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Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf Detektionsvorrichtungen zum
Detektieren einzelner Moleküle,
Gruppen ähnlicher
Moleküle,
Reihen von sich unterscheidenden Molekülen, Verfahren zum Detektieren von
diesen unter Verwenden der Detektionsvorrichtungen, und die Verwendung
derartiger Vorrichtungen und Verfahren zum Detektieren derartiger
Moleküle.
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Stand der
Technik
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In
Vorrichtungen und Verfahren des Stands der Technik, wie Matrix Assisted
Laser Ablation Time of Flight Mass Spectrometer (MALDI-TOF MS),
zum Messen der Flugzeit (TOF) von Teilchen (wie einzelne Moleküle, Gruppen ähnlicher
Moleküle,
Reihen sich unterscheidender Moleküle oder dergleichen), werden
die Teilchen von einer Matrix durch einen Laserpuls abgetragen und
in Richtung eines Zeitablaufdetektors durch ein elektrisches Feld
an einem Ende einer Vakuum-Flugröhre beschleunigt.
Der Zeitablaufdetektor ist üblicherweise
ein Mikrokanalplattendetektor, der ein Elektronenvervielfacher ist
und erfordert, dass ihn eine bestimmte Anzahl von Teilchen trifft,
bevor eine Zählrate
registriert wird. Der Zeitablaufdetektor misst die Zeit vom Laserpuls
bis eine Anzahl von Teilchen (mit im Wesentlichen demselben Masse/Ladungs-Verhältnis und
in einer ausreichenden Anzahl, um registriert zu werden) den Zeitablaufdetektor
trifft. Ein Problem mit diesen Vorrichtungen ist es, dass die Beschränkungen
in der Empfindlichkeit der Mikrokanalplattendetektoren bedeutet,
dass sie nicht zum Detektieren einzelner Teilchen geeignet sind.
Eine andere Schwierigkeit ist, dass Teilchen größerer Masse, die oft bei biologischen
Messungen wichtig sind, niedrigere Signale am Detektor erzeugen
und daher TOF MS nicht für
ihre Detektion geeignet ist.
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Im
Artikel „Laser-Induced
volatilization and Ionization of microparticles" von M.P. Sinha in Review of Scientific
Instruments, American Institute of Physics, New York, US, Band 55,
Nr. 6, Juni 1984, Seiten 886–891, ist
ein Apparat, umfassend ein Quadrupolmassenspektrometer zum Analysieren
ionisierter Teilchen, offenbart. In diesem Apparat wird, während es
sich in einem Teilchenstrahl im Flug befindet, jedes Teilchen individuell durch
einen Laserpuls ionisiert. Um den Laserstrahl mit den Teilchen zu
synchronisieren, wird die Geschwindigkeit jedes Teilchens im Strahl
durch Messen seiner Flugzeit zwischen zwei beabstandeten Laserstrahlen bestimmt.
Ein Problem mit derartigen Vorrichtungen ist es, dass Teilchen größerer Masse
niedrigere Signale am Detektor des Massenspektrometers erzeugen.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung werden mindestens einige der Probleme mit dem Stand der
Technik mittels Vorrichtungen gelöst, die die Merkmale besitzen,
die in den kennzeichnenden Abschnitten des Anspruchs 1 und des Anspruchs
2 vorhanden sind, und durch Verfahren mit den Merkmalen, die im
kennzeichnenden Abschnitt des Anspruchs 4 erwähnt sind. Insbesondere können die
Vorrichtungen der Ansprüche
1 und 2 Photonen von Licht oder anderer elektromagnetischer Strahlung,
die durch ein einzelnes Teilchen oder durch eine Reihe von Teilchen
oder Gruppen von Teilchen gestreut werden, detektiert werden. Außerdem ergibt
die vorliegende Erfindung eine hohe Empfindlichkeit für Teilchen
größerer Masse,
die aufgrund ihrer hohen Masse, aber relativ geringen Geschwindigkeit,
schwierig in Massenspektrometern des Stands der Technik zu detektieren
sind, die aber aufgrund ihrer großen Größe, viele Photonen streuen
und deshalb relativ leicht unter Verwenden der vorliegenden Erfindung
zu detektieren sind.
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Kurze Beschreibung
der Figuren
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1a) zeigt schematisch eine Seitenansicht einer
ersten Ausführungsform
einer Vorrichtung gemäß der vorliegenden
Erfindung;
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1b) zeigt schematisch einen vergrößerten Abschnitt
durch die Linie I-I der Vorrichtung der 1a);
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2a) zeigt schematisch eine zweite Ausführungsform
einer Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung;
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2b) zeigt schematisch einen vergrößerten Abschnitt
durch die Linie II-II der Vorrichtung der 2a);
und
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3 zeigt
eine dritte Ausführungsform
einer Vorrichtung gemäß der vorliegenden
Erfindung.
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Detaillierte Beschreibung
der Ausführungsformen,
die die Erfindung veranschaulichen
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1a und 1b zeigen
schematisch und nicht maßstabsgetreu
eine erste Ausführungsform
eines Massenspektrometers 1 gemäß der vorliegenden Erfindung.
Gut bekannte Merkmale des Massenspektrometers 1, die nicht
für die
vorliegende Erfindung relevant sind, wurden aus Gründen der
Klarheit weggelassen. Das Massenspektrometer 1 (z. B. Ettan
Mass Spectrometer von Amersham Biosciences, Schweden) besitzt an
seinem proximalen Ende 2 eine Probenkammer 3,
in der eine zu analysierende Probe 5 ionisiert werden kann, durch
Ionisierungsmittel, wie ein Laser 6. Die Probe kann eine
beliebige Substanz von Interesse sein, z. B. eine biologische Probe
in der Form eines Gewebestückes
oder einer Fluidprobe oder eines Schmiers oder Blots oder dergleichen,
oder eine Probe mit einer oder mehreren chemischen Verbindungen,
die identifiziert werden müssen,
oder eine Substanz, deren Zusammensetzung untersucht wird, etc.
Die Probenkammer 3 besitzt eine Öffnung 7, die in eine
verlängerte
Flugkammer 9 führt.
Wenn das Massenspektrometer 1 verwendet wird, kann Luft
aus der Flugkammer 9 derart evakuiert werden, dass sie
ein nahes Vakuum enthält.
Gegebenenfalls kann das distale Ende 17 der Flugkammer 9 mit
einem Sammelmittel 10 zum Sammeln von Ionen derart versehen
sein, dass die Komponenten der Probe 5 für eine weitere
Analyse gesammelt werden können.
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Wie
in 1b gesehen werden kann, ist die
Flugkammer 9 mit einem Detektionsmittel für elektromagnetische
Strahlung versehen, wie eine Photovervielfacherröhre 11, z. B. eines
Photonenzähltyps
(z. B. ein Hamamatsu R7400P aus Japan), oder ein Photonenzählmodul
(z. B. ein Perkin Elmer SPCM-AQR-12-FC, USA),
das zum Erzeugen eines Ausgabesignals von einem einzeln detektierten
Photon fähig
ist (wobei die Quanteneffizienz des Detektors in Betracht gezogen
wird), derart angeordnet, dass seine Einlasslinse 13 im Wesentlichen
senkrecht zu und dem nominalen Flugweg FPnom zugewandt
ist, den die ionisierten Teilchen 15 der Probe 5 nehmen,
wenn sie durch die Flugkammer 9 fliegen. Die Photovervielfacherröhre 11 ist
in der Nähe des
distalen Endes 17 der Flugkammer angeordnet.
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Eine
Quelle elektromagnetischer Strahlung, z. B. Licht, detektierbar
durch die Photovervielfacherröhre 11,
z. B. ein Laser 19 (z. B. ein Coherent Inc., USA, INNOVA
Argon Laser), ist angeordnet, um einen Strahl 21 einer
Strahlung durch ein Fenster 22a in die Flugkammer 9 auf
den nominalen Flugweg FPnom vor der Photovervielfachereingangslinse 13 zu
strahlen, aber auf eine derartige Weise, dass der Strahl 21 nicht
direkt in die Eingangslinse 13 strahlt. Die dem Fenster 22a gegenüberliegende
Seite der Flugkammer ist mit einem Fenster 22b versehen,
das zu einem Lichtentsorger 24 führt, der den Strahl 21 absorbiert
und verhindert, dass jegliches Licht vom Strahl 21 in die
Flugkammer 9 zurückreflektiert
wird. Um die Menge von unerwünschtem
gestreutem Licht vom Strahl 21 während seiner Passage vom Laser
zum Lichtentsorger 24 zu verringern, sind die Fenster 22a, 22b bevorzugt
als Brewster-Fenster erzeugt (von CVI Laser Corp, USA), d, h. sie
sind im Brewster-Winkel
geneigt, um die Reflektionsverluste (und daher das durch Reflektion
gestreute Licht) auf ein Minimum zu reduzieren, und Schwarzlicht-Baffles 26 mit
kleinen Löchern,
die mit dem Laserstrahl 21 in einer Linie angeordnet sind,
sind zwischen den Fenstern und der Probe 15 angeordnet,
um weiter die Menge von unerwünschtem
Licht zu reduzieren, das in die Flugkammer 9 eintritt.
Wie in 1b gesehen werden kann, ist die
Photovervielfacherröhre 11 bevorzugt
mit einer Eingangslinse 13 senkrecht zum Weg des Strahls 21 angeordnet.
Ggf. kann eine Pinhole-Aperture 14 und/oder Sammellinsen 18 (50mm
Durchmesser, f = 100mm 14 KLA 001/078-Sammellinsen von Melles Griot,
USA) vor der Photovervielfacherröhre 11 derart
angeordnet sein, dass das detektierbare Volumen, in dem der nominale
Flugweg FPnom und der Strahl 21 übereinstimmen, auf
das Pinhole 14 abgebildet wird, und dadurch das bereitstellt,
was im Allgemeinen als eine konfokale Anordnung bekannt ist. Diese
konfokale Anordnung besitzt den Vorteil, dass Streuphotonen, die
nicht vom detektierbaren Volumen herrühren, den Detektor 11 erreichen.
Da die Flugkammer 9 unter Vakuum ist, werden bei Nichtvorhandensein
irgendeines Materials, das durch den Strahl 21 läuft, keine
Photonen vom Strahl 21 in die Eingangslinse 13 gestreut
und die Photovervielfacherröhre 11 wird
nicht das Vorhandensein von Licht registrieren. Jedoch, wenn ein
Teilchen 15 durch den Strahl 21 läuft, dann
werden einige Photonen 25 vom Strahl 21 gestreut
(schematisch gezeigt durch gestrichelte Linien) und, statistisch,
ist es wahrscheinlich, dass einige von jenen in die Eingangslinse 13 eintreten
und durch die Photovervielfacherröhre 11 detektiert
werden. Ionisierungsmittel 6, die Quelle elektromagnetischer
Strahlung 19 und die Photovervielfacherröhre 11 sind
mit einem Steuerungs- und Datenaufnahme- und Verarbeitungsmittel verbunden,
wie ein Mikroprozessor oder ein Computer 23. Das Steuerungs-
und Datenaufnahme- und Verarbeitungsmittel 23 steuert den
Betrieb des Ionisierungsmittels 6 und enthält Zeitmessmittel
zum Aufnehmen der Flugzeit ΔT
von einer Probe 5, die ionisiert wird, bis Photonen durch
die Photovervielfacherröhre 11 detektiert
werden. Die Flugzeit AT für
ein Teilchen, das das Licht von der Quelle der elektromagnetischen
Strahlung 11 streut, ist proportional zu der Masse des Teilchens 15,
so dass es, sobald ΔT
bekannt ist, möglich
ist, die Masse des Teilchens 15 zu bestimmen, das das Streuen
verursachte. Eine zweite Streulichtdetektionsanordnung, umfassend
eine Photovervielfacherröhre 11' und Optiken 13', 14', kann gegebenenfalls
durch ein Fenster 22d angeordnet sein, um Licht, das vom Teilchen 15 gestreut
wird, zu detektieren. Die Ausgabe von dieser Anordnung könnte zusammen
mit der Ausgabe von der ersten Streulichtdetektionsanordnung unter
Verwenden von PMT 11 verarbeitet werden, um ein genaueres
System zu ergeben.
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Alternativ
kann ein Parabolspiegel 28 (gezeigt durch gestrichelte
Linien in 1a, 1b)
ggf. in der Flugkammer 9 gegenüber von PMT 11 derart
angeordnet sein, dass jegliches Licht, das eintritt, auf die Eingangslinse 13 des
PMT 11 reflektiert wird. Auf diese Weise könnte fast
die Hälfte
des durch das Teilchen 15 gestreuten Lichtes auf PMT 11 übertragen
werden.
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Um
die höchstmöglichen
Empfindlichkeiten zu erreichen, ist es möglich, die Photovervielfacherröhre zu kühlen, um
ihr Untergrundrauschen zu verringern, das als Untergrundzählraten
bezeichnet wird.
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Eine
zweite Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist schematisch und nicht maßstabsgetreu in 2a und 2b gezeigt,
und dieselben Bezugszeichen, wie sie für die Merkmale der in 1a und 1b gezeigten
Ausführungsform
verwendet werden, werden für ähnliche
Merkmale in dieser Ausführungsform
verwendet. Zusätzlich
zu einem ersten Detektionsmittel für elektromagnetische Strahlung,
wie eine Photovervielfacherröhre 11,
die am distalen Ende der Flugkammer 9 vorgesehen ist, ist
ein anderes ähnliches
Photonendetektionsmittel, wie eine Photovervielfacherröhre 31 am
proximalen Ende 27 der Flugkammer 9 angeordnet. Eine
andere Quelle elektromagnetischer Strahlung, z. B. Licht, die durch
die Photovervielfacherröhre 31 detektierbar
ist, z. B. ein Laser 39, ist angeordnet, um einen weiteren
Strahl 43 von Strahlung durch das Fenster 42a in
der Flugkammer 9 auf den nominalen Flugweg FPnom in
einem bekannten Abstand L von der Position zu strahlen, bei der
der erste Strahl 21 den nominalen Flugweg FPnom vor
der Photovervielfachereingangslinse 33 der zusätzlichen
Photovervielfacherröhre 31 schneidet,
derart, dass er nicht direkt in die Eingangslinse 33 strahlt.
Die zusätzliche
Photovervielfacherröhre 31 und
der Laser 39 sind mit dem Steuerungsmittel 23 verbunden.
In dieser Ausführungsform
wird die Photovervielfacherröhre 31,
die am proximalen Ende Flugkammer 9 angeordnet ist, verwendet,
um ein Teilchen zu detektieren, wenn Licht vom Strahl 43 durch
ein Teilchen gestreut wird, das am proximalen Ende 27 der
Flugröhre 9 vorhanden
ist. Dasselbe Teilchen wird dann eine kurze Zeit ΔT später durch
Licht detektiert, das es vom Strahl 21 streut, wobei es
an der Photovervielfacherröhre 11 am
distalen Ende 17 der Flugkammer 9 detektiert wird.
Da der Abstand L zwischen den Photovervielfacherröhren 11, 31 bekannt
ist, ist es möglich,
die Geschwindigkeit des Teilchens und nachfolgend seine Masse (oder
Masse/Ladungs-Verhältnis)
zu berechnen. Diese Berechnung kann durch Steuerungsmittel 23 ausgeführt werden,
die ein Programm zum Analysieren der Signale umfassen, die Teilchen
entsprechen, die durch die Photovervielfacherröhren 11, 31 detektiert
werden. Dieses Programm könnte
die Signale von den Photovervielfacherröhren derart korrelieren, dass
die Signale von jedem Teilchen oder Gruppe von Teilchen, die durch
die Photovervielfacherröhre
am proximalen Ende der Flugkammer 9 detektiert werden,
mit dem entsprechenden Signal verglichen werden können, das
an der Photovervielfacherröhre
am distalen Ende der Flugkammer 9 detektiert wird. Die
Zeit zwischen der Registrierung des entsprechenden Signals kann
dann verwendet werden, um die Masse des Teilchens oder der Gruppe
von Teilchen zu bestimmen, die die Signale erzeugen.
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3 zeigt
schematisch und nicht maßstabsgetreu
eine dritte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung und dieselben Bezugszeichen, wie sie
für die
Merkmale der in 2a–2b gezeigten
Ausführungsformen
verwendet werden, werden für ähnliche
Merkmale in dieser Ausführungsform
verwendet. In dieser Ausführungsform
ist die Quelle von Teilchen ein Flüssigkeitschromatograph 1' mit einer Entladungsröhre 4,
die in die Probenkammer 3 führt. Diese Entladungsröhre 4 liegt
typischerweise in der Form einer Kapillarröhre 4 vor, die eine
Düsenspitze 8 besitzt,
die in die Probenkammer 13 der Vorrichtung 1 hervorsteht.
Die Kapillarröhre 4 ist
mit einem elektrischen Potential von z. B. 3000 Volt verbunden.
Die Probenkammer 3 ist von der Flugkammer 9 durch
eine Einlassplatte 12 getrennt, die eine Einlassöffnung 16 auf
einem niedrigeren Potential als die Kapillarröhre enthält, z. B. Erdpotential. Elektrisch
geladene Flüssigkeitstropfen
verlassen die Düsenspitze 8 der Kapillarröhre 4 und
verdampfen, wenn sie in Richtung der Einlassöffnung 14 wandern.
Dies führt
zur Ionisation der Probenmoleküle
in der Flüssigkeit
und diese Moleküle
werden zum distalen Ende 17 der Flugkammer 9 geschleudert.
Diese Moleküle
verursachen ein Streuen der Strahlen 21, 43 wie
oben beschrieben, und so kann die Masse dieser Moleküle auch
durch Messen der Zeit zwischen den Signalen, die sie in den Photovervielfacherröhren erzeugen,
detektiert werden, wie auch oben beschrieben.
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Um
sicherzustellen, dass die Photovervielfacherröhren dieselben Teilchen identifizieren,
ist es bevorzugt, dass die Intensitäten der Strahlungsstrahlen,
wo sie den nominalen Flugweg FPnom schneiden,
im Wesentlichen identisch sind, und dass die Photovervielfacherröhren 11, 31 im
Wesentlichen dieselbe Spezifikation besitzen. Dies kann erreicht
werden unter Verwenden zweier Quellen 19, 39,
die eingestellt sind, um dieselbe Leistung zu erzeugen, und auf
dieselbe Spotgröße auf dem
nominalen Flugweg FPnom fokussiert sind, oder
durch Bereitstellen einer Quelle, deren Strahl in zwei Wege gesplittet
ist, einen am distalen Ende der Flugröhre und einen am proximalen
Ende, jeweils fokussiert auf dieselbe Spotgröße auf dem nominalen Flugweg FPnom. Es ist auch möglich, die Laserquelle 19 hinter
den Detektionspunkt 13 auf den anderen Detektionspunkt 33 mit
Verwendung von Spiegeln, optischen Fasern, Prismen oder dergleichen
zu lenken. Falls die Strahlen im Wesentlichen identische Intensitäten besitzen,
wird die Anzahl von Photonen, die durch ein Teilchen gestreut werden,
im Wesentlichen dieselbe am proximalen und distalen Ende der Flugkammer
sein. Es wird deshalb möglich
sein, ein Teilchen zu erkennen, das durch die proximale Photovervielfacherröhre 31 gelaufen
ist, wenn es die distale Photovervielfacherröhre 31 durchläuft, da
die Anzahl von Photonen, die durch die zwei Photovervielfacherröhren 11, 31 detektiert
werden, im Wesentlichen dieselbe sein wird.
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Es
kann auch in Betracht gezogen werden, einen einzelnen Detektor zu
verwenden und das gestreute Licht von einer Anzahl von Streupunkten
entlang des nominalen Flugwegs des/der Moleküls/Möleküle mittels Linsen, Faseroptiken,
Spiegeln, etc. zu dem einzigen Detektor zu leiten.
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Man
beachte, dass die Anzahl von Teilchen, die durch ein Teilchen gestreut
werden, gegeben ist durch:
wobei
- λ
- = Wellenlänge,
- n
- = Brechungsindex des
Zeichens
- a
- = Teilchenradius
- N
- = Anzahl von Photonen
pro Sekunde pro Einheitswatt
- t
- = Zeit und
- l2
- = der Durchmesser/die
Breite des Laserfokus-Querschnitts.
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So
ist die Anzahl von durch ein Teilchen gestreuten Photonen abhängig unter
anderem von der vierten Potenz des Radius des Teilchens. Falls λ = 500nm,
n = 1.6, N = 2.5 E + 18, t = 1.0 E – 8 und l = 1.0 E + 8nm, würde ein
Teilchen oder Molekül
mit einem Durchmesser von 20nm ungefähr 18000 Photonen in 1ns unter
Verwenden eines 1W-Lasers streuen. Ein Teilchen mit einem Durchmesser
von 30nm würde
ungefähr
460000 Photonen mit einem 1W-Laser streuen. Typischerweise arbeitet
ein Photovervielfacher mit 5 bis 10 % Wirkungsgrad, d. h. er registriert
nur einen Treffer, wenn er von 10 bis 20 Photonen getroffen wird,
und um das Registrieren von Artefakten als Moleküle oder Teilchen zu vermeiden,
könnte
ein Schwellenwert derart gesetzt sein, dass ein Treffer nur registriert
wird, falls z. B. 3 oder 5 Protonen in 1s detektiert werden. Dies
bedeutet, dass es unter Verwenden von nur einem 1W-Laser möglich ist,
zuverlässig
das Licht zu detektieren, das durch ein 20nm-Durchmesser-Teilchen
gestreut wird. Kleinere Teilchen sind zuverlässig detektierbar unter Verwenden
eines leistungsfähigeren
Lasers. Dies kann erreicht werden durch Pulsen des Lasers derart,
dass er Pulse kurzer Dauer abfeuert, die viel höhere Energieniveaus besitzen,
z. B. von der Größenordnung
von kW, und die zeitlich so eingeteilt sind, dass sie den nominalen
Flugweg schneiden, wenn erwartet wird, dass Teilchen durch den/die
Detektionspunkt(e) laufen. Es könnte
auch erreicht werden durch Konstruieren der Vorrichtung derart, dass
der nominale Flugweg durch die Laserkavität eines Lasers läuft, wo
die Laserintensität
auf ihrer höchsten Intensität ist.
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Um
zu verhindern, dass die Teilchen etc. durch den/die Strahlen) der
elektromagnetischen Strahlung abgelenkt werden, kann in Betracht
gezogen werden, zwei Zählraten-verbreitende
Strahlen von im Wesentlichen gleicher Stärke bereitzustellen, die auf
dasselbe Volumen auf dem nominalen Flugweg fokussiert sind, d. h.
zwei Strahlen bereitzustellen, die mit einem 180° Winkel zwischen ihren Achsen
derart angeordnet sind, dass sich ihre Wirkungen auf die Teilchen
aufheben.
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Es
kann auch in Betracht gezogen werden, eine Mehrzahl von Detektionsvorrichtungen
zum Detektieren der gestreuten Strahlung von jedem Strahl zu verwenden,
um die Anzahl von Signalen zu vergrößern, die für jedes Teilchen oder dergleichen
empfangen werden. Dies würde
eine Mehrzahl von Signalen für
jedes detektierte Teilchen oder dergleichen ergeben und würde die
Korrelation zwischen den an verschiedenen Positionen auf dem nominalen
Flugweg detektierten Signalen genauer machen.
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Die
oben erwähnten
Ausführungsformen
dienen zum Veranschaulichen der vorliegenden Erfindung und dienen
nicht zum Beschränken
des beanspruchten Schutzumfangs, der durch die folgenden Ansprüche beansprucht
wird.
