DE60307881T2

DE60307881T2 - Positionelle isomeren von pegyliertem interferon alpha 2a

Info

Publication number: DE60307881T2
Application number: DE60307881T
Authority: DE
Inventors: Doris Brugger; Stefan Foser; Alfred Schacher; Karl Weyer
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2002-11-15
Filing date: 2003-11-10
Publication date: 2007-03-08
Anticipated expiration: 2023-11-11
Also published as: UY28080A1; NO20052310D0; MXPA05005178A; PL376883A1; TW200413404A; CN1711109A; RU2005118752A; BR0316227A; AR042039A1; CA2503594A1; PA8587801A1; JP4279258B2; NO20052310L; EP1562634B1; KR20050065677A; PE20040834A1; ATE337017T1; WO2004045648A1; CN1323722C; AU2003293668A1

Description

Die Erfindung befaßt sich mit Stellungsisomeren von monopegyliertem Interferon alpha-2a, mit einem Verfahren zu deren Isolierung und für deren Verwendung bei der Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von Krankheiten, insbesondere zur Behandlung von Viruserkrankungen.
Interferon alpha-2a spielt eine wichtige Rolle bei der Behandlung von chronischer Hepatitis C, ist jedoch durch seine kurze in vivo-Halbwertszeit in seiner Wirksamkeit eingeschränkt. Zur Verbesserung der Halbwertszeit und Wirksamkeit wurde Interferon alpha-2a mit einer Polyethylenglykoleinheit konjugiert.
Die Pegylierung verändert die physiko-chemischen und biologischen Eigenschaften des Proteins. Ein Effekt ist die Verringerung des proteolytischen Abbaus und der Nieren-Clearance. Dies erhöht die Halbwertszeit des pegylierten Proteins im Blut. Eine andere Wirkung ist die veränderte Verteilung im Körper, die von der Größe der PEG-Einheit des Proteins abhängt.
Interferon alpha-2a, pegyliert mit einer großen Polyethylenglykoleinheit (PEG-Einheit) wie einer 40 kDa verzweigten Polyethyleneinheit
worin R und R' unabhängig Niederalkyl sind; n und n' ganze Zahlen mit einer Summe von 600 bis 1500 sind; und das mittlere Molekulargewicht der Polyethylenglykoleinheiten in dem Konjugat etwa 26.000 Dalton bis etwa 66.000 Dalton beträgt;
zeigt verbesserte biologische Aktivität und anhaltende Adsorption und verringerte Nieren-Clearance, was in einem starken antiviralen Druck über einen einwöchigen Dosierzeitraum resultiert, siehe Perry M. C., et al. Drugs, 2001, 15, 2263–2288 und Lamb M. W., et al. The Annals of Pharmacotherpy. 2002, 36, 933–938.
Siehe auch Monkarsh et al., Analytical Biochemistry, 1997, 247, 434–440 (Positional Isomers of monopegylated Interferon α-2a) und Bailon et al., Bioconjugate Chemistry, 2001, 12, 195–202 (Rational Designs of a Potent, Long-Lasting Form of Interferon).
Das Verfahren zur Pegylierung von Interferon alpha-2a wird in EP A 809 996 beschrieben.
Da diese Pegylierung durch die Umsetzung von PEG2-NHS der Formel
mit primären Aminogruppen an beispielsweise Lysin oder an dem N-Terminus von Interferon alpha durchgeführt wird, können eine oder mehrere PEG-Einheiten angelagert sein und ein Gemisch aus unpegyliertem, mono- und mehrfach-pegyliertem Interferon bilden. Monopegyliertes Interferon alpha kann aus dem Gemisch durch in der Technik bekannte Verfahren isoliert werden. Da ferner das Interferon alpha-2a-Molekül 12 Pegylierungsstellen zeigt (11 Lysine und den N-Terminus) ist es ein Gemisch aus Stellungsisomeren. Von diesen zwölf möglichen Isomeren, wurden neun isoliert und charakterisiert, jedes von diesen ist an der verzweigten Polyethylenglykolkette an ein spezifisches Lysin konjugiert, nämlich
an Lys(31) zur Bildung von Interferon alpha-2a, pegyliert an Lys(31) [bezeichnet als PEG- Lys(31)],
an Lys(49) zur Bildung von Interferon alpha-2a, pegyliert an Lys(49) [bezeichnet als PEG- Lys(49)],
an Lys(70) zur Bildung von Interferon alpha-2a, pegyliert an Lys(70) [bezeichnet als PEG- Lys(70)],
an Lys(83) zur Bildung von Interferon alpha-2a, pegyliert an Lys(83) [bezeichnet als PEG- Lys(83)],
an Lys(112) zur Bildung von Interferon alpha-2a, pegyliert an Lys(112) [bezeichnet als PEG- Lys(112)],
an Lys(121) zur Bildung von Interferon alpha-2a, pegyliert an Lys(121) [bezeichnet als PEG- Lys(121)],
an Lys(131) zur Bildung von Interferon alpha-2a, pegyliert an Lys(131) [bezeichnet als PEG- Lys(131)],
an Lys(134) zur Bildung von Interferon alpha-2a, pegyliert an Lys(134) [bezeichnet als PEG- Lys(134)],
an Lys(164) zur Bildung von Interferon alpha-2a, pegyliert an Lys(164) [bezeichnet als PEG- Lys(164)].
Es ist herausgefunden worden, daß PEG-Lys(31) und PEG-Lys(134) in einem Antivirusassay aktiver sind als das Gemisch, die Aktivität von PEG-Lys(164) gleich dem Gemisch war, wohingegen die Aktivitäten von PEG-Lys(49), PEG-Lys(70), PEG-Lys(83), PEG-Lys(112), PEG-Lys(121) und PEG-Lys(131) geringer waren.
Die Erfindung befaßt sich daher mit neuen Stellungsisomeren von pegyliertem Interferon alpha-2a, nämlich mit PEG-Lys(31) und PEG-Lys(134), dadurch gekennzeichnet, daß das durchschnittliche Molekulargewicht der Polyethylenglykoleinheit (PEG-Einheit) in dem pegylierten Interferon 26.000 Dalton bis 66.000 Dalton, insbesondere etwa 40.000 Dalton beträgt.
Es ist ein Chromatographieverfahren zur Trennung der Stellungsisomere von pegyliertem Interferon alpha-2a entwickelt worden, das auf den lokalen Ladungsdifferenzen basiert. Dieses Verfahren besteht aus einer Zweischritt-Trennung durch Ionenaustauschchromatographie.
In einer weiteren Ausführungsform befaßt sich die Erfindung daher mit einem Verfahren zur Isolierung der Stellungsisomere von Lys-pegyliertem Interferon alpha-2a, das aus

a) der Trennung der Stellungsisomere auf einer präparativen Flüssigchromatographiesäule mit einer schwachen Kationenaustauschmatrix; und
b) der weiteren Trennung und Reinigung der Fraktionen aus dem ersten Schritt auf einer präparativen Säule, bevorzugt einer HPLC-Säule mit einer starken Kationenaustauschmatrix besteht, wobei das durchschnittliche Molekulargewicht der Polyethylenglykoleinheit (PEG-Einheit) in dem pegylierten Interferon 26.000 Dalton bis 66.000 Dalton beträgt.

Der Trennungsschritt a) auf der schwachen Kationenaustauschmatrix wurde unter Anwendung eines linearen pH-Gradienten von etwa pH 3,8 bis pH 8,0 durchgeführt.
Der Trennungsschritt b) wurde mit einem linearen pH-Gradienten aus einem Natriumacetatpuffer (A) zu einem Kaliumphosphatpuffer (B), ausgehend von einem anfänglichen pH von 4,2 bis etwa 4,6, bevorzugt etwa 4,4, bis zu einem End-pH von etwa 6,4 bis etwa 6,8, bevorzugt 6,6, durchgeführt, wobei die Pufferlösungen zusätzlich bis zu 12 Ethanol und bis zu 1,5% Diethylenglykol, bevorzugt 10% Ethanol und 1% Diethylenglykol, enthalten.
Die Elution der Isomere kann durch die Ausgangskonzentration der Pufferlösung beeinflußt werden. Die Konzentration der Pufferlösung beträgt etwa 3 mM bis etwa 15 mM Natriumacetat, bevorzugt etwa 3 bis 7 mM, idealerweise 3,4 mM oder 6,8 mM.
Der Trennungsschritt b) wird bei Raumtemperatur oder bei einer Temperatur im Bereich von etwa 27°C bis etwa 35°C, bevorzugt bei einer Temperatur von etwa 30 bis 32°C durchgeführt.
Dieses Verfahren kann auch analytisch zur Analyse der Zusammensetzung der Stellungsisomere, die bei der Pegylierungsreaktion von Interferon alpha-2a erhalten werden, verwendet werden.
Die resultierenden Proteinproben wurden gesammelt und durch eine Vielzahl an Protein-Chemie-Verfahren wie Massenspektrometrie-Peptidkartierung, Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigchromatographie (RP-HPLC)-Peptidkartierung, MALDI-TOF-Spektren von nicht aufgeschlossenem Protein, Größenausschluß-HPLC (SE-HPLC) und SDS-PAGE analysiert und identifiziert, siehe Beispiele 2 bis 6.
Zunächst wurde das Molekulargewicht jedes Isomers durch MALDI-TOF-Spektrometrie bestimmt, um sicher zustellen, daß die pegylierten Interferon alpha-2a-Moleküle nach der IEC-Chromatographie (Ionenaustauschchromatographie) noch immer intakt waren und um die Monopegylierung zu bestätigen. Jeder IEC-Peak wurde ohne weitere Modifikation gemessen. Die Spektren aller Moleküle zeigen die erwarteten breiten M⁺-Peaks mit Maxima bei 63 kDa und die entsprechenden M2⁺-Peaks bei 32 kDa und M3⁺-Peaks bei 21 kDa (5).
Als nächstes wurde jedes Isomer unter Verwendung von Endo-Lys-C-Protease proteolytisch aufgeschlossen und die resultierenden MALDI-TOF-Peptidkarten wurden mit der, die aus dem Referenzstandard von pegyliertem Interferon alpha-2a stammt, verglichen.
Die Interpretation der Spektren und die Strukturidentifizierung der Stellungsisomere basiert auf den folgenden Überlegungen:

1. Dipegylierung der Isomere kann aufgrund der Molekulargewichtsbestimmung für das gesamte Molekül (siehe oben) ausgeschlossen werden.
2. Das einzelne Lysin eines speziellen Isomers mit der angelagerten pegylierten Polymergruppe ist durch die Endo-Lys-C-Protease (2) New England Journal of Medicine 2000, 343, 1666–1172 nicht als Lysin zu erkennen und daher wird die Polypeptidkette an dieser speziellen Position nicht gespalten.
3. Daher geht man davon aus, daß die Peptidkarte eines speziellen Isomers die Peptide (und nur die Peptide), die sich auf ihr einzelnes pegyliertes Lysin beziehen, nicht aufweist.
4. Es wird nicht erwartet, daß der Massenpeak der Peptide mit dem angelagerten PEG-Rest in der MALDI-TOF-Peptidkarte nachgewiesen wird, da der für den genauesten Nachweis der nicht pegylierten Peptide ausgewählte Massenbereich zwischen 850 Da und 6000 Da liegt. Die PEG-Einheit selbst hat bereits ein Molekulargewicht von 40 000 Da. Die pegylierten Peptide sind jedoch auch unter Verwendung derselben Aufschlusses und von trans-3-Indolacrylsäure (1AA) als Matrix nachgewiesen worden. Für jedes Lys-C-aufgeschlossene Isomer wurde ein breiter Peak bei 46–47 kDa beobachtet, was die Gegenwart der monopegylierten Peptide bestätigte. Aufgrund der breiten Massenverteilung, induziert durch den PEG-Rest, konnten die angelagerten Peptide in diesen Experimenten nicht direkt identifiziert werden (Daten nicht gezeigt).

Die resultierenden Peptidkarten werden in 6 gezeigt. Peaks, die im Vergleich zum Standard fehlen, sind durch Pfeile markiert.
In anbetracht der Spektren der beiden Referenzen von Interferon alpha-2a und pegyliertem IFN alpha-2a, sind keine signifikanten Unterschiede zu erkennen. Aufgrund der Tatsache, daß das pegylierte Interferon alpha-2a ein Ge misch aus unterschiedlichen Pegylieurungsisomeren ist, werden alle Peptidpeaks, die für Interferon nachgewiesen werden auch für pegyliertes Interferon alpha-2a nachgewiesen.
In dem Spektrum des Endo-Lys-C-aufgeschlossenen Proteins aus der IEC-Fraktion 1 fehlen die Peptide, die die Aminosäuren 24–31 und 32–49 umfassen, im Bereich zwischen 850 und 6.000 Da, alle anderen Peaks sind vorhanden. Daher muß der PEG-Rest an Lys31 angelagert sein.
Die anderen Fraktionen wurden auf dieselbe Weise identifiziert. In jedem Fall fehlen die pegylierten Peptide im Vergleich zum Referenzstandard-Spektrum. Für die Fraktionen 3 und 4a fehlt nur ein Peptidpeak, für das zweite Peptid 132–133 ist die Masse zu klein, um sie in dem definierten Massefenster nachweisen zu können. Nur Fraktion 4a konnte nicht mit diesem Verfahren nachgewiesen werden, es konnten keine Schlußfolgerungen vorgenommen werden.
Zur Identifizierung von Isomer 4a ist ein Endo-Lys-C-Peptidkartierungsverfahren mit RP- HPLC/UV-Detektion entwickelt worden. Das Protein wurde wie für die MALDI-TOF MS-Peptidkartierung beschrieben mit Endoproteinase-Lys-C aufgeschlossen. Die Peptide wurden mittels eines Wasser/Acetonitril/TFA (Trifluoressigsäure)-Gradienten getrennt.
Mit dem Referenzstandard von pegyliertem Interferon alpha-2a wurden 13 Peaks beobachtet. Alle Fraktionen wurden von Hand gesammelt und durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie identifiziert.
Die Bestimmung der Pegylierungsstelle der IEC-Fraktion 4a wurde wiederum durch den Vergleich des Chromatogramms der Probe mit dem des Referenzmaterials vorgenommen. Der Peak mit den beiden Peptiden 134–164 und 134–165 fehlt eindeutig in dem Probenchromatogramm, und so kann die IEC-Fraktion 4a dem Isomer, das das PEG an Lys164 enthält, zugeordnet werden. Die Chromatogramme von dem Referenzstandard von pegyliertem Interferon alpha-2a (46 μg/ml) und der Fraktion 4a werden in 7 gezeigt.
Eine graphische Darstellung der 9 isolierten und charakterisierten Stellungsisomere von pegyliertem Interferon alpha-2a wird in 9 gezeigt.
Die antivirale in vitro-Aktivität der isolierten Isomere wurde durch die Schutzwirkung an Madin-Darby-Rindernierenzellen (MDBK) gegen die Infektion mit dem Bläschenstomatitisvirus (VSV) analysiert und mit einem Standard von pegyliertem Interferon alpha 2a gemäß dem in J. Virol. 1981, 37, 755–758 beschriebenen Verfahren verglichen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist daher die Verwendung der Stellungsisomere von pegyliertem Interferon alpha-2a-Molekül, pegyliert an Lys(31) und Lys(134), zur Herstellung eines Medikaments für antiproliferative, antivirale und immunomodulatorische Verwendungen. Die Stellungsisomere können ferner zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Viruserkrankungen verwendet werden, insbesondere zur Behandlung von Hepatitis C.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch die pharmazeutischen Zusammensetzungen auf der Basis der Verbindungen der Formel I oder deren Salze und Verfahren zu deren Herstellung.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die bei der Kontrolle oder Vorbeugung von Krankheiten verwendet werden, umfassen ein Stellungsisomer von pegyliertem IFN alpha-2a, nämlich PEG-Lys(31) oder PEG-Lys(134), und ein therapeutisch inertes, nicht toxisches und therapeutisch verträgliches Trägermaterial. Die zu verwendenden pharmazeutischen Zusammensetzungen können in einer mit guter medizinischer Praxis übereinstimmenden Art und Weise formuliert und dosiert werden, wobei die zu behandelnde Krankheit, der Zustand des einzelnen Patienten, die Abgabestelle des Stellungsisomers von pegyliertem IFN alpha-2a, das Verabreichungsverfahren und andere einem Fachmann bekannte Faktoren in Betracht gezogen werden sollten.
Nachstehend werden Verfahren und das Material, das bei der Isolierung und der Charakterisierung der Stellungsisomere von pegyliertem Interferon alpha-2a verwendet wird, ausführlicher beschrieben.
Das pegylierte Interferon alpha-2a (PEG-IFN alpha-2a), das zur Isolierung der Isomere verwendet wird, wurde von Hoffmann-La Roche Inc. durch die Konjugierung von Lysin-ε-Aminogruppen an die Oberfläche des Interferonmoleküls mit einer aktivierten verzweigten Polyethylenglykoleinheit mit einem Molekulargewicht von 40.000 Da hergestellt, wie in EP A 809996 und in Bioconjugate Chem. 2001, 12, 195–202 beschrieben.
Die Reinheit der Proben während der Trennung der Stellungsisomere aus jedem Reinigungsschritt wurde unter Verwendung einer analytischen starken Kationenaustauschsäule (TOSOH-BIOSEP, SP-5PW, 10 μm Teilchengröße, 7,5 mm Durchmesser, 7,5 cm Länge) überprüft. Die Säule wurde mit 3,4 mM Natriumacetat, 10% Ethanol und 1% Diethylenglykol, eingestellt auf einen pH von 4,4 (Puffer A), prääquilibriert. Nach dem Einbringen der PEG-IFN-Proben wurde die Säule mit Puffer A gewaschen, gefolgt von einem aufsteigenden linearen Gradienten auf 10 mM Kaliumhydrogenphosphat, 10% Ethanol und 1% Diethylenglykol, eingestellt auf einen pH von 6,6 (Puffer B). Die Fließgeschwindigkeit betrug 1,0 ml/min und der Nachweis erfolgte bei 218 nm, die Ergebnisse sind in 1 angegeben.
Analog zu dem oben beschriebenen Verfahren ist das folgende analytische Verfahren für die Analyse der Zusammensetzung der Stellungsisomere, die bei der Pegylierungsreaktion von Interferon alpha-2a erhalten wurden, gefunden worden.
Nach der Trennung des monopegylierten Interferons alpha aus dem Reaktionsgemisch durch in der Technik bekannte Verfahren, wurden die Stellungsisomere durch ein analytisches Flüssig-HPLC-Verfahren (Hochdruckflüssigchromatographie) auf einer Säule, die mit einer starken Kationenaustauschmatrix, wie zum Beispiel nicht poröse SP-NPR-Phase mit einer Teilchengröße von 2,5 μm von TosoH Bioscience, geladen ist, getrennt. Die mobile Phase besteht aus einem Puffer A (10% V/V Ethanol; 1% V/V Diethylenglykol; 2,3 mM Natriumacetat und 5,2 mM Essigsäure in gereinigtem Wasser; der pH wurde nicht eingestellt) und einem Puffer B (10% V/V in Ethanol; 1% V/V in Diethylenglykol; 16,4 mM KH₂PO₄; und 4,4 mM K₂HPO₄ in gereinigtem Wasser, der pH wurde nicht eingestellt), die Ergebnisse werden in 8 gezeigt.
Die folgenden Beispiele werden die Erfindung weiter veranschaulichen.
Beispiel 1A – Trennung der Stellungsisomere
Es wurde ein Zweischritt-Isolierungs- und Reinigungsschema zur Herstellung der monopegylierten Isoformen von PEG-Interferon alpha-2a verwendet.

a) Der erste Schritt war eine Trennung der Stellungsisomere auf einer präparativen Niedrigdruckflüssigchromatographiesäule mit einer schwachen Kationenaustauschmatrix (TOSON-BIOSEP, Toyopearl CM-650S, z. B. Resin Batch Nr 82A, wobei der Durchmesser der Säule 16 mm beträgt und die Länge 120 cm). Es wurde ein linearer pH-Gradient mit steigender Natriumacetatkonzentration (25 mM, pH 4,0 bis 75 mM bis pH 7,8) bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,7 ml/min angewendet. Der Nachweis erfolgte bei 280 nm. Mit diesem Chromatographieschritt konnten die Spezies 1, 2, 5, 6 und ein Gemisch aus 3, 4, 4a, 7 und 8 gesammelt werden, siehe Tabelle 1.
b) Die Fraktionen wurden in dem zweiten Herstellungsschritt weiter getrennt und gereinigt. Es wurde eine präparative Säule mit derselben Matrix wie die analytische starke Kationenaustauschsäule (Resin Batch Nr. 82A mit einer Ionenaustauschkapazität von 123 mÄqu./ml) wie oben beschrieben, aber größeren Ausmaßen (30 mm i. D. und 70 mm Länge), zudem einer höheren Fließgeschwindigkeit und einer längeren Laufzeit verwendet. Wie bei dem analy tischen Verfahren wurde die Säule mit 3,4 mM Natriumacetat, 10% Ethanol und 1% Diethylenglykol, eingestellt auf einen pH von 4,4 (Puffer A), prääquilibriert. Nach der Einbringung der PEG-IFN-Proben wurde die Säule mit Puffer A gewaschen, gefolgt von einem aufsteigenden linearen Gradienten auf 10 mM Kaliumhydrogenphosphat, 10% Ethanol und 1% Diethylenglykol, eingestellt auf einen pH von 6,6 (Puffer B). Die Fließgeschwindigkeit betrug 1,0 ml/min und der Nachweis erfolgte bei 218 nm.

Die Proteinkonzentration des PEG-IFN alpha-2a-Isomers wurde durch Spektrophotometrie, basierend auf der 280 nm-Absorption der Proteineinheit von PEG-IFN alpha-2a bestimmt.
Ein analytisches Elutionsprofil von 180 μg von PEG-IFN alpha-2a wird in 1 gezeigt. Das Ergebnis dieses Verfahrens ist eine Trennung in 8 Peaks, 2 Peaks mit Basislinientrennung und 6 mit Teiltrennung. Der Abfall der Basislinienabsorption hin zum Ende des Chromatogramms läßt darauf schließen, daß es keine weiteren monopegylierten Spezies von IFN alpha-2a gab, die bei einer höheren Retentionszeit eluierten.
Überdies ist nach sorgfältiger Betrachtung des IEC-Chromatogramms ein weiterer Peak nahe der Nachweisgrenze zwischen den Peaks 2 und 3 zu erkennen, was ein Anzeichen für die Gegenwart zusätzlicher Stellungsisomere ist, die auch zu der spezifischen Aktivität des PEG-IFN alpha 2a-Gemisches beitragen sollten. Es war mit weiteren Spezies zu rechnen, da das Interferon alpha-2a-Molekül 12 Pegylierungsstellen zeigt (11 Lysine und den N-Terminus). Aufgrund der geringen Häufigkeit dieser Spezies wurden sie nicht isoliert und charakterisiert.
Die Isomerproben aus den IEC-Optimierungsdurchläufen wurden direkt nach der Isolierung (t = 0) und nach 2 Wochen Lagerung bei 5°C untersucht (Daten werden nicht gezeigt). Es waren weder signifikante Unterschiede für das Protein aus den IEC-Peaks im Hinblick auf den Proteingehalt zu erkennen, wie durch spektrometrische Verfahren bestimmt, noch gab es nachzuweisende Veränderungen der Monopegylierungsstelle, des Gehalts an Oligo-PEG-IFN alpha-2a, der Menge an Aggregaten und der Bioassayaktivität. In Anbetracht der relativen Häufigkeit der einzelnen Isomere – wie durch das IEC-Verfahren bestimmt – sowie der spezifischen Aktivitäten – wie in dem Antivirusassay bestimmt- wird fast die gesamte spezifische Bioaktivität des PEG-IFN alpha-2a-Gemisches, das für deren Isolierung verwendet wird, rückgewonnen (ungefähr 93%).
Die analytische IE-HPLC wurde zur Überprüfung der Reinheit der einzelnen Isomere in bezug auf die Kontamination mit anderen Stellungsisomeren in den IEC-Fraktionen überprüft. Die Peaks 2, 3, 4, 4a, 5 und 7 waren zu mehr als 98% rein, die Peaks 1 und 8 waren zu 93% rein und der Peak 6 war zu 88% rein.
Tabelle 1:
PEG-Peptide, identifiziert durch den Vergleich der Lys-C-Aufschlußspektren von den Isomeren und dem Referenzstandard. Identifizierte PEG-Stellen in den getrennten PEG-IFN-Spezies

^a 132-133 zu klein für den Nachweis.
^a,b RP-HPLC.

Die Fraktionen wurden durch die in den Beispielen 2 bis 6 beschriebenen Verfahren charakterisiert. Beispiel 1B – Analytische Trennung der Stellungsisomere von monopegyliertem Interferon alpha-2a

HPLC-Ausrüstung:	HP1100
Säule:	SP-NPR, TosoH Bioscience, Teilchengröße: 2,5 μm, nicht porös, Bestell-Nr.: 13076
Injektion:	5-10 μg monopegyliertes IFN
mobile Phase:	Puffer A:
	10% V/V Ethanol
	1% V/V Diethylenglykol
	2,3 mM Na-Acetat
	5,2 mM Essigsäure, in gereinigtem Wasser, keine pH-Einstellung
	Buffer B
	10% V/V Ethanol
	1% V/V Diethylenglykol
	16,4 mM KH₂PO₄
	4,4 mM K₂HPO₄, in gereinigtem Wasser, keine ph-Einstellung
Gradient:	0 min 40% B
	2 min 40% B
	2,1 min 48% B
	25 min 68% B
	27 min 75% B
	30 min 75% B
	34 min 40% B
	40 min 40% B
Fluß:	1,0 ml/min
Säulentemperatur:	25°C
Nachweis:	218 nm

ein typisches Chromatogramm wird in 8 gezeigt.

Beispiel 2 – Analyse der Fraktionen durch Massenspektrometrie-Peptidkartierung
Auf einem MALDI-TOF MS-Instrument (PerSeptive Biosystems Voyager-DE STR mit verzögerter Extraktion) wurden Massenspektren aufgezeichnet. Jede IEC-Fraktion (Ionenaustauschchromatographie) wurde durch Dialyse entsalzt, mit 0,02 M 1,4-Dithio-DL-threitol (DTT) reduziert und mit 0,2 M 4-Vinylpyridin alkyliert. Dann wurden die Proteine mit Endoproteinase Lys-C (Wako Biochemicals) in 0,25 M Tris(tris(hydroxymethyl)-aminoethan) bei pH 8,5 mit einem ungefähren Enzym-zu-Protein-Verhältnis von 1 : 30 aufgeschlossen. Die Reaktion wurde über Nacht bei 37°C durchgeführt.
Eine Lösung aus 20 mg/ml α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure und 12 mg/ml Nitrocellulose in Aceton/Isopropanol 40/60 (V/V) wurde als Matrix verwendet (Dickschichtapplikation). Zunächst wurden 0,5 μl der Matrix auf dem Zielobjekt plaziert und konnten trocknen. Dann wurde 1,0 μl der Probe zugegeben. Die Spektren wurden in einem linearen positiven Ionisationsmodus mit einer Beschleunigungsspannung von 20.000 V und einer Gitterspannung von 95% erhalten. Mindestens 190 Laserschüsse, die den ganzen Fleck bedecken, wurden für jedes Spektrum gesammelt. Des-Arg¹-Bradykinin und Rinderinsulin wurden für die interne Kalibrierung verwendet.
Beispiel 3 – Hochdruckflüssigchromatographie (RP-HPLC)-Peptidkartierung
Die Peptide wurden durch Unkehrphasen-Hochdruckflüssigchromatographie (RP-HPLC)-Peptidkartierung charakterisiert. Die IEC-Fraktionen wurden reduziert, alkyliert und mit Endoproteinase Lys-C wie oben für die MALDI-TOF MS-Peptidkartierung beschrieben, aufgeschlossen. Die Analyse der aufgeschlossenen Isomere wurde auf einem Waters Alliance HPLC-System mit einer analytischen Vydac RP-C18-Säule (5 μm, 2,1 × 250 mm) und einer Vorsäule mit demselben Packungsmaterial durchgeführt. Die Elution wurde mit einem Acetonitrilgradienten von 1 bis 95% 105 min in Wasser mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,2 ml/min durchgeführt. Beide Lösungsmittel enthielten 0,1% (V/V) TFA. 100 ml jeder aufgeschlossenen Probe wurden injiziert und bei 215 nm aufgezeichnet.
Beispiel 4 – MALDI-TOF-Spektren eines nicht aufgeschlossenen Proteins
Eine 18 mg/ml Lösung von trans-3-Indolacrylsäure in Acetonitril/0,1% Trifluoressigsäure 70/30 (V/V) wurde mit demselben Volumen der Probelösung vorgemischt. Dann wurde 1,0 μl des Gemisches auf die Oberfläche des Zielobjektes gegeben. Typischerweise wurden 150–200 Laserschüsse in einem linearen positiven Ionisationsmodus gemittelt. Die Beschleunigungsspannung wurde auf 25.000 V eingestellt und die Gitterspannung auf 90%. Rinderalbumin M⁺ und M²⁺ wurden für die externe Kalibrierung verwendet.
Beispiel 5 – SE-HPLC (Größenausschluß-HPLC)
Die SE-HPLC wurde mit einem Waters Alliance 2690 HPLC-System, ausgestattet mit einer TosoHaas TSK-Gel G 4000 SWXL-Säule (7,8 × 300 mm), durchgeführt. Die Proteine wurden unter Verwendung einer mobilen Phase, die 0,02 MNaH₂PO₄, 0,15 M NaCl, 1% (V/V) Diethylenglykol und 10% (V/V) Ethanol (pH 6,8) enthielt, bei einer Fleißgeschwindigkeit von 0,4 ml/min eluiert und bei 210 nm nachgewiesen. Die Injektionsmengen betrugen 20 μg von jedem Isomer.
Die Größenausschluß-HPLC und SDS-PAGE wurden zur Bestimmung der Menge an Oligo- PEG-IFN alpha-2a-Formen und -Aggregaten in unterschiedlichen IEC-Fraktionen verwendet. Das Referenzmaterial enthält 2,3% Aggregate und 2,2% Oligomere (4).
Die Peaks 1, 4, 4a, 5, 6 und 8 enthalten < 0,7% der oligopegylierten IFN alpha-2a-Formen, wohingegen in den Peaks 2, 3 und 7 der Prozentsatz der oligopegylierten IFN alpha-2a-Formen unter der Nachweisgrenze (< 0,2%) liegt. Im Falle der Aggregate war ein anderer Trend zu erkennen. In allen Peaks lag die Menge an Aggregaten unterhalb von 0,9%.
Beispiel 6 – SDS-PAGE
SDS-PAGE wurde sowohl unter Nicht-Reduktions- als auch unter Reduktionsbedingungen unter Verwendung von 16%igen Tris-Glycin-Gels (1,5 mm, 10 Loch) durchgeführt. Novex Mark 12-Molekulargewichtsmarker mit einem Massebereich von 2,5 bis 200 kDa wurden für die Kalibrierung verwendet, Rinderserumalbumin (BSA) wurde als Empfindlichkeitsstandard (2 ng) verwendet. Ungefähr 11 μg von allen Proben und 0,5 μg des Standards wurden auf das Gel aufgebracht. Die Durchlaufbedingungen waren 125 V und 6 W für l20 min. Die Proteine wurden unter Verwendung des Silberfärbungskits SilverXpress von Novex fixiert und angefärbt.
Die Gele, die unter Nicht-Reduktionsbedingungen für die IEC-Fraktionen 1–8 (2) aufgezeichnet wurden, zeigen ein Muster, das mit dem des Referenzstandards von PEG-IFN alpha-2a vergleichbar ist.
Unter Reduktionsbedingungen zeigen die Gele im Vergleich zu dem Standard eine erhöhte Intensität geringfügiger Banden bei etwa 90 kDa. Zwischen 6 und 10 kDa erscheinen Proteinfragmente für die Peaks 6, 7 und 8 (3). Beide Banden zusammen entsprechen ungefähr 1% des Schnittmaterials. In den Spuren der Isomere 1, 5, 6, 7, 8 sind zusätzliche Banden mit mehr als 100 kDa zu sehen, die auch in dem Standard vorliegen. Diese können den Oligomeren zugeordnet werden. Somit bestätigt SDS-PAGE die Ergebnisse der SE-HPLC-Analyse.
Alles in allem bringen RP-HPLC- und SDS-PAGE-Experimente zum Ausdruck, daß die Reinheit der IEC-Fraktionen als mit dem PEG-IFN alpha-2a-Referenzstandard vergleichbar betrachtet werden kann.
Die Struktur der PEG-IFN alpha-2a-Spezies aus den 9IEC-Fraktionen wurde basierend auf den Ergebnissen der oben beschriebenen Verfahren unter Verwendung der oben genannten Vorgehensweise identifiziert.
Beispiel 7 – Die antivirale Aktivität (AVA)
Die antivirale Aktivität wurde durch ihre Schutzwirkung an Madin-Darby-Rindernierenzellen (MDBK) gegen die Infektion durch den Bläschenstomatitisvirus (VSV) bewertet und mit einem PEG-IFN alpha-2a-Standard verglichen. Die Proben und der Referenzstandard wurden in Eagles Minimum Essential Medium (MEM), enthaltend 10 fetales Rinderserum, auf eine Endkonzentration von 10 ng/ml (Assayausgangskonzentration) verdünnt. Jede Probe wurde in vierfacher Ausfertigung analysiert.
Der Antivirusschutz von Madin-Darby-Rindernierenzellen (MDBK) vor dem Bläschenstomatitisvirus wurde gemäß dem in Virol. 1981, 37, 755–758 beschriebenen Verfahren getestet. Alle Isomere induzierten eine Aktivität in dem Antivirusassay, wie in Tabelle 2 dargestellt. Die Aktivitäten lagen im Bereich von l 061 bis 339 U/μg, was ein Anzeichen dafür ist, daß der Unterschied in den spezifischen Aktivitäten des Proteins zwischen den Stellungsisomeren signifikant ist. Das Know-how und die bisher erzielten Ergebnisse ermöglichen weitere Untersuchungen, um diese Struktur-Funktion-Beziehung zwischen den Stellungsisomeren und den IFN alpha-Rezeptoren bestimmen zu können.
Tabelle 2:
In Vitro-Antivirusaktivitäten von PEG-IFN alpha-2a und einzelnen PEG-IFN alpha-2a-Isomeren.
Die Antivirusaktivität wurde in MDBK-Zellen, die mit dem Bläschenstomatitisvirus infiziert waren, bestimmt. Die Ergebnisse stellen die Mittel von drei Assays, die unabhängig durchgeführt wurden, dar. Antivirusassay von PEG-IFN
Die Ergebnisse werden ferner durch die folgenden Figuren veranschaulicht
1: Analytische IEC-HPLC von 180 μg PEG-IFN alpha-2a. Eine analytische starke Kationenaustauschsäule wurde zur Überprüfung der Reinheit der abgetrennten Stellungsisomere aus jedem Reinigungsschritt verwendet (TOSOH-BIOSEP, SP-5PW, 10 μm Teilchengröße, 7,5 mm Durchmesser, 7,5 cm Länge).
2: A/B: SDS-PAGE-Analyse mit Tris-Glycin (16%). Die Proben wurden unter Nicht-Reduktionsbedingungen der Elektrophorese unterzogen. Die Gele wurden für das Protein mit Silberfärbung angefärbt. Spuren: M, Molekulargewichtsmarkerproteine/2, Peak 1/3, Peak 2/4, Peak 3/5, Peak 4/6, Peak 4a/7, Peak 5/8, Peak 6/9, Peak 7/10, Peak 8/11, 1 × PEG-IFN-Standard/12, 1,5 × PEG-IFN-Standard/C₁, IFN-Standard.
3: A/B: SDS-PAGE-Analyse mit Tris-Glycin (16%). Die Proben wurden unter Reduktionsbedingungen der Elektrophorese unterzogen. Die Gele wurden für das Protein mit Silberfärbung angefärbt. Spuren: M, Molekulargewichtsmarkerproteine/2, Peak 1/3, Peak 2/4, Peak 3/5, Peak 4/6, Peak 4a/7, Peak 5/8, Peak 6/9, Peak 7/ 10, Peak 8/11, 1 × PEG-IFN-Standard/12, 1,5 × PEG-IFN-Standard/C₁, IFN-Standard.
4: Größenausschluß (SE-)-HPLC wurde zur Bestimmung der Menge an Oligo-PEG- IFN-Formen und -Aggregaten in den unterschiedlichen IEC-Fraktionen verwendet. Die SE-HPLC wurde mit einer TosoHaas TSK Gel G 4000SWXL-Säule (7,8 × 300 mm) durchgeführt.
5: Die MALDI-TOF-Spektrometrie wurde zur Bestimmung des Molekulargewichts jedes Isomers verwendet, um sicher zustellen, daß die PEG-IFN-Moleküle nach der IEC-Chromatographie noch immer intakt waren, und um die Monopegylierung zu bestätigen.
6: MALDI-TOF Lys-C-Peptidkarten des PEG-IFN-Referenzstandards und der Peaks 1, 2, 3, 4, 4a, 5, 6, 7, 8. Fehlende Peaks im Vergleich zum Standard sind durch Pfeile gekennzeichnet.
7: RP-HPLC-Chromatogramme der Lys-C-Aufschlüsse der PEG-IFN-Referenz und von Peak 4a.
8: Analytische HPLC von 5–10 μg eines PEG-IFN alpha-2a-Gemisches aus Stellungsisomeren auf einer Säule, die mit SP-NPR, TosoH Bioscience, Teilchengröße: 2,5 μm, nicht porös, geladen ist, wie in Beispiel 1B beschrieben.
9: Bänderstruktur von Interferon alpha-2a mit den Pegylierungsstellen. Dies ist die Hochauflösungsstruktur von menschlichem Interferon alpha-2a, bestimmt mit NMR-Spektroskopie, siehe J. Mol. Biol. 1997, 274, 661–675. Die Pegylierungsstellen von pegyliertem Interferon alpha-2a sind rot gefärbt und mit Restart und Restnummer markiert.

Claims

Stellungsisomere von pegyliertem Interferon alpha-2a, ausgewählt aus PEG-Lys (31), PEG-Lys (134), wobei das durchschnittliche Molekulargewicht der Polyethylenglykoleinheit (PEG-Einheit) in dem pegylierten Interferon 26.000 Dalton bis 66.000 Dalton, insbesondere etwa 40.000 Dalton, beträgt.
Verfahren zur Isolierung der Stellungsisomere nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das pegylierte Interferon a) in seine Stellungsisomere auf einer präparativen Flüssigchromatographiesäule mit einer schwachen Kationenaustauschmatrix abgetrennt wird; und b) die Fraktionen weiter abgetrennt und auf einer präparativen Säule mit einer starken Kationenaustauschmatrix gereinigt werden.
Verfahren zur Isolierung von Stellungsisomeren von Lys-pegyliertem Interferon alpha-2a, dadurch gekennzeichnet, daß das pegylierte Interferon a) in seine Stellungsisomere auf einer präparativen Flüssigchromatographiesäule mit einer schwachen Kationenaustauschmatrix abgetrennt wird; und b) die Fraktionen weiter abgetrennt und auf einer präparativen Säule mit einer starken Kationenaustauschmatrix gereinigt werden, wobei das durchschnittliche Molekulargewicht der Polyethylenglykoleinheit (PEG-Einheit) in dem pegylierten Interferon 26.000 Dalton bis 66.000 Dalton beträgt.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei der Chromatographieschritt a) durch Anwenden eines linearen pH-Gradienten von etwa pH 3,8 bis pH 8,0 zum Erhöhen der Natriumacetatkonzentration durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Chromatographieschritt b) mit einem linearen Gradienten eines Natriumacetatpuffers (A) zu einem Kaliumphosphatpuffer (B) durchgeführt wird, ausgehend von einem anfänglichen pH 4,2 bis etwa 4,6 bis zu einem End-pH von etwa pH 6,4 bis etwa 6,8, wobei die Pufferlösungen zusätzlich bis zu 12% Ethanol und bis zu 1,5% Diethylenglykol enthalten.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Chromatographieschritte bei einer Temperatur von etwa 27°C bis etwa 35°C vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa 30 bis 32°C durchgeführt werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend ein Stellungsisomer von pegyliertem Interferon alpha-2a nach Anspruch 1 und einen therapeutisch inerten Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzungen zur Behandlung oder Prophylaxe von Immunomodulationsstörungen, wie neoplastischen Krankheiten oder Infektionskrankheiten, umfassend ein Stellungsisomer von pegyliertem Interferon alpha-2a nach Anspruch 1 und einen therapeutisch inerten Träger.
Stellungsisomer von pegyliertem Interferon alpha-2a nach Anspruch 1 zur Herstellung von Medikamenten zur Verwendung bei der Behandlung von Krankheiten.
Stellungsisomer nach Anspruch 9 zur Herstellung eines Medikaments für antiproliferative, antivirale und immunomodulatorische Verwendungen.
Stellungsisomer nach Anspruch 10 zur Herstellung von Medikamenten für die Behandlung von Viruskrankheiten.
Verwendung eines Stellungsisomers von pegyliertem Interferon alpha-2a nach Anspruch 1 zur Herstellung von Medikamenten für die Verwendung bei der Behandlung oder Prophylaxe von Krankheiten.
Verwendung nach Anspruch 12 zur Herstellung von Medikamenten für antiproliferative, antivirale und immunomodulatorische Verwendungen.
Verwendung nach Anspruch 13 zur Herstellung von Medikamenten für die Behandlung von Viruskrankheiten.