CN104714017A - 一种定量检测降钙素原的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域,公开了一种定量检测降钙素原的方法。本发明所述方法将待检测样品与荧光标记的抗降钙素原第一抗体混合,得到含降钙素原抗原抗体复合体的反应液;将该反应液在反应介质中分别与抗降钙素原第二抗体、降钙素原抗原反应,分别检测荧光信号;根据荧光信号值计算获得待检测样品中降钙素原的含量。本发明所述方法运用了双抗体夹心法与竞争法相结合的技术,其稳定性、线性、准确性都有显著提高,具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,特别涉及一种定量检测降钙素原的方法。
背景技术
降钙素原(procalcitonin,PCT)是无激素活性的降钙素前肽物质,降钙素仅在甲状腺的C细胞受到激素性刺激时才产生,降钙素原可由很多器官的不同类型细胞在受到促炎症反应刺激特别是受到细菌引起的刺激后分泌。
降钙素原是一种能特异性区分细菌感染和其它原因导致的炎症反应的重要标志物,当严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时,其在血浆中的水平升高。临床资料显示,PCT浓度>0.1ng/mL时说明存在临床相关的细菌感染,需要采用抗生素进行治疗;当PCT浓度>0.5ng/mL时,要考虑患者可能有发展成重症败血症或败血症性休克的危险。PCT反映了全身炎症反应的活跃程度。影响PCT水平的因素包括被感染器官的大小和类型、细菌的种类、炎症的程度和免疫反应的状况。检测病例中PCT浓度的变化,有利于判断机体细菌感染情况,评判机体健康状况,对临床和基础性研究都有重要意义。
自上世纪80年代以后,免疫学检测技术随着单克隆抗体、人工合成多肽、基因工程表达抗原及各种标记技术的成熟而迅速发展,免疫比浊法、速率散射比浊法(INA)、胶乳增强透射比浊法(ITA)与化学发光分析技术逐渐取代传统的免疫沉淀、免疫凝集物,使检测更为快捷,近些年快速检测(POCT)的应用使免疫学操作更为简单、方便。
目前,多种免疫学检测技术应用于PCT检测,既可以定性,亦可以定量。常用方法有放射免疫分析法(RIA)、酶标免疫分析法(ELISA)、胶体金法、定量化学发光免疫分析(CLIA),但以上方法在应用过程中均存在缺陷。放射免疫(RIA)、酶标免疫(ELISA)灵敏度较高,但操作复杂、产品有效期短;胶体金操作简单快捷,但不能定量检测;定量化学发光免疫检测需要较长时间且检测成本高。因此还需要研发一种新的检测降钙素原的方法,以便于快速、准确检测样品中的降钙素原。
发明内容
本发明的发明目的在于提供一种定量检测降钙素原的方法,其稳定性、线性、准确性均有显著提高。
为了实现本发明的发明目的,本发明采用如下技术方案:
将待检测样品与荧光标记的抗降钙素原第一抗体混合,得到含降钙素原抗原抗体复合体的反应液;将该反应液在反应介质中分别与抗降钙素原第二抗体、降钙素原抗原反应,分别检测荧光信号;根据标准曲线及测得荧光信号值获得待检测样品中降钙素原的含量。
作为优选,所述荧光标记所用的荧光素为Alexa Fluor系列荧光素。
作为优选,所述反应介质为试纸条。
更优选地,所述抗降钙素原第二抗体、降钙素原抗原固定在同一反应介质的不同位置。
本发明提供的定量检测降钙素原方法是一项基于免疫荧光法的定量检测技术,结合了双抗体夹心法与竞争法,将待测样本与含荧光标记的抗降钙素原第一抗体的缓冲液在试剂瓶中进行混合得反应液,混合液中的荧光标记PCT抗体和样本的PCT抗原结合形成抗原抗体复合物;取反应液在反应介质中与抗降钙素原第二抗体反应,捕获待测样品中含有的降钙素原与荧光标记的抗降钙素原抗体复合物,检测、收集第一荧光信号;取所得反应液在反应介质中与降钙素原抗原反应,竞争结合反应液中的荧光标记的抗降钙素原抗体,检测,收集第二荧光信号;根据第一荧光信号、第二荧光信号及标准曲线,计算获得待检测样品中降钙素原的含量。
优选的方案是所述反应介质为试纸条,所述抗降钙素原第二抗体、降钙素原抗原固定在反应介质的不同位置,利用免疫层析法进行检测。免疫层析法(immunochromatography)其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带,当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品后,由于毛细作用,样品将沿着该膜向前移动,当移动至固定有抗体的区域时,样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合,用免疫胶体金或免疫荧光标记从而实现特异性的免疫检测。
试纸条上固定了抗降钙素原第二抗体的位置为检测线,当混合样本滴到试纸条并通过毛细作用扩散到硝酸纤维素膜的检测线上,荧光标记的抗原抗体复合物被检测线上的PCT第二抗体所捕获。待测样本中的PCT抗原越多,检测线上的复合物积聚得越多,荧光抗体的信号越强。
试纸条上固定了抗降钙素原的位置为质控线,当混合样本滴到试纸条并通过毛细作用扩散到硝酸纤维素膜的质控线上,荧光标记的抗原抗体复合物被质控线上的PCT抗原所捕获。血液样本中的PCT抗原越多,质控线上的复合物积聚得越少,荧光抗体的信号越弱。
用已知浓度的标准品检测试纸条,仪器分别各自收集检测线和质控线的荧光信号累加值,用各自的累加值计算出相应的比值。把已知浓度和相对应的比值带入计算公式得出标准曲线,最后根据标准曲线计算出相应的浓度值。
本发明提供的定量检测降钙素原的方法运用了双抗夹心法与竞争法相结合的技术。具体地,在试纸条定量检测降钙素原的过程中,检测线利用双抗夹心法,质控线利用竞争法。本发明的发明人通过大量的创造性劳动成功将两种技术融合到了一起,实验结果证明该方法用于定量检测待测样品中降钙素原含量特异性好、线性范围好、准确度高。
一般情况下,双抗夹心法用于大分子的检测;竞争法用于小分子的检测,小分子属于半抗原,没有两个或两个以上位点结合抗体,故用竞争法。降钙素原是大分子物质,现有的检测方法中多只采用夹心法原理进行检测,但在实际应用过程中发现夹心法的线性相关性不理想,影响了其准确度、稳定性,有效期也相对较短。目前,还没有关于利用两种不同的检测原理用于检测降钙素原的相关报道,这与降钙素原分子量大、容易引起非特异性结合有关。
在本发明的一些实施例中,本发明提供的检测方法中,荧光标记的抗降钙素原抗体所用的荧光素为Alexa Fluor系列荧光素。
在本发明的一些实施例中,荧光标记的抗降钙素原抗体所用的荧光素为Alexa647。
优选地,本发明提供的试剂中,抗降钙素原抗体、降钙素原抗原固定在同一反应介质中的两个不同位置。更为优选地,本发明提供的试剂中,所述反应介质具体为试纸条,试纸条中固定有抗降钙素原抗体、降钙素原抗原,且抗降钙素原抗体、降钙素原抗原分别固定在两个不同的位置,分别为检测线、质控线。
在本发明的另外一些实施例中,本发明提供的试剂盒包含PCT反应板,含有固化了抗降钙素原抗体的检测线和固化了降钙素原抗原的质控线。
在本发明的另外一些实施例中,本发明提供一种试剂盒,其包括PCT检测缓冲液、PCT反应板、取样器和ID芯片;PCT检测缓冲液被分装在试剂管中;PCT反应板有独立包装,内有干燥剂;PCT检测缓冲液与PCT反应板各自组装成盒,分开运输。
本发明提供了一种定量检测降钙素原的方法,本发明提供的方法包括:取待检测样品,与荧光标记的抗降钙素原抗体混合,得反应液;取反应液与抗降钙素原第二抗体反应,捕获待测样品中含有的降钙素原与荧光标记的抗降钙素原抗体复合物,检测、收集第一荧光信号;取所得反应液与降钙素原抗原反应,竞争结合反应液中的荧光标记的抗降钙素原抗体,检测,收集第二荧光信号;根据第一荧光信号、第二荧光信号,计算获得待检测样品中降钙素原的含量。实验结果证实,本发明提供的定量检测降钙素原的试剂盒稳定性高、线性好、准确性高,使用方便。
本发明降钙素原(PCT)定量测定试剂盒(荧光免疫层析法)由PCT检测缓冲液、PCT反应板、取样器、ID芯片等组分构成。其制备工艺概括如下:
(1)PCT检测缓冲液:检测缓冲液中含有5%-25%荧光标记的抗人PCT单克隆抗体,含有5%-15%稳定剂为BSA溶液,防腐剂为0.1%-0.3%叠氮钠溶液。
(2)PCT反应板:反应板含有固化了抗人PCT单克隆抗体的检测线和固化了抗人PCT抗原的质控线。
从原理上得出,本发明所述方法融合了夹心法与竞争法两种方法,更能有效的防止漏检现象的发生;两种方法的融合加之有效的算法使有效期时间更长;两种方法的融合,线性关系R2值更好。本发明克服了竞争法应用于大分子的技术难点,其稳定性、线性、准确性都有显著提高,具有良好的应用前景。
附图说明
图1示实施例4实验结果,其中,直线1的PCT反应板包括,检测线为抗人PCT单克隆抗体,质控线为抗人PCT抗原的RLU值线性曲线,R2=0.995;直线2的PCT反应板包括,检测线为抗人PCT单克隆抗体,质控线为羊抗鼠的RLU值线性曲线,R2=0.987。
图2和图3为实施例5对照实验结果的正态分布图。
具体实施方式
本发明公开了一种定量检测降钙素原的方法,本领域技术人员可以参考本文内容,使用该方法,实现其应用,特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明内。本发明所述方法及应用已经通过较佳的实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文制备方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
为了使本技术领域的技术人员能够更好地理解本发明的技术方案,下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1:降钙素原定量检测试剂盒的制备
降钙素原(PCT)定量检测试剂盒包括:PCT检测缓冲液、PCT反应板、取样器、ID芯片。检测缓冲液被分装在试剂管中;反应板有独立包装,内有干燥剂;检测缓冲液与反应板各自组装成盒,分开运输。
(1)PCT检测缓冲液:由荧光标记的抗人PCT单克隆抗体、稳定剂BSA溶液、防腐剂叠氮钠和缓冲液组成。检测缓冲液中含有5%-25%荧光标记的抗人PCT单克隆抗体,含有5%-15%稳定剂为BSA溶液,防腐剂为0.1%-0.3%叠氮钠溶液。具体配置方法如下:
①抗体的处理:40μL抗人PCT单克隆抗体,加入标记液40μL,混匀后静置5min。
②抗体与荧光素连接:在混合后的液体中,加入2μL Alexa647荧光素,混匀后,在血液混匀器上室温混匀1h。
③终止反应:在步骤②中的液体里加入1μL的终止液,混匀后,在血液混匀器上室温混匀1h。
④在步骤③中加入1.8mL的反应液,和18μL的10%BSA混匀,即合成荧光标记的抗人PCT单克隆抗体保存液。
⑤PCT检测缓冲液:以体积比计,荧光标记的抗人PCT单克隆抗体保存液和反应液的比例为1:9,在加入叠氮钠,使叠氮钠的终浓度达0.3%,最后用锡箔纸进行避光处理。
⑥把所得PCT检测缓冲液每500μL分装一瓶,并用铝箔纸封口,放在2-8℃中保存。
(2)PCT反应板:PCT反应板含有固化了抗人PCT单克隆抗体的检测线和固化了抗人PCT抗原的质控线,其制备方法为:
①把NC70膜裁剪成每条30cm,并粘贴在背板上。粘贴好NC70膜的背板准备划线。
②划线:
检测线:取抗人PCT单克隆抗体,用包被液5倍稀释,划线宽度0.5μL/cm;
质控线:取PCT抗原,用包被液2倍稀释,划线宽度0.5μL/cm。
划线位置:质控线距离NC70膜的顶端1.1cm,检测线距离NC70膜的顶端1.4cm。
③背板划好后放置37℃恒温箱,抗体稳定的结合时间14h。
④把裁剪好的吸水纸和玻纤,分别粘贴在背板上。
⑤粘贴好的背板,在切条机上,裁割成4mm每条。
⑥切割后的试纸条放入试纸卡中,并扣上卡壳盖。
⑦每个铝箔袋中,放入一个试纸卡和一个干燥剂后,封口。
⑧在封好口的铝箔袋上粘贴标签。
优选地,标记液:0.1M-0.2M碳酸盐溶液;荧光保存液:0.01M磷酸盐溶液;包被液:0.02M磷酸溶液;抗体、抗原的来源:来源都是Hstest;抗体浓度:4.6mg/ml和7mg/ml;抗原浓度:1mg/ml,荧光素为Alexa647。
实施例2:本发明所述降钙素原定量检测试剂盒质控相关参数
(1)外观
试剂盒外观整洁,文字符号清晰;反应板整洁完整,无毛刺,无破损,材料附着牢固;试剂盒中液体澄清,无沉淀和絮状物。
(2)模条宽度
模条宽度≥2.5mm。
(3)爬行速度
液体爬行速度应不低于10mm/min。
(4)空白限
应不高于0.1ng/ml。
(5)准确度
型式检验:使用罗氏公司纯品进行回收试验,回收率在85%-115%范围内。
出厂检验:用商业正确度质控品测试试剂盒,相对偏差应不大15%。
(6)线性范围
在0.1ng/ml~50ng/ml测量范围内,线性相关系数r≥0.990,相对偏差不超过±15%。
(7)重复性
用不同浓度的两个样本进行检测,各重复检测10次,其变异系数CV应不大于10%。
(8)批间差
用三个批号试剂盒检测同一份样本,每个批号检测3次,分别计算每批3次的平均值,则三批试剂盒之间相对极差应不大于15%。
(9)特异性
检测含浓度为40g/L的人血清白蛋白,其检测结果不高于检测浓度为0.1ng/ml PCT值。
(10)稳定性
试剂盒在规定的贮存条件下保存至有效期(18个月)后进行检测,结果符合(3)、(4)、(5)、(6)、(7)项的要求。
实施例3:降钙素原定量检测试剂盒的准确度检测
实验材料及其来源:
实施例1制备获得的降钙素原定量检测试剂盒;
对照组所用试剂盒、对应荧光免疫分析仪来源于外购,方法为荧光免疫层析法;
具体方案:实施例1制备的试剂盒与外购试剂盒,做低值质控品和高值质控品检测的对比。每个浓度分别检测20次,计算相对偏差、靶值率。
待测样品中PCT的浓度分别为0.49ng/mL(对应的质控范围为0.39-0.59ng/mL)和9.46ng/mL(对应的质控范围为7.76-11.2ng/mL)。
实验方法
检测所用仪器为豪迈生物干式荧光免疫分析仪D-HMF,检测结果见表1。
表1 实验组和对照组对不同的检测样品的检测结果
从表1中实验结果可知,实验组对不同待测样品的检测结果与待测样品中所含有的PCT浓度基本一致,检测结果都在靶值范围内,且相对偏差较小,分别为10.2%、6.4%,可以定量检测出待测样品中PCT的含量。而对照组对不同待测样品的检测结果与待测样品中所含有的PCT浓度偏差较大,分别为28.6%、20.1%;且在靶值率分别为20%、45%。实验结果说明,本发明提供的降钙素原定量检测试剂盒准确性高,能够用于定量检测待测样品中的PCT。
实施例4:降钙素原定量检测试剂盒的线性范围检测
实验材料:
实施例1制备的降钙素原定量检测试剂盒。
具体方案:
为比较实验组试剂盒与对照组试剂盒在线性检测的优劣势,在线性范围内做0.1ng/mL、1ng/mL、3.125ng/mL、6.25ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL7个浓度的检测,每个浓度做3次重复,得出均值后,用均值带入公式计算相应的R2。
实验组试剂盒:检测线固定抗人PCT单克隆抗体,质控线固定抗人PCT抗原。
对照组试剂盒:PCT反应板包括,检测线固定抗人PCT单克隆抗体,质控线固定鼠源羊抗鼠类普通二抗。
实验方法:
取待测样品用实施例1制备获得的降钙素原定量检测试剂盒中的PCT检测缓冲液混合均匀,取反应液滴加到PCT反应板上,充分反应后进行检测。
检测所用仪器为豪迈生物干式荧光免疫分析仪D-HMF,经四参数拟合和线性拟合所得数据见表2、表3。
表2 PCT检测线线性检测结果
实验组ng/mL | RLU值1 | RLU值2 | RLU值3 | RLU均值 |
0.1 | 503 | 449 | 537 | 496 |
1 | 673 | 804 | 703 | 727 |
3.125 | 2159 | 1586 | 1684 | 1810 |
6.25 | 3453 | 3829 | 3317 | 3533 |
12.5 | 6553 | 6111 | 6426 | 6363 |
25 | 12196 | 11856 | 9830 | 11294 |
50 | 25490 | 26400 | 24512 | 25467 |
表3 PCT质控线线性的检测结果
对照组ng/mL | RLU值1 | RLU值2 | RLU值3 | RLU均值 |
0.1 | 387 | 388 | 380 | 385 |
1 | 594 | 600 | 585 | 593 |
3.125 | 1486 | 1492 | 1471 | 1483 |
6.25 | 2371 | 2373 | 2360 | 2368 |
12.5 | 5824 | 5817 | 5804 | 5815 |
25 | 8842 | 8838 | 8828 | 8836 |
50 | 15640 | 15643 | 15628 | 15637 |
根据表2、表3中结果见图1,图1中直线1为实验组,检测线固定抗人PCT单克隆抗体,质控线固定抗人PCT抗原的RLU值对应关系曲线,R2=0.995;直线2为对照组,检测线固定抗人PCT单克隆抗体,质控线固定鼠源羊抗鼠类二抗的RLU值对应关系曲线,即R2=0.987。从结果可知,本发明提供的试剂盒的线性范围明显优于对照组。
实施例5:
实验方案:在线性范围内,随机检测130例血清样本,每份样本都用实验组试剂盒、国内对照试剂盒(质控线与实验组不同,即质控线固定鼠源羊抗鼠类普通二抗)、国外对照试剂盒(质控线与实验组相同,即质控线固定抗人PCT抗原)进行同时对比检测,且对于同种血清,每种试剂盒都做两个平行,并计算出相应的均值。实验组试剂盒与国内对照粗试剂盒分别与国外试剂盒用均值做正太分布的对比,结果见表4和表5。
表4
表5
根据以上数据做出的国外对照组与国内对照组、实验组的正态分布图分别如图2和图3所示。实验结果:正态分布图可以看出,采用本发明方法的实验组数据与国外对照数据正态分布优于国内对照数据与国外对照数据的正态分布,即实验组试剂盒的检测值更加准确。
以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出的是,上述优选实施方式不应视为对本发明的限制,本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明的精神和范围内,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种定量检测降钙素原的方法,其特征在于,包括以下步骤:
将待检测样品与荧光标记的抗降钙素原第一抗体混合,得到含降钙素原抗原抗体复合体的反应液;将该反应液在反应介质中分别与抗降钙素原第二抗体、降钙素原抗原反应,分别检测荧光信号;根据测得荧光信号值计算获得待检测样品中降钙素原的含量。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述计算方法具体为:检测已知浓度的标准品,分别收集标准品的两种荧光信号值并累加,用各自的累加值计算出相应的比值得出标准曲线,将待测样品的荧光信号值代入标准曲线,得出待测样品中降钙素原的含量。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述荧光标记所用的荧光素为Alexa Fluor系列荧光素。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述反应介质为试纸条。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述抗降钙素原第二抗体、降钙素原抗原固定在反应介质的不同位置。
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