DE60129741T2 - Zielgerichtete kombinationsimmuntherapie für krebs und infektionskrankheiten - Google Patents

Zielgerichtete kombinationsimmuntherapie für krebs und infektionskrankheiten Download PDF

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung ist auf Zusammensetzungen zum Bewirken einer Therapie eines Tumors oder einer infektiösen Krankheit gerichtet, wobei mehr als ein therapeutisches Mittel verwendet wird, wobei jedes der therapeutischen Mittel verschiedene Fähigkeiten zum Abtöten eines Tumors oder einer infektiösen Zelle besitzt.
  • Beschreibung des Standes der Technik
  • Zielgerichtete Therapie wie antikörpergerichtete Therapie bietet Vorteile gegenüber nicht gerichteter Therapie wie z. B. systemischer Therapie über orale oder i.v. Verabreichung von Wirkstoffen oder einer Therapie des ganzen Körpers wie externer Strahlentherapie (XRT). Ein Vorteil von antikörpergerichteter Therapie und insbesondere von einer Therapie, die monoklonale Antikörper verwendet (MAbs) ist die Fähigkeit, erhöhte Dosierungen eines therapeutischen Mittels an einen Tumor abzugeben, wobei normales Gewebe mehr von den Wirkungen des therapeutischen Mittels verschont wird. Diese gerichtete Therapie könnte die Verwendung von nackten MAbs oder MAbs einschließen, die an Wirkstoffe, bakterielle oder andere Toxine, Radionuklide, oder neutroneneinfangende Mittel wie Bor-Zusätze konjugiert sind.
  • Jedoch haben antikörpergerichtete Therapien Nachteile, einschließlich: (1) die Unfähigkeit, auf alle Krebszellen innerhalb eines Tumors abzuzielen, auf Grund der Heterogenität der Tumorantigene, insbesondere wenn nicht isotope Therapeutika verwendet werden; (2) geringen absoluten Zuwachs des Antikörpers im Tumor; und (3) die Verwendung therapeutischer Konjugate, die inakzeptable Toxizität gegenüber normalen Organen verursacht. Die Behandlungsmethoden des Standes der Technik haben keine vollständigen Lösungen für jedes dieser Probleme bereitgestellt.
  • Verfahren, um die Menge an Isotop zu erhöhen, das spezifisch gegen einen Tumor gerichtet werden kann, während gleichzeitig die Zeitdauer minimiert wird, während der ein Isotop im Kreislauf verbleibt, so dass die Toxizität gegenüber dem Wirt reduziert wird, sind in den US-Patenten Nr. 5,482,698 und 5,525,338 beschrieben. Zum Beispiel kann Toxizität gegenüber dem Wirt minimiert werden durch Verwendung von Techniken zum vorherigen Abzielen, die den Abgabeschritt des Isotops vom Lokalisierungsschritt des Antikörpers entkoppeln. Zusätzlich offenbaren diese Patente Verfahren, um die Mengen an therapeutischen Mitteln zu vervielfältigen, die an Tumorstellen abgegeben werden können. Diese Verfahren sind auch gemäß der vorliegenden Erfindung verwendbar. US-Patent Nr. 4,624,846 offenbart Verfahren, um die Toxizität gegenüber dem Wirt zu verringern, indem ein zweiter Antikörper verabreicht wird, um den zirkulierenden radiomarkierten ersten Antikörper zu entfernen. Die parallele US-Anmeldung mit der Anmeldenummer 08/486,166, angemeldet am 7. Juni 1995 (nicht mehr anhängig), lehrt die Verwendung eines Antikörpers, der anti-idiotypisch zur ersten verabreichten (radiomarkierten) primären abzielenden Spezies als ein Klärungsmittel in Verfahren zum vorherigen Abzielen ist. Diese Verfahren können auch gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. WO 97/41898 beschreibt ein Verfahren zur Tumortherapie, einschließlich des Verabreichens eines ersten Konjugats, welches eine Komponente zum Abzielen an einen Tumor, eine therapeutisches Mittel und ein erstes Mitglied eines Bindungspaares enthält; dann gegebenenfalls des Verabreichens eines Klärungsmittels, um nicht auf den Tumor abzielende erste Konjugate zu entfernen; und dann des Verabreichens eines zweiten Konjugats, welches das komplementäre Bindemitglied des Bindungspaares und ein zweites therapeutisches Mittel enthält.
  • Obwohl diese Patente und Patentanmeldungen Verfahren offenbaren, die einige der Probleme ansprechen, die mit zielgerichteten Therapien verbunden sind, spricht keine von ihnen das Problem an, das von der Heterogenität der Tumorantigene verursacht wird. Zusätzlich besteht ein andauerndes Bedürfnis, die Spezifität einer Komponente zum Abzielen zu verwenden, um gleichzeitig Tumor abtötende Mengen von therapeutischen Mitteln an Tumore abzugeben, jedoch den toxischen Effekt dieser Mittel gegenüber normalem Gewebe zu vermeiden. Die vorliegende Offenbarung stellt eine Lösung dieser Probleme bereit, indem sie ein Verfahren offenbart, das mehrfache Verabreichungen zum Abzielen und Verabreichungen zum vorherigen Abzielen verwendet, um mehr als ein therapeutisches Mittel an den Tumor abzugeben. Bevorzugt haben die therapeutischen Mittel verschiedene Tumor-abtötende Eigenschaften, damit mehr Zellen im Tumor abgezielt und getötet werden können. Weiterhin maximiert und vervielfältigt die vorliegende Offenbarung die molaren Mengen der therapeutischen Mittel, die pro Mol Antikörper abgegeben werden, um den geringen absoluten Zuwachs von Antikörperspiegel am Ziel anzugehen. Um das Problem des geringen Antikörper-zu-normalem-Gewebe-Verhältnis zu lösen, wird mindestens ein therapeutisches Mittel in einem späteren Behandlungsschritt abgegeben.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Kit aus Bestandteilen (Kit-of-Parts) zum Bewirken einer Therapie eines Tumors oder einer infektiösen Krankheit in einem Patienten, umfassend:
    • (A) ein erstes Konjugat, umfassend eine abzielende Komponente und ein erstes therapeutisches Mittel, wobei die abzielende Komponente selektiv an eine Markersubstanz, die durch ein Mittel, das den Tumor oder die infektiöse Krankheit verursacht, hergestellt wird oder mit diesem/r in Verbindung gebracht wird, und an ein Erkennungshapten von niederem Molekulargewicht bindet;
    • (B) gegebenenfalls ein Klärungsmittel; und
    • (C) ein zweites Konjugat, umfassend ein Nicht-Wirkstoff-Erkennungshapten von niederem Molekulargewicht, an welches das erste Konjugat bindet, und ein zweites therapeutisches Mittel, wobei das zweite therapeutische Mittel gleich oder verschieden ist vom ersten therapeutischen Mittel.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der Bestandteile des Kits in der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Bewirken einer Therapie eines Tumors oder einer infektiösen Krankheit in einem Patienten, wie in den Ansprüchen definiert.
  • Die vorliegende Offenbarung stellt eine Zusammensetzung bereit, die in einem Verfahren zur Therapie von Tumoren und infektiösen Krankheiten verwendet werden kann, einschließlich bakterieller, viraler und Pilz-Krankheiten. Es umfasst die Verabreichung eines ersten Konjugats, welches eine abzielende Komponente enthält, ein therapeutisches Mittel, und ein erstes Mitglied eines Bindungspaares; dann gegebenenfalls das Verabreichen eines Klärungsmittels, um nicht abgezielte erste Konjugate zu entfernen; und dann das Verabreichen eines zweiten Konjugats, welches das komplementäre Bindemitglied des Bindungspaares und ein zweites therapeutisches Mittel enthält.
  • Das Verfahren der vorliegenden Offenbarung gibt mehr als ein therapeutisches Mittel an einen Tumor oder eine Krankheitsstelle ab, unter Verwendung sowohl von Verfahren zum Abzielen als auch zum vorherigen Abzielen, um eine wirksame und effiziente Abgabe des Mittels an die Stelle zu erreichen. Die vorliegende Offenbarung stellt eine Zusammensetzung bereit, die in einer Therapie verwendet werden kann, die das Problem der Heterogenität eines Tumors angeht, durch Verwendung von multispezifischen abzielenden Mitteln und durch Abgabe von mindestens zwei verschiedenen therapeutischen Mitteln mit verschiedenen Tumor-abtötenden Eigenschaften an die Tumorstellen.
  • Die vorliegende Offenbarung stellt weiterhin eine Zusammensetzung bereit, die in einem therapeutischen Verfahren verwendet werden kann, das die Toxizität gegenüber Patienten minimiert, die durch die therapeutischen Mittel verursacht wird, indem Verfahren zum vorherigen Abzielen und Abzielen der Abgabe verwendet werden. Die vorliegende Offenbarung stellt zusätzlich eine Zusammensetzung bereit, die in einem therapeutischen Verfahren verwendet werden kann, mit verringerten toxischen Wirkungen gegenüber normalem Gewebe durch die Verwendung von Klärungsmitteln in Kombination mit Verfahren zum Abzielen und vorherigen Abzielen zum Abgeben von mehr als einem therapeutischen Mittel, um effizient nicht lokalisierte abzielende Komponenten aus dem Kreislauf zu entfernen.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt die Prozentzahl ID/g von Y-88-DTPA-MN14 (anti-CEA)-Streptavidinkonjugat mit und ohne klärendem anti-idiotypischem Antikörper gegenüber MN14, WI2; und 111-In-DTPA-pep-Biotin in Tumoren zu fortlaufenden Zeitpunkten.
  • 2 zeigt die Verhältnisse Tumor zu Blut für Y-88-DTPA-MN14 (anti-CEA)-Streptavidinkonjugat mit und ohne klärendem anti-idiotypischem Antikörper gegenüber MN14, WI2; und 111-In-DTPA-pep-Biotin zum Klären zu fortlaufenden Zeitpunkten.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
  • Die beanspruchte Zusammensetzung kann in einem Verfahren zur Therapie verwendet werden, das spezifisch die folgenden Schritte einschließt:
    • (A) Verabreichen eines ersten Konjugats, umfassend eine abzielende Komponente, ein erstes Mitglied eines Bindungspaares und ein erstes therapeutisches Mittel an den Patienten, wobei die abzielende Komponente selektiv an eine Markersubstanz bindet, die hergestellt oder in Verbindung gebracht wird mit dem Tumor oder mit einem Mittel, das eine infektiöse Krankheit verursacht, und Zulassen, dass das erste Konjugat an die Stelle des Tumors oder der Krankheit lokalisiert, wodurch Therapie am Tumor oder dem krankhaften Gewebes bewirkt wird;
    • (B) gegebenenfalls Verabreichen an den Patienten einer Zusammensetzung zum Klären, und Zulassen, dass die Zusammensetzung zum Klären nicht lokalisierte erste Konjugate aus dem Kreislauf entfernt;
    • (C) Verabreichen an den Patienten eines zweiten Konjugats, umfassend ein komplementäres Mitglied des Bindungspaares und ein zweites therapeutisches Mittel, wobei das zweite therapeutische Mittel gleich oder verschieden ist vom ersten therapeutischen Mittel, und Zulassen, dass das zweite Konjugat an die Stelle des Tumors oder der Krankheit lokalisiert, wodurch eine Therapie des Tumors oder krankhaften Gewebes bewirkt wird.
  • Die abzielende Komponente ist ein Antikörper oder ein Antigen bindendes Antikörperfragment, welche die Fähigkeit besitzt, spezifisch an mindestens ein Epitop auf den Markersubstanzen, die mit der Oberfläche des Tumors oder dem die infektiöse Krankheit verursachenden Mittel in Verbindung gebracht oder durch diese hergestellt werden, oder auf einem eines Bestandteil des zweiten Konjugats zu binden. Der Antiköper oder das Antiköperfragment können monospezifisch oder multispezifisch sein. Sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper sowie bestimmte rekombinante Antikörper wie chimäre und humanisierte Antikörper und Fusionsproteine können verwendet werden. Ein chimärer Antikörper ist ein rekombinantes Protein, das die variablen Domänen und die die Komplementarität bestimmenden Regionen („complementarity determining regions") enthält, die aus einem Nager-Antikörper abgeleitet sind, während der Rest des Antikörpermoleküls von einem menschlichen Antikörper abgeleitet ist. Humanisierte Antikörper sind rekombinante Proteine, in denen murine Komplementarität bestimmende Regionen eines monoklonalen Antikörpers aus den schweren und leichten variablen Ketten des Mause-Immunoglobulins in eine menschliche variable Domäne transferiert wurden. Menschliche Antikörper sind Antikörper, die entweder aus Menschen isoliert sind und dann in einer Kultur heranwachsen gelassen werden, oder unter Verwendung von Tieren hergestellt werden, deren Immunsysteme so verändert wurden, dass sie auf Stimulation durch Antigene durch Herstellung menschlicher Antikörper antworten. Andere Techniken zum Herstellen von menschlichen Antikörpern sind dem Fachmann gut bekannt wie Invitro-Phagen-Präsentation („phage display"). Ein Fusionsprotein ist ein rekombinant hergestelltes, antigenbindendes Molekül, in dem zwei oder mehr verschiedene Einzelketten-Antikörper oder Segmente von Antikörper-Fragmenten mit den gleichen oder verschiedenen Spezifitäten verbunden sind. Eine Vielzahl von bispezifischen Fusionsproteinen kann durch molekulare Techniken hergestellt werden. In einer Form ist das bispezifische Fusionsprotein monovalent, und besteht zum Beispiel aus einem scFv mit einer einzelnen Bindungsstelle für ein Antigen und einem Fab-Fragment mit einer einzelnen Bindungsstelle für ein zweites Antigen. In einer anderen Form ist das bispezifische Fusionsprotein divalent, und besteht zum Beispiel aus einem IgG mit zwei Bindungsstellen für ein Antigen und zwei scFv mit zwei Bindungsstellen für ein zweites Antigen.
  • Die abzielende Komponente kann multivalent und/oder multispezifisch sein. Mit „multivalent" ist gemeint, dass die betreffende abzielende Komponente mehr als ein Ziel gleichzeitig binden kann, welches die gleiche oder eine verschiedene Struktur haben kann. Mit „multispezifisch" ist gemeint, dass die betreffenden Mittel gleichzeitig an mindestens zwei Ziele binden können, die eine verschiedene Struktur besitzen. Zum Beispiel würde eine abzielende Komponente mit zwei verschiedenen Spezifitäten als multivalent und multispezifisch betrachtet werden, weil sie zwei strukturell verschiedene Ziele gleichzeitig binden kann. Auf der anderen Seite wäre ein Molekül, welches zwei oder mehr verschiedene Arme besitzt, die dasselbe Target binden, aber keine anderen Spezifitäten haben, multivalent aber nicht multispezifisch.
  • Einige bevorzugte abzielende Komponenten sind bispezifisch, aber in manchen Fällen sind zusätzliche Spezifitäten, z. B. zwei bis sechs, bevorzugt. Ähnlich sind einige bevorzugte abzielende Komponenten bivalent, aber ein Erhöhen der Valenz des Mittels wäre vorteilhaft beim Binden von entweder zusätzlichen Molekülen desselben Ziels oder vielen verschiedenen Zielen.
  • Die abzielende Komponente kann auch von einer Nicht-Antikörperspezies sein, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, Peptiden, Polypeptiden, Enzymen und Oligonukleotiden.
  • Die primäre abzielende Spezies, die das erste Mittel zur Therapie trägt, zum Beispiel einen radiomarkierten bispezifischen Antikörper, kann gegen ein spezifisches zweites Mittel zur Therapie erzeugt werden, oder gegen ein Konjugat, das ein therapeutisches Mittel und eine Erkennungskomponente umfasst. In der ersten Ausführungsform kann man zum Beispiel einen radiomarkierten bispezifischen Antikörper verwenden, der zweifach gegen CEA und das Ringsystem von Camptothecin abzielt. In diesem Fall wird das zweite Mittel zur Therapie verwendet, um übliche Chemotherapie abzugeben, wie eine der auf Camptothecin basierenden Antikrebssubstanzen wie CPT-11 (Irinotecan), Topotecan oder 10-Hydroxycamptothecin.
  • Bevorzugte abzielende Komponenten binden verschiedene Antigene oder verschiedene Epitope des gleichen Antigens auf einer Zielzelle. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird eine abzielende Komponente verwendet, die einen Arm umfasst, der spezifisch für ein Hapten von geringem Molekulargewicht ist, an den ein therapeutisches Mittel konjugiert oder fusioniert wird. In diesem Fall zielt der Antikörper vorher auf die Zellen ab, und das Hapten von geringem Molekulargewicht mit dem angehängten therapeutischen Mittel wird verabreicht, nachdem der Antikörper an die Ziele gebunden hat. Beispiele för erkennbare Haptene schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Chelatoren, wie DTPA, Fluoresceinisothiocyanat, Vitamin B-12 und andere Komponenten, gegen die spezifische Antikörper erzeugt werden können. Die nachfolgend injizierten Haptene können verschiedene therapeutische Mittel tragen. Es kann auch mehr als ein multispezifischer Antikörper verwendet werden, von denen jeder einen Arm umfasst, der das gleiche Hapten erkennt. Die Verwendung von multispezifischen Antikörpern und Kombinationen von multispezifischen Antikörpern stellt eine wirksame Technik bereit, um die Heterogenität von Antigenen in Tumoren und anderem krankhaften Gewebe zu überwinden, und auch um die Bindung eines zweiten Reagens (Hapten/Wirkstoff oder Isotop) zum Ziel zu erhöhen.
  • Die Verwendung von Konjugaten von Mitteln zur Hapten-Therapie zur Lokalisation von Therapeutika an Krankheitsziele hat einige deutliche Vorteile. Das gleiche Hapten kann an mehrere verschiedene Mittel zur Therapie angehängt werden. Zusätzlich, wenn eine Immunantwort gegenüber einem Mittel zur Therapie gesehen wird, wird dies nicht die Möglichkeit aufheben, einen Vektor zum Abzielen eines entwickelten nicht-immunogenen Antikörpers in Systemen, die auf Mitteln zur Hapten-Therapie basieren, zu verwenden. Dies erlaubt auch die Verwendung eines universellen Systems zum Abzielen, das mit einer beliebigen Kombination eines Antikörpers zum Abzielen und eines Mittels zur Therapie verwendet werden kann. Durch die Verwendung eines Hapten-Erkennungssystems hat der entwickelnde Chemiker die Kontrolle darüber, wie Haptene an ein Mittel zur Therapie angehängt werden, und kann Merkmale wie Labilität gegenüber einem bestimmten extrazellulären oder intrazellulären Enzym oder Instabilität gegenüber einer bestimmten Anzahl von Bedingungen, wie einem leicht verminderten pH, einarbeiten.
  • Das Bindungspaar wird aus der Gruppe bestehend aus Avidin oder Streptavidin und Biotin, komplementären DNA-Fragmenten, komplementären Peptid-Oligonukleotiden, Enzymen und ihren entsprechenden Wirkstoff-Vorstufensubstraten und einem multispezifischen Antikörper oder Antikörperfragment und dem entsprechenden Hapten ausgewählt. Das erste Mitglied des Bindungspaares ist bevorzugt ein multispezifischer, bevorzugt bispezifischer Antikörper oder ein Antikörperfragment, das eine Spezifität gegenüber einem Hapten von geringem Molekulargewicht einschließt. Das zweite Mitglied des Bindungspaares ist das komplementäre Hapten. Genauer verwendet das Verfahren ein erstes Konjugat, das einen Arm, der selektiv an eine Markersubstanz bindet, einen zweiten Arm, der an eine Markersubstanz bindet, und ein therapeutisches Mittel umfasst. Das zweite Konjugat ist ein Hapten, das ein zweites therapeutisches Mittel trägt, welches gleich oder verschieden vom ersten therapeutischen Mittel sein kann. Beide Konjugate können eine Radiomarkierung als therapeutisches Mittel umfassen, und, wenn dieses der Fall ist, ist es bevorzugt, zwei Radionuklide zu verwenden, die verschiedene Niveaus an Strahlung emittieren. Ein Klärungsmittel, welches an das erste Konjugat bindet, kann verwendet werden und ist bevorzugt anti-idiotypisch zur abzielenden Komponente und genauer ein anti-idiotypischer Antikörper. Weiter bevorzugt ist der anti-idiotypische Antikörper mit Galactose und Biotinresten substituiert.
  • Die ersten und zweiten therapeutischen Mittel sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Radionukliden, Wirkstoffen, Toxinen, und Bor-Zusätzen. Wenn beide therapeutischen Mittel Radionuklide sind, ist es bevorzugt, dass jedes der Radionuklide verschiedene Niveaus an Strahlung emittiert. Geeignete therapeutische Radionuklide schließen I-131, I-125, At-211, P-32, P-33, Sc-47, Cu-64, Cu-67, As-77, Y-90, Ph-105, Pd-109, Ag-111, I-125, Pr-143, Sm-153, Tb-161, Ho-166, Lu-177, Re-186, Re-188, Re-189, Ir-194, Au-199, Pb-212 und Bi-213 ein. Bevorzugt ist das erste therapeutische Mittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus I-131, I-125 und At-211, und das zweite therapeutische Mittel ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus P-32, P-33, Sc-47, Cu-64, Cu-67, As-77, Y-90, Ph-105, Pd-109, Ag-111, I-125, Pr-143, Sm-153, Tb-161, Ho-166, Lu-177, Re-186, Re-188, Re-189, Ir-194, Au-199, Pb-212 und Bi-213.
  • Alternativ ist das zweite therapeutische Mittel ein Bor-Zusatz, und das Verfahren umfasst weiterhin ein Bestrahlen des Tumors mit thermischen oder epithermischen Neutronen nach der Lokalisierung des zweiten Konjugats am Tumor. Das zweite therapeutische Mittel kann alternativ ein Wirkstoff-Polymer-Konjugat, ein PEG-Wirkstoff-Konjugat oder ein Wirkstoff-Liposomen-Konjugat umfassen.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform verwendet die Abgabe von polymeren Wirkstoffkonjugaten im zweiten Therapieschritt. Hier wird ein Konjugat eines Mittels zur bispezifischen Antikörper-Therapie bereitgestellt, wobei der zweite Erkennungsarm einen gewissen Teil eines polymeren Mittels zur Therapie erkennt. Typischerweise hätten solche Mittel eine allgemeine Formel umfassend ein (Erkennungs-Hapten)n-(Polymer-Rückgrat)-(therapeutische Komponente), oder ein Polymer-Rückgrat-(Komponente zur Therapie)m, wobei n und m ganze Zahlen sind, die verschiedene Substitutionsgrade am Polymer-Rückgrat der jeweiligen Spezies darstellen. Natürlich kann das Verbinden eines Wirkstoffs direkt mit einem Polymer die Definition eines Polymer-Wirkstoff-Komplexes als eine Wirkstoffvorstufe zum Ergebnis haben, da man erwartet, dass der Wirkstoff seinen Effekt nach der Spaltung ausüben wird, und dass der Polymer-Wirkstoff-Komplex inhärent ein geringeres Toxizitätsprofil als der freie Wirkstoff haben wird.
  • Es gibt viele Verfahren, um verschiedene Wirkstoffe an polymere Rückgrate anzuhängen. Im Grunde ist alles, was vom Gesichtspunkt eines Chemikers aus benötigt wird, komplementäre funktionelle Gruppen sowohl am Polymer als auch am Wirkstoff. Zum Beispiel hat das Mittel SN-38 zur Chemotherapie eine freie Hydroxylgruppe in der Position 10 seines A-Rings. Diese kann als eine reaktive Gruppe mit Polymeren verwendet werden, die freie Carboxylgruppen enthalten, um ein Camptothecin enthaltendes Polymer hervorzubringen, wobei die Wirkstoffeinheiten als Phenylesterderivate angehängt werden. In dieses Konjugat integriert ist das Konzept, dass das Camptothecin enthaltende Polymer ein Stabilitätsprofil besitzt, das eine begrenzte Lebensdauer in vivo aufgrund der relativen Labilität der Phenylesterverbindungen hat. Das bispezifische Konjugat des Mittels zur Antikörpertherapie, das im ersten Schritt verwendet wird, kann über seinen sekundären Antikörperarm zur Erkennung entweder die Camptothecinkomponenten oder das Polymer-Rückgrat erkennen. Durch Verändern der Verbindungschemie zwischen Wirkstoff und Polymer kann das Stabilitätsprofil des Polymer-Wirkstoff-Konjugats verändert werden. Zum Beispiel kann man in derselben beispielhaften Klasse SN-38 an ein Polyamin enthaltendes Polymer [z. B. Poly-Lysin] anhängen. Hier hat das 10-Hydroxycamptothecin enthaltende SN-38 seine 10-Hydroxygruppe in ein intermediäres Chlorcarbonyl-Derivat durch Reaktion mit Phosgen umgewandelt. Dieses reaktive Intermediat wird im Gegenzug für die Reaktion mit dem Poly-Amin-Polymer verwendet, um SN-38-Einheiten hervorzubringen, die durch Urethan-Bindungen angehängt sind, welche etwas stabiler sind als Esterbindungen, aber nicht für so stabil gehalten werden wie zum Beispiel Amidbindungen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein strukturell voll definierter polymerer Trägerstoff statt zufälligen Co-Polymeren wie Poly-Lysin, Poly-Glutamat und Dextranen verwendet, die in vielen vorherigen Polymerwirkstoff-Arbeiten verwendet wurden. Zum Beispiel kann ein Decapeptid leicht unter Verwendung gewöhnlicher Peptidsynthesechemie zusammengesetzt werden. Wiederum kann im Fall von SN-38 enthaltenden Konjugaten das Peptid von 1 bis 10-Glutamyl-[oder andere Säure-]Reste besitzen. Weiterhin können, wenn der sekundäre Arm des Konjugats des Mittels zur bispezifischen Antikörpertherapie zuerst gegen ein universelleres Hapten wie DTPA erzeugt wird, mehrere DTPA-Komponenten zum Zwecke der Erkennung weiterhin an das Polymer-SN-38-Konjugat angehängt werden.
  • Der Wirkstoff kann nach Spaltung vom Polymer internalisiert werden. Oder er kann als Teil eines intakten Komplexes durch eine Vernetzung des primären abzielenden Mittels zur bispezifischen Antikörpertherapie am Ziel internalisiert werden. Das (Erkennungs-Hapten)n-(Polymer-Rückgrat)-(Komponente zur Wirkstoffvorstufentherapie)m kann die Internalisierung von tumorgebundenem bsmab als gesamtem Komplex induzieren, und ein solcher Aspekt der Internalisierung von bsmab-abgegebenen Wirkstoffkonjugaten kann für eine verbesserte Wirksamkeit wichtig sein. Denn die Internalisierungseigenschaften von Antikörpern stellen ein Kontinuum dar im Sinne, dass alle mabs zu einem gewissen Grad internalisiert werden. Eine Theorie schlägt vor, dass ein „nicht internalisierender" mab für ein binäres System zur Abgabe verwendet werden kann. Jedoch kann, insbesondere für einen Wirkstoffansatz, oder dualen Wirkstoffansatz, eine relativ hohe Internalisierungsgeschwindigkeit einer Wirkstoffvorstufe bevorzugt sein. Innerhalb der binären Natur der Abgabe des bispezifischen Systems kann die geringere Verfügbarkeit von Wirkstoff-Hapten-Bindungsstellen etwas aufgehoben sein durch die erhöhte Effizienz auf Grund höherer Spiegel des internalisierten Wirkstoffs. Insbesondere wenn die Internalisierung nach einer Vernetzung des zuerst abgezielten Mittels zur bispezifischen Antikörpertherapie durch wirkstofftragende Konjugate angestoßen oder erhöht wird, die durch die vorher abgezielten Bispezifischen erkannt werden.
  • Jedes beliebige [Wirkstoff-Polymer-Erkennungs-Hapten]-Konjugat kann in der Erfindung verwendet werden. Bevorzugte Kombinationen schließen Mittel ein, die auf Grund günstiger chemischer Zubereitungen ausgewählt werden. Beim Zusammenkoppeln der Spezies schließen die hauptsächlichen Reaktionen zur Bildung der chemischen Bindung die Bildung von Amiden, Estern, Carbamaten, Harnstoffen und Thioderivaten derselben ein, sind aber nicht beschränkt darauf. Beispielhafte polymere Träger der Erfindung sind Polyaminosäuren wie Poly-Lysin, Polyglutaminsäure (E) und Asparaginsäure (D), einschließlich D-Aminosäureanaloga derselben. Co-Polymere wie Poly(Lys-Glu) {Poly[KE]} in gewünschten Verhältnissen zueinander, vorteilhafterweise von 1:10 bis 10:1 können verwendet werden. Co-Polymere, die auf Aminosäuremischungen wie Poly(Lys-Ala-Glu-Tyr)(KAEY; 5:6:2:1) basieren, können auch verwendet werden.
  • Kleinere polymere Trägermaterialien eines definierten Molekulargewichts können durch Festphasenpeptidsynthesetechniken hergestellt werden, die einfach Polypeptide von 2-50 Resten Kettenlänge herstellen. Ein zweiter Vorteil dieser Art von Reagens, neben einer präzisen strukturellen Definition, ist die Möglichkeit, an bestimmte Punkte in der Kette einzelne oder eine beliebige gewünschte Anzahl von chemischen Griffen („chemical handles") zu platzieren. Diese können später zum Anhängen von Erkennungs- und therapeutischen Haptenen zu ausgewählten Mengen jeder Komponente verwendet werden.
  • Polyethylenglykol [PEG] hat wünschenswerte In-vivo-Eigenschaften für die Verwendung in diesem Ansatz. Esterverbindungen zwischen den Hydroxylgruppen von SN-38 und beiden Enden eines Standard-Dihydroxyl-PEGs können durch Einführen von Di-Säuren wie Bernsteinsäure zwischen die SN-38- und die PEG-Hydroxylgruppen eingeführt werden, um Spezies wie SN-38-O-CO(CH2)2CO-O-PEG-O-CO(CH2)2CO-OSN-38 hervorzubringen. Das hergestellte Di-SN-38-PEG kann als das kürzeste Mitglied der Klasse der SN-38-Polymer-Wirkstoffvorstufen betrachtet werden. Die gewünschten Invivo-Eigenschaften der PEG-Derivate und die begrenzte Ladekapazität aufgrund ihrer dimären Funktionalität führte zur Herstellung von PEG-Copolymeren mit größerer Kapazität zum Hapten-Tragen wie die durch Poiani et al. beschriebenen (Bioconjugate Chem., 5:621-630, 1994). PEG-Derivate, die an beiden Enden als ihre Bis(succinimidyl)carbonat-Derivate aktiviert sind und mit multifunktionellen Diaminen wie Lysin co-polymerisiert werden. Das Produkt einer solchen Copolymerisation, das sich wiederholende (-Lys(COOH)-PEG-Lys(COOH)-PEG-)n-Einheiten enthält, wobei die Lysylcarboxylgruppe nicht in das Polymerisierungsverfahren einbezogen ist, kann zum Anhängen von SN-38-Resten verwendet werden. Die SN-38-Reste werden mit den freien Carboxylgruppen reagiert, um SN-38-Ester der (-Lys(COOH)-PEG-Lys(COOH)-PEG-)n-Kette herzustellen.
  • Andere synthetische Polymere, die verwendet werden können, um Erkennungs- und Wirkstoffhaptene zu tragen, schließen ein: N-2-Hydroxypropylmethacrylamid (HMPA)-Co-Polymere, Polystyrol-Co-Maleinsäure/Anhydrid (SMA), Polydivinylethermaleinsäureanhydrid (DIVEMA), Polyethylenimin, ethoxyliertes Polyethylenimin, „Starburst"-Dendrimere und Poly-N-vinylpyrrolidon (PVP). Als Beispiel wird DIVEMA-Polymer, umfassend mehrere Anhydrideinheiten, mit einer begrenzten Menge von SN-38 reagiert, um ein gewünschtes Substitutionsverhältnis des Wirkstoffs am Polymerrückgrat herzustellen. Zurückbleibende Anhydridgruppen werden unter wässrigen Bedingungen geöffnet, um freie Carboxylatgruppen herzustellen. Eine begrenzte Anzahl der freien Carboxylatgruppen wird unter Verwendung von üblichen wasserlöslichen Mitteln zur Peptidkupplung (z. B. EDAC) aktiviert und wird an eine Komponente zur Erkennung, die eine freie Aminogruppe trägt, gekoppelt. Ein Beispiel der letzteren wäre Histamin, gegen das in der Vergangenheit Antikörper erzeugt wurden.
  • Die oben stehenden Veranschaulichungen der Polymerverwendung betreffen SN-38, den aktiven Metabolit der Wirkstoffvorstufe CPT-11 (Irinotecan), als ein Beispiel. SN-38 hat eine aromatische Hydroxylgruppe, die in den vorstehenden Beschreibungen verwendet wurde, um Arylester herzustellen, die gegenüber Enzymen vom Esterasetyp empfänglich sind. Auf ähnliche Weise hat das Camptothecinanalogon Topotecan, das in der Chemotherapie weit verbreitet verwendet wird, zugängliche aromatische Hydroxylreste, die auf ähnliche Weise wie für SN-38 beschrieben verwendet werden können, um Polymer-Wirkstoffvorstufen herzustellen, die gegenüber Esterase empfänglich sind.
  • Doxorubicin und andere Wirkstoffe mit „chemischen Griffen" aus Aminogruppen, die aktiv genug sind zur chemischen Kopplung an polymere Trägerstoffe, können wirksam an Trägerstoffmoleküle über diese freien Aminogruppen in einer Vielzahl von Weisen gekoppelt werden. Polymere, die freie Carboxylatgruppen tragen, können in situ aktiviert werden (EDAC), und die aktivierten Polymere mit Doxorubicin gemischt werden, um den Wirkstoff direkt an die Seitenketten des Polymers über Amidbindungen anzuhängen.
  • Aminogruppen enthaltende Wirkstoffe können auch an Aminogruppen tragende Polymere gekoppelt werden, indem kommerziell erhältliche und spaltbare Mittel zur Verknüpfung wie Ethylenglyco-bissuccinimidylsuccinat (EGS, Pierce Chemical Co., Rockford, IL) oder Bis-[2-succinimidoxycarbonyloxyethyl]sulfon (BSOCOES, Molecular Biosciences, Huntsville, AL) gemischt werden, um die zwei Amine als zwei Amide nach der Reaktion mit dem Bis-succinimidylester-Gruppen zu vernetzen.
  • Methotrexat hat auch eine verfügbare Aminogruppe zum Koppeln von aktivierten Carboxylat enthaltenden Polymeren auf eine ähnliche Weise wie die, die vorstehend für Doxorubicin beschrieben wurde. Es hat auch zwei Glutamyl-Carboxylgruppen (alpha und gamma), die zum Koppeln an Aminogruppen enthaltende Polymere aktiviert werden können. Die freien Carboxylatgruppen des Methotrexats können in situ aktiviert werden (EDAC), und der aktivierte Wirkstoff kann mit einem Aminogruppen enthaltenden Polymer gemischt werden, um direkt den Wirkstoff an die Seitenketten des Polymers über Amidbindungen anzuhängen. Überschüssiger unreagierter oder vernetzter Wirkstoff wird leicht vom Polymer-Wirkstoff-Konjugat unter Verwendung von Größenausschluss- oder Ionenaustauschchromatographie abgetrennt.
  • Maytansinoide und Calicheamicine (wie Esperamycin) enthalten gemischte Di- und Trisulfidbindungen, die gespalten werden können, um Spezies mit einem einzelnen Thiol hervorzubringen, das zur chemischen Manipulation verwendbar ist. Das Thiomaytansinoid oder Thioesperamycin kann mit einem Maleimid oder Thiol enthaltenden Polymer reagiert werden, wobei eine Verbindung des Wirkstoffs über einen Thioether oder Disulfidbindungen bewirkt wird.
  • Wenn der Wirkstoff selbst oder das Polymerrückgrat nicht als Erkennungseinheit verwendet wird, kann ein separates Hapten auch an das Polymer angehängt werden, bevorzugt ein Hapten, das verwendbar zur universellen Erkennung ist, wenn es an ein beliebiges Polymer-Wirkstoff-Konjugat angehängt wird. Wenn Erkennungshaptene vorstehend kurz diskutiert wurden, ist das Chelat Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) das Erkennungshapten, das meistens in dieser Diskussion verwendet wird. Antikörper wurden gegen Indium-DTPA durch mindestens zwei unabhängige Labore erzeugt. Antikörper können gegen das freie Chelat oder einen Metallkomplex des Chelats reaktiv sein. Antikörper können haben und haben verschiedene Affinitäten für DTPA, wenn das Chelat mit verschiedenen Metallen komplexiert wird. Dies kann vorteilhafterweise verwendet werden, da der Anti-Erkennungshapten-Arm eines bispezifischen Antikörpers auf eine Affinität hin durch einfaches Variieren des Metalls, das vom Chelat gehalten wird, maßgeschneidert werden kann. Es wurde argumentiert, dass Antikörper mit höherer Affinität nicht die Fähigkeit besitzen, feste Tumore so tief oder gleichmäßig wie Antikörper von geringerer Affinität zu durchdringen, auf Grund einer Bindung von stärkerer Affinität an die Oberflächenzellen des Tumorzieles. Antikörper wurden auch gegen andere Metallchelate erzeugt, wie 1,4,7,10-Tetraazacyclododekan-N,N',N'',N'''-tetra-Essigsäure (DOTA), oder N,N'-Di[2-hydroxy-5-(ethylen-3-carboxy)benzyl]ethylendiamin N,N'-di-Essigsäure (HBED).
  • Das Erkennungshapten der vorliegenden Erfindung braucht kein Metallchelatkomplex zu sein. Andere hydrophile Moleküle von geringem Molekulargewicht, die die Fähigkeit besitzen, eine starke Immunantwort hervorzurufen, können auch verwendet werden, um Antikörper herzustellen. Ein Beispiel davon ist die Histamin-Succinat-Komponente zusammen mit dem 679-Antikörper gegen Histaminsuccinat, beschrieben in der wissenschaftlichen Literatur. Man kann viele weitere Immunogene in Betracht ziehen, die verwendet werden könnten, um Antikörper zu erzeugen, die unter In-vivo-Bedingungen verwendbar sind. Gemeinhin verwendete Immunogene schließen Fluorescein, 2,4-Dinitrophenyl-Derivate und Biotin ein. Das zuletzt erwähnte ist weniger bevorzugt als die ersten zwei, da Erkennungshaptene bevorzugt sind, die nicht normalerweise in lebenden Systemen vorhanden sind. Carboxyl enthaltende Chelatderivate wie DTPA, DOTA, HBED und HSG werden leicht an aminhaltige Polymere durch kontrollierte Aktivierung einer begrenzten Anzahl ihrer Carboxylatgruppen unter Verwendung von EDAC-artigen Reagenzien gekoppelt. Fluorescein wird leicht an aminhaltige Polymere unter Verwendung eines isothiocyanatderivatisierten Analogon gekoppelt.
  • Weiterhin sind die ersten und zweiten therapeutischen Mittel Mischungen von mindestens zwei Radionukliden, Wirkstoffen, Toxinen oder Bor-Zusätzen. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das erste therapeutische Mittel ein Radionuklid und das zweite therapeutische Mittel ist ein Wirkstoff, ein Toxin oder ein Bor-Zusatz. Wie vorstehend beschrieben, wird das erste therapeutische Mittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus I-131, I-125 und At-211. Das zweite therapeutische Mittel ist ein Wirkstoff und wird ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Taxol, Stickstoff-Lost-Verbindungen („nitrogen mustards"), Ethyleniminderivaten, Alkylsulfonaten, Nitroso-Harnstoffen, Triazenen, Folsäureanaloga, Pyrimidinanaloga, Purinanaloga, Vinca-Alkaloiden, Antibiotika, Enzymen, Platin-Koordinationskomplexen, substituiertem Harnstoff, Methylhydrazinderivaten, adrenokortikalen Suppressiva, Hormonen, Antagonisten, Camptothecin und Endostatin. Das zweite therapeutische Mittel kann alternativ ein Toxin sein, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Abrin, Alphatoxin, Diphterietoxin, Exotoxin, Gelonin, antiviralem Protein der Kermesbeere („pokeweed antiviral protein"), Ricin, Saporin, DNAse und RNAse. Eine bevorzugte RNAse hat die Sequenz der RNAse aus Froschoozyten.
  • In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das erste therapeutische Mittel ein Wirkstoff oder Toxin, und das zweite therapeutische Mittel ist ein Radionuklid oder ein Bor-Zusatz. Beispiele von verwendbaren Wirkstoffen, Toxinen und Radionukliden sind vorstehend beschrieben.
  • Das therapeutische Mittel kann auch ein Cytokin, Lymphokin, Chemokin oder ein Immunmodulator sein. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein multispezifisches, bevorzugt bispezifisches Cytokin-Fusionsprotein in einem ersten Schritt verabreicht, gefolgt durch die Verabreichung eines therapeutischen Radionuklids als zweitem Schritt. Zum Beispiel kann ein bispezifisches Fusionsprotein von hMN14, einem humanisierten monoklonalen Anti-CEA-Antikörper, h734, einem humanisierten Anti-diDTPA-Antikörperfragment und einem Cytokin wie IL2 verwendet werden. Gemäß dieser Ausführungsform kann [hMN14-Fab]-[h734-sFv]-IL2 in einem ersten Schritt verabreicht werden, gefolgt durch DTPA-Peptid, radiomarkiert mit einem therapeutischen Radionuklid. Alternativ kann [hMN14-Fab]-[h734-sFv], radiomarkiert mit einem therapeutischen Radionuklid im ersten Schritt verwendet werden, gefolgt durch DTPA-IL2.
  • Das erste Konjugat kann einen Antikörper umfassen, der selbst therapeutisch ist, d. h. es kann ein therapeutisch wirksamer „nackter" Antikörper sein, in welchem Falle kein zusätzliches therapeutisches Mittel an ihn konjugiert zu werden braucht. Zum Beispiel bewirkt IgG1 eine ADCC („antibody dependent cell mediated cytotoxicity” antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität) und/oder Komplementbindung. Ein Antikörper gegen EGF [Anti-hEGF-IgG/734] blockiert den EGF-Rezeptor, und dann kann ein zweites Therapeutikum nachfolgend verabreicht werden. Ein monoklonaler bispezifischer anti-CD20-Antikörper kann auch ADCC, Aktivierung des Komplementsystems und/oder Apoptose bewirken. Das zweite Konjugat umfasst dann einen gewöhnlicheren Wirkstoff, ein Toxin, Cytokin oder Radionuklid.
  • Dieses Verfahren beschäftigt sich speziell mit dem Problem der Krankheitsheterogenität, die normalerweise in einer klinischen Umgebung auftritt. Die Heterogenität wird durch das Abzielen sowohl auf große Tumore als auch auf kleine Mikrometastasen mit demselben therapeutischen Verfahren angegangen. Zum Beispiel wird sowohl ein hochenergetischer (tief eindringender) Beta-Strahler und ein Beta-Strahler von geringer oder mittlerer Energie, der seinen eindringenden Effekt über viel kürzere Distanzen ausübt, an die Ziel-Tumorstelle verabreicht. Um eine Krankheit zu behandeln, die beschränkter ist, kann ein Beta-Strahler von mittlerer Energie genügende Endringtiefe haben, um größere Tumore zu behandeln. In dieser Ausführungsform wird sowohl ein Beta-Strahler von mittlerer Energie und ein Beta-Strahler von geringer Energie oder, bevorzugt, ein Wirkstoff oder Toxin, an die Tumorstellen abgegeben.
  • Krebsstellen, die gemäß der vorliegenden Erfindung abgezielt und behandelt werden können, schließen Karzinome, Melanome, Sarkome, Neuroblastome, Leukämien, Lymphome, Gliome und Myelome ein. Das Verfahren ist besonders gut geeignet zur Therapie von begrenzter metastatischer Krankheit, z. B. für Patienten, die mehrfache Tumorstellen aufweisen, bis zu etwa 5 cm im Durchmesser.
  • Tumore von bis zu 5 cm im Durchmesser sind solche Tumore, die sich im maximal wirksamen Bereich des am tiefsten eindringenden Radionuklids befinden, das mit Radioimmuntherapie verwendbar ist, dem ausschließlich Beta-Teilchen emittierenden Yttrium-90-(Y-90)-Nuklid. Ein Tumor mit optimalem Durchmesser zur Verwendung mit diesem Nuklid ist einer mit 3,4 cm, und die Wirksamkeit des Isotops fällt dramatisch oberhalb und unterhalb dieses optimalen Durchmessers ab, so dass der optimale Bereich für einen Tumor, auf den mit Y-90 abgezielt wird, zwischen 2,8 und 4,2 cm ist. O'Donoghue et al., J. Nucl. Med., 36: 1902-1909 (1995). Dieses Isotop kann weniger wirksam gegen kleine Tumorablagerungen sein, und ein Isotop mit kürzerer Reichweite wird auch für duale Isotopenbestrahlung gebraucht. O'Donoghue et al., supra.
  • Ein Tumor von 5 cm Durchmesser wiegt ungefähr 65 g (4/3 πr3; wobei 1 cm3 = 1 g Gewicht) und enthält 6,5 × 109 Zellen. Eine durchschnittliche Zelle kann 5-20 μm im Durchmesser sein. Zur optimalen Auslöschung von Tumorzellen erscheint es, dass ein Isotop einer bestimmten Energie vermutlich versagt, wirksame Toxizität an einen Tumor in diesem Bereich abzugeben. Zweiundzwanzig Isotope wurden veröffentlicht, die im Kontext eines doppelt radiomarkierten Antikörpers verwendet werden konnten. O'Donoghue et al., supra. Jedoch können für die allerkleinsten Tumorablagerungen und für einzelne Zellen wenige der vorhandenen Isotope verwendbar sein, und ein Wirkstoff oder Toxin wird geeigneter sein.
  • Das hierein beschriebene Verfahren umfasst mindestens zwei Schritte. Im ersten Schritt wird ein Konjugat umfassend eine abzielende Komponente, ein Mitglied eines Bindungspaares und ein erstes therapeutisches Mittel verabreicht. Nachdem das erste Konjugat verabreicht wurde und ihm erlaubt wurde, zu lokalisieren, und bevorzugt nachdem die Zeit für eine maximale Aufnahme des Konjugats im Tumor verstrichen ist, wird ein zweites Konjugat verabreicht. Dieses Konjugat umfasst das komplementäre Mitglied des Bindungspaares, das im ersten Schritt verwendet wird, und ein zweites therapeutisches Mittel. Dieses Konjugat lokalisiert an den Tumorstellen mit Hilfe des Bindungspaares. Zum Beispiel umfasst, wenn ein radiomarkiertes MAb-Avidinkonjugat im ersten Schritt verabreicht wird, das zweite Konjugat Biotin. Die Bindungsaffinität zwischen Avidin und Biotin führt dazu, dass das zweite Konjugat an das Avidin bindet, das bereits an den Tumorstellen lokalisiert ist. Als Ergebnis wird das zweite Konjugat auch an den Tumorstellen lokalisiert. Da jede Avidinkomponente bis zu vier Biotinkomponenten binden kann, wird durch diesen Schritt eine Vervielfältigung erreicht.
  • Wahlweise kann ein Klärungsschritt zwischen den zwei vorstehend beschriebenen Schritten durchgeführt werden. Das bedeutet, dass, nachdem das erste Konjugat Zeit hatte, an den Tumorstellen zu lokalisieren, ein Klärungsmittel verabreicht werden kann, um zirkulierendes Konjugat zu entfernen.
  • Abzielende Komponenten
  • Die abzielende Komponente kann z. B. ein Antikörper oder ein Antigen bindendes Antikörperfragment sein. Monoklonale Antikörper sind bevorzugt wegen ihrer hohen Spezifitäten. Sie werden leicht hergestellt durch inzwischen als gebräuchlich angesehene Verfahrensweisen der Immunisierung von Säugetieren mit einer immunogenen Antigenzubereitung, Fusion von Lymph- oder Milzzellen des Immunsystems mit einer unsterblichen Myelom-Zelllinie und Isolierung von spezifischen Hybridomklonen. Weniger übliche Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern werden auch in Betracht gezogen, wie Fusionen zwischen verschiedenen Arten und Manipulationen von hypervariablen Regionen durch gentechnische Veränderungen, da es primär die Antigenspezifität der Antikörper ist, die ihre Verwendbarkeit in der vorliegenden Erfindung beeinflusst. Es wird verstanden werden, dass neuere Techniken zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern auch verwendet werden können, z. B. menschliche monoklonale, inter-spezies-monoklonale, chimäre (z. B. Human-Maus) klonale, gentechnisch veränderte Antikörper u. Ä.
  • Antikörperfragmente, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen ein F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv und ähnliche einschließlich Hybridfragmente. Bevorzugte Fragmente sind Fab', F(ab')2, Fab und F(ab)2. Weiterhin verwendbar sind jegliche Unterfragmente, die die hypervariable, antigenbindende Region eines Immunglobulins beibehalten, und eine Größe besitzen, die ähnlich oder kleiner als ein Fab'- Fragment ist. Dies schließt gentechnisch veränderte und/oder rekombinante Antikörper und Proteine ein, egal ob einzelkettige oder mehrkettige, welche eine Antigenbindungsstelle integriert haben und ansonsten im Wesentlichen auf die selbe Art wie natürliche Immunglobulinfragmente in vivo als Trägermaterialien zum Abzielen funktionieren. Solche einzelkettigen bindenden Moleküle sind z. B. in US-Patent Nr. 4,946,778 offenbart.
  • Fab'-Antikörperfragmente können auf geeignete Weise durch reduzierende Spaltung von F(ab')2-Fragmenten hergestellt werden, die selbst durch Pepsinverdau von intaktem Immunglobulin hergestellt werden können. Fab-Antikörperfragmente können durch Papainverdau von intaktem Immunglobulin unter reduzierenden Bedingungen oder durch Spaltung von F(ab)2-Fragmenten, die aus vorsichtigem Papainverdau von ganzem Immunglobulin stammen, hergestellt werden. Die Fragmente können auch durch gentechnische Verfahrensweisen hergestellt werden.
  • Es sollte bemerkt werden, dass Mischungen von Antikörpern und Immunglobulinklassen verwendet werden können, sowie Hybridantikörper. Multispezifische Antikörper, einschließlich bispezifischer und hybrider, Antikörper und Antigen bindende Antikörperfragmente sind in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendbar. Eispezifische und Hybridantikörper besitzen die Fähigkeit, spezifisch an mindestens ein Epitop auf den Markersubstanzen oder auf einer Komponente des zweiten Konjugats zu binden. Diese Antikörper umfassen bevorzugt mindestens zwei verschiedene, im Wesentlichen monospezifische Antikörper oder Antikörperfragmente, die spezifisch an mindestens ein Epitop auf der Markersubstanz binden, die durch die Krebszellen hergestellt oder mit ihnen und mit mindestens einem Epitop einer Komponente des zweiten Konjugats in Verbindung gebracht wird. Multispezifische Antikörper und Antikörperfragmente mit dualen Spezifitäten können analog zu den Anti-Tumormarkerhybriden, die in US-Patent Nr. 4,361,544 offenbart werden, hergestellt werden. Andere Techniken zur Herstellung von Hybridantikörpern werden z. B. in US-Patenten Nr. 4,474,893 und 4,479,895 und in Milstein et al., Immunol. Today, 5: 299 (1984) offenbart.
  • Bevorzugt sind Antikörper mit spezifischer Immunreaktivität gegenüber einer Markersubstanz, die von mindestens 60 % der Krebszellen hergestellt wird oder mit ihnen in Verbindung gebracht wird, und einer Kreuzreaktivität gegenüber anderen Antigenen oder nicht abgezielten Substanzen von weniger als 35 %. Ein monoklonaler Antikörper, der spezifisch auf Tumorstellen durch Binden an Antigene abzielt, die von den Tumoren hergestellt werden oder mit ihnen in Verbindung gebracht werden, ist besonders bevorzugt.
  • Antikörper gegen Tumorantigene sind bekannt. Zum Beispiel werden Antikörper und Antikörperfragmente, die spezifisch Marker binden, die durch Tumore hergestellt werden oder mit ihnen in Verbindung gebracht werden, inter alia offenbart in Hansen et al., US-Patent Nr. 3,927,193 und Goldenberg, US-Patenten Nr. 4,331,647 , 4,348,376 , 4,361,544 , 4,468,457 , 4,444,744 , 4,818,709 und 4,624,846 . Insbesondere werden vorteilhafterweise Antikörper gegen ein Antigen, z. B. einen gastrointestinalen Tumor, Lungen-, Brust-, Prostata-, Eierstock-, Hoden-, Gehirn-, oder lymphatischen Tumor, ein Sarkom oder ein Melanom verwendet.
  • Die Antikörper und Antigen bindenden Antikörperfragmente, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, können an das Mitglied des Bindungspaares durch eine Vielzahl von Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, konjugiert werden, einschließlich chemischer Konjugation und rekombinanter Verfahren zur Herstellung von Fusionsproteinen. Viele dieser Verfahren werden in den vorstehend aufgeführten US-Patenten und Patentanmeldungen offenbart (siehe auch Childs et al., J. Nuc. Med., 26: 293 (1985).
  • Ein Antikörper, der zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung bevorzugt ist, ist MN-14, ein CEA-Antikörper der zweiten Generation, der zehnfach höhere Affinität für CEA besitzt als die Version der ersten Generation, NP-4. Hansen et al., Cancer, 71: 3478-85 (1993). MN-14 internalisiert langsam, was ihn geeignet für eine Vorgehensweise zum vorherigen Abzielen macht.
  • Andere Komponenten zum Abzielen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen z. B. ein Proteine, Peptide, Polypeptide, Glykoproteine, Lipoproteine, Phospholipide, Oligonukleotide, Steroide, Alkaloide und Ähnliches, z. b. Hormone, Lymphokine, Wachstumsfaktoren, Albumin, Cytokine, Enzyme, Immunmodulatoren, Rezeptorproteine, Antisense-Oligonukleotide, Antikörper und Antikörperfragmente, welche bevorzugt Markersubstanzen binden, die von der Zielstelle hergestellt oder mit ihr in Verbindung gebracht werden.
  • Bindungspaar
  • Ein gebräuchliches Bindungspaar, das in Verfahren zum vorherigen Abzielen verwendet wird, ist Avidin oder Streptavidin und Biotin. Avidin, das in Eiweiß gefunden wird, hat eine sehr hohe Bindungsaffinität für Biotin, welches ein Vitamin des B-Komplexes ist. Wilcheck et al., Anal. Biochem., 171: 1 (1988). Streptavidin, das aus Streptomyces avidinii stammt, ist ähnlich zu Avidin, besitzt aber geringere unspezifische Gewebebindung, und wird daher oft an Stelle von Avidin verwendet. Sowohl Avidin als auch Streptavidin haben eine Tetravalenz für Biotin, was eine Vervielfältigung erlaubt, wenn erstere an Biotin binden. Modifizierte Formen von Avidin wie deglykosiliertes Avidin, ladungsneutralisiertes Avidin oder deglykosiliertes und ladungsneutralisiertes Avidin können auch in der Erfindung verwendet werden.
  • „Biotin" wie hierin verwendet, schließt Biotin, kommerzielle Biotinprodukte, in denen das Biotin durch Zufügen von Alkylgruppen verändert wurde, und Biotinderivate wie Aktivester, Amine, Hydrazide und Thiolgruppen ein, wobei die komplementären reaktiven Gruppen auf Polymeren Amine, Acyl- und Alkyl-Abgangsgruppen, Carbonylgruppen und Alkylhalide oder Akzeptoren vom Michael-Typ sind.
  • Das Streptavidin-Biotin-System stellt die stärkste nicht kovalente biologische Interaktion dar, die zwischen einem Protein und einem Liganden bekannt ist (Ka = 1015 M–1). Rosebrough, Nucl. Med. Biol., 20: 663-68 (1993). Außerdem besitzt Streptavidin einen pI von –6 verglichen mit > 10 für Avidin, was die Ladung von Sav stärker dem Neutralen bei physiologischem pH annähert, im Gegensatz zur starken positiven Ladung von Avidin. Darüber hinaus ist Avidin „klebrig (sticky)" in vivo und in vitro. Rosebrough, supra. Aus diesen Gründen wird Streptavidin dem Avidin bevorzugt, um Konjugate herzustellen, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, und das Streptavidin/Biotin-System ist ein bevorzugtes Bindungspaar zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung. Es soll jedoch verstanden werden, dass sowohl Avidin als auch Streptavidin gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Demnach ist beabsichtigt, dass, wie hierin verwendet, entweder Avidin oder Streptavidin sowohl Avidin als auch Streptavidin einschließen.
  • Verfahren zum Konjugieren von Biotin und Avidin an therapeutische Mittel und/oder Antikörper sind bekannt und werden z. B. in der parallelen US-Anmeldung mit der Anmeldenr. 08/486,166 (nicht mehr anhängig) beschrieben.
  • Wenn Streptavidin (oder Avidin) das erste Mitglied des Bindungspaares ist, und Biotin das komplementäre Mitglied des Bindungspaares ist, dann kann das zweite Konjugat (das Konjugat Biotin-therapeutisches Mittel) zwei oder mehr Biotinkomponenten umfassen. Dies erhöht die Fähigkeit des Konjugats, an die Zielstelle zu lokalisieren, und erlaubt dem Biotin, das radiomarkierte Streptavidin-MAb-Konjugat, das an die Zielstellen vorher abgezielt wurde, zu vernetzen, was die Internalisierung des zweiten therapeutischen Mittels in die abgezielten Tumorzellen induziert.
  • Komplementäre DNA-Fragmente können auch als Bindungspaare verwendet werden. Bos et al., Cancer Res. 54: 3479-3486 (1994). Damit kann gemäß der vorliegenden Erfindung das erste Konjugat einen Antikörper, ein therapeutisches Mittel und ein einzelsträngiges Oligonukleotid umfassen und das zweite Konjugat kann ein komplementäres einzelsträngiges Oligonukleotid und ein therapeutisches Mittel umfassen. Ein hauptsächlicher Vorteil dieses Systems gegenüber den Biotin/Avidinsystemen könnte die vermutete geringere Immunogenität eines relativ kurzen DNA-Stücks verglichen mit der immunogenen 60.000-Dalton-Avidin-Spezies sein.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das erste Mitglied des Bindungspaares ein Oligonukleotid-Analogon wie eine einzelkettige Peptid-Nukleinsäure und das komplementäre Mitglied des Bindungspaares ist die komplementäre Peptid-Nukleinsäure.
  • Alternativ kann das erste Mitglied des Bindungspaares ein Enzym oder ein Enzymsubstrat sein und das komplementäre Mitglied ist jeweils das entsprechende Enzymsubstrat bzw. Enzym. Alternativ kann ein Substratanalogon an Stelle des Enzymsubstrats verwendet werden.
  • Andere Bindungspaare, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden in den anderen Patenten und Patentanmeldungen, die hierin diskutiert werden, offenbart, oder sie sind dem Fachmann offensichtlich, und die Verwendung solch anderer Bindungspaare wird speziell in Betracht gezogen.
  • Therapeutische Mittel
  • Die ersten und zweiten therapeutischen Mittel können gleich oder verschieden sein, und können z. B. therapeutische Radionuklide, Wirkstoffe, Hormone, Hormonantagonisten, Rezeptorantagonisten, Enzyme oder Proenzyme, die durch ein anderes Mittel aktiviert werden, Autokrine oder Cytokine sein. Toxine können auch in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Andere therapeutische Mittel, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen Anti-DNA-, Anti-RNA-, radiomarkierte Oligonukleotide wie Antisense-Oligodesoxyribonukleotide, Anti-Protein- und Anti-Chromatin-zytotoxische oder antimikrobielle Mittel ein. Andere therapeutische Mittel sind in den vorstehend erwähnten US-Patenten und Patentanmeldungen beschrieben, oder sind dem Fachmann bekannt, und die Verwendung solcher anderer therapeutischer Mittel gemäß der vorliegenden Erfindung wird speziell in Betracht gezogen.
  • Isotope, Wirkstoffe und Toxine sind bevorzugte therapeutische Mittel. Während die ersten und zweiten therapeutischen Mittel die gleichen sein können, sind sie in einer bevorzugten Ausführungsform verschieden. Zum Beispiel können die ersten und zweiten therapeutischen Mittel verschiedene Radionuklide umfassen, oder das erste therapeutische Mittel kann einen Wirkstoff umfassen, während das zweite therapeutische Mittel ein Radionuklid umfasst, oder das erste therapeutische Mittel kann ein Radionuklid umfassen, während das zweite therapeutische Mittel einen Wirkstoff umfasst.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden verschiedene Isotope, die über verschiedene Distanzen hinweg als Ergebnis ihrer individuellen Energieemissionen wirksam sind, als erstes und zweites therapeutisches Mittel verwendet. Dies erreicht eine wirksame Behandlung von Tumoren und ist verwendbar für Patienten, die verschiedene Tumore verschiedener Größen aufweisen wie unter normalen klinischen Umständen.
  • Wie vorstehend diskutiert, sind wenige der erhältlichen Isotope verwendbar zur Behandlung der allerkleinsten Tumorablagerungen und einzelner Zellen, und ein Wirkstoff oder Toxin kann ein verwendbareres therapeutisches Mittel in diesen Situationen sein. Demgemäß werden in bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung Isotope in Kombination mit nicht isotopen Spezies wie Wirkstoffen, Toxinen und Mitteln zum Neutroneneinfang verwendet.
  • Ein Isotop kann im ersten Schritt oder in einem nachfolgenden Schritt verwendet werden. Beispiele geeigneter Isotope schließen ein P-32, P-33, Sc-47, Cu-64, Cu-67, As-77, Y-90, Rh-105, Pd-109, Ag-111, I-125, Pr-143, Sm-153, Tb-161, Ho-166, Lu-177, Re-186, Re-188, Re-189, Ir-194, Au-199, Pb-212 und Bi-213. Wenn das Isotop im ersten Schritt verwendet wird, ist es bevorzugt, leicht verstoffwechselbare Isotope zu verwenden, wie Jod. Beispiele von Isotopen, die im ersten Schritt der vorliegenden Erfindung besonders verwendbar sind, schließen I-125, I-131 und At-211 ein. Wenn das Isotop in einem nachfolgenden Schritt verwendet wird, ist bevorzugt, Isotope zu verwenden, die zurückbleiben („residualize"), wie Yttrium-90.
  • Es sind viele Wirkstoffe und Toxine bekannt, die zytotoxische Wirkungen auf Zellen haben und in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Sie können in Kompendien von Wirkstoffen und Toxinen gefunden werden wie dem Merck-Index, Goodman und Gilman, u. Ä., und in den oben zitierten Referenzen. Beispiele bekannter zytotoxischer Mittel, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, sind z. B. aufgelistet in Goodman et al., „the Pharmacological Basis of Therapeutics", sechste Ausgabe, A. G. Gilman et al., Hrsg./Macmillan Publishing Co. New York, 1980. Diese schließen Taxol, Stickstoff-Lost-Verbindungen („nitrogen mustards"), wie Mechlorethamin, Cyclophosphamid, Melphalan, Uracil-Senfgas und Chlorambucil; Ethylenimin-Derivate wie Thiotepa; Alkylsulfonate wie Busulfan; Nitrosoharnstoffe wie Carmustin, Lomustin, Semustin und Streptozocin; Triazene wie Dacarbizin; Folsäure-Analoga wie Methotrexat; Pyrimidinanaloga wie Fluoruracil, Cytarabin und Azarabin; Purinanaloga wie Mercaptopurin und Thioguanin; Vinca-Alkaloide wie Vinblastin und Vincristin; Antibiotika wie Dactinomycin, Dannorubizin, Doxorubizin, Bleomycin, Mithramycin und Mitomycin; Enzyme wie L-Asparaginase; Platin-Koordinationskomplexe wie Cisplatin; substituierte Harnstoffe wie Hydroxyharnstoff; Methylhydrazinderivate wie Procarbazin; adrenokortikale Suppressiva wie Mitotan; Hormone und Antagonisten wie Adrenokortikosteroide (Prednison), Progestine (Hydroxyprogesteroncaproat, Medroprogesteronazetat und Megestrolazetat),; Östrogene (Diethylstilbestrol und Ethinylöstradiol), Anti-Östrogene (Tamoxifen) und Androgene (Testosteronpropionat und Fluoxymesteron) ein.
  • Wirkstoffe, die mit der intrazellulären Proteinsynthese interferieren, können auch in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden; solche Wirkstoffe sind dem Fachmann bekannt und schließen Puromycin, Cycloheximid und Ribonuklease ein.
  • Wirkstoffvorstufen sind in der vorliegenden Erfindung besonders verwendbar als inaktive Vorläufer eines therapeutischen Mittels, weil die Wirkstoffvorstufe relativ wenig toxisch im Vergleich zu seinem aktiven therapeutischen Metaboliten ist. In der vorliegenden Erfindung kann die Wirkstoffvorstufe als zweites Konjugat und als komplementäres Mitglied eines Bindungspaares wirken, da es das Substrat eines Enzyms ist, welches das andere Mitglied des Bindungspaares ist, und eine Komponente des ersten Konjugats ist.
  • Wenn das erste Konjugat verabreicht wird, wird es durch die abzielende Komponente auf den Tumor abgezielt. Nachdem dem ersten Konjugat genügend Zeit gegeben wurde, zu lokalisieren, und gegebenenfalls ein Klärungsmittel verabreicht wurde, wird dann der Wirkstoffvorstufe, d. h. das zweite Konjugat verabreicht. Der Wirkstoffvorstufe bindet die Enzymkomponente des ersten Konjugats am Tumor, und wird in den aktiven Metaboliten umgewandelt, welcher den Tumor tötet. Beispiele solcher Enzym-Wirkstoffvorstufe-Bindungspartner sind I-131-Antikörper-Carboxypeptidase G2 und die Topoisomerase inhibierende Wirkstoffvorstufe CPT-11; Beta-Lactamase und Cephalosporin-Doxorubicin; alkalische Phosphatase und Etoposidphosphat; Carboxypeptidase G2 und das Glutaminsäurederivat von Benzoesäure-Senfgas; und Beta-Glucuronidase und das Glucuronid eines jeglichen Wirkstoffs, welcher ein Glucuronid bilden kann, wie p-Hydroxyanilin-Senfgas. Andere Beispiel von abzielenden Enzymen zur Aktivierung von Wirkstoffvorstufen werden diskutiert in Bioconjugate Chem., Bd. 4, (1), 3-9 (1993), und in der US-Patentanmeldung mit der Anmeldenr. 07/182,623 (nicht mehr anhängig zugunsten der Teilanmeldung 08/445,110, welche als US-Patent Nr. 5,851,527 am 22. Dezember 1998 erteilt wurde).
  • Die vorliegende Erfindung zieht auch Farbstoffe in Betracht, die z. B. in fotodynamischer Therapie verwendet werden, und in Verbindung mit geeigneter nicht-ionisierender und ionisierender Strahlung verwendet werden. Einige Isotope wie Y-90 emittieren eine Energie, die mit fotoaktivierenden Mitteln verwendet werden kann. Die Verwendung von Licht und Porphyrinen in Verfahren der vorliegenden Erfindung wird auch in Betracht gezogen, und ihre Verwendung in der Krebstherapie wurde als Übersicht zusammengefasst. van den Bergh, Chemistry in Britain, 22:430-437 (1986).
  • Wie vorstehend diskutiert können Toxine auch in den hierin beschriebenen Verfahren verwendet werden. Toxine, die als Therapeutika verwendbar sind, sind dem Fachmann bekannt und schließen Toxine aus Pflanzen und Bakterien ein, wie Abrin, Alpha-Toxin, Diphtherie-Toxin, Exotoxin, Gelonin, antiviralem Protein der Kermesbeere, Rizin und Saporin. Toxine wie RNAsen können auch verwendet werden; z. B. RNAse aus Frosch-Oozyten, entweder rekombinant hergestellt, kann verwendet werden.
  • Das andere therapeutische Mittel kann getrennt vom Isotop abgegeben werden. Zum Beispiel kann ein radioiodiertes Sav-MAb-Konjugat wie vorstehend beschrieben einem Patienten verabreicht werden. Dann kann wahlweise ein Klärungsmittel eines anti-idiotypischen MAb verabreicht werden, um verbleibendes zirkulierendes radioiodiertes Konjugat zu entfernen. Als nächstes kann ein biotinyliertes Polymer-Wirkstoffkonjugat oder ein Biotin-Toxin-Konjugat in einem dritten Schritt verabreicht werden. Dieses spezielle Protokoll ist bevorzugt zur Verwendung in der Therapie von kleineren Tumoren, Mikrometastasen und selbst Krankheiten mit verteilten einzelnen Zellen, oder minimalen Zellen.
  • Es soll verstanden werden, dass jegliche Kombination der vorstehend beschriebenen therapeutischen Mittel verwendet werden kann. Zum Beispiel können sowohl die ersten als auch die zweiten therapeutischen Mittel Radioisotope sein, das erste therapeutische Mittel kann ein Radioisotop sein und das zweite therapeutische Mittel kann ein Wirkstoff sein, das erste therapeutische Mittel kann ein Wirkstoff sein und das zweite therapeutische Mittel kann ein Radioisotop sein, das erste therapeutische Mittel kann ein Radioisotop sein und das zweite therapeutische Mittel kann ein Toxin sein, das erste therapeutische Mittel kann ein Toxin sein und das zweite therapeutische Mittel kann ein Radioisotop sein, sowohl die ersten als auch die zweiten therapeutischen Mittel können Wirkstoffe sein, oder sowohl die ersten als auch die zweiten therapeutischen Wirkstoffe können Toxine sein.
  • Während die vorstehende Beschreibung die Verwendung von zwei Spezies zum Abzielen und zwei therapeutischen Mitteln lehrt, umfasst die vorliegende Erfindung Ausführungsformen, in denen mehr als zwei abzielende Spezies und/oder therapeutische Mittel verwendet werden. Zum Beispiel können Mischungen von Radiometallen, die verschiedene optimale Bereiche im Gewebe haben, mit dem gleichen Biotin-Chelat in einem einzigen Schritt verwendet werden. Als ein besonderes Beispiel kann eine Mischung der Nuklide Y-90 (optimaler Gewebebereich 28-42 mm), Praseodym-143 (optimaler Gewebebereich 6-11 mm) und Lutetium-177 (optimaler Gewebebereich 1,2-3,0 mm) alle im selben Reaktionsgefäß durch das gleiche Biotin-Chelat (umfassend z. B. DTPA oder makrozyklische DOTA-Derivate) radiomarkiert werden, um Biotin-Chelat-Komplexe mit vergleichbaren physiko-chemischen und biologischen Klärungseigenschaften, die verschiedene Isotope umfassen, zu ergeben. Das Herstellen dieser Konjugate wird erleichtert, weil die meisten Radioisotope, die in der Radioimmuntherapie verwendbar sind, frei von Trägermaterialien erhältlich sind, und viele von diesen sind schwere, trikationische Metalle wie Y-90.
  • Wenn eine Mischung von therapeutischen Mitteln verwendet wird, wird eine Vielzahl von therapeutischen Mitteln an die Tumorstellen abgegeben, wodurche die Vorteile des Verfahrens vergrößert werden. Die Verwendung von Mischungen von Nukliden hat den weiteren Vorteil, dass eine größere Prozentzahl der injizierten biotinylierten Chelate eine nuklidische Ladung an das Tumorziel abgibt.
  • Klärungsmittel
  • Im Stand der Technik bekannte Klärungsmittel können gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel kann, wenn das erste Konjugat Avidin oder Streptavidin umfasst, Biotin als Klärungsmittel verwendet werden. Alternativ können, wenn das erste Konjugat Biotin umfasst, Avidin oder Streptavidin als Klärungsmittel verwendet werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Klärungsmittel ein Antikörper, der die Bindungsstelle der abzielenden Spezies bindet, wobei die abzielende Spezies ein Antikörper, ein Antigen-bindendes Antikörperfragment oder eine nicht-Antikörper abzielende Spezies sein kann. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist das Klärungsmittel ein MAb, der anti-idiotypisch zum MAb des im ersten Schritt verwendeten Konjugats ist, wie in der US-Anmeldung mit der Anmeldenummer 08/486,166 (nicht mehr anhängig) beschrieben. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das Klärungsmittel mit verschiedenen Kohlehydratresten wie Galaktose substituiert, welche es dem Klärungsmittel erlauben, schnell aus dem Kreislauf durch Asialoglykoprotein-Rezeptoren in der Leber entfernt zu werden.
  • In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist das Klärungsmittel ein anti-idiotypischer MAb, der mit Galaktose und einer kleinen Anzahl von Biotinresten substituiert ist. Damit werden verschiedene Zwecke erreicht. Der anti-idiotypische MAb beseitigt das erste Antikörperkonjugat (radioiodiertes MAb-SAv) aus dem Kreislauf, und lagert dies in den Hepatozyten ab. Da der anti-idiotypische MAb an die MAb-Bindungsregion des ersten Antikörpers bindet, entfernt dies nicht das erste Antikörperkonjugat, das schon an den Tumorstellen lokalisiert ist.
  • Die vielfache Galaktosesubstitution stellt eine schnelle Entfernung des anti-idiotypischen MAbs in die Leberhepatozyten sicher, gewöhnlich innerhalb von Minuten. Da der anti-idiotypische MAb galaktosyliert ist und schnell entfernt wird, hat er keine Chance, kompetitiv das erste am Tumor lokalisierte Antikörperkonjugat vom Tumor über die Zeit hinweg zu entfernen. Ausserdem gibt es sehr wenig Myelotoxizität, da fast alle zirkulierende Radioaktivität aus dem Blut entfernt wurde.
  • Die kleine Anzahl an Biotinresten am anti-idiotypischen MAb ist ausreichend, um den Bruchteil des Streptavidins zu blockieren, welcher in die Leber entfernt wird, und verbleibt für eine verlängerte Zeitdauer auf Grund ihrer inhärenten Widerstandsfähigkeit gegenüber Proteasen.
  • Aus der vorstehenden Beschreibung ist offensichtlich, dass die Erfindung vorteilhafter Weise zu den Verfahren zum vorherigen Abzielen und Vervielfältigen, die in den vorstehend zitierten US-Patenten und Patentanmeldungen beschrieben werden, verwendet werden kann. Zum Beispiel kann das erste Antikörperkonjugat ein Polymer umfassen, an das eine Vielzahl von Streptavidin-Komponenten angefügt ist, was eine erhöhte Anzahl von Bindungsstellen für das nachfolgend verabreichte Biotin zum Binden bereitstellt, wie in US-Patent Nr. 5,482,698 beschrieben.
  • Das zweite Konjugat der vorliegenden Erfindung kann ein natürlicherweise vorkommendes Metallionen-chelatierendes Protein umfassen, das die Fähigkeit besitzt, eine Vielzahl von Metallionen pro Protein zu tragen, um die Menge an therapeutischen Mittel aus Metallionen, die an die Tumorstellen abgegeben wird, zu vervielfältigen, wie in der parallelen US-Anmeldung mit der Anmeldenummer 08/409,960 (nun US-Patent Nr. 5,736,119 ) beschrieben.
  • Die vorliegende Offenbarung bietet Vorteile gegenüber vorherigen Verfahren, welche zwei therapeutische Mittel an eine Zielstelle abgeben, unter Verwendung eines Schrittes zum vorherigen Abzielen, gefolgt durch zwei Abgabeschritte. Zum Beispiel hat das Verfahren der vorliegenden Offenbarung den Vorteil, dass jede abzielende Zusammensetzung ein therapeutisches Mittel daran angehängt hat. Dies ist ein Vorteil, da jedes Molekül, das an die Zielstelle abgegeben wird, ein therapeutisches Mittel an die Zielstelle abgibt, und die Therapie an den Stellen vervielfältigt wird. Auch erreicht die vorliegende Offenbarung die Abgabe einer Vielzahl von therapeutischen Mitteln in wenigeren Schritten als durch vorherige Verfahren gebraucht wurden.
  • Die Verwendung des Avidin/Biotin-Bindungspaares gemäß der vorliegenden Offenbarung bietet auch eine Vervielfältigung, die nicht notwendiger Weise durch andere Verfahren erreicht wird. Zum Beispiel hat in der vorliegenden Offenbarung das Avidin des Konjugats des AB-Avidin-therapeutischen Mittels vier Bindungsstellen, die dem Binden durch nachfolgend verabreichte Konjugate von Biotin-therapeutischem Mittel zugänglich sind. Im Gegensatz dazu wird in anderen Verfahren zum vorherigen Abzielen eine der Biotin- Bindungsstellen verwendet, um Avidin an die Zielstelle abzuzielen, z. B. durch Binden an ein Biotin, das vorher an die Zielstelle abgezielt wurde. Dies lässt nur drei Biotin-Bindungsstellen verfügbar zum Binden des nachfolgend verabreichten Biotinkonjugats. Daher erlaubt die vorliegende Offenbarung, dass mehr Konjugat von Biotintherapeutischem Mittel an den Tumorstellen lokalisiert wird.
  • BEISPIELE (NICHT BEANSPRUCHT)
  • Beispiel 1 (Vergleichsbeispiel)
  • Abgezielte doppelte therapeutische Mittel
  • Bevorzugte Ausführungsformen von abgezielten doppelten therapeutischen Mitteln, die unter Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Offenbarung abgegeben werden können, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf die folgenden Systeme:
    • (1) I-131-Antikörper-Biotin, entfernt (und Tumor-avidinyliert) mit neutralisiertem, deglykosyliertem Avidin, und sekundär abgezielt mit Y-90-Chelat-Biotin.
    • (2) I-131-Antikörper-Biotin, entfernt mit einem anti-idiotypischen Antikörper, Tumoravidinyliert mit neutralisiertem, deglykosyliertem Avidin und sekundär abgezielt mit Y-90-Chelat-Biotion.
    • (3) I-131-Antikörper-Streptavidin, entfernt mit einem anti-idiotypischen Antikörper und sekundär abgezielt mit Y-90-Chelat-Biotin.
    • (4) I-131-Antikörper-Streptavidin, entfernt mit einem anti-idiotypischen Antikörper und sekundär abgezielt mit Lu-177-Chelat-Biotion.
    • (5) I-131-Antikörper-Streptavidin, entfernt mit einem anti-idiotypischen Antikörper und sekundär abgezielt mit Camptothecin-Biotin.
    • (6) I-131-Antikörper-Streptavidin, entfernt mit einem anti-idiotypischen Antikörper und sekundär abgezielt mit Onconase-Biotin.
    • (7) I-131-Antikörper-Streptavidin, entfernt mit einem anti-idiotypischen Antikörper und sekundär abgezielt mit dem antiviralen Protein der Kermesbeere-Biotin.
    • (8) I-131-Antikörper-Streptavidin, entfernt mit einem anti-idiotypischen Antikörper und sekundär abgezielt mit Endostatin-Biotin.
    • (9) I-131-Antikörper-Avidin (gegebenenfalls neutralisiert und deglykosyliert), entfernt mit einem anti-idiotypischen Antikörper und sekundär abgezielt mit Gelonin-Biotin.
    • (10) I-131-bispezifischer Antikörper (wie anti-CEA und anti-Y-DOTA-Chelat), entfernt mit einem anti-idiotypischen Antikörper und sekundär abgezielt durch ein Y-90-DOTA-Derivat.
    • (11) I-131-bispezifischer Antikörper (wie anti-CEA und anti-Doxorubicin), entfernt mit einem anti-idiotypischen Antikörper und sekundär abgezielt durch ein Doxorubicin-Analogon.
    • (12) I-131-bispezifischer Antikörper (wie anti-CEA und anti-Ricin-A-Kette), entfernt mit einem anti-idiotypischen Antikörper und sekundär abgezielt durch ein Ricin-A-Analogon.
    • (13) I-131-biotinylierter bispezifischer Antikörper (wie anti-CEA und anti-Y-DOTA-Chelat), entfernt (und am Tumor streptavidinyliert) mit Streptavidin, und sekundär abgezielt durch ein Y-90-DOTA-Biotin.
    • (14) I-131-Antikörper-Avidin (gegebenenfalls neutralisiert und deglykosyliert), entfernt mit einem anti-idiotypischen Antikörper und sekundär abgezielt mit I-125-Antikörper(3)-Biotin.
    • (15) I-131-Antikörper-Avidin (gegebenenfalls neutralisiert und deglykosyliert), entfernt mit einem anti-idiotypischen Antikörper und sekundär abgezielt mit (Y-90-DOTA)8-Dextran-Biotin.
    • (16) I-131-Antikörper-Carboxypeptidase G2, entfernt mit einem anti-idiotypischen Antikörper und sekundär abgezielt mit der Topoisomerase-inhibierenden Wirkstoffvorstufe CPT-11.
    • (17) I-131-Antikörper-Avidin (gegebenenfalls neutralisiert und deglykosyliert), entfernt mit einem anti-idiotypischen Antikörper und sekundär abgezielt mit (10B-Carboran)8-Dextran-Biotin.
  • Der Borzusatz, abgezieltes B-10, wird dann mit thermischen oder epithermischen Neutronen bestrahlt, um den Neutroneneinfang zu starten, und zytotoxische Alpha-Teilchen herzustellen und Kerne abzustoßen. Beispiele von Borzusätzen sind in der parallelen US-Patentanmeldung mit der Anmeldenummer 08/687,626 beschrieben (nun US-Patentnummer 5,846,741, erteilt am 8. Dezember 1998).
  • In allen vorstehend zitierten Ausführungsformen sind wenig oder keine anderen nicht-Zielbindungsstellen im Gewebe zugänglich, auf Grund der Entfernung und Metabolisierung des ersten Konjugats. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das benutzte sekundäre Erkennungssystem dem Körper fremd, der behandelt wird, wodurch unspezifische Bindung minimiert wird, und eine echtere Form von Tumor-spezifischem Abzielen als Ergebnis erhalten wird.
  • Die therapeutischen Mittel können polymer sein. In der vorstehenden Ausführungsform (11) schließen Doxorubicin-Analoga den freien Wirkstoff, Doxorubicin-Dextran-Polymere und Doxorubicin-PEG-Derivate ein. PEG-Derivate der zweiten therapeutischen Mittel sind besonders erwähnenswert, da die Verweilzeit solcher Mittel im Serum genau kontrolliert werden kann, so dass die Mittel eine ausreichende Zeitdauer zirkulieren, um alle vorher abgezielten Tumorstellen zu sättigen.
  • Ausführungsform 13 schließt zwei Erkennungssysteme am zweiten Konjugat ein; d. h. eine Antikörper-basierende und eine Biotin-Steptavidin-basierende Erkennung des Y-90-Therapiemittels.
  • In Ausführungsform (8) ist Endostatin ein Angiogenese-inhibierendes Mittel, ähnlich zu Angiostatin.
  • Ausführungsformen (5) und (11) sind Beispiele zur Verwendung von gewöhnlich erhältlichen anti-Krebswirkstoffen in den offenbarten Verfahren, was ein Vorteil ist, da diese Wirkstoffe in verminderten Mengen verabreicht werden können und damit weniger toxisch sind, verglichen mit der Verabreichung des freien Wirkstoffs alleine. Weiterhin ist die Rezeptorstelle für den Wirkstoff nur am Tumor gegenwärtig, was das Tumor-zu-Gewebe-Lokalisationsverhältnis erhöht. Allgemein kann jeder Standardwirkstoff zur Chemotherapie innerhalb des Umfangs der vorliegenden Offenbarung verwendet werden, aber es ist bevorzugt, dass die hauptsächlichen limitierenden Toxizitäten der zwei therapeutischen Mittel unterschiedlich sind. Zum Beispiel ist Myelosuppression die hautsächlich limitierende Toxizität von Radioimmuntherapie, und sie wird nicht weiter durch die Verwendung von Bleomycin als zweites therapeutisches Mittel erhöht, da seine hauptsächliche limitierende Toxizität die Lungenfibrose ist.
  • Ausführungsform 14, wie in US-Patent Nr. 5,525,338 beschrieben, offenbart die Verwendung von sekundär abzielenden Antikörpern innerhalb von Protokollen zum vorherigen Abzielen. In dieser Ausführungsform wird die Verwendung von Biotin-Avidin-Erkennung ergänzt durch Antikörper(3)-Erkennung des gleichen oder eines verschiedenen Epitops auf der ursprünglichen Zielzelle. Auf ähnliche Weise offenbart Ausführungsform 15, wie in US-Patent Nr. 5,482,698 beschrieben, viele polymere Materialien, welche eine Vervielfältigung des Abzielens ermöglichen.
  • Ausführungsform 16 offenbart eine bevorzugte Ausführungsform, die eine Wirkstoffvorstufe innerhalb des Bereichs der vorliegenden Offenbarung verwendet. Speziell verwendet diese Ausführungsform das relative Fehlen von Toxizität der Wirkstoffvorstufe im Vergleich mit ihrem aktiveren Metaboliten (d. h. SN-38), um weiterhin den Unterschied zwischen toxikologischen Wirkungen zwischen Tumor und normalem Gewebe zu verstärken.
  • Beispiel 2
  • Abzielen auf einen CEA-produzierendem Tumor mit zwei verschiedenen Radionukliden
  • Nacktmäuse, die ungefähr eine Woche alte GW-39 (CEA-produzierende) menschliche Tumor-Xenotransplantate tragen, werden mit einer Injektion eines Y-88-DTPA-MN14 (anti-CEA)-Streptavidin-Radioimmunkonjugats behandelt. Achtundvierzig Stunden später werden die Tiere mit einem fünffachen molaren Überschuss (zum verbleibenden MN-14 im Kreislauf) eines anti-idiotypischen Antikörpers zu MN14 behandelt; WI2. Drei Stunden später werden die Tiere mit Biotin-D-Phe-(Epsilon-In-111-BZ-DPPA)-D-LysNH2 injiziert. Nach Töten und Autopsie werden wichtige Gewebe separat in einem Gamma-Szintillationszähler unter Verwendung von Energiebereichseinstellungen, die für die zwei Radionuklide angemessen sind, gezählt; welche, da sie bei sehr verschiedenen Energien zerfallen, daher gleichzeitig gezählt werden können. 1 zeigt die Prozentzahl ID/g beider Mittel im Tumor zu fortlaufenden Zeitpunkten, während 2 die Tumor-zu-Blut-Verhältnisse für die Reagenzien zeigt. Es wird gefunden, dass die Tumor-zu-Blut-Verhältnisse für das nachfolgend verabreichte Biotin-D-Phe-(Epsilon-In-111-Bz-DTPA)-D-LysNH2 weit über 100:1 innerhalb einer sehr kurzen Zeit reicht. Tumor-zu-Blut-Verhältnisse des Y-88-DTPA-MN14 sind auch um 80-100:1 zu den getesteten Zeitpunkten. Im Vergleich hat Y-88-Streptavidin-MN14 allein (als ein Modell für Standard-Radioimmuntherapie) nur ein 2:1 Tumor-zu-Blut-Verhältnis selbst 72 Stunden nach der Injektion.
  • Beispiel 3
  • Dreischrittige Radioimmuntherapie, die I-125 oder I-131 und Y-90 an Tumorstellen abgibt.
  • In diesem Beispiel wird ein erstes Antikörperkonjugat, das einen anti-Tumor MAb, konjugiert an Streptavidin (SAv) und radiomarkiert mit einem Iodisotop wie I-131 oder I-125, einem Patienten verabreicht.
  • Nach der Zeit für eine maximale Ansammlung im Tumor, z. B. etwa 24 Std. bis etwa 48 Std., wird eine Klärungszusammensetzung umfassend ein Konjugat eines MAbs der antiidiotypisch zum Antikörper des ersten Antikörperkonjugats ist, verabreicht. Dieses Klärungsmittel entfernt das erste Antikörperkonjugat aus dem Kreislauf.
  • Das radioiodierte MAb-SAv, das an den Tumorstellen lokalisiert ist, bleibt dort, wobei es den Tumor im Fall von I-125 über sehr kurze Abstände (Einzelzelldurchmesser), oder über kurze bis mittlere Abstände im Fall von I-131 (optimaler Bereich 0,26 bis 0,5 cm) bestrahlt. Der radioiodierte MAb-SAv, der im Inneren der Leberhapatocyten abgelagert wird, wird metabolisiert und das Radioiod wird freigesetzt und schnell aus dem Patienten ausgeschieden.
  • Dann wird ein Konjugat verabreicht, das ein biotinyliertes Chelat umfasst, das ein radiometallisches therapeutisches Nuklid wie Y-90 als zweites therapeutisches Mittel trägt. Wegen der großen Affinität von Biotin für Streptavidin bindet das Biotin-Chelat-Y-90-Konjugat schnell an den Tumor über die SAv-Komponenten, die an der Tumorstelle während der vorangehenden Schritte lokalisiert wurden. Da das Biotin-Chelat-Y-90- Konjugat eine Spezies von geringem Molekulargewicht ist, wird nicht lokalisiertes Konjugat schnell vom Patienten über den Urin ausgeschieden. Damit wird eine zweite therapeutische Dosis an Radionuklid an die Tumorstelle mit minimaler Myelotoxizität abgegeben.
  • Beispiel 4
  • Dreischrittige Radioimmuntherapie, welche I-131 und P-32 an Tumorstellen abgibt
  • Dieses Beispiel nutzt den Vorteil der therapeutischen Wirkungen von längerlebigen Nukliden und der Tatsache, dass Nuklide, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Offenbarung an Tumorstellen lokalisiert sind, an der Stelle für eine ausgedehnte Zeitdauer bleiben. Dieses Beispiel verdeutlicht auch die Verwendung eines Paares komplementärer Oligonukleotide als Bindungspartner.
  • Im ersten Schritt wird ein radioiodiertes Konjugat eines abzielenden MAbs und ein einzelner Strang eines Oligonukleotids wie Polyguanin verabreicht. Ein galactosylierter anti-idiotypischer MAb wird am Zeitpunkt der maximalen Tumorlokalisation gegeben, um das erste zirkulierende MAb-Konjugat zu entfernen, wie vorstehend diskutiert. Das zweite therapeutische Isotop P-32 wird in der Form eines Enzym-resistenten Phosphorthioatesters, der an den einzelnen Strang eines Oligonukleotids, das komplementär zu dem im ersten Schritt verwendeten ist, gebunden, in diesem Fall Polycytosin.
  • Durch dieses Verfahren werden sowohl I-131 als auch P-32 an die Tumorstellen abgegeben.
  • Beispiel 5
  • Therapie, die einen Wirkstoff und Radioisotop an Tumorstellen abgibt
  • Ein SAv-MAb-Konjugat, das mit vielfachen Wirkstoffkomponenten substituiert ist, wird einem Patienten verabreicht. Während ein Klärungsmittelschritt durchgeführt werden kann, ist er optional. Da das anfängliche Konjugat kein radioaktives Isotop trägt, sollte ein Auslassen des Klärungsschritts keine nachteilige Wirkung auf den Patienten haben.
  • Zum Zeitpunkt der maximalen Ansammlung im Tumor wird ein multi-biotinyliertes Polymer-Lutetium-177-Konjugat gegeben. Das heißt, dass das Konjugat zwei oder mehr Biotinkomponenten umfasst. Dieses letztere Konjugat bindet an das SAv-MAb-Konjugat, das schon an den Tumorstellen lokalisiert ist, vernetzt das SAv-MAb-Konjugat und induziert Apoptose und Internalisierung. Der Tumor wird dann mit dem internalisierten, zurückgehaltenen Lutetium-177-Radionuklid über eine ausgedehnte Zeitdauer bestrahlt, auf Grund der 7-tägigen Halbwertszeit des Nuklids. In einer Abwandlungsform dieses Beispiels wird eine Mischung oder ein „Cocktail" von Isotopen im zweiten Schritt verwendet. Bevorzugt werden Isotope mit verschiedenen wirksamen Bereichen verwendet.
  • Beispiel 6
  • Kombinierte Radioimmuntherapie und Toxin-Immuntherapie unter Verwendung eines dreischrittigen Protokolls
  • Ein mit Iod-131-markiertes Streptavidin-mAB-Konjugat wird einem Patienten durch Injektion verabreicht. Zum Zeitpunkt der maximalen Ansammlung des Konjugats im Tumor wird eine zirkulierende Dosis zum Entfernen eines leicht biotinylierten anti-idiotypischen Antikörpers verabreicht. Dieses Klärungsmittel entfernt nicht-abgezielte Konjugate aus dem Blut und das I-131 wird schnell vom Protein in der Leber katabolisiert und wird ausgeschieden. Konjugat, das an die Tumorstellen abgezielt ist, bleibt an den Tumorstellen für eine ausgedehnte Zeitdauer und bestrahlt die Tumorzellen. Im dritten Schritt wird der Patient mit einem Toxinkonjugat von (Biotin)2-Onconase injiziert. Das Toxin lokalisiert an die Tumorstellen über die vorher abgezielten Streptavidinkomponenten. Die doppelt-biotinylierte Onconase besitzt die Fähigkeit, an das Streptavidin-MAb-Konjugat zu binden und es zu vernetzen, was die Internalisierung des Toxins in die Tumorzellen induziert, welche schon mit I-131 bestrahlt wurden, wodurch eine duale Therapie der Tumorzellen bewirkt wird.
  • Beispiel 7
  • Kombinierte Radioimmuntherapie und Wirkstoffimmuntherapie unter Verwendung eines dreischrittigen Protokolls
  • Ein Iod-131-markiertes Streptavidin-MAb-Konjugat wird einem Patienten durch Injektion verabreicht. Zum Zeitpunkt der maximalen Ansammlung des Konjugats im Tumor wird eine klärende Dosis eines leicht biotinylierten anti-idiotypischen Antikörpers in den Kreislauf verabreicht. Dieses Klärungsmittel entfernt nicht abgezielte Konjugate aus dem Blut und das I-131 wird schnell vom Protein der Leber katabolisiert und wird ausgeschieden. Konjugat, das an die Tumorstellen abgezielt wurde, bleibt an den Tumorstellen für eine ausgedehnte Zeitdauer und bestrahlt die Tumorzellen.
  • Im dritten Schritt wird dem Patient Wirkstoffkonjugat aus (Biotin)2-Dextran(Doxorubicin)10 injiziert. Der Wirkstoff lokalisiert an den Tumorstellen über vorher abgezielte Streptavidinkomponenten. Der doppelt-biotinylierte polymere Wirkstoff besitzt die Fähigkeit, zu binden und das Streptavidin-MAb-Konjugat zu vernetzen, was die Internalisierung des Doxorubicins in die Tumorzellen induziert, welche schon mit I-131 bestrahlt wurden, wodurchi eine duale Therapie der Tumorzellen bewirkt wird.
  • Beispiel 8
  • Zubereitung von poly-∀-Glutaminsäure (SN-38-(-Ester)10
  • Eine Menge von 10 g (2-6,66 × 10–4 Mol) von Poly-∀-Glutaminsäure (15-50 kDalton; Sigma Chemical Company) wird mit 200 mL von trockenem, destillierten Dimethylformamid (DMF) und 3,92 g (1 × 10– 2 Mol) SN-38 gemischt. Mit Hilfe eines Chlorwasserstoff-generierenden Systems (langsames Mischen von Salzsäure und konzentrierter Schwefelsäure und Passieren des sich ergebenden Gases durch konzentrierte Schwefelsäure) wird trockenes Chlorwasserstoffgas zum DMF hinzugefügt, bis ein Gewichtsanstieg von 5 g stattgefunden hat. Die Mischung wird unter Rückfluss für drei Stunden unter Verwendung eines Soxhlet-Extraktors erhitzt, der mit trockenem Magnesiumsulfat gefüllt wird, um Wasser aus dem DMF zu entfernen, bevor es ins Reaktionsgefäß zurückkehrt. Nach dem Abkühlen wird das Produkt, Poly-∀-Glutaminsäure (SN-38-(-Ester)10 in DMF mit einem 10-fachen Überschuss von Diethylether zu DMF behandelt. Der gesammelte Niederschlag wird mit Ether gewaschen, in Wasser aufgenommen, und die wässrige Lösung mit Chloroform extrahiert, um restliches freies SN-38 zu entfernen. Poly-∀-Glutaminsäure (SN-38-(-Ester)10 wird als lyophilisierter Feststoff gesammelt, und das Verhältnis SN-38-zu-Polymer durch Spektrofotometrie bestimmt.
  • Beispiel 9
  • Herstellung von AcLys(DTPA)Glu6 [SN-38]6Lys[DTPA]NH2
  • Das in der Überschrift genannte Peptid wird als eigenständige Einheit unter Verwendung von synthetischen Festphasen-Standardverfahren zubereitet, wodurch der erste an das Harz angeheftete Lysinrest mit einer Allyloxycarbonyl-(Aloc)-Epsilon-Schutzgruppe substituiert ist, und der letzte [N-Terminale] Lysylrest ähnlich an seiner Epsilon-Aminoposition geschützt ist. Der N-Terminus wird beim Abschluss der Kettensynthese acetyliert. Die Glutaminsäure Gamma-Carboxylgruppen werden als Tert-Butyl-Ester während des Peptidaufbaus geschützt. Alpha-Aminogruppen werden unter Verwendung von Fmoc geschützt, und das Peptid wird an der Festphase hergestellt, mit aufeinander folgenden Runden von Fmoc-Entschützung und -Kopplung. Dann werden die zwei-Epsilon Aloc-Gruppen selektiv entfernt. Das teilweise geschützte Peptid wird mit einem Überschuss von Tetra-Tert-Butyl-DTPA über seine freie Carboxylgruppe reagieren gelassen. Schließlich werden die Tert-Butyl-Schutzgruppen jeweils von den Lysyl- und DTPA-Carboxylresten entfernt, und das Peptid wird vom Harz mit Trifluoressigsäure abgespalten. Das freigesetzte Intermediat ist bereit zur Reaktion mit einem geeigneten aktivierten Wirkstoff. SN-38 und das vorstehend genannte Peptid werden zusammen in Toluol reagieren gelassen, unter Verwendung von saurer Katalyse und Dean-Stark-Bedingungen, um AcLys(DTPA)Glu6[SN-38]6Lys[DTPA]NH2 herzustellen, wobei das SN-38 als Ester an die Glutamat-Gamma-Carboxylgruppen des Peptids gebunden ist.
  • Beispiel 10
  • Duale Therapie unter Verwendung eines radiomarkierten bispezifischen Antikörpers und eines Wirkstoff-Polymer-Konjugats
  • Ein Patient mit einem CEA-exprimierenden Tumor wird mit einem I-131-markierten bispezifischen anti-CEA × anti-Camptothecin Antikörper behandelt, welchem ermöglicht wird, auf die CEA-expremierenden Tumorzellen abzuzielen, und im Wesentlichen den Kreislauf und die normalen Gewebe zu verlassen. Wenn dies passiert ist, wird der Patient weiterhin mit dem Konjugat Poly-∀-Glutaminsäure (SN-38-(-Ester)10 behandelt.
  • Es wird einem Fachmann offensichtlich sein, dass verschiedene Modifikationen und Variationen mit den Zusammensetzungen dieser Erfindung gemacht werden können.

Claims (33)

  1. Kit aus Bestandteilen (kit-of-parts) zum Bewirken einer Therapie eines Tumors oder einer infektiösen Krankheit in einem Patienten, umfassend: (A) ein erstes Konjugat umfassend eine abzielende Komponente und ein erstes therapeutisches Mittel, wobei die abzielende Komponente selektiv an eine Markersubstanz, die durch ein Mittel, das den Tumor oder die infektiöse Krankheit verursacht, hergestellt wird oder mit ihm in Verbindung gebracht wird, und an ein Erkennungs-Hapten von niederem Molekulargewicht bindet; (B) gegebenenfalls ein Klärungsmittel; und (C) ein zweites Konjugat umfassend ein nicht-Wirkstoff-Erkennungs-Hapten von niederem Molekulargewicht, an welches das erste Konjugat bindet, und ein zweites therapeutisches Mittel, wobei das zweite therapeutische Mittel gleich oder verschieden ist vom ersten therapeutischen Mittel.
  2. Kit nach Anspruch 1, wobei das erste und zweite therapeutische Mittel ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Radionukliden, Cytokinen, Wirkstoffen, Toxinen und Bor-Zusätzen, bevorzugt Radionuklide, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus P-32, P-33, Sc-47, Cu-64, Cu-67, As-77, Y-90, Ph-105, Pd-109, Ag-111, I-125, Pr-143, Sm-153, Tb-161, Ho-166, Lu-177, Re-186, Re-188, Re-189, Ir-194, Au-199, Pb-212 und Bi-213.
  3. Kit nach Anspruch 2, wobei jedes der Radionuklide verschiedene Niveaus an Strahlung emittiert.
  4. Kit nach Anspruch 1, wobei das erste Konjugat eine abzielende Komponente umfasst, die selektiv an eine Markersubstanz bindet, die durch ein Mittel, das eine infektiöse Krankheit verursacht, hergestellt wird oder mit ihm in Verbindung gebracht wird.
  5. Kit nach Anspruch 2, wobei das zweite therapeutische Mittel ein Cytokin umfasst.
  6. Kit nach Anspruch 2, wobei das erste und zweite therapeutische Mittel Mischungen von mindestens zwei Radionukliden, Wirkstoffen, Toxinen, Cytokinen oder Bor-Zusätzen sind.
  7. Kit nach Anspruch 2, wobei das erste therapeutische Mittel ein Radionuklid ist, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus I-131, I-125 und At-211, und das zweite therapeutische Mittel ein Wirkstoff ist, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Taxol, Stickstoff-Lost-Verbindungen (nitrogen mustards), Ethyleniminderivaten, Alkylsulfonaten, Nitroso-Harnstoffen, Triazenen, Folsäureanaloga, Pyrimidinanaloga, Purinanaloga, Vinca-Alkaloiden, Antibiotika, Enzymen, Platin-Koordinationskomplexen, substituiertem Harnstoff, Methylhydrazinderivaten, adrenokortikalen Suppressiva, Hormonen, Antagonisten, Camptothecin, Calicheamicin und Endostatin, einem Toxin, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Abrin, Alphatoxin, Diphtherietoxin, Exotoxin, Gelonin, antiviralem Protein der Kermesbeere („pokeweed antiviral Protein"), Ricin, Saporin, DNAse und RNAse, einem Cytokin, oder einem Bor-Zusatz.
  8. Kit nach Anspruch 2, wobei das erste therapeutische Mittel ein Wirkstoff oder Toxin ist und das zweite therapeutische Mittel ein Radionuklid oder Bor-Zusatz ist.
  9. Kit nach Anspruch 8, wobei das erste therapeutische Mittel ein Wirkstoff ist und das Wirkstoff ausgewählt aus der Gruppe von Taxol, Stickstoff-Lost-Verbindungen, Ethyleniminderivaten, Alkylsulfonaten, Nitroso-Harnstoffen, Triazenen, Folsäureanaloga, Pyrimidinanaloga, Purinanaloga, Vinca-Alkaloiden, Antibiotika, Enzymen, Platin-Koordinationskomplexen, substituiertem Harnstoff, Methylhydrazinderivaten, adrenokortikalen Suppresiva, Hormonen, Antagonisten, Camptothecin und Endostatin ist.
  10. Kit nach Anspruch 8, wobei das erste therapeutische Mittel ein Toxin ist, und das Toxin ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Abrin, Alphatoxin, Diphtherietoxin, Exotoxin, Gelonin, antiviralem Protein der Kermesbeere, Ricin, Saporin, DNAse und RNAse ist.
  11. Kit nach Anspruch 9, wobei das zweite therapeutische Mittel ein Radionuklid ist, und das Radionuklid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus P-32, P-33, Sc-47, Cu-64, Cu-67, As-77, Y-90, Ph-105, Pd-109, Ag-111, I-125, I-131, Pr-143, Sm-153, Tb- 161, Ho-166, Lu-177, Re-186, Re-188, Re-189, Ir-194, Au-199, At-211, Pb-212 und Bi-213, oder wobei das zweite therapeutische Mittel ein Bor-Zusatz ist.
  12. Kit nach Anspruch 10, wobei das zweite therapeutische Mittel ein Radionuklid ist das Radionuklid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus P-32, P-33, Sc-47, Cu-64, Cu-67, As-77, Y-90, Ph-105, Pd-109, Ag-111, I-125, I-131, Pr-143, Sm-153, Tb-161, Ho-166, Lu-177, Re-186, Re-188, Re-189, Ir-194, Au-199, At-211, Pb-212 und Bi-213, oder wobei das zweite therapeutische Mittel ein Bor-Zusatz ist.
  13. Kit nach Anspruch 1, wobei die abzielende Komponente einen Antikörper umfasst.
  14. Kit nach Anspruch 13, wobei der Antikörper ein bispezifischer Antikörper ist, der die Fähigkeit besitzt, spezifisch an mindestens ein Epitop auf der Markersubstanz und an das Erkennungs-Hapten von niederem Molekulargewicht zu binden.
  15. Kit nach Anspruch 14, wobei der Antikörper multivalent ist.
  16. Kit nach Anspruch 15, wobei der Antikörper gegen mehrere verschiedene Antigene auf dem Tumor oder mehrere verschiedene Epitope auf dem gleichen Antigen auf dem Tumor zielgerichtet ist.
  17. Kit nach Anspruch 1, wobei die abzielende Komponente ein Antigen-bindendes Antikörperfragment umfasst.
  18. Kit nach Anspruch 17, wobei die abzielende Komponente die Fähigkeit besitzt, spezifisch an mindestens ein Epitop auf der Markersubstanz und an das Erkennungs-Hapten von niederem Molekulargewicht zu binden.
  19. Kit nach Anspruch 17, wobei die abzielende Komponente multivalent ist.
  20. Kit nach Anspruch 19, wobei die abzielende Komponente gegen mehrere verschiedene Antigene auf dem Tumor oder mehrere verschiedene Epitope auf dem gleichen Antigen abzielt.
  21. Kit nach Anspruch 1, wobei das Klärungsmittel anti-idiotypisch zur abzielenden Komponente des ersten Konjugats ist.
  22. Kit nach Anspruch 21, wobei der anti-idiotypische monoklonale Antikörper mit Galaktose und Biotinresten substituiert ist.
  23. Kit nach Anspruch 1, wobei die ersten und zweiten Konjugate Radionuklide enthalten, die verschiedene Niveaus an Strahlung emittieren.
  24. Kit nach Anspruch 1, wobei das erste therapeutische Mittel einen bispezifischen Antikörper oder Antikörperfragment und ein Cytokin umfasst.
  25. Kit nach Anspruch 24, wobei das zweite therapeutische Mittel ein Radionuklid umfasst.
  26. Kit nach Anspruch 1, wobei das erste therapeutische Mittel einen bispezifischen Antikörper oder Antikörperfragment und ein Radionuklid umfasst.
  27. Kit nach Anspruch 26, wobei das zweite therapeutische Mittel ein Cytokin umfasst.
  28. Kit nach Anspruch 1, wobei das zweite therapeutische Mittel ein Wirkstoff-Polymer-Konjugat, ein PEG-Wirkstoff-Konjugat oder ein Wirkstoff-Liposom-Konjugat umfasst.
  29. Kit nach Anspruch 1, wobei die abzielende Komponente einen bispezifischen Antikörper umfasst, der gegen ein freies Chelat oder einen Metallkomplex eines Chelats reaktiv ist.
  30. Kit nach Anspruch 29, wobei das Chelat DOTA, DTPA, HBED, oder HSG ist.
  31. Kit nach Anspruch 1, wobei das Erkennungs-Hapten von niederem Molekulargewicht eines ist, das normalerweise nicht in vivo vorhanden ist, eine Histamin-Succinat-Komponente enthält, ein Fluoresceinderivat ist, ein 2,4-Dinitrophenylderivat ist, oder Vitamin B-12 ist.
  32. Verwendung von (A) einem ersten Konjugat umfassend eine abzielende Komponente und ein erstes therapeutisches Mittel, wobei die abzielende Komponente selektiv an eine Markersubstanz, die durch ein Mittel, das den Tumor oder die infektiöse Krankheit verursacht, hergestellt wird oder mit ihm in Verbindung gebracht wird, und an ein Erkennungs-Hapten von niederem Molekulargewicht bindet, und (B) gegebenenfalls einem Klärungsmittel, und (C) einem zweiten Konjugat, umfassend ein nicht-Wirkstoff Erkennungs-Hapten von niederem Molekulargewicht, an welches das erste Konjugat bindet, und ein zweites therapeutisches Mittel, wobei das zweite therapeutische Mittel gleich oder verschieden ist vom ersten therapeutischen Mittel, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Bewirken einer Therapie eines Tumors oder einer infektiösen Krankheit in einem Patienten, wobei (C) nach (A) zu verabreichen ist.
  33. Verwendung nach Anspruch 32, wobei (A), (B) und (C) wie in einem beliebigen der Ansprüche 2 bis 31 definiert sind.
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