DE60225593T2

DE60225593T2 - Immobilisierung von bindungsstoffen

Info

Publication number: DE60225593T2
Application number: DE60225593T
Authority: DE
Inventors: Stefan LÖFAS; Hans SJÖBOM
Original assignee: GE Healthcare Bio Sciences AB
Current assignee: Cytiva Sweden AB
Priority date: 2001-12-21
Filing date: 2002-12-13
Publication date: 2009-04-16
Anticipated expiration: 2022-12-14
Also published as: JP2005513503A; ATE389177T1; EP1456659B1; US20060223113A1; AU2002359130A1; DE60225593D1; EP1456659A1; WO2003056337A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine räumlich adressierbare Immobilisierung von Bindemitteln an die Oberfläche eines Trägers und im Besonderen auf ein Verfahren zum Herstellen eines Arrays durch räumlich immobilisierende Bindemittel in bestimmten Bereichen auf der Oberfläche eines Trägers, ein in dem Verfahren hergestelltes Array, die Verwendung des hergestellten Arrays, einen das Array umfassenden Biosensor und eine Oberfläche eines aktivierten festen Trägers, an welche die Bindemittel gekoppelt werden können.
Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik
Das Array-Verfahren, das Arrays von Bindemitteln, zum Beispiel Liganden wie z. B. Oligonukleotide und Peptide, auf festen Trägern bereitstellt, hat speziell in den Bereichen der Biotechnologie und Pharmazeutik als Hilfsmittel zum Durchführen von wiederholten Untersuchungen und Screenings von Analyten, einschließlich Genexpressionsanalyse, Medikamentenscreening, Nukleinsäuresequenzierung, Mutationsanalyse und Ähnlichem an Bedeutung gewonnen.
Zu den bisher zum Abgeben oder „Punktieren" der Bindemittel an getrennten Positionen auf dem Array verwendeten Verfahren zählen piezoelektrisches Mikropipettieren („Tintenstrahlen"), Mikrokontaktdrucken, Kapillarstempeln, elektrisches Adressieren und trägheitsgetriebene Injektion von Mikrotropfen. Ein allgemeiner Überblick über die sogenannten Mikroarray-Verfahren ist zum Beispiel in Tibtech 1996, 14: 401–407 und Tibtech 1996, 16: 301–306 zu finden.
Ein wichtiger Schritt in der Herstellung von Mikroarrays ist die Immobilisierung von Bindemitteln an die Oberfläche des Trägers. Es ist eine große Vielzahl an Verfahren zum Anbringen von Biomolekülen an festen Trägern bekannt, einschließlich kovalentem Binden an die Oberfläche des Trägers und nicht-kovalente Interaktion der Biomoleküle mit der Oberfläche.
Allgemeine Beschreibungen der Bindeverfahren sind zum Beispiel zu finden in Affinity Techniques. Enzyme Purification: Part B. Methods in Enzymology, Vol. 34 (Affinitätsverfahren. Enzymreinigung: Teil B. Verfahren in der Enzymologie, Bd 34), ed. W. B. Jacoby, M. Wilchek, Acad. Press, N.Y. (1974) und Immobilized Biochemicals and Affinity Chromatography, Advances in Experimental Medicine and Biology, vol. 42 (Immobilisierte Biochemikalien und Affinitätschromatographie, Vorteile in der experimentellen Medizin und Biologie, Bd. 42), ed. R. Dunlop, Plenum Press, N.Y. (1974). Beispielhafte Bindeverfahren sind auch in den nachstehenden Veröffentlichungen offenbart.
US-A-4,681,870 beschreibt ein Verfahren zum Einarbeiten freier Amin- oder Carboxylgruppen in eine Siliziummatrix. Diese Gruppen können dann bei Vorhandensein eines Carbodiimids kovalent mit z. B. einem Protein oder anderem Liganden verbunden werden. Alternativ kann durch die Behandlung mit Cyan-Halogenid unter alkalischen Bedingungen eine Siliziummatrix aktiviert werden. Der Ligand wird bei Anlagerung an die aktivierte Oberfläche kovalent an die Oberfläche angebracht.
US-A-4,282,287 beschreibt ein Verfahren zum Modifizieren der Oberfläche eines Polymers durch sukzessive Anwendung mehrerer Schichten aus Biotin, Avidin und Extendern.
US-A-4,762,881 beschreibt ein Verfahren zum Anbringen eines Polypeptids an ein festes Substrat, indem eine lichtempfindliche unnatürliche Aminosäurengruppe in die Polypeptidkette integriert und das Produkte einem energiearmen ultravioletten Licht ausgesetzt wird.
Die Modifikation von Oberflächeneigenschaften hinsichtlich hydrophiler und hydrophober Eigenschaften in der Herstellung von Mikroarrays wurde ebenfalls im Stand der Technik beschrieben.
Zum Beispiel offenbart WO 98/42730 die Herstellung einer Trägeroberfläche, die in einem ersten Zustand hydrophil und in einem zweiten Zustand hydrophob ist, so dass das Substrat sowohl in wässrigen als auch organischen Medien verwendet werden kann. Die Oberfläche des Substrats enthält eine Mehrzahl hydrophiler Stellen, die leicht geschützt und nicht geschützt werden können. Durch Schützen eines Teils der Stellen wird die Oberfläche in einer hydrophoben Form bereitgestellt, so dass die ungeschützten Stellen an organischen Synthesevorgängen teilnehmen können, die unter Verwendung organischer Reagenten und Lösungsmittel durchgeführt werden. Im Anschluss an die Synthese werden die geschützten hydrophilen Stellen nicht mehr geschützt und regenerieren die Substratoberfläche in hydrophiler Form zur Verwendung mit wässrigen Reagenten, z. B. in Screenings und/oder Trennungsverfahren, die in wässrigen Medien durchgeführt werden.
US-A-6,127,129 offenbart ein Verfahren zum Herstellen eines Biomoleküls oder Zellarrays auf einem Metallsubstrat. Eine ωroodised Alkanethiol-Monolager wird auf dem Metallsubstrat aufgebracht, um eine hydrophile Oberfläche zu bilden. Die Monolager wird dann mit hydrophoben Schutzgruppen umgesetzt und die Oberfläche strukturiert, um ein Array aus freiliegenden Metalloberflächen zu bilden. Die nachfolgende Ablagerung von ω-modifiziertem Alkanethiol in den Flächen der freiliegenden Metallsubstrate erzielt einen Array aus getrennten hydrophilen Punkten von ungeschütztem ω-modifizierten Alkanethiol, an dem Biomoleküle oder Zellen angebracht werden. Die Schutzgruppen werden anschließend von dem hydrophoben Hintergrund entfernt, der die getrennten Punkte mit immobilisierten Biomolekülen oder Zellen umgibt, und die Monolager wird gegenüber unspezifischem Proteinbinden resistent gemacht, indem z. B. PEG-Anteile daran angebracht werden.
EP-A-895 082 offenbart ein Verfahren zum Punktieren von Sonden auf einen festen Träger, der reagierende Maleimidgruppen auf der Trägeroberfläche umfasst, mit zugegebenen Thiolgruppen enthaltenden Nukleinsäuresonden, durch ein Tintenstrahlverfahren. Ein alternatives Bindungspaar sind Epoxygruppen auf der Oberfläche und Amingruppen auf den Nukleinsäuresonden. Die unspezifische Bindung an die Oberfläche wird verhindert, indem nicht umgesetzte Maleimidgruppen durch BSA-Lösung oder durch Spaltung blockiert werden. Eine Epoxygruppen enthaltende Oberfläche kann hydrophil gestaltet werden, indem nicht umgesetzte Epoxyringe mit Ethanolamin geöffnet werden, um im Anschluss an die Bindung der Nukleinsäuresonden Hydroxygruppen zu bilden.
WO 98/55593 offenbart die Strukturierung eines festen Trägers mit synthetischen Nukleinsäuremolekülen unter Verwendung von zum Beispiel einem Tintenstrahldrucklieferungsverfahren. Die Oberfläche des Trägers wird silanisiert, was eine stark hydrophobe Oberfläche bereitstellt, die es erlaubt, dass sich Oligonukleotidsondentropfen an spezifischen und lokalisierten Positionen an der Oberfläche des festen Trägers bilden, ohne Kreuzkontamination zwischen den Sonden, selbst bei einer hohen Sondendichte.
WO 98/39481 offenbart Verfahren zur kovalenten, spezifischen Immobilisierung von Nukleinsäuremolekülen an eine feste mercaptosilanisierte hydrophobe Oberfläche durch eine reversible Schwefelkohlenstoffbindung, gebildet durch Kopplung eines mit Sulfhydryl oder mit Schwefelkohlenstoff modifizierten Nukleinsäuremoleküls mit den Sulfhydrylgruppen der Mercaptosilane. Es kann eine hohe Sondendichte ohne Kreuzkontamination erreicht werden.
US-A-6,066,448 offenbart Verfahren zum Erzeugen von strukturierten Multi-Array-, multispezifischen Oberflächen. Die Bindungsbereiche auf der Multi-Array-Oberfläche können hydrophob oder hydrophil sein und die umgebende Fläche kann die entgegengesetzte Eigenschaft (hydrophil oder hydrophob) zu der der Bindungsbereiche aufweisen. Die Verwendung einer solchen hydrophilen/hydrophoben Grenze hilft beim Abgrenzen des erzeugten Bindungsbereiches zu einer getrennten Fläche an der Oberfläche. Die hydrophoben und hydrophilen Bindungsbereiche können durch Mikrokontaktdrucken erzeugt werden.
US-A-5,474,796 offenbart die Herstellung von Arrayplatten durch Beschichten einer Glasplatte mit einer lichtresistenten Substanz, Aussetzen gegenüber Licht, um eine gemusterte Oberfläche von freiliegenden und lichtresistent-beschichteten Flächen zu erhalten, Umsetzen der freigelegten Flächen mit einem hydrophoben Reagens, Entfernen des lichtresistenten Mittels und Umwandeln der freigelegten Flächen in hydrophile Bindungsbereiche. Alternativ beginnt eine Herstellung bei einer derivatisierten hydrophilen Oberfläche, um die hydrophilen Bindungsbereiche in dem letzten Schritt unmittelbar zu erhalten.
US-A-5,985,551 offenbart die Herstellung einer Arrayplatte, die eine Trägeroberfläche mit einer kovalent verbunden Schicht aus Inertsiloxan umfasst und ein Array von 10 zu 10⁴ Stellen pro cm² definiert, die nicht die kovalent verbundene Schicht aufweisen. Chemische Reaktionslösungen werden über die Oberflächenspannung an den Stellen lokalisiert, die bei ungefähr 50–2000 Mikrometer Durchmesser liegen.
US-A-6,171,797 offenbart ein Verfahren zum Herstellen eines Arrays aus individuellen Polymeren, die kovalent an die Oberfläche eines festen Trägers gebunden sind. Mindestens zwei individuelle Polymere, z. B. Nukleinsäuren, werden durch eine cycloadditionsreaktive Gruppe auf der Oberfläche, die fähig ist, mit einer Gruppe zu reagieren, die an den Polymeren vorhanden ist, in einer Cycloadditionsreaktion kovalent an die Oberfläche des Trägers gebunden, um eine kovalente Bindung zwischen dem Polymer und der Oberfläche des Trägers herzustellen.
In vielen Ausführungsformen ist der Kontaktwinkel der cycloadditionsreaktiven Gruppe ausreichend, um für eine extrem niedrige Tropfenverteilung von auf der Oberfläche des Trägers befindlicher Flüssigkeit zu sorgen.
WO 01/94946 offenbart die Herstellung von Arrays aus proteinbindenden Mitteln. In einer Ausführungsform wird ein Objektträger, der eine goldene Oberfläche aufweist, mit einer Aminothiol-Schicht beschichtet, die anschließend mit einer Gruppe funktionalisiert wird, die an eine funktionelle Ankergruppe, z. B. eine Thiolfunktion, eines proteinbindenden Mittels binden wird. Nach der Aufbringung des/der proteinbindenden Mittel(s) an die im Allgemeinen hydrophile funktionelle Oberfläche können nicht umgesetzte Maleimide auf der Oberfläche chemisch blockiert werden, z. B. durch ein hydrophiles Thiol, um die Grundlage unspezifischer Proteinbindungen zu minimieren. Die Oberfläche kann ebenfalls mithilfe von Proteinen, wie z. B. Human Serum Albumin (HSA), blockiert werden.
US 5,624,711 offenbart die Herstellung von Trägern für eine Festphasensynthese von Oligomerarrays aus einzelnen Verbindungen. Ein Glasträger oder anderer Trä ger wird mit einem Aminalkylsilan derivatisiert, um eine Oberfläche mit aminfunktionellen Gruppen bereitzustellen. Diese Oberfläche wird dann mit einem Gemisch aus Verbindungsmolekülen (z. B. Nitroveratryloxycarbonyl-Amincapronsäure) und Verdünnungsmolekülen (z. B. geschützte Aminosäuren) behandelt, um eine Oberfläche mit Initiationsstellen mit einer vorher ausgewählten Dichte bereitzustellen. Die Verbindungsmoleküle tragen zur hydrophoben oder hydrophilen Nettonatur der Oberfläche bei und können ausgewählt werden, um die Darstellung des darauf mit bestimmten Rezeptoren, Proteinen oder Arzneimitteln synthetisierten Polymers zu verbessern. Die Verdünnungsmoleküle können auch ausgewählt werden, um die hydrophoben oder hydrophilen Eigenschaften an die Oberfläche des Trägers weiterzugeben. Zum Beispiel stellt o-t-Butylserin als ein Verdünnungsmolekül eine hydrophobe Oberfläche während der Polymersynthese bereit, aber bei der Behandlung mit Säure stellt Ätherspaltung eine hydrophilere Oberfläche für Untersuchungen bereit.
US 6,329,209 offenbart Arrays aus verschiedenen Proteinfangmitteln, die an getrennten Flächen immobilisiert sind, z. B. mit einem dünnen organischen Film bedecktes Gold. Die Oberflächen oder Grenzbereiche zwischen den Flächen der Proteinfangmittel können mit einem anderen dünnen organischen Film mit geringen unspezifischen Bindungseigenschaften für Proteine und anderen Analyten bedeckt sein, z. B. einer Monolager aus hydrophilen Ketten, die an eine geordnete hydrophobe Monolager aus Alkylketten angebracht ist.
Zako, Tamotsu, et al., J. Biochem. 129, 1–4 (2001) offenbart die Immobilisierung eines Proteins (Glühwürmchenluziferase) an einen mit Carboxymethyldextran beschichteten Oberflächenplasmonresonanz(SPR)-Sensorchip durch eine aminbasierte Kopplungschemie. N-Ethyl-N'-(3-Diethylaminopropyl)-Carbodiimid (EDC) und N-Hydroxysuccinimid (NHS) werden verwendet, um die Oberfläche zu aktivieren und das Protein wird anschließend mit dem Sensorchip kontaktiert, um das Protein kovalent an die Oberfläche zu koppeln. Überschüssige NHS-Estergruppen werden durch Ethanolamin blockiert.
Im Allgemeinen sind jedoch die Verfahren aus dem Stand der Technik zum Anbringen von Bindungsmitteln an Oberflächen in mehrerer Hinsicht unbefriedigend. Die Mängel umfassen geringe Reaktionseffizienzen und eine allgemeine Unfähigkeit, das regionale und selektive Anbringen einer Mehrzahl von Bindungsmitteln an die Oberfläche zuzulassen. Auch hohe unspezifische Bindungen von Analyten an die Oberfläche werden beim Ausführen von Scrreenings und Untersuchungen mithilfe von Liganden tragenden Oberflächen, die gemäß den Verfahren aus dem Stand der Technik hergestellt wurden, oft beobachtet. Daher besteht Bedarf nach einem effizienter und einfacher auszuführenden Verfahren der Immobilisierung von Bindemitteln in der Herstellung von Arrays. Solch ein Verfahren sollte ein stabiles Anbringen ausgewählter Bindemittel an vordefinierte Oberflächenbereiche bereitstellen, jedoch sollte die Anbringung strikt auf vordefinierte Bereiche beschränkt werden. Ebenfalls sollten beim Durchführen von Untersuchungen und Screenings mithilfe der hergestellten Oberflächen unspezifische Bindungen von Analyten an die Oberflächen gering oder vernachlässigbar sein. Die vorstehenden Bedürfnisse werden durch die vorliegende Erfindung erfüllt, die weitere ähnliche Vorteile liefert.
Zusammenfassung der Erfindung
In Kürze bezieht sich die vorliegende Erfindung auf das Herstellen von Arrays aus Bindemitteln und basiert auf dem Konzept der Anwendung der Aktivierung funktioneller Gruppen zu reaktiven (oder reaktiveren) Gruppen, um dadurch die hydrophilen Eigenschaften der Oberfläche eines festen Trägers temporär zu verändern, die eine funktionelle Gruppe trägt. Nach dem Kontaktieren der vordefinierten Bereiche oder Punkte auf der Oberfläche mit flüssigem Medium, das ein Bindemittel zur Bildung des Arrays aus immobilisierten Bindemitteln enthält, stellt die Deaktivierung der Oberfläche den hydrophilen Ausgangszustand der Oberfläche wieder her. Solch eine temporäre Veränderung der Oberflächeneigenschaften kann auf verschiedene Weise verwendet werden, um die Bildung eines gewünschten Arrays zu verbessern.
Das temporäre Verändern eines im Allgemeinen hydrophilen Oberflächenbereichs eines Trägers in den hydrophoben Zustand durch Aktivieren funktioneller Gruppen auf dem hydrophilen Oberflächenbereich (mindestens an vordefinierten Bereichen oder Punkten davon) zu reaktiven Gruppen, die hydrophob sind, und das anschließende Kontaktieren des Oberflächenbereichs an den vordefinierten Bereichen oder Punkten mit einer oder mehreren wässrigen Flüssigkeiten, die an die Oberfläche zu immobilisierende Bindemittel enthalten, können die Ausbreitung oder die Ausdehnung von Flüssigkeit auf der Oberfläche reduzieren und die Immobilisierung des Bindemittels kann effektiv auf die vordefinierten Bereiche beschränkt werden. Nach der Umwandlung oder Deaktivierung beliebiger nicht umgesetzter reaktiver Gruppen zu hydrophileren Gruppen wird die ursprüngliche im Allgemeinen hydrophile Eigenschaft der Oberfläche wiederhergestellt und das unspezifische Binden an die Oberfläche wird minimiert, wenn die Oberfläche anschließend für die Analyse verwendet wird.
Deshalb stellt die vorliegende Erfindung in einem Aspekt ein Verfahren zum Herstellen eines Arrays aus getrennten lokalisierten Bindemittel tragenden Bereichen auf der Oberfläche eines festen Trägers bereit, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(i) Bereitstellen eines festen Trägers mit einer Oberfläche, die an mindestens einer Mehrzahl vordefinierter getrennter Bereiche darauf funktionelle Gruppen trägt, wobei die Oberfläche in einem ersten Oberflächeneigenschaftszustand hydrophil ist,
(ii) Umsetzen der funktionellen Gruppen an mindestens den vordefinierten getrennten Bereichen der Oberfläche des festen Trägers mit einem Aktivierungsmittel, das ausgewählt wurde, um die funktionellen Gruppen zu aktivieren, um reaktive Gruppen einer derartigen Polarität zu bilden, dass eine beliebige aktivierte Oberfläche in einem zweiten Zustand, der hydrophob ist, mit einem Kontaktwinkel mit Wasser von mindestens 40° bereitgestellt wird,
(iii) selektiv Abgeben eines vorbestimmten Volumens eines wässrigen flüssigen, ein Bindungsmittel enthaltenden Mediums an jedem vordefinierten getrennten Bereich auf der Oberfläche des festen Trägers, um das Bindungsmittel an die reaktiven Gruppen zu binden, wobei der zweite hydrophobe Zustand im Wesentlichen das Verteilen des wässrigen flüssigen Mediums reduziert, wenn es auf der Oberfläche aufgebracht wird, und
(iv) Deaktivieren nicht umgesetzter reaktiver Gruppen auf der Oberfläche des festen Trägers so, dass der erste hydrophile Zustand der Oberfläche des festen Trägers wiederhergestellt wird.

In einer Ausführungsform wird im Wesentlichen die gesamte, funktionelle Gruppen tragende Festphasenoberfläche Aktivierungszuständen unterzogen. In einer anderen Ausführungsform wird die Aktivierung der funktionellen Gruppen auf die vordefinierten getrennten Bereiche auf der Oberfläche des Trägers beschränkt.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Array aus einem oder mehr Bindemitteln bereit, die in dem Verfahren gemäß dem ersten Aspekt hergestellt wurden.
Andere Aspekte der vorliegenden Erfindung stellen die Verwendung eines Arrays bereit, das in dem Verfahren gemäß dem ersten Aspekt hergestellt wurde, um molekulare Interaktionen zu untersuchen und eine Untersuchung für einen bzw. mehrere Analyte durchzuführen.
Ein noch anderer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf einen Biosensor, der ein Array umfasst, das in dem Verfahren gemäß dem ersten Aspekt hergestellt wurde.
Ein wieder anderer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf eine aktivierte Oberfläche eines festen Trägers, an die Bindemittel gekoppelt werden können.
Definitionen
In der Beschreibung und den Ansprüchen der vorliegenden Erfindung wird die nachstehende Terminologie in Übereinstimmung mit den nachstehend dargestellten Definitionen verwendet.
"Array" bezieht sich, wie hierin verwendet, im Allgemeinen auf ein lineares oder zweidimensionales Array aus getrennten Bereichen, wobei jeder einen begrenzten Bereich aufweist, die auf einer durchgehenden Oberfläche eines festen Trägers gebildet sind und ein oder mehrere Bindemittel tragen. Geordnete Arrays aus Nukleinsäuren, Proteinen, kleinen Molekülen, Zellen oder anderen Substanzen auf einem festen Träger ermöglichen eine parallele Analyse komplexer biochemischer Sonden. In einem „Mikroarray" beträgt die Dichte der getrennten Bereiche oder Punkte typischerweise mindestens 100/cm² und die getrennten Bereiche weisen typischerweise einen Durchmesser in Bereich von ungefähr 10–1000, normalerweise ungefähr 10–500 auf und sind von anderen Bereichen in dem Array um ungefähr denselben Abstand getrennt.
„Vordefinierter Bereich" bezieht sich, wie hierin verwendet, auf einen lokalisierten Bereich auf der Oberfläche eines festen Trägers. Der vordefinierte Bereich kann jede gewünschte Form aufweisen, wie z. B. kreisförmig, rechtwinklig, elliptisch etc. und wird nachstehend oft als „Punkt" bezeichnet.
„Fester Träger" soll, wie hierin verwendet, ein beliebiges festes (flexibles oder starres) Substrat umfassen, auf dem ein Array aus einem oder mehreren Bindemitteln aufgebracht werden soll. Das Substrat kann biologisch, nicht biologisch, organisch, anorganisch oder eine Kombination davon sein und in Form von Teilchen, Strängen, Ausfällungen, Gelen, Platten, Röhren, Kugeln, Behältern, Kapillargefäßen, Pads, Scheiben, Filmen, Platten, Trägern etc. mit jeder geeigneten Form vorliegen, einschließlich Scheibe, Kugel, Kreis etc. Die das Array tragende Substratoberfläche kann jede zweidimensionale Konfiguration aufweisen und zum Beispiel Stufen, Kanten, Knicke, Absätze und Ähnliches enthalten und kann die Oberfläche einer Materialschicht sein, die anders ist als der Rest des Substrats.
„Funktionelle Gruppe" meint, wie hierin verwendet, eine reaktive chemische Entität, die dazu dient, ein Bindemittel mit der Oberfläche zu verbinden. Normalerweise müssen funktionelle Gruppen aktiviert werden, um ein Bindemittel zu immobilisieren. Die funktionellen Gruppen können von Natur aus in dem Material vorhanden sein, das für den festen Träger verwendet wird, oder durch Behandeln oder Beschichten des Trägers mit einem geeigneten Material bereitgestellt werden. Die funktionelle Gruppe kann ebenfalls durch Umsetzen der Oberfläche des festen Trägers mit einem geeigneten chemischen Mittel eingeführt werden.
„Aktivierung", wie hierin verwendet, meint eine Modifikation einer funktionellen Gruppe an der Oberfläche des festen Trägers, um ein Koppeln eines Bindemittels an die Oberfläche zu ermöglichen.
„Bindemittel", wie hierin verwendet, meint ein beliebiges Mittel, das Teil eines spezifischen Bindungspaares ist, einschließlich zum Beispiel Polypetiden, wie z. B. Proteine oder Fragmente davon, Nukleinsäuren, z. B. Oligonukleotide, Polynukleotide und Ähnliches etc. Oft ist das Bindemittel ein Ligand.
„Ligand", wie hierin verwendet, meint ein Molekül, das eine bekannte oder unbekannte Affinität zu einem gegebenen Analyten aufweist und an einen vordefinierten Bereich der Oberfläche immobilisiert werden kann. Der Ligand kann ein natürlich auftretendes Molekül oder ein künstlich hergestelltes Molekül sein. Der Ligand kann per se oder als Aggregat mit anderen Arten verwendet werden. Optional kann der Ligand auch eine Zelle sein.
Ein „Analyt", wie hierin verwendet, ist ein Molekül, typischerweise ein Makromolekül, wie z. B. ein Polynukleotid oder Polypeptid, dessen Vorhandensein, Menge und/oder Identität zu bestimmen sind. Der Analyt wird von einem speziellen Liganden erkannt, der ein Analyt-/Ligand-Paar bildet. Optional kann der Ligand auch eine Zelle sein.
„Oberflächeneigenschaft", wie hierin verwendet, bezieht sich auf die hydrophile oder hydrophobe Eigenschaft einer Oberfläche.
„Hydrophob", wie hierin verwendet, kann definiert werden als wasserabweisend, während „hydrophil" als wasseranziehend definiert werden kann. Im Hinblick auf eine Oberfläche können die Begriffe hydrophob und hydrophil durch den Kontaktwinkel für einen Tropfen einer Flüssigkeit auf einer ebenen festen Oberfläche definiert werden, wobei der Kontaktwinkel von der Ebene der Oberfläche gemessen wird, welche die Oberfläche an der Dreiphasengrenzlinie berührt. Eine hydrophile Flüssigkeit wird daher auf einer hydrophilen Oberfläche einen geringen Kontaktwinkel aufweisen, während eine hydrophobe Flüssigkeit einen hohen Kontaktwinkel aufweisen wird. Zum Beispiel weisen hydrophobe Oberflächen typischerweise Kontaktwinkel mit Wasser im Bereich von 40 bis 110° auf, während die Kontaktwinkel mit Wasser für hydrophile Oberflächen typischerweise im Bereich von 1 bis 25° liegen. Somit ist die Oberfläche eines Trägers hydrophob, wenn sich ein auf die Oberfläche aufgebrachter Tropfen eines wässrigen Mediums im Wesentlichen nicht über die Flächengröße des aufgebrachten Tropfens verteilt, wobei die Oberfläche agiert, um das Verteilen des auf die Oberfläche aufgebrachten Tropfens durch hydrophobe Interaktion mit dem Tropfen zu verhindern.
„Polarität" bezieht sich, wie hierin verwendet, auf die polaren/nicht polaren Eigenschaften einer chemischen Gruppe. „Polar" und „nicht polar" ähneln den Begriffen hydrophil und hydrophob. Eine polare Gruppe ist hydrophil und eine nicht polare Gruppe ist hydrophob. Eine Hydroxygruppe ist ein Beispiel für eine polare Gruppe und eine Alkylgruppe ist ein Beispiel für eine nicht polare Gruppe. Wenn es zum Beispiel heißt, dass eine Gruppe wenig polar ist, beinhaltet das natürlich auch, dass die Gruppe nicht polar sein kann und umgekehrt.
Der Begriff „wässriges flüssiges Medium", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein flüssiges Medium, das weniger als 50 Vol.-% organisches Lösungmittel, noch bevorzugter weniger als ungefähr 10 Vol.-% organisches Lösungsmittel und am bevorzugtesten ungefähr 0 Vol.-% organisches Lösungsmittel enthält.
Die Begriffe „nicht wässriges flüssiges Medium" und „organisches flüssiges Medium", wie hierin verwendet, beziehen sich auf ein flüssiges Medium, das weniger als 50 Vol.-% Wasser, noch bevorzugter weniger als ungefähr 10 Vol.-% Wasser und am bevorzugtesten ungefähr 0 Vol.-% Wasser enthält.
In der Beschreibung und den angefügten Ansprüchen sollen die Singularformen „ein", „einer" und „der" auch die Pluralform einschließen, sofern nicht anders angegeben. Sofern nicht anders angegeben, haben die hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe außerdem dieselbe Bedeutung, die Fachleute aus dem Gebiet der Erfindung allgemein verstehen werden.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Wie vorstehend erwähnt, bezieht sich die vorliegende Erfindung auf das Koppeln von Bindemitteln, wie z. B. Liganden, an funktionelle Gruppen an der Oberfläche eines festen Träges an vordefinierten Bereichen oder Punkten davon, um ein Array der Bindungsmittel an der Oberfläche herzustellen. Normalerweise wird gewünscht, dass die Arrayoberfläche eine allgemein hydrophile Eigenschaft aufweist, um beim Verwenden der Arrayoberfläche in Untersuchungen das unspezifische Binden biomolekularer Analyte daran zu verhindern. Andererseits wird gewünscht, dass mindestens die vordefinierten Bereiche auf der Arrayoberfläche eine im Wesentlichen weniger hydrophile Eigenschaft aufweisen als der Rest der Arrayoberfläche und vorzugsweise eine im Allgemeinen hydrophobe Eigenschaft, um ein großflächiges Verteilen der Tropfen der die Bindemittel enthaltenden wässrigen Flüssigkeit beim Kontaktieren der Oberfläche damit zu verhindern, um die Bindemittel an die Oberfläche zu binden.
Die Erfindung nutzt vorteilhafterweise die Aktivierung der funktionellen Gruppen mit ausgewählten Aktivierungsmitteln zu reaktiven Gruppen, um eine hydrophobe Oberfläche bereitzustellen, die mit den die Bindemittel enthaltenden Flüssigkeitstropfen kontaktiert werden soll. Auf diese Weise kann eine hydrophile Oberfläche temporär hydrophob gestaltet werden und dadurch die beiden vorstehenden Bedürfnisse befriedigen, d. h. eine hydrophobe Eigenschaft für das Koppeln der Bindemittel darstellen, um das Verteilen der Bindemittel auf der Oberfläche im Wesentlichen zu reduzieren oder zu eliminieren, und im Anschluss an das Koppeln die gewünschte hydrophile Eigenschaft der ungekoppelten Bereiche bereitzustellen, um die unspezifische Bindung zu reduzieren oder zu eliminieren. Aufgrund der geringen Verteilung auf den aktivierten Oberflächenbereichen können die Bindemittel tragenden Bereiche begrenzt und gut definiert werden und, falls gewünscht, eine hohe Dichte an Bindemittelbereichen oder Punkten zulassen, trotz der Verwendung von wasserbasierter Bindemittel enthaltender Flüssigkeit.
In einer Verfahrensausführungsform der Erfindung werden die funktionellen Gruppen auf der Oberfläche durch selektive Aktivierung der funktionellen Gruppen an vordefinierten Punkten auf der Oberfläche zu reaktiven Gruppen umgewandelt. Die aktivierten reaktiven Gruppen werden dann verwendet, um die Bindemittel, z. B. Liganden, durch Abgeben einer vorbestimmten Bindemittel enthaltenden Flüssigkeitsmenge an jedem Punkt, an den vordefinierten Punkten zu immobilisieren. Der Vorgang kann an verschiedenen Stellen auf der Oberfläche wiederholt werden, um eine Oberfläche bereitzustellen, die mit einer Mehrzahl an Punkten auf der Oberfläche hergestellt ist, die dieselben oder verschiedene Bindemittel enthält. Wenn die Bindemittel Liganden mit einer speziellen Affinität zu einem oder mehreren Analyten sind, können Screenings und Untersuchungen in den Bereichen der Oberfläche durchgeführt werden, die Liganden enthält, wie später beschrieben wird. In einigen Ausführungsformen dient ein an die Oberfläche des festen Trägers gebundenes erstes Bindemittel als Einfänger für ein zweites Bindemittel, das ein Ligand sein kann. Nach der Herstellung des Arrays kann die Oberfläche getrocknet und, wenn gewünscht, für die anschließende Verwendung gespeichert werden.
In einer alternativen Verfahrensausführungsform werden die funktionellen Gruppen eher auf der gesamten Oberfläche als nur an den vordefinierten Punkten aktiviert und die Bindemittel werden anschließend selektiv an die vordefinierten Punkte gebunden.
Das selektive Abgeben der vorbestimmten Flüssigkeitsmenge an die vordefinierten Punkte kann vorzugsweise durch eine Aufbringungsvorrichtung, wie später beschrieben wird, durchgeführt werden.
Die Verwendung der Aktivierung gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht somit das (vorzugsweise kovalente) Koppeln der Bindemittel und stellt gleichzeitig die gewünschten temporären Oberflächeneigenschaften für die Immobilisierungsbereiche oder Punkte bereit, d. h. eine hydrophile Oberfläche hydrophob gestalten, um zu verhindern, dass sich die wässrigen Lösungen aus Bindemitteln beim Kontaktieren mit den aktivierten Bereichen verteilen. Das wiederum hilft dabei, die Immobilisierung von Bindenmitteln an die vordefinierten Bereiche zu konzentrieren und zu beschränken. Eine beispielhafte schematische Darstellung des Verfahrens der Erfindung ist nachstehend gegeben.
Die Aktivierung (A) funktioneller Gruppen (F) an einer Oberfläche (S) eines festen Substrats kann im Allgemeinen durch die folgende Gleichung dargestellt werden: S – F + A → S – F – A
Vordefinierte Bereiche oder Punkte (Si) auf der Oberfläche können zur endgültigen Immobilisierung von Liganden an die vordefinierten Bereiche aktiviert werden durch selektives Abgeben (Aufbringen) eines Aktivierungsgemisches an die vordefinierten Bereiche, um die funktionellen Gruppen in aktivierte Gruppen umzuwandeln. Der Vorgang wird dargestellt durch die Gleichung: Si – F + A → Si – F – A
Die Immobilisierung eines Liganden (L₁) an einen vordefinierten Bereich der Oberfläche wird dargestellt durch die Gleichung: Si – F – A + Lj → Sj – F – Lj
Die Immobilisierung eines anderen Liganden (Lj) an einen anderen Bereich (Sj) der Oberfäche kann dargestellt werden durch die Gleichung: Sj – F – A + Lj → Sj – F – Lj
Die Wiederholung der vorstehenden Schritte an verschiedenen Bereichen der Oberfläche wird eine Matrix aus an die Substratoberfläche immobilisierte Liganden erzeugen. Solch eine Matrix kann ein gewünschtes Ligandenmuster aufweisen.
Ein an eine Oberfläche immobilisierter Ligand wird eine spezifische Bindungsaffinität zu einem besonderen Analyten (An) aufweisen. Ein Beispiel für eine direkte Untersuchung an einem vordefinierten Bereich der Oberfläche zum Vorhandensein des Analyten (An') in einem flüssigen Medium wird dargestellt durch die Gleichung: Sj – F – Lj + An' → Sj – F – Lj – An'
Die ursprüngliche hydrophile Eigenschaft der die funktionelle Gruppe tragenden Substratoberfläche kann durch (i) nur die funktionelle Gruppe, (ii) sowohl die funktionelle Gruppe als auch das Substratoberflächenmaterial oder (iii) nur das Substratoberflächenmaterial bereitgestellt werden. Im ersten Fall (i) sollte die funktionel le Gruppe relativ hydrophil sein, wohingegen in Fall (ii) die funktionelle Gruppe auch eine moderate oder geringe hydrophile Eigenschaft aufweisen kann. Im Fall (iii) kann die funktionelle Gruppe sogar leicht hydrophob sein, solange das Substratoberflächenmaterial eine ausreichende hydrophile Eigenschaft aufweist, um die Oberfläche im Allgemeinen hydrophil zu gestalten.
Eine große Vielzahl aktivierbarer funktioneller Gruppen, die Fachleuten gut bekannt sind, kann in der Erfindung verwendet werden. Beispiele für solche hydrophilen Gruppen sind Hydroxy-, Carboxy-, Carbonyl-, Formyl-, Amino- und Mercaptogruppen, um nur einige zu nennen.
Verfahren zum Aktivieren der funktionellen Gruppen werden Fachleuten leicht deutlich und können aus einer großen Vielzahl an Verfahren ausgewählt werden.
Das Aktivierungsmittel wird ausgewählt, um eine aktivierte Oberfläche oder aktivierte Oberflächenbereiche bereitzustellen, die hydrophob ist/sind mit einem Kontaktwinkel (wie vorstehend definiert) im Bereich von ungefähr 40 bis ungefähr 100° und vorzugsweise von ungefähr 60 bis 100°.
Aktivierungsmittel und Verfahren, die verwendet werden können, hängen natürlich von der zu aktivierenden funktionellen Gruppe ab und von der durch die Aktivierung gewünschte zu erhaltende reaktive Gruppe. Beispielhafte Kombinationen aus funktionellen Gruppen und Aktivierungsmitteln beinhalten jene, die Nitro- und Dinitrophenylester, Tosylate, Mesylate, Triflate und Disulfide einführen. Zum Beispiel kann eine Hydroxygruppe mit Dibernsteinsäurecarbonat zu Epoxid oder mit Diepoxid zu aktiviertem Ester umgesetzt werden. Eine Carboxygruppe kann durch Reaktion mit Dinitrophenol zu Dinitrophenylester aktiviert werden. Eine Thiol(mercapto)-Gruppe kann durch Reaktion mit Dipyridyldisulfiden zu einer Disulfidgruppe aktiviert werden.
Zum Immobilisieren der Bindemittel an die Oberfläche werden die aktivierten funktionellen Gruppen, die wie vorstehend erwähnt, nur an den vordefinierten Bereichen oder alternativ auf der gesamten Oberfläche vorhanden sind, selektiv an den vordefinierten Bereichen mit dem Bindemittel oder den Bindemitteln umgesetzt. Die notwendigen Reaktionsbedingungen, einschließlich Zeit, Temperatur, pH-Wert, Lösungsmittel, Zusatzstoffe etc. hängen unter anderem von der verwendeten besonderen Art ab und die geeigneten Bedingungen für jede besondere Situation werden Fachleuten leicht deutlich werden.
Das flüssige Medium, das Bindemittel enthält, normalerweise eine Lösung davon, kann durch selektives Abgeben einer vorbestimmten Menge an Flüssigkeit auf die Oberfläche des festen Trägers auf den jeweiligen vordefinierten Bereich aufgebracht werden. Solch eine Aufbringung kann manuell erfolgen, z. B. über eine Pipette, oder durch die Verwendung einer automatisierten Maschine oder eines Gerätes. Eine große Vielzahl an Geräten zum Abgeben oder Aufbringen wässriger Lösungen auf genaue Positionen der Oberfläche eines Trägers, sogenannte „Arrayer", ist Fachleuten bekannt und kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Solche Geräte beinhalten Tintenstrahldrucker (einschließlich piezoelektrische und thermische Geräte), „Stift- und Ring"-Geräte, Geräte zum Mikrokontaktdrucken, Geräte zum Kapillarstempeln und Ähnliches. Weitere Informationen sind zum Beispiel in US-A-4,877, 745 , US-A5,338,688 , US-A-5,474,996 , US-A-5,658,802 , US-A-6,165,417 , WO 00/56455 , WO 00/56433 , WO 00/56442 und WO 98/51999 zu finden. Kommerzielle Arrayer sind erhältlich bei einer Reihe von Lieferanten, einschließlich z. B. Packard, Biorobotics, Affymetrix, Techan, Cartesian Technologies, Gene Machines, Molecular Dynamics und HSG-IMIT.
Die vorbestimmte Flüssigkeitsmenge, die auf jeden einzelnen Oberflächenbereich oder Punkt abzugeben ist, hängt unter anderem ab von der Größe des Punktes, der Dichte der funktionellen Gruppe, dem Bindemittel und seiner Konzentration, der Aufbringungsvorrichtung etc. und in jeder Situation können geeignete Flüssigkeitsmengen von Fachleuten leicht ausgewählt werden.
Wenn eine hydrophile Oberfläche temporär hydrophob gestaltet wird, wird die hydrophobe Eigenschaft der Oberflächenbereiche, welche die aktivierten funktionellen Gruppen tragen, für eine äußerst geringe Verteilung einer auf der Oberfläche abgelagerten wässrigen Flüssigkeit sorgen. Die entstandenen Punkte aus immobilisierten Bindemitteln an der Oberfläche können daher eher klein sein und normalerweise einen Durch messer unterhalb von ungefähr 1 mm, insbesondere unterhalb von ungefähr 500 μm und insbesondere maximal 200 μm aufweisen. Andererseits ist der Punktdurchmesser vorzugsweise nicht kleiner als ungefähr 1 μm, noch bevorzugter nicht kleiner als ungefähr 5 μm und insbesondere nicht kleiner als ungefähr 10 μm.
In Abhängigkeit von der beabsichtigten Anwendung des herzustellenden Arrays können dieselben oder unterschiedlichen Bindemittel oder Gruppen aus verschiedenen Bindemitteln an die Mehrzahl vordefinierter Bereiche auf der Oberfläche des festen Trägers gebunden werden.
Im Anschluss an die Immobilisierung des Bindemittels oder der Bindemittel an die Oberfläche können alle übrigen reaktiven Gruppen inaktiviert werden, indem sie mit einer geeigneten Waschlösung behandelt werden, um den allgemein hydrophilen Charakter der Oberfläche wiederherzustellen. Solche Inaktivierungsmittel sind Fachleuten gut bekannt und können abhängig von der speziellen reaktiven Gruppe auf der Oberfläche leicht ausgewählt werden.
Der feste Träger ist vorzugsweise eine starre Struktur und kann ein Substrat mit einer Oberflächenschicht aus einem anderen Material umfassen. Beispielhafte Substratmaterialien sind Langmuir Blodgett-Filme, funktionalisiertes Glass, Si, Ge, GaAs, GaP, SiO₂, SiN₄, modifiziertes Silizium und eine große Vielzahl an Polymeren, wie z. B. (Poly)tetrafluoroethylen, (Poly)vinylidendifluorid oder Kombinationen davon. Ein bevorzugtes Substratmaterial für viele Anwendungen ist Flachglas.
Die Oberfläche des festen Trägers kann aus einer Vielzahl Materialien bestehen, zum Beispiel Polymeren, Kunststoffen, Harzen, Polysacchariden, Siliziumdioxid, oder Siliziumdioxid-basierten Materialien, Kohlenstoff, Metallen, anorganischen Glasen, Membranen etc., vorausgesetzt, dass die Oberfläche funktionelle Gruppen tragen kann. Eine geeignete Oberfläche ist ein Metallfilm, z. B. Gold, Silber oder Aluminium, vorzugsweise Gold.
Die Oberfläche des festen Trägers kann mit einer Schicht aus einem Polymer versehen sein. In solch einem Fall werden die Polymere die zu aktivierenden funktionellen Gruppen tragen. Das Polymer kann aus einer beliebigen geeigneten Klasse aus Verbindungen ausgewählt werden, zum Beispiel Polyethylenglykole, Polyethylenimide, Polysaccharide, Polypeptide oder Polynukleotide, um nur einige zu nennen. Das Anbringen der Polymere an die Oberfläche des Trägers kann durch eine Vielzahl Verfahren erfolgen, die Fachleuten leicht deutlich werden. Zum Beispiel können Polymere tragende Trichlorsilyl- oder Trisalkoxygruppen mit Hydroxylgruppen auf der Substratoberfläche umgesetzt werden, um Siloxanverbindungen zu bilden. Das Anbringen an eine Gold- oder Silberoberfläche kann mithilfe von Thiolgruppen auf dem Polymer stattfinden. Alternativ kann das Polymer mithilfe einer Zwischenart, wie z. B. einer selbstangebrachten Monolager aus Alkanethiolen angebracht werden. Die Art der ausgewählten Polymere und das zum Anbringen der Polymere an die Oberfläche ausgewählte Verfahren werden somit abhängen von dem Polymer mit einer geeigneten Reaktivität zum Anbringen an die Substratoberfläche und von den Eigenschaften der Polymere hinsichtlich des unspezifischen Adsorbierens insbesondere an Proteine.
Die funktionellen Gruppen können auf dem Polymer vorhanden sein oder dem Polymer durch Zugeben einer einzelnen oder mehrerer funktionellen Gruppen zugegeben werden. Solche funktionellen Gruppen sind vorzugsweise heterobifunktionell, wobei ein Ende angepasst ist, um mit den reaktiven Gruppen auf dem Polymer zu reagieren, und das andere Ende angepasst ist, um mit dem Aktivierungsmittel zu reagieren. Verfahren zum Anbringen der funktionellen Gruppen werden Fachleuten leicht deutlich und können aus einer großen Vielzahl an Gruppen ausgewählt werden. Beispielhafte Verfahren sind die Amidierung von Amingruppen an dem Polymer mit Bernsteinsäure und Umsetzung von Hydroxygruppen an dem Polymer mit Bromessigsäure.
Wie vorstehend erwähnt, ist das Bindemittel normalerweise ein Ligand, d. h. ein Molekül, das fähig ist, einen besonderen Analyten in der Lösung zu detektieren. Beispiele für Liganden umfassen, ohne Anspruch auf Vollständigkeit, Agonisten und Antagonisten für Zellmembranen, Toxine und Venome, virale Epitope, Antigen bestimmende Faktoren, Hormone und Hormonrezeptoren, Steroide, Peptide, Enzyme, Substrate, Kofaktoren, Arzneimittel, Lektine, Zucker, Oligonukleotide, Oligosaccharide, Proteine, Glykoproteine, Zellen, Zellmembranen, Organellen, Zellrezeptoren, Vitamine und Immunoglobuline, z. B. monoklonale und polyklonale Antikörper.
Zu den Liganden von besonderem Interesse zählen auch die, die eine biologische Funktion zum Binden mit (einem) speziellen Analyt(en) beschleunigen. Geeignete Liganden sind oft relativ kleine Einzelmoleküle, wie z. B. Kofaktoren, die spezifische Bindungseigenschaften aufweisen. Typischerweise werden Liganden eine Größe von mehr als ungefähr 100 D, vorzugsweise größer als ungefähr 1 kD aufweisen. Andere Beispiele für (gegenwärtig) interessante Liganden beinhalten, ohne Beschränkung darauf, die allgemeine Klasse der mit der Oberflächenmembran der Zellen verbundenen Rezeptoren und beinhalten zum Beispiel die immunologisch wichtigen Rezeptoren von B-Zellen, T-Zellen, Makrophagen und Ähnliches.
Analyte, die untersucht werden können, beinhalten, ohne Beschränkung darauf, Agonisten und Antagonisten für Zellmembranrezeptoren, Toxine und Venome, virale Epitope, Hormone (z. B. Opiate, Steroide etc.), Hormonrezeptoren, Peptide, Enzyme, Enzymsubstrate, Kofaktoren, Arzneimittel, Lektine, Zucker, Oligonukleotide, Oligosaccharide, Proteine und monoklonale Antikörper.
Eine Arrayoberfläche, die gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren der Erfindung hergestellt wurde, kann zum Screening von Analyten mit einer Affinität zu den immobilisierenden Liganden verwendet werden. Solch eine Screeninguntersuchung kann durch Kontaktieren einer einen Analyten (oder Analyte) enthaltenden Lösung mit der Oberfläche für eine geeignete Zeitdauer durchgeführt werden. Durch Bestimmen der Bereiche auf der Oberfläche, an denen sich der Analyt (die Analyten) anschließen, wenn der Analyt mit der Oberfläche kontaktiert wird, können die Liganden mit einer Affinität zu dem Analyten identifiziert werden.
Verfahren zum Erfassen des Vorhandenseins gebundener Analyten auf der Oberfläche können aus einer großen Vielzahl an Erfassungsverfahren ausgewählt werden, zum Beispiel Marker-basierte Verfahren, in denen der/die Analyt(e) oder ein analytspezifischer Reagens markiert wird, z. B. mit einem Radiolabel, einem Chromophor, einem Fluorphor, einem Chemilumineszenzanteil oder einem Übergangsme tall.
Bei vielen Anwendungen werden die Untersuchungen mit einem Biosensor durchgeführt. Biosensoren können auf einer Vielzahl an Erfassungsverfahren basieren. Typischerweise beinhalten solche Verfahren, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Massenerfassungsverfahren, wie z. B. piezoelektrische, optische, thermooptische und Oberflächenwellengeräte (SAW)-Verfahren und elekrochemische Verfahren, wie z. B. potentiometrische, konduktometrische, amperometrische und kapazitive Verfahren. Im Hinblick auf optische Detektionsverfahren, beinhalten repräsentative Verfahren jene, welche die Oberflächenmassenkonzentration detektieren, wie z. B. Reflexionsoptikverfahren, einschließlich sowohl Innen- als auch Außenreflexionsverfahren, die winkel-, Wellenlängen- oder phasenaufgelöst sind, zum Beispiel Ellipsometrie und Evaneszenzwellenspektroskopie (EWS), wobei die letztere Oberflächenplasmonresonanz (SPR)-Spektroskopie, Brewsterwinkelrefraktometrie, Grenzwinkelrefraktometrie, verhinderte Totalreflextion (FTR), Evaneszenzwellenellipsometrie, gestreute Totalinnenreflextion (STIR), optische Wellenleitersensoren, evaneszenzwellenbasierte Bildgebung beinhaltet, wie z. B. grenzwinkelaufgelöste Bildgebung, brewsterwinkelaufgelöste Bildgebung, SPR-winkelaufgelöste Bildgebung und Ähnliches. Ferner können photometrische Verfahren verwendet werden, die zum Beispiel auf Evaneszenzfluoreszenz (TTRF) und Phosphoreszenz sowie Wellenleiterinterferometer basieren.
Eine beispielhafte Art SPR-basierter Biosensoren wird von Biacore AB (Uppsala, Schweden) unter dem Handelsnamen BIACORE^® verkauft (nachstehend als "das BIACORE Instrument" bezeichnet). Diese Biosensoren verwenden ein SPR-basiertes Massenerfassungsverfahren, um eine Echtzeitbindungsinteraktionsanalyse zwischen einem an der Oberfläche gebundenen Liganden und einem interessierenden Analyten bereitzustellen. Eine typische Ausgabe des BIACORE-Instruments ist ein „Sensorgramm", das eine Darstellung der Antwort (gemessen in „Resonanzeinheiten" oder „RU") als Funktion der Zeit ist. Ein Anstieg von 1000 RU entspricht einem Anstieg der Masse auf der Sensoroberfläche von ungefähr 1 ng/mm².
Eine ausführliche Erläuterung der technischen Aspekte des BIACORE-Instruments und des Phänomens SPR ist im US-Patent Nr. 5,313,264 zu finden.
Ausführliche Informationen zu Matrixbeschichtungen für Oberflächen erfassende Biosensoren sind zum Beispiel in den US-Patenten Nr. 5,242,828 und 5,436,161 gegeben. Des Weiteren ist eine ausführliche Beschreibung der technischen Aspekte der in Verbindung mit dem BIACORE-Instrument verwendeten Chips in dem US-Patent Nr. 5,492,840 zu finden.
In den nachstehenden Beispielen sind verschiedene Aspekte der vorliegenden Erfindung zum Zweck der Darstellung und nicht der Begrenzung genauer offenbart.
BEISPIEL 1 (Vergleichend)
Aktivierung einer Sensoroberfläche (gesamte Oberfläche)
Ein Sensorchip CM5 (ein Biosensorchip mit einer Goldoberfläche mit einem kovalent verbundenen Carboxymethyl modifizierten Dextranpolymerhydrogel; Biacore AB, Uppsala, Schweden) wurde mit entionisiertem Wasser gespült und mit einem Stickstoffstrom getrocknet. 50 μl frischer Lösung von 0,2 M N-Ethyl-N'-(Dimethylaminpropyl)carbodiimid (EDC) und 0,05 M N-Hydroxysuccininud (NHS) wurden der Oberfläche zugegeben. Die Lösung deckte die gesamte Oberfäche als ein dünner Film aus Flüssigkeit ab. Unmittelbar nach dem Zugeben der EDC/NHS-Lösung wurde der Sensorchip in eine geschlossene Box mit hoher Luftfeuchtigkeit gelegt, um Verdunstung von der Oberfläche zu verhindern. Nach 20 Minuten wurde der Sensorchip aus der geschlossenen Box entnommen, mit entionisiertem Wasser gespült und von einem Stickstoffstrom getrocknet. Der getrocknete Sensorchip wurde vor der Immobilisierung für bis zu 8 Stunden in trockenem Zustand gelagert.
Der Kontaktwinkel der Chipoberfläche wurde vor und nach der NHS/EDC-Aktivierung mit einem Kontaktwinkelmessgerät (FTA200, First Ten Angstrom, U.S.A.) gemessen. Vor der Aktivierung betrug der Kontaktwinkel der Sensorchip-CM5-Oberfläche 10° und nach der Aktivierung 24°.
BEISPIEL 2 (Vergleichend)
Aktivierung einer Sensoroberfläche (vordefinierte Bereiche)
Ein Sensorchip CM5 (Biacore AB) wurde mit ionisiertem Wasser gespült, von einem Stickstoffstrom getrocknet und an einer Halterung montiert. 100 × 100 pI frischer Lösung von 0,2 M EDC und 0,05 M NHS wurden der Oberfläche unter Verwendung eines Tintenstrahlgeräts (AutoDropMikropipette AD-K 501, Microdrop, Deutschland) zugegeben. Die EDC/NHS-Lösung wurde als eine 10 × 10 Matrix mit einem Abstand von 200 μm lokalisiert. Der Durchmesser der Punkte betrug ungefähr 100 μm. Unmittelbar nach dem Zugeben der EDC/NHS-Lösung wurde der Sensorchip in eine geschlossene Box mit hoher Luftfeuchtigkeit gelegt, um Verdunstung von der Oberfläche zu verhindern. Nach 20 Minuten wurde der Sensorchip aus der geschlossenen Box entnommen, mit entionisiertem Wasser gespült und von einem Stickstoffstrom getrocknet. Der getrocknete Sensorchip wurde vor der Durchführung der Immobilisierung für bis zu 4 Stunden in trockenem Zustand gelagert.
BEISPIEL 3 (Vergleichend)
Immobilisierung von Antikörpern an eine aktivierte Oberfläche
Ein Sensorchip CM5 (Biacore AB), der gemäß dem vorstehenden Beispiel 1 oder Beispiel 2 aktiviert worden ist, wurde an eine Halterung montiert. 100 pΙ einer Lösung aus 10 mg/ml Lösung aus Antimyoglobin-Antikörpern in 10 mM Natriumacetat, pH 5,0, wurden der Oberfläche mithilfe der Tintenstrahleinrichtung in Beispiel 2 zugegeben. Der Durchmesser der Punkte betrug ungefähr 100 μm. Unmittelbar nach dem Zugeben der Antikörper-Lösung wurde der Sensorchip in eine geschlossene Box mit hoher Luftfeuchtigkeit gelegt, um Verdunstung von der Oberfläche zu verhindern. Nach 24 Stunden wurde der Sensorchip aus der geschlossenen Box entnommen, mit ionisiertem Wasser gespült und von einem Stickstoffstrom getrocknet. Beim Vergleichen der Reaktion auf die immobilisierten Punkte mit der Reaktion auf die nicht-immobilisierten Bereiche des Sensorchips wurde eine Differenz von ungefähr 5000 RU erhalten, was ungefähr 5 ng/mm² an immobilisierten Antikörpern entspricht.
BEISPIEL 4
Aktivierung einer Sensoroberfläche mit verschiedenen Aktivierungsmitteln

Ein Sensorchip CM5 (Biacore AB) wurde wie in Beispiel 1 beschrieben aktiviert, aber unter Verwendung anderer Aktivierungsmittel als NHS/EDC, und die Kontaktwinkel der hergestellten Oberflächen wurden mit dem in Beispiel 1 verwendeten Messgerät gemessen. Der Kontaktwinkel der Oberfläche des Sensorchips CM5 betrug vor der Aktivierung 10° und die nach der Aktivierung mit den unterschiedlichen Aktivierungsmitteln erhaltenen Kontaktwinkel sind in der nachstehenden Tabelle 1 dargestellt. TABELLE 1

Aktivierungsmittel	Kontaktwinkel
3-Hydroxy-3,4-Dihydrobenzotriazol (Vergleichsbeispiel)	38°
1-Hydroxy-7-Azabenzotriazol	43°
1-Hydroxybenzotriazol (Vergleichsbeispiel)	36°
Natriumphenol-4-Sulfonat (Vergleichsbeispiel)	19°
Natrium 2-Nitrophenol-4-Sulfonat	45°

Es sollte verstanden werden, dass die Erfindung nicht auf die vorstehend beschriebenen besonderen Ausführungsformen der Erfindung begrenzt ist, sondern der Anwendungsbereich der Erfindung von den angefügten Patentansprüchen festgelegt wird.

Claims

Verfahren zum Herstellen eines Arrays getrennter lokalisierter Bindungsmitteltragender Bereiche auf einer Oberfläche eines festen Trägers, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (i) Bereitstellen eines festen Trägers mit einer Oberfläche, die funktionelle Gruppen an mindestens einer Mehrzahl vordefinierter separater Bereiche darauf trägt, wobei die Oberfläche in einem ersten Zustand hydrophil ist, (ii) Umsetzen funktioneller Gruppen auf mindestens den vordefinierten getrennten Regionen der Oberfläche des festen Trägers mit einem Aktivierungsmittel, das ausgewählt ist, um die funktionellen Gruppen zu aktivieren, um reaktive Gruppen einer derartigen Polarität zu bilden, dass eine beliebige aktivierte Oberfläche bereitgestellt wird in einem zweiten Zustand, der hydrophob ist, mit einem Kontaktwinkel mit Wasser von mindestens 40°, (iii) selektiv Abgeben eines vorbestimmten Volumens eines wässrigen flüssigen, ein Bindungsmittel enthaltenden Mediums an jedem vordefinierten getrennten Bereich auf der Oberfläche des festen Trägers, um das Bindungsmittel an die reaktiven Gruppen zu binden, wobei der zweite hydrophobe Zustand im wesentlichen das Verteilen des wässrigen flüssigen Mediums reduziert, wenn es auf der Oberfläche aufgebracht wird, und (iv) Deaktivieren nicht umgesetzter reaktiver Gruppen auf der Oberfläche des festen Trägers derart, dass der erste hydrophile Zustand der Oberfläche des festen Trägers wiederhergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei im wesentlichen die gesamte Oberfläche des festen Trägers die funktionellen Gruppen trägt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der erste hydrophile Zustand der Oberfläche des festen Trägers zumindest teilweise durch die funktionellen Gruppen bereitgestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei in Schritt (ii) des Anspruchs 1 nur die vordefinierten getrennten Bereiche der Oberfläche des festen Trägers einer Aktivierung unterzogen werden.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei in Schritt (ii) des Anspruchs 1 im wesentlichen die gesamte, funktionelle Gruppen tragende Oberfläche des festen Trägers einer Aktivierung unterzogen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Bindungsmittel kovalent an die aktivierten funktionellen Gruppen gekoppelt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei jede Oberfläche des festen Trägers, die funktionelle Gruppen trägt, vor deren Aktivierung einen Kontaktwinkel von weniger als 20° besitzt, und jede aktivierte Oberfläche einen Kontaktwinkel von höher als 50° besitzt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die funktionellen Gruppen ausgewählt sind aus Carboxy-, Hydroxy-, Formyl-, Amino- und Mercapto-Gruppen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Aktivierungsmittel fähig ist, die funktionellen Gruppen zu reaktiven Gruppen zu aktivieren, die ausgewählt sind aus Nitrophenylester-, Dinitrophenylester-, Tosylat-, Mesylat-, Triflat- und Disulfidgruppen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die vordefinierten getrennten Bereiche Punkte sind, mit einem Durchmesser im Bereich von 10 bis 1000 μm.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der feste Träger einen Goldfilm umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Oberfläche des festen Trägers verlängernde Polymerketten umfasst, die eine funktionelle Gruppe tragen.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Polymer ein Hydrogel bildet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das flüssige Medium, das ein Bindungsmittel enthält, auf den vordefinierten Bereichen durch eine Aufbringungsvorrichtung aufgebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Aufbringungsvorrichtung basiert auf Tintenstrahldrucken, Mikrokontaktdrucken, Kapillarstempeln oder eine durch Schwerkraft angetriebene Ausstrahlung von Mikrotropfen.
Oberfläche eines festen Trägers mit einem Array von einem oder mehr Bindungsmitteln, hergestellt durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15.
Oberfläche eines festen Trägers nach Anspruch 16, die eine Sensoroberfläche ist.
Biosensor, umfassend eine Sensoroberfläche nach Anspruch 17.
Biosensor nach Anspruch 18, der eine Marker-freie Detektionstechnik nutzt.
Biosensor nach Anspruch 19, wobei die Detektionstechnik eine Massendetektion umfasst.
Biosensor nach Anspruch 20, wobei die Detektionstechnik die Detektion von evaneszenten Wellen, bevorzugt Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) umfasst.
Verwendung der Oberfläche eines festen Trägers nach Anspruch 16 oder 17 zum Studieren der Wechselwirkung von einer oder mehreren molekularen Spezies mit einem oder mehreren immobilisierten Bindungsmitteln.
Verwendung der Oberfläche des festen Trägers nach Anspruch 16 oder 17 zum Ausführen eines Assays für einen oder mehrere Analyten.
Fester Träger mit einer Oberfläche mit einer Mehrzahl vordefinierter getrennter Bereiche darauf, wobei jeder getrennte Bereich funktionelle Gruppen trägt, die aktiviert worden sind, um fähig zu sein, ein Bindungsmittel daran zu koppeln, wobei jede Oberfläche ausserhalb der vordefinierten Bereiche hydrophil ist, und wobei die aktivierten funktionellen Gruppen (i) eine Polarität derart besitzen, dass die vordefinierten Bereiche hydrophob sind mit einem Kontaktwinkel mit Wasser von mindestens 40°, und (ii) fähig sind, deaktiviert zu werden, um eine Polarität zu erhalten, die die vordefinierten Bereiche hydrophil macht.