KR20050065677A

KR20050065677A - Ｐｅｇｉｆｎ 알파 2ａ의 위치 이성질체

Info

Publication number: KR20050065677A
Application number: KR1020057008685A
Authority: KR
Inventors: 도리스 브뤼거; 슈테판 포저; 알프레트 샤허; 카를 베위어
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2002-11-15
Filing date: 2003-11-10
Publication date: 2005-06-29
Also published as: UY28080A1; NO20052310D0; MXPA05005178A; PL376883A1; TW200413404A; DE60307881T2; CN1711109A; RU2005118752A; BR0316227A; AR042039A1; CA2503594A1; PA8587801A1; JP4279258B2; NO20052310L; EP1562634B1; PE20040834A1; ATE337017T1; WO2004045648A1; CN1323722C; AU2003293668A1

Abstract

본 발명은 모노페길화된 인터페론 알파-2a의 위치 이성질체와 이의 단리 및 질병 치료, 특히 바이러스성의 질병의 치료를 위한 약제의 제조에서의 사용에 관련된 것이다.

Description

ＰＥＧＩＦＮ 알파 2Ａ의 위치 이성질체 {POSITIONAL ISOMERS OF PEG IFN ALPHA 2A}

본 발명은 모노페길화된 인터페론 알파-2a의 위치 이성질체와 질병 치료, 특히 바이러스성의 질병의 치료를 위한 약제의 제조에서의 이의 단리 및 사용 밥법에 관한 것이다.

인터페론 알파-2a는 C형 만성 간염 치료에서 중요한 역할을 하지만, 짧은 생체내 반감기로 인해 효능이 제한된다. 이러한 짧은 반감기와 효능을 개선하기 위해 인터페론 알파-2a는 폴리에틸렌 글리콜 부분과 접합 되었다. 페길화는 상기 단백질의 물리화학적 및 생물학적 특성을 변화시킨다. 한가지 효과는 단백질 분해 및 신청소율의 감소이다. 이는 혈액내의 페길화된 단백질의 반감기를 증가시킨다. 또 하나의 효과는 상기 단백질의 PEG 부분의 크기에 따른 체내에서의 변경된 분포이다. 40 kDa의 분지형 폴리에틸렌 부분과 같은 대형 폴리에틸렌 글리콜 부분(PEG 부분)으로 페길화된 인터페론 알파 2a는:

[식 중, R 및 R'은 독립적으로 저급 알킬이고 n 및 n'은 600 내지 1500의 합을 가진 정수이며, 상기 접합체 내의 폴리에틸렌 글리콜 단위의 평균 분자량은 약 26,000 달톤 내지 66,000 달톤임.]

개선된 생물학적 활성을 갖고 지속적 흡수 작용 및 감소된 신청소율을 나타내어 주 일회의 투약 일정 내내 강한 항바이러스성 압력을 갖게된다 (Perry M.C. 등 Drugs, 2001, 15, 2263-2288 및 Lamb M. W. 등 The Annals of Pharmacotherapy. 2002, 36, 36,933-938 참고).

상기 인터페론 알파-2a의 페길화 방법은 EP A 809 996에 기술되어 있다.

이러한 페길화는 예를 들어 라이신에 있거나 인터페론 알파의 N-말단에 있는 일차 아미노기와 하기 화학식의 PEG2-NHS의 반응으로 수행되기때문에 하나 이상의 PEG 부분이 부착되어 비페길화(unpegylated), 모노(mono)- 및 다중-페길화(multiple-pegylated)된 인터페론의 혼합물을 형성할 수 있다.

모노페길화된 인터페론 알파는 이 기술분야에서 알려진 방법으로 혼합물에서 단리될 수 있다. 또한, 인터페론 알파-2a 분자가 12개의 페길화 부위(11 라이신 및 N-말단)를 나타내기 때문에 이는 위치 이성질체의 혼합물이다. 이러한 가능한 12 이성체 중, 9 개가 단리되어 특성화되었고, 이들 각각은 분지형 폴리에틸렌 글리콜 사슬의 특정 라이신, 즉,

Lys(31)에서 페길화된 인터페론 알파 2a을 형성하게되도록 Lys(31)[PEG-Lys(31)이라 칭함],

Lys(49)에서 페길화된 인터페론 알파 2a을 형성하게되도록 Lys(49)[PEG-Lys(49)이라 칭함],

Lys(70)에서 페길화된 인터페론 알파 2a을 형성하게되도록 Lys(70)[PEG-Lys(70)이라 칭함],

Lys(83)에서 페길화된 인터페론 알파 2a을 형성하게되도록 Lys(83)[PEG-Lys(83)이라 칭함],

Lys(112)에서 페길화된 인터페론 알파 2a을 형성하게되도록 Lys(112)[PEG-Lys(112)이라 칭함],

Lys(121)에서 페길화된 인터페론 알파 2a을 형성하게되도록 Lys(121)[PEG-Lys(121)이라 칭함],

Lys(131)에서 페길화된 인터페론 알파 2a을 형성하게되도록 Lys(131)[PEG-Lys(131)이라 칭함],

Lys(134)에서 페길화된 인터페론 알파 2a을 형성하게되도록 Lys(134)[PEG-Lys(134)이라 칭함],

Lys(164)에서 페길화된 인터페론 알파 2a을 형성하게되도록 Lys(164)[PEG-Lys(164)이라 칭함]에 접합되어있다.

PEG-Lys(31) 및 PEG-Lys(134)는 항바이러스 분석에서 상기 혼합물보다 높은 활성도를 갖는다고 밝혀졌으며, PEG-Lys(164)의 활성도는 상기 혼합물과 같았으나, PEG-Lys(49), PEG-Lys(70), PEG-Lys(83), PEG-Lys(112), PEG-Lys(121) 및 PEG-Lys(131)의 활성도는 더 낮았다.

본 발명은, 따라서 페길화된 인터페론 알파 2a의 새로운 위치 이성질체, 즉, PEG-Lys(31), PEG-Lys(49), PEG-Lys(70), PEG-Lys(83), PEG-Lys(112), PEG-Lys(121), PEG-Lys(131), PEG-Lys(134) 및 PEG-Lys(164)에 관련된 것이며, 이는 페길화된 인터페론 내 폴리에틸렌 글리콜 부분(PEG 부분)의 평균 분자량이 약 26,000 달톤 내지 약 66,000 달톤, 특히 약 40,000 달톤인것을 특징으로 한다.

국소 전하 차이를 기재로한 페길화된 인터페론 알파 2a의 위치이성질체의 분리를 위한 크로마토그래피가 계발되었다. 이 방법은 이온교환 크로마토그래피에 의한 2 단계 분리로 구성되어있다.

또 다른 구현에서 본 발명은 하기로 구성된 페길화 인터페론 알파 2a의 위치이성질체의 단리 방법에 관련한다.

a) 약한 양이온교환 매트릭스를 사용한 분취용 액체 크로마토그래피 컬럼에서의 위치이성질체 분리; 및

b) 분취용 컬럼, 바람직하게는 강한 양이온교환 매트릭스를 사용한 HPLC 컬럼 상에서의 1 단계 부터로의 분획물의 추가적인 분리 및 정제. 약한 양이온교환 매트릭스에서의 분리 단계 a)는 약 pH 3.8 내지 pH 8.0의 선형 pH 기울기를 적용하여 수행되었다.

분리 단계 b)는 초기 pH 4.2 내지 약 4.6, 바람직하게는 약 pH 4.4 에서 출발하여 약 pH 6.4 내지 약 6.8의 최종 pH, 바람직하게는 약 pH 6.6의 소듐 아세테이트 완충액 (A) 내지 포타슘 포스페이트 완충액(B)의 선형 pH 기울기로 수행되었으며, 상기 완충액은 추가로 최대 12%의 에탄올 및 최대 1.5%의 디에틸렌 글리콜, 바람직하게는 10%의 에탄올과 1%의 디에틸렌 글리콜을 포함한다.

상기 이성질체의 용리는 완충액의 초기 농도의 영향을 받을 수 있다. 상기 완충액의 농도는 약 3 mM 내지 약 15 mM의 소듐 아세테이트, 바람직하게는 약 3 내지 7 mM, 이상적으로는 3.4 mM 또는 6.8 mM이다.

분리 단계 b)는 실온 또는 약 27℃ 내지 약 35℃, 바람직하게는 약 30℃ 내지 32℃의 범위의 온도에서 실행된다.

이러한 방법은 인터페론 알파 2a 페길화 반응에서 얻어진 위치이성질체의 조성의 분석을 위해 분석적으로 사용될수도 있다.

상기의 얻어진 단백질 샘플은 수집되고 질량 분광측정법 펩타이드 맵핑(peptide mapping), 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 펩타이드 맵핑, 소화되지 않은 단백질의 MALDI-TOF 스펙트럼, 크기 배제 HPLC(SE-HPLC) 및 SDS-PAGE와 같은 여러 단백질 화학적 방법 분석되며 확인되었다 (실시예 2 내지 6 참고).

첫째로, IEC 크로마토그래피 후 페길화된 인터페론 알파 2a 분자가 완전한지 한지와 모노페길화를 확인하기 위해 각 이성질체의 분자량이 MALDI-TOF 분광측정법에 의하여 측정되었다. 각 IEC 피크는 다른 변경 없이 측정되었다. 모든 분자의 스펙트럼은 최대 63 kDa을 가진 기대했던 넓은 M⁺ 피크와 32 kDa에서 상응하는 M²⁺ 피크 및 21 kDa에서 M³⁺ 피크를 보였다 (도 5).

두번째로, 각각의 이성질체는 endo-Lys-C 단백질분해효소를 이용하여 단백질분해적으로 소화되었고 결과적으로 수득된 MALDI-TOF 펩타이드 맵은 페길화된 인테페론 알파 2a 참조 물질에서 유래된 것과 비교되었다.

위치이성질체의 상기 스펙트럼의 해석 및 구조상의 확인은 하기의 고찰에 근거하였다:

1. 이성질체의 다이페길화(dipegylation)는 분자 전체의 분자량의 측정때문에 배제할 수 있다(상기참조).

2. 페길화된 중합체 군이 부착되어있는 특정 이성질체의 단독의 라이신은 endo-Lys-C 단백질분해효소(2)(New England Journal of Medicine 2000, 343, 1666-1172)에 의해 라이신으로 인식되지 않으므로 폴리펩타이드 사슬은 그 특정 위치에서 절단되지 않는다.

3. 따라서 특정 이성질체의 펩타이드 맵은 페길화된 단독의 라이신과 연관된 펩타이드(및 단지 이러한 펩다이드만)를 결핍하고 있을것으로 예상된다.

4. 비페길화된 펩타이드의 가장 정확한 검출을 위해 선택된 질량 범위가 850 Da 내지 6000 Da의 범위에 이르기때문에 MALDI-TOF 펩타이드 맵에서 PEG 잔기가 부착된 펩타이드의 질량 피크를 검출할 것으로 예상되지 않는다. 상기 PEG 부분 그 자체는 이미 40000 Da의 분자량를 갖는다. 그러나, 상기 페길화된 펩타이드는 같은 소화물 및 트랜스-3-인돌아크릴산(trans-3-indoleacrylic adid, IAA)를 매트릭스로 해서도 검출되었다. Lys-C로 소화된 각각의 이성질체에 대해 46 내지 47 kDa 에서 넓은 피크가 관찰되어 단페길화된 펩타이드의 존재를 확인할 수 있었다. PEG 잔기로 유도된 넓은 질량 분포때문에 이 실험에서 부착된 펩타이드의 직접적인 확인을 할 수 없었다 (자료 제시되지 않음).

결과적으로 수득된 펩타이드 맵은 도 6에 나타나있다. 표준에 비교해 보이지 않는 피크는 화살표로 표시되어 있다.

인터페론 알파-2a 및 페길화된 IFN 알파-2a의 두 기준의 스펙트럼에서 유의한 차이점은 나타나지 않았다. 페길화된 인터페론 알파-2a가 다른 페길화 이성질체의 혼합물이기 때문에 인터페론에 대해 검출된 모든 펩타이드 피크는 페길화된 인터페론 알파-2a에 대해서도 검출된다.

IEC 분획물 1에서 유도된 endo-Lys-C 소화된 단백질의 스펙트럼에서 아미노산 24-31 및 32-49를 포함하는 펩타이드가 850 내지 6000 Da의 부분에 없었고 다른 모든 피크는 존재한다. 그러므로 상기 PEG 잔기는 Lys 31에 부착되어 있음이 틀림없다.

다른 분획물도 같은 방법으로 확인되었다. 각각의 경우에 기준 스펙트럼과 비교해볼때 상기 페길화된 펩타이드가 나타나 있지 않다. 분획물 3 및 4a에 대해서는 단 하나의 펩타이드 피크가 없고, 두번째 펩타이드 132-133는 한정된 질량 윈도우에서 검출되기에 질량이 너무 작다. 분획물 4a만 이러한 방법으로 확인될 수 없었으며 결론을 내릴수 없었다.

이성질체 4a를 확인하기 위해 RP-HPLC/UV 검출법을 사용한 endo-Lys-C 펩타이드 맵핑법이 계발되었다. 상기 단백질은 MALDI-TOF MS 펩타이드 맵핑에 대해 기술된것과 같이 엔도프로티네이즈(endoproteinase) Lys-C로 소화되었다. 상기 펩타이드는 물/아세토니트릴(acetonitrile)/TFA(트리플루오로 아세트산) 기울기의 방법으로 분리되었다.

페길화된 인터페론 알파-2a 참조 표준물질에서는 13 피크가 관찰되었다. 모든 분획물이 손으로 수집되고 MALDI-TOF 질량 분광측정법에 의해 식별되었다.

IEC 분획물 4a의 페길화 부위는 상기 샘플의 크로마토그램을 참조물질에 대해 얻어진 것과 비교하여 지정되었다. 두 펩타이드 134-164 및 134-165를 포함한 피크는 샘플 크로마토그램에서 분명히 없기때문에 IEC 분획물 4a는 Lys 164에 PEG를 포함하는 이성질체에 할당될 수 있다. 페길화된 인터페론 알파-2a 참조 표준물질(46 μg/mL) 및 분획물 4a의 크로마토그램은 도 7에 나타나 있다.

9개의 페길화된 인터페론 알파-2a 위치 이성질체의 단리와 특성화의 도식적 묘사는 도 9에 나타나있다.

단리된 이성질체의 생체외 항바이러스성 활동은 베스티큘러 스토마타이티스 바이러스(vesticular stomatitis virus, VSV)의 감염에 대한 마딘-다비 보바인 신장(Madin-Darby bovine kidney, MDBK) 세포에서의 보호효과로 분석되었으며 J. Virol. 1981, 37, 755-758에 기술되어 있는 절차에 따라 페길화된 인터페론 알파-2a 표준물질과 비교되었다.

본 발명의 또 다른 구현은 따라서 페길화된 인터페론 알파-2a 분자의 위치 이성질체(특히 Lys(31), Lys(49), Lys(70), Lys(83), Lys(112), Lys(121), Lys(131), Lys(134), Lys(164)에서 페길화된 인터페론 알파 2a의 위치 이성질체)의 항증식성, 항바이러스성 및 면역조절 용도를 위한 약제를 제조하기 위한 용도이다. 특히 바람직한 것은 Lys(31), Lys(134) 및 Lys(164)에서 페길화된 인터페론 알파 2a의 이와 같은 약제의 제조를 위한 사용이다. 상기 위치 이성질체는 또한 바이러스성 질병, 특히 C형 간염의 치료를 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 화학식 I의 화합물 또는 그의 염 및 이의 제조 방법을 기재로한 약학적 조성물을 포함한다.

질병의 조절 또는 예방에서 사용되는 본 발명의 약학적 조성물은 페길화된 IFN 알파-2a의 위치 이성질체, 특히 PEG-Lys(31), PEG-Lys(134) 또는 PEG-(164), 보다 구체적으로는 PEG-Lys(31), PEG-Lys(134) 및 약학적으로 비활성적이고 무해하며 치료상으로 수용가능한 담체 물질을 포함한다. 사용될 약학적 조성물은 치료될 병, 환자 개인의 상태, 페길화된 IFN 알파-2a의 위치 이성질체의 약물 전달 부위, 투여의 방법 및 의사에게 알려진 요소를 고려해 올바른 진료 행위 가이드(good medical practice)와 일관된 방식으로 조제되고 투약될 수 있다.

하기에는 페길화된 인터페론 알파-2a의 위치 이성질체의 단리 및 특성화에 사용된 방법과 물질이 보다 구체적으로 기술되어 있다.

상기 이성질체의 분리에 사용된 페길화된 인터페론 알파 2a (PEG-IFN 알파 2a)는 EP A 809996 및 Bioconjugate Chem. 2001, 12, 195-202에 기술된 것과 같이 인터페론 분자의 표면에서 라이신 ε-아미노기와 40000 Da의 분자량의 활성화된 분지형 폴리에틸렌 글리콜 부분과의 접합으로 Hoffmann-La Roche Inc.에서 제조되었다.

위치 이성질체 분리 중의 각각의 정제 단계로부터의 샘플의 순도는 강한 양이온교환 분석 컬럼(TOSOH-BIOSEP, SP-5PW, 입자 크기 10 μm, 직경 7.5 mm, 길이 7.5 cm)을 사용해 점검되었다. 상기 컬럼은 3.4 mM 소듐 아세테이트, 10% 에탄올 및 1% 디에틸렌 글리콜이 pH 4.4로 조절된 것(완충액 A)으로 예비 평형화되었다. PEG-IFN 샘플을 컬럼에 로딩한 후 완충액 A로 세척한 다음 오르는 선형기울기가 10 mM 이염기 포타슘 포스페이트, 10% 에탄올 및 1% 디에틸렌 글리콜이 pH 6.6로 조절되어진 것(완충액 B)에 적용되었다. 상기 유량(flow rate)은 1.0 mL/분이었고 218 nm에서 검출된 결과는 도 1에 나타나 있다.

상기에 기술된 방법에 유추하여 인터페론 알파-2a의 페길화 반응에서 얻어진 위치 이성질체의 조성물의 분석을 위한 하기와 같은 분석법을 발견했다.

종래기술에서 공지된 방법으로 모노페길화된 인터페론 알파가 반응 혼합물로 부터 분리된 후 위치 이성질체는 예를 들어 TosoH Bioscience의 입자 크기 2.5 μm를 가진 비다공성 SP-NPR 상과 같은 강한 양이온교환 매트릭스를 사용한 컬럼에서 분석적 액체 HPLC(고압 액체 크로마토그래피)법으로 분리된다. 상기 이동상은 완충액 A (10% v/v 에탄올; 1% v/v 디에틸렌글리콜; 2.3 mM 소듐 아세테이트 및 5.2 mM 아세트산) 및 완충액 B (10% v/v 에탄올; 1% v/v 디에틸렌글리콜; 16.4 mM KH₂PO₄; 및 증류수에 4.4 mM K₂HPO₄, pH 조절되지않음)로 구성되며 결과는 도 8에 서술되어 있다.

하기 실시예는 본 발명을 더욱 상세히 설명해 준다.

실시예 1A 위치 이성질체의 분리

PEG 인터페론 알파 2a의 모노페길화된 이성질체를 제조하기 위해 2단계 분리 및 정제 방법이 사용되었다.

a) 첫번째 단계는 약한 양이온교환 매트릭스(TOSOH-BIOSEP, Toyopearl CM-650S, 예를 들어 수지 배치 번호 82A, 컬럼 직경 16 mm, 길이 120 cm)를 사용한 분취용 저압력 액체 크로마토그래피 컬럼에서의 위치 이성질체의 분리이다. 소듐 아세테이트의 증가하는 농도(25 mM, pH 4.0 내지 75 mM, pH 7.8 이하)의 선형 pH 기울기는 0.7 mL/분의 유량에서 적용되었다. 이러한 크로마토그래피 단계로 1, 2, 5, 6종 및 혼합물 3, 4, 4a, 7, 8 이 수집되었다 (표 1 참고).

b) 상기 분획물은 두번째 제조 단계에서 한층 더 분리되고 정제 되었다. 상기에 기술된 것과 같은, 강한 양이온교환 분석 컬럼(수지 배치 번호 82A, 123 mEq/mL의 이온교환 용량을 갖음)과 같은 기질을 갖으나, 더 큰 치수(30 mm i.d. 및 70 mm 길이), 더 높은 유량 및 연장된 시험 시간을 사용한 분취용 컬럼이 사용되었다. 분석 방법에 관해서는 상기 컬럼이 pH 4.4로 조절된 3.4 mM 소듐 아세테이트, 10% 에탄올 및 1% 디에틸렌 글리콜 (완충액 A)로 예비평형화되었다. PEG-IFN 샘플을 로딩한 후, 상기 컬럼은 완충액 A로 세척되고 상승하는 선형 기울기가 10mL 이염기 포타슘 포스페이트, 10% 에탄올 및 1% 디에틸렌 글리콜이 pH 6.6로 조절되어진 것(완충액 B)에 적용되었다. 유량은 1.0 mL/분, 검출은 218nm에서 였다.

PEG-IFN 알파-2a 이성질체의 단백질 농도는 PEG-IFN 알파-2a의 단백질 부분의 280 nm 흡광도에 근거하여 분광광도측정법에 의해 측정되었다.

PEG-IFN 알파 2a의 180 μg의 용리 분석 도표는 도 1에 나타나 있다. 이러한 방법의 결과는 8개의 피크로의 분리이며, 2 피크는 기준선 분리이고 6 피크는 부분적인 분리이다. 크로마토그램의 끝쪽의 기준선 흡광도의 감소는 더 높은 체류 시간에서 용리되는 다른 모노페길화 종의 IFN 알파-2a가 존재하지 않는다는 것을 암시한다.

또한, IEC-크로마토그램을 자세히 보면 검출 한도에 가까운 다른 피크를 피크 2 및 3에서 볼 수 있으며, 이는 PEG-IFN 알파-2a 혼합물의 특이적 활성도에도 기여하는 부가적인 위치 이성질체의 존재를 나타낸다. 인터페론 알파-2a 분자가 12개의 페길화 부위(11 라이신 및 N-말단)를 나타내기 때문에 부수적인 종이 예상되었다. 그러나 이러한 종의 낮은 존재비로 인해 단리 및 특성화가 이루어지지 않았다.

IEC 최적화 시험(optimization run)에서 유도된 이성질체 샘플은 단리(t=0) 후 바로, 그리도 5℃에서 2주 동안 보관 후 조사 되었다. 분광광도측정법으로 측정된 단백질 산출량에 관련하여 IEC-피크로부터 유도된 단백질에서는 유의한 차이점을 볼 수 없었다; 모노페길화 부위나 올리고-PEG-IFN 알파 2a의 함유량, 집합체의 양 및 생화학적분석 활성도에서도 다른 변화가 검출되지 않았다. IEC 방법으로 측정된 각각의 이성질체의 상대 존재비 및 항바이러스성 분석으로 측정된 특이적 활성도를 고려해 단리를 위한 PEG-IFN 알파 2a 혼합물의 거의 모든 특이적 생체활성도(약 93%)가 회수되었다.

분석 IE-HPLC는 IEC 분획물에 다른 위치 이성질체의 오염에 대해 각각의 이성질체의 순도를 점검하기 위해 사용 되었다. 피크 2, 3, 4 , 4a, 5 및 7은 98%를 초과하는 순도를, 피크 1 및 8은 93%, 그리고 피크 6는 88%의 순도를 가졌다.

상기 이성질체의 Lys-C 소화된 스펙트럼 및 참조 표준물질의 비교로 확인된 PEG-펩타이드.
분리된 PEG-IFN 종에서 확인된 PEG 부위
피크		펩타이드 맵에 없는 피크
PEG-IFN	PEG 부위	M_r (DA)	서열
피크 1	K³¹	A,E	24-49
피크 2	K¹³⁴	I,I'	134-164
피크 3	K¹³¹	C	122-131^a
피크 4	K¹²¹	B,C	113-131
피크 4a	K¹⁶⁴	^b	134-164^a,b
피크 5	K⁷⁰	D,F	50-83
피크 6	K⁸³	D,H	71-112
피크 7	K⁴⁹	E,F	32-70
피크 8	K¹¹²	B,H	84-121
^a 132-133 검출하기에 너무 작음^a,b RP-HPLC

상기 분획물은 실시예 2 내지 6에서 기술된 방법으로 특성화되었다.

실시예 1B 모노 페길화된 인터페론 알파 2a의 위치 이성질체의 분석적 분리

HPLC 장비: HP 1100

컬럼: SP-NPR, TosoH Bioscience, 입자 크기: 2.5μm, 비다공성, Order#: 13076

분사: 5-10μg 모노페길화된 IFN

이동상: 완충액 A:

10% v/v 에탄올

1% v/v 디에틸렌글리콜

2.3 mM 소듐 아세테이트

5.2 mM 아세트산, 정제수 내, pH 조절 하지 않음

완충액 B:

10% v/v 에탄올

1% v/v 디에틸렌글리콜

16.4 mM KH₂PO₄

4.4 mM K₂HPO₄, 정제수 내, pH 조절 하지 않음

기울기: 0 분 40%B

2 분 40%B

2.1 분 48%B

25 분 68%B

27 분 75%B

30 분 75%B

34 분 40%B

40 분 40%B

흐름: 1.0 mL/분

컬럼 온도: 25℃

검출: 218 nm

대표적인 크로마토그램이 도 8에 나타나 있다.

실시예 2 질량 분광측정법 펩타이드 맵핑에 의한 분획물의 분석

질량 스펙트럼이 MALDI-TOF MS 장비(지연된 추출을 사용한 PerSeptive Biosystems Voyager-DE STR)에 표시되었다. 각각의 IEC 분획물 (Ion Exchange Chromatography)은 투석에 의해서 탈염되었고, 0.02 M 1,4-디티오-DL-트리톨(DTT)으로 환원되었으며, 0.2 M 4-비닐 피리딘(vinyl pyridine)으로 알킬화되었다. 그 다음 상기 단백질은 1:30의 적절한 효소 대 단백질 비율로 pH 8.5에서 0.25 M 트리스(트리스(히드록시메틸)아미노에탄)중의 엔도프로티네이즈 Lys-C (Wako Biochemicals)로 소화되었다. 상기 반응은 37℃에서 밤새 실행되었다.

20 mg/mL α-시아노-4-히드록시나믹산 및 아세톤/이소프로파놀 40/69 (v/v)중의 12 mg/mL 나이트로셀률로즈가 매트릭스(두꺼운 층 적용(thick-layer application))로 사용되었다. 첫째로, 0.5μL의 매트릭스는 타깃에 놓고 건조되도록 하였다. 그 다음, 1.0μL의 샘플이 첨가되었다. 상기 스펙트라는 선형 양이온화 모드로 20000 V의 가속 전압 및 95%의 그리드 전압으로 얻어졌다. 스팟 전부에 적용되는 최소 190 레이저 샷(laser shot)이 각 스펙트럼에 대해 쌓였다. Des-Arg¹-브라디키닌 및 보바인 인술린이 내부 검정 보정(calibration)을 위해 사용되었다.

실시예3 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 펩타이드 맵핑

상기 펩타이드는 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 펩타이드 맵핑에 의해 특성화 되었다. IEC 분획물은 MALDI-TOF MS 펩타이드 맵핑에 기술된 것과 같이 환원되고, 알킬화되고, 엔도프로티네이즈 Lys-C로 소화되었다. 소화된 이성질체의 분석은 Vydac RP-C18 분석 컬럼 (5μm, 2.1×250 mm) 및 동일한 충전 물질을 사용한 분취용 컬럼으로 Waters Alliance HPLC 시스템상에서 수행되었다. 용리는 물에서 0.2 mL/분의 유량으로 1%에서 95%의 아세토니트릴 기울기로 105분 동안 수행되었다. 두 용매 모두 0.1% (v/v)의 TFA를 함유하였다. 100 μL의 소화된 각 샘플이 주입되었고 215 nm에서 모니터되었다.

실시예 4 소화되지 않은 단백질의 MALDI-TOF 스펙트럼

18 mg/mL의 아세토니트릴 내 트랜스-3-인돌아크릴산 용액/ 0.1 % 트리플루오로아세트산 70/30 (v/v)이 샘플 용액과 동일한 양과 사전혼합되었다. 그리고 1.0 μL의 상기 혼합물이 타깃 표면에 사용되었다. 선형 양 이온화 모드에서 일반적으로 150 내지 200 레이저 샷이 평균하였다. 가속 전압은 25000 V, 그리드 전압(grid voltage)은 90%로 설정되었다. 보바인 알부민 M⁺ 및 M²⁺는 외부 검정 보정을 위해 사용되었다.

실시예 5 SE-HPLC (크기 배제 HPLC)

SE-HPLC가 TosoHass TSK 겔 G 4000 SWXL 컬럼(7.8×300 mm)이 갖추어진 Waters Alliance 2690 HPLC 시스템으로 수행되었다. 단백질은 0.4 mL/분의 유량에서 0.02 M NaH₂PO₄, 0.15 M NaCl, 1% (v/v) 디에틸렌 글리콜 및 10%(v/v) 에탄올(pH6.8)을 포함하는 이동상을 사용하여 용리되었고 210 nm에서 검출되었다. 주입량은 각 이성질체의 20μg이었다.

크기열 배제 HPLC 및 SDS-PAGE가 다른 IEC 분획물 내의 올리고-PEG-IFN 알파 2a 형태 및 집합체의 양을 측정하기 위해 사용되었다. 표준물질은 2.3% 집합체 및 2.2%의 소중합체를 포함하였다 (도 4).

피크 1, 4, 4a, 5, 6 및 8은 ＜0.7%의 올리고페길화된 IFN 알파 2a 형태를 포함하는 반면 피크 2, 3 및 7 에서는 올리고페길화된 IFN 알파 2a 형태의 백분율은 검출 범위 (＜0.2%)의 밑에 있다. 집합체의 경우는 다른 경향을 볼 수 있었다. 모든 피크에서 집합체의 양은 0.9% 미만이었다.

실시예 6 SDS-PAGE

SDS-PAGE는 비환원 및 환원 조건하에 16%의 트리스-글라이신 겔(1.5 mm, 10웰)을 사용하여 수행되었다. 2.5 내지 200 kDa의 질량 범위를 갖는 Novex Mark 12 분자량 표시자가 검정 보정을 위해 사용되었고, 보바인 세럼 알부민(BSA)이 감도 표준물질(2 ng)로 사용되었다. 모든 샘플의 약 1μg 및 0.5 μg의 표준물질이 겔에 사용되었다. 영동 조건은 120 분간 125V 및 6W였다. 상기 단백질은 고정된 후 Novex사제 은염색 키트 SilverXpress로 염색되었다.

비환원 조건하에 IEC 분획물 1-8(도 2)에 대해 기록된 겔은 PEG-IFN 알파 2a 참조 표준물질과 유사한 패턴을 나타낸다.

환원 조건하에서는, 표준물질과 비교해볼때 약 90 kDa 의 소밴드에서 강도의 증가함을 보인다. 피크 6, 7 및 8에서 6 내지 10 kDa의 단백질 조각이 나타난다(도 3). 두 밴드는 함께 약 1%의 잘린 물질에 상응한다. 이성질체 1, 5, 6, 7, 8의 레인에 표준물질에도 나타나는 100 kDa를 초과하는 추가적인 밴드를 볼 수 있다. 이러한 밴드는 소중합체에 지정할 수 있다. 따라서, SDS-PAGE는 SE-HPLC 분석의 결과를 확증한다.

종합적으로 보아서, RP-HPLC 및 SDS-PAGE 실험은 IEC 분획물의 순도는 PEG-IFN 알파 2a 표준물질과 유사하다고 볼 수 있는 것을 나타낸다.

9 IEC 분획물로부터 유도된 PEG-IFN 알파 2a 종의 구조는 상기의 방법을 사용하여, 상술된 방법의 결과를 바탕으로 확인 되었다.

실시예 7 항바이러스 활성 (AVA)

항바이러스 활성도는 베스티큘러 스토마타이티스 바이러스의 감염에 대한 마딘-다비 보바인 신장(MDBK) 세포에서의 보호 효과로 평가되었고 PEG-IFN 알파 2a 표준물질과 비교 되었다. 샘플 및 표준물질은 10% 우태아혈청을 포함하는 이글즈 미니멈 에센셜 배지 (Eagle's Minimum Essential Medium, MEM)에 최종 농도가 10 ng/mL(분석 평가 시작 농도)이 되도록 희석되었다. 각 샘플은 4중으로 분석 평가되었다.

베스티큘러 스토마타이티스 바이러스를 사용한 마딘-다비 보바인 신장 세포(MDBK)의 항바이러스성 보호 효과는 Virol. 1981, 37, 755-758에 기술된 방법에 따라 시험하였다. 모든 이성질체는 표 2에 나타난 것과 같이 항바이러스 분석 평가에서 활성을 유도하였다. 활성도는 1061 내지 339 U/μg의 범위이며, 이는 위치 이성질체 내의 단백질의 특이적 활성의 차이가 유의한 것임을 가리킨다. 기술 정보 및 지금까지 산출된 결과는 위치 이성질체 및 IFN 알파 수용체의 이러한 구조-기능 관계를 확증하기 위한 다른 조사를 착수할 수 있도록 할 것이다.

PEG-IFN의 항바이러스 분석 평가
피크	U/μg
PEG-IFN피크 1피크 2피크 3피크 4 피크 4a피크 5피크 6피크 7피크 8	1061 ± 501818 ± 1271358 ± 46 761 ± 97339 ± 33966 ± 107600 ± 27463 ± 25513 ± 20468 ± 23

PEG-IFN 알파 2a의 시험관내 항바이러스 활성도 및 개별의 PEG-IFN 알파 2a 이성질체. 항바이러스 활성도는 베스티큘러 스토마타이티스 바이러스로 감염된 MDBK 세포에서 측정되었다. 결과는 독립적으로 수행된 세 분석 평가의 평균치를 나타낸다.

상기 결과는 하기의 도안으로 더 자세히 예증된다.

도 1: 180 μg의 PEG-IFN 알파 2a의 분석 IEC-HPLC. 강한 양이온교환 분석 컬럼이 각 정제단계에서 분리된 위치 이성질체의 순도를 검사하기 위해 사용되었다 (TOSOH-BIOSEP, SP-5PW, 10 μm 입자 크기, 7.5 mm 직경, 7.5 cm 길이).

도 2: A/B: 트리스-글라이신(16%)을 사용한 SDS-PAGE 분석, 샘플은 비환원 조건하에서 전기영동 되었다. 겔은 단백질에 대해 은염색으로 염색되었다. 레인: M, 분자량 표시자 단백질/ 2, 피크 1/ 3, 피크 2/ 4, 피크 3/ 5, 피크 4/ 6, 피크 4a/ 7, 피크 5/8, 피크 6/ 9, 피크 7/ 10, 피크 8/ 11, 1×PEG-IFN 표준물질/ 12, 1.5×PEG-IFN 표준물질/ C₁, IFN 표준물질.

도 3: A/B: 트리스-글라이신(16%)을 사용한 SDS-PAGE 분석, 샘플은 환원 조건하에서 전기영동 되었다. 겔은 단백질에 대해 은염색으로 염색되었다. 레인: M, 분자량 표시자 단백질/ 2, 피크 1/ 3, 피크 2/ 4, 피크 3/ 5, 피크 4/ 6, 피크 4a/ 7, 피크 5/8, 피크 6/ 9, 피크 7/ 10, 피크 8/ 11, 1×PEG-IFN 표준물질/ 12, 1.5×PEG-IFN 표준물질/ C₁, IFN 표준물질.

도 4: 크기 배제(SE-) HPLC가 올리고-PEG-IFN 형태 및 다른 IEC 분획물 내의 집합체의 양을 측정하기 위해 사용되었다. SE-HPLC는 TosoHaas TSK 겔 G 4000 SWXL 컬럼(7.8 × 300 mm)으로 수행되었다.

도 5: PEG-IFN 분자가 IEC 크로마토그래피 후에도 완전한지와, 모노 페길화를 확인할 목적으로, 각 이성질체의 분자량를 측정하기 위해 MALDI-TOF 분광측정법이 사용되었다.

도 6: PEG-IFN 참조 표준물질의 MALDI-TOF Lys-C 펩타이드 맵 및 피크 1, 2, 3, 4, 4a, 5, 6, 7, 8. 표준물질에 비교하여 보이지 않는 피크는 화살표로 표시되었다.

도 7: PEG-IFN 참조물질의 Lys-C 소화물의 RP-HPLC 크로마토그램 및 피크 4a.

도 8: 실시예 1B에 기술된 TosoH Bioscience사제, 입자 크기 2.5 μm, 비다공성 SP-NPR로 채워진 컬럼상의 위치 이성질체의 PEG-IFN 알파 2a 혼합물의 5 내지 10μg의 분석 HPLC.

도 9: 페길화 부위를 나타내는 인터페론 알파-2a의 리본 구조. 이 구조는 NMR 분광법으로 측정된 인간 인터페론 알파-2a의 고해상도 구조이다(J. Mol. Biol. 1997, 274, 661-675 참고). 페길화된 인터페론 알파-2a의 페길화 부위는 빨간색으로 칠해져 있고 잔류 타입 및 잔류 번호로 라벨되어 있다.

Claims

Lys(31)에서 페길화된 인터페론 알파 2a(PEG-Lys(31)), Lys(49)에서 페길화된 인터페론 알파 2a(PEG-Lys(49)), Lys(70)에서 페길화된 인터페론 알파 2a(PEG-Lys(70)), Lys(83)에서 페길화된 인터페론 알파 2a (PEG-Lys(83)), Lys(112)에서 페길화된 인터페론 알파 2a(PEG-Lys(112)), Lys(121)에서 페길화된 인터페론 알파 2a(PEG-Lys(121)), Lys(131)에서 페길화된 인터페론 알파 2a(PEG-Lys(131)), Lys(134)에서 페길화된 인터페론 알파 2a(PEG-Lys(134)) 및 Lys(164)에서 페길화된 인터페론 알파 2a(PEG-Lys(164))의 군으로부터 선택된 페길화 인터페론 알파 2a의 위치 이성질체.
제 1 항에 있어서, PEG-Lys(31) 및 PEG-Lys(134)로 부터 선택된, 페길화 인터페론 알파 2a의 위치 이성질체.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 페길화 인터페론 내의 폴리에틸렌 글리콜 부분(PEG 부분)의 평균 분자량이 약 26,000 달톤 내지 약 66,000 달턴, 특히 약 40000 달톤인 것을 특징으로 하는 페길화 인터페론 알파 2a의 위치 이성질체.
페길화 인터페론이 하기를 특징으로 하는, 페길화 인터페론 알파 2a의 위치 이성질체의 단리 방법:

a) 약한 양이온교환 매트릭스를 사용한 분취용 액체 크로마토그래피 컬럼상에서 페길화 인터페론의 위치이성질체로 분리 하는 단계; 및

b) 상기 분획물이 강한 양이온교환 매트릭스를 사용한 분취용 컬럼상에서 추가로 분리되고 정제되는 단계.
제 4 항에 있어서, 상기 크로마토그래피 단계 a)가 소듐 아세테이트 농도의 약 pH 3.8 내지 pH 8.0의 선형 pH 기울기를 사용하여 수행되는 방법.
제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 크로마토그래피 단계 b)가 pH 4.2 내지 약 4.6의 초기 pH에서 약 6.4 내지 약 6.8의 최종 pH의, 소듐 아세테이트 완충액(A)에서 포타슘 포스페이트 완충액(B)으로의 선형 기울기로 수행되며, 상기 완충액은 추가로 12% 이하의 에탄올 및 1.5% 이하의 디에틸렌 글리콜을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서, 상기 크로마토그래피 단계가 약 27 ℃ 내지 약 35 ℃, 바람직하게는 약 30 ℃ 내지 32 ℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항에 따른 페길화 인터페론 알파 2a의 위치 이성질체 및 치료상 비활성 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 페길화 인터페론 알파 2a의 위치 이성질체 및 치료상 비활성 담체를 포함하는, 종양성 질병 또는 감염성 질병과 같은 면역조절 장애의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
병의 치료 및 예방에 사용하는 약제를 제조하기 위한, 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른, 페길화 인터페론 알파 2a의 위치 이성질체의 용도.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스성 질병의 치료에 사용하는 약제를 제조하기 위한 페길화 인터페론 알파 2a의 위치 이성질체.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 페길화 인터페론 알파 2a의 위치 이성질체를 투여하는 것을 포함하는 면역조절 질병의 치료 또는 예방 방법.