MXPA05005178A - Isomeros posicionales del interferon alfa 2a (ifn) pegilado con una porcion de polietilenglicol grande (peg). - Google Patents

Abstract

La invencion concierne con isomeros posicionales del interferon alfa 2a monopegilado, con un metodo para su aislamiento y para su uso en la fabricacion de medicamentos para el tratamiento de enfermedades, especialmente para el tratamiento de enfermedades virales.

Description

WO 2004/045648 Al lili, II ?1? I li lí II: II ???? II II! I II! I! I II SI, SK, TR), OAPI patent fBF, BJ, CF, CG, Cl, CM, GA, For two-lener cades and other bbreviations, refer to the "C íd- GN, GQ, GW, ML, MR, ME, SN, TD, TG . ance Notes en Codes and Abbreviations" appearing al the begin- ning of each regular issue ofthe PCT Gazene. Published: — wilh inlemational search repon — before the expiration of the time limit for amending the claims and lo be rep blished in the event of receipt of amendments 1 ISOMEROS POSICIONALES DEL INTERFERON ALFA 2a (IFN) PEGILADO CON UNA PORCION DE POLIETILENGLICOL GRANDE (PEG) DESCRIPCION DE LA INVENCION La invención se refiere a isómeros posicionales del interferón alfa 2a monopegilado, con un método para su aislamiento y para su uso en la fabricación de medicamentos para el tratamiento de enfermedades, especialmente para el tratamiento de enfermedades virales. El interferón alfa 2a juega un papel importante para el tratamiento de la hepatitis C crónica, pero se limita en esta eficacia por la vida media in vivo corta. Para mejorar la vida media y eficacia del interferón alfa 2a se conjugó con una porción de polietilenglicol . La pegilación cambia las propiedades biológicas y fisicoquímicas de la proteína. Un efecto es el incremento de la degradación proteolítica y el aclaramiento renal. Este aumenta la vida media de la proteína pegilada en sangre. Otro efecto es la distribución alterada en el cuerpo, dependiendo del tamaño de la porción de PEG de la proteína. El interferón alfa 2a pegilado con una porción de polietilenglicol grande (porción de PEG) como una porción de polietilenglicol ramificada de 40 kDa .

Ref . No. : 163599 2 en donde R y R' son independientemente alquilo inferior; n y n' son enteros que tienen una suma a partir de 600 a 1500; y la media del peso molecular de las unidades de polietilenglicol en el conjugado es de alrededor de 26,000 daltons a alrededor de 66,000 daltons; tiene una actividad biológica mejorada y muestra una absorción sostenida y un aclaramiento renal reducido, resultando una fuerte presión antiviral partir de una a una dosificación di-aria, ver Perry M. C, et al. Drugs, 2001, 15, 2263-2288 y Lamb M. W., et al. The Annals of Pharmacotherapy. 2002, 36, 933-938. El método para la pegilacion del interferón alfa-2a se describe en la EP ? 809 996. Desde que esta pegilacion se realiza por reacción de PEG2-NHS de fórmula con grupos de amina primaria como por ejemplo lisina o el N-terminal del interferón alfa una o más porciones de PEG pueden unirse y formar una mezcla de interferones no pegilados, mono- y múltiple-pegilados . El interferón alfa monopegilado se puede aislar de una mezcla por métodos conocidos en la materia. Además, desde que la molécula del interferón alfa-2a muestra 12 sitios para la pegilacion (11 3 Usinas y el N-terminal) es una mezcla de isómeros posicionales . ? partir de estos posibles doce isómeros, nueve se aislaron y se caracterizaron, cada uno de éstos se conjugará a la cadena de polietilenglicol ramificada a una lisina específica, particularmente, a Lys(31) para formar el interferon alfa 2a pegilado a Lys(31) [referido a como PEG-Lys (31) ] , a Lys (49) para formar el interferon alfa 2a pegilado a Lys(49) [referido como a PEG-Lys (49) ] , a Lys (70) parpara formar el interferon alfa 2a pegilado a Lys (70) [referido como a PEG-Lys (70) ] , a Lys (83) parpara formar el interferon alfa 2a pegilado a Lys(83) '[referido como a PEG-Lys (83 )] , a Lys (112) para formar el interferon alfa 2a pegilado a Lys (112) [referido como a PEG-Lys (112 )] , a Lys (121) para formar interferon alfa 2a pegilado a Lys (121) [referido como a PEG-Lys (121) ] , a Lys (131) para formar interferon alfa 2a pegilado a Lys (131) [referido como a PEG-Lys (131) ] , a Lys (134) para formar interferon alfa 2a pegilado a Lys (134) [referido como a PEG-Lys (134) ] , a Lys (164) para formar interferon alfa 2a pegilado a Ly (164) [referido como a PEG-Lys (164) ] . Se ha encontrado que las PEG-Lys (31) y PEG-Lys (134) tienen actividades mayores en un ensayo antiviral que en la 4 mezcla, la actividad de PEG-Lys (164) era igual a la mezcla, mientras que las actividades de PEG-Lys (49), PEG-Lys (70), PEG-Lys (83), PEG-Lys (112) , PEG-Lys (121) y PEG-Lys (131) fueron inferiores. La invención así se refiere a isómeros posicionales nuevos del interferón pegilado alfa 2a, particularmente con PEG-Lys (31) , PEG-Lys (49) , PEG-Lys (70) , PEG-Lys (83) , PEG-Lys(112), PEG-Lys (121) , PEG-PEG-Lys (131) , PEG-Lys(134) y PEG-Lys (164), caracterizado en que la media del peso molecular de la porción del polietilenglicol (porción de PEG) en el interferón pegilado es de alrededor de 26,000 daltons a alrededor de 66,000 daltons, especialmente de alrededor de 40000 daltons. Se ha desarrollado un método de cromatografía para la separación de los isómeros posicionales del interferón pegilado alfa 2a basado en las diferencias de cargas locales. Este método consiste en dos pasos de separación por cromatografía de intercambio iónico. En una modalidad adicional la invención concierne con un método para el aislamiento de los isómeros posicionales de interferón alfa 2a pegilado que consiste en a) la separación de los isómeros posicionales sobre una columna de cromatografía líquida preparatoria con una matriz de intercambio catiónico débil; y b) la separación posterior y purificación de las fracciones del primer paso sobre una columna preparativa, 5 preferiblemente una columna HPLC con una matriz de intercambio catiónico fuerte El paso de separación a) sobre la matriz de intercambio catiónico débil se condujo aplicando un gradiente de pH lineal de alrededor de pH 3.8 a pH 8.0. La separación del paso b) se condujo con un gradiente de pH lineal de un tampón (A) de acetato de sodio a un tampón (B) de fosfato de potasio partiendo de un pH inicial 4.2 a alrededor de 4.6, preferiblemente de alrededor pH 4.4, a un pH final pH de alrededor de 6.4 a alrededor 6.8, preferiblemente de pH 6.6, las soluciones tampón que contienen además más de 12% de etanol y más de 1.5% dietilenglicol, preferiblemente 10% de etanol y 1% dietilenglicol . La elución de los isómeros pueden influenciarse por la concentración inicial de solución tampón. La concentración del tampón solución es de alrededor de 3mM a alrededor de 15mM de acetato de sodio, preferiblemente de alrededor 3 a 7mM, idealmente de 3.4mM o 6.8m . La separación del paso b) es llevada a temperatura ambiente o a una temperatura en el rango de alrededor de 27° C a alrededor de 35° C, preferiblemente a una temperatura de alrededor de 30 a 32°C. Este método puede también ser usado analíticamente para, el análisis de la composición de los isómeros de posiciona 6 les obtenidos en la reacción de pegilación del interferón alfa 2a. Las muestras de proteína resultantes se recogieron y analizaron por una variedad de métodos químicos de proteínas como mapeo peptídico de espectrometría de masa, mapeo peptídico cromatografía líquida de alta resolución de fase reversa (RP-HPLC) , espectro de MALDI-TOF de proteína indigesta, HPLC de exclusión de tamaño (SE-HPLC) y SDS-PAGE e identificado, ver los ejemplos de 2 a 6. Primero, el peso molecular de cada isómero se determinó mediante espectrometría de MALDI-TOF para asegurar que las moléculas alfa 2a del interferón pegiladas seguían siendo intactas después de la cromatografía IEC (Cromatografía de Intercambio Iónico) y para confirmar la monopegil ción. Cada pico IEC se midió sin modificación posterior. El espectro de todas las moléculas mostraron los picos M+ anchos esperados con un máximo a 63 kDa y los picos M2+ correspondientes a 32 kDa y los picos M3+ a 21 kDa (Figura 5) . Segundo, cada isómero se digirió proteolíticamente usando la proteasa endo-Lys-C y los mapas peptídicos MALDI-TOF resultantes se compararon con uno derivado del estándar de referencia interferón alfa 2a pegilada. La interpretación del espectro y la identificación estructural de los isómeros posicionales se basan en las consideraciones siguientes: 7 1. La dipegilación de los isómeros puede eliminarse a causa de la determinación del peso molecular de la molécula entera (ver arriba) 2. La lisina sola de un isómero específico que tiene el grupo polímero pegilado unido no se reconoce como lisina mediante la proteína endo-Lys-C (2) Nuevo England Journal of Medicine 2000, 343, 1666-1172. y, por consiguiente, la cadena polipeptídica no se divide en la posición específica. 3. Se esperó por consiguiente que el mapa del péptidico de un isómero específico careciera de los péptidos (y sólo aquellos péptidos) que se relacionan con estas lisinas pegiladas solas. 4. No se esperó detectar el pico de masa de los péptidos que tienen el resido PEG unidos en los mapas peptídicos MALDI-TOF como la proporción de masa escogida para la mayoría de las detecciones precisas de las proporciones de péptidos no pegilados de alrededor de 850 Da a 6000 Da. La porción de PEG tiene ya un peso molecular de 40000 Da. Sin embargo, los péptidos pegilados se han detectado también usando el mismo digesto y el trans ácido 3 - indolacrí lico como matriz. Para cada isómero digerido Lys-C un pico amplio de unos 46 - 47kDa se observó, confirmando la presencia de péptidos monopegilados . Debido a la distribución de masa amplia inducida por el residuo PEG, se puede realizar la 8 identificación no directa de los peptidos unidos en estos experimentos (datos no demostrados) Los mapas peptidicos resultantes se muestran en la Figura 6. Los picos que se pierden en comparación con el estándar se indican mediante flechas. Excepto al espectro de las dos referencias del interferon alfa-2a y el IFN alfa-2a pegilado, no se han visto diferencias significantes. Debido al hecho que el interferon alfa 2a pegilado es una mezcla de isómeros pegilados diferentes, todos los picos peptidicos detectados para el interferon se detectaron para el interferon alfa 2a pegilado, también . En el espectro de la proteína digerida endo-Lys-C derivada de la fracción 1 del IEC los peptidos que comprenden los aminoácidos 24-31 y 32-49 se perdieron en la región entre 850 y 6000 Da, todos los otros picos están presentes. Por consiguiente el residuo PEG debería unirse a la Lys 31. Las otras fracciones se identificaron de la misma manera. En cada cosa los peptidos pegilados se perdieron en comparación con el espectro estándar de referencia. Para las fracciones 3 y 4a sólo un pico peptídico se perdió, para el segundo péptido 132 - 133 la masa es demasiado pequeña para que se detecte en la ventana de masa definida. Sólo la fracción 4a no se puede identificar con este método, no se pueden hacer conclusiones . 9 Para identificar el isómero 4a, un método peptidico de mapeo de endo-Lys- C con detección RP-HPLC/IJV se desarrolló. La proteína se digerió con la endoproteinas Lys-C como se describió para el mapeo peptidico MALDI-TOF MSS. Se separaron los péptidos mediante un gradiente de agua/acetonitrilo/TFA (ácido acético trifluoro) . Con el estándar de referencia del interferón alfa 2a pegilado , se observaron 13 picos . Todas las fracciones se recogieron manualmente y se identificaron mediante espectrometría de masa MALDI-TOF. La asignación del sitio de pegilacion de la fracción 4a de IEC 4 se hizo comparando el cromatografía de la muestra de con uno los obtenidos para el material de referencia. El pico que contiene los dos péptidos 134 - 164 y 134 - 165 se pierde claramente en el cromatograma de la muestra y por consiguiente la fracción IEC puede asignarse al isómero que contiene el PEG a Lys 164. Los cromatogramas del estándar de referencia del interferón alfa 2a pegilado (46 µg/mL) y una de las fracciones 4a se muestran en la Figura 7. Una representación gráfica de los isómeros posicionales del interferón alfa 2a 9-pegilado se aislaron y caracterizaron se dan en la Figura 9. La actividad antiviral in vitro de los isómeros aislados se analizaron mediante el efecto protector en células (MDB ) de riñon bovino Madin-Dargby contra la Infección por el virus 10 estomatitis vesticular (VSV) y comparado con el estándar del interferón alfa 2a pegilado de acuerdo con el procedimiento descrito en J. Virol. 1981, 37, 755-758. Una modalidad posterior de la invención se usa por consiguiente uso de- isómeros posicionales del interferón alfa 2a pegilado, especialmente de los isómeros posicionales del interferón alfa 2a pegilado a Lys(31), Lys (49) , Lys(70), Lys(83), Lys (112), Lys (121), Lys (131) , Lys (134) y Lys (164), para la preparación de un medicamento para los usos inmunodulatorio, antiviral y proliferativo. Especialmente preferido es el uso del interferón alfa 2a pegilado a Lys (31), Lys (134) y Lys (164) para la preparación de tales medicamentos. Los isómeros posicionales pueden usarse posteriormente para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades virales, especialmente para el tratamiento de la hepatitis C. La presente invención también comprende composiciones farmacéuticas en la base de los compuestos de la fórmula I o sus sales y los métodos para producirlos. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención usados en el control o la prevención de enfermedades que comprenden un isómero posicional del IFN alfa 2 a pegilado, especialmente del PEG-Lys (31) , PEG-Lys(134) o PEG- (164) , más especialmente del PEG-Lys (31), PEG-Lys (134) , y uno terapéuticamente inerte, material de vehículo aceptable terapéuticamente y no tóxico. Las composiciones farmacéuticas 11 que se usarán pueden formularse y dosificarse de una manera constante con buena práctica -médico teniendo en consideración la disfunción que se tratará, la condición del paciente individual, el sitio de liberación del isómero posicional del IFN alfa 2a pegilado, el método de administración y otros factores conocidos a los médicos. A continuación se describen en más detalle los métodos y material usados en el aislamiento y la caracterización de los isómeros posicionales del interferon alfa 2a pegilado. El interferon alfa 2a pegilado (PEG-IFN alfa 2a) usado para el aislamiento de los isómeros se produjo en Hoffmann-La Roche Inc. Mediante la conjugación de los grupos lisina 8-amino en la superficie de la molécula de interferon con una actividad unida a la porción del polietilenglicol de peso molecular de 40000 Da como se describe en la EP A 809996 y en Bioconjugate Chem. 2001, 12, 195-202. La pureza de las muestras durante la preparación de los isómeros posicionales a partir de cada paso se comprobó usando una columna de intercambio de catión fuerte analítica (TOSOH-BIOSEP , SP-5PW, tamaño de partícula 10 µt?, diámetro de 7.5 mm, longitud 7.5 cm) . La columna se pre-equilibró con acetato de sodio 3.4 Mm, 10% etanol y 1% dietilenglicol , ajustado a un pH 4.4 (tampón A). Después de conducir las muestras de PEG-IFN, la columna se lavó con tampón A, seguido por un gradiente lineal ascendiente a 10 mM fosfato potásico 12 dibásico, 10% etanol y 1% dietilenglicol, ajustado a pH 6.6 (tampón B) . La tasa de flujo fue 1.0 mL/min y la detección a 218 nm los resultaron se dieron en la Figura 1. En analogía al método descrito anteriormente el método analítico siguiente se encontró para el análisis de la composición de los isómeros posicionales obtenidos en la reacción de pegilación del interferón alfa 2a. •Después de la separación del interferón alfa monopegílado de la mezcla de reacción por métodos conocidos en la materia, los isómeros posicionales se separaron por HPLC líquida analítica (cromatografía líquida de alta presión) método en que una columna cargada con una matriz de intercambio de catión fuerte como por ejemplo fase SP-NPR no porosa con un tamaño de partícula de 2.5 pm de , TosoH Bioscience. La fase móvil consiste de un tampón A (10% v/v de etanol; 1% v/v dietilenglicol; 2.3 mM de acetato de sodio y 5.2 mM de ácido acético en agua purificada; no se realizó ajuste de pH) y un tampón B (10% v/v en etanol; 1% v/v en dietilenglicol; 16.4 mM H2P0 ; y 4.4 mM K2HP04 en agua purificada, no se hizo ajuste de pH) , los resultados se describen en la Figura 8. Los siguientes ejemplos ilustrarán más la invención. Ejemplo 1A Separación de los isómeros posicionales Se usaron unos dos pasos de purificación y esquema de aislamiento y para preparar las isoformas monopegiladas del interferón alfa 2a PEG. 13 a) El primer paso fue una separación de los isómeros posicionales en una columna de cromatografía líquida de baja presión preparativa con una matriz de intercambio de catión débil (TOSOH-BIOSEP , Toyopearl CM-650S, por ejemplo, lote de resina no. 82A, el diámetro de la columna siendo 16 mm, longitud 120 cm) . Un gradiente de pH lineal de concentración de acetato de sodio aumentando (25 raM, pH sobre 4.0, 75 niM a pH 7.8) se aplicó a una tasa de flujo de 0.7 mL/min. La detección fue a 280 nm. Con este paso cromatográfi co se pudieron recoger las especies 1, 2, 5, 6 y una mezcla de 3, 4, 4a, 7 y 8, ver la tabla 1. b) Las fracciones se purificaron y separaron posteriormente en el segundo paso de preparación. Una columna preparativa con la misma matriz como la columna analítica de intercambio de catión fuerte (Lote de Resina no. 82A que tiene una capacidad de intercambio de ion de mayores 123 mEq/ml) como se describió anteriormente pero dimensiones (30 mm i.d. y 70 mm longitud) , además se usó una tasa de flujo mayor y tiempos de paso mayores. Como para el método analítico, la columna se preequilibró con 3.4 raM de acetato de sodio, 10% etanol y 1% dietilenglicol , ajustado a pH 4.4 (tampón A) . Después de cargar las muestras de PEG-IFN muestras, la columna se lavó con 14 tampón A, seguido por un gradiente lineal ascendiente a 10 mM de fosfato potásico dibásico, 10% etanol y 1% dietilenglicol , ajustado a pH 6.6 (tampón B) . La tasa de flujo fue 1.0 mL/min y la detección a 218 nm . La concentración de proteína del isómero del IFN alfa 2a PEG se determinó por espectofotometría , basado en la absorción 280 nm de la porción de proteína del interferón alfa 2 a PEG. Un perfil de elución analítico de 180 µ9 del IFN alfa 2a PEG se muestra en la Figura 1. El resultado de este método es una separación en 8 picos, 2 picos con separación basal y 6 con separación parcial. La disminución de la absorción de la línea basal hacia el fin del cromatograma sugiere que no hay otra especie tnonopegilada del IFN alfa 2a eluyendo un tiempo de retención mayor. Además, mirando cuidadosamente al cromatograma de IEC un pico adicional cerca del límite de detección que es visible entre los picos 2 y 3 que indicando la presencia de los isómeros posicionales adicionales que deberían contribuir además a la actividad específica de la mezcla de IFN del alfa 2 a PEG. Se esperaron especies adicionales como la molécula del interferón alfa 2a que muestra 12 sitios para la pegilación (11 lisinas y el N-terminal) . Sin embargo, 15 dada la abundancia baja de estas especies, no se aislaron ni caracterizaron. Muestras de isómeros derivados de los corridos de la optimización de IEC se investigaron directamente después del aislamiento (t=0) y después de dos semanas de almacenamiento a 5°C (no se muestran los datos) . Se observaron diferencias no significativas para la proteína derivada de los picos IEC con respecto al contenido de proteína como se determinó mediante métodos de espectométricos ; no hubo ningún cambio que se detectara en el sitio de pegilación, el contenido del oligo-IFN alfa 2a PEG, la cantidad de agregados y la actividad del bioensayo . Teniendo en cuenta la abundancia relativa de los isómeros individuales como se determinó mediante el método IEC método como las actividades específicas como se determinó en el ensayo antiviral la mayoría de la bioactividad específica de la mezcla del IFN alfa 2a PEG usada para su aislamiento se recuperó (aproximadamente el 93%) . La HPLC-IE analítica se usó para comprobar la pureza de los isómeros individuales con respecto a la contaminación con otros isómeros deposición en las fracciones de IEC. Los picos 2, 3, 4, 4a, 5 y 7 tenían más de un 98 % los picos 1 y 8 tenían 93% y el pico 6 tenían 88% de pureza. 16 Tabla 1: Los péptidos PEG se identificaron mediante la comparación del espectro de Lys-C digerido los isómeros y del estándar de referencia Sitios PEG identificados en las especies de IFN-PEG Pico Picos perdidos en el mapa peptidico IFN-PEG Sitio PEG MR (DA) Secuencia Pico 1 A, E 24-49 Pico 2 1,1" 134-164 Pico 3 C 122-134a Pico 4 K121 B,C 1113-131 Pico 4a b 134-164a'b Pico 5 K70 D,F 50-83 Pico 6 K83 D,.H 71-112 Pico 7 K4S E,F 32-70 Pico 8 K112 B,H 84-121 a 132-133 demasiado pequeño para detectarse a'bRP-HPLC. Las fracciones se caracterizaron mediante los métodos descritos en los ejemplos de 2 a 6. 17 Ejemplo IB Separación analítica de los isómeros posicionales "del interferon alfa 2 a mono-peqilado Equipo HPLC HP1100 Columna : SP-NPR, TosoH Bioscience, Tamaño de partícula: 2.5pm, no poroso, Orden#: 13076 Inyecció : 5-10 g IFN monopegilado Fase móvil : Tampón A: 10% v/v Etanol 1% v/v Dietilenglicol 2.3 m N -Acetato 5.2 mM Ácido acético, en agua purificada, no ajuste de pH a Tampón B : 10% v/v Etanol 1% v/v Dietilenglicol 16.4 mM KH2P04 4.4 mM K2HP0 en agua purificada, sin ajuste de pH Gradiente: 0 Min 40%B 2 Min 40%B 2.1 Min 48%B 25 Min 6%B 27 Min 75%B 30 Min 75%B 18 34 in 40%B 40 Min 40 %B Fluj o : 1.0 mi/min Temperatura de Columna: 25°C Detección: 218 nm una cromatografía típica se da en la Figura 8. Ejemplo 2 Análisis de las fracciones por mapeo peptídico de espectrometría de masa. Se registró el espectro de masa en un instrumento MALDI-TOF MS (PerSeptive Biosystems Voyager-DE STR con extracción retardada) . Cada fracción de IEC (Cromatografía de intercambio iónico) se desaló por diálisis, reducido con 0.02 M de 1, 4-ditio-DL-treitol (DTT) y alquilado con 0.2 M 4-vinil piridina. Luego las proteínas se digirieron con la endoproteasa Lys-C (Wako Biochemicals) en 0.25 M Tris (tris (hidroximetil) -aminoetano a pH 8.5 con un enzima aproximado a la proporción de proteína de 1:30. La reacción se llevó a cabo toda la noche a 37 °C. Una solución de 20 mg/ml de a-ciano-4-ácido hidroxicinámico y 12 mg/ml de nitrocelulosa en acetona/isopropanol 40/60 (v/v) se usaron como matriz (aplicación del estrato grueso) . Primero, 0.5 µL de matriz se pusieron en la diana y se pudieron secar. Luego 1.0 L de muestra se añadió. Los espectros se obtuvieron en ionización positiva lineal modo con un voltaje de aceleración de 20.000 19 V y un voltaje de cuadricula del 95%, al menos 190 tiros de láser cubrieron el lugar completo se acumularon para cada espectro. Se usaron insulinas bovinas y bradiquinina des-Arg1-para la calibración internas. Ejemplo 3 (RP-HPLC) Mapeo de cromatografía líquida de alta resonancia peptídica. Los péptidos se caracterizaron mediante de cromatografía de mapeo peptídico líquida de alta resolución de fase reversa (RP-HPLC) . Las fracciones IEC se redujeron, alquilaron y digirieron con la endoproteína Lys-C como se describió en el mapa peptídico MALDI-TOF MS . El análisis de los isómeros digeridos se llevó a cabo mediante el sistema HPLC Waters Alliance con una columna analítica Vydac RP-C18 (5 µt?, 2.1 x 250 mm) y una precolumna con el mismo material de empaquetado. La elución se realizó con un gradiente de acetonitrilo del 1 % al 95% durante 105 min en agua con una proporción de flujo de 0.2 mL/min. Ambos disolventes contienen TFA 0.1% (v/v) . 100 µL de cada muestra digerida se inyectó y monitorizó a 215 nm. Ejemplo 4 Espectro MALDI-TOF de proteína no digerida. Se premezcló una solución de 18 mg/ml del trans-acido 3-indolacrílico en acetonitrilo/0.1 % del ácido trifluoroacético 70/30 (v/v) con el mismo volumen de solución de muestra. Luego 1.0 µL de la mezcla se aplicó a la superficie de la diana. Se midieron 150-200 tiros de láser 20 típicamente en modo de ionización pasiva lineal. El voltaje de aceleración se fijó a 25.000 V y el voltaje de la cuadrícula a 90%. Se usó albúmina bovina M+ y M2+ para la calibración externa. Ejemplo 5 SE-HPLC (HPLC de exclusión de tamaño) Se realizó la SE-HPLC con un sistema Waters Alliance 2690 HPLC equipado con una columna S XL G 4000 de gel TSK TosoHaas (7.8 x 300 mm) . Se eluyeron las proteínas usando una fase móvil que contiene NaH2P04 0.02 M, 0.15 M de NaCl , 1% (v/v) dietilenglicol , y 10 % (v/v) etanol (pH 6.8) a una tasa de flujo 0.4 mL/min y se detectó a 210 nm . Las cantidades de inyección fueron 20 µg de cada isómero. Se usaron las HPLC de exclusión de tamaño y SDS-PAGE para determinar la cantidad de formas del IFN alfa 2a PEG-oligo y agregados en las diferentes fracciones de IEC . El material de referencia que contiene 2.3 % de agregados y 2.2% de oligomeros (Figura 4) . Los picos 1, 4, 4a, 5, 6 y 8 contienen < 0.7 % de las formas de IFN alfa 2a de ol igopegilado , mientras que en los picos 2, 3, y 7 el porcentaje de las formas de IFN alfa 2a ol igopegilado están bajo el límite de detección (< 0.2 %) . Se puede ver en el caso de los agregados una tendencia diferente . En todos los picos la cantidad de agregados es entre el 0.9%. 21 Ejemplo 6 SDS-PAGE Se realizaron SDS-PAGE bajo condiciones reductoras y no reductoras usando geles de Tris-Glicina del 16 % (1.5 mm, 10 pocilios) . Los marcadores de peso molecular 12 Novex Mark 12 con una proporción de masa de 2.5 a 200 kDa se usaron para la calibración, albúmina de suero bovino (BSA) se usó como sensibilidad estándar (2 ng) . Aproximadamente 1 µg de todas las muestras y 0.5 g de estándar se aplicó al gel . Las condiciones de corrido fueron 125 V y 6 W durante 120 min. Las proteínas se fijaron y tiñeron usando el kit de tinción de plata SilverXpress de Novex. Los geles que se registraron bajo condiciones no reducidas para las fracciones de IEC 1-8 (Figura 2) mostraron un patrón que se compara con' el estándar de referencia IFN alfa 2 a PEG. Bajo condiciones de reducción, los geles mostraron un incremento en la intensidad de las bandas menores alrededor de 90 kDa comparado con el estándar. Entre los fragmentos de la proteína de 6 y 10 kDa aparecen los picos 6, 7 y 8 (Figura 3)_. Ambas _bandas juntas corresponden a aproximadamente el 1% del material fijado. En las líneas isómero 1, 5 , 6, 7, 8 pueden verse bandas adicionales con más de 100 kDa que .están también presente en el estándar. Estas pueden asignarse a los oligómeros. Asi SDS-PAGE confirma los resultados del análisis HPLC-SE. 22 En conjunto, los experimentos PAGE-SDS y HPLC- P indican que la pureza de las fracciones de IEC pueden considerarse coirparables con el estándar de referencia del IFN alfa 2 a PEG. La estructura de las especies de IFN alfa 2a PEG derivado de las fracciones de IEC 9 se identificaron basándose en los resultados de los métodos descritos anteriormente usando la estrategia mencionado anteriormente Ejemplo 7 La actividad antiviral (AVA) La actividad antiviral se estimó por este efecto protector en las células de riñon (MDBK) bovinas Madin-Darby contra la Infección por el virus de estomatis vesticular (VSV) y comparado con el estándar del IEN del alfa 2a PEG. El estándar de referencia y las muestras se diluyeron en un Medio Esenciar* Mínimo de Eagle (MEM) que contienen suero bovino fetal al 10% a una concentración final de 10 ng/mL (concentración de inicio de ensayo) . Cada muestra se ensayó por cuadriplicado. La protección antiviral de las células de riñon bovinas Madin-Darby (MDBK) por el virus stomatis vesicular se probaron de acuerdo con el método descrito en Virol. 1981, 37, 755-758. Todos los isómeros indujeron una actividad en el ensayo anti-viral como se presenta en la Tabla 2. La proporción de actividades entre 1061 y 339 U/µgl indican que la diferencia en las actividades específicas de la proteína en los isómeros posicionales es significante. El como se conoce y los resultados generados demasiado rápido 23 permitirán la iniciación de más investigaciones para establecer la relación entre estructura ? función entre los isómeros posicionales y los receptos IFN alfa. Tabla 2 Actividades antivirales in vitro del IFN alfa 2a pegilado y los isómeros del IFN alfa 2a pegilados. Se determinó la actividad antiviral en las células MDBK infectadas con el virus stomatitis vesicular. Los resultados presentan las medias de los tres ensayos realizados independientemente . Ensayo Antiviral de PEG-IFN PEG-IFN 1061 + 50 Pico 1 1818 ± 127 Pico 2 1358 ± 46 Pico 3 761+ 97 Pico 4 339 + 33 Pico 4a 966 + 107 Pico 5 600 ± 27 Pico 6 463 ± 25 Pico 7 513 + 20 Pico 8 468 + 23 Los resultados se ilustraron posteriormente en las siguientes figuras 24 Figura 1 : IEC-HPLC Analítica de 18C^g de -IFN alfa" 2a PEG . , Se usó una columna de intercambio analítico fuerte analíticamente para comprobar lá pureza de los isómeros posicionales de cada paso de purificación (TOSOH-BIOSEP, SP-5PW, 10 pm tamaño de partícula, 7.5 mm diámetro, 7.5 cm longitud) . Figura 2A-2B: Análisis SDS-PAGE con Tris-glicina (16%) , las muestras se sometieron a electroforesis bajo condiciones no reductoras . En los geles se tiñeron las proteínas con Silver Stain. Líneas: M, peso molecular de las proteínas marcadoras/2, Pico 1/3, Pico 2/4, Pico 3/5, Pico 4/6, Pico 4a/7, Pico 5/8, Pico 6/9, Pico 7/10, Pico 8/11, lx estándar IFN PEG-/12, l,5x estándar IFN PEG-/C1, estándar IFN. Figura 3A-3B: SDS-PAGE análisis con Tris-glicina (16%) , las muestras se sometieron a electroforesis bajo condiciones reductoras . En los geles se tiñerón las proteínas con Silver Stain. Líneas: M peso, molecular con proteínas marcadoras/2, Pico 1/3, Pico 2/4, Pico 3/5, Pico 4/6, Pico 4a/7, Pico 5/8, Pico 6/9, Pico 7/10, Pico 8/11, lx PEG-IFN estándar/12, l,5x PEG-IFN estándar/Cx, IFN estándar. Figura : Se usaron los tamaños de exclusión (SE-) HPLC para determinar la cantidad de formas IFN PEG oligo y se agregaron en las diferentes fracciones de IEC. Se realizó SE-HPLC con un TosoHaas TSK gel G 4000 S XL columna (7.8 x 300 mm) . 25 Figura 5 : Se usó la espectrometría MA.LDI -TOF para determinar el peso molecular de cada isómero para asegurar que las moléculas PEG-IFN se mantenían intactas después de la cromatografía IEC y para confirmar la monopegilacion. Figura 6 : Los mapas peptídicos de Lys-C MALDI-TOF de estándar la PEG-IFN referencia y los picos 1, 2, 3, 4, 4a, 5, 6, 7, 8. Los picos perdidos comparados al estándar se indican por flechas. Figura 7 : Cromatogramas de P-HPLC de las digestiones de Lys-C de la referencia del IFN PEG y pico 4a. Figura 8 : HPLC Analítico de 5-10 µg de la mezcla del-IFN alfa 2a PEG de isómeros posicionales sobre una columna cargada con SP-NPR, TosoH Bioscience, Tamaño de partícula: 2,5 pm, no poro como se describe en el Ejemplo IB. Figura 9: La estructura Ribbon del interferón alfa-2a mostró los sitios de pegilación. Esta es la estructura de elevada resolución del interferón humano alfa-2a determinado con espectroscopia RMN see J. Mol. Biol . 1997, 274, 661-675. Los sitios de pegilación del interferón alfa-2a pegilado se colorearon con rojo y se marcaron con un tipo de residuo y un número de residuo. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (12)

26 REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecedente se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Isómeros posicionales del interferón alfa 2a pegilado caracterizados porque son seleccionados del grupo interferón alfa 2a pegilado a Lys(31) (PEG-Lys (31) ) , interferón alfa 2a pegilado a Lys (49) (PEG-Lys (49) ) , interferón alfa 2a pegilado a Lys(70) (PEG-Lys (70) ) , interferón alfa 2a pegilado a Lys(83) (PEG-Lys (83) ) , interferón alfa 2a pegilado a Lys(112) (PEG-Lys (112) ) , interferón alfa 2a pegilado a Lys (121) (PEG-Lys (121) ) , interferón alfa 2a pegilado a Lys (131) (PEG-Lys (131) ) , interferón alfa 2a pegilado a Lys (134) (PEG-Lys (134) ) e interferón alfa 2a pegilado a Lys (164) (PEG-Lys (164) ) .

2. Isómeros posicionales del interferón alfa 2a pegilado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizados porque son seleccionados de PEG-Lys (31) , PEG-Lys (134) .

3. Isómeros posicionales del interferón alfa 2a pegilado de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2 , caracterizados porque el peso medio molecular de la porción de polietilenglicol (porción PEG) en el interferón pegilado I 27 es de alrededor de 26,000 daltons a alrededor de 66,000 daltons, especialmente de alrededor 40000 daltons.

4. Método para el aislamiento de isómeros posicionales del interferón alfa 2a pegilado, caracterizado porque el 5 interferón pegilado es a) separado en sus isómeros posicionales sobre una columna de cromatografía líquida preparativa con una matriz de intercambio de catión; débil y b) las fracciones se separaron posteriormente y 10 purificaron sobre una columna preparativa con una matriz de intercambio catiónico.

5. Método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el paso cromatográfico a) se conduce aplicando un gradiente lineal de pH de alrededor de pH 3.8 a 15 pH 8.0, de concentración ascendente de acetato de sodio.

6. Método de conformidad con las reivindicaciones 4 ó 5, caracterizado porque el paso cromatográfico b) se conduce con un gradiente lineal de un tampón de acetato de sodio (A) a un tampón de fosfato de potasio (B) partiendo de un pH 4.2 20 inicial a alrededor de 4.6 a un pH final de alrededor pH 6.4 a alrededor 6.8, las soluciones tampón contienen además un 12% de etanol y más de un 1,5% de dietilenglicol .

7. Método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque los pasos cromatográficos se llevaron a 25 una temperatura de alrededor de 27° C a alrededor de 35° C, 28 preferiblemente a una temperatura de alrededor 30 a 32 °C.

8. Composiciones farmacéuticas caracterizadas porque comprenden una posición de isómero pegilado de interferón alfa 2a de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un vehículo terapéuticamente inerte.

9. Composiciones farmacéuticas para el tratamiento o profilaxis de disfunciones inmunomodulatorias tales como enfermedades neoplásicas o disfunciones de infecciones caracterizadas porque comprenden un isómero posicional del interferón alfa 2a pegilado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y a un vehículo terapéuticamente inerte .

10. Uso de un isómero posicional del interferón alfa 2a pegilado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la fabricación de medicamentos para el uso en_el tratamiento o profilaxis de enfermedades.

11. Isómero posicional del interferón alfa 2a pegilado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizado porque es para la producción de medicamentos para el uso en el tratamiento de disfunciones virales.

12. Método para el tratamiento o profilaxis de enfermedades inmunomoduladoras caracterizado porque comprende la administración de una posición del isómero pegilado del interferón alfa 2a de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.