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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung eines Fucans
für die
Herstellung eines Medikamentes zum Behandeln einer Adhäsion, die
möglicherweise
an einer erkrankten Stelle an einem Tier ist.
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HINTERGRUND
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Eine
chirurgische Adhäsion
ist ein Typ einer Narbe, die sich zwischen zwei Teilen des Körpers bildet, gewöhnlich nach
einem chirurgischen Eingriff. Adhäsionen können schwere Probleme verursachen.
Zum Beispiel, können
Adhäsionen,
die die weiblichen Reproduktionsorgane betreffen (Ovarien, Fallopianröhren) Unfruchtbarkeit,
Dyspareunia (schmerzhaften Verkehr) und schwere Beckenschmerzen
verursachen. Adhäsionen,
die im Darm auftreten, können
Darmobstruktion oder -verschluss verursachen, und Adhäsionen können sich
auch an anderen Stellen, wie um das Herz, die Wirbelsäule und
in der Hand bilden. Außer
durch einen chirurgischen Eingriff können Adhäsionen durch Dinge, wie Endometriose,
Infektion, Chemotherapie, Strahlung und Krebs verursacht werden.
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Adhäsionen,
wie auch andere Krankheiten mit Bezug zu Angiogenese, wie Arthritis
und Psoriasis, können
für Wochen,
Monate oder Jahre andauern, was ausdauernde und kostspielige Pflege
notwendig macht. Siehe Robbins Pathological Basis of Disease by
Cotran, R. S., Kumar, V., Robbins, S. L., S. 75 (W. B. Saunders Co.,
1989). Solche Krankheiten und Zustände können sich zu chronisch entzündete Zuständen mit
schrecklichen Konsequenzen sowohl für das geistige als auch physische
Wohlbefinden des Patienten entwickeln. Bedauerlicherweise, gibt
es wenige therapeutische Optionen für Patienten mit chirurgischen
Adhäsionen,
Arthritis und Psoriasis. Oft werden Patienten mit Wirkstoffen, wie
steroiden oder nicht steroiden Entzündungshemmern behandelt, um
die Symptome der Krankheiten zu lindern. Jedoch bieten diese Therapien
oft keinen geeigneten Langzeitnutzen und sie sind mit schweren Nebenwirkungen
assoziiert, wenn sie zu oft angewendet werden (wie gastrische Geschwüre durch
nicht steroide Entzündungshemmer
oder schwerere Vergiftungen durch ein Übermaß der Verwendung von Steroiden).
Andere mächtigere
anti-proliferative und/oder anti-angiogenische Wirkstoffe, wie die
Antikrebswirkstoffe Paclitaxel, Methotrexat, Doxorubicin, Camptothecin
und Etoposid können
oft aggressivere Behandlungsmodalitäten zur Verfügung stellen,
aber die Verwendung dieser Wirkstoffe gegen nicht lebensbedrohende
Krankheiten ist durch unerwünschte
Giftigkeiten und Nebenwirkungen begrenzt. Daher blieb ein Bedarf
nach Verbindungen, Zusammensetzungen, Verfahren und ähnlichem
unbefriedigt (einschließlich
Verabreichungsansätzen),
um eine oder mehr dieser Krankheiten, vorzugsweise wirksamer bei
weniger Nebenwirkungen, zu behandeln. Die vorliegenden Verbindungen,
Zusammensetzung, Verfahren, usw. stellen einen oder mehr dieser
Vorteile dar.
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ZUSAMMENFASSUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines Fucans für die Herstellung
eines Medikamentes zum Behandeln einer Adhäsion, die möglicherweise an einer erkrankten
Stelle an einem Tier ist, bereit. Die Fucane stellen einen signifikanten
therapeutischen Effekt für
diese Krankheiten bereit, während
sie weniger Nebenwirkungen besitzen.
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In
einer Ausführungsform
ist das Tier ein Mensch und/oder das Fucan ist ein Fucoidan. Die
Krankheitsstelle kann eine chirurgische Stelle sein, und das Fucan
kann zur direkten Abgabe als eine Zusammensetzung an diese erkrankte
Stelle sein. Das Fucan kann für
die im Wesentlichen kontinuierliche Verabreichung an eine erkrankte
Stelle über
die kontrollierte Freisetzung aus einer polymeren Dosierungsform
sein und die polymere Dosierungsform kann ein Film, ein Pflaster,
eine Paste, eine Mikrokugel, ein Implantat, Gel, Spray oder eine Flüssigkeit
sein. Das Fucan kann zur Verabreichung als eine pharmazeutische
Zusammensetzung in einer Form sein, die mindestens eines von Creme,
Paste, injizierbaren Trägerstoff
und Polymer umfasst.
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Falls
nicht andere angemerkt oder aus dem Kontext klar ist, können alle
Ausführungsformen,
Aspekte, Merkmale, usw. In jeder gewünschten Weise gemischt und
aneinander angepasst, kombiniert und permutiert werden.
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Das
Fucan kann zur Verabreichung als eine pharmazeutische Zusammensetzung
sein, die Fucan und eine therapeutisch wirksame Menge von mindestens
einem anderen Wirkstoff enthält.
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Der
Wirkstoff kann mindestens einer von Paclitaxel, Doxorubicin, Camptothecin,
Etopsid, Mitoxantron, Methotrexat, Menadion, Plumbagin, Juglon,
Beta-Laperchon Cyclosporin, Sulfasalazin, Steroid, Rapamycin, Retinoid,
Docetaxel, und Colchicin, einem Antisense-Oligonukleotid, Ribozym
und einem Oligonukleotid-RNA Inhibitor sein. Die therapeutisch wirksame
Menge des Fucans kann zur Abgabe Teil einer Zusammensetzung sein
und die Zusammensetzung kann von ungefähr 0,1% bis 35%, 5% bis 50%,
20–80%,
80% bis 100% (w/v) des Fucans umfassen.
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Die
Zusammensetzung kann ferner mindestens einen pharmazeutisch verträgliche Trägerstoff
umfassen, wie Pluron, Zellulose, Alginat, Acrylat, Hyaluronsäure, Polyethylenglykol,
einen injizierbaren Auszug und Chitosan. Das Fucan kann, je nach
Wunsch direkt an die erkrankte Stelle zur oralen Verabreichung, über Injektion
an die erkrankte Stelle intraokulär, intraperitoneal, intramuskulär, intraartikulär, intralesional,
subkutan intravaginal, rektal oder topisch, oder anders sein.
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Arthritis,
Psoriasis oder angiogenische Augenkrankheiten können durch Verabreichung einer
therapeutisch wirksamen Menge eines Fucans an eine erkrankte Stelle
behandelt werden.
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Pharmazeutische
Zusammensetzungen können
eine polymere Dosierungsform eine Fucans umfassen, die eine therapeutische
wirksame Menge des Fucans umfasst und mindestens einen pharmazeutisch
verträglichen
Trägerstoff,
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus einer pluronischen, Alignat-, Acrylat-,
Hyaluronsäure,
Polyethylenglykol, injizierbarem Trägerstoff und Chitosan. Die
polymere Dosierungsform kann, je nach Wunsch, ein Film, eine Paste,
eine Mikrokugel, Spray, Lotion, Flüssigkeit oder Implantat, oder
andere Form sein. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch
eine therapeutische wirksame Menge mindestens eines anderen Wirkstoffs,
wie eines Antisense-Oligonukleotids, Ribozyms und eines Oligonukleotid-RNA-Inhibitors
sein.
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Die
Adhäsion
kann eine chirurgische Adhäsion
sein.
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Diese
und andere Aspekte, Merkmale und Ausführungsformen sind in dieser
Anmeldung ausgeführt, die
die folgende eingehende Beschreibung und die beigefügten Zeichnungen
umfasst.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1 ist
ein Diagramm von Fucoidaninhibition der Zellproliferation in Synoviocyten
und glatten Muskelzellen nach 48 Stunden Exposition.
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2 ist
ein Diagramm von Fucoidaninhibition von Phorbolesthermyristat (PMA)
induzierter Neutrophilenaktivierung.
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3 ist
eine Fotographie darstellend die Fucoidaninhibierung der Collagenase
und Stromelysin Expresion bei einer Konzentration von 0,5% (w/v)
ohne exzessive Inhibierung der Proteoglykanexpression.
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4 ist
ein Diagramm der Fucoidanfreisetzung aus Ethylenvinylacetatfilm.
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5 ist
ein Diagramm der Fucoidanfreisetzung aus Polycaprolactonpaste.
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EINGEHENDE BESCHREIBUNG
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Behandlung von Adhäsionen durch
das Inhibieren von Zellproliferation, Entzündungsreaktionen und Angiogenese
unter Verwendung von sulphatierten Polysacchariden, die als Fucane
bekannt sind. Es scheint, dass Fucane wie Fucoidan die Neutrophilenaktivierung,
die Freisetzung entzündungsfördernder
Enzyme aus Athritis assoziierten Zellen, und die Angiogenes in Hühnermembranen
und chirurgischen Adhäsionenen
hemmen können.
Da alle Zellen Fucose bindende Rezeptoren enthalten, werden in einigen
Ausführungsformen
die Fucane direkt an die erkrankte Stelle verabreicht, um die im
Wesentlichen kontinuierliche Exposition von Zielgewebe gegenüber Fucanen
(wie Fucoidan) über
die kontrollierte Freisetzung aus polymeren Dosierungsformen bereitzustellen.
Da Fucane in vivo multiple Effekte haben können (, die insbesondere das
Blutthrombin und -komplement beeinflussen), ist eine Stellen gerichtete kontrollierte
Freisetzung von Fucanen eine Alternative zur systemischen Verabreichung,
die die haematologischen Toxizitäten
vermindern kann.
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Das
Folgende wird zuerst allgemein Fucane, Adhäsionen, Arthritis und Psoriasis
diskutieren, dann einige Ausführungsformen
der Erfindung diskutierten, dann einige Beispiele bereitstellen.
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Allgemeine Hintergrunddiskussion über Fucane,
Adhäsionen,
Arthritis und Psoriasis
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Fucane.
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Fucane
(einschließlich
Fucoidan) sind sulphatierte Hochmolekulargewichtspolysaccaride,
die aus braunem Seetang extrahiert wurden. Diese Verbindungen besitzen
laut Berichten multiple inhibitorische Wirkungen in vivo und in
vitro, was Anti-Thrombin-, anti-proliferative, Anti-Komplement-, Anti-Krebs-
und Anti-Neutrophilmigrationseffekte einschließt. Fucane können zahlreiche
Bindungsereignisse an den Zelloberflächen blockieren, was die Zell-Zell
Bindung durch Intergrin-Selektin Moleküle oder durch Bindung von Thrombin
oder Komplement in dem Blut oder Fucoserezeptoren auf den Zelloberflächen einschließt.
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Man
denkt, dass solche Aktivität
für die
entzündungshemmenden
Eigenschaften über
(zum Beispiel) die Inhibierung von Lymphocyten oder Neutrophilenbindung
und vaskuläre
Endothelzellen verantwortlich ist, die vielleicht die Invasion dieser
Zellen in ein Gewebekompartment mit nachfolgender Entzündung verhindert. Patankar,
M. S., et al., J. Biol. Chem. 268: 21770-21776 (1993); Brandley,
B. K., et al, J. Cell Biol. 105: 991-997 (1987). Kürzlich vorgenommene
Studien zeigten auch, dass Fucane die Proliferation von vaskulären glatten Muskelzellen
hemmen. Logeart, D., et al., Eur. J. Cell Biol. 74: 376-384 & 385-390 (1997),
was ein mögliches Anti-Restenosepotential
dieser Verbindungen andeutet (aber nicht beweist). Es wurde gezeigt,
dass Fucane langsam nach Oberflächenbindung
sowohl an Endothel- als auch glatten Muskelzellen in die Zellen
internalisiert werden. Glabe, C. G., et al., J. Cell Science 61:
475-490 (1983); Logeart, D., et al., Eur. J. Cell Biol. 74: 376-384
(1997). Riou, D., et al., Anticancer Res., 16 (3A): 1213-1218 (1996);
Itoh, H, Anticancer Res., 13 (6A): 2045-2052 (1993); Nishiro, T.,
et al., Thromb. Res., 62: 765-773 (1991); Blondin, C., et al., Mol.
Immunol., 31: 247-253 (1994); Patankar, M. S., et al., J. Biol.
Chem., 268: 21770-21776 (1993). In Japan wird Fucoidan, das aus
zahlreichen Seegräsern
extrahiert wird, als ein Gesundheitsnahrungsmittel vermarktet. Fucoidan
wurde als eine kosmetisches oder Hautagens vorgeschlagen.
JP 01031707 und
JP 01085905 . Es wurde berichtet, dass
Fucoidan ein potentielles Antikrebsmittel ist. Riou. D., Anticancer
Res. 16: 3a 1213-18 (1996); Itoh, H., et al., Anticancer Res., 15:
5b 1937-47 (1995). Es wurde berichtet, dass Fucoidan Angiogenese
nicht in vitro hemmt. Soeda, S., et al., Biochim. Biophysica Acta
(1): 127-134 (2000). In ähnlicher
Weise wunde gefunden, dass Fucoidan HUVE-Zellproliferation (in vitro),
die durch Serum induziert wurde, stimuliert, was einen möglichen
proangiogenen Effekt anzeigt (obwohl Hemmung möglich war, wenn Fibroblasten-Wachstumsfaktor vorhanden
war) Giraux, J., et al., Eur. J. Cell Biol. 77 4: 352-9 (1998).
Studien haben auch gezeigt, dass Fucane die Bindung an Endothelzellmonolayer
hemmen. Glabe, C. G., J. Cell Science, 61: 475-490 (1983). Da die
Zellen, die die Kapillaren ausmachen, Endothelzellen sind, deutet
dieser Bericht an, dass in vitro einige Aspekte der Zelladhäsion gehemmt
werden können,
aber diese Daten beweisen keinen in vitro antiangiogenen Effekt von
Fucoidan. Es wurde berichtet, dass Fucoidan die Bindung von Helicobacter
an gastrische Zellen hemmt, was auf einen antigastrischen Geschwüreffekt
hinweist. Shibat, H. J., Nutr. Sci. Vitaminol. 45: 325-336 (1999).
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Es
wird berichtet, dass andere sulphatierte Polysaccharide, die verzweigten
und linearen Typen einschließend,
differentielle antigerinnenden Aktivität besitzen. Pereira, M. S.,
J. Biol. Chem. 12: 7656-67 (1999). Es wurde berichtet, dass Dextransulphat
und Derivate Krebszellwachstum hemmen, Bittoun, P., Carbohydrate Res.
(3-4): 247-255 (1999) und antigerinnende Effekte besitzen, Mauray,
S., J. Biomat. Sci. Poly A. 9: 373-87 (1998). Sulphatierte Polysaccharide
wurden als antvirale Agenzien für
die Verwendung gegen, z. B., AIDS vorgeschlagen.
EP 00293826 ;
JP 01313433 .
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Adhäsionen
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Adhäsionsbildung
ist ein komplexer Prozess, in dem Gewebe, die normalerweise in dem
Körper
separiert sind, ineinander wachsen. Chirurgische Adhäsionen (auch
bekannt als post chirurigische Adhäsionen) entwickeln sich aus
der sonst normalen Wundheilungsreaktion der Gewebe auf Trauma hin
und ereignen sich in über
zwei Drittel aller Patienten mit abdominalen Eingriffen. Ellis,
H.,, Surg. Gynecol. Obstet. 133:497 (1971); Wiebel, M-A. und Majno,
G., Am. J. Surg. 126: 345 (1973). Die Konsequenzen dieser Adhäsionen variieren und
hängen
von der beteiligten Stelle des Eingriffs ab. Probleme können Schmerz,
Unfruchtbarkeit, Obstruktion des Darms und selbst eine erhöhtes Sterblichkeitsrisiko
nach einem Herzeingriff beinhalten.
- diZerega, G. S., Prog.
Clin. Biol. Res. 381: 1-18 (1993); diZerega, G. S., Fertil. Steril.
61: 219-235 (1994); Dobell, A. R., Jain, A. K., Ann. Thorac. Surg.
37: 273-278 (1984).
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Der
Prozess der Adhäsionsbildung
beinhaltet anfänglich
die Etablierung eines Fibrinnetzes und normale Gewebereparatur.
Der normale Reparaturprozess ermöglicht
Fibrinolyse neben mesothelialer Reparatur. Jedoch reift bei chirurgischer
Adhäsionsbildung
die Fibrinmatrix während
Fibroblasten in das Netzwerk proliferieren und es zu Angiogenese
kommt, was in der Ausbildung einer organisierten Adhäsion innerhalb
von 3 bis 5 Tagen resultiert. Buckman, R. F., et al., J. Surg. Res.
21: 67-76 (1976); Raferty, A. T., J. Anat. 129: 659-664 (1979).
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Inflammatorische
Prozesse beinhalten Neutrophilenaktivierung in dem traumatisierten
Geweben, Fibrinablagerung und Bindung von neben einander liegenden
Geweben, Macrophageninvasion, Fibroblastenproliferation in das Gebiet,
Collagenablagerung, Angiogenese und die Ausbildung von permanenten
Adhäsionsgeweben.
Gegenwärtig
schließen
preventative Therapien die Prävention
von Fibrinablagerung, Verminderung der Entzündung (steroide und nicht steroide
entzündungshemmende
Wirkstoffe) und Entfernung der Fibrinablagerung ein.
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Versuchen
zum Eingreifen, um die Bildung von post-Eingriffsadhäsionen zu
verhindern, schlossen die Verwendung von Hydrofloationstechniken
oder Barrierevorrichtungen ein. Hydroflotaiton involviert die Instillation
von großen
Volumina von Polymerlösungen
wie Dextran, Adhesion study group, Fertil. Steril. 40: 612-619 (1983),
oder Carboxymethylzellulose, Elkins, T. E., et al., Fertil. Steril.
41: 926-928 (1984) in die Stelle des Eingriffs ein, um zu versuchen
die Organe getrennt zu haken. Synthetische Barrieremembranen, die
aus oxidierter regenerierter Zellulose (InterceedTM)
herstellt wurden, Polytetrafluroethylen (Gore-tex Membran für chirurigische
Eingriffe) und vollständig
resorbierbare Membranen, die aus einer modifizierten Hyaluronsäure/Carboxymethylzellulose
(HA/CMC) Kombination (SeprafilmTM) hergestellt
wurden, wurden auch verwendet, um die Bildung von post-Eingriffsadhäsionen sowohl
bei Tieren als auch Menschen zu vermindern. Burns, J. W., et al., Eur.
J. Surg. Suppl. 577: 40-48 (1997); Burns, J. W., et al., Fertil.
Steril. 66: 814-821 (1996); Becker, J. M., et al., J. Am. Coll.
Surg. 183: 297-306 (1996). Der Erfolg dieser HA/CMC Membran kann
von ihrer Fähigkeit
stamen, Trennung des Gewebes während
des peritonealen Wundreparaturprozesses sicher zu stellen, wenn
sich die Adhäsionen
bilden. Es wurde beobachtet, dass die Membranen eine klare visköse Schicht
auf dme verletzten Gewebe nach Applikation für 3–5 Tage bildeten, eine Zeitperiode,
die compatible ist mit dem Zeitverlauf der Bildung von post Eingriffsadhäsionen.
Ellis, H.,, Br. J. Surg. 50: 10-16 (1963). Die intraperitonale Verabreichung
von entzündungshemmenden
Agenzien, wie Dexamethason oder Corticosteroiden führte zu
marginaler Hemmung der Adhäsionsbildung
diZerega, G. S., Fertil. Steril. 61: 219-235 (1994); Hockel, M,
Ann. Chir. Gynecol. 76: 306-313 (1987).
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Arthritis.
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Arthritis,
wie rheumatoide Arthritis (RA), ist eine lähmenden chronisch entzündliche
Krankheit, die fast 2% der Weltbevölkerung betrifft. Dieser Zustand
ist gekennzeichnet durch Schmerz, Anschwellen, synoviale Zellproliferation
(Pannusbildung), Angiogenese und Zerstörung des Gelenkgewebes. In
dem fortgeschrittenen Stadium schädigt die Krankheit wichtige
Organe und kann tödlich
sein. Die Krankheit involviert mehrere Mitglieder des Immunsystems
(Macrophagen/Monocyten, Neutrophile, B-Zellen und T-Zellen), komplexe
Zytokininteraktionen und synoviale Zellfehlfunktion und Proliferation.
Eine frühe
aggressive Behandlung wird nun mit die Krankheit modifizierenden
antirheumatischen Wirkstoffen (DMARDS) empfohlen, wie Methotrexat
und Kombinationen mit Cyclosporin oder Azathioprin. Arthritis and
Rheumatism, 39(5): 713-722 (1996).
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Kristall
induzierte Arthritis betrifft fast 1% der Bevölkerung und ist gekennzeichnet
durch Kristall induzierte Aktivierung von Macrophagen und Neutrophilen
in den Gelenken und löst
für viele
Tage sehr schweren Schmerz aus. Die Krankheit schreitet fort, so
dass die Intervalle zwischen den Episoden kürzer werden und die Schwere
der Krankheit für
den Patienten auf unakzeptable Niveaus ansteigt. Diese Krankheit
wird im Allgemeinen symptomatisch mit NSAIDs behandelt. Für eine eingehendere
Diskussion der Pathophysiologie dieser Krankheit oder anderer Formen
von entzündlicher
Arthritis siehe McCarty, et al., Arthritis and Allied Conditions
by Lea and Febiger, Philadelphia 1495 (1985).
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Psoriasis.
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Psoriasis
ist eine übliche,
chronisch entzündliche
Hautkrankheit, gekennzeichnet durch erhobene, verdickte und schuppige
Läsionen,
die jucken, brennen, stechen oder leicht bluten. Mehr als 2% der
Amerikaner leiden an Psoriasis und Patienten besitzen oft begleitende
arthritische Symptome. Die Ursache der Krankheit ist unbekannt und
es gibt keine Heilung für
die Krankheit gegenwärtig.
Es gibt Beweise, die das Konzept einer Autoimmunkrankheit unterstützen. Die
Krankheit ist ferner gekennzeichnet durch Neutrophilenaktivierung, Zellproliferation
und Angiogenese.
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Hautzellen
können
zwei Routen des Wachstums folgen, normalem Wachstum oder Wundheilung.
Bei normalem Wachstum, werden Zellen in der Basalschicht erzeugt,
und bewegen sich durch die Epidermis an die Hautoberfläche. Tote
Zellen werden von der Oberfläche
mit der gleichen Geschwindigkeit abgeworfen, wie sich neue unten
bilden. Während
der Wundheilung, wird verschnellertes Wachstum und Reparatur ausgelöst, was
in einem raschem Durchlauf der Hautzellen, erhöhter Blutversorgung und Entzündung resultiert.
In einiger Hinsicht ist Psoriasis ein überschießender Wundheilungsprozess.
Wenn die Haut die Hautzellen (Keratinocyten) nicht so schnell abwirft,
wie sie erzeugt werden, dann kann es zu einem Aufbau kommen. Dies
kann zu schuppigen Läsionen
und Angiogenese führen
(um die Blutzufuhr zu erhöhen).
Zur gleichen Zeit können
Lymphocyten, Neutrophile und Macrophagen Wundheit, Anschwellen und
Entzündung
erzeugen. Gegenwärtige Wirkstofftherapien
schließen
die Verwendung von steroiden und nicht steroiden entzündungshemmenden Agenzien
ein, um Entzündungssymptome
zu behandeln. Methotrexat und Cyclosporin werden auch mit marginaler
Wirksamkeit verwendet. Die gegenwärtigen Kosten zum Behandeln
von Psoriais in den USA betragen mehr als 3 Milliarden $ pro Jahr.
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Allgemeine Diskussion
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Die
vorliegende Erfindung stellt die Verwendung von Fucanen (einschließlich von
Derivaten und Analogen davon) für
die Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von chirurgischen
Adhäsionen
bereit (wobei wie hier verwendet Behandlung sowohl die Behandlung
von bestehenden Zuständen
als auch die Hemmung potentieller Zustände umfasst). Wie in den Beispiel
unten demonstriert, hemmen Fucane (und insbesondere, Fucoidan) die
Zellproliferation, inflammatorische Reaktionen/Ereignisse und Angiogenese,
einschließlich zum
Beispiel bei chirurgischen Adhäsionen.
In einer Ausführungsform
werden Fucane, wie Fucoidan, verwendet, um Angiogenese zu hemmen
oder ihr vorzubeugen. In einer anderen Ausführungsform werden Fucane, wie
Fucoidan, verwendet, um inflammatorische Zellaktivierung zu hemmen
oder ihr vorzubeugen, so dass die Zellen, die entzündliche
Reaktionen bei solchen erkrankten Stellen initiieren, gehemmt werden
können.
Das ist, zum Beispiel, wichtig, da viele Krankheiten, wie zum Beispiel,
Osteoarthritis nicht notwendigerweise mit inflammatorischen Zellanhäufung an
den erkrankten Stellen einhergehen. Somit kann solche Verwendung
von Fucanen die langwierigere Aktivierung von residenten Macrophagen,
Neutrophilen und anderen entzündungsauslösenden Zellen
hemmen oder ihr vorbeugen, die die chronischen unerwünschten
Effekte der Krankheit verursacht. Solche Fucanaktivitäten werden
hier auf chirurgische Adhäsionen
angewendet.
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In
einer Ausführungsform
dieser Erfindung können
Fucane, einschließlich
Derivate und Analoge davon, in einer Formulierung zur kontrollierten
Freisetzung formuliert werden, um anhaltende effektive Konzentrationen
des Agens bereitzustellen, die an den erkrankten Stellen bereitzustellen
sind. In einer anderen Ausführungsform
wird Fucoidan für
die Behandlung von chirurgischen Adhäsionen verwendet. Beispiele
werden hier gegeben. Solche Beispiele demonstrieren die inhibitorische
Wirkung von Fucoidan gegen primäre
Chondrocyten (in rheumatischer Arthritis involvierte Zellen), die
von frischem Knorpel abgeleitet sind Dies zeigt an, dass das Agens
ein Potential als ein anti-arthritisches Agens besitzt. Insbesondere
bietet die offenbare Fähigkeit
von Fucoidan, die Collagenase und Stromylesin Produktion zu hemmen,
therapeutische Ansätze
an, bei denen die Freisetzung dieser und/oder anderer Metalloproteinasen
medizinischen Probleme verursacht.
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In
anderen Ausführungsformen
kann Fucoidan in Kombination mit anderen therapeutischen Agenzien verwendet
werden, um eine gute Wirksamkeit gegen den Krankheitsprozess bei
geringer Toxizität
zu ermöglichen.
Zum Beispiel können
bei der Behandlung von chirurgischen Adhäsionen mächtige antiproliferative Wirkstoffe,
wie Doxorubicin, Camptothecin, Etoposid, Mitoxantron, Methotrexat,
Menadion, Plumbagin, Juglon, Beta-Laperchon Cyclosporin, Sulfasalazin,
Steriode, Rapamycin, Retinoid, Paclitaxel, Docetaxel, Colchicin
und andere Miktrotubuli-Inhibitoren, und andere Analoge und Derivate
davon, unerwünschte
Toxizitäten
bei Konzentrationen des Wirkstoffs besitzen, die für die Hemmung
der Adhäsionsprozesse
ohne Fucan benötigt
werden, aber sie können
bei niedrigeren Konzentrationen in Kombination mit Fucanen, wie
Fucoidan, nützlich sein,
um die erwünschten
Ergebnisse zu erreichen.
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In
einer anderen Ausführungsform
wird vorgeschlagen, dass das Fucan selbst die Dosierungsform des Agens
sein kann. Zum Beispiel können
die Fucane als dünne
Filme hergestellt sein, die direkt auf eine chirurgische Traumaregion
platziert werden können,
so dass die langsame Auflösung
des Fucans die Gewebe gegenüber
einer anhaltenden und wirksamen Konzentration des Agens exponiert.
In der Tat kann solch eine Formulierung als ein Verabreichungssystem
für die
kontrollierte Freisetzung des Wirkstoffs für sich selbst (als das aktive
Agens) oder für
andere Agenzien (wie Paclitaxel) agieren, die in die Formulierung
platziert werden können.
Die Fucane können
auch in Tabletten, Kapseln, Mikrokugeln, Pasten, Gele, Puder, Aerosole
geformt werden oder oral, rektal, als ein Feststoff oder als eine
Lösung
gegeben werden.
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Im
Allgemeinen, können
Fucane allein oder als Teil einer Zusammensetzung durch Applikation
oder Injektion als eine Paste, Gel, Spray, Partikel, Film, Lösung, Flüssigkeit,
Lotion, Creme oder Implant verabreicht werden. Verabreichungswege
und -stellen beinhalten oral, systemisch, intraokulär, subkutan,
intraperitoneal, intramuskulär,
intraartikulär,
inralesional, intravaginal, rektal oder topisch, wie in einem Pflaster.
Diese Wege können
auch, in bestimmten Fällen,
die vorgeschlagene Wirkungsstelle der Fucan oder Fucan-Wirkstoffkombinationsdosierungsform
sein. Die therapeutisch wirksame Menge des Fucans kann als ein Teil
einer Zusammensetzung verabreicht werden und kann 5% bis 50%, 20–80%, 80%
bis 100% (w/v) der Zusammensetzung umfassen. Die Fucane können in
geeigneten Gefäßen oder
Containern bereitgestellt werden, die selbst in Kits bereitgestellt
werden können
und auch mit einer Beschriftung bereitgestellt werden, vorzugsweise
mit einer Beschriftung, die durch eine Regierungszulassungsbehörde wie
der „Fond
and Drug Administration" in
den Vereinigten Staaten von Amerika genehmigt wurde.
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Für die Behandlung
von Adhäsionen
können
die Fucane oder Fucan enthaltenden Zusammensetzung direkt an die
erkrankte oder chirurgische Stelle als eine Lösung, Partikel, Suspension,
Film, Paste, Gel, Spray, Flüssigkeit,
Lotion, Implantat oder andere gewünschte Form verabreicht werden.
Adhäsionen
können
auch durch die systemische Verabreichung des Funcans auf intravenösem, subkutanem,
intramuskulärem,
intraperitonealem, oralem oder anderem Verabreichungswege, je nach
Wunsch, behandelt werden.
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Fucane
können
zu Behandlung von Angiogenese-Krankheiten des Auges verwendet werden.
Zum Beispiel ist diabetische Retinopathie eine potentiell zur Erblindung
führenden
Komplikation von Diabetes, die die Blutgefäße der Retina schädigt, gefolgt
von neuem Blutgefäßwachstum
(Angiogenese), die verschwommene Sicht oder retinale Zerstörung verursacht.
Maculardegeneration wird durch die Invasion von neuen Blutgefäßen unterhalb
der Retina verursacht und ist die Hauptursache von Blindheit in
den USA und Europa mit 200.000 neuen Fällen pro Jahr in den USA und
nur 15% dieser sind mit gegenwärtigen
Lasertherapien behandelbar. Ein pharmakologischer Ansatz für die Behandlung
dieser Krankheiten kann mit den Verfahren und Zusammensetzungen,
die hier diskutiert wunden, wenn sie für die Verwendung mit dem Auge
adaptiert wurden, bereitgestellt werden. Zum Beispiel können die
Fucane direkt an die Oberfläche
oder in das Auge injiziert werden. Modifikationen an solchen Systemen
schließen
chemisches Quervernetzen ein, um die Geschwindigkeit der Auflösung der
Dosierungsform abzubremsen, oder Mischung mit anderen Trägerstoffen,
wie Pluronen, Aliginaten, Acrylaten, Zellulose, Hyaluronsäure, Polytethylenglykolen,
Chitosan, einschließlich
Analoge oder Derivate davon, und zahlreiche andere pharmazeutischen
verträgliche
Formulierungsagenzien.
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In
einer anderen Ausführungsform
der Erfindung bilden die Fucane ein geladenes wässriges Gel mit positiv geladenen
Trägerstoffen
wie zum Beispiel Chitosan oder Poly-1-Lysin. Wirkstoffe wie zum
Beispiel eine Antisense-Oligonuldeotid, Ribozym und eine Oligonukleotid
RNA-Inbibitor, können in
ein solches Gel zur Applikation an eine erkankte Stelle aufgenommen
werden. Alternativ kann ein einen solchen Wirkstoff enthaltendes
Gel, oder der Wirkstoff, gelöst
in eine Lösung
des Fucans, vollständig
getrocknet werden und in Partikel zermahlen werden. Diese Partikel
können
dann auf eine erkrankte Stelle appliziert werden, um als eine Dosierungsform
zur kontrollierten Freisetzung zu agieren, oder diese Partikel können als
ein Transfektionsagenz agieren, da Oberflächen gebundene Fucane in Zellen
aufgenommen werden. Die Applikation solcher Partikel kann durch
die Verwendung von pharmazeutisch verträglichen Trägerstoffen, wie Trägerstoffen,
wie Plurone, Zellulose, Aliginaten, Acrylaten, Hyaluronsäure, Polytethylenglykolen,
Chitosan, injizierbaren Trägerstoffen, einschließlich Analoge
oder Derivate davon, und zahlreichen Polymer basierten Vehikeln
ermöglicht
werden.
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In
Hinsicht auf Transfektion und die Verwendung von Fucanen mit Nukleinsäureagenzien
wird das voranschreitende Gebiet der Medizin, das als Gentherapie
bekannt ist, durch Wirkstoffverabreichungsschwierigkeiten eingeschränkt, wobei
Genfragmente oder Nukleinsäureketten,
wie Oligonukleotide einschließlich
Riboyzmen, Antisense-Nukleotiden und Oligonukleotid RNA Inhibitoren,
wegen der großen
Ladung und des großen Molekulargewichts
dieser Verbindungen eine verminderte Zellaufnahme haben. Vor kurzem
wurde die Verwendung von Mikropartikeln (wie Kalziumphosphat), enthaltend
das Gen oder die Nukleinsäure
als Transfektionsagenzien, vorgeschlagen, so dass sie an die Zelloberfläche binden
und durch Endocytose oder Einfaltung aufgenommen werden, was zu
zellulärem
Eintritt des Gens oder der Nukleinsäure führt. Die meisten Zellen enthalten
Fucose-Rezeptoren auf der Membranoberfläche. Die vorliegende Erfindung
stellt die Verwendung von Fucanen als Transfektionsagenzien für Nukleinsäureketten
bereit. In einer Ausführungsform
kann die Nukleinsäurekette
innerhalb eines Fucoidan-Mikropartikels gebunden oder eingekapselt
werden und der Partikel kann chemisch quervernetzt werden, um die
Auflösung
vor der Applikation auf die Targetzellstelle zu hemmen.
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Die
Fucane, entweder allein oder in Kombination mit anderen Wirkstoffen,
können
in Kombination mit Materialien verwendet werden, die in den Körper implantiert
werden. Diese Materialien können
zahlreiche medizinische Geräte
wie Katheter, Shunts, Membranen, Sterns, Schwämme, Füllungen, künstliche Ersatzgelenke und
Teile davon und andere orthopädisch
bezogene Implantate einschließen.
Solche Implantate können
Fucane enthalten oder mit Fucanen beschichtet werden, entweder allein
oder in Kombination mit anderen Wirkstoffen und Trägerstoffen.
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Falls
nicht anders angezeigt, außer
in den Patentansprüchen,
schließt
die Verwendung von „oder" „und" ein, und umgekehrt. Nicht einschränkende Begriffe
sind nicht als einschränkend
zu verstehen, falls nicht explizit anders angemerkt, oder der Kontext
dies klar anzeigt. (Zum Beispiel, zeigt „einschließend", „besitzend" und „umfassend" typischerweise „ohne Beschränkung einschließend" an). Die Einzahlformen,
was die Patentansprüche
mitumfasst, wie „ein/eine/einer", und „der/die/das" schließen den
Bezug auf die Mehrzahl mit ein, falls es nicht anders angemerkt
wurde, oder Kontext es klar anzeigt.
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BEISPIELE
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Beispiel 1: Der Effekt von Fucoidan auf
die Synoviocyten- und glatten Muskelzell-Proliferation in vitro.
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Proliferation
wurde mit dem Dimethylthiazol Diphenyltetrazolium-bromidsalz (MTT)
Proliferation/Zytotoxizitätsassay
bestimmt.
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An
Tag eins wurden 1500–2000
glatte Muskelzellen (A7r5 Embryo-Ratten-Thorax-Aorta) oder Synoviocyten
(HIG.82 Kaninchen) pro Nocke einer 96 Nockenplatte plattiert, wobei
die erste Spalte frei von Zellen gelassen wurde (frei). Die Platte
wurde in den 37°C,
CO2 Inkubator gestellt. Am folgenden Tag
wurde Fucoidan bei verschiedenen Konzentrationen hinzugegeben. Kein
Fucoidan wurde zu der ersten Spalte (frei) und der zweiten Spalte
(unbehandelte Spalte) als Kontrolle gegeben. Die Zellen wurden für 48 Stunden
exponiert. Am Ende der Expositionsperiode wurden 50 μl Dimethylthiazol
Diphenyltetrazolium-bromidsalz (MTT), in Medien gelöst, hinzugegeben
und für
4 Stunden bei 37° inkubiert.
Das Medium wurde dann abgesaugt und 200 μl Dimethyl-sulfoxid (DMSO) wurden
hinzugefügt.
Die Platte wurde für
30 Minuten geschüttelt
und die Absorption bei 562 nm gelesen. Die Messung der optischen
Dichte wurde in Zellzahlen umgewandelt mit einem Standartplot für optische
Dichte mit einer bekannten Anzahl von Zellen und die Zellviabilität wurde
als % Wachstum ausgedrückt
(dieser Wert ist der %-Wert verglichen mit den Kontrollzellen).
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Wie
in 1 gezeigt induzierte das Fucoidan eine Konzentrationsabhängige Hemmung
der Zellproliferation nach 48 Stunden Exposition für sowohl
Synoviozyten als auch glatte Muskelzellen. Die inhibitorischen Konzentrationen,
die eine 50% Effekt auf die Proliferation (IC50) ergaben, waren
15 μM bzw.
6 μM.
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Beispiel 2: Der Effekt von Fucoidan auf
Phorbolestermyristat (PMA) induzierte Neutrophilenchemilumineszenz.
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Dieses
Experiment inkubierte frische präparierte
humane Neutrophile mit Fucoidan bei 0.5% w/v gefolgt von Stimulation
der Zellen mit dem PMA. Stimulierung (oder Aktivierung) der Zellen
induzierte die Superoxid-Anion-Erzeugung, die durch die Emission
von Licht (Chemilumineszenz) gemessen werden konnte. Hemmung der
Neutrophilenfunktion wurde dann durch die Hemmung der Chemilumineszenz
gemessen. Hanks gepufferte Salzlösung
(HBSS) pH 7.4 wurde während
der ganzen Studie verwendet. Alle Chemikalien wurden von Sigma Chemical
Co. (St. Louis, MO) erworben, falls nicht anders angemerkt. Alle
Experimente wurde bei 37°C
durchgeführt.
Neutrophile wurde am frisch gesammeltem humanem zitriertem Vollblut
präpariert.
Kurz gesagt wurden 400 ml Blut mit 80 ml 4% Dextran T500 (Pharmacia
LKB, Biotechnology AB Uppsala, Sweden) in HBSS gemischt und für 1 h absetzen
gelassen. Plasma wurde kontinuierlich gesammelt und 5 ml auf 5 ml Ficoll
Paque (Pharmacia) in 15 ml Polypropylen-Röhrchen (Corning, NY) appliziert.
Nach Zentrifugieren bei 500 × g
für 30
min, wurden die Neutrophilenpellets von Erythrocyten durch 20 s
hypotonischem Schock frei gewaschen. Neutrophile wurden in HBSS
resuspendiert, auf Eis gehalten und innerhalb von 3 h für Experimente
verwendet. Neutrophilen Viabilität
und Reinheit war immer höher
als 90%.
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Die
Zellen wurden bei zahlreichen Konzentrationen von Fucoidan für 15 Minuten
bei 37°C
vor Zugabe von PMA inkubiert.
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Chemilumineszenz-Studien
wurden bei einer Zellkonzentration von 5 × 106 Zellen
pro ml in HBSS mit PMA bei 0.5 μM
durchgeführt.
Zu den Röhrchen
wurden 10 μl
Luminol, gelöst
in 25% DMSO in HBSS gelöst, gegeben,
um eine Endkonzentration von 1 mM zu ergeben und die Proben wurden
gemischt, um Neutrophilenaktivierung zu initiieren. Chemilumineszenz
wurde mit einem LKB Luminometer (Model 1250) bei 37°C, wobei
direkt vor den Messungen geschüttelt
wurde, beobachtet. Kontrollröhrchen
enthielten Zellen, Fucoidan und Luminol.
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Fucoidan
hemmt stark PMA induzierte Neutrophilenaktivierung, wie in 2 gezeigt
wird. Die Daten sind für
drei separate PMA-Neutrophilen Inkubationen. Diese Daten demonstrieren
einen entzündungshemmenden
Effekt von Fucoidan.
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Beispiel 3: Der Effekt von Fucoidan auf
die IL-1 induzierte Kollagenasegen- und Stromelysingenexpression
in Chondrocyten.
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Dieser
Assay misst die RNA-Niveaus für
zwei Metalloproteinasen, Collagenase und Stromelysin. Überexpression
dieser Gene resultiert in Sekretion dieser zwei Enzyme aus artikulären Chondrocyten
und kann einen Teil der Pathophysiologie von rheumatischer Arthritis
darstellen. Agenzien, die die Überexpression von
Collagenase und Stromelysin hemmen, sind potentielle antiarthritische
Agenzien. Dieses antiarthritische Potential kann vermindert sein,
wenn das Agenz auch signifikant die Proteolglycan Genexpression
hemmt. Proteoglycan Genexpression ist Teil der normalen Physiologie
von Chondrocyten. Primäre
Chondrocytenkulturen wurden frisch aus Kälberknorpel isoliert. Die Zellen
wurden plattiert (bei 2.5 × 106/ml) in 100 × 20 mm Kulturschalen und übernacht
bei 37°C
inkubiert in Ham's
F12 Medium enthaltend 5% fötales
Rinderserum (FBS). Die Zellen wunden mit serumfreien Medium über Nacht
hungern gelassen. Die Zellen wurden für 6 Stunden mit Camptothecin
bei Konzentrationen von 10–6 M 10–7 M
and 10–8 M
vorbehandelt. Dann wurde IL-1 (20 ng/ml) zu jeder Schale hinzu gegeben
und die Schalen wurden für
zusätzliche
18 Stunden inkubiert. Gesamt-RNA wurde durch das saure Guanidine
Isothiocyanat Verfahren isoliert und der Elektrophorese auf einem
denaturierenden Gel unterzogen. Denaturierte RNA Proben (15 μg) wurden
durch Gelelektrophorese in einem 1% denaturierendem Gel analysiert,
auf eine Nylonmembran transferiert, und mit der 32P
markierten Collagenase cDNA Sonde, 32P markierten
Stromelysin cDNA Sonde, 32P markierten Proteoglykan
cDNA Sonde bzw. 32P markierten Glyzerinaldehyphosphatdehydogenase
(PAGDH) cDNA Sonde hybridisiert. Die PAGDH Niveaus fungierten als
interner Standart, um grob gleiche Ladung sicher zu stellen. Die
experimentellen Ergebnisse auf Röntgenfilmen
wurden gescannt und mit HP ScanJet analysiert.
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Fucoidan
hemmt vollständig
Collagenase und Stromelysin Expression bei einer Konzentration von 0,5%
w/v ohne übermäßige Hemmung
von Proteoglycan Expression, wie es in 3 gezeigt
wird. Bei einer Konzentration von 0,1% w/v, gab es eine mächtige Hemmung
von Collagenase und Stromelysin Expression ohne jeden hemmenden
Effekt auf die Proteoglykan Expression. Diese Daten demonstrieren
einen entzündungshemmenden
Effekt von Fucoidan.
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Beispiel 4: Der Effekt von Fucoidan auf
Angiogenese in der chorioallantoischen Membran des Hühnerembryos (CAM
Assay).
-
Befruchtete
Hühnereier
wurden von einer örtlichen
Schlüpfeinrichtung
erhalten und in einen Inkubator mit einem automatischen Rotor bei
37°C für 3,5 Tage
vor dem Schlüpfen
oder Fenster machen platziert.
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Blätter von
sterilem gewachstem Papier wurden auf das Fenster platziert, das
in dem Luftraum angebracht wurde, und wurden verwendet um Kontamination
oder Dehydrierung der Eiinhalte zu verhindern. Diese Blätter, in
der Größe 4 cm × 4 cm,
wurden durch Besprühen
mit 70% Ethanol und Trocknen lassen in einer Laminarfluss Sicherheitsbank
sterilisiert. Nach drei Tagen wurden die Eier manuell in dem Inkubator
gedreht, so dass ihr spitzes Ende für 5–10 Minuten nach oben gerichtet
war, um die Ablösung
der Eininhalte von der inneren Membran zu ermöglichen. Mit 70% Ethanol und
Kimwipes wurde die gesamte Eierschale abgewischt, um die Außenseite
des Eis zu säubern
und zu reinigen. In einer Laminarfluss Sicherheitsbank wurde das
Ei mit dem stumpfen Ende nach oben gehalten und ein Loch wurde in
das stumpfe Ende des Eis gemacht, indem vorsichtig die Schale mit
dem Ende von einer Pinzette geknackt wurde. Die Schalenreste wurden
vorsichtig mit der Pinzette entfernt, um ein Loch in dem stumpfen
Ende zu bilden. Dieses runde Loch wurde 2 bis 3 cm Durchmesser groß gemacht,
ohne die innere Membran zu beschädigen.
Nachdem das Loch in die Schale gemacht wurde, wurde die innere Schalenmembran
(die die Eiinhalte beinhaltet) vorsichtig abgerissen und mit der
Pinzette entfernt, wobei Sorge getragen wurde, die chorioallantoische
Membran (CAM) nicht zu beschädigen
(die den Eidotter und den sich entwickelnden Embryo beinhaltet).
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Das
Loch wurde dann mit dem Blatt sterilisiertem Parafilm Wachspapier
bedeckt, indem der Parafilm vorsichtig gestreckt und dann um das
Loch gelegt wurde. Das Ei wurde dann in den Eiständer in dem Inkubator (37°C) platziert
und in solch einer Weise positioniert, das Rotation verhindert wunde.
Nach 6 Tagen wurde jedes Ei eines nach dem anderen aus dem Inkubator
(stumpfe Seite nach oben) entfernt, und der Parafilm, der das Fenster
bedeckt, wurde für
direkten Zugang zu der CAM entfernt, die von dem hinteren Darm des
Embryos stammt. Fucoidan geladene Poly(epsilon-caprolacton) (PCL)
Pellets wurden hergestellt, indem PCL bei 60°C geschmolzen wurde und das
Fucoidan in das PCL physikalisch gemischt wurde und den Pellets
ermöglicht wurde,
durch Abkühlen
auf Raumtemperatur zu erhärten.
Die Fucoidanpellets wurden auf das wachsende Kapillarbett der CAM
platziert. Die Eiinhalte wurden dann mit dem Parafilmblatt wieder
versiegelt und zurück
in den 37°C
Inkubator platziert. Nach 2 weiteren Tagen, wurde die Analyse des
CAM Gefäßsystems
aufgezeichnet (48 Stunden nach Platzieren des Wirkstoffs auf das
CAM Kapillarbett). Die Wirkung des Wirkstoffes auf die CAM wurden
mit einem avaskulärem
Maßstab
bewertet, der die Effekte des Wirkstoffes als 0, 1, 2 oder 3 bewertet.
Die Werte des avaskulärem
Maßstabes
beschreiben das folgende:
- 0 Keine antiangiogene Aktivität
- 1 Mikrogefäß-Reduzierung
- 2 Kleine avaskuläre
Zone, in der Größe des Wirkstoffpellets
(2 mm Durchmesser)
- 3 Avaskuläre
Zone in der Größe von 4–5 mm im
Durchmesser.
-
Fucoidan
hemmt potent die Angiogenese in der CAM, wie es in Tabelle 1 gezeigt
wird. Konzentrationen von Fucoidan, so niedrig wie 2% w/w in PCL,
hemmen entweder teilweise oder vollständige die Angiogenese in 4
bzw. 2 CAMs. Tabelle 1: Antiangiogenische Aktivität von Fucoidan.
Die Zahl in jeder Säule
zeigt die Anzahl der Eier an (CAMs), die keine, partielle oder maximale
Inhibierung der Angiogenese zeigen.
| Wirkstoffkonzentration | Antiangiogenische
Aktivität |
| | Keine
(0) | Partielle
(1–2) | Maximale
(3) |
| Fucoidan
2.0% | - | 4 | 2 |
| Fucoidan
5.0% | - | 1 | 4 |
| Fucoidan
15.0% | - | 2 | 3 |
| Fucoidan
30.0% | - | 2 | 1 |
| Kontrolle | 11 | - | - |
-
Diese
Daten demonstrieren eine antiangiogene Aktivität von Fucoidan und zeigen,
das seine Polymerformulierung mit langsamer Freisetzung ein wirksames
Verfahren zum Freisetzen von therapeutisch wirksamen Konzentrationen
des Wirkstoff ohne nicht gewollte Toxizität zu induzieren ist.
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Beispiel 5: Die Einkapselung von Fucoidan
in Ethylenvinylacetatfilme und Polycaprolacton-Paste
-
Fünf mg Fucoidan
(Sigma) und 45 mg Ethylenvinylacetat (EVA, Molekulargewicht ungefähr 50 k,
Polysciences) wurden in 1 ml Dichlormethan gelöst/suspendiert. Zweihundert μl der Lösung wurde
auf 1 cm Diameter Teflonscheiben pipettiert und über Nacht trocknen gelassen
(Lösungmittelverflüchtigung),
um dünne elastische
Filme zu bilden, um ungefähr
10 mg Filme mit einer ungefähren
Dicke von 100 μm
zu ergeben.
-
Die
Geschwindigkeit der Wirkstofffreisezung von diesen Filmen wurde
gemessen, indem 5 mg Abschnitte der Filme in 20 ml geschlossene
Glasröhren
platziert wurden, enthaltend 10 ml Phosphat gepufferte Salzlösung (PBS)
pH 7.4. Die Röhren
wurden verschlossen, und in einen Kreisschüttler bei 37°C platziert.
Zu spezifizierten Zeitpunkten wurden die Röhren entfernt und die Menge
des freigesetzten Wirkstoffes wurde durch Absorptionsspektroskopie
analysiert. Das Freisetzungsprofil von Fucoidan (4)
war gekennzeichnet durch einen anfänglich starken Anstieg der
Wirkstofffreisetzung gefolgt durch eine langsame anhaltende Freisetzung.
Diese Dosierungsform von Fucoidan stellt eine biokompatible, biologisch
abbaubare, injizierbare Formulierung des Wirkstoffes dar, die den
Wirkstoff in einer kontrollierten Weise freisetzt.
-
PCL
Paste: Fucoidan wurde in Polycaprolacton gemischt (PCL, Birmingham
polymer, Molekular gewicht 54K) bei 60°C durch Verreiben mit einem
Spatel bei einer Konzentration von 10% w/w. Diese Mischung wurden
dann in 1 ml Plastikspritzen pipettiert und abkühlen gelassen. Diese Formulierung
könnte
durch eine 18 Gauge Nadel bei 56°C
injiziert werden.
-
Um
die Wirkstofffreisetzung aus der PCL Paste zu messen, wurden 10
mg Aliquots geschmolzener Paste auf den Boden von 15 ml Glassröhren injiziert
und ihr ermöglicht,
sich abzukühlen
und sich abzusetzen. Fünfzehn
ml PBS wurde zu jeder Röhre
hinzu gefügt
und die Röhren
wurden verschlossen, und über
Kopf in einen 37°C
Ofen gedreht. Zu spezifizierten Zeitpunkten wurden die Röhren entfernt
und die Menge des freigesetzten Wirkstoffes wurde durch Absorptionsspektroskopie
analysiert. Das Freisetzungsprofil von Fucoidan wird in 5 gezeigt.
Das Freisetzungsprofil von Fucoidan war gekennzeichnet durch einen
anfänglich
starken Anstieg der Wirkstofffreisetzung gefolgt durch eine langsame
anhaltende Freisetzung. Diese Dosierungsform von Fucoidan stellt
eine biokompatible, biologisch abbaubare, injizierbare Formulierung
des Wirkstoffes dar, die den Wirkstoff in einer kontrollierten Weise
freisetzt.
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Beispiel 6: Fucoidan beladene Membranen
zur Behandlung von chirurgischen Adhäsionen in Ratten.
-
Das
Ratten Darmseitenwandmodell chirurgischer Adhäsionen wurde verwendet, um
die Wirkung von Fucoid auf chirurgische Adhäsionen zu untersuchen. In diesem
Modell wurden 16 Ratten in zwei Gruppen von 8 aufgespalten. Nach
Eingriffs-induziertem Trauma wurden die Ratten sofort mit quervernetzten
Hyaluronsäure
(HA) Filmen behandelt, die Fucoidan enthielten oder wurden nicht
behandelt (Kontrollgruppe).
-
Materialien
und Methoden: Natrium-hyaluronat mit medizinischem Reinheitsgrad
wurde von Lifecore Scientific erhalten. Alle Lösungsmittel hatten HPLC Reinheitsgrad
und wurden von Fisher erhalten. Plastik Petrischalen wurden von
Fisher Scientific erhalten. Ethyl-3-(dimethylamino) carbodiimid
(EDAC) und Fucoidan wurden von Sigma (St. Louis. Mo) erhalten.
-
Herstellung
der Filme. Fucoidan geladene Filme wurden hergestellt, in dem eine
Lösung
mit f 0,6% w/v Fucoidan, 0,4% w/v Natrum-hyaluronat und 0,15% w/v
Glyzerin in Wasser zubereitet wurde. Kontrollfilme (keine Fucoidan)
wurden hergestellt indem eine Lösung
oder Mischung aus 0,4% w/v Natrum-hyaluronat und 0,15% w/v Glyzerin
in Wasser zubereitet wurde. Fucoidan geladene Filme und Kontrollfilme
wurden aus diesen Lösungen
gegossen, indem 4 g jeder Lösung
in separate 2,5 cm Durchmesser Plastik Petrischalen pipetiert wurden
und für
24 Stunden bei 60°C
getrocknet wurden. Das quervernetzende Agens EDAC wurde bei 4 mM mit
eingeschlossen (Endkonzentration). Jeder getrocknete Film wurde
dann vorsichtig von den Petrischalen mit einer chirurgischen Klinge
entfernt.
-
Sterilisierung.
Filme wurden zwischen 5 cm × 5
cm Wägepapier
(Fisher scientific) gepackt und in Plastikbeuteln hitzeversiegelt.
Filme wurden dann endsteriliert mit Gammastrahlung aus einer Cobalt-60
Quelle und gegenüber
2,5 Mrad Strahlung exponiert, wobei die versiegelte Röhre auf
Eis gekühlt
wurde.
-
Tierstudien.
Chirurgische Traumata wurden wie folgt induziert 16 erwachsene Sprague
Dawley Ratten, jede 225–350
g wiegend, wurden von den Charles River Laboratories, Wilmington,
MA, erhalten. Nur Tiere, die im Ganzen normal wirkten (d. h. eine
sauberes ordentliches Fell, helle klare Augen und eine aktive Haltung zeigten)
wurden in der Studie verwendet. Die Tiere wurden per Zufall eine
der zwei Gruppen zugewiesen, gewogen und mit einer einzelnen Injektion
Ketaminhydrochlorid (6 mg/kg) betäubt, die in den großen Hüftmuskel verabreicht
wurde. Das Abdomen wurde rasiert und mit Alkohol gereinigt. Ein
4 cm Einschnitt wurzle in die Haut gemacht, der ungefähr 2 cm
caudal der Linea alba begann, während
der Muskel mit Pinzetten gehalten wurde. Der Darm wurden vier mal
auf den ventralen und dorsalen Oberflächen mit einem mechanischem Schabgerät abgeschabt,
das vom Anwender unabhängigen,
kontrollierten Abrieb auf einem definiertem Gebiet ermöglicht.
Adhäsionen
an den Darm wurden evaluiert und gemäß einem vordefinierten Bewertungssystem bewertet.
- 0 = keine Adhäsionen
- 1 = filmartige Adhäsion
mit leicht identifizierbarer Ebene
- 2 = milde Adhäsion
mit frei trennbarer Ebene
- 3 = moderate Adhäsion
mit schwieriger Trennung der Ebene
- 4 = dichte Adhäsion
mit nicht trennbarer Ebene
- (Grad 1 Adhäsionen
sind die niedrigsten Ebenen von erkennbarer Adhäsion (filmartige Adhäsion mit
identifizierbarer Ebene)).
-
Nach
Abschabung des Darms, erhielten Tiere in Gruppe 1 keine Behandlung.
Tiere in Gruppen 2 erhielten die oben diskutierten Fucoidan-HA Filme.
Die Filme wurden um den Darm gewickelt. Die Einschnitte wurden dann
mit 3.0 Dexon Nahtmaterial geschlossen. Sieben Tage nach Operation,
wurde die Tiere euthanisiert und auf das Vorliegen von Grad 2 (oder
höheren)
postoperativen Adhäsionen
evaluiert. Grad 2 Adhäsionen
wurden als milde Adhäsionen
mit einer frei trennbaren Ebene definiert.
-
Ergebnisse:
-
Tabelle 2.
| Gruppe | %
Mit Adhäsionen
= 2 | Mittlere
Inzidenz ± SA | %
Ohne Adhäsionen |
| Kontrolle | 75 | 1.4 ± 0.4 | 25 |
| Fucoidan
geladene Membran | 38 | 0.5 ± 0.2 | 50 |
- • Die Membranen bedeckten nur
die Hälfte
des Darms.
- • Keine
Abnormalitäten
nach der Untersuchung der toten Tiere bemerkt (keine Materialreste,
keine Ascites, keine Anzeichen von abnormaler Heilung, weder auf
dem Darm noch auf dem mittleren Einschnitt)
-
Die
Ergebnisse demonstrieren die wirksame Hemmung der Adhäsionsbildung
durch Fucoidan geladene Filme, da die mittlere Inzidenz der Adhäsionen vermindert
war und der %-Wert der Ratten ohne Adhäsionen in Fucoidan behandelten
Ratten erhöht
war. Fucoidan geladene Filme, die den Darm vollständig bedecken, können vielleicht
noch wirksamer beim Hemmen von Adhäsionsbildung sein.