CN1726280A - 耐热的α－淀粉酶 - Google Patents

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Abstract

分离的多核苷酸，该多核苷酸包含编码具有α－淀粉酶活性的多肽的开放阅读框，所述多肽选自：a)包含这样氨基酸序列的多肽，其与SEQ IDNO：4的氨基酸22至450位具有至少70％的同一性；b)包含这样氨基酸序列的多肽，其与下述大肠杆菌宿主的质粒中所***多核苷酸的淀粉酶编码部分所编码的多肽具有至少70％的同一性，其中所述大肠杆菌宿主根据布达佩斯条约保藏在DSMZ，保藏号为DSM 15334；c)由这样的多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含的核苷酸序列与SEQ ID NO：3所示的68至1417位序列具有至少70％的同一性；以及d)具有α－淀粉酶活性的(a)、(b)或(c)的片段。

Description

耐热的α-淀粉酶
发明领域：
本发明涉及耐热的α-淀粉酶，尤其是在酸性pH下具有提高的热稳定性的α-淀粉酶。本发明还涉及此类α-淀粉酶的用途。
发明背景：
α-淀粉酶(α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC.3.2.1.1)构成了一组可以催化淀粉水解以及催化其它线性和支链1，4-糖苷寡糖和多糖水解的酶。
已有非常广泛大量的专利和科学文献涉及此类工业上非常重要的酶。例如从WO 90/11352，WO 95/10603，WO 95/26397，WO 96/23873和WO96/23874中可以知道许多被称为“Termamyl样α-淀粉酶”的α-淀粉酶和其变体。Termamyl样α-淀粉酶是非常耐热的，因此适合在高温下进行的生产过程，比如葡萄糖生产过程中的淀粉液化。
另外一组α-淀粉酶被称为“FungamylTM样α-淀粉酶”，是与从米曲霉(Aspergillus oryzae)中得到的α-淀粉酶相关或同源的α-淀粉酶。FungamylTM样α-淀粉酶具有相对较低的热稳定性，由丹麦Novozymes A/S以FUNGAMYLTM为商品名出售的商业产品的最适温度为55℃，不适合在高温下进行的加工过程。FungamylTM样α-淀粉酶目前常被用于例如酿造工业中制造糖浆。
显然，提供一种优选地在酸性pH下热稳定性提高的α-淀粉酶是非常有利的。尽管没有新的认识，但实际在本领域有着相当长期的需要。早在1980，Somkuti和Steinberg就描述过一种他们设法从微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)(微小毛霉(Mucor pusillus))中分离并鉴定的嗜热嗜酸胞外α-淀粉酶。他们描述说：“由于高温和酸性的pH环境是经济的淀粉水解的最适条件，工业用途中推荐使用微生物来源的耐热和耐酸的淀粉酶”，从而得出有关根毛霉(Rhizomucor)α-淀粉酶的结论：“这显然是真菌α-淀粉酶同时显示出嗜酸和嗜热的第一个例子。因此，微小根毛霉的α-淀粉酶具有经济重要性。”(Somkuti GA，Steinberg DH(1980)，微小毛霉的嗜热嗜酸胞外淀粉酶，Dev Indust Microbiol 21：327-337)。
然而，尽管早在1980年Somkuti和Steinberg就已得出非常清楚的结论，但编码微小根毛霉α-淀粉酶的基因至今仍没有得到克隆或序列测定，淀粉酶也至今没能重组化生产达到工业上相应用量。1987年报导了一种改进的纯化方法，但也仅能用于从野生型微小根毛霉中生产酶(Turchi SL和Becker T(1987)Curr Microbiol 15：203-205)。
发明概述：
本发明欲解决的问题是，如何提供重组的嗜热嗜酸α-淀粉酶。本发明人已经成功地从微小根毛霉中分离出编码命名为AM782的α-淀粉酶的基因，他们已成功地将此编码基因导入重组的工业丝状真菌表达***来生产α-淀粉酶。此淀粉酶的特征显示它是一种高度嗜热嗜酸的α-淀粉酶，用淀粉酶AM782催化麦芽糖糊***解所得的糖图谱证实了它具有很高的目的活性。
淀粉酶AM782能够在很高的温度下起作用，至少高达70℃。淀粉酶AM782具有很高的反应速度，与同等剂量的FungamylTM 800L相比，淀粉酶AM782能在约3小时内达到FungamylTM所需24至48小时的效果。而且，淀粉酶AM782能够将DP3降解成DP2和DP1，从而可获得更高的DP1。
因此，第一方面，本发明涉及分离的多核苷酸，其包含一个开放阅读框架，能够编码具有α-淀粉酶活性的多肽。所述多肽选自：a)包含这样氨基酸序列的多肽，其与SEQ ID NO：4的氨基酸22至450位具有至少70％的同一性，优选地与SEQ ID NO：4的氨基酸22至450位具有75％的同一性，更优选地具有80％，甚至更优选地具有85％，甚至更优选地具有90％，更优选地具有95％，且最优选地具有至少97％的同一性；b)包含这样氨基酸序列的多肽，其与下述大肠杆菌(E.coli)宿主的质粒中所***多核苷酸的淀粉酶编码部分所编码的多肽具有至少70％的同一性，其中所述大肠杆菌宿主根据布达佩斯条约保藏在DSMZ，保藏号为DSM 15334，优选地与下述大肠杆菌宿主的质粒中所***多核苷酸的淀粉酶编码部分所编码的多肽具有75％的同一性，更优选地具有80％，甚至更优选地具有85％，甚至更优选地具有90％，更优选地具有95％，且最优选地具有至少97％的同一性，其中所述大肠杆菌宿主根据布达佩斯条约保藏在DSMZ，保藏号为DSM 15334；c)由这样的多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含的核苷酸序列与SEQ ID NO：3所示的68至1417位序列具有至少70％的同一性，优选地与SEQ ID NO：3所示的68至1417位序列具有75％的同一性，更优选地具有80％，甚至更优选地具有85％，甚至更优选地具有90％，更优选地具有95％，且最优选地具有至少97％的同一性；以及d)具有α-淀粉酶活性的(a)、(b)或(c)的片段。
第二方面，本发明涉及包含如第一方面所述多核苷酸的核酸构建体，其中所述多核苷酸有效地连接到指导多肽在适宜宿主中产生的一个或多个控制序列上。
第三个方面涉及重组表达载体，其包含如第二方面所述的核酸构建体。
第四方面，本发明涉及重组宿主细胞，包含如第二方面所述的核酸构建体，或者至少一个如第三方面所述的表达载体的拷贝。
淀粉酶AM782及其同源物和变体的工业生产自然是非常令人感兴趣的。
因此，第五方面，本发明涉及产生具有α-淀粉酶活性的多肽的方法，此多肽由第一方面所述的多核苷酸编码，此方法包括：(a)在有益于多肽产生的条件下培养如权利要求12-16中任意一项所述的重组宿主细胞；以及(b)回收多肽。
淀粉酶例如淀粉酶AM782有相当多有关的应用，在此给出其中一些主要应用的概述，它包括但不限于：淀粉工业、食品加工业、纺织品工业和去垢剂工业。
因此，本发明的另外方面涉及酶促改性的淀粉衍生物的产生方法，其中，根据第五方面所述方法产生的具有α-淀粉酶活性的多肽用于淀粉液化和/或糖化；涉及高麦芽糖糖浆的生产方法，其中根据第五方面所述方法产生的具有α-淀粉酶活性的多肽用于淀粉的液化；涉及织物脱浆方法，其中根据第五方面所述方法产生的具有α-淀粉酶活性的多肽用于处理织物；涉及酿造方法，其中根据第五方面所述方法产生的具有α-淀粉酶活性的多肽在麦芽汁发酵过程中加入；还涉及醇生产方法，其中根据第五方面所述方法产生的具有α-淀粉酶活性的多肽用于酒厂麦芽浆中的淀粉液化；还涉及一种方法，其中将包含根据第五方面所述方法产生的具有α-淀粉酶活性多肽的面团产品进行烘焙。
本发明也考虑了AM782以及其同源物和变体的多种用途。
因此，本发明的许多非限制的方面涉及根据第五方面所述方法产生的具有α-淀粉酶活性的多肽在淀粉液化和/或糖化的转化过程中的用途；涉及根据第五方面所述方法产生的具有α-淀粉酶活性的多肽在高麦芽糖糖浆生产过程中液化淀粉的用途；涉及根据第五方面所述方法产生的具有α-淀粉酶活性的多肽在织物脱浆中的用途；涉及根据第五方面所述方法产生的具有α-淀粉酶活性的多肽在醇生产中的用途；涉及根据第五方面所述方法产生的具有α-淀粉酶活性的多肽在酿造中的用途；涉及根据第五方面所述方法产生的具有α-淀粉酶活性的多肽在烘焙中的用途。
附图简述：
图1显示纯化的淀粉酶AM782的pH曲线。
图2显示纯化的淀粉酶AM782的温度曲线。
图3-1至图3-3显示AM782分别在pH5及60℃、70℃和80℃下的剩余活度。
图4-1至图4-3显示AM782分别在pH6及60℃、70℃和80℃下的剩余活度。
图5-1至图5-3显示AM782分别在pH7及60℃、70℃和80℃下的剩余活度。
图6显示表达质粒pDAu71。
图7显示表达质粒pPFJo143。
图8显示实施例4的结果。
定义
序列同源性和比对
根据本发明的目的，序列比对和同源性分值的评估可以利用完整的Smith-Waterman比对来完成，对蛋白质和DNA的比对均有用。默认分值的矩阵BLOSUM50和单位矩阵(identity matrix)分别用于蛋白质和DNA的比对。在缺口(gap)的第一残基处的罚分对于蛋白质是-12，对于DNA是-16，而缺口的其它残基的罚分对于蛋白质为-2，对于DNA为-4。比对使用FASTA软件包版本v20u6来完成(W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988))，“生物序列分析的改良工具”，PNAS 85：2444-2448，以及W.R.Pearson(1990)“利用FASTP和FASTA进行快速灵敏的序列比对”Methods in Enzymology，183：63-98)。
蛋白质序列的多重比对可以用″ClustalW″(Thompson，J.D.，Higgins，D.G.和Gibson，T.J.(1994)CLUSTAL W：通过序列权重、位点特异性缺口罚分和权重矩阵选择来提高渐进性多重序列比对的灵敏度，NucleicAcids Research，22：4673-4680)。DNA序列的多重比对可以利用蛋白质比对作模板，将氨基酸用DNA序列的对应密码子替换而进行。
基本纯的多核苷酸
在此术语“基本纯的多核苷酸”涉及多核苷酸制备物，其中多核苷酸已从天然的遗传环境中分离出来，脱离了其它无关或不需要的编码序列，以适于应用的形式存在于基因工程蛋白生产***中。因此，基本纯的多核苷酸在重量上至多包含10％其它在自然条件下与其相关的多核苷酸(更低百分比的其它多核苷酸是优选的，例如，重量上至多8％，重量上至多6％，重量上至多5％，重量上至多4％，重量上至多3％，重量上至多2％，重量上至多1％，以及重量上最多1/2％)。然而，基本纯的多核苷酸可包括天然存在的5’和3’非翻译区，例如启动子和终止子。优选的是，基本纯的多核苷酸重量上至少92％是纯的，即此种多核苷酸构成了制备物中存在的所有多核苷酸物质重量的至少92％，更高百分比是优选的，例如至少94％是纯的，至少95％是纯的，至少96％是纯的，至少97％是纯的，至少98％是纯的，至少99％是纯的，以及最多99.5％是纯的。此处所述多核苷酸优选地以基本纯的形式存在。特别是，此处所述多核苷酸以基本纯的形式存在是优选的，即多核苷酸制备物中基本无其它在天然上与之相关联的多核苷酸物质。此处，术语“基本纯的多核苷酸”与术语“分离的多核苷酸”和“分离形式的多核苷酸”是同义的。
cDNA
本上下文所用的术语“cDNA”是意指能够从来自于真核细胞的成熟、剪接的mRNA分子通过反转录制备的DNA分子。cDNA缺乏通常存在于基因组DNA中的相应内含子序列。最初，原初RNA转录物是mRNA的前体，它经过一系列的加工事件而成为成熟的经剪接mRNA。这些事件包括所谓剪接的内含子去除过程。从而，当cDNA来自于mRNA时即缺乏内含子序列。
发明详述
本发明的第一方面涉及分离的多核苷酸，它包含一个能编码具有α-淀粉酶活性的多肽的开放阅读框，所述多肽选自：a)包含这样氨基酸序列的多肽，其与SEQ ID NO：4的氨基酸22至450位具有至少70％同一性；b)包含这样氨基酸序列的多肽，其与下述大肠杆菌宿主的质粒中所***多核苷酸的淀粉酶编码部分所编码的多肽具有至少70％的同一性，其中所述大肠杆菌宿主根据布达佩斯条约保藏在DSMZ，保藏号为DSM 15334；c)由这样的多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含的核苷酸序列与SEQ IDNO：3所示的68至1417位序列具有至少70％的同一性；以及d)具有α-淀粉酶活性的(a)、(b)或(c)的片段。
用于分离或克隆编码多肽的核苷酸序列的技术在本领域中公知，包括从基因组DNA的分离、从cDNA的制备或其组合。本发明中来自于此种基因组DNA的核苷酸序列的克隆能够通过以下得以实现，例如通过利用众所周知的聚合酶链反应(PCR)或表达库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段。参见，例如，Innis等人，1990，PCR：A Guide toMethods and Application，Academic Press，New York。可使用其它扩增方法，例如连接酶链反应(LCR)、连接激活的转录(LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。核苷酸序列可从根毛霉菌株或其它相关生物体克隆出来，因而，例如，可为此核苷酸序列中多肽编码区域的等位基因变体或种变体。
核苷酸序列可通过基因工程中用到的标准克隆方法来获得，以将核苷酸序列从其天然的位置重新定位到其它位置并在此进行复制。克隆方法包括：切除并分离包含编码此多肽的核苷酸序列的目的片段，将此片段***载体分子，并将此重组载体导入宿主细胞，核苷酸序列的多拷贝或克隆在其中得以复制。核苷酸序列可为基因组、cDNA、RNA、半合成的、合成来源的或它们的任一组合。
术语“多肽变体”、“蛋白质变体”、“酶变体”、或仅仅“变体”是指本发明的多肽，所述多肽包含一个或多个改变，例如此多肽的一个或多个特异位点的一个或多个特异氨基酸残基的替换、***、缺失或截短。此类改变的总数一般不超过10个，例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、或九个所述改变。另外，本发明的变体可包括亲本酶的其它修饰，一般不超过10个，例如，不超过5个此类修饰。这些变体通常与亲本多肽具有一定程度的至少80％的序列同一性，例如，至少85％，一般至少90％，或至少95％。
术语“亲本多肽”、“亲本蛋白质”、“亲本酶”、“标准酶”、或仅仅“亲本”涉及那些作为变体基础的多肽。此术语也涉及那些将变体与之相比较和比对的多肽。这些亲本可为天然存在(野生型)多肽或者甚至是通过任何适宜方法制备的其变体。例如，亲本蛋白质可为天然存在多肽的变体，其氨基酸序列已存在修饰或改变。亲本也可为等位基因变体，所述等位基因变体是一个基因的占据着相同染色体基因座的两个或多个改变形式中的任何一个。等位基因变体天然情况下通过突变引起，可导致如本领域所充分描述的群体多态性。多肽的等位基因变体是由相应基因的等位基因变体编码而成的多肽。
术语“随机文库”、“变体文库”、或仅仅“文库”是指变体多肽的文库。编码变体的基因在DNA密码子水平上的诱变产生了变体文库的多样性，由此例如在PCR反应中通过利用部分随机序列的引物，从而使个体密码子多样化。已述几种技术，利用它们将一个基因的几个核苷酸位点多样化并重组它们即可产生多样的重组文库，例如，在这些位点相距太远而单一的(掺入的)寡核苷酸引物不能将其覆盖的时候。这些技术包括如WO97/07205第3页8至29行(Novozymes A/S)中所述的个别多样化基因片段的体内重组。它们也包括用来产生全长基因文库的DNA改组技术，其中将几个基因片段组合且其中每个基因片段均可以是多样化的，例如通过掺入诱变(spiked mutagenesis)形成(Stemmer，Nature 370，pp.389-391，1994和US 5,811,238；US 5,605,793；和US 5,830,721)。人们可以如WO 98/41623和WO 98/41622(Novozymes A/S)中所述的，利用编码蛋白质“骨架”(野生型亲本多肽)的基因作为模板，将其与一个或多个单链或双链寡核苷酸结合。在合成中单链寡核苷酸可部分随机化。双链寡核苷酸可以是伴随特定区域多样化的PCR产物。在这两种情况下，为了限制所引入变化的平均数目，人们可以用编码骨架蛋白质序列的相应片段来减少多样性。
寡聚或多聚核苷酸合成中***到特异密码子位点的核苷酸混合物(A；C；T；G)比率的设计方法也已建立，用于导入偏离(bias)以得到针对一个或多个目标氨基酸组的近似目标频率分布，所述目标氨基酸由特异密码子编码。产生变体文库也是有利的，它包含在多肽一级序列中不同位点处的许多已知氨基酸修饰的排列。这些可通过翻译后修饰引入或化学修饰位点引入，或通过编码基因的突变引入。从前已经证实修饰本身由于某种原因(例如，降低抗原性，或提高特异活性、性能、稳定性或其它特性)可能是有益的。在这些例子中，产生已知序列的多种重组文库也许是首先值得做的。例如，如果已知12个单突变，人们能够组合亲本蛋白质编码基因的(至少)12种片段，其中每个片段以两种形式存在：一个带有目的突变，另一个没有。通过改变那些片段的相对量，人们可设计(大小为212)的文库，可对其预测每个基因的突变平均数目。组合突变可为一种有用的方法，因为组合突变本身可产生一些但不充足的效果，而不需借助于非常大的文库，但使用“掺入诱变”时需要非常大的文库。另一种组合这些已知突变的方法为利用编码这些已知突变的寡聚DNA的家族步移，所述寡聚DNA带有全长的野生型序列的片段。
因此，本发明的一个优选的实施方案涉及第一方面的多核苷酸，其中此多肽是人工变体，包含这样的氨基酸序列：与SEQ ID NO：4的22至450位氨基酸相比，有一个或多个截短、和/或氨基酸的至少一个替换、缺失、和/或***。
对本领域的技术人员来说，显然能够在分子的功能关键性区域之外进行这些修饰，从而仍然形成活性多肽。对本发明的核苷酸序列编码的多肽，其活性所必需的氨基酸残基并因此优选地不进行修饰例如替换的氨基酸残基能够根据本领域所公知的方法得以确定，例如，定点诱变或丙氨酸扫描诱变(参见，例如，Cunningham和Wells，1989，Science 244：1081-1085)。在后一技术中，在分子的每个正电荷残基处引入突变，并且对所得到的突变分子测试其淀粉酶活性，以确定分子活性的关键性氨基酸残基。用所合成的突变体分子测定底物-酶相互作用的位点也能够通过三维结构的分析来确定，所述三维结构可通过如核磁共振分析、晶体学或光敏亲和标记这些的技术来确定(参见，例如，de Vos等人，1992，Science 255：306-312；Smith等人，1992，Journal of Molecular Biology 224：899-904；Wlodaveret等人，1992，FEBS Letters 309：59-64)。
而且，编码本发明多肽的核苷酸序列可以通过引入核苷酸替换来修饰，所述替换不会产生由此核苷酸序列编码的多肽的其它氨基酸序列，但其符合生产酶所用宿主生物的密码子使用。
将突变引入核苷酸序列使一个核苷酸换为另一个氨基酸，可利用本领域已知的任何一种方法通过定点诱变来完成。这种方法尤其有用，它利用带有目的***片段的超螺旋双链DNA载体和两个包含目的突变的合成引物。每个各自与载体中相反的链互补的寡核苷酸引物，在温度循环中通过PfuDNA聚合酶而得以延伸。掺入引物后，生成了包含错配缺口的质粒。接下来的温度循环中，产物经DpnI处理，DpnI特异作用于甲基化和半甲基化DNA，以消化亲本DNA模板并用于选择包含突变的合成DNA。本领域已知的其它方法也可用。核苷酸替换更普遍的描述参见例如，Ford等人，1991，Protein Expression and Purification 2：95-107。
另一优选的实施方案涉及第一方面的多核苷酸，其中多肽包含与SEQID NO：4的22至450位氨基酸具有至少70％同一性的氨基酸序列，优选地包含与SEQ ID NO：4的22至450位氨基酸具有至少75％，更优选地具有80％，甚至更优选地具有85％，甚至更优选地具有90％，更优选地具有95％，且最优选地具有至少97％同一性的氨基酸序列。
还有另一优选的实施方案涉及第一方面的多核苷酸，其中多肽包含SEQID NO：4的22至450位的氨基酸。
在优选的实施方案中本发明涉及第一方面的多核苷酸，其中多肽由SEQID NO：4的22至450位氨基酸组成。
还有另一优选的实施方案涉及第一方面的多核苷酸，其中多肽包含这样的氨基酸序列，其与下述大肠杆菌宿主的质粒中所***多核苷酸的淀粉酶编码部分所编码的多肽具有至少70％的同一性，其中所述大肠杆菌宿主根据布达佩斯条约保藏在DSMZ，保藏号为DSM 15334；优选地与下述大肠杆菌宿主的质粒中所***多核苷酸的淀粉酶编码部分所编码的多肽具有75％的同一性，更优选地至少80％同一性，至少85％同一性，至少90％同一性，至少95％同一性，或具有至少97％的同一性，其中所述大肠杆菌宿主根据布达佩斯条约保藏在DSMZ，保藏号为DSM 15334；优选地，此多肽包含下述大肠杆菌宿主的质粒中所***多核苷酸的淀粉酶编码部分所编码的氨基酸序列，其中所述大肠杆菌宿主根据布达佩斯条约保藏在DSMZ，保藏号为DSM 15334；更优选地，此多肽由下述大肠杆菌宿主的质粒中所***多核苷酸的淀粉酶编码部分所编码的氨基酸序列组成，其中所述大肠杆菌宿主根据布达佩斯条约保藏在DSMZ，保藏号为DSM15334。
另一优选的实施方案涉及第一方面的多核苷酸，其中多肽是包含这样氨基酸序列的人工变体，其与下述大肠杆菌宿主的质粒中所***多核苷酸的淀粉酶编码部分所编码的氨基酸序列相比，具有一个或多个截短、和/或氨基酸的至少一个替换、缺失、和/或***，其中所述大肠杆菌宿主根据布达佩斯条约保藏在DSMZ，保藏号为DSM 15334。
核酸构建体
术语“核酸构建体”用于此处是指这样的单链或双链核酸分子，其分离自天然存在的基因，或其已经过修饰，以包含以自然界不存在的方式存在的核酸片段。
当核酸构建体包含本发明的编码序列表达所需的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。可从多种途径操作本发明中编码多肽的多核苷酸来提供多肽的表达。***载体之前对核苷酸序列的操作是值得的或是依赖于表达载体所必要的。利用重组DNA方法修饰核苷酸序列的技术是本领域公知的。
此处所述术语“控制序列”包括对本发明的多肽表达所必要或有利的所有组分。每个控制序列对编码多肽的核苷酸序列来说可是天然的或是外来的。这些控制序列包括但不限于前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽(propeptide)序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少，控制序列包括启动子、转录和翻译停止信号。控制序列可拥有连接子，用于引入特异的限制性位点，该位点促进控制序列与编码多肽的核苷酸编码序列编码区的连接。
此处术语“有效地连接”定义为下述构型，在此构型中控制序列合适地置于与DNA序列的编码序列相关的位置，从而控制序列指导多肽的表达。
此处所用术语“编码序列”意指直接指定其蛋白质产物的氨基酸序列的核苷酸序列。通常由ATG起始密码子开始的开放阅读框架一般决定了编码序列的边界。编码序列一般包括DNA、cDNA和重组核苷酸序列。
本发明的一个方面涉及核酸构建体，该核酸构建体包含如第一方面所述的多核苷酸有效地连接到一个或多个指导多肽在适宜宿主中产生的控制序列上。
表达载体
在本上下文中，术语“表达”包括多肽合成中有关的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
在本上下文中，术语“表达载体”包含线性或环形的DNA分子，该DNA分子包含编码本发明多肽的片段，且其有效连接到另外提供转录的片段上。
本发明的一方面涉及重组表达载体，该载体包含如前一方面所述的核酸构建体。
根据本发明，编码本发明淀粉酶的多核苷酸能够利用表达载体来表达，所述表达载体一般包括控制序列，例如启动子、操纵子、核酸结合位点、翻译起始信号和任选地抑制子基因或多种激活子基因。携带编码本发明α-淀粉酶的多核苷酸的重组表达载体可为任何一个可进行重组DNA操作的载体，载体的选择常常取决于其所导入的宿主细胞。导入的载体可为这样一个载体，当其导入宿主细胞时，整合到宿主细胞基因组并与其整合的染色体一同复制。合适的表达载体的例子包括pMT838。
在载体中，DNA序列应当有效地连接到合适的启动子序列上。启动子可为任何DNA序列，该序列在选择的宿主细胞中显示转录活性，且可来源于与宿主细胞同源或异源的蛋白质的编码基因。
本发明的表达载体还可包含一个合适的转录终止子，且在真核生物中，多聚腺苷酸化序列有效地连接到编码本发明α-淀粉酶变体的DNA序列上。终止序列和多聚腺苷酸化序列可适宜地与启动子来自于相同的来源。
载体进一步可包含能使载体在所述宿主细胞中复制的DNA序列。质粒pUC19、pACYC177、pUB110，、pE194，、pAMB1和pIJ702复制起点就是这种序列的例子。
载体也可包含可选择标记，例如，其产物可弥补宿主细胞缺陷的基因，例如，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)中的dal基因，或赋予其抗生物素抗性例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的基因。此外，载体可包含曲霉属的选择标记，例如amdS、argB、niaD和sC(可产生潮霉素抗性的标记)，或可通过共转化来完成的选择，例如，如WO 91/17243所述。
用于分别连接本发明的编码葡糖淀粉酶变体、启动子、终止子和其它元件的DNA构建体以及将它们***到含有复制必需信息的适当载体的方法，对本领域技术人员是众所周知的(参见，例如，Sambrook等人，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，1989)。
指导编码本发明α-淀粉酶变体的DNA序列转录尤其是在细菌宿主中转录的合适启动子的例子，有大肠杆菌lac操纵子的启动子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因dagA启动子、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)生麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)的启动子、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)xylA和xylB基因的启动子等等。对于真菌宿主的转录，有用启动子的非限制性的例子是那些来源于下述编码基因的启动子：米曲霉TAKA淀粉酶基因的启动子、来自于酿酒酵母的TPI(磷酸丙糖异构酶)启动子(Alber等人(1982)，J.Mol.Appl.Genet 1，p.419-434)、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(A.niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶或构巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶的启动子、以及其突变的、截短的、和/或杂化启动子(hybrid promoter)。
丝状真菌宿主细胞的优选终止子的例子是从下述基因得到的：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶和尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶的基因。
控制序列也可为合适的前导序列、mRNA中对宿主细胞的翻译过程重要的非翻译区域。前导序列有效地连接到编码多肽的核苷酸序列的5’端。任何在所选的宿主细胞中有功能的前导序列均可用于本发明。
丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉磷酸丙糖异构酶基因中获得。
控制序列也可为有效地连接于核苷酸序列3’末端的多聚腺苷酸化序列，并在转录时作为添加多腺苷酸残基到转录的mRNA的信号而被宿主细胞识别。任何在所选地宿主细胞中有功能的多聚腺苷酸化序列均可用于本发明。
丝状真菌宿主细胞优选的多聚腺苷酸化序列从下述基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡萄糖苷酶。
控制序列也可为信号肽编码区域，该区域编码连接到多肽氨基末端上的氨基酸序列，指导所编码的肽进入细胞的分泌途径。核苷酸序列的编码序列的5’端可固有一个天然地与编码区域片段一起连接到翻译阅读框架中的信号肽编码区，该编码区编码分泌的多肽。备选地，编码序列的5’端可包含对于编码序列是外来的信号肽编码区域。在编码序列天然不包含信号肽编码区域时，可能需要外来的信号肽编码区域。备选地，外来的信号肽编码区域可能仅仅是代替了天然信号肽编码区域以增强多肽的分泌。然而，任何指导表达蛋白进入所选宿主细胞分泌途径的信号肽编码区域均可用于本发明。
对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码区域可以是从下述基因获得的信号肽编码区域：芽孢杆菌NCBI 11837生麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT，nprS，nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因。Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews 57：109-137描述了更多信号肽。
丝状真菌宿主细胞的有效信号肽是从下述基因中获得的信号肽：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens纤维素酶和Humicola lanuginosa脂肪酶的基因。
控制序列也可为编码定位于多肽氨基末端的氨基酸序列的多肽编码区域。所得的多肽已知为酶原或前多肽(或在一些情况下为酶原)。前多肽通常是非活性的，且能够通过催化或自身催化分解而从前多肽转变成成熟有活性的多肽。前肽编码区域可以从下述基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α-因子、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)漆酶(WO 95/33836)的基因。在信号肽和前肽区域都存在于多肽的氨基端时，前肽区域定位于紧邻多肽的氨基端，信号肽区域定位于紧邻前肽区域的氨基端。
添加与宿主细胞生长相关的允许调节多肽表达的调节序列是值得做的。那些响应化学或物理刺激引起基因表达的开或关的调节***是调节***的例子，其包括调节化合物的存在。原核***中的调节***包括lac、tac和trp操纵子***。在丝状真菌中，TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子可用作调节序列。
调节序列的其它例子是那些允许基因扩增的序列。在真核***中，这些包括在氨甲蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的核苷酸序列将有效地与调节序列连接在一起。
载体可为自主复制载体，即以染色体外实体存在的载体，它的复制独立于染色体的复制，例如，质粒(一种染色体外的元件)、微型染色体或人工染色体。
载体可包括确保自我复制的任一工具。备选地，载体可为一个这样的载体，当其导入宿主细胞时整合进基因组并与其所整合的染色体一同复制。而且，可使用单个载体或质粒、或者两个或多个载体或质粒、或者转座子，其中所述两个或多个载体或质粒合起来含有导入宿主细胞基因组的总DNA。
本发明的载体优选地包含一个或多个可选择标记，使转化细胞容易选择。可选择标记是一个基因，其产物提供了杀虫剂或病毒抗性、对重金属的抗性、原养型至营养缺陷型等。
细菌可选择标记的例子有枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者赋予抗生物素抗性例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的基因。用于丝状真菌宿主细胞的可选择标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰转移酶)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸盐还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰基转移酶)、trpC(邻氨基苯甲酸合成酶)以及其等同物。
优选地用于曲霉属细胞的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
本发明的载体优选地包含这样的元件，它允许载体稳定整合入宿主细胞的基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制。
对于进入宿主细胞基因组的整合，载体可依赖于编码多肽的核苷酸序列或载体的其它元件，用于通过同源或非同源重组稳定整合进基因组。备选地，载体可包含另外的核苷酸序列指导通过同源重组进入宿主细胞基因组的整合。另外的核苷酸序列使载体在染色体精确的位置处整合进入细胞基因组。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应当优选地包含充分数量的核苷酸，比如100至1500碱基对，优选地400至1500碱基对，且最优选地800至1500碱基对，其与相应靶序列高度同源，以增加同源重组的可能性。整合元件可为任何与宿主细胞基因组的靶序列同源的序列。而且，整合元件可为非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，载体可以通过非同源重组整合进入宿主细胞基因组。
对于自主复制，载体进一步可包含能够使载体在所述宿主细胞中自主复制的复制起点。细菌复制起点的例子有：允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌中复制的pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。AMA1序列就是在丝状真菌宿主细胞中确保自主维持序列的例子。复制起点可为一个具有突变的序列，该突变使其在宿主细胞中具有功能性温度敏感(参见，例如，Ehrlich，1978，Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 75：1433)。
本发明的多于一个拷贝的核苷酸序列可以***到宿主细胞以增加基因产物的产生。核苷酸序列拷贝数量的增加能够通过整合至少一个额外拷贝的此序列进入宿主细胞基因组，或通过随核苷酸序列包含一个可扩增的选择标记基因来获得，其中此细胞包含可选择标记基因的扩增拷贝，因此核苷酸序列的额外拷贝能够通过在合适的选择性试剂中培养细胞来筛选。
宿主细胞
包含如上所述的本发明DNA构建体或表达载体的本发明细胞，有利地用作本发明α-淀粉酶变体的重组产生的宿主细胞。该细胞可用编码本发明变体的DNA构建体便利地通过将DNA构建体(一个或多个拷贝)整合到宿主染色体来获得转化。整合通常被认为是有利条件，因为DNA序列更可能在细胞中稳定地维持。DNA构建体整合到宿主染色体可以根据常规的方法来实施，例如，通过同源或异源重组。备选地，细胞可以用上述与不同类型宿主细胞相关的表达载体来转化。
本发明的细胞可以是高等生物体例如哺乳动物或昆虫的细胞，但是优选地是微生物细胞，例如，细菌或真菌(包括酵母)细胞。
适合的细菌的例子有：***，例如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、短芽孢杆菌(bacillus brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)或变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)，或者革兰氏阴性细菌例如大肠杆菌。细菌的转化可通过例如原生质体转染或利用感受态细胞以本来已知的方式来实现。
宿主细胞也可为丝状真菌，例如，属于曲霉属最优选地米曲霉或黑曲霉的菌株，或镰孢属的菌株，例如尖孢镰孢、禾谷镰孢(Fusariumgraminearum)(在理想状态称为Gribberella zeae，先前称为Sphaeriazeae，与Gibberella roseum和Gibberella roseum f.sp.cereals同义)、或硫色镰孢(Fusarium sulphureum)(在理想状态称为Gibberella puricaris，与Fusarium trichothecioides、杆孢状镰孢、接骨木镰孢(Fusariumbactridioides)、Fusarium sambucium、粉红镰孢(Fusarium roseum)和Fusarium roseum var.graminearum同义)、Fusarium cereals(与Fusariumcrokkwellnse同义)、或Fusarium venenatum的菌株。
在本发明优选的实施方案中，宿主细胞是蛋白酶缺陷的或蛋白酶欠缺的菌株。例如可以是曲霉属的蛋白酶缺陷株，尤其是具有删除了名为“alp”的碱性蛋白酶基因的米曲霉菌株例如米曲霉JaL125。此菌株在WO97/35956(Novo Nordisk)中有描述。
丝状真菌细胞可以通过包括原生质体形成和转化及随后的细胞壁重建的过程以本来已知的方式来进行转化。将曲霉属作为宿主微生物在EP 238023(Novo Nordisk)中有所描述，引用其内容作为参考。
本发明的一方面涉及包含上述核酸构建体或至少一个上述表达载体的拷贝的重组宿主细胞。优选的实施方案涉及前一方面的细胞，所述细胞是微生物；优选地是细菌或真菌的细胞；更优选地是***细胞例如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌，或最优选地是真菌曲霉属尤其是米曲霉的蛋白酶缺陷菌株的细胞。
产生本发明α-淀粉酶变体的方法
在进一步的方面，本发明涉及产生本发明α-淀粉酶变体的方法，该方法包括在有益于变体产生的条件下培养宿主细胞，和从细胞和/或培养基中回收变体。
用于培养细胞培养基可为任何适于所述宿主细胞生长和α-淀粉酶变体获得表达的常规培养基。合适的培养基可从商业供应商得到或根据公开的配方配备(例如，the American Type Culture Col-lection的目录所述)。
宿主细胞分泌的α-淀粉酶变体可通过熟知的方法方便地从培养基中回收，所述方法包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，和通过盐例如硫酸胺的方式沉淀蛋白质级分，接着利用层析方法例如离子交换层析、亲和层析等。
使用如此产生的淀粉酶的多种方法以及更多具体用途在本发明的其它方面已列出，如已经在本发明概述中提到。
本发明提供了利用本发明多核苷酸编码的α-淀粉酶从淀粉产生葡萄糖或麦芽糖等的方法。
通常，方法包括，在α-淀粉酶存在下部分水解前体淀粉和然后在葡糖淀粉酶存在下通过剪切α-(1 4)和α-(1
Figure A20038010651400232
6)糖苷键进一步水解从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原性末端释放D-葡萄糖的步骤。
利用α-淀粉酶的前体淀粉的部分水解通过水解内部的α-(1
Figure A20038010651400233
4)-键提供了淀粉分子的初步分解。商业应用中，利用α-淀粉酶的初步水解在大约105℃的温度下进行。对高的淀粉浓度通常是30％到40％的干燥固体进行处理。初步水解通常在此提高的温度下进行约5分钟。然后将部分水解的淀粉转移至第二个罐中，在85℃到90℃下孵育大约一小时以获得10到15的葡萄糖等同物(D.E.)。
在葡糖淀粉酶存在下进一步水解，从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原性末端释放D-葡萄糖的步骤，通常在30℃与60℃之间的降低的温度下在单独的罐中进行。优选地底物液体的温度降至55℃和60℃之间。溶液的pH从6-6.5降至3-5.5。优选地，溶液的pH是4-4.5。葡糖淀粉酶加入溶液中且反应进行24-72小时，优选地36-48小时。
由本发明的多核苷酸编码的α-淀粉酶也可用于酿造过程。此外，本发明的多核苷酸编码的α-淀粉酶可用于麦芽糖生产。高麦芽糖糖浆一般如下生产。为生产“高麦芽糖糖浆”(包含50％-55％的麦芽糖)，淀粉要液化至DE10-20。将液化淀粉的pH和温度分别调至65℃和pH约5.0，且置于生麦芽糖淀粉酶活性(例如，嗜热脂肪芽孢杆菌淀粉酶，例如MaltogenaseTM 4000L，0.4I/t DS(Novozymes))，支链淀粉酶活性(例如，支链淀粉酶芽孢杆菌(Bacillus pullulanase)，例如PromozymeTM 600L，0.3I/t DS(Novozymes))和α-淀粉酶活性(例如，BAN 240L或TermamylTM 120L，type LS，0.4kg/t DS(Novozymes))中24-41小时。具体的处理时间取决于所要达到的目的糖图谱。通过增加生麦芽糖α-淀粉酶和支链淀粉酶的量，麦芽糖含量能够得以增加。
备选地，“高麦芽糖糖浆”可以通过下述步骤生产：首先液化淀粉至DE10-20，然后调整pH和温度至55℃或更高且pH约5.5或更低，然后将液化淀粉置于真菌α-淀粉酶的活性(例如，嗜热脂肪芽孢杆菌淀粉酶，例如FungamylTM 800L(Novozymes))中22-44小时。真菌FungamylTM800L的量取决于预见的糖化作用的时间，例如，200g/tDS 44小时和400g/t DS 22小时。在以上过程中本发明的多核苷酸编码的α-淀粉酶可以取代FungamylTM 800L，然后温度可更高且pH更低，可达到更高的转化率从而产生更好更全面的节约。
为生产麦芽糖含量为55-65％的“高麦芽糖糖浆”淀粉，淀粉要液化至DE10-20。液化淀粉的温度和pH调整至60℃或更高，pH至约6或更低，置于生麦芽糖α-淀粉酶活性(例如，MaltogenaseTM 4000L，0.25-1.0I/t DS(Novozymes))和真菌α-淀粉酶活性(例如，曲霉属淀粉酶，例如Fungamyl)TM 800L，0.4-1.0kg/t DS(Novo Nordisk))中24-48小时；或者置于本发明的多核苷酸编码的α-淀粉酶更短的时间。
本发明的α-淀粉酶变体也可用于烘焙工艺。本发明的一方面涉及本发明的变体对于淀粉转化、醇生产、酿造和烘焙的用途。
本发明也涉及生产麦芽糖糖浆的方法，该方法包括下述步骤：1)在α-淀粉酶存在下液化淀粉；2)在本发明的真菌α-淀粉酶变体存在下糊精化；和3)回收糖浆并任选地纯化糖浆。
在步骤1)中用于液化的α-淀粉酶可以是任何α-淀粉酶。优选的α-淀粉酶是芽孢杆菌α-淀粉酶，例如Termamyl-样α-淀粉酶，包括地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(商业上可获得的如TermamylTM(NovoNordisk))、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶(出售的如BAN(Novo Nordisk)、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(出售的如TermamylTM 120L typeS)、来自芽孢杆菌菌株NCIB 12289、NCIB 12512、NCIB 12513或DSM 9375的α-淀粉酶(在WO 95/26397中均有详述)、和由Tsukamoto等人，Biochemical and Biophysical Research Communications，151(1988)，25-31页所述的α-淀粉酶。在“Termamyl-样α-淀粉酶”定义中的α-淀粉酶在例如WO 96/23874(Novo Nordisk)中有描述。
另一方面本发明涉及生产麦芽糖的方法，包括下述步骤：1)在温度140-160℃，pH4-6下液化淀粉；2)本发明的真菌α-淀粉酶变体存在时pH4-6，60-95℃尤其是在65-85℃，例如70-80℃的温度下糊精化；和3)回收糖浆和任选地纯化糖浆。
在本发明的实施方案中，在步骤2)中加入有效量的葡糖淀粉酶。本实施方案(包括用葡糖淀粉酶的处理)中的糖浆将不是麦芽糖糖浆，而是有着不同糖图谱的糖浆。葡糖淀粉酶可以是曲霉属葡糖淀粉酶，尤其是黑曲霉葡糖淀粉酶。
备选地，该方法包括如下步骤：1)在芽孢杆菌α-淀粉酶存在时，在温度95-110℃，pH4-6下液化淀粉；2)在如本发明第一方面所述的多核苷酸编码的α-淀粉酶存在时，在温度70-95℃，pH4-6下液化淀粉，随后回收和/或任选纯化所得产物。
最后，本发明的一些方面涉及多种去垢剂的用途。一方面涉及包含如第一方面所述多核苷酸编码的α-淀粉酶的去垢添加剂，优选地以无粉尘颗粒、稳定的液体或受保护酶的形式存在。此方面的优选实施方案涉及每克添加剂中包含0.02-200mg酶蛋白质的去垢添加剂。另一优选实施方案涉及根据前一方面的去垢添加剂，其另外包含其它酶，例如蛋白酶、脂肪酶、过氧化物酶、其它淀粉分解酶和/或纤维素酶。另一方面涉及包含如第一方面所述多核苷酸编码的α-淀粉酶的去垢剂组合物，该方面的优选实施方案涉及另外包含其它酶例如蛋白酶、脂肪酶、过氧化物酶、其它淀粉分解酶和/或纤维素酶的去垢剂组合物。还有另一方面涉及手工或自动的洗碗盘的去垢剂组合物，该组合物包含如第一方面所述多核苷酸编码的α-淀粉酶变体。优选的洗碗盘去垢剂组合物另外包含其它酶，例如蛋白酶、脂肪酶、过氧化物酶、其它淀粉分解酶和/或纤维素酶。去垢剂最后所涉及的方面是手工的或自动的洗衣洗涤组合物，其包含如第一方面所述的多核苷酸编码的α-淀粉酶；且优选的洗衣洗涤组合物相应地另外包含其它酶，例如蛋白酶、脂肪酶、过氧化物酶、淀粉分解酶和/或纤维素酶。
实施例
实施例1
从微小根毛霉NN046782中纯化并表征α-淀粉酶。
命名为AM782的α-淀粉酶纯化于嗜热真菌菌株NN046782的培养基，发现其在60、70和80℃，pH＝5.0、6.0和7.0时比BAN(解淀粉芽孢杆菌)淀粉酶更加稳定。特性概述如下：
分子量(SDS)＝50kDa(SDS-PAGE)
pI              pH3.5
活性pH范围      pH3-9
最适pH          pH4-5
活性温度范围    30-80℃
最适温度        70℃
pH稳定性        在pH＝5、6、7下稳定
真菌生长培养基
YG：酵母-葡萄糖琼脂
5.0g Difco粉状酵母提取物；        10.0g葡萄糖
20.0g琼脂；                       1000ml自来水
121℃高压灭菌15-20分钟。
FG-4培养基50ml/瓶：
30g大豆粉，                       15g麦芽糖
5g蛋白胨                          1000ml水
1g橄榄油(2滴/瓶)
50ml放入带有2挡板的500ml锥形瓶。121℃高压灭菌30分钟。
在YG琼脂平板(4.5cm直径)上45℃黑暗中培养真菌3天，用于接种摇瓶。用前将长满真菌培养物的平板置于4℃存放。
对于酶的产生，将上述平板中长满真菌培养物的4-6个琼脂塞(plugs)用于接种一个含有FG-4的摇瓶，45℃下160转/分钟72小时培养，然后在8000转/分钟和4℃下离心培养基30分钟来收获。收集上清用于酶纯化。
化学药品和试剂
BAN标准和FungamylTM 800L(NovozymesA/S，Denmark)用作基准。
AZCL-直链淀粉(Megazyme)用于酶试验。
其它化学试剂和缓冲液包括：
25mM Tris-HCI，pH7.0；25mM Tris-HCI；1M NaCI，pH7.0；0.1MNa3PO4/柠檬酸，pH5.5；硫酸胺；0.1M NaAc，pH5.0；0.1M MES，pH6.0；0.1M Tris-HCI，pH7.0缓冲液用于pH谱：100mM琥珀酸，100mMHEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl2，150mM KCI，0.01％TritonX-100，用HCI或NaOH调整至pH值2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0和11.0。
酶活性测试
微量滴定板试验：
用上清通过微量滴定板测定法来测试α-淀粉酶活性。将0.2％的蓝色底物AZCL-直链淀粉(Megazyme)溶液在搅拌下悬于0.1M的磷酸柠檬酸盐缓冲液(pH5.5)或Tris-HCl缓冲液(pH7)中。搅拌下将溶液分装入微量滴定板(200μl每孔)。加入20μl酶样品，在Eppendorf热搅拌器中50℃和650转/分钟孵育平板15-30分钟。100℃煮沸20分钟制备变性的酶样品，然后用作空白对照。孵育后通过4℃下3000转/分钟离心5分钟将有色液体与固体分离开。然后将150μl上清转至微量滴定板，用BioRadMicroplate Reader在595nm下测定吸光度。
Eppendorf管测定：
将0.2％的蓝色底物AZCL-直链淀粉(Megazyme)溶液在搅拌下悬于不同pH值的缓冲液。搅拌下将溶液分装入1.5ml的Eppendorf管(每管900μl)，每管加入100μM酶样品，然后将它们在50℃水浴中孵育10-60分钟。变性的酶样品(100℃煮沸20分钟来制备)用作空白对照。孵育后通过在4℃下5000转/分钟离心10分钟将有色溶液与固体分离开。然后将200μl的上清转至微量滴定板并用BioRad Microplate Reader在595nm测定吸光度。
等电聚焦
等电聚焦根据厂商的使用说明书在预制的pH3.5-9.5的Apholine PAG板(Pharmacia，Sweden)中进行。样品一式三份进行，电泳后将胶分为三份。将在pH5-7的缓冲液中含1％琼脂糖和0.4％AZCL-直链淀粉的覆盖层注入每部分凝胶，所述凝胶在45℃孵育12-16小时。酶活性和酶蛋白质的pI通过蓝带进行鉴定。
SDS-PAGE
为检测所纯化酶的纯度和确定其分子量，用30μl的酶样品进行12％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。100V跑胶1.5小时并用考马斯亮兰染色。
酶纯化
用硫酸胺(80％饱和)沉淀菌株NN046782的300ml上清并再溶解在20ml 25mM pH7.0的Tris-HCl缓冲液中，然后用同样的缓冲液透析并通过0.45mm的滤器过滤，终体积为200ml。将溶液加入用pH7.0、25mMTris-HCl缓冲液平衡过的35ml Source 15Q柱，并用线性NaCl梯度(0-0.3M)洗脱蛋白质。在pH5.5时分析从柱中所得的级分对于AZCL-直链淀粉的淀粉酶活性。将有淀粉酶活性的级分混合。然后将混合的溶液超滤，浓缩的溶液加入到用pH7.0的25mMTris-HCl平衡过的180mlSuperdex75柱中，用相同的缓冲液洗脱蛋白质。包含淀粉酶的级分通过SDS-PAGE进行分析并将纯级分混合。
酶特性描述
pH谱：
20μl酶样品和在下述有着不同pH的缓冲***(100mM琥珀酸，100mMHEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCI2，150mM KCI，0.01％Triton X-100，用HCI或NaOH调整至pH值2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0)中的200μl 0.2％AZCL-直链淀粉在微量滴定板中混合并在反应前置于冰上。通过将微量滴定板转至Eppendorf热搅拌器中开始测定，测定温度设置为50℃。将此板在Eppendorf热搅拌器上以650转/分钟的震动速度孵育20分钟。通过将板移回冰浴终止孵育。然后在冰冷离心机中将此板离心几分钟并将150μl上清移至新的微量滴定板。读取吸光度-OD595作为淀粉酶活性的测量尺度。所有反应重复进行三次，缓冲液空白包括在测试中(代替酶)。BAN和FungamylTM商业化的酶用作阳性对照。结果如图1所示。
温度谱：
装有200μl溶在0.1M pH5.5Na3PO4/柠檬酸缓冲液中的0.2％AZCL-直链淀粉的Eppendorf管在20、30、40、50、55、60、70、80℃下预孵育。通过将20μl酶样品与缓冲液混合而开始测定。管子在Eppendorf热搅拌器上以其最高震动速度(1400转/分钟)孵育10分钟。通过将管移至冰浴终止孵育。然后将管子在冰冷离心机上离心几分钟并将150μl上清移至微量滴定板中。读取OD595作为淀粉酶活性的测量尺度。所有反应均重复三次且缓冲液空白包括在测定中(代替酶)。BAN和FungamylTM用作对照。结果如图2所示。
pH和温度稳定性：
Eppendorf管中的80μl酶样品(用0.1M NaAc pH5.0，0.1M MESpH6.0，0.1M Tris-HCI pH7.0分别稀释)在Eppendorf热搅拌器上，于60、70、80℃和300转/分钟的震动孵育5、10、15和20分钟。通过将管子移回冰浴终止孵育。未孵育的样品用作对照。将20μl上述孵育的样品移入新的微量滴定板中并加入200μl溶于0.1M Na3PO4/柠檬酸缓冲液pH5.5中的0.2％AZCL-直链淀粉。通过将微量滴定板转至Eppendorf热搅拌器中开始测定，测定温度设置为50℃。将此板在Eppendorf热搅拌器上以650转/分钟的震动速度孵育30分钟。通过将板移回冰浴终止孵育。然后将板在冰冷离心机上离心几分钟并将150μl上清移至新的微量滴定板中。读取OD595作为淀粉酶活性的测量尺度。所有反应均重复三次且缓冲液空白包括在测定中(代替酶)。BAN和FungamylTM用作对照。结果如图3-5所示。
副活性(side activity)测试：
纯化的淀粉酶在pH7.0的下述底物中测试：AZCL-半乳甘露聚糖、AZCL-β-葡聚糖、AZCL-右旋糖酐、AZCL-木糖葡聚糖、AZCL-马铃薯半乳聚糖、AZCL-***聚糖(arabinan)、AZCL-支链淀粉、AZCL-木聚糖、AZCL-半纤维素(he-cellulose)、AZCL-酪蛋白。在任何底物中均未检测出副活性。
纯化的淀粉酶的纯度在12％SDS-PAGE中检查，在SDS-PAGE中显示此酶的分子量大约50KDa，通过IEF所确定的AM782的pI大约是3.5。
实施例2
克隆编码微小根毛霉NN046782的AM782α-淀粉酶基因。
真菌菌株及其培养
微小根毛霉NN046782在45℃、165转/分钟在含有2％淀粉的FG4培养基中培养48小时。通过7000转/分钟离心30分钟收获菌丝体。收获的菌丝体在用于RNA提取前储存在-80℃。
总RNA的提取
利用RNeasy Mini Kit(Qiagen)从100mg菌丝体中提取总RNA。
特异引物
来自于微小根毛霉NN046782的淀粉酶AM782被发现有着与我们在前一项目中鉴定和测序的微小根毛霉NN101459菌株的淀粉酶编码基因相同的N-末端序列。因此从先前确定的DNA序列设计出两条特异引物，并将这些用于从NN046782克隆淀粉酶。
引物AM298-CDSF(SEQ ID NO：1)：5′tat cat gaa att cag cat
引物AM298-CDSR(SEQ ID NO：2)：5′agt tca aaa tgg aca aag t
用下列的PCR反应***和条件：
Pfu DNA聚合酶含MgSO4的10×PCR缓冲液   5μl
10mM dNTP混合物                        1μl
引物AM298-CDSF(10μM)                  1μl
引物AM298-CDSR(10μM)                  1μl
pfu DNA聚合酶(3u/μl)                0.5μl
cDNA合成反应(模板)                   2μl
加高压灭菌的蒸馏水至                 50μl
条件：
95℃                                 3分钟
95℃                                 30秒钟
45或50或53℃                         30秒钟        40个循环
72℃                                 3分钟
72℃                                 7分钟
PCR产物用琼脂糖凝胶显示并将特异条带进行鉴定和纯化。从而0.3μl的该PCR产物用作模板在下列条件下进行第二轮PCR。
Pfu DNA聚合酶含MgSO4的10×PCR缓冲液 5μl
10mM dNTP混合物                      1μl
引物AM298-CDSF(10μM)                1μl
引物AM298-CDSR(10μM)                1μl
pfu DNA聚合酶(3u/μl)                0.5ul
cDNA合成反应                         0.3μl
加高压灭菌的蒸馏水至                 50μl
条件：
95℃                                 3分钟
95℃                                 30秒钟
55℃                                 30秒钟    40个循环
72℃                                 3分钟
72℃                                 7分钟
扩增结果是一条大约1.5kb大小的特异条带。用Taq DNA聚合酶(PCR产物20μl，10×缓冲液2μl，Mg2+1μl，dATP(10mM)0.5μl，Taq聚合酶(5单位/μl)0.3μl)将PolyA尾加上并在72℃下孵育30分钟。用GFX Kit从凝胶中将加了dA-尾的片段回收并再溶解在30μl水中。然后将纯化的片段连接到pGEM-T载体中(通过混合2×缓冲液10μl、T载体(50ng/l)1μl、T4连接酶(3单位/l)1μl和纯化的PCR产物8μl；然后置之于4℃过夜)，并将它转化入感受态细胞(转化条件：1μl连接溶液和40μlDH10B感受态细胞在0.1cm的电穿孔杯(curvette)中，1.8KV)。通过菌落PCR筛选出8个阳性克隆。
菌落PCR***：
10×PCR缓冲液                         5μl
25mM MgCl2                           3μl
10mM dNTP混合物                       1μl
AM298-CDSF                            1μl
AM298-CDSR                            1μl
pfu聚合酶                             1μl
加高压灭菌的蒸馏水至                  50μl
将一个白色菌落直接移至PCR混合物中作为模板。PCR条件如下：
94℃                                  3分钟
94℃                                  30秒钟
55℃                                  30秒钟    30个循环
72℃                                  1分钟
72℃                                  10分钟
PCR反应后，10μl PCR产物加到在0.5×TBE缓冲液中的1％琼脂糖中，在90V下跑胶1小时，然后在紫外线下观察，所有菌落显示阳性结果。
然后用Wizards Plus Minipreps DNA纯化***(Promega)从8个克隆中的3个克隆提取质粒。用两个引物AM298-CDSF和AM298-CDFR及ET terminater kit(Amersham)测定质粒序列且3个克隆结果一致，其全长序列显示于SEQ ID NO：3中。
包含编码α-淀粉酶AM782DNA序列的质粒已转化入大肠杆菌DH10B菌株中，该菌株由发明人根据布达佩斯条约于2002年11月29日以保藏号DSM15334保藏在德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)，Mascheroder Weg 1b，D-38124Braunschweig，德意志共和国，上述布达佩斯条约是有关用于专利程序目的的微生物保藏的国际认可。保藏物由Novozymes A/S制作。认为此质粒的DNA序列包含SEQID NO：3的DNA序列。
cDNA克隆的进一步序列分析显示此序列包含1413个核苷酸的编码区域。编码区域的翻译产物是471个氨基酸的多肽。推导出的由此基因编码的氨基酸序列带有一个信号肽(氨基酸1-21)和一个成熟肽(氨基酸22-471)，显示于SEQ ID NO：4中。
实施例3
AM782淀粉酶的亚克隆和异源表达。
菌株和质粒
用作表达宿主的米曲霉菌株BECh2具有下列基因型：amy-、alp-、Npl-、CPA-、KA-。大肠杆菌DH5α(InvitrogenTM)在表达载体的构建中用作克隆宿主。表达质粒pDAu71(图6)包含构巢曲霉amdS基因，作为在曲霉属中的筛选基因，还包含氨苄抗性基因用于大肠杆菌的筛选，使用了两拷贝的具有3个额外amyR位点的黑曲霉NA2启动子(中性淀粉酶)+构巢曲霉TPI启动子5’非翻译部分用于异源表达，并使用了黑曲霉AMG终止子。
PCR扩增：
10×PCR缓冲液(包含MgCl2)           5μl
2.5mM dNTP混合物                    5μl
168/R.p.amy3-正向引物(10μM)        5μl
169/R.p.amy4-反向引物(10μM)        5μl
Expand高保真聚合酶(Roche)           0.5μl
模板DNA                             1μl
加高压灭菌的蒸馏水至             50μl
条件：
95℃                             1分钟      1个循环
94℃                             30秒
60℃                             30秒       20个循环
72℃                             1.30分钟
72℃                             2分钟      1个循环
质粒pPFJo143(图7)的构建：从包含全长cDNA的质粒中PCR扩增出包含AM782基因的DNA片段，用从全序列设计的引物：
引物168/R.p.amy3-正向(SEQ ID NO：5)：gaagatctaccatgaaattcagcatctctctc
引物169/R.p.amy4-反向(SEQ ID NO：6)：ccgctcgagttaagcagaggtgaagatagc
引物末端分别具有克隆限制性位点BglII-Xhol。来自于PCR反应的PCR产物合并物用于克隆。用BglII和Xhol消化PCR产物并克隆入用BamHI和Xhol消化过的pDAu71。对PCR产物测序并证实与原始序列一致。
BECh2的转化是通过涉及原生质体形成和转化的方法来完成的。用于曲霉属转化的合适方法在EP 0238023和Yelton等人，1984，Proceedingsof the National Academy of Sciences USA 81：1470-1474中有述。将转化子分离并在小Nunc-容器的10ml YPM中(1％酵母提取物，2％细菌培养用蛋白胨和2％麦芽糖)30℃培养3天(旋转)。
SDS-PAGE凝胶电泳：将来自上述10ml培养物的10μl上清样品进行SDS-凝胶电泳。用SYPRO Orange Protein Gel Stain(Molecular Probes)对凝胶进行染色。
α-淀粉酶通过PNP如下进行鉴定。配制工作液：5mlα-葡萄糖苷酶溶液+1ml底物溶液(PNP-底物)。TermamylTM作为标准(浓度0-100NU/ml)。稀释用缓冲液：50mM乙酸、硼酸和磷酸及0.1mM CaCl2+0.25％BRIJ35。20μl上清在微量滴定板中孵育2分钟。加入200μl工作液。在3分钟期间测定405nm处的动力学。
将PCR扩增的ORF克隆进表达载体pDAu71，结果形成如材料和方法中所述的pPFJo143(图7)。将质粒转化进BECh2(米曲霉)。分离出10个转化子，在YPM中培养3天并将上清跑SDS-PAGE。这显示了表达从非常少至相当好的不同表达水平。分子量约为50kDa，与野生型酶的情况一致。选择转化子BECh2/pPFJo143-9发酵，以小规模纯化淀粉酶。α-淀粉酶测定根据材料和方法实施(表1)。用TermamylTM作为标准，且单位是NU/ml--意味着这仅仅给我们相对的数值，但我们可以看到活性和蛋白量间存在好的相关性。
表1：利用PNP-底物将从143-1至143-10的10个转化子发酵所得上清用于α-淀粉酶测定。数值是相对的。
实施例4
通过α-淀粉酶AM782进行麦芽糖糊***解的糖谱研究。
装置
恒温水浴Heto lab equipment DT1；pH计(Mettler MP220)；HPLCWaters***(A/P TSCN-QI-2411)；电子吸液器；分光光度计UV-1601；天平(Mettler AG 204)；折光计。
玻璃器具
250ml的有盖瓶；用于瓶的承重环(heavy rings)；500ml容量瓶；500ml烧杯；10ml玻璃试管。
酶
0.225FAU/ml的AM782α-淀粉酶，0.135FAU/g.ds的市售真菌淀粉酶FungamylTM 800L(Novozymes A/S，Denmark；AFN-000515)作为对照。
淀粉分解活性
α-淀粉酶活性可以以“真菌α-淀粉酶单位”(FAU)来表达。一个(1)FAU是在标准条件(即在37℃和pH4.7)下每小时分解5260mg固体淀粉(Amylum solubile，Merck)所需酶量。更详细地描述了此FAU测定的文件夹(folder)AF9.1/3，从Novozymes A/S，Denmark一经请求即可获得，引用此文件夹作为参考。
底物
DE11麦芽糖糊精FFS-99039
方案
分别设置两个温度为55℃和70℃的水浴。将53g麦芽糖糊精缓慢加入玻璃烧杯中的397g沸腾的Milli-Q水，同时用电子搅拌器搅拌，直到麦芽糖糊精溶解在水中。记录麦芽糖糊精溶液的重量并加入更多沸腾的水至450g。将麦芽糖糊精溶液移至水浴并冷却至水解温度。然后将麦芽糖糊精溶液分为两等份：一部分用1N HCl调整至pH5.0；剩余的保持它自然的pH(5.5)。底物浓度通过折光计来检测(DS大约10％)。
将麦芽糖溶液移至四个250ml的有盖瓶：瓶#1有90g pH5.5的溶液；瓶#2和#3有90g pH5.0的溶液；瓶#4有95g pH5.5的溶液。将瓶保持在水解温度的水浴中，瓶#1-3在70℃，瓶#4在55℃。
将10ml稀释的AM782酶(6mlAM782样品和4ml Milli-Q水)加入到每个包含90g溶液的瓶#1-3中，并将5ml稀释的FungamylTM(0.04gFungamyl溶在100ml Milli-Q水中)加入到包含95g溶液的瓶#4中。这样，AM782和FungamylTM剂量在相同的活性水平，即0.135FAU/g.ds。
测试每瓶的pH且每瓶的DS通过在T＝0小时采样来测量。其后，在水浴中孵育T＝3、6、9、21、24、28、45和48小时后从每个摇瓶取出4ml样品。
水解样品中的酶采样后通过煮沸样品15分钟立即失活，然后将它们冷却至室温用于HPLC分析。冷却后，测定每个样品的pH和DS，以确定样品的稀释度，然后用Milli-Q水稀释样品至DS＝5％的浓度。将样品与混合床的离子交换树脂(Bio-Rad AG501/X8(D))混合并将其静置20分钟，这样从样品中除去灰尘和可溶性N。然后将样品滤过0.2μm的滤器(Sartorius MINISARTTM NML 0.2微米)并将滤过的样品收集进HPLC瓶中通过HPLC分析。结果在下面的表2-4和图8中给出。
表2.在70℃和初始pH5.5的含有AM782(0.135FAU/g.ds.)的瓶#1。
  小时   pH   ％DS   ％DP1   ％DP2   ％DP3   ％DP4
  3   6.05   7.59   52.63   16.54   23.25
  6   6.03   13.74   57.39   8.61   20.26
  9   6.02   16.46   57.78   6.12   19.64
  21   5.88   19.08   58.57   4.37   17.98
  24   5.83   18.78   58.65   4.34   18.22
  28   5.82   18.47   58.92   4.25   18.37
  45   5.61   19.04   58.71   4.07   18.18
  48   5.58   12.3   18.72   58.59   4.28   18.42
表3.在70℃和初始pH5.0的含有AM782(0.135FAU/g.ds.)的瓶#2和#3
  小时   pH   ％DS   ％DP1   ％DP2   ％DP3   ％DP4
  3   5.89   7.34   51.74   16.56   24.37
  6   5.88   13.66   56.96   8.61   20.78
  9   5.87   16.13   57.29   6.53   20.05
  21   5.75   18.13   58.12   4.87   18.88
  24   5.72   17.99   58.33   5.02   18.68
  28   5.74   17.54   58.69   4.83   18.95
  45   5.53   17.79   58.45   4.87   18.90
  48   5.52   11.9   17.85   58.29   4.91   18.95
表4.在55℃和初始pH5.5的含有FungamylTM(0.135FAU/g.ds.)的瓶#4。
  小时   pH   ％DS   ％DP1   ％DP2   ％DP3   ％DP4
  20   6.12   10.8   1.41   45.27   28.19   25.13
  24   6.05   10.9   1.73   45.39   27.67   25.21
该实验显示淀粉酶AM782能够在很高的温度下起作用，至少高达70℃。淀粉酶AM782具有很高的反应速度；与同等剂量的FungamylTM 800L相比，淀粉酶AM782能在约3小时内达到FungamylTM所需24至48小时的效果。而且，淀粉酶AM782能够将DP3降解成DP2和DP1，从而可以提供更高的DP1结果。
序列表
<110>诺和酶股份有限公司
<120>耐热的α-淀粉酶
<130>10348.000-DK
<160>6
<170>PatentIn版本3.1
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物AM298-CDSF
<400>1
tatcatgaaa ttcagcat                                                    18
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物AM298-CDSR
<400>2
agttcaaaat ggacaaagt                                                   19
<210>3
<211>1438
<212>DNA
<213>微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)
<220>
<221>CDS
<222>(5)..(1417)
<223>
<220>
<221>sig_peptide
<222>(5)..(68)
<223>
<220>
<221>mat_peptide
<222>(68)..()
<223>
<400>3
tatc atg aaa ttc agc atc tct ctc tcg gca gca att gta ctc ttc gcg   49
     Met Lys Phe Ser Ile Ser Leu Ser Ala Ala Ile Val Leu Phe Ala
         -20                 -15                 -10
gcc gca aca agc ctt gca agc cct ttg ccc caa cag cag cga tat ggc    97
Ala Ala Thr Ser Leu Ala Ser Pro Leu Pro Gln Gln Gln Arg Tyr Gly
    -5              -1  1               5                   10
aaa aga gca act tcg gat gac tgg aaa agc aag gcc att tat cag ctg    145
Lys Arg Ala Thr Ser Asp Asp Trp Lys Ser Lys Ala Ile Tyr Gln Leu
                15                  20                  25
ctt aca gat cga ttt ggc cgc gcc gat gac tca aca agc aac tgc tct    193
Leu Thr Asp Arg Phe Gly Arg Ala Asp Asp Ser Thr Ser Asn Cys Ser
            30                  35                  40
aat tta tcc aac tac tgt ggt ggt acc tac gaa ggc att acg aag cat    241
Asn Leu Ser Asn Tyr Cys Gly Gly Thr Tyr Glu Gly Ile Thr Lys His
        45                  50                  55
ctt gac tac att tcc ggt atg ggc ttt gat gct atc tgg ata tcg cca    289
Leu Asp Tyr Ile Ser Gly Met Gly Phe Asp Ala Ile Trp Ile Ser Pro
    60                  65                  70
att ccc aag aac tcg gat gga ggc tac cac ggc tac tgg gct aca gat    337
Ile Pro Lys Asn Ser Asp Gly Gly Tyr His Gly Tyr Trp Ala Thr Asp
75                  80                  85                  90
ttc tac caa cta aac agc aac ttt ggt gat gaa tcc cag ctc aaa gcg    385
Phe Tyr Gln Leu Asn Ser Asn Phe Gly Asp Glu Ser Gln Leu Lys Ala
                95                  100                 105
ctc atc cag gct gcc cat gaa cgt gac atg tat gtt atg ctt gat gtc    433
Leu Ile Gln Ala Ala His Glu Arg Asp Met Tyr Val Met Leu Asp Val
            110                 115                 120
gta gcc aat cat gca ggt ccc acc agc aat ggc tac tcg ggt tac aca    481
Val Ala Asn His Ala Gly Pro Thr Ser Asn Gly Tyr Ser Gly Tyr Thr
        125                 130                 135
ttc ggc gat gca agt tta tat cat cct aaa tgc acc ata gat tac aat    529
Phe Gly Asp Ala Ser Leu Tyr His Pro Lys Cys Thr Ile Asp Tyr Asn
    140                 145                 150
gat cag acg tct att gag caa tgc tgg gtt gct gac gag ttg cct gat    577
Asp Gln Thr Ser Ile Glu Gln Cys Trp Val Ala Asp Glu Leu Pro Asp
155                 160                 165                 170
att gac act gaa aat tct gac aac gtg gcc att ctc aac gac atc gtc    625
Ile Asp Thr Glu Asn Ser Asp Asn Val Ala Ile Leu Asn Asp Ile Val
                175                 180                 185
tcc ggc tgg gtg ggt aac tat agc ttt gac ggc atc cgc att gat act    673
Ser Gly Trp Val Gly Asn Tyr Ser Phe Asp Gly Ile Arg Ile Asp Thr
            190                 195                 200
gtc aag cat att cgc aag gac ttt tgg aca ggc tac gca gaa gct gcc    721
Val Lys His Ile Arg Lys Asp Phe Trp Thr Gly Tyr Ala Glu Ala Ala
        205                 210                 215
ggc gta ttc gca act gga gag gtc ttc aat ggt gat ccg gcc tac gtt    769
Gly Val Phe Ala Thr Gly Glu Val Phe Asn Gly Asp Pro Ala Tyr Val
    220                 225                 230
gga cct tat caa aag tac ctg cca tct ctc atc aat tac cca atg tat    817
Gly Pro Tyr Gln Lys Tyr Leu Pro Ser Leu Ile Asn Tyr Pro Met Tyr
235                 240                 245                 250
tac gct ttg aac gac gtc ttt gta tcc aaa agc aaa gga ttc agc cgc    865
Tyr Ala Leu Asn Asp Val Phe Val Ser Lys Ser Lys Gly Phe Ser Arg
                255                 260                 265
atc agc gaa atg cta gga tca aat cgc aat gcg ttt gag gat acc agc    913
Ile Ser Glu Met Leu Gly Ser Asn Arg Asn Ala Phe Glu Asp Thr Ser
            270                 275                 280
gta ctt aca acg ttt gta gac aac cat gac aat ccg cgc ttc ttg aac    96l
Val Leu Thr Thr Phe Val Asp Asn His Asp Asn Pro Arg Phe Leu Asn
        285                 290                 295
agt caa agc gac aag gct ctc ttc aag aac gct ctc aca tac gta ctg    1009
Ser Gln Ser Asp Lys Ala Leu Phe Lys Asn Ala Leu Thr Tyr Val Leu
    300                 305                 310
cta ggt gaa ggc atc cca att gtg tat tat ggt tct gag caa ggt ttc    1057
Leu Gly Glu Gly Ile Pro Ile Val Tyr Tyr Gly Ser Glu Gln Gly Phe
315                 320                 325                 330
agc gga gga gcg gat cct gct aac cgt gaa gtg ctg tgg acc acc aat    1105
Ser Gly Gly Ala Asp Pro Ala Asn Arg Glu Val Leu Trp Thr Thr Asn
                335                 340                 345
tat gat aca tcc agc gat ctc tac caa ttt atc aag aca gtc aac agt    1153
Tyr Asp Thr Ser Ser Asp Leu Tyr Gln Phe Ile Lys Thr Val Asn Ser
            350                 355                 360
gtc cgc atg aaa agc aac aag gcc gtc tac atg gat att tat gtt ggc    1201
Val Arg Met Lys Ser Asn Lys Ala Val Tyr Met Asp Ile Tyr Val Gly
        365                 370                 375
gac aat gct tac gcc ttc aag cac ggc gat gct ttg gtt gtt ctc aat    1249
Asp Asn Ala Tyr Ala Phe Lys His Gly Asp Ala Leu Val Val Leu Asn
    380                 385                 390
aac tat gga tca ggt tcc aca aac caa gtc agc ttc agc gtt agt ggc    1297
Asn Tyr Gly Ser Gly Ser Thr Asn Gln Val Ser Phe Ser Val Ser Gly
395                 400                 405                 410
aag ttc gat agc ggc gca agc ctc atg gat att gtc agt aac att acc    1345
Lys Phe Asp Ser Gly Ala Ser Leu Met Asp Ile Val Ser Asn Ile Thr
                415                 420                 425
acc acg gtg tcc tcg gat gga aca gtc act ttc aac ctt aaa gat gga    1393
Thr Thr Val Ser Ser Asp Gly Thr Val Thr Phe Asn Leu Lys Asp Gly
            430                 435                 440
ctt ccg gct atc ttc acc tct gct taactttgtc cattttgaac t            1438
Leu Pro Ala Ile Phe Thr Ser Ala
      445                 450
<210>4
<21l>471
<212>PRT
<213>微小根毛霉
<400>4
Met Lys Phe Ser Ile Ser Leu Ser Ala Ala Ile Val Leu Phe Ala Ala
    -20                 -15                 -10
Ala Thr Ser Leu Ala Ser Pro Leu Pro Gln Gln Gln Arg Tyr Gly Lys
-5              -1  1               5                   10
Arg Ala Thr Ser Asp Asp Trp Lys Ser Lys Ala Ile Tyr Gln Leu Leu
            15                  20                  25
Thr Asp Arg Phe Gly Arg Ala Asp Asp Ser Thr Ser Asn Cys Ser Asn
        30                  35                  40
Leu Ser Asn Tyr Cys Gly Gly Thr Tyr Glu Gly Ile Thr Lys His Leu
    45                  50                  55
Asp Tyr Ile Ser Gly Met Gly Phe Asp Ala Ile Trp Ile Ser Pro Ile
60                  65                  70                  75
Pro Lys Asn Ser Asp Gly Gly Tyr His Gly Tyr Trp Ala Thr Asp Phe
                80                  85                  90
Tyr Gln Leu Asn Ser Asn Phe Gly Asp Glu Ser Gln Leu Lys Ala Leu
            95                  100                 105
Ile Gln Ala Ala His Glu Arg Asp Met Tyr Val Met Leu Asp Val Val
        110                 115                 120
Ala Asn His Ala Gly Pro Thr Ser Asn Gly Tyr Ser Gly Tyr Thr Phe
    125                 130                 135
Gly Asp Ala Ser Leu Tyr His Pro Lys Cys Thr Ile Asp Tyr Asn Asp
140                 145                 150                 155
Gln Thr Ser Ile Glu Gln Cys Trp Val Ala Asp Glu Leu Pro Asp Ile
                160                 165                 170
Asp Thr Glu Asn Ser Asp Asn Val Ala Ile Leu Asn Asp Ile Val Ser
            175                 180                 185
Gly Trp Val Gly Asn Tyr Ser Phe Asp Gly Ile Arg Ile Asp Thr Val
        190                 195                 200
Lys His Ile Arg Lys Asp Phe Trp Thr Gly Tyr Ala Glu Ala Ala Gly
    205                 210                 215
Val Phe Ala Thr Gly Glu Val Phe Asn Gly Asp Pro Ala Tyr Val Gly
220                 225                 230                 235
Pro Tyr Gln Lys Tyr Leu Pro Ser Leu Ile Asn Tyr Pro Met Tyr Tyr
                240                 245                 250
Ala Leu Asn Asp Val Phe Val Ser Lys Ser Lys Gly Phe Ser Arg Ile
            255                 260                 265
Ser Glu Met Leu Gly Ser Asn Arg Asn Ala Phe Glu Asp Thr Ser Val
        270                 275                 280
Leu Thr Thr Phe Val Asp Asn His Asp Asn Pro Arg Phe Leu Asn Ser
    285                 290                 295
Gln Ser Asp Lys Ala Leu Phe Lys Asn Ala Leu Thr Tyr Val Leu Leu
300                 305                 310                 315
Gly Glu Gly Ile Pro Ile Val Tyr Tyr Gly Ser Glu Gln Gly Phe Ser
                320                 325                 330
Gly Gly Ala Asp Pro Ala Asn Arg Glu Val Leu Trp Thr Thr Asn Tyr
            335                 340                 345
Asp Thr Ser Ser Asp Leu Tyr Gln Phe Ile Lys Thr Val Asn Ser Val
        350                 355                 360
Arg Met Lys Ser Asn Lys Ala Val Tyr Met Asp Ile Tyr Val Gly Asp
    365                 370                 375
Asn Ala Tyr Ala Phe Lys His Gly Asp Ala Leu Val Val Leu Asn Asn
380                 385                 390                 395
Tyr Gly Ser Gly Ser Thr Asn Gln Val Ser Phe Ser Val Ser Gly Lys
                400                 405                 410
Phe Asp Ser Gly Ala Ser Leu Met Asp Ile Val Ser Asn Ile Thr Thr
            415                 420                 425
Thr Val Ser Ser Asp Gly Thr Val Thr Phe Asn Leu Lys Asp Gly Leu
        430                 435                 440
Pro Ala Ile Phe Thr Ser Ala
    445                 450
<210>5
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物168/R.p.amy3-正向
<400>5
gaagatctac catgaaattc agcatctctc tc                                    32
<210>6
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物169/R.p.amy4-反向
<400>6
ccgctcgagt taagcagagg tgaagatagc                                       30

Claims (29)

1.分离的多核苷酸，该多核苷酸包含编码具有α-淀粉酶活性的多肽的开放阅读框，所述多肽选自：
a)包含与SEQ ID NO：4的氨基酸22至450位具有至少70％同一性的氨基酸序列的多肽；
b)包含氨基酸序列的多肽，其与下述大肠杆菌宿主的质粒中所***多核苷酸的淀粉酶编码部分所编码的多肽具有至少70％的同一性，其中所述大肠杆菌宿主根据布达佩斯条约保藏在DSMZ，保藏号为DSM 15334；
c)由这样的多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含的核苷酸序列与SEQ ID NO：3所示的68至1417位序列具有至少70％的同一性；以及
d)具有α-淀粉酶活性的(a)、(b)或(c)的片段。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中多肽为包含这样氨基酸序列的人工变体，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：4的22至450位氨基酸相比，具有一个或多个截短、和/或氨基酸的至少一个替换、缺失和/或***。
3.根据权利要求1或2所述的多核苷酸，其中多肽包含与SEQ ID NO：4的22至450位氨基酸具有至少70％同一性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的多核苷酸，其中多肽包含SEQID NO：4的22至450位氨基酸。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的多核苷酸，其中多肽由SEQ IDNO：4的22至450位氨基酸组成。
6.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中多肽包含这样的氨基酸序列，其与下述大肠杆菌宿主的质粒中所***核苷酸序列的淀粉酶编码部分所编码的多肽具有至少70％的同一性，其中所述大肠杆菌宿主根据布达佩斯条约保藏在DSMZ，保藏号为DSM 15334。
7.根据权利要求6所述的多核苷酸，其中多肽包含由下述大肠杆菌宿主的质粒中所***核苷酸序列的淀粉酶编码部分编码的氨基酸序列，其中所述大肠杆菌宿主根据布达佩斯条约保藏在DSMZ，保藏号为DS M15334。
8.根据权利要求6或7所述的多核苷酸，其中多肽由这样的氨基酸序列组成，所述氨基酸序列由下述大肠杆菌宿主的质粒中所***核苷酸序列的淀粉酶编码部分编码，其中所述大肠杆菌宿主根据布达佩斯条约保藏在DSMZ，保藏号为DSM 15334。
9.根据权利要求6或7所述的多核苷酸，其中多肽是包含这样的氨基酸序列的人工变体，所述氨基酸序列与由下述大肠杆菌宿主的质粒中所***核苷酸序列的淀粉酶编码部分编码的氨基酸序列相比，具有一个或多个截短、和/或氨基酸的至少一个替换、缺失、和/或***。
10.核酸构建体，其包含有效地连接至一个或多个控制序列的如权利要求1-9中任意一项所述的多核苷酸，其中所述一个或多个控制序列指导多肽在合适的宿主细胞中产生。
11.重组表达载体，其包含如权利要求10所述的核酸构建体。
12.重组宿主细胞，其包含如权利要求10所述的核酸构建体，或其包含至少一个拷贝的如权利要求11所述的表达载体。
13.根据权利要求12所述的细胞，该细胞是微生物。
14.根据权利要求13所述的细胞，该细胞是细菌或真菌。
15.根据权利要求14所述的细胞，该细胞是***，例如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌。
16.根据权利要求14所述的细胞，该细胞是真菌曲霉属的蛋白酶缺陷株，尤其是米曲霉的蛋白酶缺陷株。
17.产生由权利要求1-9中任意一项所述多核苷酸编码的具有α-淀粉酶活性的多肽的方法，该方法包括：
a)在益于多肽产生的条件下培养如权利要求12-16中任意一项所述的重组宿主细胞，并
b)回收多肽。
18.产生酶促改性的淀粉衍生物的方法，其中将根据权利要求17所述方法产生的具有α-淀粉酶活性的多肽用于液化和/或糖化淀粉。
19.产生高麦芽糖糖浆的方法，其中将根据权利要求17所述方法产生的具有α-淀粉酶活性的多肽用于液化淀粉。
20.织物脱浆的方法，其中将根据权利要求17所述方法产生的具有α-淀粉酶活性的多肽用于处理织物。
21.酿造方法，其中将根据权利要求17所述方法产生的具有α-淀粉酶活性的多肽在麦芽汁发酵过程中加入。
22.醇生产方法，其中将根据权利要求17所述方法产生的具有α-淀粉酶活性的多肽用于酒厂麦芽浆中的淀粉液化。
23.一种方法，其中将包含根据权利要求17所述方法产生的具有α-淀粉酶活性的多肽的面团产品进行烘焙。
24.根据权利要求17所述方法产生的具有α-淀粉酶活性的多肽的用途，用于淀粉转化过程中的液化和/或糖化。
25.根据权利要求17所述方法产生的具有α-淀粉酶活性的多肽的用途，用于高麦芽糖糖浆生产过程中液化淀粉。
26.根据权利要求17所述方法产生的具有α-淀粉酶活性的多肽的用途，用于织物脱浆。
27.根据权利要求17所述方法产生的具有α-淀粉酶活性的多肽的用途，用于醇生产。
28.根据权利要求17所述方法产生的具有α-淀粉酶活性的多肽的用途，用于酿造。
29.根据权利要求17所述方法产生的具有α-淀粉酶活性的多肽的用途，用于烘焙。
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