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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein spezifisches Bindungsanalyseverfahren,
bzw. auf ein Verfahren zur Analyse einer spezifischen Bindung, für die Durchführung einer
qualitativen oder quantitativen Analyse eines Analyts in einer Probe.
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Mit
der jüngsten
Ausweitung der medizinischen Betreuung in Haushalten und Kommunen
sowie durch den Anstieg von klinischen Untersuchungen, die hohe
Eile erfordern, gibt es eine ansteigende Nachfrage für die Entwicklung
eines spezifischen Bindungsanalyseverfahrens, welches durch andere Personen
als den Experten für
die klinische Untersuchung in einer schnellen, einfachen und genauen
Art und Weise durchgeführt
werden kann.
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Viele
Verfahren sind als eine herkömmliche spezifische
Bindungsanalyse bekannt, welche eine Immununtersuchung unter Nutzung
einer Antigen-Antikörperreaktion,
eine Rezeptoruntersuchung mit einem Rezeptor und eine Nukleinsäureuntersuchung
mit dem Hybridisierung von komplementären Nukleinsäuresequenzen
enthält.
Aufgrund ihrer hohen Spezifität
werden diese Verfahren weithin in den klinischen Untersuchungen
und in vielen anderen Gebieten genutzt.
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Bei
der Chromatographie, welche eine Art von Immununtersuchung ist,
wird eine flüssige
Probe in Kontakt mit einer Matrix gebracht, die zum Beispiel einen
porösen
Träger
oder einen mit feinen Teilchen bepackten Träger umfasst, wobei in jedem
davon eine spezifische Bindungssubstanz unlöslich gemacht oder immobilisiert
bzw. festgelegt wird. Dann wird die Anwesenheit oder Abwesenheit
eines Analyts in der Probe durch Nutzung eines Phänomens analysiert,
bei welchem die flüssige
Probe entlang der Matrix durch die durch Kapillarität verursachte Permeations-
bzw. Durchdringungskraft fließt (siehe zum
Beispiel japanische Patente Nr. 2504923 und 2667793, japanische
geprüfte
Patentveröffentlichung Nr.
Hei 7-78503, japanische
ungeprüfte
Patentveröffentlichungen
Nr. Hei 10-73592 und Hei 8-240591).
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Konkret
wird eine spezifische Bindungssubstanz, welche mit einem Markierungsmaterial
markiert ist, das frei durch das bloße Auge oder mit einem optischen
Verfahren nachweisbar ist, spezifisch an ein Analyt gebunden. Die
spezifische Bindungssubstanz, die spezifisch an das Analyt gebunden
ist, wird dann an ein Bindungsmaterial gebunden, das auf der Matrix
immobilisiert ist. Schließlich
wird die Anwesenheit oder Abwesenheit des Analyts in der Probe gemäß der markierten
Menge der auf der Matrix immobilisierten spezifischen Bindungssubstanz
analysiert.
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Der
Träger
mit der Matrix, der für
eine derartige Chromatographie verwendet wird, hat eine große Oberfläche, auf
der eine große
Menge einer spezifischen Bindungssubstanz immobilisiert werden kann, so
dass das Zusammentreffen von miteinander reagierenden Molekülen, welches
eine spezifische Bindungsreaktion verursachen kann, in einer höheren Frequenz
als im Vergleich mit einer Reaktion in einer flüssigen Phase auftreten kann.
Demgemäß ist die vorher
beschriebene Chromatographie vorteilhaft vom Standpunkt der Messempfindlichkeit
und der Messzeit.
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Jedoch
hat die herkömmliche
Chromatographie ein Problem, das Prozonenphänomen genannt wird. Das Prozonenphänomen ist
ein Phänomen,
bei welchem die Konzentration eines Analyts nicht unzweifelhaft
aus einer Signalintensität
bestimmt werden kann, die einer spezifischen Bindungsreaktion eigen
ist.
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Genauer
ausgedrückt,
wenn eine überschüssige Menge
eines Analyts in einer Probe vorhanden ist, ist auf einer Matrix
ein spezifisch an eine markierte spezifische Bindungssubstanz gebundenes
Analyt vorhanden (ein Komplex aus Markierungsmaterial-spezifischer
Bindungssubstanz-Analyt), und Analyt ist vorhanden, das nicht an
die markierte spezifische Bindungssubstanz gebunden ist (eine einfache
Substanz).
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Das
an die markierte spezifische Bindungssubstanz gebundene Analyt und
das Analyt als die einfache Substanz konkurrieren darum, spezifisch mit
einem auf der Matrix immobilisierten Bindungsmaterial zu binden.
Daher gibt es einen Fall, wo das Analyt als die einfache Substanz
unerwünscht
an das Bindungsmaterial gebunden ist, und das an die markierte spezifische
Bindungssubstanz gebundene Analyt fließt aufgrund der Durchdringungskraft
verursacht durch Kapillarität
heraus. Dies resultiert in einer reduzierten Menge der markierten
spezifischen Bindungssubstanz, die an das Bindungsmaterial gebunden
ist, so dass die der spezifischen Bindungsreaktion der spezifischen
Bindungssubstanz eigene Signalintensität nicht der Menge des Analyts
entspricht, die in der Probe enthalten ist.
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Daher
wird, wenn eine überschüssige Menge
eines Analyts in einer Probe vorhanden ist, die von der markierten
Menge der spezifischen Bindungssubstanz bestimmte Analytmenge als
unnormal klein gemessen, wodurch in einigen Fällen eine genaue Bestimmung
der Anwesenheit oder Abwesenheit des Analyts in der Probe verhindert
wird.
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Um
genau die Menge eines Analyts ohne eine Beeinflussung durch das
Prozonenphänomen zu
bestimmen, wurde ein Verfahren zur Bestätigung der Anwesenheit oder
Abwesenheit eines Analyts in einer hohen Konzentration vorgeschlagen,
mit Verdünnen
in verschiedene Konzentrationen und Messung der Signale der entsprechenden
Proben zu mehreren Zeiten. Jedoch erfordert dieses Verfahren die
Verwendung einer Mehrzahl von Reaktionsgefäßen und macht daher die Messschritte
kompliziert, was in einem Problem des Anstiegs der Größe und der
Komplexität
der Analysevorrichtung resultiert.
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Daher
ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein spezifisches
Bindungsanalyseverfahren zur Verfügung zu stellen, welches genaue
qualitative und quantitative Analysen eines Analyts in einer Probe
ermöglicht,
ohne durch das Prozonenphänomen
beeinflusst zu werden, selbst bei der Verwendung einer kleinen,
einfachen Messvorrichtung, und eine spezifische Bindungsanalysevorrichtung
vorzusehen, die dafür verwendet
wird. Gemäß der vorliegenden
Erfindung ist die Messgenauigkeit hoch, insbesondere in einem niedrigen
Konzentrationsbereich, da ein Komplex aus Markierungsmaterial, der ersten
spezifischen Bindungssubstanz und dem Analyt in einer Nachweiszone
immobilisiert ist, in der eine zweite spezifische Bindungssubstanz
immobilisiert ist, und eine quantitative Analyse wird aufgrund der Intensität eines
Signals in der ersten Nachweiszone durchgeführt.
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KURZE ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein spezifisches Bindungsanalyseverfahren
mit den Schritten von:
- (A) In Kontakt bringen
einer Probe, die ein Analyt enthält,
mit einer ersten spezifischen Bindungssubstanz, welche spezifisch
an das Analyt bindet und mit einem nachweisbaren Markierungsmaterial
markiert ist, um es dem Analyt zu ermöglichen, an die erste spezifische
Bindungssubstanz zu binden, wodurch ein Komplex aus dem Markierungsmaterial,
der ersten spezifischen Bindungssubstanz und dem Analyt erhalten
wird;
- (B) In Kontakt bringen der dem Schritt (A) unterzogenen Probe
mit einer ersten Nachweiszone, in der eine zweite spezifische Bindungssubstanz
immobilisiert ist, um es einem Überschuss
des Analyts, der nicht an die erste spezifische Bindungssubstanz
gebunden wurde, zu ermöglichen,
an die zweite spezifische Bindungssubstanz zu binden, wodurch der Überschuss
des Analyts und der Komplex in der ersten Nachweiszone immobilisiert
werden;
- (C) In Kontakt bringen der dem Schritt (B) unterzogenen Probe
mit einer zweiten Nachweiszone, in der eine mit dem Analyt identische
Substanz oder ein Analogon des Analyts immobilisiert ist, um es
der ersten spezifischen Bindungssubstanz in dem Komplex zu ermöglichen,
an die Substanz oder das Analogon zu binden, wodurch der Komplex
in der zweiten Nachweiszone immobilisiert wird;
- (D) Entsprechende Messung einer Intensität des Signals 1 und
einer Intensität
des Signals 2, welche auf das Markierungsmaterial zurückzuführen sind
und in der ersten Nachweiszone und der zweiten Nachweiszone erhalten
werden; und
- (E) Bestimmen einer Konzentration des Analyts in der Probe auf
der Grundlage der Intensität
des Signals 1 und der Intensität des Signals 2, wodurch eine
qualitative oder quantitative Analyse des Analyts in der Probe durchgeführt wird.
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Es
ist bevorzugt, dass in dem Schritt (E), wenn die Intensität des in
Schritt (D) erhaltenen Signals 1 unterschiedlichen Konzentrationen
des Analyts auf der Grundlage von einer früher erhaltenen Information
einer Probe, die eine bekannte Konzentration hat, entspricht, eine
Konzentration des Analyts bestimmt wird, nachdem auf der Grundlage
der Intensität
des Signals 2 entschieden wurde, welche Konzentration richtig
ist.
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Es
ist bevorzugt, dass das vorher beschriebene spezifische Bindungsanalyseverfahren
zusätzlich
die Entscheidung umfasst, ob auf der Grundlage der Intensität des in
Schritt (D) erhaltenen Signals 2 ein Prozonenphänomen vorhanden
ist, oder nicht.
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Es
ist bevorzugt, dass in dem Schritt (B), die dem Schritt (A) unterzogene
Probe mit einer ersten Nachweiszone in Kontakt gebracht wird, in
der eine zweite spezifische Bindungssubstanz immobilisiert ist,
um es einem Überschuss
des Analyts, welcher nicht an die erste spezifische Bindungssubstanz
gebunden wurde, und dem Komplex zu ermöglichen, an die zweite spezifische
Bindungssubstanz zu binden, wodurch der Überschuss des Analyts und der
Komplex in der ersten Nachweiszone immobilisiert werden, und in
dem Schritt (C) die Probe, die dem Schritt (B) unterzogen wurde,
in Kontakt mit einer zweiten Nachweiszone gebracht wird, in der
eine mit dem Analyt identische Substanz oder ein Analogon des Analyts
immobilisiert ist, um es der ersten spezifischen Bindungssubstanz
in dem Komplex ermöglicht,
an die Substanz oder das Analogon zu binden, wodurch der Komplex
in der zweiten Nachweiszone immobilisiert wird, wobei der Schritt
(C) nach dem Schritt (B) durchgeführt wird.
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Es
ist ebenso bevorzugt, dass in dem Schritt (C) die Probe, die dem
Schritt (A) unterzogen wurde, in Kontakt mit einer zweiten Nachweiszone
gebracht wird, in der eine Substanz, die mit dem Analyt identisch
ist oder ein Analogon des Analyts ist, immobilisiert ist, um es
der ersten spezifischen Bindungssubstanz in dem Komplex zu ermöglichen,
an die Substanz oder das Analogon zu binden, wodurch der Komplex
in der zweiten Nachweiszone immobilisiert wird, und in dem Schritt
(B) die Probe, die dem Schritt (C) unterzogen wurde, in Kontakt
mit der ersten Nachweiszone gebracht wird, in der eine zweite spezifische
Bindungssubstanz immobilisiert ist, um es dem Überschuss des Analyts, welcher
nicht an die erste spezifische Bindungssubstanz gebunden wurde,
und dem Komplex zu ermöglichen,
an die zweite spezifische Bindungssubstanz zu binden, wodurch der Überschuss
des Analyts und der Komplex in der ersten spezifischen Bindungszone
immobilisiert werden, wobei der Schritt (B) nach dem Schritt (C)
durchgeführt
wird.
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Es
ist ebenfalls bevorzugt, dass nachdem vorher der Schritt (A) durchgeführt und
die erste und die zweite Nachweiszone auf einer blattförmigen Chromatographiematrix
vorgesehen werden, die Probe, die Schritt (A) unterzogen wurde,
stromaufwärts
der ersten Nachweiszone und der zweiten Nachweiszone auf getropft
wird, um es der Probe durch die durch Kapillarität verursachte Durchdringungs-
bzw. Permeationskraft zu ermöglichen,
zu jeder der ersten Nachweiszone und der zweiten Nachweiszone auf
der Matrix zu migrieren bzw. zu wandern, gefolgt von der Durchführung der
Schritte (B) bis (E).
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Außerdem ist
es bevorzugt, dass nach Vorsehen einer Retentionszone, in der eine
erste spezifische Bindungssubstanz, die mit einem nachweisbaren
Markierungsmaterial markiert ist, aufbewahrt wird, und der ersten
Nachweiszone und der zweiten Nachweiszone auf einer blattförmigen Chromatographiematrix,
die Probe auf die Retentionszone oder stromaufwärts davon aufgetropft wird,
um es der Probe durch die durch Kapillarität verursachte Durchdringungskraft
zu ermöglichen,
zu jeder der Retentionszone, der ersten Nachweiszone und der zweiten Nachweiszone
auf der Matrix zu migrieren, gefolgt von der Durchführung der
Schritte (A) bis (E).
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Es
ist bevorzugt, dass das Signal, das dem Markierungsmaterial eigen
ist, ein Signal ist, das eine Färbung,
eine Fluoreszenz oder eine Lumineszenz aufweist.
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Es
ist bevorzugt, dass wenigstens eine der ersten und der zweiten spezifischen
Bindungssubstanzen ein Antikörper
ist.
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Es
ist bevorzugt, dass das Markierungsmaterial ein Teilchen ist, das
ein Metall-Sol, ein Farbstoff-Sol oder eine fluoreszierende Substanz
oder ein gefärbtes
Latexteilchen enthält.
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Es
ist ebenfalls bevorzugt, dass in dem Schritt (D) die Intensität des Signals 1 und
die Intensität
des Signals 2 kontinuierlich in der Reihenfolge entlang
der Wanderungs- bzw. Migrationsrichtung des Analyts gemessen werden.
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Es
ist bevorzugt, dass in dem Schritt (D) eine grafische Darstellung
erzeugt wird, die die Beziehung zwischen einer Position des Analyts
in dessen Wanderungsrichtung und jeder der Intensitäten des
Signals 1 und des Signals 2, die jeweils kontinuierlich gemessen
werden, zeigt, und wobei in dem Schritt (E) eine qualitative oder
quantitative Analyse auf der Grundlage der grafischen Darstellung
durchgeführt wird.
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Die
hierin verwendete graphische Darstellung bezieht sich entweder auf
eine lineare Linie oder eine gekrümmte Linie.
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Es
ist bevorzugt, dass in dem Schritt (E) eine quantitative Analyse
auf der Grundlage einer quantitativen Information, die vorher von
einer Probe, die eine bekannte Konzentration eines Analyts hat,
erhalten wurde, sowohl für
die Intensität
des Signals 1 als auch die Intensität des Signals 2, die
jeweils in Schritt (D) erhalten wurden, durchgeführt wird.
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Außerdem stellt
die vorliegende Erfindung eine spezifische Bindungsanalysevorrichtung
zur Verfügung,
die umfasst:
eine blattförmige
Chromatographiematrix;
eine erste Nachweiszone, in der eine
spezifische Bindungssubstanz, welche spezifisch an ein Analyt bindet,
immobilisiert ist;
eine zweite Nachweiszone, in der eine Substanz,
die zu dem Analyt identisch ist, oder ein Analogon des Analyts,
immobilisiert ist, wobei jeder der ersten Nachweiszone und der zweiten
Nachweiszone auf der Matrix zur Verfügung gestellt werden,
wobei
die Vorrichtung so angepasst ist, dass eine Probe, die ein Analyt
und eine spezifische Bindungssubstanz enthält, durch die durch Kapillarität verursachte
Durchdringungskraft zu jeder der ersten Nachweiszone und der zweiten
Nachweiszone wandert, um eine spezifische Bindungsreaktion zu verursachen,
und ein Signal, das auf die spezifische Bindungsreaktion zurückzuführen ist,
nachgewiesen wird, um eine qualitative oder quantitative Analyse des
Analyts in der Probe durchzuführen.
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Es
ist bevorzugt, dass die vorgeschriebene spezifische Bindungsanalysevorrichtung
zusätzlich eine
Retentionszone aufweist, in der eine spezifische Bindungssubstanz,
die mit einem nachweisbaren Markierungsmaterial markiert wurde,
zurückgehalten wird,
wobei die Retentionszone stromaufwärts der ersten Nachweiszone
auf der Matrix vorgesehen ist, wobei die Vorrichtung so angepasst
ist, dass die Probe durch die durch Kapillarität verursachte Durchdringungskraft
von der Retentionszone zu jeder der ersten Nachweiszone und der
zweiten Nachweiszone wandert.
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Es
ist ebenfalls bevorzugt, dass die vorher beschriebene spezifische
Bindungsanalysevorrichtung zusätzlich
eine Probenapplikationszone enthält, die
stromaufwärts
der Retentionszone auf der Matrix vorgesehen ist, wobei die Vorrichtung
so angepasst ist, dass die Probe durch die durch Kapillarität verursachte
Durchdringungskraft von der Probenapplikationszone zu jeder der
Retentionszone, der ersten Nachweiszone und der zweiten Nachweiszone
wandert.
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Es
ist ebenfalls bevorzugt, dass die vorher beschriebene spezifische
Bindungsanalysevorrichtung zusätzlich
eine Probenapplikationszone enthält, die
stromaufwärts
der ersten Nachweiszone auf der Matrix angebracht ist, wobei die
Vorrichtung so angepasst ist, das die Probe, durch die durch Kapillarität verursachte
Durchdringungskraft von der Probenapplikationszone zu jeder der
ersten und der zweiten Nachweiszone wandert.
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Während die
neuen Merkmale der Erfindung insbesondere in den beigefügten Ansprüchen festgelegt
werden, wird die Erfindung, sowohl bezüglich ihrer Organisation als
auch ihres Inhalts zusammen mit ihren anderen Aufgaben und Merkmalen,
aus der folgenden ausführlichen
Beschreibung im Zusammenhang mit den Zeichnungen besser verstanden
und eingeschätzt
werden.
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KURZE BESCHREIBUNG DER
VERSCHIEDENEN ANSICHTEN DER ZEICHNUNG
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Die 1 ist
eine schematische Schrägansicht
einer Ausführungsform
eines Testreagenzstreifens, der in dem spezifischen Bindungsanalyseverfahren
der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
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Die 2 ist
ein schematisches Diagramm, das die Struktur einer Ausführungsform
einer Analysevorrichtung zeigt, die in dem spezifischen Bindungsanalyseverfahren
der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
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Die 3 ist
ein schematisches Diagramm, das die Verteilung der mit der in der 2 gezeigten Analysevorrichtung
nachgewiesenen Verteilung der Signalintensität in einer ersten Nachweiszone 5 eines
Streifens 1 zeigt.
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Die 4 ist
ein schematisches Diagramm, das die Verteilung der mit der in der 2 gemessenen
Verteilung der Signalintensität
in einer zweiten Nachweiszone 6 des Streifens 1 zeigt.
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Die 5 ist
eine graphische Darstellung, die die Relation zwischen der Signalintensität Hs und der
hCG-Konzentration
in dem Fall zeigt, in dem Licht mit einer Wellenlänge von
650 nm auf die erste Nachweiszone 5 gestrahlt wird.
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Die 6 ist
eine graphische Darstellung, die die Relation zwischen der Signalintensität Hs und der
hCG- Konzentration
in dem Fall zeigt, in dem Licht mit einer Wellenlänge von
650 nm auf die zweite Nachweiszone 6 gestrahlt wird.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Zunächst wird
das spezifische Bindungsanalyseverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung
mit Bezugnahme auf die Zeichnungen beschrieben. Die 1 ist
eine schematische Schrägansicht
eines Teststreifens, welcher als eine spezifische Bindungsanalysevorrichtung
in dem spezifischen Bindungsanalyseverfahren der vorliegenden Erfindung
verwendet werden kann.
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Ein
Teststreifen 1 ist ein blattförmiger Teststreifen, zum Beispiel
ein Chromatographieteststreifen mit einer Matrix 2, welche
ein Bereich ist, wo eine Probe mit einem Analyt durchdringen und
sich entwickeln kann, die auf der Oberfläche davon gebildet wird. Der
Streifen 1 umfasst zum Beispiel einen porösen Träger oder
einen mit feinen Teilchen bepackten Träger, wobei in jedem davon die
Probe durch die Kapillarität
durch dringen und sich entwickeln kann.
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Auf
der Matrix 2 sind eine Probenapplikationszone 3,
eine Retentionszone 4, eine erste Nachweiszone 5 und
eine zweite Nachweiszone 6 angeordnet. Die Probenapplikationszone 3 ist
ein Bereich, in der die Probe auf die Matrix 2 aufgebracht
wird. Die Retentionszone 4 wird zwischen der Probenapplikationszone 3 und
einem Bereich einschließlich
der ersten Nachweiszone 5 und der zweiten Nachweiszone 6 angeordnet.
Die Retentionszone 4 ist ein Bereich, in dem die auftragende
Probe einfließt
und eine erste spezifische Bindungssubstanz vorgesehen ist, die mit
einem Markierungsmaterial markiert ist. Die erste Nachweiszone 5 ist
ein Bereich, in dem die Probe, die durch die Retentionszone 4 durchgetreten
ist, einfließt
und eine zweite spezifische Bindungssubstanz als ein Bindungsmaterial
immobilisiert ist. Die zweite Nachweiszone 6 ist ein Bereich,
in dem die Probe, die die Retentionszone 4 passiert hat,
anschließend durch
die erste Nachweiszone 5 einfließt und in dem ein Analyt oder
ein Analog davon immobilisiert ist.
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Hierbei
ist die in dem erfindungsgemäßen spezifischen
Bindungsanalyseverfahren verwendete Probe eine flüssige Probe,
von der angenommen wird, dass sie ein Analyt enthält. Beispiele
schließen Urin,
Blutserum, Blutplasma, Vollblut, Speichel, Lacrimalflüssigkeit,
Spinalflüssigkeit
und Sekrete aus den Papillen ein. Die Probe kann ebenfalls eine
sein, die durch Suspension oder Lösung einer festen Substanz,
einer gelförmigen
Substanz oder einer Sol-Substanz des Mucus, von menschlichem Körpergewebe,
Zellen oder ähnlichem
in einer Flüssigkeit, wie
etwa einer Pufferlösung,
einer Extraktionslösung oder
einer verdünnten
Lösung
hergestellt wird.
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Das
in der vorliegenden Erfindung verwendete Analyt kann jede Substanz
mit einem spezifischen Bindungspartner sein, die spezifisch daran binden
kann. Beispiele enthalten verschiedene Proteine, Polypeptide, Glycoproteine,
Polysaccharide, komplexe Glycolipide, Nukleinsäuren, Effektor-Moleküle, Rezeptor-Moleküle, Enzyme
und Inhibitoren, welche jeweils als ein Antikörper oder Antigen funktionieren.
Spezifischere Beispiele enthalten: Tumormarker, wie etwa das α-Fetoprotein,
das carcinoembryonische Antigen (CEA), CA 125 und CA 19-9; verschiedene
Proteine, Glycoproteine oder komplexe Glycolipide, wie etwa β2-Microglobulin
(β2m) und Ferritin;
verschiedene Hormone, wie etwa Estradiol (E2), Estriol (E3), humanes
Choriongonadotropin (hCG), lutinisierendes Hormon (LH) und humanes plazentales
Lactogen (hPL); verschiedene Virus-assoziierte Antigene oder Virus-assoziierte
Antikörper, wie
etwa HBs-Antigen, HBs-Antikörper,
HBc-Antigen, HBc-Antikörper,
HCV-Antikörper
und HIV-Antikörper; verschiedene
Allergene und deren IgE-Antikörper; Betäubungsmittel,
Arzneimittel und Metabolite davon; und Virus-assoziierte und Tumor-assoziierte
Nucleinsäuren
mit einer Polynucleotidsequenz.
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Die
in der vorliegenden Erfindung verwendete spezifische Bindungssubstanz
kann jede Substanz sein, die spezifisch an die vorher beschriebenen
Analyte binden kann. Beispiele enthalten Antikörper, Antigene, Glycoproteine,
Polysaccharide, komplexe Glycolipide, Nukleinsäuren, Effektor-Moleküle, Rezeptor-Moleküle, Enzyme
und Inhibitoren.
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In
der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass die erste spezifische
Bindungssubstanz, die mit einem Markierungsmaterial markiert ist,
und die zweite spezifische Bindungssubstanz eingesetzt werden, und
dass die markierte erste spezifische Bindungssubstanz und die zweite
spezifische Bindungssubstanz über
das Analyt miteinander binden können.
Zusätzlich,
für eine
hohe Spezifität,
wird wenigstens eine der ersten spezifischen Bindungssubstanz und
der zweiten spezifischen Bindungssubstanz bevorzugt ein Antikörper und
bevorzugter ein monoklonaler Antikörper sein.
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Hierbei
können
die erste spezifische Bindungssubstanz und die zweite spezifische
Bindungssubstanz nicht unbedingt die gleichen Substanzen sein. Zusätzlich,
wenn das Analyt keine Vielzahl von gleichen Epitopen hat, ist es
bevorzugt, dass die erste spezifische Bindungssubstanz und die zweite
spezifische Bindungssubstanz verschiedene Spezifitäten gegen
entsprechende unterschiedliche Epitope haben. Natürlich kann,
wenn das Analyt eine Vielzahl gleicher Epitope hat, gleiche Substanzen
als die erste spezifische Bindungssubstanz und die zweite spezifische
Bindungssubstanz verwendet werden.
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Die
in der zweiten Nachweiszone 6 zu immobilisierende Substanz
kann das Analyt selbst oder ein Analog davon sein, dass das gleiche
Verhalten wie das Analyt aufweist. In anderen Worten, kann jede Substanz
verwendet werden, die an die mit einem Markierungsmaterial markierte
erste spezifische Bindungssubstanz binden kann. Zum Beispiel kann ebenfalls
eine Substanz mit dem gleichen Epitop wie das des an die erste spezifische
Bindungssubstanz zu bindenden Analyts verwendet werden.
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Das
in der vorliegenden Erfindung zu verwendende Markierungsmaterial
kann jede Substanz sein, deren Anwesenheit frei nachgewiesen werden kann.
Beispiele enthalten nicht nur eine direkte Markierung, etwa ein
Markierungsmaterial, das dem bloßen Auge in einem natürlichen
Zustand sichtbar ist, einem Markierungsmaterial, das mit der Verwendung eines
optischen Filters sichtbar ist, oder ein Markierungsmaterial, das
sichtbar ist, wenn es durch ultraviolette Strahlung oder ähnliches
angeregt wird, um seine Fluoreszenz zu fördern, sondern ebenfalls eine indirekte
Markierung, wie etwa ein Markierungsmaterial, dessen sichtbares
Signal durch Zugabe davon mit einem Entwicklungsmittel, wie etwa
einem Substrat, nachweisbar ist.
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Beispiele
der direkten Markierung enthalten feine gefärbte Teilchen, wie etwa Farbstoff-Sole,
Metall-Sole oder gefärbte
Latexteilchen, und Teilchen mit einer fluoreszierenden Substanz.
Auf der anderen Seite enthalten Beispiele der indirekten Markierung
Enzyme, wie etwa alkalische Phosphatase und Meerrettichperoxidase.
Die direkte Markierung kann bevorzugt verwendet werden, da sie ein
Signal erzeugt, das ohne Zugabe eines zusätzlichen Reagenzes nachgewiesen
werden kann, und dadurch umgehend ein analytisches Signal zur Verfügung stellt,
und auch beständig
und stabil ist.
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In
einer im Folgenden beschriebenen Ausführungsform der Erfindung wurde
Urin als eine Probe und hCG als ein in der Probe enthaltenes Analyt verwendet.
Ferner wurde ein Anti-hCG monoklonaler Antikörper verwendet, der in einer
Sandwichreaktion mit dem hCG teilnehmen kann, sowohl als eine erste spezifische
Bindungssubstanz als auch eine zweite spezifische Bindungssubstanz
verwendet, und kolloidales Gold wurde als ein Markierungsmaterial
verwendet.
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Hierbei
erlaubt die Verwendung von gefärbten
Teilchen von kolloidalem Gold oder ähnlichem einen markierten Teil
in einer kleinen Zone oder Volumen zu konzentrieren, da die gefärbten Teilchen
fein sind. Dies ermöglicht
eine genaue qualitative und/oder quantitative Analyse des hCG, die
in der ersten Nachweiszone 5 und der zweiten Nachweiszone 6 durchzuführen ist,
unter Verwendung eines Signals, das einer Reaktion eigen ist, in
welchem kolloidales Gold, welches als das Markierungsmaterial der
ersten spezifischen Bindungssubstanz dient, teilnimmt.
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Die
einer qualitativen oder quantitativen Analyse zu unterziehende Probe
wird zunächst
auf die Probenapplikationszone 3 aufgetragen, die aufgetragene
Probe wandert von der Probenapplikationszone 3 zu der Retentionszone 4 in
der Matrix 2, während sie
diese durch die Kapillarität
durchdringt und sich entwickelt. Das heißt, die Probe mit einem Analyt wird
in Kontakt mit der Retentionszone gebracht, die die erste spezifische
Bindungssubstanz markiert mit einem nachweisbaren Markierungsmaterial
zurückhält, um dem
Analyt zu ermöglichen,
an die erste spezifische Bindungssubstanz zu binden, wodurch ein
Komplex aus Markierungsmaterial, erster spezifischer Bindungssubstanz
und Analyt erhalten wird (Schritt (A)).
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Wie
vorher beschrieben, kann jedes Material als das die Matrix aufbauende
Material verwendet werden, das in der Lage ist, eine Stelle zu bilden,
an der das Analyt und die spezifische Bindungssubstanz sich entwickeln
können.
Beispiele enthalten einen porösen
Träger,
einen Gel-Träger
und einen Träger aus
gepackten feinen Teilchen. In dieser Ausführungsform wird Nitrozellulose
eingesetzt.
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Nitrozellulose
ist hervorragend in Vergleich zu anderen Matrixmaterialien, wie
etwa Papier, da sie inhärent
Protein binden kann, ohne vorher aktiviert zu werden. Bei direktem
Auftrag auf Nitrozellulose kann eine spezifisch bindende Substanz,
wie etwa ein Antikörper,
verlässlich
immobilisiert werden, ohne eine chemische Behandlung zu erfordern,
welche die spezifische Bindungsfähigkeit
der spezifischen Bindungssubstanz unterdrücken könnte. Andererseits, wenn Papier
als das Matrixmaterial verwendet wird, erfordert zum Beispiel die
Immobilisierung des Antikörpers
eine chemische Bindung, die unter Verwendung von CNBr, Carbonyldiimidazol,
Tressilchlorid oder ähnlichem
durchgeführt
werden muss.
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Außerdem ist
Nitrozellulose kommerziell in verschiedenen Porengrößen erhältlich,
so dass das Matrixmaterial leicht gemäß den Erfordernissen, wie etwa
der Fließgeschwindigkeit
der Probe, ausgewählt
werden kann. In dem Fall der Verwendung eines Nitrozelluloseblatts
ist es bevorzugt, die Festigkeit und Handhabbarkeit durch Anhaften
(Backen) eines blattförmigen
Verstärkungsmaterials
hergestellt aus Plastik oder ähnlichem
auf die Rückseite
des Nitrozelluloseblattes zu verbessern. Ein derartiges verstärktes Nitrozelluloseblatt
kann einfach durch Ausbildung einer dünnen Schicht Nitrozellulose
auf einen Verstärkungsmaterial
hergestellt werden.
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Nachdem
der Antikörper
in der Nachweiszone immobilisiert ist, ist es bevorzugt, die Matrix
zu blockieren, um das unspezifische Absorptionsvermögen der
Matrix zu reduzieren. Das Blockieren kann zum Beispiel durch Aufbringen
von Protein (zum Beispiel bovines Serumalbumin und Milchprotein),
Polyvinylalkohol oder Ethanolamin, oder einer Kombination davon,
erfolgen.
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In
der Retentionszone 4 wird der monoklonale Anti-hCG Antikörper als
die erste spezifische Bindungssubstanz vorgesehen, die immunologisch
an das hCG als das Analyt binden kann. Hierbei ist der Anti-hCG
monoklonale Antikörper
mit kolloidalem Gold markiert, das als das Markierungsmaterial dient.
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Das
hCG als das Analyt, das in einer Urinprobe enthalten ist, fließt in die
Retentionszone 4 und es bindet spezifisch an die erste
spezifische Bindungssubstanz darin, um einen Komplex aus Markierungsmaterial,
erster spezifischer Bindungssubstanz und Analyt zu ergeben. Mit
anderen Worten, wird hCG als das Analyt mit kolloidalem Gold über den monoklonalen
Anti-hCG Antikörper
versehen.
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Hierbei
ist es bevorzugt, die erste spezifische Bindungssubstanz in der
Retentionszone 4 in einem trockenen Zustand vorzusehen.
Zum Beispiel wird nach Blockieren der Matrix ein Reagenz mit der
ersten spezifischen Bindungssubstanz auf die Matrix aufgebracht,
gefolgt durch eine Gefriertrocknungsbehandlung, durch die die erste
spezifische Bindungssubstanz in einem trockenen Zustand in der Retentionszone 4 zurückgehalten
wird. Im Ergebnis, wenn die Retentionszone 4 in einem trockenen
Zustand ist, wird die erste spezifische Bindungssubstanz in der Retentionszone
zurückgehalten.
Wenn die Matrix 2 der flüssigen Probe, die darin durchdringt
und sich entwickelt, angefeuchtet wird, kann die erste spezifische
Bindungssubstanz frei auf der Matrix 2 migrieren.
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Daher
fließt
die Probe mit dem Komplex, in welchem das Analyt an die erste spezifische
Bindungssubstanz gebunden ist, in die erste Nachweiszone 5 und
die zweite Nachweiszone 6, die auf der Matrix 2 vorgesehen
sind, während
sie die Matrix 2 durchdringen und sich entwickeln.
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In
der ersten Nachweiszone 5 wird der monoklonale Anti-hCG
Antikörper
als die zweite spezifische Bindungssubstanz die an das hCG als das
Analyt binden kann, im Wesentlichen immobilisiert. Zum Beispiel,
wenn die Matrix Nitrozellulose umfasst, kann der Antikörper durch
Aufbringen eines Reagens immobilisiert werden, das den vorhergehenden
Antikörper
enthält,
um es dem Antikörper
zu ermöglichen an
der Matrix sowohl physikalisch als auch chemisch zu absorbieren.
Dieser monoklonale Anti-hCG Antikörper als die zweite spezifische
Bindungssubstanz migriert selbst dann nicht, wenn er in einem feuchten Zustand
ist.
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In
der zweiten Nachweiszone 6 wird im Wesentlichen der Analyt
(hCG) oder ein Analog davon, das an den Anti-hCG monoklonalen Antikörper als die
erste spezifische Bindungssubstanz binden kann, immobilisiert. Dieses
Analyt und das Analog davon migrieren ebenfalls nicht, wenn sie
in einem feuchten Zustand sind.
-
Es
sollte angemerkt werden, dass die Probe auf die Probenapplikationszone
aufgebracht werden kann, nachdem sie mit der ersten spezifischen
Bindungssubstanz außerhalb
des Test Reagensstreifens reagiert hat. Die erste spezifische Bindungssubstanz,
die mit der Probe außerhalb
des Streifens reagiert, kann eine sein, die nicht an das Markierungsmaterial
gebunden ist. Ferner kann sie ebenfalls eine sein, die an ein Markierungsmaterial
gebunden ist, welches ein Signal unterschiedlich von dem der markierten
ersten spezifischen Bindungssubstanz in der Matrix erzeugt. Wenn
die markierte erste spezifische Bindungssubstanz vorher mit der
Probe außerhalb des
Streifens reagiert, ist es nicht notwendig die Retentionszone 4 auf
der Matrix 2 vorzusehen, in der die erste spezifische Bindungssubstanz
vorgesehen wird.
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Das
Analyt in der Probe, das mit der ersten Nachweiszone 5 reagiert,
bindet spezifisch an die zweite spezifische Bindungssubstanz. Als
ein Ergebnis wird das Analyt in der ersten Nachweiszone 5 über die
zweite spezifische Bindungssubstanz immobilisiert. Genauer bindet
der mit kolloidalem Gold markierte monoklonale Anti-hCG Antikörper, als
die erste spezifische Bindungssubstanz, über das hCG als das Analyt,
an den monoklonalen Anti-hCG Antikörper als die zweite spezifische
Bindungssubstanz, die in der ersten Nachweiszone 5 immobilisiert
ist.
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Das
heißt
die Probe, die dem Schritt (A) unterzogen wird, wird in Kontakt
mit einer ersten Nachweiszone gebracht, in der eine zweite spezifische Bindungssubstanz
immobilisiert ist, um einen Überschuss
des Analyts, welcher nicht an die erste spezifische Bindungssubstanz
gebunden wurde zu ermöglichen,
an die zweite spezifische Bindungssubstanz zu binden, wodurch der Überschuss
des Analyts in der ersten Nachweiszone immobilisiert wird (Schritt (B)).
-
Hierbei,
wenn eine überschüssige Menge des
hCG in der Probe vorhanden ist, bindet das hCG nicht spezifisch
an den mit kolloidalem Gold markierten Anti-hCG monoklonalen Antikörper und
das an den mit kolloidalem Gold markierten Anti-hCG monoklonalen
Antikörper
gebundene hCG konkurrieren darum spezifisch an die zweite spezifische
Bindungssubstanz in der ersten Nachweiszone zu binden.
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Im
Ergebnis bindet das hCG als die einfache Substanz spezifisch an
die in der ersten Nachweiszone 5 gebundene spezifische
Bindungssubstanz bevorzugt gegenüber
dem hCG, das spezifisch an den mit kolloidalem Gold markierten Anti-hCG
monoklonalen Antikörper
gebunden ist. Dies resultiert in einer Abnahme der Menge des in
der ersten Nachweiszone gebundenen mit kolloidalem Gold markierten
Anti-hCG-Antikörper,
wodurch die im kolloidalem Gold eigene Signalintensität abnimmt.
Entsprechend spiegelt die in der ersten Nachweiszone 5 nachgewiesene
Signalintensität
nicht die Menge an hCG in der Probe wieder. Wie vorher beschrieben
wird dieses Phänomen,
in welchem die Signalintensität
nicht gemäß der Menge
des Analyts ansteigt, als ein Prozonenphänomen bezeichnet.
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Von
den Molekülen
des mit kolloidalem Gold markierten Anti-hCG monoklonalen Antikörper als die
erste spezifische Bindungssubstanz, die die zweite Nachweiszone 6 erreicht
haben, binden die spezifisch an das hCG als das immobilisierte Analyt,
die weiter an das hCG als das Analyt binden können, wodurch sie in der zweiten
Nachweiszone 6 immobilisiert werden. In anderen Worten
wird der mit kolloidalem Gold markierte Anti-hCG monoklonale Antikörper als
die erste spezifische Bindungssubstanz über das hCG als das Analyt
in der zweiten Nachweiszone 6 immobilisiert.
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Das
heißt,
die Probe, die dem Schritt (B) unterzogen wurde, wird mit einer
zweiten Nachweiszone in Kontakt gebracht, in der eine Substanz identisch
zu dem Analyt oder ein Analog des Analyts immobilisiert ist, um
der ersten spezifischen Bindungssubstanz in dem Komplex zu ermöglichen
an das Analyt oder das Analog zu binden, wodurch der Komplex in
der zweiten Nachweiszone immobilisiert wird. (Schritt (C)).
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Hierbei
ist es bevorzugt, dass die Probe sich derartig entwickelt, dass
die Probe weiter fließt, selbst
nachdem sie hinter die erste Nachweiszone 5 und die zweite
Nachweiszone 6 gewandert ist. Für diesen Zweck wird eine ausreichende
Menge der Probe auf die Probenapplikationszone 3 appliziert,
so dass einem Überschuss
der markierten ersten spezifischen Bindungssubstanz, welcher nicht
an der spezifischen Bindungsreaktion in der ersten Nachweiszone 5 und
der zweiten Nachweiszone teilnimmt, ermöglicht wird, von der ersten
Nachweiszone 5 und der zweiten Nachweiszone 6 durch
die Probe, die durch die Nachweiszonen fließt, fort gewaschen zu werden.
Daher kann eine Absorptionszone an dem Ende der Matrix 2 vorgesehen
werden, in der sich die Probe entwickelt. Das die Absorptionszone
aufbauende Material kann jedes Material mit einer absorptiven Eigenschaft
sein, um ausreichend die anderen Bestandteile als den Analyt fort
zu waschen. Beispiele schließen
Glasfaser, Filterpapier GA-200 (hergestellt von TOYO KABUSHIKI KAISHA)
ein.
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Mit
dem Vorsehen der Absorptionszone kann jede nicht reagierte Substanz
mit dem Fluss der Probe weggewaschen werden, so dass nach der spezifischen
Bindungsreaktion ein der spezifischen Bindungsreaktion eigenes Signal
in der ersten Nachweiszone 5 und der zweiten Nachweiszone 6 ohne Abtrennung
der nicht reagierten Substanz durchgeführt werden kann. Entsprechend
ist es bei dem spezifischen Bindungsanalyseverfahren der vorliegenden
Erfindung möglich,
eine Signalintensität
zu messen, die der spezifischen Bindungsreaktion zwischen dem Analyt
und der spezifischen Bindungssubstanz eigen ist, in jedem Teil einer
Stelle, an der die spezifische Bindungsreaktion auftritt. Jedoch
ist es bevorzugt, eine qualitative oder quantitative Analyse des Analyts
in der Probe durch Messung einer Signalintensität oder einer Verteilung der
Signalintensität
in jeder der ersten Nachweiszone 5 und der zweiten Nachweiszone 6 oder
in einem weiten Bereich einschließlich dieser Nachweiszonen
durchzuführen.
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Dann
wird eine Intensität
des Signals 1 und des Signals 2, welche dem Markierungsmaterial
zuzuschreiben sind und in der ersten Nachweiszone und der zweiten
Nachweiszone erhalten werden, entsprechend gemessen (Schritt (D)),
und eine Konzentration des Analyts in der Probe wird auf der Grundlage
der Intensität
des Signals 1 und der des Signals 2 bestimmt,
wodurch eine qualitative oder quantitative Analyse des Analyts in
der Probe durchgeführt
wird (Schritt (E)).
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Eine
quantitative Information, die die Korrelation zwischen der Verteilung
der Signalintensität und
der Konzentration eines Analyts zeigt, kann vorher unter Verwendung
von Proben mit bekannten Konzentrationen angefertigt werden. Die
Konzentration des Analyts kann ebenfalls auf der Grundlage der quantitativen
Information und der Verteilung der Signalintensität bestimmt
werden, die durch die tatsächliche
Analyse erhalten wird.
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Die 2 ist
ein schematisches Diagramm, die ein Analysegerät veranschaulicht das zusammen mit
dem Streifen 1 in dem erfindungsgemäßen spezifischen Bindungsanalyseverfahren
verwendet wird. Die Analysevorrichtung umfasst zum Beispiel eine erste
Elektrode 11, eine zweite Elektrode 12, einen Detektor
für den
Beginn der Messung 10, einen Analysator 9, eine
Lichtquelle 7 und einen Lichtdetektor 8. Die erste
Elektrode 11 und die zweite Elektrode 12 werden
für die
Messung der elektrischen Leitfähigkeit der
Probenapplikationszone 3 verwendet. Der Detektor für den Beginn
der Messung 10 detektiert das Aufbringen einer Probe auf
die Probenapplikationszone 3 auf der Grundlage der Änderung
der elektrischen Leitfähigkeit
und speist ein Nachweissignal in den Analysator 9 ein.
Nach Ablauf einer vorbestimmten Zeit für den Empfang des Nachweissignals
steuert der Analysator 9 eine Arbeitsbühne 13, um den gesamten
Teststreifen 1 in der durch den Pfeil Z gezeigten Richtung
abzutasten. Danach steuert der Analysator 9 die Lichtquelle 7 und
analysiert ein Ausgabesignal des Lichtdetektors 8. Die
Lichtquelle 7 strahlt Licht auf jede der ersten Nachweiszone 5 und
der zweiten Nachweiszone 6. Der Lichtdetektor 8 weist ein
reflektiertes Licht jeweils aus der ersten Nachweiszone 5 und
der zweiten Nachweiszone 6 nach.
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Im
Folgenden wird der Betrieb der Analysevorrichtung beschrieben werden.
Vor dem Aufbringen einer Probe werden vorangehend eine elektrische
Leitfähigkeit
der Probenapplikationszone 3 in dem trockenen Zustand und
in dem feuchten Zustand nach der Aufbringung einer Probe gemessen.
Die auf diese Weise erhaltene Information wird vorangehend in den
Detektor für
den Beginn der Messung 10 als eine Information des Beginns
der Messung eingegeben.
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Danach
wird eine Probe mit hCG auf die Probenapplikationszone 3 aufgebracht
und die Probenapplikationszone 3 ändert sich nachfolgend von
trocken zu feucht, wobei sich die elektrische Leitfähigkeit
der Probenapplikationszone 3, welche durch die erste Elektrode 11 und
die zweite Elektrode 12 überwacht wird, ändert. Durch Berücksichtigung
der Änderung
der elektrischen Leitfähigkeit
und der Information des Beginns der Messung weist der Detektor für den Beginn
der Messung 10 das Aufbringen der Probe auf die Probenapplikationszone 3 nach.
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Hierbei
ist es bevorzugt, die Probe auf die Applikationszone 3 nach
Anordnung des Teststreifens 1 in der spezifischen Bindungsanalysevorrichtung
aufzubringen, aber alternativ kann der Teststreifen 1 mit
der aufgebrachten Probe in der spezifischen Bindungsanalysevorrichtung
angeordnet werden.
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Wenn
der Detektor für
den Beginn der Messung 10 das Aufbringen der Probe nachweist,
steuert der Analysator 9 die Arbeitsbühne 13, um den Teststreifen 1 in
der durch den Pfeil Z gezeigten Richtung abzutasten. Zur gleichen
Zeit steuert der Analysator 9 sowohl die Lichtquelle 7 als
auch den Lichtdetektor 8, um in einem vorbestimmten Zeitabstand
die durch das Abtasten verursachte Signalintensität zu messen,
wodurch sich die in den 3 und 4 gezeigten
Chromatogramme ergeben.
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Die
Lichtquelle 7 strahlt Licht einer vorbestimmten Wellenlänge (zum
Beispiel 650 nm) auf einen Bereich einschließlich der ersten Nachweiszone 5 und
der zweiten Nachweiszone 6, worauf der Lichtdetektor 8 das
reflektierte Licht detektiert. Als die für die Messung verwendete Wellenlänge kann
jede für die
Färbung
der Probe oder die des Markierungsmittels in der ersten Nachweiszone 5 und
der zweiten Nachweiszone 6 geeignete Wellenlänge angemessen
ausgesucht werden.
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Das
hierin verwendete Signal kann jedes nachweisbare Signal sein, das
durch eine Reaktion erzeugt wird, in welchem ein Markierungsmittel
teilnimmt, zum Beispiel: Fluoreszenz, die mit einem Fluorometer
messbar ist; Lumineszenz, die mit einem Lumineszenzphotometer messbar
ist; und Färbung, die über visuelle
Bewertung oder mit einer Farbunterschiedsmessvorrichtung in der
ersten Nachweiszone 5 und der zweiten Nachweiszone 6.
In diesem Fall wird die Intensität
oder ähnliches
eines reflektierten Lichts oder die Fluoreszenz oder die Lumineszenz, die
in der ersten Nachweiszone 4 und der zweiten Nachweiszone 6 erzeugt
wird, in der ersten Nachweiszone 5 und der zweiten Nachweiszone 6 nachgewiesen.
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Der
Nachweis des vorher beschriebenen Signals wird kontinuierlich durchgeführt, während die Position
des Teststreifens 1 die Positionen der Lichtquelle 7 und
des Lichtdetektors 8 in der Richtung parallel zu der Durchdringungsrichtung
der Probe auf dem Teststreifen relativ geändert werden, das heißt in der
durch den Pfeil Z gezeigten Richtung. Entweder der Teststreifen 1 oder
die Lichtquelle 7 können bewegt
werden, oder beide von ihnen können
zusammen in der Richtung parallel zu der Durchdringungsrichtung
der Probe bewegt werden.
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Der
Lichtdetektor 8 sendet das Signal zu dem Analysator 9.
Der Analysator 9 analysiert das Signal aus dem Lichtdetektor 8,
wodurch die Intensität des
Signals gemessen wird. Dann erzeugt der Analysator 9 eine
Korrelationskurve, die die Relation zwischen der gemessenen Signalintensität und dem
abgetasteten Abstand darstellt, das heißt ein Chromatogramm, und analysiert
dieses.
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Die 3 und 4 sind
schematische Diagramme, die entsprechend die Korrelationskurven (Chromatogramme)
zeigen, die durch die Analyse der Verteilung der Signalintensität in der
Nähe der ersten
Nachweiszone 5 und der zweiten Nachweiszone 6 aufgebracht
werden. Die Chromatogramme werden durch Aussenden von Licht der
Lichtquelle 7 auf die Matrix 2 während des
Abtastens des Teststreifens 1 zu der Lichtquelle 7 und
dann Analyse eines reflektierten Lichts aufgetragen, das durch den
Lichtdetektor 8 mit dem Analysator 9 nachgewiesen
wird. In den Chromatogrammen bezeichnen die virtuellen vertikalen
Achsen die Signalintensität
an oder in der Nähe
der ersten Nachweiszone 5 oder der zweiten Nachweiszone 6,
und die horizontale Achsen bezeichnen den Bereich der ersten Nachweiszone 5 oder
der zweiten Nachweiszone 6 (der abgetastete Abstand von
der Probenapplikationszone 3).
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Die
Höhe jedes
Chromatogramms kann als eine Signalintensität gemessen werden, die einer spezifischen
Bindungsreaktion zuzurechnen ist. Die Fläche jedes Chromatogramms kann
ebenfalls als eine Signalintensität gemessen werden, die einer spezifischen
Bindungsreaktion zuzurechnen ist. Hierbei werden die Höhen der
Chromatogramme der ersten Nachweiszone 5 und der zweiten
Nachweiszone als Hs und Hr bezeichnet. Die Flächen der Chromatogramme der
ersten Nachweiszone 5 und der zweiten Nachweiszone 6 werden
als Ss bzw. Sr bezeichnet.
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In
dieser Ausführungsform
werden die Chromatogramme durch kontinuierliche Messung eines reflektierten
Lichts in einem Bereich erhalten, der die erste Nachweiszone 5 und
die zweite Nachweiszone 6 enthält, während Abtasten des Teststreifens 1 oder der
Lichtquelle 7. Zum Beispiel ist eine Signalintensität in einem
Schnitt stromaufwärts
eines Bereiches einschließlich
der ersten Nachweiszone 5 und der zweiten Nachweiszone 6,
das heißt
einem Abschnitt eines Bereiches, welcher näher zu der Probenapplikationszone 3 ist,
mit einer geraden Linie mit einer Signalintensität in dem Bereich stromabwärts des
Bereiches verbunden, das heißt
eines Abschnitts des Bereiches, welcher weiter von der Probenapplikationszone 3 entfernt
ist. Dann kann ein Abstand erhalten durch Abziehen der Höhe der geraden
Linie von der des höchsten
Werts des Chromatogramms von jeder der ersten Nachweiszone 5 und
der zweiten Nachweiszone 6 als die Höhe des Chromatogramms angesehen
werden. Ebenfalls kann die Fläche
des Bereiches, der durch die gerade Linie der Chromatogramme umfasst
wird, als die Fläche
des Chromatogramms angesehen werden. Auf diese Art und Weise kann
die dem Hintergrund zugehörige
Signalintensität
von der Signalintensität
in jeder der ersten Nachweiszone 5 und der zweiten Nachweiszone
abgezogen werden, wodurch es möglich
wird, eine Signalintensität
zu erhalten, die einer spezifischen Bindungsreaktion zuzurechnen
ist. Entsprechend ist es möglich,
eine qualitative oder quantitative Analyse eines Analyts selbst
in einer gefärbten
Probe, wie etwa Vollblut, durchzuführen, ohne durch den Hintergrund und
Fremdmaterial beeinflusst zu werden.
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Hierbei
kann eine Signalintensität
in einem frei gewählten
Bereich auf der Matrix 2 unterschiedlich zu der ersten
Nachweiszone 5 und der zweiten Nachweiszone 6 ebenfalls
als eine dem Hintergrund zugehörige
Signalintensität
angesehen werden. Zum Beispiel kann eine Signalintensität mit dem
geringsten Wert aus den Signalintensitäten in der Nähe jeweils
der ersten Nachweiszone 5 und der zweiten Nachweiszone 6 ausgewählt werden.
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Der
Hintergrund wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Verhalten,
das eine Probe aufweist, die kein Analyt enthält. Zum Beispiel hat eine Signalintensität, die der
nicht spezifischen Absorption der spezifischen Bindungssubstanz,
oder ähnlichem,
in jeder der ersten Nachweiszone 5 und der zweiten Nachweiszone 6 zugehörig ist,
und die Färbung,
oder ähnliches,
der Probe selbst im Falle der Messung eines Signals, das der Färbung eigen
ist, einen Einfluss auf den Hintergrund hat, wodurch die Messempfindlichkeit
reduziert wird. Zusätzlich
bezieht sich fremdes Material allgemein auf eine Substanz, die unterschiedlich
zu einem in einer Probe enthaltenen Analyt ist. Das fremde Material,
das ein Problem in einem spezifischen Bindungsanalyseverfahren verursachen
kann, ist eine Substanz, welche ein ähnliches Verhalten zu dem des
Analyts in seiner Bindungsreaktion mit einer spezifischen Bindungssubstanz
aufweist (zum Beispiel ein Analog des Analyts), oder eine, welche
eine spezifische Bindungsreaktion zwischen dem Analyt und der spezifischen
Bindungssubstanz, zum Beispiel durch Bindung des Analyts, behindert.
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Der
Analysator 9 enthält
eine quantitative Information in einem Speicher (nicht gezeigt)
und bestimmt die Konzentration des Analyts sowohl durch Bezugnahme
auf die quantitative Information als auch auf Hs und Hr oder Ss
und Sr, wobei jeder davon der analysierte Wert ist.
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Im
Folgenden wird das erfindungsgemäße spezifische
Bindungsanalyseverfahren mittels eines Beispiels geschrieben, welches
unter Verwendung des in der 1 gezeigten
Streifens und der in der 2 gezeigten Analysevorrichtung
durchgeführt wird.
Jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt.
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Beispiel
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Das
spezifische Bindungsanalyseverfahren der vorliegenden Erfindung
wurde unter Verwendung des in der 1 gezeigten
Streifens und der in der 2 gezeigten Analysevorrichtung
durchgeführt. Hierbei
wurde die Konzentration des Analyts durch den Analysator 9 aus
Hs und Hr bestimmt.
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Die 5 zeigt
eine graphische Darstellung, die die Relation zwischen der Signalintensität Hs und hCG-Konzentration in
dem Fall des Bestrahlens mit Licht mit einer Wellenlänge von
650 nm auf die erste Nachweiszone 5 zeigt. Die hierbei
verwendeten Proben wurden jeweils durch Zugabe eines hCG zu einem
Kontrollurin für
die Genauigkeitskontrolle hergestellt, dessen hCG-Konzentration
im Wesentlichen Null war. Die hCG-Konzentrationen der Proben wurden
auf 0 (IE/L), 10 (IE/L), 30 (IE/L), 50 (IE/L), 100 (IE/L), 300 (IE/L),
500 (IE/L), 1000 (IE/L), 1500 (IE/L), 2000 (IE/L), 3000 (IE/L),
5000 (IE/L), 7500 (IE/L) bzw. 10000 (IE/L) eingestellt. Die Messung
erfolgte für jede
Probe entweder zwei- oder dreimal.
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Wie
in der 5 gezeigt, wurden in den Fällen von Proben mit geringen
HCG-Konzentrationen nahezu die gesamten Analyte an die markierte
erste spezifische Bindungssubstanz gebunden und diese wurden an
die zweite spezifische Bindungssubstanz gebunden, die in der ersten
Nachweiszone 5 immobilisiert ist.
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Entsprechend
stieg die Signalintensität
Hs, welche in der ersten Nachweiszone 5 nachgewiesen wurde
und einer Reaktion zuzurechnen ist, in welcher das markierte Material
teilnimmt, mit einem Anstieg in der Konzentration an. In den Fällen von
Proben mit hohen hCG-Konzentrationen war eine überschüssige Menge des nicht an die
markierte erste spezifische Bindungssubstanz gebundenen Analyts
in dem Reaktionssystem vorhanden, so dass das spezifisch an die
markierte erste spezifische Bindungssubstanz gebundene Analyt und
das nicht spezifisch an die markierte erste spezifische Bindungssubstanz
gebundene Analyt darum konkurrierten, spezifisch an die zweite spezifische
Bindungssubstanz zu binden, die in der ersten Nachweiszone 5 immobilisiert
ist. Im Ergebnis nahm die Signalintensität Hs, welche in der ersten
Nachweiszone 5 nachgewiesen wurde und einer Reaktion zuzurechnen
ist, bei welcher das markierte Material teilnahm, mit einem Anstieg
in der Konzentration ab.
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Bei
Verwendung der in der 5 gezeigten Linie als eine analytische
Linie war es möglich,
die Konzentration des Analyts zu bestimmen. Genauer gesagt wurde,
wenn die Signalintensität
Hs einen bestimmten Wert ergab, eine dem bestimmten Wert entsprechende
Konzentration durch die horizontale Achse über die gepunktete Linie bestimmt.
Wenn zum Beispiel die Signalintensität Hs 5,0 war, konnte die Konzentration
als etwa 1200 (IE/L) bestimmt werden.
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Jedoch
gab es Fälle,
wo der Analysator 9, durch Bezugnahme auf die gepunktete
Linie in der 5 als die analytische Linie
nachwies, dass mehrere Konzentrationen vorhanden waren und folglich die
zu der Signalintensität
entsprechende Analytkonzentration nicht unzweifelhaft abgestimmt
werden konnte. In dem Fall, wo es eine Möglichkeit gab, dass die hCG-Konzentration 6000
(IE/L) oder höher
sein könnte,
war es nicht möglich
zu bestimmen, ob die hCG-Konzentration etwa 3500 (IE/L) oder etwa
7600 (IE/L) war, wenn die Signalintensität Hs 10 war. In einem derartigen
Fall, in dem die Analytkonzentration entsprechend der Signalintensität Hs nicht
unzweifelhaft bestimmt werden konnte, war es möglich, die Konzentration durch
Erhalt der Signalintensität
Hr aus dem Chromatogramm der zweiten Nachweiszone 6 zusammen
mit der Signalintensität
Hs zu bestimmen, und durch Analyse sowohl von Hr als auch von Hs
in einer im Folgenden beschriebenen Art und Weise.
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Die 6 zeigt
eine graphische Darstellung, die die Relation zwischen der Signalintensität Hr und der
hCG-Konzentration
in dem Fall des Bestrahlens der zweiten Nachweiszone 6 mit
Licht mit einer Wellenlänge
von 650 nm zeigt.
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Die
hierin verwendeten Proben wurden jeweils durch Zugabe eines hCG
zu einem Kontrollurin für
die Genauigkeitskontrolle hergestellt, dessen hCG-Konzentration
im Wesentlichen Null war. Die hCG-Konzentrationen der Proben waren
0 (IE/L), 10 (IE/L), 30 (IE/L), 50 (IE/L), 100 (IE/L), 300 (IE/L),
500 (IE/L), 1000 (IE/L), 1500 (IE/L), 2000 (IE/L), 3000 (IE/L),
5000 (IE/L), 7500 (IE/L) bzw. 10000 (IE/L). Die Messung wurde zwei-
oder dreimal für
jede Probe durchgeführt.
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Wie
aus der 6 ersichtlich floss, wenn die Konzentration
des Analyts in der Probe hoch war, die nicht an das Analyt gebundene
markierte erste spezifische Bindungssubstanz aus der ersten Nachweiszone
heraus und band an das Analyt oder das Analog davon, das in der
zweiten Nachweiszone 6 immobilisiert war, so dass die Signalintensität Hr, welche
dem Markierungsmaterial zuzurechnen war, abnahm. Genauer gesagt
wurden, wenn die Konzentration des Analyts in der Probe niedrig
war und daher dort markierte erste spezifische Bindungssubstanzen
vorhanden waren, die nicht an das Analyt gebunden waren, die überschüssigen,
freien markierten ersten spezifischen Bindungssubstanzen an das
Analyt oder das Analog davon gebunden, die in der zweiten Nachweiszone 6 immobilisiert
waren. Dies resultierte in der Erzeugung der Signalintensität Hr, welche
einer Reaktion zuzurechnen war, in welchem das Markierungsmaterial
teilnahm. Auf der anderen Seite, wenn die Konzentration des Analyts
in der Probe hoch und daher folglich eine überschüssige Menge des Analyts vorhanden
war, wurde im Wesentlichen die Gesamtheit der markierten ersten
spezifischen Substanzen an das Analyt gebunden. Selbst wenn diese
markierten ersten spezifischen Substanzen die zweite Nachweiszone 6 erreichten,
waren sie nicht in der Lage, an das Analyt oder das Analog davon
zu binden, welches in der zweiten Nachweiszone 6 immobilisiert war,
und wurden von der zweiten Nachweiszone 6 weggewaschen.
Entsprechend gab es im Wesentlichen keine Erzeugung der Signalintensität Hr, welche
einer Reaktion zuzurechnen ist, in welchem das markierte Material
teilnahm.
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Hierbei
wurden im engeren Sinne, wenn die erste spezifische Bindungssubstanz
mehrere Bindungsstellen wie ein Antikörper hat (zwei Bindungsstellen
im Fall IgG-Antikörpers),
wie in diesem Beispiel, die Bindungszustände der entsprechenden Bindungsstellen
auf die Signalintensität
reflektiert. Das heißt,
es gab eine signifikant geringe Möglichkeit, dass die erste spezifische
Bindungssubstanz, bei welcher alle Bindungsstellen durch Analyte
besetzt waren, in der Lage sein würde weiterhin an ein Analyt
zu binden. Entsprechend gab es ebenfalls eine signifikant geringe
Möglichkeit,
dass eine derartige erste spezifische Bindungssubstanz an das in der
zweiten Nachweiszone 6 immobilisierte Analyt binden würde. Wenn
es jedoch selbst dort eine mögliche
Bindungsstelle gab, die für
das Analyt in der ersten spezifischen Bindungssubstanz verblieb,
stieg die Möglichkeit
für diese
erste spezifische Bindungssubstanz mit dem Verhältnis der verbleibenden Bindungsstelle
an, an das in der zweiten Nachweiszone 6 immobilisierte
Analyt zu binden. In jedem Fall sank die Signalintensität Hr, die
durch die gepunktete Linie in der 6 bezeichnet
wird, mit einem Anstieg der Analytkonzentration.
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Unter
Verwendung der gepunkteten Linien in den 6 und 5 als
eine quantitative Information war es möglich, die Konzentration des
Analyts in der folgenden Art und Weise zu bestimmen.
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Wie
vorher beschrieben, gab es Fälle,
wo der Analysator 9, durch Bezug auf die gepunktete Linie der 5,
nachwies, dass mehrere Konzentrationen vorhanden waren und daher
die Analytkonzentration entsprechend der Signalintensität nicht
unzweifelhaft bestimmt werden konnte. In dem Fall, in dem es eine Möglichkeit
gab, dass die hCG-Konzentration 6000 (IE/L) oder höher sein
konnte, war es nicht möglich zu
bestimmen, ob die hCG-Konzentration etwa 3500 (IE/L) oder etwa 7600
(IE/L) war, wenn die Signalintensität Hs 10 war. Jedoch
war es möglich,
die Konzentration durch weitere Bezugnahme auf die gepunktete Linie
in der 6 zu bestimmen. Genauer gesagt konnte, wenn die
Signalintensität
Hr in der 6 1,2 war, die Konzentration
als etwa 3500 (IE/L) aus der gepunkteten Linie bestimmt werden.
Wenn die Signalintensität
Hr in der 6 0,45 war, konnte die Konzentration
als etwa 7600 (IE/L) aus der gepunkteten Linie bestimmt werden.
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Auf
diese Weise war es selbst in dem Fall, in dem die Analytkonzentration
nicht zweifelhaft nur aus der Signalintensität Hs in der 5 bestimmt
werden konnte, möglich
die Konzentration durch Erhalt der Signalintensität Hr aus
dem Chromatogramm der zweiten Nachweiszone 6 und Analyse
sowohl von Hr als auch von Hs zu bestimmen.
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Hierbei
war es möglich,
die Konzentration nur aus dem Hr in der 6 zu bestimmen.
Jedoch war die Messgenauigkeit geringer, wenn die Konzentration
aus dem Hr bestimmt wurde, als wenn sie aus dem Hs bestimmt wurde,
da der Gradient der gepunkteten Linie mit Bezug auf die Konzentration
in dem niedrigen Konzentrationsbereich gering war. Entsprechend
wurde es bevorzugt Hr nur für
die Bestimmung zu verwenden, ob eine der zwei Konzentrationen, die
aus Hs abgeleitet waren, richtig waren, während Hs allein für die Bestimmung
der Konzentration eingesetzt wurde.
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Zusätzlich war
es möglich,
die Messung durch Bestimmung der Konzentration aus dem Hs in der 5 zu
vereinfachen, wenn nur der Hr in der 6 größer als
ein vorbestimmter Wert war. In dem Fall dieses Beispiels erfolgte
die Messung zum Beispiel durch Ermittlung der Konzentration aus
dem Hs in der 5 nur wenn Hr 0,6 oder größer war,
und es wurde entschieden, dass das Prozonenphänomen vorhanden war, wenn Hr
0,6 oder weniger war und um die Konzentration auf 6000 (IE/L) oder
höher zu begrenzen,
ohne eine spezifische Menge der Konzentration zu bestimmen. Das
heißt,
Hr nur einzusetzen für
die Entscheidung ob das Prozonenphänomen vorhanden war oder nicht,
war wirkungsvoll bei der Vereinfachung der Messung.
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In
diesem Beispiel wurde die zweite Nachweiszone 6 stromabwärts von
der ersten Nachweiszone 5 in der Entwicklungsrichtung der
flüssigen
Probe (die durch den Pfeil Z gezeigte Richtung) angeordnet. Eine
derartige Anordnung verbesserte die Genauigkeit der quantitativen
Analyse aus dem folgenden Grund. Wenn eine flüssige Probe durch eine Matrix
floss, worin ein Protein, wie etwa ein Antikörper, immobilisiert war, wurde
der Fluss der flüssigen
Probe behindert, wobei ein Phänomen
induziert wurde, bei dem die flüssige
Probe nur durch einen bestimmten Abschnitt der Matrix floss, was
in einer ungleichmäßigen Bindung
in der Nachweiszone in der Stromabwärtsseite resultierte. Folglich
wurde die Reproduzierbarkeit der Messung verringert. Die Behinderung des
Flusses der flüssigen
Probe durch das in der Matrix immobilisierte Protein wurde durch
eine räumliche
Barriere, eine ungleichmäßige Hydrophilizität, verursacht
durch ungleichmäßige Immobilisationsdichte,
und ähnliches
induziert. Da die Messgenauigkeit durch Sicherstellung der Reproduzierbarkeit
des Signals für
die Bestimmung verbessert wurde, das heißt durch quantitative Analyse
der Konzentration, welche in der Nachweiszone 5 erzeugt
wurde, war es bevorzugt, die Nachweiszone für die quantitative Analyse
an der Seite stromaufwärts
anzuordnen.
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Wie
vorher beschrieben, ermöglichte
sowohl die Analyse der Hs und der Hr als eine quantitative Information
die Konzentration zu bestimmen, ohne durch das sog. Prozonenphänomen beeinflusst
zu werden.
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Es
sollte bemerkt werden, dass während dies
Beispiel die Hs und die Hr einsetzte, der Einsatz von Ss und von
Sr, die in den 3 und 4 gezeigt
werden, ähnliche
Ergebnisse erzielen. Genauer gesagt wurde Ss für die quantitative Bestimmung
eingesetzt, während
Sr für
die Bestimmung eingesetzt wurde, ob das Prozonenphänomen vorhanden
war oder nicht.
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Wie
vorher beschrieben, war es gemäß dem spezifischen
Bindungsanalyseverfahren dieses Beispiels möglich, eine qualitative oder
quantitative Analyse des in der Probe enthaltenen Analyts in einer einfachen
und schnellen Art und Weise durchzuführen, selbst wenn das Prozonenphänomen vorhanden war.
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Wie
vorher dargestellt, kann erfindungsgemäß die Menge eines Analyts in
einer Probe durch Bezugnahme auf eine quantitative Information bestimmt
werden, welche die Korrelation zwischen der Konzentration des Analyts
und der analysierten Werte der Intensitäten zeigt, welche der spezifischen
Bindungsreaktion von spezifischen Bindungssubstanzen zuzurechnen
ist, und in zwei Nachweiszonen erzeugt werden, wodurch eine durchzuführende genaue
qualitative oder quantitative Analyse in einer einfachen und schnellen
Art und Weise ohne Beeinflussung durch das Prozonenphänomen ermöglicht wird.
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Obwohl
die vorliegende Erfindung in Bezugnahme auf zurzeit bevorzugte Ausführungsformen beschrieben
wurde, ist zu verstehen, dass eine derartige Offenbarung nicht als
beschränkend
zu interpretieren ist. Verschiedene Veränderungen und Modifikationen
werden zweifellos für
Fachleute offensichtlich werden, an welche sich die vorliegende
Erfindung richtet, nachdem die vorhergehende Offenbarung gelesen
wurde. Entsprechend ist beabsichtigt, dass die beigefügten Ansprüche so interpretiert werden,
um alle Änderungen
und Modifikationen abzudecken, die in den Umfang der Erfindung fallen.
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Um
eine genaue qualitative und quantitative Analyse eines Analyts in
einer Probe ohne Beeinflussung durch ein Prozonenphänomen durchzuführen wird
ein spezifisches Bindungsverfahren offenbart mit den Schritten von:
in Kontakt bringen einer Probe mit einer Zone, in der eine erste
spezifische Bindungssubstanz markiert mit einem Markierungsmaterial
zurückgehalten
wird, um dem Analyt zu ermöglichen
an die erste spezifische Bindungssubstanz zu binden; in Kontakt
bringen der Probe mit einer ersten Nachweiszone, der eine zweite
spezifische Bindungssubstanz immobilisiert ist, um einen Überschuss
des Analyts zu ermöglichen
an die zweite spezifische Bindungssubtanz zu binden; in Kontakt bringen
der Probe mit einer zweiten Nachweiszone, in der eine Substanz identisch
zu dem Analyt immobilisiert ist, um der ersten spezifischen Bindungssubstanz
zu ermöglichen,
an die Substanz zu binden; entsprechende Messung der Intensitäten des
Signals 1 des Signals 2, die in der ersten Nachweiszone
der zweiten Nachweiszone erhalten werden dem markierenden Material
eigen sind; und dann Bestimmung der Konzentration des Analyts auf
der Grundlage der Intensitäten.