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Die
Erfindung bezieht sich auf das oligopeptide Efrapeptin zur Behandlung
von Erkrankungen, die auf Angiogenese basieren, wie z.B. Krebs,
Arteriosklerose, Psoriasis und die Maculadegeneration.
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Die
Angiogenese ist die Bildung von neuen Blutgefäßen aus bereits bestehenden
Gefäßen mittels
Migration und Multiplizierung von Endothelzellen (Folkman, J. Angiogenesis
and angiogenesis inhibition: an overview, EXS, 79, 1–8 (1977).
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Mit
Ausnahme die Wundheilung und die Monatsblutung, tritt die Angiogenese
bei Erwachsenen nur in pathologischen Zuständen auf, wie Neoplasma, Arteriosklerose,
Psoriasis, Maculadegeneration, wobei die Angiogenese zum Wachstum
und zum Auftreten der Krankheitssymptome beiträgt. Zum Beispiel, ist beobachtet worden,
dass massive Karzinome über
eine Mindestgröße hinaus
nicht weiter wachsen und auch keine Metastase bilden, wenn sie kein
Gefäßsystem
entwickeln (Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid
and other disease. Nat. Med., 1 (1), 27–31 (1995) und Folkman, J.:
What is the Evidence that Tumors are Angiogenesis Dependent? J.
Natl. Canc. Inst., 82, 4–6
(1990)).
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Zu
den Erkrankungen, die in Verbindung mit der Angiogenese stehen,
gehören
zudem die Endometriose, das Kaposi-Sarkom und andere Erkrankungen
im Zusammenhang mit HIV, Leukämie,
Myokard-Angiogenese, das neovasale Glaukoma und die Retinopathie
bei Zuckerkranken. Wie aus diesem Text ersichtlich, wird der Begriff „Erkrankungen,
die in Verbindung mit der Angiogenese stehen" für
pathologische Zustände
benutzt, die die Reproduktion der Endothelzellen für Wachstum
und Symptome, benötigen.
(Chappey et al., Endothelial cells in culture: an experimental model
for the study of vascular dysfunctions. Cell Biol. Toxicol., 12 (4–6), 199–205 (1996).
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Es
gibt zahlreiche experimentelle Ergebnisse, die aussagen, dass die
Unterdrückung
einer Angiogenese bei Menschen und Tieren, die an einer im Zusammenhang
damit stehenden Krankheit leiden, zu einer Linderung der Symptome,
einer Stilllegung der Fortschreitung und sogar zur Therapie führen kann.
Zum Beispiel, sind die Verbindungen, die die Reproduktion der Endothelzellen
unterdrücken,
imstande die Inhibition der Angiogenese bei Krebs hervor zu rufen
und somit das Wachstum und die Metastasen des Neoplasma bei verschiedenen
Tiermodellen, aber auch beim Menschen, die sich an diesen klinischen
Modellen beteiligt haben, einzuschränken. (Eatock et al., Tumor
vasculature as a target for anticancer therapy, Cancer Treat Rev., 26
(3), 191–201
(2000)).
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Es
ist offensichtlich, dass für
die Therapie von Krebs und anderen Erkrankungen, die im Zusammenhang
mit der Angiogenese stehen, eine Methode benötigt wird, die die Multiplizierung
der Endothelzellen verhindert.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung, werden Methoden zur Therapie von Erkrankungen definiert,
die in Zusammenhang mit der Multiplizierung der Endothelzellen stehen.
Diese Methoden beziehen auch die Verabreichung eines Rezepts an
Menschen oder Tieren mit ein, das therapeutische Dosen des oligopeptiden
Efrapeptins beinhaltet. Efrapeptine gehören zur Gattung der nicht polaren,
hydrophoben Peptide, die sich von den pathogenen Pilzen isolieren
und aus gewöhnlichen
Aminosäuren,
wie Alanin, Glysin, Leukin und nicht gewöhnlichen Aminosäuren, wie α-Aminobuttersäure, β-Alanin,
Isovalin und Pipekolsäure.
Efrapeptine haben ihr Aminoende gebunden an ein Acetylende und das
Karboxylende gebunden an N-Peptid-1-Isobutulo-2-[1-Pyrrolo-(1,2-α)-Pyrimidin,
2,3,4,5,6,7,8-exahydro]-äthylamin
(Krasnoff et al., Antifungal and Insecticidal Properties of the
Efrapeptins: Metabolites of the Fungus Tolypocladium niveum, J.
Invert. Path., 58, 180–188
(1991)).
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Aufgrund
des vorliegenden Patents, beweisen die Efrapeptine eine bemerkenswerte
Inhibition der Multiplizierung der Endothelzellen, die durch die
Existenz von Nährstoffen
gewährleistet
wird. Zusätzlich
dazu, verhindert die Verabreichung von Efrapeptinen mittels eines
geeigneten Arzneiträgers,
das Fortschreiten der Erkrankungen, die in Zusammenhang mit der
Angiogenese stehen, wie dies bei der Entwicklung eines primären Karzinomtumors
der Fall ist.
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Die 1 zeigt
die Inhibition der Multiplizierung der Endothelzellen durch Efrapeptin
D (SEQ ID NO 2). Die 2 zeigt die Inhibition der Migration
der Endothelzellen durch Efrapeptin D (SEQ ID NO 2). Die 3 zeigt
die Wachstumsverhinderung von Krebs nach der Verabreichung von Efrapeptin
D (SEQ ID NO 2).
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Die
Merkmale und Eigenschaften dieses Patents werden in der folgenden
detaillierten Beschreibung dargestellt oder lassen sich daraus ableiten.
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Dieses
Patent definiert Methoden zur Therapie von Erkrankungen, die in
Zusammenhang mit der Angiogenese stehen. Die Therapie besteht aus
der Verabreichung eines Efrapeptins oder einer Mischung von Efrapeptinen
in ausreichender Dosierung zur Inhibition der unerwünschten
Multiplizierung von Endothelzellen, konkreter der Angiogenese, und
noch konkreter, von Erkrankungen, die in Zusammenhang mit der Angiogenese
stehen.
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Beispiel 1
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Ergebnis der Einflussnahme
von Efrapeptin D (SEQ ID NO 2) auf die Multiplizierung der Endothelzellen.
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Die
gewöhnliche
Kultur von menschlichen Endothelzellen aus der Nabelschnur (HUVECs)
umschloss ihre Multiplizierung als komplette Abdeckung der Kulturoberfläche durch
Zellen. Anschließend,
lösten
sich die Zellen mit Trypsin, verteilten sich auf eine Fläche von
96 Kanäle,
mit 5000 Zellen pro Kanal, und man ließ sie danach ruhen, damit sie
sich wieder anheften konnten. Danach, wurden die Zellen durch die
vorliegende Lösung
von 20 ng/mL des grundlegenden Fibroblasten-Wachstumsfaktors (bFGF) zur Multiplizierung
stimuliert. Es wurden den Kanälen
zudem Konzentrationen von Efrapeptin D (SEQ ID NO 2) von 10 nM bis
10 μM beigefügt. Nach
einem Zeitraum von 48 Stunden wurde die Multiplizierung der Endothelzellen
berechnet mittels Cyquant Cell Proliferation Assay, anhand der Benutzungsanweisungen
des Herstellers. Die Inhibition der Multiplizierung der Zellen wird
erwähnt
als % Minderung der Zellendichte und aufgrund der folgenden Formel
berechnet:
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Das
Efrapeptin D (SEQ ID NO 2) behindert um 50% die Multiplizierung
der Endothelzellen mit einer Inhibitionslösung von 0.75 μM. In der 1 wird
das unproduktive Ergebnis von Efrapeptin D (SEQ ID NO 2) dargestellt.
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Beispiel 2
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Ergebnis der Einflussnahme
von Efrapeptin D (SEQ ID NO 2) auf die Migration der menschlichen
Endothelzellen
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Die
Migration von HUVECs wurde in abgeänderten Gefäßen Boyden ausgewertet unter
der Benutzung eines Schemas mit 48 Kanälen, die aus oberen und unteren
Kanälen
bestanden und durch ein Polycarbonatfilter mit 8 μm Poren und
einer Kollagenschicht getrennt waren. Die HUVECs wurden den unteren
Kanälen
und der Migrationsfaktor (5 ng/mL VEGF) den oberen Kanälen beigemengt. Über 6 Stunden
migrierten bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 die
HUVECs von den unteren zu den oberen Kanälen, bei Untermischung mit und
ohne Efrapeptin D (SEQ ID NO 2) in einer Menge von 100 nM bis zu
10 μM. Am
Ende des vorgesehenen Zeitraums, wurden die Filter entfernt und
die Zellen der Filter wurden stabilisiert, mit Hämatoxylin eingefärbt und
unter dem Mikroskop abgezählt.
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Das
Efrapeptin D (SEQ ID NO 2) behinderte die von VEGF stimulierte Migration
der HUVECs. Das Antimigrations-Beispiel des oligopeptiden Efrapeptins
wird in der 2 abgebildet. Die aufgeführten Werte beziehen
sich auf Durchschnittswerte zehn Felder und die Senkrechten stellen
die Standardabweichung dar.
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Beispiel 3
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Anti-Krebs Ergebnis von
Efrapeptin D (SEQ ID NO 2)
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Zwei
Gruppen von jeweils neun C57BL/6 Mäusen erhielten eine subkutane
Injektion mit 1 × 106 Zellen/0.2 mL Lewis Lungen- Karzinomzellen
(LLC). Die Therapie, die begann als die Tumore palpabel waren, bestand
aus täglichen
Injektionen in die Bauchregion von 0.3 mg/kg Efrapeptin D (SEQ ID
NO 2) oder der gleichen Menge einer Lösung ohne Efrapeptin. Die Tiere
erhielten insgesamt vierzehn Injektionen. Die Karzinomtumore wurden
zweimal wöchentlich
aufgezeichnet und aufgrund der Formel: Karzinomtumor
= Länge × Breite2 × π/6berechnet.
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Die
Verabreichung von Efrapeptin D (SEQ ID NO 2) minderte erheblich
das Wachstum der LLC-Tumore, wie aus der 3 ersichtlich.
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