wirtszelllinien um einen Faktor von zehn oder mehr. (2) Bestehende Systeme ergeben keine stöchiometrisch ausgewogenen und proportionalen Mengen der Untereinheiten von multimeren Proteinen; die vorliegende Erfindung gewährleistet, dass die Expressionsniveaus der Untereinheiten ausgewogen und proportional sind. (3) Bestehende Systeme liefern kein Mittel zum Schützen der Transgene, die die Protein-Untereinheiten codieren, vor Transgen-Stummschaltung.
1 zeigt eine nichteinschränkende schematische Darstellung einer der Ausführungsformen dieses Teils der Erfindung.
Dies ist die Konfiguration der DNA-Elemente der Expressionseinheiten in dem Plasmid sowie nach Integration in das Genom. Expressionseinheit 1 ist in 1A gezeigt. Sie enthält ein offenes Leseraster für ein Transgen (ein Reportergen, Gen 1). Dieses befindet sich stromaufwärts von dem gedämpften EMCV IRES (Martinez-Sals et al., 1999; Mizuguchi et al., 2000; Rees et al., 1996) und von dem offenen Leseraster, das das Zeocin-Resistenz-Selektionsmarkerprotein (zeo) codiert. Die Gencassette weist den SV40-Transcriptionsterminator an ihren 3'-Enden auf (t). Dieses bicistronische Transgen wird auf hohem Niveau ausgehend von dem CMV-Promotor transcribiert. Stromaufwärts des CMV-Promotors befinden sich vier LexA-Bindungsstellen (LexA-BS). Danach kommt das monocistronische Gen, das ein Fusionsprotein zwischen dem LexA-Protein und einer Histon-Acetyltransferase (HAT) oder einem funktionellen Teil einer HAT, das noch in der Lage ist, Acetylgruppen auf Histonschwänze zu übertragen, codiert (LexA-HAT). Diese monocistronische Transcriptionseinheit wird ausgehend vom SV40-Promotor transcribiert. Die Gene weisen den SV40-Transcriptionsterminator an ihren 3'-Enden auf (t). Diese gesamte Cassette mit mehrfachen Genen wird von STAR-Elementen flankiert.
1B ist ähnlich wie 1A, aber ein Plasmid enthält jetzt drei Expressionseinheiten, die Gen 1, Gen 2 bzw. LexA-HAT codieren. Die Expressionseinheiten, die Gen 1 und Gen 2 codieren, sind in einer solchen Weise divergent orientiert, dass die beiden CMV-Promotoren benachbart, doch unterschiedlich orientiert sind. Zwischen den beiden Promotoren sind LexA-Bindungsstellen platziert, zu denen die LexA-Fusionsproteine gelenkt werden. Auf diese Weise werden Chromatinöffner zu beiden Expressionseinheiten gelenkt.
Dem Fachmann ist klar, dass in diesen Beispielen mehr mögliche Kombinationen hergestellt werden können. Zum Beispiel können die Expressionseinheiten in einer solchen Weise hergestellt werden, dass sich Gen 1, Gen 2 und LexA-HAT jeweils auf getrennten Plasmiden befinden. Außerdem können STAR-Elemente aus diesen Konstrukten weggelassen werden, und die Expression von Gen 1 kann dennoch von der Anwesenheit von Chromatinöffnern profitieren.
Die Selektion von Zellen, die die gezeigten Plasmide beherbergen, kann auf der Cotransfektion zum Beispiel mit einem Plasmid beruhen, das das Puromycin-Resistenz-Gen enthält. Ein zweiter Selektionsschritt kann dann die Zugabe von Zeocin zum Kulturmedium beinhalten, da das Zeocin-Resistenz-Gen mit dem interessierenden Gen (Gen 1) gekoppelt ist. Es ist auch möglich, direkt auf Zeocin zu selektieren, da das Zeocin-Resistenz-Gen über eine IRES-Sequenz mit dem interessierenden Gen (Gen 1) gekoppelt ist. Es ist auch möglich, dass die Expressionseinheit, die das Puromycin-Resistenz-Gen codiert, auf demselben Plasmid platziert wird, wie in 1 gezeigt ist. Dem Fachmann ist auch klar, dass die möglichen Kombinationen von Selektionsmarkern zahlreich sind. Ein Beispiel für ein mögliches Antibiotikum wird oben angegeben. Das eine Antibiotikum, das besonders vorteilhaft ist, ist Zeocin, da das Zeocin-Resistenz-Protein (Zeocin-R) dadurch wirkt, dass es den Wirkstoff bindet und harmlos macht. Daher ist es leicht, die Menge an Wirkstoff, die Zellen abtötet, mit einem niedrigen Niveau der Zeocin-R-Expression zu titrieren, während man die auf hohem Niveau exprimierenden überleben lässt. Alle anderen Antibiotikum-Resistenz-Proteine, die gewöhnlich verwendet werden, sind Enzyme, und somit wirken sie katalytisch (nicht 1:1 zum Wirkstoff). Wenn eine zweistufige Selektion durchgeführt wird, ist es daher vorteilhaft, ein Antibiotikum-Resistenz-Protein mit dieser 1:1-Bindungswirkungsweise zu verwenden. Daher ist das Antibiotikum Zeocin ein bevorzugter Selektionsmarker. Zweckmäßigerweise wird das Antibiotikum Zeocin in einem zweistufigen Selektionsverfahren in dem monocistronischen Gen mit Puromycin-R oder Hygromycin-R kombiniert.
Es ist weiterhin klar, dass es auch möglich ist, einen Antibiotikum-Selektionsmarker mit einem Selektionsmarker zu kombinieren, der für eine Induktion von Fluoreszenz oder für eine Farbablagerung sorgt.
Dem Fachmann ist auch klar, dass verschiedene Promotoren verwendet werden können, solange sie in der verwendeten Zelle funktionieren. Der CMV-Promotor gilt als der stärkste verfügbare Promotor, so dass er vorzugsweise für das bicistronische Gen gewählt wird, um die größtmögliche Produktausbeute zu erhalten. Weitere Beispiele für bevorzugte Promotoren sind Promotoren konstitutiver Gene, und bevorzugte Beispiele für solche Promotoren konstitutiver Gene sind die Säuger-Promotoren für EF1-α oder Ubiquitin. Durch die gute Expression und Stabilität des SV40-Promotors ist er für die Expression des monocistronischen Gens gut geeignet; genügend Selektionsmarker-Protein (zum Beispiel das Antibiotikum-Resistenz-Protein Puromycin-R in dem hier genannten Beispiel) wird hergestellt, um eine hohe Expression des Selektionsmarkers zu verleihen. Somit wird der SV40-Promotor vorzugsweise als Promotor verwendet, der die Expression des Selektionsmarkers steuert.
In einer bevorzugten Ausführungsform gibt die Erfindung ein Verfahren an, bei dem wenigstens eine der Protein-Expressionseinheiten wenigstens zwei STAR-Sequenzen umfasst. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform gibt die Erfindung ein Verfahren an, bei dem die Protein-Expressionseinheit, die wenigstens zwei STAR-Sequenzen umfasst, so angeordnet ist, dass die Protein-Expressionseinheit auf beiden Seiten von wenigstens einer STAR-Sequenz flankiert wird. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform sind die wenigstens zwei STAR-Sequenzen im Wesentlichen identisch. Im Wesentlichen identische STAR-Sequenzen sind hier definiert als STAR-Sequenzen, die in ihren wichtigen Domänen (den Domänen, die die transcriptionsstabilisierende oder -verstärkende Eigenschaft verleihen) identisch sind, die aber in ihren weniger wichtigen Domänen variieren können, zum Beispiel eine Punktmutation, Deletion oder Insertion an einer weniger wichtigen Position innerhalb der STAR-Sequenz. Vorzugsweise ergeben die im Wesentlichen identischen STAR-Sequenzen gleiche Mengen an transcriptionsstabilisierender oder -verstärkender Aktivität.
Die Verwendung von STARs zum Flankieren wenigstens einer Protein-Expressionseinheit ist einer der Aspekte der ausgewogenen und proportionalen Expressionsniveaus von zwei oder mehr Proteinen und insbesondere für die Expression der Monomere von multimeren Proteinen. Die STARs schaffen Chromatindomänen mit einem bestimmten und stabilen Transcriptionspotential. Infolgedessen fungieren Promotoren, die die Transcription von jeder bicistronischen mRNA steuern, auf bestimmten stabilen Niveaus. Eine rekombinante Wirtszelllinie, die nach dem Verfahren der Erfindung geschaffen wird und in der diese Niveaus zu geeigneten Anteilen jedes Monomers des interessierenden multimeren Proteins führen, das in hohen Ausbeuten exprimiert wird, lässt sich leicht identifizieren.
Noch ein weiteres bevorzugtes Merkmal eines Verfahrens gemäß der Erfindung ist die Einführung einer (schwachen) internen Ribosomenbindungsstelle (IRES) als Beispiel für eine Proteintranslationsstartstelle mit einer reduzierten Translationseffizienz zwischen dem offenen Leseraster des interessierenden Proteins und dem offenen Leseraster des Selektionsmarkers. Die Translation von Proteinen ausgehend von IRES-Elementen ist weniger effizient als die Cap-abhängige Translation: Die Proteinmenge ausgehend von IRES-abhängigen offenen Leserastern (ORFs) liegt im Bereich von weniger als 20% bis 50% der Menge ausgehend vom ersten ORF (Mizuguchi et al., 2000). Dadurch sind IRES-Elemente für die Produktion aller Untereinheiten eines multimeren Proteins aus einer einzigen Messenger-RNA (mRNA) nicht wünschenswert, da es nicht möglich ist, eine ausgewogene und proportionale Expression von zwei oder mehr Proteinmonomeren ausgehend von einer bicistronischen oder multicistronischen mRNA zu erreichen. Die reduzierte Effizienz der IRES-abhängigen Translation liefert jedoch den Vorteil, der von der vorliegenden Erfindung ausgenutzt wird. Weiterhin kann eine Mutation von IRES-Elementen ihre Aktivität dämpfen und die von den IRES-abhängigen ORFs ausgehende Expression auf unter 10% des ersten ORF senken (Lopez de Quinto und Martinez-Salas, 1998; Rees et al., 1996). Der von der Erfindung ausgenutzte Vorteil ist der folgende: Wenn das IRES-abhängige ORF ein Selektionsmarkerprotein codiert, bedeutet sein niedriges relatives Translationsniveau, dass hohe absolute Transcriptionsniveaus auftreten müssen, damit die rekombinante Wirtszelle selektiert wird. Daher exprimieren selektierte rekombinante Wirtszellisolate notwendigerweise große Mengen der Transgen-mRNA. Da das rekombinante Protein ausgehend von dem Cap-abhängigen ORF translatiert wird, kann es in großer Menge produziert werden, was zu hohen Produktausbeuten führt.
Dem Fachmann ist klar, dass Änderungen an dem IRES vorgenommen werden können, ohne das Wesen der Funktion des IRES zu verändern (was somit eine Proteintranslationsstartstelle mit einer reduzierten Translationseffizienz ergibt), was zu einem modifizierten IRES führt. Die Verwendung eines modifizierten IRES, das noch in der Lage ist, einen kleinen Prozentsatz an Translation zu ergeben (im Vergleich zu einer 5'-Cap-Translation), ist daher in dieser Erfindung mit eingeschlossen.
In noch einer anderen Ausführungsform gibt die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung einer Zelle, die zwei oder mehr Proteine exprimiert, oder ein Verfahren zum Identifizieren einer Zelle an, bei dem die Expression von zwei oder mehr Proteinen in einem vorbestimmten Verhältnis erfolgt, wobei jede der Protein-Expressionseinheiten auf einem getrennten DNA-Träger liegt. Die vorliegende Erfindung verwendet vorzugsweise für jedes Protein und/oder Monomer eines multimeren Proteins eine getrennte Transcriptionseinheit. In jeder Transcriptionseinheit wird das Monomer-ORF durch effiziente Cap-abhängige Translation produziert. Dieses Merkmal der Erfindung trägt dazu bei, dass rekombinante Wirtszellen isoliert werden, die hohe Ausbeuten an jedem Monomer auf Niveaus aufweisen, die ausgewogen und proportional zur Stöchiometrie des multimeren Proteins sind. Die erhöhte Vorhersagbarkeit, mit der solche rekombinanten Wirtszellen isoliert werden, führt zu einer Verbesserung der Effizienz der Suche nach solchen Isolaten um einen Faktor von zehn oder mehr. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der DNA-Träger ein Vektor (oder Plasmid; die Ausdrücke werden hier mit derselben Bedeutung verwendet). In einer anderen Ausführungsform ist der Vektor ein viraler Vektor, und in einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der virale Vektor ein adenoviraler Vektor oder ein retroviraler Vektor. Dem Fachmann ist klar, dass in einem Verfahren gemäß der Erfindung auch andere virale Vektoren verwendet werden können.
Herkömmliche Expressionssysteme sind DNA-Moleküle in Form eines rekombinanten Plasmids oder eines rekombinanten viralen Genoms. Das Plasmid oder das virale Genom wird in (Säugerwirts)Zellen eingeführt und nach in der Technik bekannten Verfahren in ihre Genome integriert. Die vorliegende Erfindung ver wendet diese Typen von DNA-Molekülen ebenfalls, um ihr verbessertes Transgen-Expressionssystem zu übertragen. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung von Plasmid-DNA zur Übertragung des Expressionssystems. Ein Plasmid enthält mehrere Komponenten: Herkömmliche Komponenten, die in der Technik bekannt sind, sind ein Replikationsstartpunkt und ein Selektionsmarker für die Vermehrung des Plasmids in Bakterienzellen; ein Selektionsmarker, der in eukaryontischen Zellen die Funktion hat, Wirtszellen, die ein integriertes Transgen-Expressionssystem tragen, zu identifizieren und zu isolieren; das interessierende Protein, dessen auf hohem Niveau erfolgende Transcription durch einen Promotor herbeigeführt wird, der in eukaryontischen Zellen funktioniert (z.B. den starken, unmittelbar-frühen Promotor/Enhancer des humanen Cytomegalievirus, pCMV (Boshart et al., 1985)); und virale Transcriptionsterminatoren (z.B. die SV40-Polyadenylierungsstelle (Kaufman und Sharp, 1982)) für das interessierende Transgen und den Selektionsmarker.
Der verwendete Vektor kann jeder Vektor sein, der zum Klonieren von DNA geeignet ist und der in einem Transcriptionssystem verwendet werden kann. Wenn Wirtszellen verwendet werden, ist der Vektor vorzugsweise entweder ein integrierender Vektor oder ein episomal replizierender Vektor. Bei einem episomal replizierenden Vektor werden Wirkungen augrund von verschiedenen Integrationsstellen des Vektors vermieden. DNA-Elemente, die den Vektor an der Integrationsstelle flankieren, können Wirkungen auf das Transcriptionsniveau des Promotors haben und dadurch Wirkungen von Fragmenten nachahmen, die DNA-Sequenzen mit einer die Gentranscription modulierenden Eigenschaft umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Vektor einen Replikationsstartpunkt aus dem Epstein-Barr-Virus (EBV), OriP, und ein Zellkernantigen (EBNA-1). Solche Vektoren können in vielen Typen von eukaryontischen Zellen replizieren und fügen sich unter geeigneten Bedingungen in Chromatin ein.
In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform gibt die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung einer Zelle, die die zwei oder mehr Proteine exprimiert, oder ein Verfahren zur Gewinnung einer Zelle an, bei dem die Expression von zwei oder mehr Proteinen in einem vorbestimmten Verhältnis erfolgt und das das Bereitstellen von zwei oder mehr Protein-Expressionseinheiten umfasst, wobei eine der Protein-Expressionseinheiten oder des bzw. der interessierenden Proteine eine schwere Kette eines Immunglobulins codiert und/oder wobei eine andere der Protein-Expressionseinheiten oder des bzw. der interessierenden Proteine eine leichte Kette eines Immunglobulins codiert. Gemäß dieser Ausführungsform wird ein multimeres Protein, ein Antikörper, erhalten. Dem Fachmann ist klar, dass es möglich ist, eine Zelle bereitzustellen, die eine schwere Kette eines Immunglobulins ausgehend von einer Protein-Expressionseinheit und eine leichte Kette eines Immunglobulins ausgehend von einer anderen Protein-Expressionseinheit exprimiert, wobei eine dritte Protein-Expressionseinheit eine sekretorische Komponente oder eine verbindende Kette codiert. Auf diese Weise wird für die Produktion von zum Beispiel sIgA und pentamerem IgM gesorgt.
In noch einer anderen Ausführungsform wird ein Verfahren gemäß der Erfindung bereitgestellt, bei dem die Protein-Expressionseinheiten gleichzeitig in die Zelle eingeführt werden.
Ein funktioneller Promotor ist vorzugsweise ein Promotor eines humanen Cytomegalievirus (CMV), ein Promotor des Simianvirus (SV40), ein humaner Ubiquitin-C-Promotor oder ein Promotor eines humanen Verlängerungsfaktors alpha (EF1-α).
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Protein-Expressionseinheit bereit, die Folgendes umfasst:

– ein bicistronisches Gen, das ein offenes Leseraster, welches ein interessierendes Protein codiert, eine Proteintranslations-Startstelle mit einer reduzierten Translationseffizienz und einen Selektionsmarker umfasst und bei dem das bicistronische Gen unter der Kontrolle eines funktionellen Promotors steht; und
– wenigstens einen Chromatinöffner; und
– wenigstens eine STAR-Sequenz und/oder
– wenigstens zwei TRAP-Sequenzen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die Protein-Expressionseinheit einen Chromatinöffner und wenigstens zwei STAR-Sequenzen, die vorzugsweise so angeordnet sind, dass die Protein-Expressionseinheit auf beiden Seiten von wenigstens einer STAR-Sequenz flankiert wird. Beispiele für eine solche Protein-Expressionseinheit sind im experimentellen Teil dieser Patentanmeldung angegeben.
In einer anderen Ausführungsform umfasst die Protein-Expressionseinheit gemäß der Erfindung STAR-Sequenzen, wobei die STAR-Sequenzen im Wesentlichen identisch sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung eine Protein-Expressionseinheit bereit, die Folgendes umfasst:

– ein bicistronisches Gen, das ein offenes Leseraster, welches ein interessierendes Protein codiert, eine Proteintranslations-Startstelle mit einer reduzierten Translationseffizienz und einen Selektionsmarker umfasst und bei dem das bicistronische Gen unter der Kontrolle eines funktionellen Promotors steht;
– wenigstens eine STAR-Sequenz, wobei sie gegebenenfalls mit einer monocistronischen Gencassette versehen ist, wobei die STAR-Sequenz in Tabelle 1 gezeigt ist, und/oder ein funktionelles Äquivalent und/oder ein funktionelles Fragment davon;
– wenigstens zwei TRAP-Sequenzen, die so positioniert sind, dass sie die STAR-Elemente flankieren, wobei die TRAP-Sequenzen in Tabelle 2 gezeigt sind.

In einer anderen Ausführungsform wird eine Protein-Expressionseinheit gemäß der Erfindung bereitgestellt, wobei die Proteintranslations-Startstelle mit der reduzierten Translationseffizienz eine interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES) umfasst. Besonders bevorzugt wird ein modifiziertes, z.B. schwächeres, IRES verwendet.
In noch einer anderen Ausführungsform wird eine Protein-Expressionseinheit gemäß der Erfindung bereitgestellt, wobei die Protein-Expressionseinheit ein Vektor ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der DNA-Träger ein Vektor (oder Plasmid; die Ausdrücke werden hier mit gleicher Bedeutung verwendet). In einer anderen Ausführungsform ist der Vektor ein viraler Vektor, und in einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der virale Vektor ein adenoviraler Vektor oder ein retroviraler Vektor. Dem Fachmann ist klar, dass in einem Verfahren gemäß der Erfindung auch andere virale Vektoren verwendet werden können.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Protein-Expressionseinheit gemäß der Erfindung bereitgestellt, wobei das interessierende Protein eine schwere Kette eines Immunglobulins ist. In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird eine Protein-Expressionseinheit gemäß der Erfindung bereitgestellt, wobei das interessierende Protein eine leichte Kette eines Immunglobulins ist. Wenn diese beiden Protein-Expressionseinheiten innerhalb derselben (Wirts)Zelle vorhanden sind, wird ein multimeres Protein und insbesondere ein Antikörper zusammengesetzt.
Die Erfindung umfasst eine Zelle, die mit einer Protein-Expressionseinheit versehen ist, welche einen Chromatinöffner und ein STAR-Element umfasst. Die Erfindung umfasst auch eine (Wirts)Zelle, die wenigstens eine Protein-Expressionseinheit gemäß der Erfindung umfasst. Eine solche (Wirts)Zelle wird dann zum Beispiel für im großen Maßstab durchgeführte Produktionsverfahren verwendet. Die Erfindung umfasst auch eine Zelle, die nach einem der hier beschriebenen Verfahren erhältlich ist. Die Erfindung umfasst weiterhin ein Protein, das aus der Zelle erhältlich ist (zum Beispiel durch den Vorgang der Proteinreinigung). Vorzugsweise ist das Protein ein multimeres Protein, und besonders bevorzugt ist das multimere Protein ein Antikörper. Ein solcher Antikörper kann in pharmazeutischen und/oder diagnostischen Anwendungen verwendet werden.
Die obige Diskussion und die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung aufgeführt und sollen den Umfang der hier beanspruchten Erfindung nicht einschränken. Sie geben einfach einige der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung an. Modifikationen und Variationen, die dem Fachmann einfallen können, fallen in den Umfang dieser Erfindung. Verschiedene andere Ausführungsformen gelten für die vorliegende Erfindung, einschließlich: andere Selektionsmarker-Gene; andere IRES-Elemente oder Mittel zur Dämpfung der IRES-Aktivität; andere Elemente, die die Transcription beeinflussen, einschließlich Promotoren, Enhancern, Introns, Terminatoren und Polyadenylierungsstellen; andere Reihenfolgen und/oder Orientierungen der monocistronischen und bicistronischen Gene; andere Anti-Repressor-Elemente oder Teile, Derivate und/oder Analoga davon; andere Anti-Repressor-Elemente oder Teile, Derivate und/oder Analoga davon; andere Vektorsysteme zur Übertragung der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle auf eukaryontische Wirtszellen; und Anwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens auf andere transgene Systeme.
Beispiele
Beispiel 1: Expression von LexA-HAT und LexA-Brahma und Brahma-Proteinen in CHO-Zellen
Ein Ziel dieser Erfindung besteht darin, Chromatinöffner anzuwenden, um die Vorhersagbarkeit, die Ausbeute und die Stabilität von Transgenen in Säugerzelllinien zu verbessern. Hier führen wir mehrere Chromatinöffner in CHO-Zellen ein, und wir beschreiben die Konstruktion der verschiedenen Öffnerkonstrukte.
Materialien und Verfahren
Plasmide
Die Konstruktion des pPlug&Play-d2EGFP-ires-Zeo(PP)-Vektors wird im Folgenden beschrieben. Das Plasmid pd2EGFP (Clontech 6010-1) wird durch Einsetzen eines Linkers an der BsiWI-Stelle modifiziert, was pd2EGFP-link ergibt. Der Linker (hergestellt durch Assoziieren der Oligonucleotide GTACGGATATCAGATCTTTAATTAAG und GTACCTTAATTAAAGATCTGATAT) führt Stellen für die Restriktionsendonucleasen PacI, BglII und EcoRV ein. Dadurch entsteht die mehrfache Klonierungsstelle MCSII für die Insertion von STAR-Elementen. Dann werden die Primer GATCAGATCTGGCGCGCCATTTAAATCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGG und AGGCGGATCCGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGG verwendet, um einen Bereich von 0,37 kb aus pd2EGFP zu amplifizieren, der in die BglII-Stelle von pIRES (Clontech 6028-1) inseriert wird, wobei pIRES-stuf entsteht. Dadurch werden Stellen für die Restriktionsendonucleasen AscI und SwaI am MCSI eingeführt; dies wirkt als "Ausstopffragment", um eine potentielle Störung zwischen STAR-Elementen und benachbarten Promotoren zu vermeiden. pIRES-stuf wird mit BglII und FspI verdaut, wobei ein DNA-Fragment freigesetzt wird, das aus dem Ausstopffragment, dem CMV-Promotor, dem IRES-Element (flankiert durch die mehrfachen Klonierungsstellen MCS A und MCS B) und dem SV40-Polyadenylierungssignal besteht. Dieses Fragment wird mit dem Vektorgerüst von pd2EGFP-link, das durch Verdau mit BamHI und StuI erzeugt wurde, ligiert, was pd2IRES-link ergibt.
Die offenen Leseraster der Zeocin-Resistenz-Gene werden wie folgt in die BamHI/NotI-Stellen von MCS B in pd2IRES-link eingesetzt: das Zeocin-Resistenz-ORF wird durch PCR mit den Primern GATCGGATCCTTCGAAATGGCCAAGTTGACCAGTGC und AGGCGCGGCCGCAATTCTCAGTCCTGCTCCTC ausgehend von dem Plasmid pEM7/zeo amplifiziert, mit BamHI und NotI verdaut und mit BamHI/NotI-verdautem pd2IRES-link ligiert, was pd2IRES-Iink-zeo ergibt.
Der SEAP-Reporter ORF wird durch PCR-Amplifikation von pSEAP2-basic mit den Primern GATCGAATTCTCGCGACTTCGCCCACCATGC und AGGCGAATTCACCGGTGTTTAAACTCATGTCTGCTCGAAGCGGCCGG und Insertion der EcoRI-verdauten SEAP-Cassette in die EcoRI-Stellen in MCS A der Plasmide pd2IRES-Iink-zeo in pd2IRES-Iink-zeo eingeführt (was das Plasmid PP2 ergibt). PP2 wird mit EcoRI und MluI geschnitten, um das SEAP-Gen zu entfernen, und p2EGFP wird mit den Primern GATCGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG und AGGCACGCGTGTTAACCTACACATTGATCCTAGCAGAAGC eingeführt. Dieser Vektor wird als Basisvektor verwendet, um PP-LexA (PPL), PP-LexA-Brm (PPLBrm), PP-LexA-PCAF (PPLPCAF), PP-LexA-p300HAT (PPLp300) und PP-LexA-Ash1HMTase (PPLHuAsh1) aufzubauen.
Die Brm-codierende Sequenz wird durch PCR ausgehend von dem Plasmid pSVhSNF-α (Chiba et al., 1994) unter Verwendung der Primer Brm-a1F-H3-AgeI (GATCAAGCTTACCGGTATGTCCACGCCCACAGACCCTGGTGC) und Brm-a1572R-XbaI (AGGCTCTAGAATCACTCATCATCCGTCCCACTTCCTTC) amplifiziert und unter Verwendung von HindIII und XbaI in pPur (BD Biosciences Nr. 6156-1) kloniert, wobei pPur-Brm entstand. LexA-Bindungsstellen (LBS) werden ausgehend von dem Plasmid pREP4-HSF-Luc+ (van der Vlag et al., 2000) unter Verwendung der Primer LBS-for-SalI (AGGCGTCGACGTTTCGACTCCCAAGCTTTG) und LBS-rev-AscI (GATCGGCGCGCCGGTACCATAGCGGCCGCGAC) amplifiziert und unter Verwendung von SalI und AscI stromaufwärts des CMV-Promotors in PP kloniert, wobei PPLbs entstand. LexA wird ausgehend von dem Plasmid pEG202 (Bennetzen und Hall, 1982) unter Verwendung der Primer LexA-for-H3 (GATCAAGCTTATGAAGACGTTAACGGCCAGGC) und LexA-rev-AgeI (AGGCACCGGTCAGCCAGTCGCCGTTGCGAATAACC) amplifiziert und unter Verwendung von HindIII und AgeI stromabwärts des SV40-Promotors in das Plasmid pPur kloniert, wobei pPur-LexA entstand. Die Oligonucleotide Link-for-Bsu (GATCTCCCCTGAGGAAGTGCACAACCTGAGGCC) und Link-rev-Bsu (GATCTGGCCTCAGGTTGTGCACTTCCTCAGGGG) werden in die BamHI-Stelle von pPur-LexA ligiert, wobei pPur-LexA-linker entsteht.
Der Kontrollvektor PPlbs-lexA (PPL) wird geschaffen, indem man die purocodierende Sequenz aus pPur-LexA unter Verwendung von AgeI und XbaI entfernt und anschließend die LexA-Cassette (ApaLI × EcoRI, Enden glatt gemacht) in die EcoRV-Stelle von PPlbs überführt. Das PCR-Produkt Brm (Primer Brm-a1F-H3-AgeI und Brm-a1572R-XbaI) wird unter Verwendung von AgeI und XbaI in pPur-LexA kloniert, wobei pPur-LexA-Brm entsteht. Die P/CAF-codierende Sequenz wird durch PCR aus dem Plasmid pCX-P/CAF (Martinez-Balbás et al., 2000) unter Verwendung der Primer PCAF-a1F-h3-AgeI (GATCAAGCTTACCGGTATGTCCGAGGCTGGCGGGGCCG) und PCAF-a833R-XbaI (AGGCTCTAGAATCACTTGTCAATTAATCCAGCTTCC) amplifiziert und unter Verwendung von AgeI und XbaI in pPur-LexA-linker kloniert, wobei pPur-LexA-PCAF entsteht.
Die LexA-Brm-Cassette wird unter Verwendung von ApaLI und EcoRI aus pPur-LexA-Brm geschnitten und mit glatten Enden in die EcoRV-Stelle von PPLbs eingefügt, wobei PPLBrm entsteht. P/CAF wird aus pPur-LexA-PCAF geschnitten und unter Verwendung von AgeI und ApaLI/PacI in PPLBrm kloniert, wobei PPLPCAF entsteht. Die HAT-Domäne von humanem p300 wird durch PCR ausgehend von dem Plasmid pCMVβ-p300 (Martinez-Balbás et al., 2000) unter Verwendung der Primer p300-a934F-AgeI (GATCACCGGTCAGCCTGCAACTCCACTTCCCAGCC) und p300-a1652R-NheI (AGGCGCTAGCCTACATGGT GGACCACTGGGCTCTTCGG) amplifiziert und unter Verwendung von AgeI und NheI/XbaI in PPLBrm kloniert, wobei PPLp300 entsteht (1A). Die HMTase-Domäne von humanem Ash1 wird durch PCR unter Verwendung der Primer HuAsh1,aa1787-For (GATCACCGGTACAAGCAGCTGTTCCCCCCATCATATC) und HuAsh1,aa2393-Rev (AGGCGCTAGCTCATAATGATGCTGAGTGAATATTATCAC) amplifiziert und in AgeI- und NheI-verdautes PPLBrm kloniert, wobei PPLHuAsh1 entsteht.
5'-STARs werden in die SalI-Stelle der verschiedenen PPL-Konstrukte kloniert. 3'-STARs werden entweder in die PacI-Stelle (PPL, PPLBrm und PPLp300) oder die Bsu36I-Stelle (PPLPCAF) kloniert.
Transfektion und Kultur von CHO-Zellen
Die CHO-Zelllinie CHO-K1 (ATCC CCL-61) wird bei 37 °C/5% CO₂ in HAMS-F12-Medium + 10% fetales Kälberserum, das 2 mM Glutamin, 100 E/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin enthält, kultiviert. Die Zellen werden mit den Plasmiden transfiziert, wobei man SuperFect (QIAGEN) gemäß der Beschreibung durch den Hersteller verwendet. Kurz gesagt, Zellen werden in Kulturgefäßen ausgesät und über Nacht bis 70-90% Konfluenz wachsen gelassen. SuperFect-Reagens wird in einem Verhältnis von 6 μl/μg (z.B. für eine 10-cm-Petri-Schale 20 μg DNA und 120 μl SuperFect) mit Plasmid-DNA kombiniert und zu den Zellen gegeben. Nach Inkubation über Nacht wird das Transfektionsgemisch durch frisches Medium ersetzt, und die transfizierten Zellen werden weiter inkubiert. Nach Kultivierung über Nacht werden die Zellen trypsinisiert und in frischen Kulturgefäßen mit frischem Medium ausgesät. Nach einer weiteren Inkubation über Nacht wird Zeocin bis zu einer Konzentration von 50 μg/ml hinzugefügt, und die Zellen werden weiter kultiviert. Nach weiteren drei Tagen wird das Medium durch frisches Medium, das Zeocin enthält (100 μg/ml), ersetzt und weiter kultiviert. Wenn einzelne Kolonien sichtbar werden (ungefähr zehn Tage nach der Transfektion), wird das Medium entfernt und durch frisches Medium ohne Zeocin ersetzt. Einzelne Klone werden isoliert und auf 24-Napf-Platten in Medium ohne Zeocin übergeführt. Einen Tag nach der Isolierung der Kolonien wird Zeocin zu dem Medium gegeben. Die Expression des GFP-Reporter-Gens wird ungefähr 3 Wochen nach der Transfektion bewertet.
Beispiel 2: Chromatinöffner verbessern das Niveau der Transgen-Expression
Ein Ziel dieser Erfindung besteht darin, sowohl die Vorhersagbarkeit als auch die Niveaus der Transgen-Expression für die heterologe Proteinproduktion zu verbessern und somit die Ausbeute des heterologen Proteins zu erhöhen und die Zahl der Kolonien, die analysiert werden müssen, um eine produktivere Kolonie zu erhalten, zu reduzieren.
Materialien und Verfahren
Das getestete Konstrukt besteht aus einem bicistronischen Gen mit dem GFP-Gen, einem IRES und dem Zeocin-Resistenz-Gen unter der Kontrolle des CMV-Promotors und einem monocistronischen Gen, das LexA-P/CAF unter der Kontrolle des SV40-Promotors codiert, aber keine STAR-Elemente, um das gesamte Konstrukt zu flankieren. Das Konstrukt wird wie in Beispiel 1 durch Transfektion auf CHO-K1-Zellen übertragen. Stabile Kolonien werden expandiert, bevor das GFP-Signal mit einem XL-MCL-Beckman-Coulter-Durchflusscytometer bestimmt wird. Der Mittelwert des GFP-Signals wird als Maß für das Niveau der GFP-Expression genommen und ist in 2 aufgetragen. Die Ergebnisse werden mit Kolonien verglichen, die mit einem Konstrukt, das kein LexA-P/CAF-Gen enthält (Kontrolle), und einem Konstrukt, das sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende mit STAR-40-Elementen flankiert (STAR40-abgeschirmt) ist, aber kein LexA-P/CAF enthält, transfiziert werden.
Ergebnisse
2 zeigt, dass die Lenkung von LexA-P/CAF zu LexA-Bindungsstellen stromaufwärts des CMV-Promotors zu mehreren CHO-Kolonien führt, die GFP-Protein auf signifikant höherem Niveau exprimieren als die "leere" Kontrolle ohne LexA-P/CAF. Das GFP-Signal in den Kolonien mit den höchsten Signalen ist vergleichbar mit dem höchsten GFP-Signal, das bei einem Konstrukt erhalten wird, das flankierende STAR40-Elemente, aber kein LexA-P/CAF aufweist. Ähnlich der Verteilung der GFP-Signale unter den verschiedenen Kolonien exprimieren die meisten Kolonien GFP nicht oder nur auf einem niedrigen Niveau. Dies deutet darauf hin, dass die Vorhersagbarkeit der Proteinexpression im Vergleich zu dem "leeren" Kontrollkonstrukt nicht signifikant geändert wird. Im Vergleich zu den GFP-Signalen in Kolonien, die mit einem STAR-abgeschirmten Konstrukt transfiziert sind, verleihen diese STAR-Elemente einen höheren Grad der Vorhersagbarkeit. Das höchste GFP-Expressionsniveau in STAR-abgeschirmten Kolonien liegt in derselben Größenordnung wie das GFP-Expressionsniveau in LexA-P/CAF-Kolonien. Es gibt jedoch erheblich mehr STAR-abgeschirmte Kolonien, die ein hohes GFP-Expressionsniveau zeigen. Es wird daher geschlossen, dass der LexA-P/CAF-Öffner einem Transgen höhere Expressionsniveaus verleihen kann, aber dass sie keine bessere Vorhersagbarkeit der Transgen-Expression verleihen. Eine bessere Vorhersagbarkeit wird besser erreicht, wenn STAR-Elemente zu einem Konstrukt gegeben werden.
Beispiel 3: Die Kombination von Chromatinöffnern und STAR-Elementen verbessert die Vorhersagbarkeit und die Ausbeuten der Transgen-Expression
Öffner werden mit STAR-Elementen kombiniert, wie es in 1 beschrieben ist, und getestet werden die Vorhersagbarkeit und die Ausbeute der Transgen-Expression bei stabil transfizierten individuellen Kolonien.
Materialien und Verfahren
Das getestete Konstrukt besteht aus einem bicistronischen Gen mit dem GFP-Gen, einem IRES und dem Zeocin-Resistenz-Gen unter der Kontrolle des CMV-Promotors und einem monocistronischen Gen, das LexA-P/CAF unter der Kontrolle des SV40-Promotors codiert. Das gesamte Konstrukt ist von STAR 40 flankiert (1A). Das Konstrukt wird wie in Beispiel 1 durch Transfektion auf CHO-K1-Zellen übertragen. Stabile Kolonien werden expandiert, bevor das GFP-Signal mit einem XL-MCL-Beckman-Coulter-Durchflusscytometer bestimmt wird. Der Mittelwert des GFP-Signals wird als Maß für das Niveau der GFP-Expression genommen und ist in 3 aufgetragen. Die Ergebnisse werden mit Kolonien verglichen, die mit einem Konstrukt, das kein LexA-P/CAF-Gen und keine STAR-Elemente enthält ("leere" Kontrolle), und einem Konstrukt, das kein LexA-P/CAF-Gen enthält, aber sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende mit STAR 40 flankiert ist, transfiziert werden.
Ergebnisse
3 zeigt, dass das Konstrukt, in dem LexA-P/CAF zu dem CMV-Promotor gelenkt wird und das von STAR-Elementen flankiert ist, hohe GFP-Expressionsniveaus verleiht. Das höchste GFP-Expressionsniveau ist mehr als dreimal so hoch wie die höchsten Niveaus in der "leeren" Kontrolle. Außerdem findet man in verschiedenen Kolonien einen hohen Grad der Vorhersagbarkeit von GFP-Expressionsniveaus. Im Gegensatz zu Kolonien, die ein Konstrukt mit LexA-P/CAF allein exprimieren (2), weisen mehr Kolonien, die das Konstrukt mit LexA-P/CAF und STAR-Elementen enthalten, ein hohes Niveau der GFP-Expression auf. Es wird daher geschlossen, dass die Kombination von STAR-Elementen und einem Öffner sowohl hohe Proteinexpressionsniveaus als auch einen hohen Grad der Vorhersagbarkeit der Expression verleiht.
Beispiel 4: Die Stabilität der Transgen-Expression wird durch Anwendung von Chromatinöffnern und STARs in Expressionssystemen verbessert.
Während der Kultivierung von rekombinanten Wirtszellen ist es übliche Praxis, eine Antibiotikum-Selektion aufrechtzuerhalten. Dadurch soll die transcriptionale Stummschaltung des Transgens oder ein Verlust des Transgens aus dem Genom durch Vorgänge wie Rekombination verhindert werden. Für die Produktion von Proteinen ist dies jedoch aus mehreren Gründen unerwünscht. Erstens sind die Antibiotika, die verwendet werden, sehr teuer und tragen erheblich zu den Stückkosten des Produkts bei. Zweitens muss das Protein zur biopharmazeutischen Verwendung nachweisbar rein sein, ohne Spuren des Antibiotikums in dem Produkt. Ein Vorteil von STAR-Elementen für die heterologe Proteinproduktion besteht darin, dass sie Transgenen während der längeren Kultivierung eine stabile Expression verleihen, auch in Abwesenheit einer Antibiotikum-Selektion; diese Eigenschaft wird in diesem Beispiel nachgewiesen und ist in 5 gezeigt.
Materialien und Verfahren
Nach einer Woche werden die GFP-Expressionsniveaus in den Kolonien gemessen, die in Beispiel 2 und 3 beschrieben sind. Nach den ersten drei Wochen nach der Transfektion, wenn die ersten GFP-Messungen durchgeführt wurden, wurden die Kolonien in Medium ohne Zeocin oder andere Antibiotika kultiviert. Dies wurde während des restlichen Experiments fortgesetzt.
Ergebnisse
4 zeigt die Daten zur GFP-Expression von Kolonien, die stabil mit dem Konstrukt transfiziert sind, in dem LexA-P/CAF zum CMV-Promotor gelenkt wird und das von STAR-Elementen flankiert ist. Die Kolonien mit den höchsten GFP-Expressionsniveaus in 3 werden für die Analyse der Stabilität der Expression mit der Zeit in Abwesenheit von Selektionsdruck durch Antibiotika ausgewählt. Die Expression des Reporter-GFP-Proteins bleibt in den CHO-Zellen über drei Zeitpunkte hinweg stabil. Der erste Zeitpunkt stellt den Beginn des Experiments dar, wenn der Selektionsdruck weggenommen wird. Messungen werden nach einer, zwei und drei Wochen durchgeführt, was ungefähr 10, 20 bzw. 30 Zellzyklen bedeutet. Kolonien, die das STAR 40 und LexA-P/CAF enthalten, sind in Abwesenheit von Antibiotika stabil, aber Kolonien, die nur das LexA-P/CAF enthalten, sind in Abwesenheit von Antibiotika nicht stabil. Dies beweist, dass die Anwendung einer Kombination von Öffnern und STAR-Elementen Transgene vor einer Stummschaltung während einer längeren Kultivierung schützt. Dies beweist auch, dass diese Eigenschaft von der Antibiotikum-Selektion unabhängig ist.
Beispiel 5: Der p300HAT-Chromatinöffner hat keine Wirkung auf die transiente Genexpression, die durch den CMV- und den UB6-Promotor gesteuert wird, hat aber eine Wirkung auf einen Minimalpromotor.
Die Natur der Wirkungen von Öffnern auf die Genexpression wird untersucht. Eine mögliche Wirkungsweise besteht darin, dass die Öffner transient auf Promotoren wirken und dass diese Wirkung anschließend auf stabile Klone übertragen wird. Daher testeten wir die Wirkungen von mehreren Öffnern auf transiente Expressionsniveaus. Die verwendeten Promotoren sind die starken CMV- und UB6-Promotoren sowie der SV40-Minimalpromotor.
Materialien und Verfahren
Plasmide
Die Reporterkonstrukte bestehen aus dem DsRED-Gen unter der Kontrolle entweder des CMV-, des UB6- oder des SV40-Minimalpromotors. Stromaufwärts von diesen Promotoren befinden sich LexA-Bindungsstellen. LexA-Bindungsstellen (LBS) werden ausgehend von dem Plasmid pREP4-HSF-Luc+ (van der Vlag et al., 2000) unter Verwendung der Primer LBS-for-SalI (AGGCGTCGACGTTTCGACTCCCAAGCTTTG) und LBS-rev-AscI (GATCGGCGCGCCGGTACCATAGCGGCCGCGAC) amplifiziert und unter Verwendung von SalI und AscI stromauf wärts der Promotoren in PP kloniert. Ein weiteres Konstrukt enthält ein Gen, das einen Teil des p300-Gens codiert, welches die Histon-Acetyltransferase-Domäne (HAT) codiert. Die HAT-Domäne von humanem p300 wird durch PCR ausgehend von dem Plasmid pCMVβ-p300 (Martinez-Balbás et al., 2000) unter Verwendung der Primer p300-a934F-AgeI (GATCACCGGTCAGCCTGCAACTCCACTTTCCCAGCC) und p300-a1652R-NheI (AGGCGCTAGCCTACATGGTGGACCACTGGGCTCTTCGG) amplifiziert und unter Verwendung von AgeI und NheI/XbaI kloniert, wobei PPLp300HAT entsteht. Die p300HAT-Domäne wird in demselben Leseraster mit dem LexA-Protein kloniert, und die gesamte Cassette wird unter die Kontrolle des SV40-Promotors gestellt.
Transfektion und Kultur von CHO-Zellen
Die CHO-Zelllinie CHO-K1 (ATCC CCL-61) wird bei 37 °C/5% CO₂ in HAMS-F12-Medium + 10% fetales Kälberserum, das 2 mM Glutamin, 100 E/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin enthält, kultiviert. Die Zellen werden unter Verwendung von Lipofectamine 2000 (Invitrogen) gemäß der Beschreibung durch den Hersteller transfiziert. Das DsRED-Reporter-Gen mit den verschiedenen Promotoren wird entweder allein oder in Kombination mit dem SV40-p300HAT-Konstrukt für die Transfektion verwendet. Transfizierte Zellen werden in Kulturgefäßen ausgesät und über Nacht bis 70-90% Konfluenz wachsen gelassen. Lipofectamine-Reagens wird in einem Verhältnis von 7,5 μl pro 3 μg mit Plasmid-DNA kombiniert und nach 30 Minuten Inkubation bei 25 °C zu den Zellen gegeben. Nach 6 Stunden Inkubation wird das Transfektionsgemisch durch frisches Medium ersetzt, und die transfizierten Zellen werden weiter inkubiert. 24 Stunden nach der Transfektion wird das DsRED-Signal mit einem XL-MCL-Beckman-Coulter-Durchflusscytometer bestimmt. Der Mittelwert des DsRED-Signals wird als Maß für das Niveau der DsRED-Expression genommen und ist in 5 aufgetragen.
Ergebnisse
5 zeigt, dass die Lenkung von LexA-P300HAT zu LexA-Bindungsstellen stromaufwärts des CMV oder des UB6-Promotors nicht zu einer Erhöhung der DsRED-Expression führt. Wenn das Lex-P300HAT jedoch mit dem Plasmid, das das vom SV40-Minimalpromotor gesteuerte DsRED-Gen enthält, exprimiert wird, wird eine Erhöhung von 400% beobachtet. Das Lex-P300HAT verstärkt also nicht die transienten Expressionsniveaus der CMV- und UB6-gesteuerten Genexpression, sondern nur von einem Minimalpromotor, in diesem Fall dem SV40-Minimalpromotor.
Beispiel 6: Der p300HAT-Öffner verbessert das Niveau der CMV-gesteuerten Expression in stabil transfizierten Klonen, aber nur während eines begrenzten Zeitraums.
Während der Kultivierung von rekombinanten Wirtszellen ist es übliche Praxis, eine Antibiotikum-Selektion aufrechtzuerhalten. Dadurch soll die transcriptionale Stummschaltung des Transgens oder ein Verlust des Transgens aus dem Genom durch Vorgänge wie Rekombination verhindert werden. Für die Produktion von Proteinen ist dies jedoch aus mehreren Gründen unerwünscht. Erstens sind die Antibiotika, die verwendet werden, sehr teuer und tragen erheblich zu den Stückkosten des Produkts bei. Zweitens muss das Protein zur biopharmazeutischen Verwendung nachweisbar rein sein, ohne Spuren des Antibiotikums in dem Produkt. In diesem Beispiel testen wir, ob der P300HAT-Öffner die Stabilität der Genexpression über einen längeren Zeitraum hinweg induzieren. kann.
Materialien und Verfahren
Plasmide
In diesem Experiment werden zwei Plasmide miteinander verglichen: der CMV-d2EGFP-ires-Zeo-Vektor (CMV-Kontrolle) und das CMV-d2EGFP-ires-Zeo--LexA-P300HAT (CMV-p300HAT) (6). Das offene Leseraster des Zeocin-Resistenz-Gens wird wie folgt in BamHI/NotI-Stellen stromabwärts des pIRES inseriert: Das Zeocin-Resistenz-ORF wird durch PCR mit den Primern GATCGGATCCTTCGA AATGGCCAAGTTGACCAGTGC und AGGCGCGGCCGCAATTCTCAGTCCTGCTCCTC ausgehend von dem Plasmid pEM7/zeo amplifiziert, mit BamHI und NotI verdaut und mit BamHI/NotI-verdautem pIRES-link ligiert, was pIRES-Iink-zeo ergibt. Das d2EGFP-Reporter-ORF wurde durch Amplifikation von (Clontech 6010-1) mit den Primern GATCGAATTCTCGCGAATGGTGAGCAAGCAGATCCTGAAG und AGGCGAATTCACCGGTGTTTAAACTTACACCCACTCGTGCAGGCTGCCCAGG und Insertion der EcoRI-verdauten d2EGFP-Cassette in die EcoRI-Stelle im pIRES-link-zeo-Plasmid in pIRES-Iink-zeo eingeführt. Dadurch entstand die CMV-Kontrolle (CMV-d2EGFP-IRES-Zeo).
Die Wirkung des LexA-P300HAT auf die Genexpression wird mit einem Plasmid bestimmt, das sich erheblich von den Plasmiden in 1A unterscheidet. In 1A wird die SV40-Lex-Öffnereinheit stromabwärts von der anderen Expressionseinheit, die das CMV-gesteuerte GFP-Reporter-Gen umfasst, platziert. Die Transcription der beiden Einheiten erfolgt dann in derselben Richtung. In dem neuen Plasmid (6) wird die Transcription des CMV-gesteuerten d2EGFP-Reporter-Gens von der Transcription des SV40-gesteuerten LexA-P300HAT-Öffners weg geleitet. In dieser Konfiguration befinden sich der CMV- und der SV40-Promotor in großer Nähe zueinander. Zwischen diesen beiden Promotoren werden LexA-Bindungsstellen kloniert. Damit beeinflusst das LexA-P300HAT den Expressionsstatus sowohl des CMV-gesteuerten Reporter-Gens als auch des SV40-gesteuerten Öffners. LexA-Bindungsstellen (LBS) werden ausgehend von dem Plasmid pREP4-HSF-Luc+ (van der Vlag et al., 2000) unter Verwendung der Primer AGGCGTCGACGTTTCGACTCCCAAGCTTTG und GATCGGCGCGCCGGTACCATAGCGGCCGCGAC amplifiziert und unter Verwendung von SalI und AscI zwischen dem CMV- und dem SV40-Promotor in PP kloniert.
LexA wird ausgehend von dem Plasmid pEG202 (Bennetzen und Hall, 1982) unter Verwendung der Primer GATCAAGCTTATGAAGACGTTAACGGCCAGGC und AGGCACCGGTCAGCCAGTCGCCGTTGCGAATAACC amplifiziert und unter Verwendung von HindIII und AgeI stromabwärts des SV40-Promotors in das Plasmid pPur kloniert, wobei pPur-LexA entstand. Die Oligonucleotide GATCTCCCCTGAGGAAGTGCACAACCTGAGGCC und GATCTGGCCTCAGGTTGTGCACTTCCTCAGGGG werden in die BamHI-Stelle von pPur-LexA ligiert, wobei pPur-LexA-linker entsteht. Die HAT-Domäne von humanem p300 (Aminosäuren 934-1652) wird durch PCR ausgehend von dem Plasmid pCMVβ-p300 (Martinez-Balbás et al., 2000) unter Verwendung der Primer GATCACCGGTCAGCCTGCAACTCCACTTTCCCAGCC und AGGCGCTAGCCTACATGGTGGACCACTGGGCTCTTCGG amplifiziert und unter Verwendung von AgeI und NheI/XbaI in pPur-LexA-linker kloniert, wobei pPur-LexA-P300-HAT entsteht. Die gesamte SV40-LexA-P300-NAT-Transcriptionseinheit wird stromabwärts der LexA-Bindungsstellen kloniert, wobei -CMV-d2EGFP-ires-Zeo--LexA-P300HAT (CMV-p300HAT) entsteht (6).
Transfektion und Kultur von CHO-Zellen
Die CHO-Zelllinie CHO-K1 (ATCC CCL-61) wird bei 37 °C/5% CO₂ in HAMS-F12-Medium + 10% fetales Kälberserum, das 2 mM Glutamin, 100 E/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin enthält, kultiviert. Die Zellen werden unter Verwendung von Lipofectamine 2000 (Invitrogen) gemäß der Beschreibung durch den Hersteller transfiziert. Kurz gesagt, Zellen werden in Kulturgefäßen ausgesät und über Nacht bis 70-90% Konfluenz wachsen gelassen. Lipofectamine-Reagens wird in einem Verhältnis von 7,5 μl pro 3 μg mit Plasmid-DNA kombiniert und nach 30 Minuten Inkubation bei 25 °C zu den Zellen gegeben. Nach 6 Stunden Inkubation wird das Transfektionsgemisch durch frisches Medium ersetzt, und die transfizierten Zellen werden weiter inkubiert. Nach Inkubation über Nacht werden die Zellen trypsinisiert und in Verdünnungsreihen in frische Petri-Schalen mit frischem Medium, zu dem Zeocin bis zu einer Konzentration von 100 μg/ml gegeben wurde, ausgesät, und die Zellen werden weiter kultiviert. Wenn einzelne Kolonien sichtbar werden (ungefähr zehn bis vierzehn Tage nach der Transfektion), werden individuelle Klone isoliert und auf 24-Napf-Platten in Medium, das Zeocin enthält, übergeführt. Die Expression des d2EGFP-Reporter-Gens wird ungefähr vier Wochen nach der Transfektion bewertet. Nach diesen ersten Messungen werden die Zellen anschließend in Medium ohne Selektionsmittel (Zeocin) kultiviert. Die Expression des d2EGFP-Reporter-Gens wird zu verschiedenen Zeitpunkten bis zu 120 Tagen nach der Transfektion bewertet.
Ergebnisse
6 zeigt, dass die Lenkung von LexA-P300HAT zu LexA-Bindungsstellen stromaufwärts des CMV-Promotors zu mehreren CHO-Kolonien führt, die im Vergleich zu der "leeren" Kontrolle ohne LexA-P300HAT geringfügig höhere Niveaus von d2EGFP-Protein exprimieren. Der Durchschnitt des d2EGFP-Signals in den 11 Kolonien, die mit dem CMV-Kontrollplasmid transfiziert wurden, beträgt 109, wenn 30 Tage nach der Transfektion gemessen wird. Zum Vergleich beträgt der Durchschnitt des d2EGFP-Signals in den 15 Kolonien, die mit dem CMV-p300HAT-Plasmid transfiziert wurden, 158, wenn 30 Tage nach der Transfektion gemessen wird. Wenn sie jedoch längere Zeit verfolgt wurden, fielen die Expressionsniveaus beider Plasmide ab. Der Durchschnitt des d2EGFP-Signals in den 11 Kolonien, die mit dem CMV-Kontrollplasmid transfiziert wurden, beträgt 28, wenn 120 Tage nach der Transfektion gemessen wird. Der Durchschnitt des d2EGFP-Signals in den 15 Kolonien, die mit dem CMV-p300HAT-Plasmid transfiziert wurden, beträgt 70, wenn 120 Tage nach der Transfektion gemessen wird. Somit fiel das Expressionsniveau des Plasmids ohne den LexA-P300HAT-Öffner um einen Faktor 4 ab, während das Expressionsniveau des Plasmids mit dem LexA-P300HAT-Öffner um einen Faktor 2 abfiel. Wir schließen daraus, dass das LexA-p300HAT mehr Stabilität der Genexpressionsniveaus verleiht als das Plasmid ohne Öffner, aber nur zu einem eingeschränkten Grad. Mit dem CMV-Promotor sind die höheren Expressionsniveaus, die durch den LexA-P300HAT-Öffner induziert werden, daher zeitlich beschränkt, wenigstens wenn die Zellen in Abwesenheit von Antibiotikum-Selektionsdruck kultiviert werden.
Beispiel 7: STAR- und TRAP-Elemente verbessern die Stabilität der p300-HAT-vermittelten erhöhten Genexpressionsniveaus über die Zeit
In diesem Beispiel testen wir, ob die Kombination von STAR, TRAP-Elementen und dem LexA-P300HAT die langfristige Stabilität der Genexpression fördern kann.
Materialien und Verfahren
Plasmide
In diesem Experiment werden zwei Plasmide miteinander verglichen: der UB6-d2EGFP-ires-Zeo-Vektor (UB6-Kontrolle) und das UB6-d2EGFP-ires-Zeo-LexAP300HAT-STAR7-TRAP (UB6-p300HAT-STAR7) (7). Die Konfiguration des Öffnerelements in Bezug auf die Transcriptionseinheit des Reporter-Gens ist ähnlich wie in 6. Der CMV-Promotor wird jedoch durch den UB6-Promotor ersetzt (durch PCR amplifiziert ausgehend von pUB6V5HisA unter Verwendung der Primer GATCGGTACCGGCGCGCCTCCGCGCCGGGTTTTG und AGGCGAGCTCGGTACCAAGCTTCGTCTAAC und unter Verwendung von AscI und SacI in PPLp300HAT kloniert, wobei UB6-p300HAT entsteht). Außerdem wird 5'-STAR7 in die SalI-Stelle kloniert, und 3'-STAR7 wird in die PacI-Stelle des UB6-p300HAT-Konstrukts kloniert, wobei UB6-p300HAT-STAR7 entsteht. An die STAR7-Sequenz wird die SPA-Pausen-TRAP-Sequenz addiert (7).
Transfektion und Kultur von CHO-Zellen
Die Transfektion und Kultur erfolgen wie in Beispiel 6. Die Expression des d2EGFP-Reporter-Gens wird ungefähr drei Wochen nach der Transfektion bewertet. Nach diesen ersten Messungen werden die Zellen anschließend in Medium ohne Selektionsmittel (Zeocin) kultiviert. Die Expression des d2EGFP-Reporter-Gens wird zu verschiedenen Zeitpunkten und letztmalig 95 Tage nach der Transfektion bewertet.
Ergebnisse
7 zeigt, dass die Lenkung von LexA-P300HAT zu LexA-Bindungsstellen stromaufwärts des UB6-Promotors zu mehreren CHO-Kolonien führt, die d2EGFP-Protein auf signifikant höherem Niveau exprimieren als die "leere" UB6-Kontrolle ohne LexA-P300HAT. Der Durchschnitt des d2EGFP-Signals in den 12 Kolonien, die mit dem UB6-Kontrollplasmid transfiziert wurden, beträgt 70, wenn 25 Tage nach der Transfektion gemessen wird. Zum Vergleich beträgt der Durchschnitt des d2EGFP-Signals in den 12 Kolonien, die mit dem UB6- p300HAT-STAR7-Plasmid transfiziert wurden, 157, wenn 25 Tage nach der Transfektion gemessen wird. Somit hat die kombinierte Anwendung von STAR7 und des LexA-P300HAT-Öffners eine positive Wirkung auf das Expressionsniveau des Reporterproteins in stabil transfizierten Klonen.
Wenn sie jedoch längere Zeit verfolgt wurden, fielen die Expressionsniveaus des UB6-Kontrollplasmids ab. Der Durchschnitt des d2EGFP-Signals in den 12 Kolonien, die mit dem UB6-Kontrollplasmid transfiziert wurden, beträgt 31, wenn 95 Tage nach der Transfektion gemessen wird. Der Durchschnitt des d2EGFP-Signals in den 12 Kolonien, die mit dem UB36-p300HAT-STAR7-Plasmid transfiziert wurden, beträgt 207, wenn 95 Tage nach der Transfektion gemessen wird. Somit fiel das Expressionsniveau des Plasmids ohne den LexA-P300HAT-Öffner signifikant ab, während das Expressionsniveau des Plasmids mit dem LexA-P300HAT-Öffner tatsächlich um ca. 30% gestiegen ist. Wir schließen daraus, dass die kombinierte Wirkung von STAR7, der Spa/Pause-TRAP-Sequenz und des LexA-p300HAT-Öffners im Vergleich zu dem Plasmid ohne STAR, TRAP-Sequenzen und einen Öffner einen hohen Grad der Stabilität der Genexpressionsniveaus verleiht. Wenigstens im Zusammenhang mit dem UB6-Promotor bleiben die höchsten Expressionsniveaus, die durch STAR7/TRAP und den LexA-P300HAT-Öffner induziert werden, daher über die Zeit stabil. Dies beweist, dass die Anwendung einer Kombination von Öffnern, STAR- und TRAP-Elementen Transgene vor einer Stummschaltung während längerer Kultivierung schützt. Dies beweist auch, dass diese Eigenschaft an der Antibiotikum-Selektion unabhängig ist.
Beispiel 8: Die Kombination des p300HAT-Öffners und eines STAR/TRAP-Elements verbessert die Kopienzahlabhängigkeit der Genexpression
Transgen-Expressionseinheiten für die heterologe Proteinexpression werden im Allgemeinen in das Genom der Wirtszelle integriert, um eine stabile Retention während der Zellteilung zu gewährleisten. Die Integration kann dazu führen, dass eine oder mehrere Kopien der Expressionseinheit in das Genom eingefügt werden; mehrere Kopien können als Tandem-Anordnungen vorhanden sein oder auch nicht. Dies führt zu der Frage, ob das Transgen in kopienzahlabhängiger oder -unabhängiger Weise exprimiert wird. Insbesondere Klone, die eine höhere Kopienzahl enthalten, neigen dazu, mit der Zeit instabil zu exprimieren. In diesem Beispiel bestimmen wir die Beziehung zwischen Transgen-Expressionsniveaus und Kopienzahl.
Material und Verfahren
CHO-Zellen wurden mit UB6-d2EGFP-ires-Zeo-Vektor (UB6-Kontrolle) und dem UB6-d2EGFP-ires-Zeo-LexA-P300HAT-STAR7-TRAP (UB6-p300HAT-STAR7) transfiziert. Einzelne Klone wurden ausgewählt und 95 Tage lang kultiviert, wie in Beispiel 7. Zellen wurden geerntet, die d2EGFP-Expression wurde gemessen, und die übrigen Zellen wurden lysiert, und die genomische DNA wurde unter Verwendung des DNeasy Tissue Kit (QIAGEN 69504) gemäß der Beschreibung durch den Hersteller gereinigt. Die Kopienzahl des d2EGFP-Gens wurde bestimmt, indem man eine kompetitive PCR-Vorschrift befolgte (Fu et al., 1999). Das resultierende Autoradiogramm wurde auf einen Leuchtstoffschirm (Personal F/X, BioRad) einwirken gelassen und durch Densitometrie analysiert, um die relative Stärke der d2EGFP-DNA-Banden zu bestimmen. Der Blot wurde mit einer Sonde für Actin rehybridisiert, und das Verhältnis zwischen dem d2EGFP- und dem Actinsignal wurde als relative Kopienzahl genommen.
Ergebnisse
Wir bestimmten die Kopienzahl der integrierten Vektoren in den in 8 gezeigten Kolonien. Es gab keine Korrelation zwischen der Kopienzahl von integrierten Plasmiden und dem Expressionsniveau von d2EGFP im UB6-Kontrollvektor, in dem kein STAR-Element vorhanden war. Dies wird durch den niedrigen Korrelationskoeffizienten (R²) von 0,24 angezeigt. Dagegen gab es eine gute Korrelation zwischen Expression und Kopienzahl von d2EGFP im UB6-p300HAT-STAR7-Vektor. Dies wird durch den hohen Korrelationskoeffizienten (R²) von 0,82 angezeigt. Bedeutsamerweise war nicht nur die d2EGFP-Expression kopienzahlabhängig, sondern es wurde auch mehr d2EGFP-Protein pro Kopie produziert. Einer Schätzung zufolge gibt es ein um den Faktor 3 erhöhtes d2EGFP-Expressionsniveau pro Kopie im UB6-p300HAT-STAR7-Vektor.
Dies lässt vermuten, dass die Kombination von STAR7, der Spa/Pause-TRAP-Sequenz und dem LexA-P300HAT-Öffner den Transgen-Expressionseinheiten Kopienzahlabhängigkeit verleiht, so dass die Transgen-Expression von anderen Transgenkopien in Tandemanordnungen unabhängig ist und von Gen-Stummschaltungseinflüssen an der Integrationsstelle unabhängig ist. Weiterhin nimmt die Expression pro Kopie zu, wenn das Transgen durch die Kombination von STAR7/TRAP und dem LexA-P300HAT-Öffner geschützt ist.
Beschreibung der Figuren
1. Schematisches Diagramm der Erfindung.
1A zeigt zwei Expressionseinheiten auf einem Plasmid. Expressionseinheit 1 umfasst ein bicistronisches Gen, das (von 5' nach 3') ein Transgen (das zum Beispiel eine Untereinheit eines multimeren Proteins codiert; Gen 1), ein IRES und einen Selektionsmarker (zeo, der Zeocin-Resistenz verleiht) unter der Kontrolle des CMV-Promotors enthält. Stromaufwärts des CMV-Promotors befinden sich vier LexA-Bindungsstellen (LexA-BS). Die Expressionseinheit weist den SV40-Transcriptionsterminator an ihrem 3'-Ende auf (t). Dann kommt ein monocistronisches Gen, das ein Fusionsprotein zwischen dem LexA-Protein und einer Histon-Acetyltransferase (HAT) oder ein funktionelles Teil eines HAT, das noch Acetylgruppen auf Histonschwänze übertragen kann (LexA-HAT), codiert. Diese Gene befinden sich unter der Kontrolle des SV40-Promotors. Die Expressionseinheit weist den SV40-Transcriptionsterminator an ihrem 3'-Ende auf (t). Die gesamte Cassette mit den beiden Expressionseinheiten wird von STAR-Elementen flankiert.
1B ist 1A ähnlich, aber es gibt jetzt drei Expressionseinheiten auf einem Plasmid. Expressionseinheit 1 umfasst ein bicistronisches Gen, das ein Transgen Gen 1, ein IRES und einen Selektionsmarker zeo unter der Kontrolle des CMV-Promotors enthält. Die Transcriptionsorientierung dieser ersten Expressionseinheit ist stromaufwärts gerichtet. Expressionseinheit 2 umfasst ein bicistronisches Gen, das ein Transgen Gen 2, ein IRES und einen Selektionsmarker puro (Puromycin-Resistenz-Gen) unter der Kontrolle des CMV-Promotors enthält. Die Transcriptionsorientierung dieser zweiten Expressionseinheit ist stromabwärts gerichtet. Zwischen den zwei CMV-Promotoren der beiden Expressionseinheiten befinden sich vier LexA-Bindungsstellen (LexA-BS). Das monocistronische Gen codiert dieselben LexA-Fusionsproteine wie in 1A. Die gesamte Konstellation von drei Expressionseinheiten ist von STAR-Elementen flankiert.
2. Chromatinöffner verbessern die CMV-gesteuerte GFP-Expression in CHO-Zellen
Mit den Konstrukten, die das LexA-P/CAF codierende Gen enthalten, werden CHO-K1-Zellen transfiziert. Stabile Kolonien (14 von jedem Konstrukt) werden expandiert, und das GFP-Signal wird mit einem XL-MCL-Beckman-Coulter-Durchflusscytometer bestimmt. Für jede unabhängige Kolonie (X-Achse) ist der Mittelwert des GFP-Signals aufgetragen (Y-Achse). Dies wird als Maß für das Niveau der GFP-Expression genommen. Die Ergebnisse werden mit denen von Kolonien verglichen, die mit einem Konstrukt, das kein LexA-P/CAF-Gen enthält (Kontrolle), und einem Konstrukt, das sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende von STAR-40-Elementen flankiert (Star40-abgeschirmt) ist, transfiziert sind.
3. Die Kombination von Chromatinöffnern und STARs verstärkt die vom CMV-Promotor gesteuerte GFP-Expression in CHO-Zellen
Mit dem Konstrukt, das von STAR 40 flankiert ist und das LexA-P/CAF codierende Gen enthält (siehe 1), werden CHO-K1-Zellen transfiziert. Stabile Kolonien (14 von jedem Konstrukt; X-Achse) werden expandiert, das GFP-Signal wird bestimmt, und der Mittelwert des GFP-Signals wird wie in 2 aufgetragen (Y-Achse). Die Ergebnisse werden mit denen von Kolonien verglichen, die mit einem Konstrukt, das kein LexA-P/CAF-Gen oder STAR-40-Elemente enthält (Kontrolle), und einem Konstrukt, das sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende von STAR-40-Elementen flankiert ist, transfiziert sind.
4. Die Kombination von Chromatinöffnern und STARs verstärkt die Stabilität der vom CMV-Promotor gesteuerten GFP-Expression in CHO-Zellen
Stabil transfizierte Kolonien, die entweder das LexA-P/VAF-Öffnerkonstrukt oder das GFP-Konstrukt, das von STAR 40 flankiert ist, enthalten sowie das LexA-P/CAF codierende Gen enthalten (siehe 1), werden expandiert. Von beiden Kategorien werden vier Kolonien (X-Achse) mit den höchsten GFP-Niveaus ausgewählt (siehe 3). Diese Kolonien werden ohne das Antibiotikum (Zeocin) weiter kultiviert, und das GFP-Signal wird in Abständen von einer Woche bestimmt, was ungefähr 10 Zellzyklen darstellt. Der Mittelwert des GFP-Signals wird wie in 3 aufgetragen (Y-Achse). Der erste Balken jeder Kolonie stellt das GFP-Signal zu dem Zeitpunkt dar, an dem der Antibiotikum-Selektionsdruck weggenommen wird. Die drei benachbarten Balken stellen das GFP-Signal dar, das nach einer, zwei bzw. drei Wochen gemessen wird.
5. LexA-P300HAT verstärkt nicht die transiente Expression des CMV- und UB6-Promotors, sondern nur des SV40-Minimalpromotors.
5 zeigt zwei verschiedene Klassen von Plasmiden. Klasse 1 umfasst das DsRED-Reporter-Gen unter der Kontrolle des CMV-Promotors, UB6-Promotors oder SV40-Minimalpromotors. Stromaufwärts dieser Promotoren befinden sich vier LexA-Bindungsstellen (LexA-B5). Bei der zweiten Plasmidklasse handelt es sich um ein Gen, das ein Fusionsprotein zwischen dem LexA-Protein und der funktionellen P300-Histon-Acetyltransferase(HAT)-Domäne codiert. Die verschiedenen Reporter-Gen-Konstrukte werden allein oder zusammen mit dem Plasmid, das das LexA-P300HAT-Öffnerprotein codiert, für eine Transfektion verwendet. 24 Stunden nach der Transfektion werden die DsRED-Signale gemessen (Y-Achse). Das Signal, das nur mit dem Reporter-Gen-Konstrukt gemessen wird, wird willkürlich auf 100 gesetzt. Das Signal eines solchen Reporter-Gens allein wird mit dem Signal des jeweiligen Reporter-Gen-Konstrukts in Kombination mit dem LexA-P300HAT-Öffnerkonstrukt gemessen.
6. Der p300HAT-Öffner verbessert das Niveau der CMV-gesteuerten Expression in stabil transfizierten Klonen, aber nur während eines begrenzten Zeitraums.
CHO-K1-Zellen werden mit zwei verschiedenen Konstrukten transfiziert. Konstrukt 1 umfasst ein bicistronisches Gen, das (von 5' nach 3') das d2EGFP-Reporter-Gen, ein IRES und einen Selektionsmarker (zeo, der Zeocin-Resistenz verleiht) unter der Kontrolle des CMV-Promotors enthält (CMV-Kontrolle, Bild A).
Konstrukt 2 umfasst eine erste Expressionseinheit, die ein bicistronisches Gen umfasst, das (von 5' nach 3') das d2EGFP-Reporter-Gen, ein IRES und einen Selektionsmarker (zeo, der Zeocin-Resistenz verleiht) unter der Kontrolle des CMV-Promotors enthält. Die Cassette weist den SV40-Transcriptionsterminator an seinem 3'-Ende auf (t). Stromaufwärts des CMV-Promotors befinden sich vier LexA-Bindungsstellen (LexA-BS). Stromabwärts der LexA-Bindungsstellen befindet sich eine zweite Expressionseinheit, ein monocistronisches Gen, das ein Fusionsprotein zwischen dem LexA-Protein und der funktionellen P300-Histon-Acetyltransferase(HAT)-Domäne codiert. Die Expressionseinheit weist den SV40-Transcriptionsterminator an seinem 3'-Ende auf (t). Die Transcription der beiden Expressionseinheiten ist entgegengesetzt gerichtet. Damit sind die LexA-Bindungsstellen zwischen den beiden Expressionseinheiten platziert und wirken auf diese ein (CMV-p300HAT, Bild B).
Eine angegebene Zahl von stabilen Kolonien wird expandiert, und nach verschiedenen angegebenen Zeiträumen wird das d2EGFP-Signal mit einem XL-MCL-Beckman-Coulter-Durchflusscytometer bestimmt. Für jede unabhängige Kolonie ist der Mittelwert des d2EGFP-Signals aufgetragen. Dies wird als Maß für das Niveau der d2EGFP-Expression genommen. Die Ergebnisse werden mit denen von Kolonien verglichen, die mit einem Konstrukt transfiziert sind, das kein LexA-P300HAT-Gen enthält (CMV-Kontrolle).
7. Die erhöhten Gen-Expressionsniveaus aufgrund der kombinierten Wirkung von STAR7/TRAP und dem p300-HAT-Öffner sind über die Zeit hochgradig stabil.
CHO-K1-Zellen werden mit zwei verschiedenen Konstrukten transfiziert. Konstrukt 1 umfasst ein bicistronisches Gen, das (von 5' nach 3') das d2EGFP-Reporter-Gen, ein IRES und einen Selektionsmarker (zeo, der Zeocin-Resistenz verleiht) unter der Kontrolle des UB6-Promotors enthält (UB6-Kontrolle, Bild A).
Konstrukt 2 umfasst eine erste Expressionseinheit, die ein bicistronisches Gen umfasst, das (von 5' nach 3') das d2EGFP-Reporter-Gen, ein IRES und einen Selektionsmarker (zeo, der Zeocin-Resistenz verleiht) unter der Kontrolle des UB6-Promotors enthält. Die Cassette weist den SV40-Transcriptionsterminator an seinem 3'-Ende auf (t). Stromaufwärts des UB6-Promotors befinden sich vier LexA-Bindungsstellen (LexA-BS). Stromabwärts der LexA-Bindungsstellen befindet sich eine zweite Expressionseinheit, ein monocistronisches Gen, das ein Fusionsprotein zwischen dem LexA-Protein und der funktionellen P300-Histon-Acetyltransferase(HAT)-Domäne codiert. Die Expressionseinheit weist den SV40-Transcriptionsterminator an seinem 3'-Ende auf (t). Die Transcription der beiden Expressionseinheiten ist entgegengesetzt gerichtet. Damit sind die LexA-Bindungsstellen zwischen den beiden Expressionseinheiten platziert und wirken auf diese ein. Die gesamte Cassette ist sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende von STAR-7-Elementen (STAR7) flankiert (UB6-p300HAT-STAR7, Bild B). An die STAR7-Sequenz wird eine SPA-Pause-TRAP-Sequenz addiert.
Eine angegebene Zahl von stabilen Kolonien wird expandiert, und nach verschiedenen angegebenen Zeiträumen wird das d2EGFP-Signal mit einem XL-MCL-Beckman-Coulter-Durchflusscytometer bestimmt. Für jede unabhängige Kolonie ist der Mittelwert des d2EGFP-Signals aufgetragen. Dies wird als Maß für das Niveau der d2EGFP-Expression genommen. Die Ergebnisse werden mit denen von Kolonien verglichen, die mit einem Konstrukt transfiziert sind, das kein LexA-P300HAT-Gen enthält (UB6-Kontrolle).
8. Die Kombination des p300-HAT-Öffners und eines STAR/TRAP-Elements verbessert die Kopienzahlabhängigkeit der Genexpression.
d2EGFP-Expressionseinheiten in der UB6-Kontrolle (A) und in UB6-p300HAT-STAR7 (B), die in genomische CHO-DNA integriert sind, werden in Bezug auf d2EGFP-Expression und die Anwesenheit oder Anzahl von d2EGFP-Kopien analysiert. Eine radioaktive d2EGFP-Sonde wurde verwendet, um die Menge der Transgen-DNA im Genom jeden Klons nachzuweisen, die dann mit einem Leuchtstoffschirm quantifiziert wurde. Die Expression der Klone wird gegen die relative Kopienzahl aufgetragen. Der Korrelationskoeffizient ist für jeden Fall angegeben.
Anstelle von LexA-Öffner-Fusionsproteinen, die zu LexA-Bindungsstellen gelenkt werden, können auch GAL4-Öffner-Fusionsproteine verwendet werden. Diese GAL4-Öffner-Fusionsproteine werden zu GAL4-Bindungsstellen gelenkt, die stromaufwärts eines Promotors platziert werden. Im Unterschied zu dem bakteriellen LexA-Protein ist GAL4 ein Hefeprotein. Wie das LexA-Protein ist GAL4 ein Transcriptionsfaktor, der eine DNA-Bindungsdomäne und eine trans-wirkende Domäne aufweist, wobei letztere Domäne für die Aktivierung der Genexpression verantwortlich ist. Um ein GAL4-Öffner-Fusionsprotein zu schaffen, wird das Teil des GAL4-Gens, das die Aminosäuren 1 bis 147 codiert (Lillie und Green, 1989), in demselben Leseraster mit dem jeweiligen Öffnerprotein oder dem funktionellen Teil des Öffnerproteins kloniert. In der vorliegenden Erfindung wird die Expression des GAL4-Öffner-Fusionsgens durch den SV40-Promotor gesteuert. Das GAL4-Öffner-Fusionsprotein wird zu GAL4-Bindungsstellen gelenkt, die GAL4-Operatoren genannt werden. Gemeinsam werden vier GAL4-Operatoren unmittelbar stromaufwärts eines Promotors platziert. Ein GAL4-Promotor ist die folgende Sequenz: CGGAGTACTGTCCTCCG.
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Tabelle 1. Die STAR-Elemente, die in den beschriebenen Beispielen zum Testen verwendet werden.
Tabelle 2. Bevorzugte TRAP-Sequenzen.
Sequenzprotokoll

Claims

Verfahren zum Exprimieren eines Polypeptids in einer Zelle, das Kultivieren eines stabil transfizierten Zellklons unter Expression des Polypeptids umfasst, wobei die Zellen des stabil transfizierten Zellklons Nucleinsäure enthalten, die einen Promotor umfasst, der funktionell mit einem offenen Leseraster verknüpft ist, der das Polypeptid codiert, wobei der Promotor einen Promotor eines humanen Cytomegalievirus, eines Simianvirus 40, eines Ubiquitin C oder eines Verlängerungsfaktors 1-α umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleinsäure weiterhin eine Bindungsstelle für ein Polypeptid mit Histon-Acetyltransferase-Aktivität (Öffner) umfasst, wobei die Zellen des stabil transfizierten Zellklons den Öffner umfassen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Öffner ein p300/CBP-Protein oder ein P/CAF-Protein oder CBP oder ein funktionelles Teil, Derivat und/oder Analogon eines der obigen Proteine umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Öffner ein Fusionsprotein ist, das wenigstens einen funktionellen Bestandteil einer Histon-Acetyltransferase und eine sequenzspezifische nucleinsäurebindende Domäne umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die sequenzspezifische nucleinsäurebindende Domäne von LexA oder Gal4 abgeleitet ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-4, wobei die Zellen des stabil transfizierten Klons weiterhin Nucleinsäure enthalten, die einen Promotor umfasst, der funktionell mit einem offenen Leseraster verknüpft ist, der ein weiteres Polypeptid codiert.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-5, wobei die Nucleinsäure ein bi- oder multicistronisches Gen umfasst.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-6, wobei das Polypeptid oder das weitere Polypeptid oder beide ein Teil eines multimeren Proteins sind.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-7, wobei das Polypeptid eine schwere oder leichte Kette eines Immunglobulins oder ein antigenbindendes Teil, Derivat und/oder Analogon davon ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-8, wobei sich die Bindungsstelle stromaufwärts des Promotors befindet.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-9, das weiterhin das Ernten des Polypeptids aus den Zellen oder ihrem Kulturüberstand umfasst.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-10, wobei die Nucleinsäure, die einen Promotor umfasst, der funktionell mit einem offenen Leseraster verknüpft ist, der das Polypeptid codiert, auf einer oder beiden Seiten von einer stabilisierenden Anti-Repressor-Sequenz (STAR-Sequenz) flankiert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei die STAR-Sequenz eine Sequenz, wie sie in Tabelle I gezeigt ist, oder ein funktionelles Teil, Derivat und/oder Analogon davon umfasst.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-12, wobei die Nucleinsäure weiterhin Folgendes umfasst: (i) wenigstens eine Transcriptionspausensequenz (TRAP-Sequenz), wobei sich die TRAP-Sequenz in der Nucleinsäure stromabwärts eines offenen Leserasters in einer Orientierung befindet, die wenigstens zum Teil die Bildung von Antisense-RNA verhindern kann; oder (ii) wenigstens eine TRAP-Sequenz, wobei sich die TRAP-Sequenz stromaufwärts des Promotors befindet und in einer Orientierung vorliegt, die wenigstens zum Teil verhindern kann, dass die Transcription in den Promotor und das offene Leseraster eintritt; oder (iii) sowohl (i) als auch (ii).
Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei die TRAP-Sequenz eine Sequenz, wie sie in Tabelle II gezeigt ist, oder ein funktionelles Teil, Derivat und/oder Analogon davon umfasst.
Stabil transfizierte Zelle, die Nucleinsäure umfasst, die einen Promotor umfasst, der funktionell mit einem offenen Leseraster verknüpft ist, der ein Polypeptid codiert, wobei der Promotor einen Promotor eines humanen Cytomegalievirus, eines Simianvirus 40, eines Ubiquitin C oder eines Verlängerungsfaktors 1-α umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleinsäure weiterhin eine Bindungsstelle für ein Polypeptid mit Histon-Acetyltransferase-Aktivität (Öffner) umfasst, wobei die stabil transfizierte Zelle den Öffner umfasst.
Zelle gemäß Anspruch 15, wobei die Zelle eine Wirbeltierzelle oder eine Pflanzenzelle, vorzugsweise eine Säugerzelle, besonders bevorzugt eine menschliche Zelle ist.
Zelle gemäß Anspruch 16, wobei die Zelle eine U-2-OS-Osteosarkom-, CHO-, 293-, HuNS-1-Myelom-, WERI-Rb-1-Retinoblastom-, BHK-, Vero-, nichtsezernierendes-Maus-Myelom-Sp2/0-Ag-14-, nichtsezernierendes-Maus-Myelom-NSO- oder NCI-H295R-Nebennieren-Karzinomzelle umfasst.
Nucleinsäure, die einen Promotor umfasst, der funktionell mit einem offenen Leseraster verknüpft ist, der ein Polypeptid codiert, und weiterhin eine Bindungsstelle für ein Polypeptid mit Histon-Acetyltransferase-Aktivität (Öffner) umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleinsäure weiterhin eine STAR-Sequenz, wie sie in Tabelle I gezeigt ist, oder ein funktionelles Teil, Derivat und/oder Analogon davon umfasst.
Nucleinsäure gemäß Anspruch 18, die weiterhin eine TRAP-Sequenz umfasst, und zwar entweder: (i) stromaufwärts des Promotors in einer Orientierung, die wenigstens zum Teil verhindert, dass die Transcription in den Promotor und das offene Leseraster eintritt; oder (ii) stromabwärts des offenen Leserasters in einer Orientierung, die wenigstens zum Teil die Bildung von Antisense-RNA verhindern kann; oder (iii) sowohl (i) als auch (ii).
Nucleinsäure gemäß Anspruch 18 oder 19, wobei der Promotor einen Promotor eines humanen Cytomegalievirus, eines Simianvirus 40, eines Ubiquitin C oder eines Verlängerungsfaktors 1-α umfasst.
Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 18-20, die ein bi- oder multicistronisches Gen umfasst und vorzugsweise eine interne Ribosomeneintrittsstelle umfasst.
Zelle, die mit einer Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 18-21 versehen ist.
Verwendung eines Polypeptids mit Histon-Acetyltransferase-Aktivität zur Erhöhung des Transcriptionsniveaus einer Nucleinsäure, die sich unter der Kontrolle eines Promotors befindet, wobei der Promotor einen Promotor eines humanen Cytomegalievirus, eines Simianvirus 40, eines Ubiquitin C oder eines Verlängerungsfaktors 1-α umfasst, in stabil transfizierten Zellen.