DE60132498T2

DE60132498T2 - Isoprenoidproduktion

Info

Publication number: DE60132498T2
Application number: DE60132498T
Authority: DE
Inventors: Ravi Plymouth GOKARN; Holly Chanhassen JESSEN; Mary Jo Wayzata ZIDWICK
Original assignee: Cargill Inc
Current assignee: Cargill Inc
Priority date: 2000-09-29
Filing date: 2001-09-28
Publication date: 2009-01-15
Anticipated expiration: 2021-09-29
Also published as: AU2001296359B2; AU9635901A; WO2002026933A3; WO2002026933A2; US20030219798A1; ATE384119T1; EP1383864A4; HK1062580A1; EP1383864A2; EP1383864B1; DE60132498D1; WO2002026933A9

Description

HINTERGRUND
1. Technisches Gebiet
Die Erfindung bezieht sich auf Methoden und Materialien, die in der Herstellung von Isoprenoiden Verwendung finden.
2. Hintergrundinformation
Isoprenoide sind Verbindungen, die mindestens eine Fünf-carbon-isoprenoideinheit besitzen. Beispiele von Isoprenoidverbindungen beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, Carotinoide, Isoprene, Sterole, Terpene und Ubiquinone. Verschiedene enzymatische Wege in -Pflanzen, Tieren und Mikroorganismen enden in der Herstellung von Isoprenoidverbindungen. Typischerweise werden Isopentenyldiphosphate (IPP), Dimethylallyldiphosphate (DMAPP) oder Kombinationen daraus polymerisiert, um Isoprenoidverbindungen zu bilden.
Zwei Wege können verwendet werden, um IPP herzustellen. Der erste Weg, bekannt als Mevalonat-abhängiger Weg, stellt IPP aus 3-Hydroxymethyl-3-methylglutaryl-Coenzym A (HMGCoA) in einer Reihe von Reaktionen her. Der zweite Weg, bekannt als Mevalonatunabhängiger Weg, stellt IPP aus 1-Deoxyxylulose-5-phosphat (DXP) in einer Reihe von Reaktionen her. Eine dieser Reaktionen beruht auf der Nutzung der DXP-Synthase (DXS), um die Verdichtung von Pyruvat und Glyceraldehyd-3-phosphat zu katalysieren, um DXP herzustellen.
Einmal hergestellt, kann IPP dazu verwendet werden, verschiedene Isoprenoidverbindungen herzustellen. Insbesondere als Polyprenyldiphosphatsynthasen (DDS) bekannte Enzyme katalysieren Polymerisationsreaktionen, die IPP und DMAPP verknüpfen, um Verbindungen herzustellen, die als Polyprenyldiphosphate bekannt sind. Beispielsweise katalysiert Decaprenyldiphosphatsynthase (DDS) die fortlaufende Verdichtung von IPP mit allylischen Diphosphaten, um Decaprenyldiphosphat herzustellen. Decaprenyldiphosphat ist ein Polyprenyldiphosphat, das verwendet werden kann, um die Seitenkette eines Ubiquinons, welches als CoQ(10) bekannt ist, auszubilden. Andere Polyprenyldiphosphatsynthasen beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, Farnesyl-, Geranyl- und Octaprenyldiphosphatsynthasen.
ZUSAMMENFASSUNG
Die Erfindung bezieht sich auf Methoden und Materialien, die in der Herstellung von Isoprenoidverbindungen Verwendung finden. Besonders beschrieben werden hierbei Nukleinsäuremoleküle, Polypeptide, Wirtszellen und Methoden, die verwendet werden können, um Isoprenoidverbindungen herzustellen. Isoprenoidverbindungen sind sowohl biologisch als auch kommerziell von Bedeutung. Beispielsweise verwendet die Nahrungsmittelindustrie Isoprenoidverbindungen als Nahrungsergänzungsstoffe, während die Parfumherstellung Isoprenoidverbindungen als Duftstoffe nutzt. Die Nukleinsäuremoleküle, die hier beschrieben werden, können verwendet werden, um Wirtszellen zu konstruieren, die die Fähigkeit haben, bestimmte Isoprenoidverbindungen herzustellen. Die hier beschriebenen Polypeptide können dazu verwendet werden, in zellfreien Systemen bestimmte Isoprenoidverbindungen zu erzeugen. Die hier beschriebenen Wirtszellen können in Kultursystemen dazu verwendet werden, große Mengen bestimmter Isoprenoidverbindungen herzustellen.
Gewöhnlich wird eine isolierte Nukleinsäure dargestellt, welche eine Nukleinsäuresequenz enthält, die eine Länge und Prozentidentität zu der in SEQ ID NO:1 dargelegten Sequenz über die Länge besitzt, wobei der Punkt, der durch die Länge und Prozentidentität definiert wird, sich innerhalb der Fläche befindet, die durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird, wobei Punkt A die Koordinaten (3626, 100) besitzt, Punkt B die Koordinaten (3626, 65) besitzt, Punkt C die Koordinaten (50, 65) besitzt und Punkt D die Koordinaten (12, 100) besitzt. Punkt B kann die Koordinaten (3626, 85) besitzen. Punkt C kann die Koordinaten (100, 65) besitzen. Punkt C kann die Koordinaten (50, 85) besitzen. Punkt D kann die Koordinaten (15, 100) besitzen. Die Nukleinsäuresequenz kann ein Polypeptid kodieren. Das Polypeptid kann DXS-Aktivität besitzen. Die Nukleinsäuresequenz kann so sein wie in SEQ ID NO:1 dargelegt.
Weiterhin wird eine isolierte Nukleinsäure dargestellt, welche eine Nukleinsäuresequenz enthält, die eine Länge und Prozentidentität zu der in SEQ ID NO:2 dargelegten Sequenz über die Länge besitzt, wobei der Punkt, der durch die Länge und Prozentidentität definiert wird, sich innerhalb der Fläche befindet, die durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird, wobei Punkt A die Koordinaten (1926, 100) besitzt, Punkt B die Koordinaten (1926, 65) besitzt, Punkt C die Koordinaten (50,65) besitzt und Punkt D die Koordinaten (12, 100) besitzt. Die Nukleinsäuresequenz kann ein Polypeptid kodieren. Das Polypeptid kann DXS-Aktivität besitzen.
Weiterhin wird eine isolierte Nukleinsäure dargestellt, welche eine Nukleinsäuresequenz enthält, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid kodiert, welches eine Aminosäuresequenz enthält, wobei die Aminosäurensequenz eine Länge und Prozentidentität zu der in SEQ ID NO:3 dargelegten Sequenz über die Länge besitzt, wobei der Punkt, der durch die Länge und Prozentidentität definiert wird, sich innerhalb der Fläche befindet, die durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird, wobei Punkt A die Koordinaten (641, 100) besitzt, Punkt B die Koordinaten (641, 65) besitzt, Punkt C die Koordinaten (25, 65) besitzt und Punkt D die Koordinaten (5, 100) besitzt. Das Polypeptid kann DXS-Aktivität besitzen.
Weiterhin wird eine isolierte Nukleinsäure dargestellt, welche eine Nukleinsäuresequenz enthält, die eine Länge und Prozentidentität zu der in SEQ ID NO:37 dargelegten Sequenz über die Länge besitzt, wobei der Punkt, der durch die Länge und Prozentidentität definiert wird, sich innerhalb der Fläche befindet, die durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird, wobei Punkt A die Koordinaten (1990, 100) besitzt, Punkt B die Koordinaten (1990, 65) besitzt, Punkt C die Koordinaten (50, 65) besitzt und Punkt D die Koordinaten (16, 100) besitzt. Punkt B kann die Koordinaten (1990, 85) besitzen. Punkt C kann die Koordinaten (100, 55) besitzen. Punkt C kann die Koordinaten (50, 85) besitzen. Punkt D kann die Koordinaten (20, 100) besitzen. Die Nukleinsäuresequenz kann ein Polypeptid kodieren. Das Polypeptid kann DDS-Aktivität besitzen. Die Nukleinsäuresequenz kann so sein wie in SEQ ID NO:37 dargelegt.
Weiterhin wird eine isolierte Nukleinsäure dargestellt, welche eine Nukleinsäuresequenz enthält, die eine Länge und Prozentidentität zu der in SEQ ID NO:38 dargelegten Sequenz über die Länge besitzt, wobei der Punkt, der durch die Länge und Prozentidentität definiert wird, sich innerhalb der Fläche befindet, die durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird, wobei Punkt A die Koordinaten (1002, 100) besitzt, Punkt B die Koordinaten (1002, 65) besitzt, Punkt C die Koordinaten (50, 65) besitzt und Punkt D die Koordinaten (16, 100) besitzt. Die Nukleinsäuresequenz kann ein Polypeptid kodieren. Das Polypeptid kann DDS-Aktivität besitzen.
Weiterhin wird eine isolierte Nukleinsäure dargestellt, welche eine Nukleinsäuresequenz enthält, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid kodiert welches eine Aminosäuresequenz enthält, wobei die Aminosäurensequenz eine Länge und Prozentidentität zu der in SEQ ID NO:39 dargelegten Sequenz über die Länge besitzt, wobei der Punkt, der durch die Länge und Prozentidentität definiert wird, sich innerhalb der Fläche befindet, die durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird, wobei Punkt A die Koordinaten (333, 100) besitzt, Punkt B die Koordinaten (333, 65) besitzt, Punkt C die Koordinaten (25, 65) besitzt und Punkt D die Koordinaten (5, 100) besitzt. Das Polypeptid kann DDS-Aktivität besitzen.
Weiterhin wird eine isolierte Nukleinsäure dargestellt, welche eine Nukleinsäuresequenz enthält, die eine Länge und Prozentidentität zu der in SEQ ID NO:40 dargelegten Sequenz über die Länge besitzt, wobei der Punkt, der durch die Länge und Prozentidentität definiert wird, sich innerhalb der Fläche befindet, die durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird, wobei Punkt A die Koordinaten (1833, 100) besitzt, Punkt B die Koordinaten (1833, 65) besitzt, Punkt C die Koordinaten (50, 65) besitzt und Punkt D die Koordinaten (16, 100) besitzt. Punkt B kann die Koordinaten (1833, 85) besitzen. Punkt C kann die Koordinaten (100, 65) besitzen. Punkt C kann die Koordinaten (50, 85) besitzen. Punkt D kann die Koordinaten (20, 100) besitzen. Die Nukleinsäuresequenz kann ein Polypeptid kodieren. Das Polypeptid kann DDS-Aktivität besitzen. Die Nukleinsäuresequenz kann so sein wie in SEQ ID NO:40 dargelegt.
Weiterhin wird eine isolierte Nukleinsäure dargestellt, welche eine Nukleinsäuresequenz enthält, die eine Länge und Prozentidentität zu der in SEQ ID NO:41 dargelegten Sequenz über die Länge besitzt, wobei der Punkt, der durch die Länge und Prozentidentität definiert wird, sich innerhalb der Fläche befindet, die durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird, wobei Punkt A die Koordinaten (1014, 100) besitzt, Punkt B die Koordinaten (1014, 65) besitzt, Punkt C die Koordinaten (50, 65) besitzt und Punkt D die Koordinaten (16, 100) besitzt. Die Nukleinsäuresequenz kann ein Polypeptid kodieren. Das Polypeptid kann DDS-Aktivität besitzen.
Weiterhin wird eine isolierte Nukleinsäure dargestellt, welche eine Nukleinsäuresequenz enthält, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid kodiert welches eine Aminosäuresequenz enthält, wobei die Aminosäurensequenz eine Länge und Prozentidentität zu der in SEQ ID NO:42 dargelegten Sequenz über die Länge besitzt, wobei der Punkt, der durch die Länge und Prozentidentität definiert wird, sich innerhalb der Fläche befindet, die durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird, wobei Punkt A die Koordinaten (337, 100) besitzt, Punkt B die Koordinaten (337, 65) besitzt, Punkt C die Koordinaten (25, 65) besitzt und Punkt D die Koordinaten (5, 100) besitzt. Das Polypeptid kann DDS-Aktivität besitzen.
Weiterhin wird eine isolierte Nukleinsäure dargestellt, welche eine Nukleinsäuresequenz enthält, die eine Länge und Prozentidentität zu der in SEQ ID NO:95 dargelegten Sequenz über die Länge besitzt, wobei der Punkt, der durch die Länge und Prozentidentität definiert wird, sich innerhalb der Fläche befindet, die durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird, wobei Punkt A die Koordinaten (2017, 100) besitzt, Punkt B die Koordinaten (2017, 65) besitzt, Punkt C die Koordinaten (50, 65) besitzt und Punkt D die Koordinaten (16, 100) besitzt. Punkt B kann die Koordinaten (2017, 85) besitzen. Punkt C kann die Koordinaten (100, 65) besitzen. Punkt C kann die Koordinaten (50, 85) besitzen. Punkt D kann die Koordinaten (20, 100) besitzen. Die Nukleinsäuresequenz kann ein Polypeptid kodieren. Das Polypeptid kann DXR-Aktivität besitzen. Die Nukleinsäuresequenz kann so sein wie in SEQ ID NO:95 dargelegt.
Weiterhin wird eine isolierte Nukleinsäure dargestellt, welche eine Nukleinsäuresequenz enthält, die eine Länge und Prozentidentität zu der in SEQ ID NO:96 dargelegten Sequenz über die Länge besitzt, wobei der Punkt, der durch die Länge und Prozentidentität definiert wird, sich innerhalb der Fläche befindet, die durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird, wobei Punkt A die Koordinaten (1161, 100) besitzt, Punkt B die Koordinaten (1161, 65) besitzt, Punkt C die Koordinaten (50, 65) besitzt und Punkt D die Koordinaten (16, 100) besitzt. Die Nukleinsäuresequenz kann ein Polypeptid kodieren. Das Polypeptid kann DXR-Aktivität besitzen.
Weiterhin wird eine isolierte Nukleinsäure dargestellt, welche eine Nukleinsäuresequenz enthält, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid kodiert, welches eine Aminosäuresequenz enthält, wobei die Aminosäurensequenz eine Länge und Prozentidentität zu der in SEQ ID NO:97 dargelegten Sequenz über die Länge besitzt, wobei der Punkt, der durch die Länge und Prozentidentität definiert wird, sich innerhalb der Fläche befindet, die durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird, wobei Punkt A die Koordinaten (386, 100) besitzt, Punkt B die Koordinaten (386, 65) besitzt, Punkt C die Koordinaten (25, 65) besitzt und Punkt D die Koordinaten (5, 100) besitzt. Das Polypeptid kann DXR-Aktivität besitzen.
Weiterhin wird eine isolierte Nukleinsäure dargestellt, welche eine Nukleinsäuresequenz von mindestens 12 Nukleotiden enthält, wobei die isolierte Nukleinsäure unter Hybridisierungsbedingungen zum sense- oder antisense-Strang eines Nukleinsäuremoleküls hybridisiert, wobei die Sequenz des Nukleinsäuremoleküls die in SEQ ID NO:1, 2, 37, 38, 40, 41, 95 oder 96 dargelegte Sequenz ist. Die Nukleinsäuresequenz kann aus mindestens 50 Nukleotiden bestehen (z. B. mindestens 100, 200, 300, 400, 500 oder mehr). Die Nukleinsäuresequenz kann ein Polypeptid kodieren. Das Polypeptid kann DXS-, DDS- oder DXR-Aktivität besitzen.
Weiterhin wird ein im Wesentlichen reines Polypeptid dargestellt, welches eine Aminosäuresequenz enthält, wobei die Aminosäurensequenz eine Länge und Prozentidentität zu der in SEQ ID NO:3 dargelegten Sequenz über die Länge besitzt, wobei der Punkt, der durch die Länge und Prozentidentität definiert wird, sich innerhalb der Fläche befindet, die durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird, wobei Punkt A die Koordinaten (641, 100) besitzt, Punkt B die Koordinaten (641, 65) besitzt, Punkt C die Koordinaten (25, 65) besitzt und Punkt D die Koordinaten (5, 100) besitzt. Das Polypeptid kann DXS-Aktivität besitzen.
Weiterhin wird ein im Wesentlichen reines Polypeptid dargestellt, welches eine Aminosäuresequenz enthält, wobei die Aminosäurensequenz eine Länge und Prozentidentität zu der in SEQ ID NO:39 dargelegten Sequenz über die Länge besitzt, wobei der Punkt, der durch die Länge und Prozentidentität definiert wird, sich innerhalb der Fläche befindet, die durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird, wobei Punkt A die Koordinaten (333, 100) besitzt, Punkt B die Koordinaten (333, 65) besitzt, Punkt C die Koordinaten (25, 65) besitzt und Punkt D die Koordinaten (5, 100) besitzt. Das Polypeptid kann DDS-Aktivität besitzen.
Weiterhin wird ein im Wesentlichen reines Polypeptid dargestellt, welches eine Aminosäuresequenz enthält, wobei die Aminosäurensequenz eine Länge und Prozentidentität zu der in SEQ ID NO:42 dargelegten Sequenz über die Länge besitzt, wobei der Punkt, der durch die Länge und Prozentidentität definiert wird, sich innerhalb der Fläche befindet, die durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird, wobei Punkt A die Koordinaten (337, 100) besitzt, Punkt B die Koordinaten (337, 65) besitzt, Punkt C die Koordinaten (25, 65) besitzt und Punkt D die Koordinaten (5, 100) besitzt. Das Polypeptid kann DDS-Aktivität besitzen.
Weiterhin wird ein im Wesentlichen reines Polypeptid dargestellt, welches eine Aminosäuresequenz enthält, wobei die Aminosäurensequenz eine Länge und Prozentidentität zu der in SEQ ID NO:97 dargelegten Sequenz über die Länge besitzt, wobei der Punkt, der durch die Länge und Prozentidentität definiert wird, sich innerhalb der Fläche befindet, die durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird, wobei Punkt A die Koordinaten (386, 100) besitzt, Punkt B die Koordinaten (386, 65) besitzt, Punkt C die Koordinaten (25, 65) besitzt und Punkt D die Koordinaten (5, 100) besitzt. Das Polypeptid kann DXR-Aktivität besitzen.
Ein Aspekt der Erfindung stellt eine Wirtszelle dar, die eine Nukleinsäure, wie in den Ansprüchen definiert, enthält. Die Wirtszelle kann prokaryotisch sein. Die Wirtszelle kann eine Rhodobacter-, Sphingomonas- oder Escherichia-Zelle sein. Die Wirtszelle kann eine exogene Nukleinsäure enthalten, die ein Polypeptid kodiert, welches DDS-, DXS- oder Chorismatlyaseaktivität besitzt. Die Wirtszelle kann eine exogene Nukleinsäure enthalten, die eine UbiC-Sequenz oder eine LytB-Sequenz enthält. Die Wirtszelle kann eine exogene Nukleinsäure enthalten, die eine UbiC-Sequenz und eine LytB-Sequenz enthält. Die Wirtszelle kann eine nicht funktionelle crtE-Sequenz und entweder eine nicht funktionelle ppsR-Sequenz oder eine nicht funktionelle ccoN-Sequenz enthalten. Die Wirtszelle kann eine nicht funktionelle crtE-Sequenz, ppsR-Sequenz und ccoN-Sequenz enthalten.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung stellt eine Wirtszelle, wie in den Ansprüchen definiert, dar. Weiterhin wird eine Wirtszelle dargestellt, die eine exogene Nukleinsäure und eine nicht funktionelle crtE-Sequenz, ppsR-Sequenz oder ccoN-Sequenz enthält, wobei die exogene Nukleinsäure sich innerhalb eines crtE-, ppsR- oder ccoN-Locus der Wirtszelle befindet.
Weiterhin wird eine Wirtszelle dargestellt, die eine genomische Deletion enthält, wobei die Deletion mindestens einen Teil einer crtE-Sequenz, ppsR-Sequenz oder ccoN-Sequenz umfasst und wobei die Wirtszelle eine nicht funktionelle crtE-Sequenz, ppsR-Sequenz oder ccoN-Sequenz umfasst.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt eine Methode dar, um CoQ(10) herzustellen, wie in den Ansprüchen definiert. Weiterhin wird eine Methode dargestellt für eine zunehmende Produktion von CoQ(10) in einer Zelle, welche endogene DDS-Aktivität besitzt. Die Methode beinhaltet das Einfügen eines Nukleinsäuremoleküls, welches eine Nukleinsäuresequenz enthält, die ein Polypeptid kodiert, das eine DDS-Aktivität besitzt, in die Zelle, so dass die Produktion von CoQ(10) gesteigert wird. Das Nukleinsäuremolekül kann eine isolierte Nukleinsäure, wie in den Ansprüchen definiert, enthalten. Die Produktion von CoQ(10) kann im Vergleich zu einer Kontrollzelle, der das eingefügte Nukleinsäuremolekül fehlt, um mindestens 5 Prozent gesteigert werden. Die Zelle kann eine Rhodobacter- oder Sphingomonas-Zelle sein. Die Zelle kann ein membranhaltiges Bakterium oder ein stark membranhaltiges Bakterium sein. Die Methode kann auch das Einfügen eines zweiten Nukleinsäuremoleküls, welches eine Nukleotidsequenz enthält, die ein Polypeptid kodiert, das DXS-Aktivität besitzt, in die Zelle beinhalten. Das zweite Nukleinsäuremolekül kann eine isolierte Nukleinsäure, wie in den Ansprüchen definiert, enthalten.
Weiterhin wird eine Methode dargestellt für eine zunehmende Produktion von CoQ(10) in einer Zelle, welche endogene DDS-Aktivität besitzt. Die Methode beinhaltet das Einfügen eines Nukleinsäuremoleküls, welches eine Nukleinsäuresequenz enthält, die ein Polypeptid kodiert, das eine DXS-Aktivität besitzt, in die Zelle, so dass die Produktion von CoQ(10) gesteigert wird. Die Produktion von CoQ(10) kann im Vergleich zu einer Kontrollzelle, der das eingefügte Nukleinsäuremolekül fehlt, um mindestens 5 Prozent gesteigert werden. Die Zelle kann eine Rhodobacter- oder Sphingomonas-Zelle sein. Das Nukleinsäuremolekül kann eine isolierte Nukleinsäure, wie in den Ansprüchen definiert, enthalten. Die Zelle kann ein membranhaltiges Bakterium oder ein stark membranhaltiges Bakterium sein. Die Methode kann auch das Einfügen eines zweiten Nukleinsäuremoleküls, welches eine Nukleotidsequenz enthält, die ein Polypeptid kodiert, das DDS-Aktivität besitzt, in die Zelle beinhalten. Das zweite Nukleinsäuremolekül kann eine isolierte Nukleinsäure, wie in den Ansprüchen definiert, enthalten.
Weiterhin wird eine Methode für eine zunehmende Produktion von CoQ(10) in einem membranhaltigen Bakterium dargestellt. Die Methode beinhaltet das Einfügen eines Nukleinsäuremoleküls, welches eine Nukleinsäuresequenz enthält, die ein Polypeptid kodiert, das DDS-Aktivität besitzt, in das Bakterium, so dass die Produktion von CoQ(10) gesteigert wird.
Weiterhin wird eine Methode für eine zunehmende Produktion von CoQ(10) in einem stark membranhaltigen Bakterium dargestellt. Die Methode beinhaltet das Einfügen eines Nukleinsäuremoleküls, welches eine Nukleinsäuresequenz enthält, die ein Polypeptid kodiert, das DDS-Aktivität besitzt, in das stark membranhaltige Bakterium, so dass die Produktion von CoQ(10) gesteigert wird.
Weiterhin wird eine Methode zur Herstellung eines Isoprenoids dargestellt. Die Methode beinhaltet die Kultivierung einer Zelle unter Bedingungen, in denen die Zelle das Isoprenoid herstellt, wobei die Zelle mindestens eine exogene Nukleinsäure enthält, die mindestens ein Polypeptid kodiert, wobei die Zelle mehr Isoprenoid herstellt, als eine vergleichbare Zelle, der mindestens die eine exogene Nukleinsäure fehlt. Die Zelle kann eine Rhodobacter- oder eine Sphingomonas-Zelle sein. Das Isoprenoid kann CoQ(10) sein. Das mindestens eine Polypeptid kann DDS-, DXS-, ODS-, SDS-, DXR-, 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritolsynthase-, 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritolkinase- oder Chorismatlyase-Aktivität besitzen. Das mindestens eine Polypeptid kann ein UbiC-Polypeptid oder ein LytB-Polypeptid sein. Die Zelle kann eine nicht funktionelle crtE-Sequenz, ppsR-Sequenz oder ccoN-Sequenz enthalten. Die Zelle kann eine nicht funktionelle crtE-Sequenz, ppsR-Sequenz und ccoN-Sequenz enthalten. Die Zelle kann eine genomische Deletion enthalten, wobei die Deletion mindestens einen Teil einer crtE-Sequenz, ppsR-Sequenz oder ccoN-Sequenz enthält und wobei die Zelle eine nicht funktionelle crtE-Sequenz, ppsR-Sequenz oder ccoN-Sequenz enthält.
Weiterhin wird eine Methode zur Herstellung eines Isoprenoids dargestellt. Die Methode beinhaltet die Kultivierung einer genetisch modifizierten Zelle unter Bedingungen, in denen die Zelle das Isoprenoid herstellt. Das Isoprenoid kann CoQ(10) sein. Die Zelle kann eine exogene Nukleinsäure enthalten. Die Zelle kann eine genomische Deletion enthalten.
Sofern nicht anders definiert, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe dieselbe Bedeutung, wie sie üblicherweise von einem Fachmann, den diese Erfindung betrifft, verstanden wird. Obwohl Methoden und Materialien, die den hier beschriebenen ähnlich oder gleichbedeutend sind, in der Praxis oder beim Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden geeignete Methoden und Materialien nachstehend beschrieben. Im Fall einer Auseinandersetzung wird die vorliegende Patentschrift, einschließlich der Definitionen, dies regeln. Darüber hinaus sind die Materialien, Methoden und Beispiele nur veranschaulichend und sollen nicht einschränken. Andere Eigenschaften und Vorteile der Erfindung werden anhand der folgenden ausführlichen Beschreibung und anhand der Ansprüche klar ersichtlich sein.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Diagramm eines Herstellungsweges für CoQ(10).
2 ist eine Auflistung einer Nukleinsäuresequenz, die ein Sphingomonas trueperi-(ATCC 12417) Polypeptid kodiert, das DXS-Aktivität besitzt (SEQ ID NO:1). Das Startcodon ist das ATG auf dem Nukleotid Nummer 182 und das Stopcodon ist das TAA auf dem Nukleotid Nummer 2107. Die anzunehmende Ribosomenbindungsstelle ist auf den Nukleotiden Nummer 175–178. Diese Sequenz beinhaltet einen offenen Leserahmen, sowie 5' und 3' untranslatierte Sequenzen.
3 ist eine Auflistung einer Nukleinsäuresequenz, die ein Sphingomonas trueperi-(ATCC 12417) Polypeptid kodiert, welches DXS-Aktivität besitzt (SEQ ID NO:2). Diese Sequenz entspricht dem offenen Leserahmen.
4 ist eine Auflistung einer Aminosäuresequenz eines Sphingomonas trueperi-(ATCC 12417) Polypeptids, welches DXS-Aktivität besitzt (SEQ ID NO:3).
5 ist eine Sequenzanhäufung von 14 Nukleinsäuresequenzen, die Polypeptide kodieren, welche DSX-Aktivität besitzen. STdxsdna stellt die Nukleinsäuresequenz dar, die in SEQ ID NO:2 dargelegt wird; CRdxsdna stellt eine Nukleinsäuresequenz von Chlamydomonas reinhardtii (GenBank Zugangsnummer AJ007559; SEQ ID NO:4) dar; CJxsdna stellt eine Nukleinsäuresequenz von Campylobacter jejuni (GenBank Zugangsnummer AL139074; SEQ ID NO:5) dar; PAdxsdna stellt eine Nukleinsäuresequenz von Pseudomonas aeruginosa (GenBank Zugangsnummer AE004821; SEQ ID NO:6) dar; LEdxsdna stellt eine Nukleinsäuresequenz von Lycopersicon esculentum (GenBank Zugangsnummer AF143812; SEQ ID NO:7) dar; MTdxsdna stellt eine Nukleinsäuresequenz von Mycobacterium tuberculosis (GenBank Zugangsnummer 296072; SEQ ID NO:8) dar; RSdxs1dna stellt eine Nukleinsäuresequenz eines Rhodobacter sphaeroides-dxs1-Gens (SEQ ID NO:9) dar; RSdxs2dna stellt eine Nukleinsäuresequenz eines Rhodobacter sphaeroides-dxs2-Gens (SEQ ID NO:10) dar; SPCCdxsdna stellt eine Nukleinsäuresequenz von Synechococcus PCC6301 (GenBank Zugangsnummer Y18874; SEQ ID NO:11) dar; ECdxsdna stellt eine Nukleinsäuresequenz von Escherichia coli (GenBank Zugangsnummer AF035440; SEQ ID NO:12) dar; NMdxsdna stellt eine Nukleinsäuresequenz von Neisseria meningitidis (GenBank Zugangsnummer AL162753; SEQ ID NO:13) dar; HIdxsdna stellt eine Nukleinsäuresequenz von Haemophilus influenzae (GenBank Zugangsnummer U32822; SEQ ID NO:14) dar; SSdxsdna stellt eine Nukleinsäuresequenz von Streptomyces sp. CL190 (GenBank Zugangsnummer AB026631; SEQ ID NO:16) dar; HPdxsdna stellt eine Nukleinsäuresequenz von Helicobacter pylori 26695 (GenBank Zugangsnummer AE000552; SEQ ID NO:17) dar.
6 ist eine Sequenzanhäufung von 21 Aminosäuresequenzen von Polypeptiden, welche DXS-Aktivität besitzen. STdxsp stellt eine Aminosäuresequenz dar, die in SEQ ID NO:3 dargelegt wird; AAdxsp stellt eine Aminosäuresequenz von Aquifex aeolicus (GenBank Zugangsnummer 067036; SEQ ID NO:18) dar; BSdxsp stellt eine Aminosäuresequenz von Bacillus subtilis (GenBank Zugangsnummer P54523; SEQ ID NO:19) dar; CRdxsp stellt eine Aminosäuresequenz von Chlamydomonas reinhardtii (GenBank Zugangsnummer CAA07554; SEQ ID NO:20) dar; CJdxsp stellt eine Aminosäuresequenz von Campylobacter jejuni (GenBank Zugangsnummer CAB72788; SEQ ID NO:21) dar; PAdxsp stellt eine Aminosäuresequenz von Pseudomonas aeruginosa (GenBank Zugangsnummer AAG07431; SEQ ID NO:15) dar; LEdxsp stellt eine Aminosäuresequenz von Lycopersicon esculentum (GenBank Zugangsnummer AAD38941; SEQ ID NO:22) dar; MLdxsp stellt eine Aminosäuresequenz von Mycobacterium leprae (GenBank Zugangsnummer Q50000; SEQ ID NO:23) dar; MTdxsp stellt eine Aminosäuresequenz von Mycobacterium tuberculosis (GenBank Zugangsnummer CAB09493; SEQ ID NO:24) dar; RCdxsp stellt eine Aminosäuresequenz von Rhodobacter capsulatus (GenBank Zugangsnummer P26242; SEQ ID NO:25) dar; RSdxs1p stellt eine Aminosäuresequenz dar, die von einem Rhodobacter sphaeroides-dxs1-Gen (SEQ ID NO:26) kodiert wird; RSdxs2p stellt eine Aminosäuresequenz dar, die von einem Rhodobacter sphaeroides-dxs2-Gen (SEQ ID NO:27) kodiert wird; SPCCdxsp stellt eine Aminosäuresequenz von Synechococcus PCC6301 (GenBank Zugangsnummer CAB60078; SEQ ID NO:28) dar; SPdxsp stellt eine Aminosäuresequenz von Synechocystis PCC6803 (GenBank Zugangsnummer P73067; SEQ ID NO:29) dar; TMdxsp stellt eine Aminosäuresequenz von Thermotoga maritima (GenBank Zugangsnummer Q9X291; SEQ ID NO:30) dar; ECdxsp stellt eine Aminosäuresequenz von Escherichia coli (GenBank Zugangsnummer D64771; SEQ ID NO:31) dar; NMdxsp stellt eine Aminosäuresequenz von Neisseria meningitidis (GenBank Zugangsnummer CAB83889; SEQ ID NO:32) dar; HIdxsp stellt eine Aminosäuresequenz von Haemophilus influenzae (GenBank Zugangsnummer B64172; SEQ ID NO:33) dar; PFdxsp stellt eine Aminosäuresequenz von Plasmodium falciparum (GenBank Zugangsnummer AAD03740; SEQ ID NO:34) dar; SSdxsp stellt eine Aminosäuresequenz von Streptomyces sp. CL190 (GenBank Zugangsnummer BAA85847; SEQ ID NO:35) dar; und HPdxsp stellt eine Aminosäuresequenz von Helicobacter pylori 26695 (GenBank Zugangsnummer AAD07422; SEQ ID NO:36) dar.
7 ist eine Auflistung einer Nukleinsäuresequenz, die ein Rhodobacter sphaeroides-(ATCC 17023)Polypeptid kodiert, welches DDS-Aktivität besitzt (SEQ ID NO:37). Das Startcodon ist das ATG auf Nukleotid Nummer 372 und das Stopcodon ist das TGA auf Nukleotid Nummer 1373. Die anzunehmende Ribosomenbindungsstelle ist auf den Nukleotiden Nummer 363–366. Diese Sequenz beihaltet einen offenen Leserahmen sowie 5' und 3' untranslatierte Sequenzen.
8 ist eine Auflistung einer Nukleinsäuresequenz, die ein Rhodobacter sphaeroides-(ATCC 17023) Polypeptid kodiert, welches DDS-Aktivität besitzt (SEQ ID NO:38). Diese Sequenz entspricht dem offenen Leserahmen.
9 ist eine Auflistung einer Aminosäuresequenz eines Rhodobacter sphaeroides-(ATCC 17023) Polypeptids, welches DDS-Aktivität besitzt (SEQ ID NO:39).
10 ist eine Auflistung einer Nukleinsäuresequenz, die ein Sphingomonas trueperi-(ATCC 12417) Polypeptid kodiert, das DDS-Aktivität besitzt (SEQ ID NO:40). Das Startcodon ist das ATG auf dem Nukleotid Nummer 605 und das Stopcodon ist das TGA auf dem Nukleotid Nummer 1618. Die anzunehmende Ribosomenbindungsstelle ist auf den Nukleotiden Nummer 590–594. Diese Sequenz beihaltet einen offenen Leserahmen sowie 5' und 3' untranslatierte Sequenzen.
11 ist eine Auflistung einer Nukleinsäuresequenz, die ein Sphingomonas trueperi-(ATCC 12417) Polypeptid kodiert, das DDS-Aktivität besitzt (SEQ ID NO:41). Diese Sequenz entspricht dem offenen Leserahmen.
12 ist eine Auflistung einer Aminosäuresequenz eines Sphingomonas trueperi-(ATCC 12417) Polypeptids, welches DDS-Aktivität besitzt (SEQ ID NO:42). Diese Sequenz entspricht dem offenen Leserahmen.
13 ist eine Sequenzanhäufung von fünf Nukleinsäuresequenzen, die Polypeptide kodieren, welche DDS-Aktivität besitzen. RSddsdna stellt die Nukleinsäuresequenz dar, die in SEQ ID NO:38 dargelegt wird; STddsdna stellt die Nukleinsäuresequenz dar, die in SEQ ID NO:41 dargelegt wird; SPddsdna stellt eine Nukleinsäuresequenz von Schizosaccharomyces pombe (GenBank Zugangsnummer D84311; SEQ ID NO:43) dar; GSddsdna stellt eine Nukleinsäuresequenz von Gluconobacter suboxydans (GenBank Zugangsnummer AB006850; SEQ ID NO:44) dar; und RCddsdna stellt eine Nukleinsäuresequenz von Rhodobacter capsulatus ( U.S. Patent Nr. 6,103,488 ; SEQ ID NO:45) dar.
14 ist eine Sequenzanhäufung von fünf Aminosäuresequenzen von Polypeptiden, welche DDS-Aktivität besitzen. RSddsp stellt die Aminosäuresequenz dar, die in SEQ ID NO:39 dargelegt wird; STddsp stellt die Aminosäuresequenz dar, die in SEQ ID NO:42 dargelegt wird; GSddsp stellt eine Aminosäuresequenz von Gluconobacter suboxydans (GenBank Zugangsnummer BAA32241; SEQ ID NO:46) dar; APddsp stellt eine Aminosäuresequenz von Schizosaccharomyces pombe (GenBank Zugangsnummer CAB66154; SEQ ID NO:47) dar; und RCddsp stellt eine Aminosäuresequenz von Rhodobacter capsulatus ( U.S. Patent Nr. 6,103,488 ; SEQ ID NO:48) dar.
15 ist eine Sequenzanhäufung von drei Aminosäuresequenzen von Polypeptiden, welche DXS-Aktivität besitzen. Hpdxsp stellt die Aminosäuresequenz dar, die in SEQ ID NO:36 dargelegt wird; Ecdxsp stellt die Aminosäuresequenz dar, die in SEQ ID NO:31 dargelegt wird; und Hidxsp stellt die Aminosäuresequenz dar, die in SEQ ID NO:33 dargelegt wird.
16 ist eine Sequenzanhäufung von vier Aminosäuresequenzen von Polypeptiden, welche DDS-, ODS-(Octaprenyldiphosphatsynthase), oder SDS-(Solanesyldiphosphatsynthase)Aktivität besitzen. Rcsdsp stellt eine Aminosäuresequenz von Rhodobacter capsulatus dar, welche SDS-Aktivität besitzt (SEQ ID NO:49); Rpodsp stellt eine Aminosäuresequenz von Rickettsia prowazeki dar, welche ODS-Aktivität besitzt (SEQ ID NO:50); Gsddsp stellt die Aminosäuresequenz dar, die in SEQ ID NO:46 dargelegt wird; und Ecodsp stellt eine Aminosäuresequenz von Escherichia coli ispB dar, welche ODS-Aktivität besitzt (SEQ ID NO:51).
17 ist eine Sequenzanhäufung von fünf Aminosäuresequenzen von Polypeptiden, welche DDS-, ODS- oder SDS-Aktivität besitzen. Rpodsp stellt die Aminosäuresequenz dar, die in SEQ ID NO:50 dargelegt wird; Gsddsp stellt die Aminosäuresequenz dar, die in SEQ ID NO:46 dargelegt wird; Ecodsp stellt die Aminosäuresequenz dar, die in SEQ ID NO:51 dargelegt wird; Hiodsp stellt eine Aminosäuresequenz von Haemophilus influenzae dar, welche ODS-Aktivität besitzt (SEQ ID NO:52); und Rcsdsp stellt die Aminosäuresequenz dar, die in SEQ ID NO:49 dargelegt wird.
18 ist ein Diagramm eines Konstruktes, bezeichnet appUC18-SHDXS.
19 ist ein Diagramm eines Konstruktes, bezeichnet appUC18-RSdds.
20 ist ein Diagramm eines Konstruktes, bezeichnet appUC18-SHDDS.
21 ist ein Massenchromatogramm, erhalten aus einer MG1655 PUC18 Probe.
22 ist ein Massenchromatogramm, erhalten aus einer MG1655 PUC18-DDS Probe.
23 ist ein Massenspektrum, erhalten aus einer MG1655 PUC18 Probe.
24 ist ein Massenspektrum, erhalten aus einer MG1655 PUC18-DDS Probe.
25 ist ein Massenspektrum, erhalten aus einer MG1655 PUC18 Probe.
26 ist ein Graph, der die Länge und Prozentidentität mit den Punkten A, B, C und D aufträgt und dabei ein Gebiet, das durch Schattierung angezeigt wird, definiert.
27 ist eine Sequenzanhäufung von sieben Aminosäuresequenzen von Polypeptiden, welche DXR-Aktivität besitzen. Bsdxrp stellt eine Aminosäuresequenz von Bacillus subtilis (SEQ ID NO:98) dar; Hmdxrp stellt eine Aminosäuresequenz von Haemophilus influenzae (SEQ ID NO:99) dar; Ecdxrp stellt eine Aminosäuresequenz von Escherichia coli (SEQ ID NO:100) dar; Zmdxrp stellt eine Aminosäuresequenz von Zymonas mobilis (SEQ ID NO:101) dar; Sldxrp stellt eine Aminosäuresequenz von Synechococcus leopoliensis (SEQ ID NO:102) dar; Ssdxrp stellt eine Aminosäuresequenz von Synechocystis sp. PCC6803 (SEQ ID NO:103) dar; und Mtdxrp stellt eine Aminosäuresequenz von Mycobacterium tuberculosis (SEQ ID NO:104) dar.
28 ist eine Auflistung einer Nukleinsäuresequenz, die ein Sphingomonas trueperi-Polypeptid kodiert, das DXR-Aktivität besitzt (SEQ ID NO:95). Das Startcodon ist das GTG entweder auf dem Nukleotid Nummer 575 oder 578 und das Stopcodon ist das TGA auf dem Nukleotid Nummer 1733. Diese Sequenz beinhaltet einen offenen Leserahmen sowie 5' und 3' untranslatierte Sequenzen.
29 ist eine Auflistung einer Nukleinsäuresequenz, die ein Sphingomonas trueperi-Polypeptid kodiert, das DXR-Aktivität besitzt (SEQ ID NO:96). Diese Sequenz entspricht dem offenen Leserahmen.
30 ist eine Auflistung einer Aminosäuresequenz eines Sphingomonas trueperi-Polypeptids, das DXR-Aktivität besitzt (SEQ ID NO:97).
31 ist eine Sequenzanhäufung von zwölf Nukleinsäuresequenzen, die Polypeptide kodieren, welche DXR-Aktivität besitzen. Stdxrcds stellt die Nukleinsäuresequenz dar, die in SEQ ID NO:96 dargelegt wird; Padxrd stellt eine Nukleinsäuresequenz von Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO:105) dar; Zmdxrd stellt eine Nukleinsäuresequenz von Zygomonas mobilis (SEQ ID NO:106) dar; Sgdxrd stellt eine Nukleinsäuresequenz von Streptomyces griseolosporeus (SEQ ID NO:107) dar; Nmdxrd stellt eine Nukleinsäuresequenz von Neisseria meningitidis (SEQ ID NO:108) dar; Ecdxrd stellt eine Nukleinsäuresequenz von Escherichia coli (SEQ ID NO:109) dar; Sldxrd stellt eine Nukleinsäuresequenz von Synechococcus leopoliensis (SEQ ID NO:110) dar; Mldxrd stellt eine Nukleinsäuresequenz von Mycobacterium leprae (SEQ ID NO:111) dar; Pmdxrd stellt eine Nukleinsäuresequenz von Pasteurella multocida (SEQ ID NO:112) dar; Atdxrd stellt eine Nukleinsäuresequenz von Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO:113) dar; Cjdxrd stellt eine Nukleinsäuresequenz von Campylobacter jejuni (SEQ ID NO:114) dar; und Pfdxrd stellt eine Nukleinsäuresequenz von Plasmodium falciparum (SEQ ID NO:115) dar.
32 ist eine Sequenzanhäufung von sechzehn Aminosäuresequenzen von Polypeptiden, welche DXR-Aktivität besitzen. Stdxrp stellt die Aminosäuresequenz dar, die in SEQ ID NO:97 dargelegt wird; Zmdxrp stellt eine Aminosäuresequenz von Zymonas mobilis (SEQ ID NO:116) dar; Padxrp stellt eine Aminosäuresequenz von Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO:117) dar; Ecdxrp stellt eine Aminosäuresequenz von Escherichia coli (SEQ ID NO:118) dar; Nmdxrp stellt eine Aminosäuresequenz von Neisseria meningitidis (SEQ ID NO:119) dar; Hidxrp stellt eine Aminosäuresequenz von Haemophilus influenzae (SEQ ID NO:120) dar; Ssdxrp stellt eine Aminosäuresequenz von Synechocystis sp. PCC6803 (SEQ ID NO:121) dar; Pmdxrp stellt eine Aminosäuresequenz von Pasteurella multocida (SEQ ID NO:122) dar; Sldxrp stellt eine Aminosäuresequenz von Synechococcus leopoliensis (SEQ ID NO:123) dar; Sgdxrp stellt eine Aminosäuresequenz von Streptomyces griseolosporeus (SEQ ID NO:124) dar; Bsdxrp stellt eine Aminosäuresequenz von Bacillus subtilis (SEQ ID NO:125) dar; Mldxrp stellt eine Aminosäuresequenz von Mycobacterium leprae (SEQ ID NO:126) dar; Mtdxrp stellt eine Aminosäuresequenz von Mycobacterium tuberculosis (SEQ ID NO:127) dar; Atdxrp stellt eine Aminosäuresequenz von Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO:128) dar; Cjdxrp stellt eine Aminosäuresequenz von Campylobacter jejuni (SEQ ID NO:130) dar; und Pfdxrp stellt eine Aminosäuresequenz von Plasmodium falciparum (SEQ ID NO:131) dar.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Beschrieben werden hierbei Methoden und Materialien, die mit der Herstellung von Isoprenoiden in Zusammenhang stehen. Besonders beschrieben werden hierbei isolierte Nukleinsäuren, im Wesentlichen reine Polypeptide, Wirtszellen, und Methoden und Materialien für die Herstellung verschiedener Isoprenoidverbindungen. Die Erfindung stellt Methoden und Materialien zur Verfügung, die mit der Herstellung von CoQ(10) in Zusammenhang stehen, wie in den Ansprüchen definiert. Im Sinne dieser Erfindung ist eine Isoprenoidverbindung jede Verbindung, die eine Fünf-carbon-isoprenoideinheit enthält. Beispiele für Isoprenoidverbindungen beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, Carotinoide, Isoprene, Sterole, Terpene und Ubiquinone. Solche Isoprenoidverbindungen können in einem großen Anwendungsbereich verwendet werden. Beispielsweise können Isoprenoidverbindungen, hergestellt wie hier beschrieben, für industrielle, pharmazeutische oder kosmetische Produkte verwendet werden. Im Allgemeinen sind Carotinoide lipophile Pigmente, welche typischerweise in photosynthetischen Pflanzen und Bakterien gefunden werden. Beispiele für Carotinoide beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, Carotene, Xanthophylle, Hydrocarboncarotinoide, Hydroxycarotinoidderivate, Epoxycarotinoidderivate, Furanoxycarotinoidderivate und Oxycarotinoidderivate. Isoprene sind ölige Hydrocarbone, die durch die Destillation von Kautschuk oder Guttapercha erhalten werden können. Beispiele für Isoprene beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, Gummi, Vitamin A und Vitamin K. Sterole sind auf Steroid basierende Alkohole, die typischerweise eine Hydrocarbonseitenkette aus acht bis zehn Carbonatomen in der 17-beta Position und eine Hydroxylgruppe in der 3-beta Position haben. Beispiele für Sterole beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, Ergosterol, Cholesterol und Stigmasterol. Terpene sind Fettarten, die typischerweise und in großer Fülle in Pflanzen gefunden werden. Beispiele für Terpene beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, Dolichol, Squalene und Limonene. Ubiquinone sind 2,3-Dimethoxy-5-methylbenzoquinonderivate, welche eine Seitenkette besitzen, die mindestens eine Isoprenoideinheit enthält. Typischerweise wird ein Ubiquinon als Coenzym Q (CoQ) bezeichnet. Zusätzlich wird die Anzahl der Isoprenoideinheiten einer Seitenkette eines bestimmten Ubiquinons verwendet, um dieses bestimmte Ubiquinon zu identifizieren.
Beispielsweise wird ein Ubiquinon mit sechs Isoprenoideinheiten als CoQ(6) bezeichnet, während ein Ubiquinon mit zehn Isoprenoideinheiten als CoQ(10) bezeichnet wird. Es wird angemerkt, dass CoQ(10) auch als Ubidecarenon bezeichnet wird. Beispiele für Ubiquinone beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, CoQ(6), CoQ(8), CoQ(10) und CoQ(12).
Isoprenoidverbindungen können von Pyruvat hergeleitete Produkte sein. Der Begriff „von Pyruvat hergeleitetes Produkt", wie er hier verwendet wird, bezeichnet jede Verbindung, die aus Pyruvat in nicht mehr als 25 ezymatischen Stufen synthetisch hergestellt wird. So ist eine Isoprenoidverbindung kein aus Pyruvat hergeleitetes Produkt, wenn diese Isoprenoidverbindung aus Pyruvat in mehr als 25 enzymatischen Stufen synthetisch hergestellt wird. Eine enzymatische Stufe ist eine einzelne chemische Reaktion, welche von einem Polypeptid, das enzymatische Aktivität besitzt, katalysiert wird. Der Begriff „Polypeptid, das enzymatische Aktivität besitzt", wie er hier verwendet wird, bezeichnet jedes Polypeptid, das eine chemische Reaktion anderer Substanzen katalysiert, ohne selbst bei der Vollendung der Reaktion zerstört oder verändert zu werden. Typischerweise katalysiert ein Polypeptid, das enzymatische Aktivität besitzt, die Bildung eines oder mehrerer Produkte aus einem oder mehreren Substraten. Solche Polypeptide können jede Art von enzymatischer Aktivität besitzen, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, die enzymatische Aktivität, die in Zusammenhang steht mit einem Enzym wie DXS, DDS, ODS, SDS, DXR (1-Deoxy-D-xylulose5-phosphatreductoisomerase) und ispE (4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritolkinase).
Ein Polypeptid, das eine bestimmte enzymatische Aktivität besitzt, kann ein Polypeptid sein, das entweder natürlich vorkommt oder nicht natürlich vorkommt. Ein natürlich vorkommendes Polypeptid ist jedes Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz besitzt, wie sie in der Natur gefunden wird, einschließlich Wildtyp- und polymorphe Polypeptide. Solche natürlich vorkommenden Polypeptide kann man aus jeder Art erhalten, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, aus Tier-, (z. B. Säugetier-), Pflanzen-, Pilz- und Bakterienarten. Ein nicht natürlich vorkommendes Polypeptid ist jedes Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz besitzt, die nicht in der Natur gefunden wird. So kann ein nicht natürlich vorkommendes Polypeptid eine mutierte Abart eines natürlich vorkommenden Polypeptids sein, oder ein konstruiertes Polypeptid. Beispielsweise kann ein nicht natürlich vorkommendes Polypeptid, das DDS-Aktivität besitzt, eine mutierte Version eines natürlich vorkommenden Polypeptids sein, welches DDS-Aktivität besitzt, das wenigstens etwas DDS-Aktivität beibehält. Ein Polypeptid kann zum Beispiel durch Sequenzadditionen, Deletionen, Substitutionen oder Kombinationen daraus mutiert sein.
Beispiele für Isoprenoidverbindungen, die aus Pyruvat hergeleitete Produkte sind, beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, CoQ(6), CoQ(7), CoQ(8), CoQ(9), CoQ(10), Astaxanthin, Canthaxanthin, Lutein, Zeaxanthin, Betacarotin, Lykopen, Capsanthin, Bixin, Norbixin, Crocetin, Zetacarotin, Vitamin E, Giberellin, Abscisinsäure, Ergosterol, Geraniol und Latex. Wie in 1 dargestellt, können mehrere Polypeptide dazu verwendet werden, Glukose CoQ(10) umzusetzen. Beispielsweise können Polypeptide, die DXS-, DXR-, LytB und DDS-Aktivität besitzen, dazu verwendet werden, Glukose CoQ(10) umzusetzen. Solche Polypeptide können erhalten werden und dazu verwendet werden, CoQ(10) herzustellen, wie hier beschrieben.
1. Nukleinsäuren
Der Begriff „Nukleinsäure", wie er hier verwendet wird, umfasst sowohl RNA als auch DNA, einschließlich cDNA, genomische DNA und synthetische (z. B. chemisch synthetisierte) DNA. Die Nukleinsäure kann als Doppelstrang oder als Einzelstrang vorliegen. Als Einzelstrang kann die Nukleinsäure der sense-Strang oder der antisense-Strang sein. Zusätzlich kann die Nukleinsäure ringförmig oder linear sein.
Der Begriff „isoliert", wie er hier verwendet wird in Bezug auf eine Nukleinsäure, bezeichnet eine natürlich vorkommende Nukleinsäure, die nicht direkt den den beiden Sequenzen benachbart ist, welchen sie in dem natürlich vorkommenden Genom des Organismus, von dem sie stammt, direkt benachbart ist (eine auf dem 5' Ende und eine auf dem 3'Ende). Beispielsweise kann eine isolierte Nukleinsäure, ohne darauf beschränkt zu sein, ein rekombinantes DNA-Molekül jeder Länge sein, vorausgesetzt eine der Nukleinsäuresequenzen, die normalerweise direkt dieses rekombinante DNA-Molekül flankierend in einem natürlich vorkommenden Genom gefunden werden, ist entfernt oder abwesend. So beinhaltet eine isolierte Nukleinsäure, ohne darauf beschränkt zu sein, eine rekombinante DNA, die als separates Molekül besteht (z. B. ein cDNA- oder genomisches DNA-Fragment, hergestellt mittels PCR oder Restriktionsendonukleasebehandlung), unabhängig von anderen Sequenzen, ebenso wie eine rekombinante DNA, die eingeschlossen ist in einen Vektor, in ein autonom replizierendes Plasmid, in ein Virus (z. B. ein Retrovirus, Adenvirus oder Herpesvirus) oder in die genomische DNA eines Prokaryoten oder Eukaryoten. Zusätzlich kann eine isolierte Nukleinsäure ein rekombinantes DNA-Molekül enthalten, das Teil einer hybridisierten oder fusionierten Nukleinsäuresequenz ist.
Der Begriff „isoliert", wie er hier verwendet wird in Bezug auf eine Nukleinsäure, bezeichnet auch jede nicht natürlich vorkommende Nukleinsäure, da nicht natürlich vorkommende Nukleinsäuresequenzen in der Natur nicht gefunden werden und keine direkt benachbarten Sequenzen in einem natürlich vorkommenden Genom besitzen. Beispielsweise wird eine nicht natürlich vorkommende Nukleinsäure, wie z. B. eine konstruierte Nukleinsäure, als isolierte Nukleinsäure angesehen. Eine konstruierte Nukleinsäure kann unter Verwendung des gebräuchlichen molekularen Klonens oder chemischer Nukleinsäuresynthesetechniken hergestellt werden. Eine isolierte nicht natürlich vorkommende Nukleinsäure kann unabhängig von anderen Sequenzen, oder in einen Vektor, in ein autonom replizierendes Plasmid, in ein Virus (z. B. ein Retrovirus, Adenovirus oder Herpesvirus) oder in die genomische DNA eines Prokaryoten oder Eukaryoten eingeschlossen sein. Zusätzlich kann eine nicht natürlich vorkommende Nukleinsäure ein Nukleinsäuremolekül enthalten, das Teil einer hybridisierten oder fusionierten Nukleinsäuresequenz ist.
Es wird für einen Fachmann offensichtlich sein, dass eine Nukleinsäure, die unter Hunderten und Millionen anderer Nukleinsäuremoleküle in, zum Beispiel, cDNA- oder genomischen Bibliotheken oder in Gelschnitten, die einen Restriktionsverdau einer genomischen DNA enthalten, nicht als isolierte Nukleinsäure angesehen wird.
Der Begriff „exogen", wie er hier verwendet wird in Bezug auf eine Nukleinsäure und eine bestimmte Zelle, bezeichnet jede Nukleinsäure, die nicht von dieser bestimmten Zelle, wie in der Natur gefunden, stammt. So gilt eine nicht natürlich vorkommende Nukleinsäure als exogen für eine Zelle, sobald sie in die Zelle eingebracht wurde. Es ist wichtig zu erwähnen, dass eine nicht natürlich vorkommende Nukleinsäure Nukleinsäuresequenzen oder Fragmente von Nukleinsäuresequenzen enthalten kann, die in der Natur gefunden werden, vorausgesetzt, die Nukleinsäure als Ganze existiert nicht in der Natur. Beispielsweise ist ein Nukleinsäuremolekül, das eine genomische DNA-Sequenz innerhalb eines Expressionsvektors enthält, eine nicht natürlich vorkommende Nukleinsäure und ist somit exogen für eine Zelle, sobald sie in die Zelle eingebracht wurde, da dieses Nukleinsäuremolekül als Ganzes (genomische DNA plus Vektor-DNA) nicht in der Natur existiert. So gilt jeder Vektor, jedes autonom replizierende Plasmid, jedes Virus (z. B. Retrovirus, Adenvirus oder Herpesvirus), das als Ganzes nicht in der Natur existiert, als nicht natürlich vorkommende Nukleinsäure. Daraus folgt, dass genomische DNA-Fragmente, die mittels PCR oder Restriktionsendonukleasebehandlung hergestellt werden, ebenso wie cDNAs als nicht natürlich vorkommende Nukleinsäure gelten, da sie als separate Moleküle vorkommen, die nicht in der Natur gefunden werden. Es folgt daraus auch, dass jede Nukleinsäure, die eine Promotorsequenz und eine Polypeptid-kodierende Sequenz (z. B. cDNA oder genomischen DNA) in einer Anordnung enthält, wie sie in der Natur nicht gefunden wird, eine nicht natürlich vorkommende Nukleinsäure ist.
Eine Nukleinsäure, die natürlich vorkommt, kann exogen für eine bestimmte Zelle sein. Zum Beispiel ist ein vollständiges Chromosom, isoliert aus einer Zelle von Person X, eine exogene Nukleinsäure in Bezug auf eine Zelle von Person Y, sobald das Chromosom in Y's Zelle eingebracht wurde.
Beschrieben wird hierbei eine isolierte Nukleinsäure, die eine Nukleinsäuresequenz enthält, die (1) eine Länge und (2) eine Prozentidentität mit einer identifizierten Nukleinsäuresequenz über diese Länge besitzt. Weiterhin wird hierbei eine isolierte Nukleinsäure beschrieben, die eine Nukleinsäuresequenz enthält, die ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die (1) eine Länge und (2) eine Prozentidentität zu einer identifizierten Aminosäuresequenz über diese Länge besitzt. Typischerweise ist die identifizierte Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz eine Sequenz, auf die mit einer bestimmten Sequenzidentifikationsnummer verwiesen wird und die Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz, die mit der identifizierten Sequenz verglichen wird, wird als Zielsequenz bezeichnet. Beispielsweise kann eine identifizierte Sequenz die Sequenz sein, die in SEQ ID NO:1 dargelegt wird.
Eine Länge und Prozentidentität über diese Länge wurde für jede Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz wie folgt bestimmt. Erstens wird eine Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz mit der identifizierten Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz verglichen, wobei das BLAST-2-Sequenz-(Bl2seq) Programm der eigenständigen Version von BLASTZ verwendet wird, enthaltend BLASTN Version 2.0.14 und BLASTP Version 2.0.14. Diese eigenständige Version von BLASTZ kann von der Bibliothek der Universität von Wisconsin bezogen werden, ebenso wie auf www.fr.com oder www.ncbi.nlm.nih.gov. Anweisungen, wie das Bl2seq Programm zu verwenden ist, können im readme file gefunden werden, das mit BLASTZ mitgeliefert wird. Bl2seq führt einen Vergleich zwischen zwei Sequenzen aus, wobei es entweder den BLASTN- oder den BLASTP-Algorithmus verwendet. BLASTN wird verwendet, um Nukleinsäuresequenzen zu vergleichen, während BLASTP verwendet wird, um Aminosäuresequenzen zu vergleichen. Um zwei Nukleinsäuresequenzen zu vergleichen, sind die folgenden Möglichkeiten vorgegeben: -i ist vorgegeben für eine Datei, die die erste Nukleinsäuresequenz enthält, die verglichen werden soll (z. B. C:\seq1.txt); -j ist vorgegeben für eine Datei, die die zweite Nukleinsäuresequenz enthält, die verglichen werden soll (z. B. C:\seq2.txt); -p ist vorgegeben für blastn; -o ist vorgegeben für jeden gewünschten Dateinamen (z. B. C:\output.txt); -q ist vorgegeben für -1; -r ist vorgegeben für 2; und alle anderen Optionen werden in ihrer Standardeinstellung belassen. Beispielsweise kann der folgende Steuerbefehl dazu verwendet werden, eine Ausgabedatei zu erzeugen, welche einen Vergleich zwischen zwei Sequenzen enthält: C:\Bl2seq-i c:\seq1.txt-j c:\seq2.txt-p blastn-o c:\output.txt-q-1-r2. Um zwei Aminosäuresequenzen zu vergleichen, sind die Auswahlmöglichkeiten von Bl2seq vorgegeben wie folgt: -i ist vorgegeben für eine Datei, die die erste Aminosäuresequenz enthält, die verglichen werden soll (z. B. C:\seq1.txt), -j ist vorgegeben für eine Datei, die die zweite Aminosäuresequenz enthält, die verglichen werden soll (z. B. C:\seq2.txt); -p ist vorgegeben für blastp; -o ist vorgegeben für jeden gewünschten Dateinamen (z. B. C:\output.txt); und alle anderen Optionen werden in ihrer Standardeinstellung belassen. Beispielsweise kann der folgende Steuerbefehl dazu verwendet werden, eine Ausgabedatei zu erzeugen, welche einen Vergleich zwischen zwei Aminosäuresequenzen enthält: C:\Bl2seq-i c:\seq1.txt-j c:\seq2txt.-p blastp-o c:\output.txt. Wenn die Zielsequenz zu irgendeinem Anteil der identifizierten Sequenz homolog ist, dann wird die ausgewiesene Ausgabedatei diese Bereiche der Homologie als alignete Sequenzen darstellen. Wenn die Zielsequenz zu keinem Anteil der identifizierten Sequenz homolog ist, dann wird die ausgewiesene Ausgabedatei keine aligneten Sequenzen darstellen. Einmal alignet, wird eine Länge bestimmt durch Zählen der Anzahl aufeinanderfolgender Nukleotide oder Aminosäurereste der Zielsequenz, dargestellt in Alignment mit einer Sequenz der identifizierten Sequenz, angefangen mit jeder passenden Position und endend mit jeder anderen passenden Position. Eine passende Position ist jede Position, in der ein identisches Nukleotid oder ein identischer Aminosäurerest sowohl in der Ziel- als auch in der identifizierten Sequenz dargestellt ist. Gaps, dargestellt in der Zielsequenz, werden nicht gezählt, da Gaps keine Nukleotide oder Aminosäurereste sind. Ebenso werden Gaps, die in der identifizierten Aminosäuresequenz dargestellt sind, nicht gezählt, da Nukleotide oder Aminosäurereste der Zielsequenz gezählt werden, nicht Nukleotide oder Aminosäurereste der identifizierten Sequenz.
Die Prozentidentität über eine bestimmte Länge wird bestimmt durch das Zählen der Anzahl der passenden Positionen über diese Länge und durch das Teilen dieser Anzahl durch die Länge, gefolgt vom Multiplizieren des resultierenden Wertes durch 100. Beispielsweise, wenn (1) eine 1000-Nukleotid-Zielsequenz verglichen wird mit der Sequenz, die in SEQ ID NO:1 dargelegt wird, (2) das Bl2seq-Programm 200 Nukleotide der Zielsequenz darstellt, alignet mit einem Gebiet der Sequenz, die dargelegt ist in SEQ ID NO:1, wobei die ersten und letzten Nukleotide dieser 200-Nukleotidregion übereinstimmen und (3) die Anzahl der Übereinstimmungen bei diesen 200 verbundenen Nukleotiden 180 ist, dann enthält die 1000- Nukleotid-Zielsequenz eine Länge von 200 und eine Prozentidentität über diese Länge von 90 (z. B. 180 ÷ 200·100 = 90).

Es ist so zu verstehen, dass eine einzelne Nukleinsäure- oder Aminosäure-Zielsequenz, die mit einer identifizierten Sequenz alignet, viele verschiedene Längen haben kann, wobei jede Länge ihre eigene Prozentidentität hat. Beispielsweise hat eine Zielsequenz, die eine 20-Nukleotidregion enthält, die mit einer identifizierten Sequenz wie folgt alignet, viele verschiedene Längen, einschließlich die in Tabelle 1 aufgelisteten.

Tabelle I.

Startposition	Endposition	Länge	Passende Positionen	Prozentidentität
1	20	20	15	75,0
1	18	18	14	77,8
1	15	15	11	73,3
6	20	15	12	80,0
6	17	12	10	83,3
6	15	10	8	80,0
8	20	13	10	76,9
8	16	9	7	77,8

Es wird angemerkt, dass der Wert der Prozentidentität auf die nächste Zehnerstelle gerundet wird. Beispielsweise wird 78,11 78,12, 78,13 und 78,14 abgerundet auf 78,1, während 78,15, 78,16, 78,17, 78,18 und 78,19 aufgerundet wird auf 78,2. Es wird auch angemerkt, dass der Längenwert immer ganzzahlig sein wird.
Hier beschrieben wird eine isolierte Nukleinsäure, welche eine Nukleinsäuresequenz enthält, die mindestens eine Länge und Prozentidentität über diese Länge, wie oben bestimmt, besitzt, so dass der Punkt, der durch diese Länge und Prozentidentität definiert wird, sich innerhalb der Fläche befindet, die durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird. Zusätzlich wird hier eine isolierte Nukleinsäure beschrieben, welche eine Nukleinsäuresequenz enthält, die ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die mindestens eine Länge und Prozentidentität über diese Länge, wie oben bestimmt, besitzt, so dass der Punkt, der durch diese Länge und Prozentidentität definiert wird, sich innerhalb der Fläche befindet, die durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird. Der Punkt, der durch eine Länge und Prozentidentität über diese Länge definiert wird, ist der Punkt auf der X/Y-Koordinate in 26, bei dem die X-Achse die Länge ist und die Y-Achse die Prozentidentität. Somit hat der Punkt, der durch eine Nukleinsäuresequenz mit einer Länge von 200 und einer Prozentidentität von 90 definiert wird, Koordinaten (200, 90). Im Sinne dieser Erfindung wird jeder Punkt, der auf Punkt A, B, C oder D trifft, als innerhalb der Fläche angesehen, die durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird. Ebenso wird jeder Punkt, der auf eine Linie trifft, die die Fläche definiert, welche durch die Punkte A, B, C und D definiert wird, als innerhalb der Fläche angesehen, die durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird. Es ist so zu verstehen, dass der Begriff „die Fläche, welche durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird", wie er hier verwendet wird, sich auf diese Fläche bezieht, die durch die Linien definiert wird, die Punkt A mit Punkt B verbinden, Punkt B mit Punkt C, Punkt C mit Punkt D und Punkt D mit Punkt A. Die Punkte A, B, C und D können eine Fläche definieren, welche irgendeine Form besitzt, die durch vier Punkte definiert wird (z. B. Quadrat, Rechteck oder Raute). Zusätzlich können zwei oder mehr Punkte dieselben Koordinaten besitzen. Zum Beispiel können die Punkte B und C identische Koordinaten besitzen. In diesem Fall ist die Fläche, die durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird, dreieckig. Wenn drei Punkte identische Koordinaten besitzen, ist die Fläche, die durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird, eine Linie. In diesem Fall würde jeder Punkt, der auf diese Linie trifft, als innerhalb der Fläche angesehen, die durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird. Wenn alle vier Punkte identische Koordinaten besitzen, dann ist die Fläche, die durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird, ein Punkt. In allen Fällen können einfache algebraische Gleichungen verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein Punkt sich innerhalb der Fläche befindet, die durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird.
Es wird angemerkt, dass 26 eine graphische Darstellung ist, die mögliche Positionen der Punkte A, B, C und D aufzeigt. Die schattierte Fläche, dargestellt in 26, repräsentiert ein mögliches Beispiel, während die Pfeile andeuten, dass andere Positionen für die Punkte A, B, D und D möglich sind. Tatsächlich können die Punkte A, B, C und D jede X-Koordinate und jede Y-Koordinate haben. Beispielsweise kann Punkt A eine X-Koordinate haben, gleich der Anzahl von Nukleotiden oder Aminosäureresten in einer identifizierten Sequenz, und eine Y-Koordinate von 100, Punkt B kann eine X-Koordinate gleich der Anzahl von Nukleotiden oder Aminosäureresten in einer identifizierten Sequenz haben, und eine Y-Koordinate kleiner oder gleich 100 (z. B. 50, 55, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 und 99). Punkt C kann eine X-Koordinate haben, gleich einem Prozentanteil (z. B. 1, 2, 5, 10, 15 oder mehr Prozent) der Anzahl von Nukleotiden oder Aminosäureresten in einer identifizierten Sequenz, und eine Y-Koordinate kleiner oder gleich 100 (z. B. 50, 55, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 und 99). Punkt D kann eine X-Koordinate haben, gleich der Länge eines typischen PCR-Primers (z. B. 12, 13, 14, 15, 16, 17 oder größer) oder eines antigenen Polypeptids (z. B. 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 oder größer), und eine Y-Koordinate kleiner oder gleich 100 (z. B. 50, 55, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 und 99).
Eine isolierte Nukleinsäure, welche eine Nukleinsäuresequenz enthält, die eine Länge und Prozentidentität zu der in SEQ ID NO:1 dargelegten Sequenz über die Länge besitzt, wird betrachtet, vorausgesetzt, der Punkt, der durch diese Länge und Prozentidentität definiert wird, befindet sich innerhalb der Fläche, die durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird; wobei Punkt A eine X-Koordinate kleiner oder gleich 3626 hat, und eine Y-Koordinate kleiner oder gleich 100; wobei Punkt B eine X-Koordinate kleiner oder gleich 3626 hat, und eine Y-Koordinate größer oder gleich 65; wobei Punkt C eine X-Koordinate größer oder gleich 50 hat, und eine Y-Koordinate größer oder gleich 65; und wobei Punkt D eine X-Koordinate größer oder gleich 12 hat, und eine Y-Koordinate kleiner oder gleich 100. Beispielsweise kann die X-Koordinate für Punkt A 3626, 3600, 3500, 3000, 2500 oder kleiner sein; und die Y-Koordinate für Punkt A kann 100, 99, 95, 90, 85, 80, 75 oder kleiner sein. Die X-Koordinate für Punkt B kann 3626, 3600, 3500, 3000, 2500 oder kleiner sein; und die Y-Koordinate für Punkt B kann 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 oder größer sein. Die X-Koordinate für Punkt C kann 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 oder größer sein; und die Y-Koordinate für Punkt C kann 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 oder größer sein. Die X-Koordinate für Punkt D kann 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100 oder größer sein; und die Y-Koordinate für Punkt D kann 100, 99, 95, 90, 85, 80, 75 oder kleiner sein. In einem Beispiel kann Punkt A (3626, 100) sein, Punkt B kann (3626, 95) sein, Punkt C kann (1900, 95) sein und Punkt D kann (1900, 100) sein.
Eine isolierte Nukleinsäure, welche eine Nukleinsäuresequenz enthält, die eine Länge und Prozentidentität zu der in SEQ ID NO:2 dargelegten Sequenz über die Länge besitzt, wird betrachtet, vorausgesetzt, der Punkt, der durch diese Länge und Prozentidentität definiert wird, befindet sich innerhalb der Fläche, die durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird; wobei Punkt A eine X-Koordinate kleiner oder gleich 1926 hat, und eine Y-Koordinate kleiner oder gleich 100; wobei Punkt B eine X-Koordinate kleiner oder gleich 1926 hat, und eine Y-Koordinate größer oder gleich 65; wobei Punkt C eine X-Koordinate größer oder gleich 50 hat, und eine Y-Koordinate größer oder gleich 65; und wobei Punkt D eine X-Koordinate größer oder gleich 12 hat, und eine Y-Koordinate kleiner oder gleich 100. Beispielsweise kann die X-Koordinate für Punkt A 1926, 1900, 1850, 1800, 1750 oder kleiner sein; und die Y-Koordinate für Punkt A kann 100, 99, 95, 90, 85, 80, 75 oder kleiner sein. Die X-Koordinate für Punkt B kann 1926, 1900, 1850, 1800, 1750 oder kleiner sein; und die Y-Koordinate für Punkt B kann 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 oder größer sein. Die X-Koordinate für Punkt C kann 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 oder größer sein; und die Y-Koordinate für Punkt C kann 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 oder größer sein. Die X-Koordinate für Punkt D kann 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100 oder größer sein; und die Y-Koordinate für Punkt D kann 100, 99, 95, 90, 85, 80, 75 oder kleiner sein. In einem Beispiel kann Punkt A (1926, 100) sein, Punkt B kann (1926, 95) sein, Punkt C kann (1000, 95) sein und Punkt D kann (1000, 100) sein.
Eine isolierte Nukleinsäure, welche eine Nukleinsäuresequenz enthält, die ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die eine Länge und Prozentidentität zu der in SEQ ID NO:3 dargelegten Sequenz über die Länge besitzt, wird betrachtet, vorausgesetzt, der Punkt, der durch diese Länge und Prozentidentität definiert wird, befindet sich innerhalb der Fläche, die durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird; wobei Punkt A eine X-Koordinate kleiner oder gleich 641 hat, und eine Y-Koordinate kleiner oder gleich 100; wobei Punkt B eine X-Koordinate kleiner oder gleich 641 hat, und eine Y-Koordinate größer oder gleich 50; wobei Punkt C eine X-Koordinate größer oder gleich 25 hat, und eine Y-Koordinate größer oder gleich 50; und wobei Punkt D eine X-Koordinate größer oder gleich 5 hat, und eine Y-Koordinate kleiner oder gleich 100. Beispielsweise kann die X-Koordinate für Punkt A 641, 635, 630, 625, 620 oder kleiner sein; und die Y-Koordinate für Punkt A kann 100, 99, 95, 90, 85, 80, 75 oder kleiner sein. Die X-Koordinate für Punkt B kann 641, 635, 630, 625, 620 oder kleiner sein; und die Y-Koordinate für Punkt B kann 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 oder größer sein. Die X-Koordinate für Punkt C kann 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 oder größer sein; und die Y-Koordinate für Punkt C kann 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 oder größer sein. Die X-Koordinate für Punkt D kann 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100 oder größer sein; und die Y-Koordinate für Punkt D kann 100, 99, 95, 90, 85, 80, 75 oder kleiner sein. In einem Beispiel kann Punkt A (641, 100) sein, Punkt B kann (641, 95) sein, Punkt C kann (400, 95) sein und Punkt D kann (400, 100) sein.
Eine isolierte Nukleinsäure, welche eine Nukleinsäuresequenz enthält, die eine Länge und Prozentidentität zu der in SEQ ID NO:37 dargelegten Sequenz über die Länge besitzt, wird betrachtet, vorausgesetzt, der Punkt, der durch diese Länge und Prozentidentität definiert wird, befindet sich innerhalb der Fläche, die durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird; wobei Punkt A eine X-Koordinate kleiner oder gleich 1990 hat, und eine Y-Koordinate kleiner oder gleich 100; wobei Punkt B eine X-Koordinate kleiner oder gleich 1990 hat, und eine Y-Koordinate größer oder gleich 65; wobei Punkt C eine X-Koordinate größer oder gleich 50 hat, und eine Y-Koordinate größer oder gleich 65; und wobei Punkt D eine X-Koordinate größer oder gleich 12 hat, und eine Y-Koordinate kleiner oder gleich 100. Beispielsweise kann die X-Koordinate für Punkt A 1990, 1950, 1900, 1850, 1800, 1750 oder kleiner sein; und die Y-Koordinate für Punkt A kann 100, 99, 95, 90, 85, 80, 75 oder kleiner sein. Die X-Koordinate für Punkt B kann 1990, 1950, 1900, 1850, 1800, 1750 oder kleiner sein; und die Y-Koordinate für Punkt B kann 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 oder größer sein. Die X-Koordinate für Punkt C kann 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 oder größer sein; und die Y-Koordinate für Punkt C kann 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 oder größer sein. Die X-Koordinate für Punkt D kann 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100 oder größer sein; und die Y-Koordinate für Punkt D kann 100, 99, 95, 90, 85, 80, 75 oder kleiner sein. In einem Beispiel kann Punkt A (1990, 100) sein, Punkt B kann (1990, 95) sein, Punkt C kann (1000, 95) sein und Punkt D kann (1000, 100) sein.
Eine isolierte Nukleinsäure, welche eine Nukleinsäuresequenz enthält, die eine Länge und Prozentidentität zu der in SEQ ID NO:38 dargelegten Sequenz über die Länge besitzt, wird betrachtet, vorausgesetzt, der Punkt, der durch diese Länge und Prozentidentität definiert wird, befindet sich innerhalb der Fläche, die durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird; wobei Punkt A eine X-Koordinate kleiner oder gleich 1002 hat, und eine Y-Koordinate kleiner oder gleich 100; wobei Punkt B eine X-Koordinate kleiner oder gleich 1002 hat, und eine Y-Koordinate größer oder gleich 65; wobei Punkt C eine X-Koordinate größer oder gleich 50 hat, und eine Y-Koordinate größer oder gleich 65; und wobei Punkt D eine X-Koordinate größer oder gleich 12 hat, und eine Y-Koordinate kleiner oder gleich 100. Beispielsweise kann die X-Koordinate für Punkt A 1002, 950, 900, 850, 800, 750 oder kleiner sein; und die Y-Koordinate für Punkt A kann 100, 99, 95, 90, 85, 80, 75 oder kleiner sein. Die X-Koordinate für Punkt B kann 1002, 950, 900, 850, 800, 750 oder kleiner sein; und die Y-Koordinate für Punkt B kann 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 oder größer sein. Die X-Koordinate für Punkt C kann 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 oder größer sein; und die Y-Koordinate für Punkt C kann 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 oder größer sein. Die X-Koordinate für Punkt D kann 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100 oder größer sein; und die Y-Koordinate für Punkt D kann 100, 99, 95, 90, 85, 80, 75 oder kleiner sein. In einem Beispiel kann Punkt A (1002, 100) sein, Punkt B kann (1002, 95) sein, Punkt C kann (500, 95) sein und Punkt D kann (500, 100) sein.
Eine isolierte Nukleinsäure, welche eine Nukleinsäuresequenz enthält, die ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die eine Länge und Prozentidentität zu der in SEQ ID NO:39 dargelegten Sequenz über die Länge besitzt, wird betrachtet, vorausgesetzt, der Punkt, der durch diese Länge und Prozentidentität definiert wird, befindet sich innerhalb der Fläche, die durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird; wobei Punkt A eine X-Koordinate kleiner oder gleich 333 hat, und eine Y-Koordinate kleiner oder gleich 100; wobei Punkt B eine X-Koordinate kleiner oder gleich 333 hat, und eine Y-Koordinate größer oder gleich 50; wobei Punkt C eine X-Koordinate größer oder gleich 25 hat, und eine Y-Koordinate größer oder gleich 50; und wobei Punkt D eine X-Koordinate größer oder gleich 5 hat, und eine Y-Koordinate kleiner oder gleich 100. Beispielsweise kann die X-Koordinate für Punkt A 333, 330, 325, 320, 315 oder kleiner sein; und die Y-Koordinate für Punkt A kann 100, 99, 95, 90, 85, 80, 75 oder kleiner sein. Die X-Koordinate für Punkt B kann 333, 330, 325, 320, 315 oder kleiner sein; und die Y-Koordinate für Punkt B kann 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 oder größer sein. Die X-Koordinate für Punkt C kann 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 oder größer sein; und die Y-Koordinate für Punkt C kann 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 oder größer sein. Die X-Koordinate für Punkt D kann 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100 oder größer sein; und die Y-Koordinate für Punkt D kann 100, 99, 95, 90, 85, 80, 75 oder kleiner sein. In einem Beispiel kann Punkt A (333, 100) sein, Punkt B kann (333, 95) sein, Punkt C kann (150, 95) sein und Punkt D kann (150, 100) sein.
Eine isolierte Nukleinsäure, welche eine Nukleinsäuresequenz enthält, die eine Länge und Prozentidentität zu der in SEQ ID NO:40 dargelegten Sequenz über die Länge besitzt, wird betrachtet, vorausgesetzt, der Punkt, der durch diese Länge und Prozentidentität definiert wird, befindet sich innerhalb der Fläche, die durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird; wobei Punkt A eine X-Koordinate kleiner oder gleich 1833 hat, und eine Y-Koordinate kleiner oder gleich 100; wobei Punkt B eine X-Koordinate kleiner oder gleich 1833 hat, und eine Y-Koordinate größer oder gleich 65; wobei Punkt C eine X-Koordinate größer oder gleich 50 hat, und eine Y-Koordinate größer oder gleich 65; und wobei Punkt D eine X-Koordinate größer oder gleich 12 hat, und eine Y-Koordinate kleiner oder gleich 100. Beispielsweise kann die X-Koordinate für Punkt A 1833, 1800, 1750, 1700, 1650 oder kleiner sein; und die Y-Koordinate für Punkt A kann 100, 99, 95, 90, 85, 80, 75 oder kleiner sein. Die X-Koordinate für Punkt B kann 1833, 1800, 1750, 1700, 1650 oder kleiner sein; und die Y- Koordinate für Punkt B kann 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 oder größer sein. Die X-Koordinate für Punkt C kann 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 oder größer sein; und die Y-Koordinate für Punkt C kann 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 oder größer sein. Die X-Koordinate für Punkt D kann 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100 oder größer sein; und die Y-Koordinate für Punkt D kann 100, 99, 95, 90, 85, 80, 75 oder kleiner sein. In einem Beispiel kann Punkt A (1833, 100) sein, Punkt B kann (1833, 95) sein, Punkt C kann (900, 95) sein und Punkt D kann (900, 100) sein.
Eine isolierte Nukleinsäure, welche eine Nukleinsäuresequenz enthält, die eine Länge und Prozentidentität zu der in SEQ ID NO:41 dargelegten Sequenz über die Länge besitzt, wird betrachtet, vorausgesetzt, der Punkt, der durch diese Länge und Prozentidentität definiert wird, befindet sich innerhalb der Fläche, die durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird; wobei Punkt A eine X-Koordinate kleiner oder gleich 1014 hat, und eine Y-Koordinate kleiner oder gleich 100; wobei Punkt B eine X-Koordinate kleiner oder gleich 1014 hat, und eine Y-Koordinate größer oder gleich 65; wobei Punkt C eine X-Koordinate größer oder gleich 50 hat, und eine Y-Koordinate größer oder gleich 65; und wobei Punkt D eine X-Koordinate größer oder gleich 12 hat, und eine Y-Koordinate kleiner oder gleich 100. Beispielsweise kann die X-Koordinate für Punkt A 1014, 950, 900, 800, 700, 600 oder kleiner sein; und die Y-Koordinate für Punkt A kann 100, 99, 95, 90, 85, 80, 75 oder kleiner sein. Die X-Koordinate für Punkt B kann 1014, 950, 900, 800, 700, 600 oder kleiner sein; und die Y-Koordinate für Punkt B kann 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 oder größer sein. Die X-Koordinate für Punkt C kann 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 oder größer sein; und die Y-Koordinate für Punkt C kann 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 oder größer sein. Die X-Koordinate für Punkt D kann 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100 oder größer sein; und die Y-Koordinate für Punkt D kann 100, 99, 95, 90, 85, 80, 75 oder kleiner sein. In einem Beispiel kann Punkt A (1014, 100) sein, Punkt B kann (1014, 95) sein, Punkt C kann (500, 95) sein und Punkt D kann (500, 100) sein.
Eine isolierte Nukleinsäure, welche eine Nukleinsäuresequenz enthält, die ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die eine Länge und Prozentidentität zu der in SEQ ID NO:42 dargelegten Sequenz über die Länge besitzt, wird betrachtet, vorausgesetzt, der Punkt, der durch diese Länge und Prozentidentität definiert wird, befindet sich innerhalb der Fläche, die durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird; wobei Punkt A eine X-Koordinate kleiner oder gleich 337 hat, und eine Y-Koordinate kleiner oder gleich 100; wobei Punkt B eine X-Koordinate kleiner oder gleich 337 hat, und eine Y-Koordinate größer oder gleich 50; wobei Punkt C eine X-Koordinate größer oder gleich 25 hat, und eine Y-Koordinate größer oder gleich 50; und wobei Punkt D eine X-Koordinate größer oder gleich 5 hat, und eine Y-Koordinate kleiner oder gleich 100. Beispielsweise kann die X-Koordinate für Punkt A 337, 335, 330, 325, 320, 315 oder kleiner sein; und die Y-Koordinate für Punkt A kann 100, 99, 95, 90, 85, 80, 75 oder kleiner sein. Die X-Koordinate für Punkt B kann 337, 335, 330, 325, 320, 315 oder kleiner sein; und die Y-Koordinate für Punkt B kann 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 oder größer sein. Die X-Koordinate für Punkt C kann 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 oder größer sein; und die Y-Koordinate für Punkt C kann 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 oder größer sein. Die X-Koordinate für Punkt D kann 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100 oder größer sein; und die Y-Koordinate für Punkt D kann 100, 99, 95, 90, 85, 80, 75 oder kleiner sein. In einem Beispiel kann Punkt A (337, 100) sein, Punkt B kann (337, 95) sein, Punkt C kann (150, 95) sein und Punkt D kann (150, 100) sein.
Eine isolierte Nukleinsäure, welche eine Nukleinsäuresequenz enthält, die eine Länge und Prozentidentität zu der in SEQ ID NO:95 dargelegten Sequenz über die Länge besitzt, wird betrachtet, vorausgesetzt, der Punkt, der durch diese Länge und Prozentidentität definiert wird, befindet sich innerhalb der Fläche, die durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird; wobei Punkt A eine X-Koordinate kleiner oder gleich 2017 hat, und eine Y-Koordinate kleiner oder gleich 100; wobei Punkt B eine X-Koordinate kleiner oder gleich 2017 hat, und eine Y-Koordinate größer oder gleich 65; wobei Punkt C eine X-Koordinate größer oder gleich 50 hat, und eine Y-Koordinate größer oder gleich 65; und wobei Punkt D eine X-Koordinate größer oder gleich 12 hat, und eine Y-Koordinate kleiner oder gleich 100. Beispielsweise kann die X-Koordinate für Punkt A 2017, 2000, 1950, 1900, 1800, 1700, 1600 oder kleiner sein; und die Y-Koordinate für Punkt A kann 100, 99, 95, 90, 85, 80, 75 oder kleiner sein. Die X-Koordinate für Punkt B kann 2017, 2000, 1950, 1900, 1800, 1700, 1600 oder kleiner sein; und die Y-Koordinate für Punkt B kann 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 oder größer sein. Die X-Koordinate für Punkt C kann 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000, 1500 oder größer sein; und die Y-Koordinate für Punkt C kann 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 oder größer sein. Die X-Koordinate für Punkt D kann 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 250, 500, 1000, 1500 oder größer sein; und die Y-Koordinate für Punkt D kann 100, 99, 95, 90, 85, 80, 75 oder kleiner sein. In einem Beispiel kann Punkt A (2017, 100) sein, Punkt B kann (2017, 95) sein, Punkt C kann (1800, 95) sein und Punkt D kann (1800, 100) sein.
Eine isolierte Nukleinsäure, welche eine Nukleinsäuresequenz enthält, die eine Länge und Prozentidentität zu der in SEQ ID NO:96 dargelegten Sequenz über die Länge besitzt, wird betrachtet, vorausgesetzt, der Punkt, der durch diese Länge und Prozentidentität definiert wird, befindet sich innerhalb der Fläche, die durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird; wobei Punkt A eine X-Koordinate kleiner oder gleich 1161 hat, und eine Y-Koordinate kleiner oder gleich 100; wobei Punkt B eine X-Koordinate kleiner oder gleich 1161 hat, und eine Y-Koordinate größer oder gleich 65; wobei Punkt C eine X-Koordinate größer oder gleich 50 hat, und eine Y-Koordinate größer oder gleich 65; und wobei Punkt D eine X-Koordinate größer oder gleich 12 hat, und eine Y-Koordinate kleiner oder gleich 100. Beispielsweise kann die X-Koordinate für Punkt A 1161, 1050, 1000, 950, 900, 800, 700, 600 oder kleiner sein; und die Y-Koordinate für Punkt A kann 100, 99, 95, 90, 85, 80, 75 oder kleiner sein. Die X-Koordinate für Punkt B kann 1161, 1050, 1000, 950, 900, 800, 700, 600 oder kleiner sein; und die Y-Koordinate für Punkt B kann 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 oder größer sein. Die X-Koordinate für Punkt C kann 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000 oder größer sein; und die Y-Koordinate für Punkt C kann 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 oder größer sein. Die X-Koordinate für Punkt D kann 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 250, 500, 1000 oder größer sein; und die Y-Koordinate für Punkt D kann 100, 99, 95, 90, 85, 80, 75 oder kleiner sein. In einem Beispiel kann Punkt A (1161, 100) sein, Punkt B kann (1161, 95) sein, Punkt C kann (1000, 95) sein und Punkt D kann (1000, 100) sein.
Eine isolierte Nukleinsäure, welche eine Nukleinsäuresequenz enthält, die ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die eine Länge und Prozentidentität zu der in SEQ ID NO:97 dargelegten Sequenz über die Länge besitzt, wird betrachtet, vorausgesetzt, der Punkt, der durch diese Länge und Prozentidentität definiert wird, befindet sich innerhalb der Fläche, die durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird; wobei Punkt A eine X-Koordinate kleiner oder gleich 386 hat, und eine Y-Koordinate kleiner oder gleich 100; wobei Punkt B eine X-Koordinate kleiner oder gleich 386 hat, und eine Y-Koordinate größer oder gleich 50; wobei Punkt C eine X-Koordinate größer oder gleich 25 hat, und eine Y-Koordinate größer oder gleich 50; und wobei Punkt D eine X-Koordinate größer oder gleich 5 hat, und eine Y-Koordinate kleiner oder gleich 100. Beispielsweise kann die X-Koordinate für Punkt A 386, 380, 375, 370, 365, 360, 350, 325, 300 oder kleiner sein; und die Y-Koordinate für Punkt A kann 100, 99, 95, 90, 85, 80, 75 oder kleiner sein. Die X-Koordinate für Punkt B kann 386, 380, 375, 370, 365, 360, 350, 325, 300 oder kleiner sein; und die Y-Koordinate für Punkt B kann 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 oder größer sein. Die X-Koordinate für Punkt C kann 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 350 oder größer sein; und die Y-Koordinate für Punkt C kann 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 oder größer sein. Die X-Koordinate für Punkt D kann 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 350 oder größer sein; und die Y-Koordinate für Punkt D kann 100, 99, 95, 90, 85, 80, 75 oder kleiner sein. In einem Beispiel kann Punkt A (386, 100) sein, Punkt B kann (386, 95) sein, Punkt C kann (350, 95) sein und Punkt D kann (350, 100) sein.
Eine isolierte Nukleinsäure wird auch zur Verfügung gestellt, welche mindestens etwa 12 Basen lang ist (z. B. mindestens etwa 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 100, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000 oder 5000 Basen lang) und unter Hybridisierungsbedingungen zum sense- oder antisense-Strang einer Nukleinsäure, welche die in SEQ ID NO:1, 2, 37, 38, 40, 41,95 oder 96 dargestellte Sequenz besitzt, hybridisiert. Die Hybridisierungsbedingungen können mäßig oder sehr streng sein.
Im Sinne dieser Erfindung bedeuten mäßig strenge Hybridisierungsbedingungen, dass die Hybridisierung durchgeführt wird bei etwa 42 C in einer Hybridisierungslösung, die 25 mM KPO₄ (pH 7,4), 5 × SSC, 5 × Denhart's Lösung, 50 μg/ml denaturierte, sonifizierte Lachsspermien-DNA, 50%iges Formamid, 10%iges Dextransulfat und 1–15 ng/ml Sonde (ungefähr 5 × 10⁷ cpm/μg) enthält, wobei die Waschungen bei etwa 50 C durchgeführt werden mit einer Waschlösung, die 2 × SSC und 0,1%iges Sodiumdodecylsulfat enthält.
Sehr strenge Hybridisierungsbedingungen bedeuten, dass die Hybridisierung bei etwa 42 C in einer Hybridisierungslösung durchgeführt wird, die 25 mM KPO₄ (pH 7,4), 5 × SSC, 5 × Denhart's Lösung, 50 μg/ml denaturierte, sonifizierte Lachsspermien-DNA, 50%iges Formamid, 10%iges Dextransulfat und 1–15 ng/ml Sonde (ungefähr 5 × 10⁷ cpm/μg) enthält, wobei die Waschungen bei etwa 65 C durchgeführt werden mit einer Waschlösung, die 2 × SSC und 0,1%iges Sodiumdodecylsulfat enthält.
Eine isolierte Nukleinsäure, wie hier beschrieben, kann durch die Verwendung jeder Methode erhalten werden, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, des gewöhnlichne molekularen Klonens und Techniken der chemischen Nukleinsäuresynthese. Beispielsweise kann die PCR verwendet werden, um eine isolierte Nukleinsäure zu erhalten, welche eine Nukleinsäuresequenz enthält, die eine Ähnlichkeit mit der die in SEQ ID NO:1, 2, 37, 38, 40, 41, 95 oder 96 dargestellten Sequenz teilt. PCR bezeichnet ein Verfahren oder eine Technik, in der die Zielnukleinsäure in einer Weise vervielfältigt wird, die der ähnlich ist, die in U.S. Patent No. 4,683,195 beschrieben wird sowie nachfolgende Abwandlungen des hier beschriebenen Verfahrens. Im Allgemeinen werden Sequenzinformationen von den Enden der interessanten Region oder darüber hinaus verwendet, um Oligonukleotid-Primer zu gestalten, die in ihren Sequenzen gegenüberliegenden Strängen einer potentiellen zu amplifizierenden Matrize identisch oder ähnlich sind. Wenn eine PCR verwendet wird, kann eine Nukleinsäuresequenz aus RNA oder DNA amplifiziert werden. Beispielsweise kann eine Nukleinsäuresequenz mittels PCR-Amplifizierung aus zellulärer Total-RNA, genomischer Total-DNA und cDNA sowie aus Bakteriophagensequenzen, Plasmidsequenzen, viralen Sequenzen und ähnlichem isoliert werden. Wenn RNA als Quelle für die Matrize benutzt wird, dann kann die reverse Transkriptase dazu verwendet werden, komplementäre DNA-Strange zu synthetisieren.
Eine isolierte Nukleinsäure, wie hier beschrieben, kann auch durch Mutagenese erhalten werden. Beispielsweise kann eine isolierte Nukleinsäure, welche eine Sequenz enthält, die in SEQ ID NO:1, 2, 37, 38, 40, 41, 95 oder 96 dargestellt ist, mutiert werden durch die Verwendung gebräuchlicher Techniken des molekularen Klonens (z. B. ortsgerichtete Mutagenese). Mögliche Mutationen beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, Deletionen, Insertionen und Substitutionen, sowie Kombinationen aus Deletionen, Insertionen und Substitutionen.
Zusätzlich können Nukleinsäure- und Aminosäuredatenbanken (z. B. GenBank^®) verwendet werden, um eine isolierte Nukleinsäue, wie hier beschrieben, zu erhalten. Beispielsweise kann jede Nukleinsäuresequenz, die ein wenig Homologie zu einer Sequenz aufweist, welche in SEQ ID NO:1, 2, 37, 38, 40, 41, 95 oder 96 dargelegt ist, oder jede Aminosäuresequenz, die ein wenig Homologie zu einer Sequenz aufweist, die in SEQ ID NO:3, 39, 42 oder 97 dargelegt ist, als Suchanfrage verwendet werden, um GenBank^® zu durchsuchen.
Weiterhin können Techniken der Nukleinsäurehybridisierung verwendet werden, um eine isolierte Nukleinsäure, wie hier beschrieben, zu erhalten. Kurzgefasst kann jede Nukleinsäure, die ein wenig Homologie zu einer Sequenz aufweist, die in SEQ ID NO:1, 2, 37, 38, 40, 41, 95 oder 96 dargelegt ist, als Sonde verwendet werden, um eine ähnliche Nukleinsäure durch Hybridisierung unter mäßigen bis sehr strengen Bedingungen zu identifizieren. Einmal identifiziert, kann die Nukleinsäure gereinigt, sequenziert und analysiert werden, um zu bestimmen, ob sie so ist, wie hier beschrieben.
Die Hybridisierung kann als Southern oder Northern Blot durchgeführt werden, um eine DNA- beziehungsweise eine RNA-Sequenz zu identifizieren, die mit einer Sonde hybridisiert. Die Sonde kann mit einem Biotin, Digoxygenin, einem Enzym oder einem Radioisotop, wie beispielsweise ³²P, gekennzeichnet sein. Die DNA oder RNA, die analysiert werden soll, kann auf einem Agarose- oder Polyacrylamidgel elektrophoretisch getrennt werden, auf Nitrocellulose, Nylon oder eine andere geeignete Membran überführt werden und mit der Sonde hybridisiert werden, unter Verwendung von im Fach wohlbekannten Standardtechniken, wie jene in den Abschnitten 7.39–7.52 in Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, second edition, Cold Spring harbor Laboratory, Plainview, NY beschriebenen. Typischerweise ist eine Sonde mindestens etwa 20 Nukleotide lang. Beispielsweise kann eine Sonde, entsprechend einer 20-Nukleotidsequenz, dargelegt in SEQ ID NO:1, 2, 37, 38, 40, 41, 95 oder 96, dazu verwendet werden, eine identische oder ähnliche Nukleinsäure zu identifizieren. Zusätzlich können Sonden verwendet werden, die länger oder kürzer als 20 Nukleotide sind.
Eine isolierte Nukleinsäure wird zur Verfügung gestellt, welche die gesamte Nukleinsäuresequenz enthält, die in 2, 3, 7, 8, 10, 28 oder 29 dargestellt ist. Zusätzlich wird eine isolierte Nukleinsäure zur Verfügung gestellt, welche einen Teil der Nukleinsäuresequenz enthält, die in 2, 3, 7, 8, 10, 28 oder 29 dargestellt ist. Beispielsweise wird eine isolierte Nukleinsäure zur Verfügung gestellt, welche eine 15-Nukleotidsequenz enthält, die identisch ist mit irgendeiner in 2, 3, 7, 8, 10, 28 oder 29 dargestellten 15-Nukleotidsequenz, wobei sie, ohne darauf beschränkt zu sein, die Sequenz enthält, die bei Nukleotid 1 beginnt und bei Nukleotid 15 endet, oder die bei Nukleotid 2 beginnt und bei Nukleotid 16 endet, oder die bei Nukleotid 3 beginnt und bei Nukleotid 17 endet, und so weiter. Es ist so zu verstehen, dass auch eine isolierte Nukleinsäure zur Verfügung gestellt wird, die eine Nukleotidsequenz enthält, die größer als 15 Nukleotide (z. B. 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 oder mehr Nukleotide) in der Länge ist und identisch zu irgendeinem Teil der Sequenz, die in 2, 3, 7, 8, 10, 28 oder 29 dargestellt ist. Beispielsweise wird eine isolierte Nukleinsäure zur Verfügung gestellt, welche eine 25-Nukleotidsequenz enthält, die identisch ist mit irgendeiner in 2, 3, 7, 8, 10, 28 oder 29 dargestellten 25-Nukleotidsequenz, wobei sie, ohne darauf beschränkt zu sein, die Sequenz enthält, die bei Nukleotid 1 beginnt und bei Nukleotid 25 endet, oder die bei Nukleotid 2 beginnt und bei Nukleotid 26 endet, oder die bei Nukleotid 3 beginnt und bei Nukleotid 27 endet, und so weiter. Zusätzliche Beispiele beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, isolierte Nukleinsäuren, die eine Nukleotidsequenz enthalten, die 50 oder mehr Nukleotide (z. B. 100, 150, 200, 250, 300, 350, oder mehr Nukleotide) lang ist und identisch zu irgendeinem Teil der Sequenz, die in 2, 3, 7, 8, 10, 28 oder 29 dargestellt ist. Solche isolierten Nukleinsäuren können, ohne darauf beschränkt zu sein, jene isolierten Nukleinsäuren beinhalten, die eine Nukleinsäuresequenz enthalten, vertreten in einer einzelnen Sequenzlinie, welche in 2, 3, 7, 8, 10, 28 oder 29 dargestellt ist, da jede Sequenzlinie, die in diesen Abbildungen dargestellt ist, mit Ausnahme der letzten Linie, eine 50-Nukleotidsequenz bietet. Zusätzlich wird eine isolierte Nukleinsäure zur Verfügung gestellt, welche eine Variation der Nukleinsäuresequenz, dargestellt in 2, 3, 7, 8, 10, 28 oder 29, enthält. Beispielsweise wird eine isolierte Nukleinsäure zur Verfügung gestellt, welche eine Nukleinsäuresequenz enthält, dargestellt in 2, 3, 7, 8, 10, 28 oder 29, die eine einzelne Insertion, eine einzelne Deletion, eine einzelne Substitution, mehrfache Insertionen, mehrfache Deletionen, mehrfache Substitutionen oder jede Kombination daraus (z. B. einzelne Deletion zusammen mit mehrfachen Insertionen) enthält. Mehrere Beispiele einer isolierten Nukleinsäure werden zur Verfügung gestellt, die eine Variation einer in 2, 3, 7, 8, 10, 28 oder 29 dargestellten Nukleinsäuresequenz enthält.
5 stellt die Nukleinsäuresequenz dar, die in 3 (bezeichnet STdxsdna) dargestellt ist, alignet mit 13 anderen Nukleinsäuresequenzen. Beispiele von Variationen der STdxsdna-Sequenz beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, jede Variation der STdxsdna-Sequenz, die in 5 zur Verfügung gestellt wird. In 5 werden Variationen zur Verfügung gestellt, dergestalt, dass ein Vergleich des Nukleotids (oder das Fehlen hiervon) an einer bestimmten Position der STdxsdna-Sequenz mit dem Nukleotid (oder dem Fehlen hiervon) an derselben Position jeder der anderen 13 Nukleinsäuresequenzen, dargestellt in 5, eine Liste von spezifischen Veränderungen für die STdxsdna-Sequenz zur Verfügung stellt. Beispielsweise kann das „t" an Position 1260 der STdxsdna-Sequenz durch ein „a" ersetzt werden, wie in 5 angegeben. Wie auch in 5 angegeben, kann das „a" an Position 1851 der STdxsdna-Sequenz ersetzt werden durch ein „t" oder „c"; ein „t" kann nach dem „a" an Position 1865 der STdxsdna-Sequenz eingefügt werden; oder das „t" an Position 1078 der STdxsdna-Sequenz kann gestrichen werden. Es ist so zu verstehen, dass die STdxsdna-Sequenz jede Anzahl an Variationen sowie jede Kombination von Variationstypen enthalten kann. Beispielsweise kann die STdxsdna-Sequenz eine Variation enthalten, die in 5 zur Verfügung gestellt wird, oder mehr als eine (z. B. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, oder mehr) der Variationen, die in 5 zur Verfügung gestellt werden. Es wird angemerkt, dass die Nukleinsäuresequenzen in ihrer vollen Länge, dargestellt in 5, Polypeptide kodieren können, die DXS-Aktivität besitzen. Es wird auch angemerkt, dass die Nukleinsäuresequenz, die in 2 dargestellt ist, die Nukleinsäuresequenz enthält, die in 3 dargestellt ist.
13 stellt die Nukleinsäuresequenz dar, die in 8 (bezeichnet RSddsdna) dargestellt ist, und die Nukleinsäuresequenz, die in 11 (bezeichnet STddsdna) dargestellt ist, alignet miteinander sowie mit drei anderen Nukleinsäuresequenzen. Beispiele von Variationen der RSddsdna-Sequenz beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, jede Variation der RSddsdna-Sequenz, die in 13 zur Verfügung gestellt wird. Beispiele von Variationen der STddsdna-Sequenz beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, jede Variation der STddsdna-Sequenz, die in 13 zur Verfügung gestellt wird. In 13 werden Variationen zur Verfügung gestellt, dergestalt, dass ein Vergleich des Nukleotids (oder das Fehlen hiervon) an einer bestimmten Position der RSddsdna-Sequenz oder der STddsdna-Sequenz mit dem Nukleotid (oder dem Fehlen hiervon) an derselben Position jeder der anderen Nukleinsäuresequenzen, dargestellt in 13, eine Liste von spezifischen Veränderungen für die RSddsdna-Sequenz und die STddsdna-Sequenz zur Verfügung stellt. Beispielsweise kann das „a" an Position 51 der RSddsdna-Sequenz oder das „a" an Position 756 der STddsdna-Sequenz durch ein „t" ersetzt werden, wie in 13 angegeben. Wiederum ist es so zu verstehen, dass die RSddsdna-Sequenz sowie die STddsdna-Sequenz jede Anzahl an Variationen sowie jede Kombination von Variationstypen enthalten kann. Beispielsweise kann die RSddsdna-Sequenz eine Variation enthalten, die in 13 zur Verfügung gestellt wird, oder mehr als eine (z. B. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, oder mehr) der Variationen, die in 13 zur Verfügung gestellt werden. Ebenso kann die STddsdna-Sequenz eine Variation enthalten, die in 13 zur Verfügung gestellt wird, oder mehr als eine (z. B. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, oder mehr) der Variationen, die in 13 zur Verfügung gestellt werden. Es wird angemerkt, dass die Nukleinsäuresequenzen in ihrer vollen Länge, dargestellt in 13, Polypeptide kodieren können, die DDS-Aktivität besitzen. Es wird auch angemerkt, dass die Nukleinsäuresequenz, die in 7 dargestellt ist, die Nukleinsäuresequenz enthält, die in 8 dargestellt ist und dass die Nukleinsäuresequenz, die in 10 dargestellt ist, die Nukleinsäuresequenz enthält, die in 11 dargestellt ist.
Die Nukleinsäuresequenz, die in 7 dargestellt ist, enthält eine Nukleinsäuresequenz, die ein R. sphaeroides-(ATCC 17023)Polypeptid kodiert, das DDS-Aktivität besitzt. Eine andere Variante dieser Nukleinsäuresequenz ist die Nukleinsäuresequenz eines Klons, isoliert aus R. sphaeroides (ATCC 35053). Kurzgefasst wurde ein R. sphaeroides-(ATCC 35053)Klon identifiziert und es wurde herausgefunden, dass er eine Sequenz enthält, identisch zu der Nukleinsäuresequenz, die in 7 dargestellt ist, mit folgenden drei Ausnahmen. Der R. sphaeroides-(ATCC 35053)Klon hat ein „t" an Position 885 statt eines „c"'s, ein „c" eingefügt nach dem „c" an Position 1620 und ein „c" eingefügt nach dem „c" an Position 1733.
Die Nukleinsäuresequenz, die in 8 dargestellt ist, enthält auch eine Nukleinsäuresequenz, die ein R. sphaeroides-(ATCC 17023)Polypeptid kodiert, das DDS-Aktivität besitzt. Eine andere Variante dieser Nukleinsäuresequenz ist die Nukleinsäuresequenz eines Klons, isoliert aus R. sphaeroides (ATCC 35053). Kurzgefasst wurde ein R. sphaeroides-(ATCC 35053)Klon identifiziert und es wurde herausgefunden, dass er eine Sequenz enthält, identisch zu der Nukleinsäuresequenz, die in 8 dargestellt ist, mit folgender Ausnahme. Der R. sphaeroides-(ATCC 35053)Klon hat ein „t" an Position 514 statt eines „c"'s.
31 stellt die Nukleinsäuresequenz dar, die in 29 (bezeichnet STdxrcds) dargestellt ist, alignet mit elf anderen Nukleinsäuresequenzen. Beispiele von Variationen der STdxrcds-Sequenz beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, jede Variation der STdxrcds-Sequenz, die in 31 zur Verfügung gestellt wird. In 31 werden Variationen zur Verfügung gestellt, dergestalt, dass ein Vergleich des Nukleotids (oder das Fehlen hiervon) an einer bestimmten Position der STdxrcds-Sequenz mit dem Nukleotid (oder dem Fehlen hiervon) an derselben Position jeder der anderen Nukleinsäuresequenzen, dargestellt in 31, eine Liste von spezifischen Veränderungen für die STdxrcds-Sequenz zur Verfügung stellt. Wieder ist es so zu verstehen, dass die STdxrcds-Sequenz jede Anzahl an Variationen sowie jede Kombination von Variationstypen enthalten kann. Beispielsweise kann die STdxrcds-Sequenz eine Variation enthalten, die in 31 zur Verfügung gestellt wird, oder mehr als eine (z. B. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, oder mehr) der Variationen, die in 31 zur Verfügung gestellt werden. Es wird angemerkt, dass die Nukleinsäuresequenzen in ihrer vollen Länge, dargestellt in 31, Polypeptide kodieren können, die DXR-Aktivität besitzen. Es wird auch angemerkt, dass die Nukleinsäuresequenz, die in 29 dargestellt ist, die Nukleinsäuresequenz enthält, die in 28 dargestellt ist.
Es wird auch eine isolierte Nukleinsäure zur Verfügung gestellt, die eine Variante eines Teils der Nukleinsäuresequenz, die in 2, 3, 7, 8, 10, 11, 28 oder 29 dargestellt ist, enthält, wie hier beschrieben.
Eine isolierte Nukleinsäure wird zur Verfügung gestellt, welche eine Nukleinsäuresequenz enthält, die die gesamte Aminosäuresequenz, die in 4, 9, 12 oder 30 dargestellt ist, kodiert. Zusätzlich wird eine isolierte Nukleinsäure zur Verfügung gestellt, welche eine Nukleinsäuresequenz enthält, die einen Teil der Aminosäuresequenz, die in 4, 9, 12 oder 30 dargestellt ist, kodiert. Beispielsweise wird eine isolierte Nukleinsäure zur Verfügung gestellt, welche eine Nukleinsäuresequenz enthält, die eine 15- Aminosäuresequenz kodiert, die identisch ist mit irgendeiner in 4, 9, 12 oder 30 dargestellten 15-Aminosäuresequenz, wobei sie, ohne darauf beschränkt zu sein, die Sequenz enthält, die bei Aminosäurerest 1 beginnt und bei Aminosäurerest 15 endet, oder die Sequenz, die bei Aminosäurerest 2 beginnt und bei Aminosäurerest 16 endet, oder die Sequenz, die bei Aminosäurerest 3 beginnt und bei Aminosäurerest 17 endet, und so weiter. Es ist so zu verstehen, dass auch eine isolierte Nukleinsäure zur Verfügung gestellt wird, die eine Nukleinsäuresequenz enthält, welche eine Aminosäuresequenz kodiert, die größer als 15 Aminosäurereste (z. B. 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 oder mehr Aminosäurereste) in der Länge ist und identisch zu irgendeinem Teil der Sequenz, die in 4, 9, 12 oder 30 dargestellt ist. Beispielsweise wird eine isolierte Nukleinsäure zur Verfügung gestellt, welche eine Nukleinsäuresequenz enthält, die eine 25-Aminosäuresequenz kodiert, die identisch ist mit irgendeiner in 4, 9, 12 oder 30 dargestellten 25-Aminosäuresequenz, wobei sie, ohne darauf beschränkt zu sein, die Sequenz enthält, die bei Aminosäurerest 1 beginnt und bei Aminosäurerest 25 endet, oder die Sequenz, die bei Aminosäurerest 2 beginnt und bei Aminosäurerest 26 endet, oder die Sequenz, die bei Aminosäurerest 3 beginnt und bei Aminosäurerest 27 endet, und so weiter. Zusätzliche Beispiele beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, isolierte Nukleinsäuren, die eine Nukleinsäuresequenz enthalten, welche eine Aminosäuresequenz kodiert, die 50 oder mehr Aminosäurereste (z. B. 100, 150, 200, 250, 300, 350, oder mehr Aminosäurereste) lang ist und identisch zu irgendeinem Teil der Sequenz, die in 4, 9, 12 oder 30 dargestellt ist. Solche isolierten Nukleinsäuren können, ohne darauf beschränkt zu sein, jene isolierten Nukleinsäuren beinhalten, welche eine Nukleinsäuresequenz enthalten, die eine Aminosäuresequenz kodiert, vertreten in einer einzelnen Sequenzlinie, welche in 4, 9, 12 oder 30 dargestellt ist, da jede Sequenzlinie, die in diesen Abbildungen dargestellt ist, mit Ausnahme der letzten Linie, eine 50-Aminosäuresequenz bietet.
Zusätzlich wird eine isolierte Nukleinsäure zur Verfügung gestellt, die eine Nukleinsäuresequenz enthält, welche eine Aminosäuresequenz kodiert, wobei sie eine Variation der Aminosäuresequenz, dargestellt in 4, 9, 12 oder 30, besitzt. Beispielsweise wird eine isolierte Nukleinsäure zur Verfügung gestellt, die eine Nukleinsäuresequenz enthält, welche eine Aminosäuresequenz kodiert, dargestellt in 4, 9, 12 oder 30, die eine einzelne Insertion, eine einzelne Deletion, eine einzelne Substitution, mehrfache Insertionen, mehrfache Deletionen, mehrfache Substitutionen oder jede Kombination daraus (z. B. einzelne Deletion zusammen mit mehrfachen Insertionen) enthält. Mehrere Beispiele einer isolierten Nukleinsäure werden zur Verfügung gestellt, die eine Nukleinsäuresequenz enthält, welche eine Aminosäuresequenz kodiert, wobei sie eine Variation der Aminosäuresequenz, dargestellt in 4, 9, 12 oder 30, besitzt.
6 stellt die Aminosäuresequenz dar, die in 4 (bezeichnet STdxsp) dargestellt ist, alignet mit 20 anderen Aminosäuresequenzen. Beispiele von Variationen der STdxsp-Sequenz beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, jede Variation der STdxsp-Sequenz, die in 6 zur Verfügung gestellt wird. In 6 werden Variationen zur Verfügung gestellt, dergestalt, dass ein Vergleich des Aminosäurerests (oder das Fehlen hiervon) an einer bestimmten Position der STdxsp-Sequenz mit dem Aminosäurerest (oder dem Fehlen hiervon) an derselben Position jeder der anderen 20 Aminosäuresequenzen, dargestellt in 6, eine Liste von spezifischen Veränderungen für die STdxsp-Sequenz zur Verfügung stellt. Beispielsweise kann das „t" an Position 1148 der STdxsp-Sequenz durch ein „s" ersetzt werden, wie in 6 angegeben. Wie auch in 6 angegeben, kann das „f" an Position 575 der STdxsp-Sequenz durch ein „m", „a", „l", „i", „y" oder „v" ersetzt werden. Für 6 wurde die Nukleinsäurenummerierung von 2 verwendet, um die Positionen der Aminosäurereste der STdxsp-Sequenz zu nummerieren. Somit beginnt der erste Aminosäurerest der STdxsp-Sequenz mit Nummer 182 und setzt sich in Dreierschritten fort. Es ist so zu verstehen, dass die STdxsp-Sequenz jede Anzahl an Variationen sowie jede Kombination von Variationstypen enthalten kann. Beispielsweise kann die STdxsp-Sequenz eine Variation enthalten, die in 6 zur Verfügung gestellt wird, oder mehr als eine (z. B. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, oder mehr) der Variationen, die in 6 zur Verfügung gestellt werden. Es wird angemerkt, dass die 21 Aminosäuresequenzen in ihrer vollen Länge, dargestellt in 6, Polypeptide sein können, die DXS-Aktivität besitzen.
14 stellt die Aminosäuresequenz dar, die in 9 (bezeichnet RSddsp) dargestellt ist, und die Aminosäuresequenz, die in 12 (bezeichnet STddsp) dargestellt ist, alignet miteinander sowie mit drei anderen Aminosäuresequenzen. Für 14 wurde die Nukleinsäurenummerierung von 7 verwendet, um die Positionen der Aminosäurereste der RSddsp-Sequenz zu nummerieren und die Nukleinsäurenummerierung von 10 wurde verwendet, um Positionen der Aminosäurereste der STddsp-Sequenz zu nummerieren. Somit beginnt der erste Aminosäurerest sowohl der RSddsp-Sequenz als auch der STddsp-Sequenz mit einer Nummer, die nicht 1 ist und setzt sich in Dreierschritten fort. Beispiele von Variationen der RSddsp-Sequenz beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, jede Variation der RSddsp-Sequenz, die in 14 zur Verfügung gestellt wird. Beispiele für Variationen der STddsp-Sequenz beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, jede Variation der STddsp-Sequenz, die in 14 zur Verfügung gestellt wird. In 14 werden Variationen zur Verfügung gestellt, dergestalt, dass ein Vergleich des Aminosäurerestes (oder das Fehlen hiervon) an einer bestimmten Position der RSddsp-Sequenz oder der STddsp-Sequenz mit dem Aminosäurerest (oder dem Fehlen hiervon) an derselben Position jeder der anderen Aminosäuresequenzen, dargestellt in 14, eine Liste von spezifischen Veränderungen für die RSddsp-Sequenz oder die STddsp-Sequenz zur Verfügung stellt. Beispielsweise kann das „l" an Position 762 der RSddsp-Sequenz oder das „l" an Position 1007 der STddsp-Sequenz durch ein „a" ersetzt werden, wie in 14 angegeben. Wiederum ist es so zu verstehen, dass die RSddsp-Sequenz sowie die STddsp-Sequenz jede Anzahl an Variationen sowie jede Kombination von Variationstypen enthalten kann. Beispielsweise kann die RSddsp-Sequenz eine Variation enthalten, die in 14 zur Verfügung gestellt wird, oder mehr als eine (z. B. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, oder mehr) der Variationen, die in 14 zur Verfügung gestellt werden. Ebenso kann die STddsp-Sequenz eine Variation enthalten, die in 14 zur Verfügung gestellt wird, oder mehr als eine (z. B. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, oder mehr) der Variationen, die in 14 zur Verfügung gestellt werden. Es wird angemerkt, dass die fünf Aminosäuresequenzen in ihrer vollen Länge, dargestellt in 14, Polypeptide sein können, die DDS-Aktivität besitzen.
Die Aminosäuresequenz, die in 9 dargestellt ist, stellt ein R. sphaeroides-(ATCC 17023)Polypeptid dar, das DDS-Aktivität besitzt. Eine andere Variante dieser Aminosäuresequenz ist die Aminosäuresequenz, kodiert von einem Klon, isoliert aus R. sphaeroides (ATCC 35053). Kurzgefasst wurde ein R. sphaeroides-(ATCC 35053)Klon identifiziert und es wurde herausgefunden, dass er eine Aminosäuresequenz kodiert, identisch zu der Aminosäuresequenz, die in 9 dargestellt ist, mit folgender Ausnahme. Der R. sphaeroides-(ATCC 35053)Klon hat ein „y" an Position 172 statt eines „h"'s.
32 stellt die Aminosäuresequenz dar, die in 30 (bezeichnet STdxrp) dargestellt ist, alignet mit 15 anderen Aminosäuresequenzen. Beispiele von Variationen der STdxrp-Sequenz beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, jede Variation der STdxrp-Sequenz, die in 32 zur Verfügung gestellt wird. In 32 werden Variationen zur Verfügung gestellt, dergestalt, dass ein Vergleich des Aminosäurerestes (oder das Fehlen hiervon) an einer bestimmten Position der STdxrp-Sequenz mit dem Aminosäurerest (oder dem Fehlen hiervon) an derselben Position jeder der anderen 15 Aminosäuresequenzen, dargestellt in 32, eine Liste von spezifischen Veränderungen für die STdxrp-Sequenz zur Verfügung stellt. Es ist so zu verstehen, dass die STdxrp-Sequenz jede Anzahl an Variationen sowie jede Kombination von Variationstypen enthalten kann. Beispielsweise kann die STdxrp-Sequenz eine Variation enthalten, die in 32 zur Verfügung gestellt wird, oder mehr als eine (z. B. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, oder mehr) der Variationen, die in 32 zur Verfügung gestellt werden. Es wird angemerkt, dass die Aminosäuresequenzen in ihrer vollen Länge, dargestellt in 32, Polypeptide sein können, die DXR-Aktivität besitzen.
Es wird auch eine isolierte Nukleinsäure zur Verfügung gestellt, die eine Nukleinsäuresequenz enthält, welche eine Aminosäuresequenz kodiert, die eine Variante eines Teils der in 4, 9, 12 oder 30 dargestellten Aminosäuresequenz enthält, wie hier beschrieben.
2. Polypeptide
Im Wesentlichen reine Polypeptide werden zur Verfügung gestellt. Der Begriff „im Wesentlichen rein", wie er hier verwendet wird in Bezug auf ein Polypeptid, bedeutet, dass das Polypeptid im Wesentlichen frei ist von anderen Polypeptiden, Lipiden, Kohlehydraten und Nukleinsäuren, mit denen es natürlicherweise verbunden ist. Somit ist ein im Wesentlichen reines Polypeptid jedes Polypeptid, das aus seiner natürlichen Umwelt entfernt ist und mindestens zu 60% rein ist. Ein im Wesentlichen reines Polypeptid kann mindestens zu etwa 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 oder 99 Prozent rein sein. Typischerweise wird ein im Wesentlichen reines Polypeptid eine einzelne Hauptbande an ein nichtreduzierendes Polyacrylamidgel abgeben.
Jedes im Wesentlichen reine Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz besitzt, welche von einer hier beschriebenen Nukleinsäure kodiert wird, wird betrachtet. Zusätzlich wird jedes im Wesentlichen reine Polypeptid betrachtet, das eine Aminosäuresequenz enthält, die eine Länge und Prozentidentität zu der in SEQ ID NO:3 dargelegten Sequenz über die Länge besitzt, wie hier bestimmt, vorausgesetzt, der Punkt, der durch diese Länge und Prozentidentität definiert wird, befindet sich innerhalb der Fläche, die durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird; wobei Punkt A eine X-Koordinate kleiner oder gleich 641 und eine Y-Koordinate kleiner oder gleich 100 hat; wobei Punkt B eine X-Koordinate kleiner oder gleich 641 und eine Y-Koordinate größer oder gleich 50 hat; wobei Punkt C eine X-Koordinate größer oder gleich 25 und eine Y-Koordinate größer oder gleich 50 hat; und wobei Punkt D eine X-Koordinate größer oder gleich 5 und eine Y-Koordinate kleiner oder gleich 100 hat. Beispielsweise kann die X-Koordinate für Punkt A 641, 635, 630, 625, 620 oder kleiner sein; und die Y-Koordinate für Punkt A kann 100, 99, 95, 90, 85, 80, 75 oder kleiner sein. Die X-Koordinate für Punkt B kann 641, 635, 630, 625, 620 oder kleiner sein; und die Y-Koordinate für Punkt B kann 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 oder größer sein. Die X-Koordinate für Punkt C kann 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 oder größer sein; und die Y-Koordinate für Punkt C kann 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 oder größer sein. Die X-Koordinate für Punkt D kann 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100 oder größer sein; und die Y-Koordinate für Punkt D kann 100, 99, 95, 90, 85, 80, 75 oder kleiner sein. In einem Beispiel kann Punkt A (641, 100) sein, Punkt B kann (641, 95) sein, Punkt C kann (400, 95) sein und Punkt D kann (400, 100) sein.
Jedes im Wesentlichen reine Polypeptid wird betrachtet, das eine Aminosäuresequenz enthält, die eine Länge und Prozentidentität zu der in SEQ ID NO:39 dargelegten Sequenz über die Länge besitzt, wie hier bestimmt, vorausgesetzt, der Punkt, der durch diese Länge und Prozentidentität definiert wird, befindet sich innerhalb der Fläche, die durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird; wobei Punkt A eine X-Koordinate kleiner oder gleich 333 und eine Y-Koordinate kleiner oder gleich 100 hat; wobei Punkt B eine X-Koordinate kleiner oder gleich 333 und eine Y-Koordinate größer oder gleich 50 hat; wobei Punkt C eine X-Koordinate größer oder gleich 25 und eine Y-Koordinate größer oder gleich 50 hat; und wobei Punkt D eine X-Koordinate größer oder gleich 5 und eine Y-Koordinate kleiner oder gleich 100 hat. Beispielsweise kann die X-Koordinate für Punkt A 333, 330, 325, 320,315 oder kleiner sein; und die Y-Koordinate für Punkt A kann 100, 99, 95, 90, 85, 80, 75 oder kleiner sein. Die X-Koordinate für Punkt B kann 333, 330, 325, 320,315 oder kleiner sein; und die Y-Koordinate für Punkt B kann 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 oder größer sein. Die X-Koordinate für Punkt C kann 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 oder größer sein; und die Y-Koordinate für Punkt C kann 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 oder größer sein. Die X-Koordinate für Punkt D kann 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100 oder größer sein; und die Y-Koordinate für Punkt D kann 100, 99, 95, 90, 85, 80, 75 oder kleiner sein. In einem Beispiel kann Punkt A (333, 100) sein, Punkt B kann (333, 95) sein, Punkt C kann (150, 95) sein und Punkt D kann (150, 100) sein.
Jedes im Wesentlichen reine Polypeptid wird betrachtet, das eine Aminosäuresequenz enthält, die eine Länge und Prozentidentität zu der in SEQ ID NO:42 dargelegten Sequenz über die Länge besitzt, wie hier bestimmt, vorausgesetzt, der Punkt, der durch diese Länge und Prozentidentität definiert wird, befindet sich innerhalb der Fläche, die durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird; wobei Punkt A eine X-Koordinate kleiner oder gleich 337 und eine Y-Koordinate kleiner oder gleich 100 hat; wobei Punkt B eine X- Koordinate kleiner oder gleich 337 und eine Y-Koordinate größer oder gleich 50 hat; wobei Punkt C eine X-Koordinate größer oder gleich 25 und eine Y-Koordinate größer oder gleich 50 hat; und wobei Punkt D eine X-Koordinate größer oder gleich 5 und eine Y-Koordinate kleiner oder gleich 100 hat. Beispielsweise kann die X-Koordinate für Punkt A 337, 335, 330, 325, 320,315 oder kleiner sein; und die Y-Koordinate für Punkt A kann 100, 99, 95, 90, 85, 80, 75 oder kleiner sein. Die X-Koordinate für Punkt B kann 337, 335, 330, 325, 320,315 oder kleiner sein; und die Y-Koordinate für Punkt B kann 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 oder größer sein. Die X-Koordinate für Punkt C kann 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 oder größer sein; und die Y-Koordinate für Punkt C kann 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 oder größer sein. Die X-Koordinate für Punkt D kann 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100 oder größer sein; und die Y-Koordinate für Punkt D kann 100, 99, 95, 90, 85, 80, 75 oder kleiner sein. In einem Beispiel kann Punkt A (337, 100) sein, Punkt B kann (337, 95) sein, Punkt C kann (150, 95) sein und Punkt D kann (150, 100) sein.
Jedes im Wesentlichen reine Polypeptid wird betrachtet, das eine Aminosäuresequenz enthält, die eine Länge und Prozentidentität zu der in SEQ ID NO:97 dargelegten Sequenz über die Länge besitzt, wie hier bestimmt, vorausgesetzt, der Punkt, der durch diese Länge und Prozentidentität definiert wird, befindet sich innerhalb der Fläche, die durch die Punkte A, B, C und D in 26 definiert wird; wobei Punkt A eine X-Koordinate kleiner oder gleich 386 und eine Y-Koordinate kleiner oder gleich 100 hat; wobei Punkt B eine X-Koordinate kleiner oder gleich 386 und eine Y-Koordinate größer oder gleich 50 hat; wobei Punkt C eine X-Koordinate größer oder gleich 25 und eine Y-Koordinate größer oder gleich 50 hat; und wobei Punkt D eine X-Koordinate größer oder gleich 5 und eine Y-Koordinate kleiner oder gleich 100 hat. Beispielsweise kann die X-Koordinate für Punkt A 386, 380, 375, 370, 365, 360, 350, 325, 300 oder kleiner sein; und die Y-Koordinate für Punkt A kann 100, 99, 95, 90, 85, 80, 75 oder kleiner sein. Die X-Koordinate für Punkt B kann 386, 380, 375, 370, 365, 360, 350, 325, 300 oder kleiner sein; und die Y-Koordinate für Punkt B kann 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 oder größer sein. Die X-Koordinate für Punkt C kann 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 350 oder größer sein; und die Y-Koordinate für Punkt C kann 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 oder größer sein. Die X-Koordinate für Punkt D kann 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 350 oder größer sein; und die Y-Koordinate für Punkt D kann 100, 99, 95, 90, 85, 80, 75 oder kleiner sein. In einem Beispiel kann Punkt A (386, 100) sein, Punkt B kann (386, 95) sein, Punkt C kann (350, 95) sein und Punkt D kann (350, 100) sein.
Jede Methode kann verwendet werden, um ein im Wesentlichen reines Polypeptid zu erhalten. Beispielsweise können gebräuchliche Reinigungstechniken für Polypeptide, wie Affinitätschromatographie und HPLC, ebenso wie Synthesetechniken für Polypeptide verwendet werden. Zusätzlich kann jedes Material verwendet werden, um ein im Wesentlichen reines Polypeptid zu erhalten. Beispielsweise kann Gewebe von Wildtyp- oder transgenen Tieren als Ausgangsmaterial verwendet werden. Zusätzlich können Gewebekulturzellen, konstruiert um ein bestimmtes Polypeptid von Interesse zu überexprimieren, verwendet werden, um ein im Wesentlichen reines Polypeptid zu erhalten. Weiterhin kann ein hier beschriebenes Polypeptid „konstruiert" werden, um eine Aminosäuresequenz zu enthalten, die es dem Polypeptid erlaubt, an einer Affinitätsmatrix gefangen zu werden. Beispielsweise kann ein tag, wie z. B. c-myc, Hämagglutinin, Polyhistidin oder Flag^TM tag (Kodak), als Hilfe zur Polypeptidreinigung verwendet werden. Solche tags können überall innerhalb des Polypeptids eingefügt werden, einschließlich am Carboxyl- oder am Aminoende. Andere Fusionen, die nützlich sein könnten, schließen Enzyme ein, die beim Nachweis der Polypeptide helfen, wie z. B. die Alkalische Phosphatase. Es werden Polypeptide zur Verfügung gestellt, die die gesamte in 4, 9, 12 oder 30 dargestellte Aminosäuresequenz enthalten. Zusätzlich werden Polypeptide zur Verfügung gestellt, die einen Teil der in 4, 9, 12 oder 30 dargestellten Aminosäuresequenz enthalten. Beispielsweise werden Polypeptide zur Verfügung gestellt, welche eine 15-Aminosäuresequenz enthalten, die identisch ist mit irgendeiner in 4, 9, 12 oder 30 dargestellten 15-Aminosäuresequenz, wobei sie, ohne darauf beschränkt zu sein, die Sequenz enthalten, die bei Aminosäurerest 1 beginnt und bei Aminosäurerest 15 endet, oder die Sequenz, die bei Aminosäurerest 2 beginnt und bei Aminosäurerest 16 endet, oder die Sequenz, die bei Aminosäurerest 3 beginnt und bei Aminosäurerest 17 endet, und so weiter. Es ist so zu verstehen, dass auch Polypeptide zur Verfügung gestellt werden, die eine Aminosäuresequenz enthalten, die größer als 15 Aminosäurereste (z. B. 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 oder mehr Aminosäurereste) in der Länge ist und identisch zu irgendeinem Teil der Sequenz, die in 4, 9, 12 oder 30 dargestellt ist. Beispielsweise werden Polypeptide zur Verfügung gestellt, welche eine 25-Aminosäuresequenz enthalten, die identisch ist mit irgendeiner in 4, 9, 12 oder 30 dargestellten 25-Aminosäuresequenz, wobei sie, ohne darauf beschränkt zu sein, die Sequenz enthalten, die bei Aminosäurerest 1 beginnt und bei Aminosäurerest 25 endet, oder die Sequenz, die bei Aminosäurerest 2 beginnt und bei Aminosäurerest 26 endet, oder die Sequenz, die bei Aminosäurerest 3 beginnt und bei Aminosäurerest 27 endet, und so weiter.
Zusätzliche Beispiele beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, Polypeptide, welche eine Aminosäuresequenz enthalten, die 50 oder mehr Aminosäurereste (z. B. 100, 150, 200, 250, 300, 350, oder mehr Aminosäurereste) lang ist und identisch zu irgendeinem Teil der Sequenz, die in 4, 9, 12 oder 30 dargestellt ist. Solche Polypeptide können, ohne darauf beschränkt zu sein, jene Polypeptide beinhalten, welche eine Aminosäuresequenz enthalten, vertreten in einer einzelnen Sequenzlinie, welche in 4, 9, 12 oder 30 dargestellt ist, da jede Sequenzlinie, die in diesen Abbildungen dargestellt ist, möglicherweise mit Ausnahme der letzten Linie, eine 50-Aminosäuresequenz bietet.
Zusätzlich werden Polypeptide zur Verfügung gestellt, welche eine Aminosäuresequenz enthalten, die eine Variation der in 4, 9, 12 oder 30 dargestellten Aminosäuresequenz besitzt. Beispielsweise werden Polypeptide zur Verfügung gestellt, die eine in 4, 9, 12 oder 30 dargestellte Aminosäuresequenz enthalten, welche eine einzelne Insertion, eine einzelne Deletion, eine einzelne Substitution, mehrfache Insertionen, mehrfache Deletionen, mehrfache Substitutionen oder jede Kombination daraus (z. B. einzelne Deletion zusammen mit mehrfachen Insertionen) enthält. Mehrere Beispiele von Polypeptiden werden zur Verfügung gestellt, welche eine Aminosäuresequenz enthalten, die eine Variation der in 4, 9, 12 oder 30 dargestellten Aminosäuresequenz besitzt.
6 stellt die Aminosäuresequenz dar, die in 4 (bezeichnet STdxsp) dargestellt ist, alignet mit 20 anderen Aminosäuresequenzen. Beispiele von Variationen der STdxsp-Sequenz beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, jede Variation der STdxsp-Sequenz, die in 6 zur Verfügung gestellt wird. In 6 werden Variationen zur Verfügung gestellt, dergestalt, dass ein Vergleich des Aminosäurerestes (oder das Fehlen hiervon) an einer bestimmten Position der STdxsp-Sequenz mit dem Aminosäurerest (oder dem Fehlen hiervon) an derselben Position jeder der anderen 20 Aminosäuresequenzen, dargestellt in 6, eine Liste von spezifischen Veränderungen für die STdxsp-Sequenz zur Verfügung stellt. Beispielsweise kann das „t" an Position 1148 der STdxsp-Sequenz durch ein „s" ersetzt werden, wie in 6 angegeben. Wie auch in 6 angegeben, kann das „f" an Position 575 der STdxsp-Sequenz durch ein „m", „a", „l", „i", „y" oder „v" ersetzt werden. Für 6 wurde die Nukleinsäurenummerierung von 2 verwendet, um die Positionen der Aminosäurereste der STdxsp-Sequenz zu nummerieren. Somit beginnt der erste Aminosäurerest der STdxsp-Sequenz mit Nummer 182 und setzt sich in Dreierschritten fort. Es ist so zu verstehen, dass die STdxsp-Sequenz jede Anzahl an Variationen sowie jede Kombination von Variationstypen enthalten kann. Beispielsweise kann die STdxsp-Sequenz eine Variation enthalten, die in 6 zur Verfügung gestellt wird, oder mehr als eine (z. B. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, oder mehr) der Variationen, die in 6 zur Verfügung gestellt werden. Es wird angemerkt, dass die 21 Aminosäuresequenzen in ihrer vollen Länge, dargestellt in 6, Polypeptide sein können, die DXS-Aktivität besitzen.
14 stellt die Aminosäuresequenz dar, die in 9 (bezeichnet RSddsp) dargestellt ist, und die Aminosäuresequenz, die in 12 (bezeichnet STddsp) dargestellt ist, alignet miteinander sowie mit drei anderen Aminosäuresequenzen. Für 14 wurde die Nukleinsäurenummerierung von 7 verwendet, um die Positionen der Aminosäurereste der RSddsp-Sequenz zu nummerieren und die Nukleinsäurenummerierung von 10 wurde verwendet, um Positionen der Aminosäurereste der STddsp-Sequenz zu nummerieren. Somit beginnt der erste Aminosäurerest sowohl der RSddsp-Sequenz als auch der STddsp-Sequenz mit einer Nummer, die nicht 1 ist und setzt sich in Dreierschritten fort. Beispiele von Variationen der RSddsp-Sequenz beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, jede Variation der RSddsp-Sequenz, die in 14 zur Verfügung gestellt wird. Beispiele für Variationen der STddsp-Sequenz beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, jede Variation der STddsp-Sequenz, die in 14 zur Verfügung gestellt wird. In 14 werden Variationen zur Verfügung gestellt, dergestalt, dass ein Vergleich des Aminosäurerestes (oder das Fehlen hiervon) an einer bestimmten Position der RSddsp-Sequenz oder der STddsp-Sequenz mit dem Aminosäurerest (oder dem Fehlen hiervon) an derselben Position jeder der anderen Aminosäuresequenzen, dargestellt in 14, eine Liste von spezifischen Veränderungen für die RSddsp-Sequenz oder die STddsp-Sequenz zur Verfügung stellt. Beispielsweise kann das „l" an Position 762 der RSddsp-Sequenz oder das „l" an Position 1007 der STddsp-Sequenz durch ein „a" ersetzt werden, wie in 14 angegeben. Wiederum ist es so zu verstehen, dass die RSddsp-Sequenz sowie die STddsp-Sequenz jede Anzahl an Variationen sowie jede Kombination von Variationstypen enthalten kann. Beispielsweise kann die RSddsp-Sequenz eine Variation enthalten, die in 14 zur Verfügung gestellt wird, oder mehr als eine (z. B. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, oder mehr) der Variationen, die in 14 zur Verfügung gestellt werden. Ebenso kann die STddsp-Sequenz eine Variation enthalten, die in 14 zur Verfügung gestellt wird, oder mehr als eine (z. B. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, oder mehr) der Variationen, die in 14 zur Verfügung gestellt werden. Es wird angemerkt, dass die fünf Aminosäuresequenzen in ihrer vollen Länge, dargestellt in 14, Polypeptide sein können, die DDS-Aktivität besitzen.
32 stellt die Aminosäuresequenz dar, die in 30 (bezeichnet STdxrp) dargestellt ist, alignet mit 15 anderen Aminosäuresequenzen. Beispiele von Variationen der STdxrp-Sequenz beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, jede Variation der STdxrp-Sequenz, die in 32 zur Verfügung gestellt wird. In 32 werden Variationen zur Verfügung gestellt, dergestalt, dass ein Vergleich des Aminosäurerestes (oder das Fehlen hiervon) an einer bestimmten Position der STdxrp-Sequenz mit dem Aminosäurerest (oder dem Fehlen hiervon) an derselben Position jeder der anderen 15 Aminosäuresequenzen, dargestellt in 32, eine Liste von spezifischen Veränderungen für die STdxrp-Sequenz zur Verfügung stellt. Es ist so zu verstehen, dass die STdxrp-Sequenz jede Anzahl an Variationen sowie jede Kombination von Variationstypen enthalten kann. Beispielsweise kann die STdxrp-Sequenz eine Variation enthalten, die in 32 zur Verfügung gestellt wird, oder mehr als eine (z. B. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, oder mehr) der Variationen, die in 32 zur Verfügung gestellt werden. Es wird angemerkt, dass die Aminosäuresequenzen in ihrer vollen Länge, dargestellt in 32, Polypeptide sein können, die DXR-Aktivität besitzen.
Es werden auch Polypeptide zur Verfügung gestellt, die eine Aminosäuresequenz enthalten, die eine Variante eines Teils der in 4, 9, 12 oder 30 dargestellten Aminosäuresequenz enthält, wie hier beschrieben.
3. Genetisch modifizierte Zellen
Jede Zelle, die eine hier beschriebene isolierte Nukleinsäure enthält, wird betrachtet. Dies beinhaltet, ohne darauf beschränkt zu sein, prokaryotische Zellen, wie z. B. aus der Familie der Rhodospirillaceae (z. B. Rhodobacter-Zellen) und eukaryotische Zelle, wie z. B. Pflanzen- und Säugetierzellen. Es wird angemerkt, dass Zellen, die eine isolierte Nukleinsäure enthalten, wie hier beschrieben, die isolierte Nukleinsäure nicht exprimieren müssen. Zusätzlich kann die isolierte Nukleinsäure in das Genom der Zelle integriert sein oder in einem episomalen Stadium verbleiben. Mit anderen Worten können Zellen dauerhaft oder vorübergehend mit einer isolierten Nukleinsäure, wie hier beschrieben, transformiert werden.
Jede Methode kann verwendet werden, um eine isolierte Nukleinsäure in eine Zelle einzufügen. Tatsächlich sind dem Fachmann viele Methoden, Nukleinsäure in eine Zelle einzufügen, ob in vivo oder in vitro, wohlbekannt. Beispielsweise sind Kalziumphosphatausfällung, Elektroporation, Hitzeschock, Lipofektion, Mikroinjektion, Konjugation und viral vermittelter Nukleinsäuretransfer gebräuchliche Methoden, die verwendet werden können, um Nukleinsäure in eine Zelle einzufügen. Zusätzlich kann nackte DNA direkt an Zellen in vivo abgegeben werden, wie anderswo beschrieben ( U.S. Patent Nummer 5,580,859 und U.S. Patent Nummer 5,589,466 , einschließlich der Fortsetzungen davon). Weiterhin kann Nukleinsäure durch die Erzeugung transgener Tiere in Zellen eingefügt werden.
Jede Methode kann verwendet werden, um Zellen, die eine hier beschriebene isolierte Nukleinsäure enthalten, zu identifizieren. Beispielsweise können PCR und Techniken der Nukleinsäurehybridisierung, wie z. B. Northern und Southern Blot, verwendet werden. In manchen Fällen können die Immunhistochemie und biochemische Techniken verwendet werden, um zu bestimmen, ob eine Zelle eine bestimmte Nukleinsäure enthält, indem die Expression eines Polypeptids, das von dieser bestimmten Nukleinsäure kodiert wird, nachgewiesen wird. Beispielsweise kann der Nachweis der Immunoreaktivität eines Polypeptid X nach Einfügen einer isolierten Nukleinsäure, welche eine cDNA enthält, die ein Polypeptid X kodiert, in eine Zelle, die normalerweise das Polypeptid X nicht exprimiert, darauf hinweisen, dass diese Zelle nicht nur die eingebrachte Nukleinsäure enthält, sondern auch das kodierte Polypeptid X dieser eingebrachten Nukleinsäure exprimiert. In diesem Fall kann der Nachweis jeder enzymatischen Aktivität eines Polypeptid X auch darauf hinweisen, dass diese Zelle die eingebrachte Nukleinsäure enthält und das kodierte Polypeptid X dieser eingebrachten Nukleinsäure exprimiert.
Jede Methode kann verwendet werden, um die Expression einer Aminosäuresequenz von einer Nukleinsäure zu regeln. Solche Methoden sind dem Fachmann wohlbekannt und beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, das Erstellen einer Nukleinsäure, so, dass ein regulierendes Element die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid kodiert, antreibt. Typischerweise sind regulierende Elemente DNA-Sequenzen, die die Expression anderer DNA-Sequenzen auf der Stufe der Transkription regeln. Solche regulierenden Elemente beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, Promotoren, Enhancer und desgleichen. Zusätzlich kann jede Methode zur Expression eines Polypeptids von einem exogenen Nukleinsäuremolekül in Mikroorganismen wie z. B. Bakterien und Hefe verwendet werden. Beispielsweise können wohlbekannte Methoden zur Herstellung und Nutzung von Nukleinsäurekonstruktionen, welche zur Expression exogener Polypeptide innerhalb von Rhodobacter-Arten (z. B. R. sphaeroides und R. capsulatus) fähig sind, verwendet werden.
Siehe, z. B. Dryden und Dowhan, J. Bacteriol., 178(4): 1030–1038 (1996); Vasilyeva et al., Applied Biochemistry and Biotechnology, 77–79: 337–345 (1999); Graichen et al., J. Bacteriol., 181(14): 4216–4222 (1999); Johnson et al., J. Bacteriol., 167(2): 604–610 (1986); und Duport et al., Gene, 145: 103–108 (1994). Weiterhin können alle Methoden verwendet werden, um Zellen zu identifizieren, die eine Aminosäuresequenz von einer Nukleinsäure exprimieren. Solche Methoden sind dem Fachmann wohlbekannt und beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, Immunzytochemie, Western Blot, Northern Blot und RT-PCR.
Die hier beschriebenen Zellen können eine einzelne Kopie oder mehrfache Kopien (z. B. etwa 5, 10, 20, 35, 50, 75, 100 oder 150 Kopien) einer bestimmten exogenen Nukleinsäure beinhalten. Beispielsweise kann eine Bakterienzelle etwa 50 Kopien einer exogenen Nukleinsäure X beinhalten. Zusätzlich können die hier beschriebenen Zellen mehr als eine bestimmte exogene Nukleinsäure beinhalten. Beispielsweise kann eine Bakterienzelle etwa 50 Kopien einer exogenen Nukleinsäure X sowie etwa 75 Kopien einer exogenen Nukleinsäure Y beinhalten. In diesen Fällen kann jede unterschiedliche Nukleinsäure ein unterschiedliches Polypeptid kodieren, das seine eigene einzigartige enzymatische Aktivität besitzt. Beispielsweise kann eine Bakterienzelle zwei unterschiedliche exogene Nukleinsäuren besitzen, so dass ein hoher Level CoQ(10) hergestellt wird. In diesem Beispiel kann eine solche Zelle eine erste exogene Nukleinsäure beinhalten, die ein Polypeptid kodiert, welches DXS-Aktivität besitzt und eine zweite exogene Nukleinsäure, die ein Polypeptid kodiert, welches DDS-Aktivität besitzt. Darüber hinaus kann eine einzelne exogene Nukleinsäure ein oder mehr als ein Polypeptid kodieren. Beispielsweise kann eine einzelne Nukleinsäure Sequenzen beinhalten, die drei verschiedene Polypeptide kodieren.
Zusätzlich zur Bereitstellung von Zellen, die eine isolierte Nukleinsäure der Erfindung beinhalten, werden Zellen zur Verfügung gestellt (z. B. Pflanzenzellen, Tierzellen und Mikroorganismen), die zur Herstellung von Isoprenoidverbindungen, wie z. B. CoQ(10) verwendet werden können. Der Begriff „Mikroorganismus", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf alle mikroskopischen Organismen einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Bakterien, Algen, Pilze und Protozoen. Es wird angemerkt, dass Bakterienzellen membranhaltige Bakterien oder nicht membranhaltige Bakterien sein können.
Der Begriff „nicht membranhaltige Bakterien", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf alle Bakterien, denen eine intrazytoplasmatische Membran fehlt. Der Begriff „membranhaltige Bakterien", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf alle natürlich vorkommenden, genetisch modifizierten oder durch die Umwelt modifizierten Bakterien, die eine intrazytoplasmatische Membran besitzen. Eine intrazytoplasmatische Membran kann auf vielfältige Art und Weise aufgebaut sein, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, als Vesikel, Tubuli, thylakoidartige Membransäcke und hoch organisierte Membransäulen. Jede Methode kann verwendet werden, um Bakterien auf das Vorhandensein von intrazytoplasmatischen Membranen zu untersuchen, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Elektronenmikroskopie, Lichtmikroskopie und Dichtegradienten. Siehe z. B. Chory et al., J. Bacteriol., 159: 540–554 (1984); Niederman und Gibson, Isolation and Physiochemical Properties of Membranes from Purple Photosynthetic Bacteria. In: The Photosynthetic Bacteria, Ed. By Roderick K. Clayton und William R. Sistrom, Plenum Press, pp. 79–118 (1978); und Lueking et al., J. Biol. Chem., 253: 451–457 (1978). Beispiele für membranhaltige Bakterien, die hier verwendet werden können, beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, Bakterien der Rhodospirillaceae-Familie, wie die aus der Gattung Rhodobacter (z. B. R. sphaeroides, R. capsulatus, R. sulfidophilus, R. adriaticus und R. veldkampii), aus der Gattung Rhodospirillum (z. B. R. rubrum, R. photometricum, R. molischianum, R. fulvum und R. salinarum), aus der Gattung Rhodopseudomonas (z. B. R. palustris, R. viridis und R. sulfoviridis), aus der Gattung Rhodomicrobium, aus der Gattung Rhodocyclus und aus der Gattung Rhodopila; Bakterien der Chromatiaceae-Familie, wie die aus der Gattung Chromatium, aus der Gattung Thiocystis, aus der Gattung Thiospirillum, aus der Gattung Thiocapsa, aus der Gattung Lamprobacter, aus der Gattung Lamprocystis, aus der Gattung Thiodictyon, aus der Gattung Amoebobacter und aus der Gattung Thiopedia; grüne Schwefelbakterien, wie die aus der Gattung Chlorobium und aus der Gattung Prosthecochloris; Bakterien der Methylococcaceae-Familie, wie die aus der Gattung Methylococcus (z. B. M. capsulatus) und aus der Gattung Methylomonas (z. B. M. methanica); und besonders Bakterien der Nitrobacteraceae-Familie, wie die aus der Gattung Nitrobacter (z. B. N. winogradsky und N. hamburgensis), aus der Gattung Nitrococcus (z. B. N. mobilis) und aus der Gattung Nitrosomonas (z. B. N. europaea).
Membranhaltige Bakterien können stark membranhaltige Bakterien sein. Der Begriff „stark membranhaltige Bakterien", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf jedes Bakterium, das mehr intrazytoplasmatische Membran besitzt, als R. sphaeroides-(ATCC 17023)Zellen besitzen, nachdem die R. sphaeroides-(ATCC 17023)Zellen (1) chemoheterotroph unter aeroben Bedingungen für vier Tage kultiviert, (2) chemoheterotroph unter sauerstoffarmen Bedingungen für vier Tage kultiviert und (3) geernted worden sind. Die aeroben Bedingungen umfassen das Kultivieren der Zellen im Dunkeln bei 30°C unter Anwesenheit von 25 Prozent Sauerstoff. Die sauerstoffarmen Bedingungen umfassen das Kultivieren der Zellen im Licht bei 30°C unter Anwesenheit von 2 Prozent Sauerstoff. Nach dem Arbeitsschritt des Kultivierens für vier Stunden unter sauerstoffarmen Bedingungen werden die R. sphaeroides-(ATCC 17023)Zellen durch Zentrifugieren geerntet und analysiert.
Typischerweise kann jede Zelle (z. B. membranhaltige Bakterien) genetisch modifiziert sein, so dass eine bestimmte Isoprenoidverbindung hergestellt wird. Solche Zellen können eine exogene Nukleinsäure enthalten, die ein Polypeptid kodiert, welches enzymatische Aktivität besitzt. Beispielsweise kann ein Mikroorganismus, der endogene DDS-Aktivität besitzt, mit einer exogenen Nukleinsäure, die ein Polypeptid kodiert, das DDS-Aktivität besitzt, umgewandelt werden. In diesem Fall kann der Mikroorganismus erhöhte DDS-Aktivität besitzen, was zu einer erhöhten Produktion von CoQ(10) führen kann. Somit kann einer Zelle eine exogene Nukleinsäure verliehen werden, die ein Polypeptid kodiert, welches eine enzymatische Aktivität besitzt, die die Produktion einer Verbindung, die normalerweise von dieser Zelle hergestellt wird, katalysiert. In diesem Fall kann die genetisch modifizierte Zelle mehr von der Verbindung herstellen, oder sie kann die Verbindung effizienter herstellen, als eine ähnliche Zelle, die nicht die genetische Modifikation besitzt. Alternativ kann einer Zelle eine exogene Nukleinsäure verliehen werden, die ein Polypeptid kodiert, welches eine enzymatische Aktivität besitzt, die die Produktion einer Verbindung, die normalerweise nicht von dieser Zelle hergestellt wird, katalysiert.
Die Erfindung stellt Zellen zur Verfügung, die eine exogene Nukleinsäure enthalten, die ein Polypeptid kodiert, welches eine enzymatische Aktivität besitzt, die zu einer erhöhten Produktion von CoQ(10) führt. Solche Zellen können eine Nukleinsäure enthalten, die ein Polypeptid kodiert, welches DDS-Aktivität besitzt. Andere Beispiele beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, Zellen, die eine exogene Nukleinsäure enthalten, die Polypeptide kodiert, welche DXS-Aktivität und/oder Chorismatlyase-(z. B. ubiC)Aktivität besitzen. Nukleinsäuremoleküle, die Polypeptide kodieren, welche solche enzymatische Aktivitäten besitzen, können, wie hier beschrieben, erhalten werden. Beispielsweise kann eine Nukleinsäure, die ein Polypeptid kodiert, welches Chorismatlyase besitzt, geklont werden, indem die in Genbank^® unter Zugangsnummer X66619 zur Verfügung gestellte Sequenzinformation verwendet wird.
Typischerweise stellen Mikroorganismen der Erfindung CoQ(10) her mit einer Ausbeute (mg CoQ(10) pro g Trockenbiomasse), die um mindestens etwa 5 (z. B. mindestens etwa 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35 oder mehr) Prozent größer ist, als die eines vergleichbaren Wildtyp-Stammes unter ähnlichen Bedingungen. Bakterien können mehr CoQ(10) herstellen, wenn sie unter anaeroben Bedingungen gewachsen sind, verglichen mit aeroben Bedingungen. Beispielsweise können anaerob kultivierte Bakterien etwa 3 bis 4 mal mehr CoQ(10) herstellen, als aerob kultivierte Bakterien derselben Art. Um die Ausbeute der Produktion einer Isoprenoidverbindung für eine bestimmte Zelle (z. B. Mikroorganismus) festzusetzen, kann jede Methode verwendet werden. Siehe, z. B., Cohen-Bazire et al., J. Cell Corp. Physiol., 49: 25–68 (1957); Edl und, J. Chromatogr. 425: 87–97 (1988); Rousseau und Varin, J. Chromatogr. Sci., 36: 247–52 (1998); und Leray et al., J. Lipid Res., 39: 2099–2105 (1998).
Eine Zelle wird zur Verfügung gestellt, die eine exogene Nukleinsäure enthält, die ein Polypeptid kodiert, welches DXS-, DDS-, ODS-, SDS-, DXR-, 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritolsynthase-(z. B. ispD), 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritolkinase-(z. B. ispE) und/oder Chorismatlyase-(z. B. ubiC)Aktivität besitzt. Nukleinsäuremoleküle, die Polypeptide kodieren, die solche enzymatischen Aktivitäten besitzen, können, wie hier beschrieben, erhalten werden. Es wird auch eine Zelle zur Verfügung gestellt, die mehr als ein unterschiedliches exogenes Nukleinsäuremolekül besitzt, wobei jedes unterschiedliche exogene Nukleinsäuremolekül ein Polypeptid kodiert, das jeweils eine andere von den folgenden enzymatischen Aktivitäten besitzt: DXS-, DDS-, ODS-, SDS-, DXR-, 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritolsynthase-(z. B. ispD), 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritolkinase-(z. B. ispE) und/oder Chorismatlyase-(z. B. ubiC)Aktivität. Beispielsweise stellt die Erfindung eine Zelle zur Verfügung, die eine erste exogene Nukleinsäure enthält, die ein Polypeptid kodiert, welches DXS-Aktivität besitzt und eine zweite exogene Nukleinsäure, die ein Polypeptid kodiert, welches DDS-Aktivität besitzt.
Eine Zelle wird zur Verfügung gestellt, die eine exogene Nukleinsäure enthält, die eine dxs-Sequenz (z. B. Stdxs-Sequenz), eine dds-Sequenz (z. B. Stdds- oder Rsdds-Sequenz), eine dxr-Sequenz (z. B. Stdxr-Sequenz), eine ubiC-Sequenz (z. B. EcUbiC-Sequenz) oder eine lytB-Sequenz (z. B. RsLytB-Sequenz) enthält. Solche Nukleinsäuren können, wie hier beschrieben, erhalten werden. Es wird auch eine Zelle zur Verfügung gestellt, die mehr als eine der folgenden Sequenzen enthält: eine dxs-Sequenz (z. B. Stdxs-Sequenz), eine dds-Sequenz (z. B. Stdds- oder Rsdds-Sequenz), eine dxr-Sequenz (z. B. Stdxr-Sequenz), eine ubiC-Sequenz (z. B. EcUbiC-Sequenz) oder eine lytB-Sequenz (z. B. RsLytB-Sequenz). Beispielsweise stellt die Erfindung eine Zelle zur Verfügung, die eine erste exogene Nukleinsäure enthält, die eine dds-Sequenz enthält und eine zweite exogene Nukleinsäure, die eine dxs-Sequenz enthält. Ebenso wird eine Zelle zur Verfügung gestellt, die eine einzelne exogene Nukleinsäure enthält, welche eine dds-Sequenz und eine dxs-Sequenz enthält.
Typischerweise baut ein Mikroorganismus im Rahmen der Erfindung eine Hexose, wie z. B. Glukose, ab. Ein Mikroorganismus kann jedoch auch als Kohlenstoffquelle eine Pentose (z. B. Ribose, Arabinose, Xylose und Lyxose) abbauen. In anderen Worten kann ein Mikroorganismus im Rahmen der Erfindung als Kohlenstoffquelle entweder eine Hexose oder eine Pentose nutzen. Zusätzlich kann ein Mikroorganismus im Rahmen der Erfindung Kohlenstoffquellen wie z. B. Methanol und/oder organische Säuren (z. B. Bernsteinsäure oder Apfelsäure) verwenden.
Alle hier beschriebenen Zellen können eine reduzierte enzymatische Aktivität besitzen wie z. B. Geranylgeranylpyrophosphatsynthase- und/oder Magnesium-Protoporphyrin-IX-Chelatase-Aktivität. Alle hier beschriebenen Zellen können eine reduzierte biologische Aktivität besitzen, wie z. B. reduzierte Aktivität von aeroben Repressor-Polypeptiden (z. B. PPSR) oder von Polypeptiden mit einem Oxidationsreduktionssensor (z. B. CBB3). Im Fall von Molekülen mit Multiuntereinheiten, wie z. B. CBB3, kann die Aktivität des Polypeptids mit einem Oxidationsreduktionssensor durch Inaktivierung einer oder mehr als einer Untereinheit reduziert werden. Beispielsweise kann die CBB3-Aktivität durch Inaktivierung einer einzelnen Untereinheit von CBB3, wie z. B. der ccoN Untereinheit, reduziert werden.
Der Begriff „reduziert", wie er hier verwendet wird hinsichtlich einer Zelle und einer bestimmten Aktivität (z. B. einer bestimmten enzymatischen Aktivität), bezieht sich auf einen niedrigeren Aktivitätslevel als der in einer vergleichbaren Zelle der selben Art gemessene. So gilt eine R. sphaeroides-Zelle, der eine Geranylgeranylpyrophosphatsynthase-Aktivität fehlt, als Zelle mit reduzierter Geranylgeranylpyrophosphatsynthase-Aktivität, da die meisten, wenn nicht alle vergleichbaren R. sphaeroides-Zellen wenigstens etwas Geranylgeranylpyrophosphatsynthase-Aktivität besitzen. Solche reduzierte Enzymaktivitäten können das Ergebnis von geringer Enzymkonzentration, geringer spezifischer Enzymaktivität oder Kombinationen daraus sein.
Viele verschiedene Methoden können verwendet werden, um eine Zelle herzustellen, die reduzierte enzymatische und/oder biologische Aktivität besitzt. Beispielsweise kann eine R. sphaeroides-Zelle unter Verwendung gebräuchlicher Mutagenese oder Knockout-Technologie so konstruiert werden, dass sie einen unterbrochenen enzymkodierenden Locus hat. Alternativ kann die Antisense-Technologie angewendet werden, um die enzymatische Aktivität zu verringern. Beispielsweise kann eine R. sphaeroides-Zelle so konstruiert werden, dass sie eine cDNA enthält, die ein Antisense-Molekül kodiert, welches verhindert, dass ein Enzym hergestellt wird. Der Begriff „Antisense-Molekül", wie er hier verwendet wird, umfasst jede Nukleinsäure, die Sequenzen enthält, die dem kodierenden Strang eines endogenen Polypeptids entsprechen. Ein Antisense-Molekül kann auch Flankensequenzen (z. B. regulierende Sequenzen) besitzen. Somit können Antisense-Moleküle Ribozyme oder Antisense-Oligonukleotide sein. Ein Ribozym kann jede gewöhnliche Struktur haben, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Haarnadel-, Hammerhead- oder Axhead-Strukturen, vorausgesetzt das Molekül spaltet RNA.
Zellen, die eine reduzierte enzymatische und/oder biologische Aktivität besitzen, können unter Verwendung jeder Methode identifiziert werden. Beispielsweise kann eine R. sphaeroides-Zelle, die reduzierte Geranylgeranylpyrophosphatsynthase-Aktivität besitzt, leicht durch Verwendung gebräuchlicher biochemischer Methoden, die die Geranylgeranylpyrophosphatsynthase-Aktivität messen, identifiziert werden. Siehe z. B. Math et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89(15): 6761–6764 (1992).
Eine Zelle wird zur Verfügung gestellt, die reduzierte Geranylgeranylpyrophosphatsynthase-, aerobe Repressor- und/oder cbb3-Typ-Cytochromoxidase-Aktivität besitzt. Solche Zellen können reduzierte Geranylgeranylpyrophosphatsynthase-, aerobe Repressor- und/oder cbb3-Typ-Cytochromoxidase-Aktivitit besitzt, als Ergebnis des Aufbrechens der endogenen Sequenzen, die Popypeptide, welche diese Aktivitäten besitzen, kodieren. Beispielsweise kann eine Zelle als Ergebnis des Ausschaltens eines Teils der endogenen crtE-Sequenz innerhalb eines Zellgenoms reduzierte Geranylgeranylpyrophosphatsynthase-Aktivität besitzen; eine Zelle kann reduzierte als Ergebnis des Ausschaltens eines Teils der endogenen ppsR-Sequenz innerhalb eines Zellgenoms aerobe Repressor-Aktivität besitzen; und eine Zelle kann als Ergebnis des Ausschaltens eines Teils der endogenen ccoN-Sequenz innerhalb eines Zellgenoms reduzierte cbb3-Typ-Cytochromoxidase-Aktivität besitzen.
Es wird auch eine Zelle zur Verfügung gestellt, die nicht funktionelle crtE-, ppsR- und/oder ccoN-Nukleinsäuresequenzen innerhalb ihres Genoms enthält, so dass das kodierte Polypeptid entweder mutiert oder nicht exprimiert ist. Solche Zellen können verwendet werden, um große Mengen CoQ(10) herzustellen. Die Sequenz von crtE kann so sein wie in Genbank^® Zugangsnummer AJ010302 dargelegt. Die Sequenz von ppsR kann so sein wie in Genbank^® Zugangsnummer AJ010302 oder L19596 dargelegt. Die Sequenz von ccoN kann so sein wie in Genbank^® Zugangsnummer U58092 dargelegt. Knockout-Technologie kann verwendet werden, um Zellen herzustellen, die nicht funktionelle crtE-, ppsR- und/oder ccoN-Nukleinsäuresequenzen enthalten.
4. Herstellen von Isoprenoiverbindungen
Die hier beschriebenen Zellen können verwendet werden, um Isoprenoidverbindungen herzustellen. Beispielsweise kann ein Mikroorganismus, der endogene DDS-Aktivität besitzt, mit einer Nukleinsäure, die ein Polypeptid kodiert, welches DDS-Aktivität besitzt, umgewandelt werden, so dass der Mikroorganismus mehr CoQ(10) produziert, als wenn dem Mikroorganismus diese Nukleinsäure nicht beigegeben worden wäre. Nach der Transformation kann der Mikroorganismus, kultiviert unter für die CoQ(10)-Produktion optimalen Bedingungen, verwendet werden.
Zusätzlich können im Wesentlichen reine Polypeptide, die enzymatische Aktivität besitzen, allein oder in Kombination mit Zellen verwendet werden, um Isoprenoidverbindungen herzustellen. Beispielsweise kann eine Zubereitung, die ein im Wesentlichen reines Polypeptid enthält, das DDS-Aktivität besitzt, verwendet werden, um die Bildung von CoQ(10) zu katalysieren. Weiterhin können zellfreie Extrakte, die ein Polypeptid enthalten, das enzymatische Aktivität besitzt, allein oder in Kombination mit im Wesentlichen reinen Polypeptiden und/oder Zellen verwendet werden, um Isoprenoidverbindungen herzustellen. Beispielsweise kann ein zellfreier Extrakt, der ein Polypeptid enthält, das DSX-Aktivität besitzt, verwendet werden, um 1-Deoxyxylulose-5-phosphat zu bilden, während ein Mikroorganismus, der Polypeptide enthält, welche die erforderlichen enzymatischen Aktivitäten besitzen, um die Reaktionen zu katalysieren, die zur Bildung von CoQ(10) aus 1-Deoxyxylulose-5-phosphat benötigt werden, verwendet werden kann, um CoQ(10) zu produzieren. Jede Methode kann angewendet werden, um einen zellfreien Extrakt herzustellen. Beispielsweise können osmotischer Schock, Sonifikation und/oder wiederholte Frost-Tau-Zyklen, gefolgt von Filtration und/oder Zentrifugation verwendet werde, um einen zellfreien Extrakt aus intakten Zellen herzustellen.
Es wird angemerkt, dass eine Zelle, ein im Wesentlichen reines Polypeptid und/oder ein zellfreier Extrakt dafür verwendet werden kann, um eine bestimmte Isoprenoidverbindung herzustellen, welche wiederum chemisch behandelt wird, um eine andere Verbindung herzustellen. Beispielsweise kann ein Mikroorganismus verwendet werden, um CoQ(10) herzustellen, während ein chemischer Prozess angewendet wird, um CoQ(10) in ein CoQ(10)-Derivat abzuwandeln, wie z. B. CoQ(10), das eine polare Gruppe enthält. Ebenso kann ein chemischer Prozess dazu verwendet werden, um eine bestimmte Verbindung herzustellen, die wiederum in eine Isoprenoidverbindung umgebaut wird, wofür eine Zelle, ein im Wesentlichen reines Polypeptid und/oder ein zellfreier Extrakt, wie hier beschrieben, verwendet wird. Beispielsweise kann ein chemischer Prozess angewendet werden, um Deoxyxylose-5-phosphat herzustellen, während ein Mikroorganismus verwendet werden kann, um Deoxyxylose-5-phosphat in CoQ(10) umzubauen.
Typischerweise wird eine bestimmte Isoprenoidverbindung hergestellt, indem ein Mikroorganismus zur Verfügung gestellt wird, und der zur Verfügung gestellte Mikroorganismus in einem Kulturmedium kultiviert wird, so dass diese Isoprenoidverbindung hergestellt wird. Im Allgemeinen können das Kulturmedium und/oder die Kulturbedingungen dergestalt sein, dass der Mikroorganismus zu einer angemessenen Dichte wächst und die gewünschte Verbindung effizient herstellt. Für großangelegte Produktionsprozesse können die folgenden Methoden verwendet werden. Zunächst wird ein großer Behälter (z. B. ein 100-Gallonen, 200-Gallonen, 500-Gallonen oder größerer Behälter), der ein geeignetes Kulturmedium enthält mit, beispielsweise, einer Glukose-Kohlenstoff-Quelle mit einem bestimmten Mikroorganismus beimpft. Nach der Inokulation werden die Mikroorganismen inkubiert, um die Produktion der Biomasse zu ermöglichen. Sobald eine erwünschte Biomasse erreicht ist, kann die Brühe, die die Mikroorganismen enthält, in einen zweiten Behälter überführt werden. Dieser zweite Behälter kann jede Größe haben. Beispielsweise kann der zweite Behälter größer, kleiner, oder genauso groß wie der erste Behälter sein. Typischerweise ist der zweite Behälter größer als der erste, so dass zusätzliches Kulturmedium zur Brühe aus dem ersten Behälter hinzugegeben werden kann. Zusätzlich kann das Kulturmedium in diesem zweiten Behälter dasselbe wie das im ersten Behälter verwendete sein, oder unterschiedlich davon. Beispielsweise kann der erste Behälter ein Medium mit Xylose enthalten, während der zweite Behälter ein Medium mit Glukose enthält. Nach der Überführung können die Mikroorganismen inkubiert werden, um die Produktion der gewünschten Isoprenoidverbindung zu ermöglichen. Sobald sie hergestellt ist, kann jede Methode verwendet werden, um die gewünschte Verbindung zu isolieren. Beispielsweise können, wenn der Mikroorganismus die gewünschte Isoprenoidverbindung in die Brühe abgibt, gebräuchliche Trennungstechniken angewendet werden, um die Biomasse von der Brühe abzutrennen und gebräuchliche Isolationsverfahren (z. B. Extraktions-, Destillations- und Ionenaustauscher-Verfahren) können angewendet werden, um die Isoprenoidverbindung aus der mikroorganismusfreien Brühe zu erhalten. Zusätzlich kann die gewünschte Isoprenoidverbindung isoliert werden, während sie hergestellt wird oder sie kann isoliert werden, nachdem die Produktionsphase abgeschlossen ist. Wenn der Mikroorganismus die gewünschte Isoprenoidverbindung zurückhält, dann kann die Biomasse gesammelt und behandelt werden, um die Isoprenoidverbindung freizusetzen und die freigesetzte Isoprenoidverbindung kann isoliert werden.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen, die den in den Ansprüchen beschriebenen Anwendungsbereich der Erfindung nicht einschränken, weiter beschrieben.
BEISPIELE
Beispiel 1 – Klonen von Nukleinsäure, die ein Sphingomonas trueperi-Polypeptid, welches DXS-Aktivität besitzt, kodiert
S. trueperi-Zellen wurden von der American Type Culture Collection (ATCC Cat. No. 12417) bezogen. Um bakterielle genomische DNA zu isolieren, wurden Zellen in Kulturen von 100–200 ml für 2–3 Tage bei 30°C in einem Schüttler bei einer Rotation von 250 rpm angezüchtet. Kutivierte Zellen wurden zentrifugiert, um ein Zellpellet zu formen, gewaschen, indem das Pellet in einer Lösung aus 10 mM Tris/1 mM EDTA resuspendiert wurde und wieder, wie zuvor, zentrifugiert. Die Zellpellets wurden in 5 ml GTE-Puffer pro 100 ml der Originalkultur resuspendiert. GTE-Puffer besteht aus 50 mM Glukose/25 mM Tris-HCl (pH 8,0)/10 mM EDTA (pH 8,0). Die bakteriellen Zellwände wurden durch Zugabe von Lysozym (Endkonzentration 1 mg/ml), Proteinase K (Endkonzentration 1 mg/ml) und Mutanolysin (Endkonzentration 5,5 μg/ml) zur resuspendierten Zelllösung aufgelöst, um ein Lysegemisch zu bilden, welches für 90 Minuten bei 37°C inkubiert wurde. Nach dieser Inkubation wurde dem Gemisch Sodiumdodecylsulfat bis zu einer Endkonzentration von 1 Prozent zugegeben und zusätzlich wurde Proteinase K zugegeben, bis die Konzentration der Lösung 2 mg/ml betrug. Nach einer einstündigen Inkubation bei 50°C wurde die die lysierten Zellen enthaltende Lösung 1:1 mit frischem GTE-Puffer verdünnt. Nach der Verdünnung wurde der Lösung Sodiumchlorid bis zu einer Endkonzentration von 0,15 M beigegeben. Polypeptide und Moleküle außer Nukleinsäuren wurden aus der lysierten bakteriellen Zelllösung entfernt, indem ein gleiches Volumen eines organischen Gemisches, hergestellt aus Phenol, Chloroform und Isoamylalkohol, in einem Verhältnis von 25:24:1 (weiterhin bezeichnet als PCIA), zugegeben wurde. Nach Zugabe von PCIA wurde die Lösung gemischt. Um die organische Phase von der DNA-haltigen wässrigen Phase zu trennen, wurde das Gemisch bei 12.000 × g für 10 Minuten zentrifugiert. Die wässrige Phase wurde in eine saubere Röhre überführt und mit einem gleichen Volumen Chloroform allein zurückgewonnen. Die wässrigen und organischen Phasen wurden durch Zentrifugieren bei 3.000 × g für 10 Minuten getrennt. Die wässrige Phase wurde wieder in eine neue Röhre überführt und mit 2,5 mg RNase behandelt, um jede vorhandene RNA abzubauen. Die gereinigte DNA wurde durch Zugabe von 2,5 Volumen Ethanol zur wässrigen Phase wiedererlangt. Nach dem Mischen der Lösung wurde die ausgefällte DNA entfernt, indem sie auf einem Glasstäbchen aufgewickelt wurde. Die aufgewickelte DNA wurde mit 70 Prozent Ethanol gespült. Nach dem Spülen ließ man das Ethanol verdunsten, indem die DNA der Luft ausgesetzt wurde, bis sie trocken war. Die trockene DNA wurde in einer Lösung aus 10 mM Tris (pH 8,5) resuspendiert. Die resuspendierte DNA wurde mit PCIA, gefolgt, wie zuvor, von Chloroform allein, zurückgewonnen. Die DNA wurde wieder durch Zugabe von einem Zehntel Volumen von 7,5 M Ammoniumacetat und 2,5 Volumen Ethanol ausgeschieden, gefolgt von Aufwickeln, Spülen und Lufttrocknen. Die gereinigte DNA wurde in 10 mM Tris (pH 8,5) resuspendiert. Das folgende Polymerase-Kettenreaktions-(PCR)Verfahren wurde angewendet, um Nukleinsäure, die ein S. trueperi-Polypeptid kodiert, welches DXS-Aktivität besitzt, zu isolieren. Drei degenerierte Vorwärts-PCR-Primer (F1, F2 und F3) und drei degenerierte Rückwärts-PCR-Primer (R1, R2 und R3) wurden bestimmt durch den Vergleich von Sequenzen mehrerer Klone, die Polypeptide, welche DXS-Aktivität besitzen, kodieren (15). Die Sequenz jedes degenerierten Primers war wie folgt:
Die Primer wurden in allen logischen Kombinationen in der PCR verwendet, wobei Taq-Polymerase (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) und 1 ng gereinigte genomische DNA pro Mikroliter Reaktionsgemisch verwendet wurden. Jede PCR-Reaktion wurde durchgeführt, indem ein touchdown-PCR-Programm mit vier Zyklen bei jeder der folgenden Annealing-Temperaturen verwendet wurde: 60°C, 58°C, 56°C und 54°C, gefolgt von 25 Zyklen bei 52°C. Jeder Zyklus hatte eine anfängliche 30 Sekunden dauernde Denaturierungsstufe bei 94°C und eine 90 Sekunden dauernde Extension bei 72°C. Das Programm hatte eine anfängliche Denaturierungsstufe von 2 Minuten bei 94°C und eine abschließende Extension von 5 Minuten bei 72°C.
Zwischen etwa 2 μM und 12 μM jedes PCR-Primers wurde in jeder Reaktion verwendet, abhängig vom Grad der Degeneration. Nachdem jede PCR-Reaktion fertiggestellt war, wurde ein Teil jeder Reaktion durch Gelelektrophorese abgetrennt, wobei ein 1,5prozentiges TAE-(Tris-acetat-EDTA)Agarosegel verwendet wurde. Die Ergebnisse der Gelelektrophorese deuteten darauf hin, dass die Kombination des degenerierten Primers F3 mit dem degenerierten Primer R2 ein Nukleinsäuremolekül von 882 bp (bezeichnet als F3R2-Fragment) produzierte. Das F3R2-Fragment wurde aus der Agarosegelmatrix gereinigt, indem das Qiagen Gelextraktionsverfahren gemäß den Angaben des Herstellers (Qiagen Inc., Valencia, CA) angewendet wurde. Ein Teil des gereinigten Fragments wurde in den pCR11- TOPO-Vektor ligiert. Der Vektor, der das F3R2-Fragment enthielt, wurde in E. coli-TOP10-Zellen eingebaut, wobei das TOPO-Klonierungsverfahren (Invitrogen, Carlsbad, CA) angewendet wurde. Die transformierten TOP10-Zellen wurden auf LB-Agarplatten ausplattiert, die 100 μg/ml Ampicillin (Amp) und 50 μg/ml 5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-β-D-Galactopyranosid (Xgal) enthielten. Einzelne weiße Kolonien wurden auf frische LB-Amp-Xgal-Platten rückausplattiert und anhand einer PCR mit den F3- und R2-Primern überprüft, um die Anwesenheit von Plasmiden im erwünschten Insert zu bestätigen. Plasmid-DNAs wurden aus Bakterienkolonien unter Verwendung des QiaPrep Spin Miniprep Kits (Qiagen, Inc.) erhalten. Die Plasmid-DNAs wurden dann quantifiziert und mit den M13-Vorwärts- und Rückwärts-Primern sequenziert. Die Sequenzanalyse deutete daraufhin, dass die Sequenz des F3R2-Fragments mit Sequenzen anderer Nukleinsäuremoleküle, die Polypeptide kodieren, welche DXS-Aktivität besitzen, alignete.
Um die gesamte Code-Sequenz für das S. trueperi-Polypeptid, welches DSX-Aktivität besitzt, zu erhalten, wurde Genome Walking durchgeführt wie folgt. Primer wurden gestaltet, beruhend auf der Sequenz des 882 bp F3R2-Segments für das Walking sowohl aufwärts als auch abwärts. Diese Walking-Primer hatten die folgenden Sequenzen:
Die GSP1F- und GSP2F-Primer sind Primer, die vom Startcodon des DXS-Polypeptids abwärts gerichtet sind, während die GSP1R- und GSP2R-Primer Primer sind, die in die entgegengesetzte Richtung gerichtet sind. Zusätzlich befinden sich die GSP2F- und GSP2R-Primer zusammen innerhalb der GSP1F- und GSP1R-Primer. Genome Walking wurde gemäß dem Handbuch des CLONTECH Universal Genome Walking kits (CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) durchgeführt, mit der Ausnahme, dass FspI und SmaI verwendet wurden statt DraI und EcoRV. Die genomische DNA, die verwendet wurde, stammte von S. trueperi. DMSO wurde zum PCR-Gemisch hinzugefügt, bis eine Endkonzentration von 5 Prozent erreicht wurde. Die PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung eines Perkin Elmer 9700 Thermozykler durchgeführt. Der erste PCR-Durchgang bestand aus 7 Zyklen von 2 Sekunden bei 94°C und 3 Minuten bei 72°C, gefolgt von 36 Zyklen von 2 Sekunden bei 94°C und 3 Minuten bei 67°C, mit einer abschließenden Extension bei 67°C für 4 Minuten. Der zweite PCR-Durchgang bestand aus 5 Zyklen von 2 Sekunden bei 94°C und 3 Minuten bei 72°C, gefolgt von 24 Zyklen von 2 Sekunden bei 94°C und 3 Minuten bei 67°C, mit einer abschließenden Extension bei 67°C für 4 Minuten. Nachdem die PCR-Reaktion fertiggestellt war, wurde ein Teil des Reaktiongemisches jedes Durchgangs durch Gelelektrophorese getrennt, wobei ein 1,5prozentiges TAE-Agarosegel verwendet wurde. Gute Amplifizierungsprodukte wurden mit den PvuII- und StuI-Bibliotheken unter Verwendung der GSP1F- und GSP2F-Primer und mit den FspI- und PvuII-Bibliotheken unter Verwendung der GSP1R- und GSP2R-Primer erhalten. Die Produkte des zweiten Durchgangs aus jeder dieser Bibliotheken wurden gelgereinigt, kloniert unter Verwendung des TOPO-Klonierungs-Verfahrens (Invitrogen, Carlsbad, CA) und sequenziert. Ein 1,7 kilobase-(kb)Fragment wurde aus der PvuIIF-Bibliothek subkloniert, ein 2,8 kb-Fragment wurde aus der StuIF-Bibliothek subkloniert, ein 400 kb-Fragment wurde aus der FspIR-Bibliothek subkloniert und ein 330 kb-Fragment wurde aus der PvuIIR-Bibliothek subkloniert. Jedes dieser subklonierten Fragmente wurde sequenziert. Die Sequenzanalysen deuteten darauf hin, dass jedes subklonierte Fragment eine Sequenz enthielt, die sich mit der des F3R2-Fragments überschnitt und anderen Nukleinsäuresequenzen, die Polypeptide kodieren, welche DXS-Aktivität besitzen, ähnlich war.
Weil sich die Sequenzinformation, die durch das Genome Walking erhalten wurde, über 13 bp aufwärts vom translatorischen Startcodon aus erstreckte, wurde ein zweiter Genome Walk durchgeführt, um zusätzliche Sequenzinformationen zu erhalten. Dieser zweite Walk verwendete GSPB2R, 5'TGAGGATCTTGTGCGGATAGC-ATTGGTG-3' (SEQ ID NO:63) als Primer im ersten Durchgang und GSPB3R, 5'-AGCGGCGTCTTGGGTAGGTCAGCCAT-3' (SEQ ID NO:64) als Primer im zweiten Durchgang. Der zweite Durchgang wurde nur unter Verwendung der SmaI- und StuI-Bibliotheken durchgeführt. CLONTECH's Advantage-GC genomische Polymerase wurde für die PCR verwendet mit einer 1,0 mM GC Melt Konzentration gemäß den Ausführungen des Herstellers. Der erste Durchgang der PCR wurde unter Verwendung eines Perkin Elmer 9700 Thermozyklers durchgeführt mit einer anfänglichen Denaturierungsstufe bei 96°C für 5 Sekunden, gefolgt von 7 Zyklen, bestehend aus 2 Sekunden bei 94°C und 3 Minuten bei 72°C, gefolgt von 36 Zyklen, bestehend aus 2 Sekunden bei 94°C und 3 Minuten bei 66°C, mit einer abschließenden Extension bei 66°C für 4 Minuten. Der zweite PCR-Durchgang hatte 5 Zyklen, bestehend aus 2 Sekunden bei 94°C und 3 Minuten bei 72°C, gefolgt von 26 Zyklen, bestehend aus 2 Sekunden bei 94°C und 3 Minuten bei 66°C, mit einer abschließenden Extension bei 66°C für 4 Minuten. Teile der PCR-Produkte aus jedem Durchgang wurden durch Gelelektrophorese getrennt, wobei ein 1,5prozentiges TAE-Agarosegel verwendet wurde. Die Gelelektrophorese offenbarte die Anwesenheit eines 250 bp-Amplifizierungsproduktes, erhalten aus dem zweiten Durchgang der PCR, unter Verwendung der StuI-Bibliothek. Dieses Fragment wurde gelgereinigt, kloniert, wobei das TOPO-Klonierungsverfahren (Invitrogen, Carlsbad, CA) angewendet wurde und sequenziert. Eine Überlappung mit der zuvor erhaltenen Sequenz wurde gefunden, die sich über die Länge des Klons bis 181 bp vor dem Startcodon erstreckte. Der Klon in voller Länge, kodierende und nicht-kodierende Sequenz enthalten, war 3626 bp lang (2). Der offene Leserahmen war 1926 bp lang (3), welcher ein Polypeptid mit 641 Aminosäueresten kodierte (4).
Die kodierende Sequenz des DXS-Polypeptids wurde mittels PCR amplifiziert, wobei die genomische DNA von S. trueperi als Matrize verwendet wurde. Primer wurden auf der Grundlage der oben erhaltenen Sequenz gestaltet. Die Sequenzen der Primer waren wie folgt:
Diese Primer wurden gestaltet, um einen KpnI-Restriktionsort am Anfang des amplifizierten Fragments einzuführen und einen XbaI-Restriktionsort am Ende des amplifizierten Fragments. Die Sequenz jedes Restriktionsortes ist unterstrichen. Das PCR-Reaktionsgemisch enthielt folgendes: 100 ng genomische DNA, 2 μl jedes Primers (SHDXF1 und SHDXR1, jeweils 50 μM), 10 μl 10 × Pfu-Plus-Puffer, 5 μl DMSO, 8 μl dNTPs (10 mM von jedem) und 5 Einheiten Pfu-Polymerase in einem Endvolumen von 100 μl. Jede PCR-Reaktion wurde in einem Perkin Elmer Geneamp PCR System 2400 unter folgenden Bedingungen durchgeführt: eine anfängliche Denaturierung bei 94°C für 5 Minuten, 8 Zyklen von (1) 94°C für 45 Sekunden, (2) 55°C für 45 Sekunden und (3) 72°C für 3 Minuten; 21 Zyklen von (1) 94°C für 45 Sekunden, (2) 61°C für 45 Sekunden und (3) 72°C für 3 Minuten; und eine abschließende Extension von 72°C für 10 Minuten. Ein Teil der PCR-Reaktion wurde durch Gelelektrophorese getrennt, wobei ein 0,8prozentiges TAE-Gel verwendet wurde. Die Gelelektrophorese zeigte ein 1,6 kb-Fragment. Dieses Fragment wurde (1) unter Verwendung eines Qiagen Gel Extraction Kits (Qiagen Inc., Valencia, CA) gereinigt, (2) mit KpnI und XbaI (New England BioLabs, Inc., Beverly, MA) behandelt und (3) in pUC18, das auch mit KpnI und XbaI behandelt und gelgereinigt wurde, subkloniert. Das resultierende Konstrukt, bezeichnet als appUC18-SHDXS, ist in 18 dargestellt. Die Ligation wurde mit T4- DNA-Ligase bei 16°C für 16 Stunden durchgeführt. Nach der Ligation wurde 1 μl verwendet, um E. coli ElectroMAX^TM DH10B^TM Zellen (Life Technologies, Inc., Rockville, MD) zu elektroporieren. Die elektroporierten Zellen wurden auf LB-Amp-Platten (Amp Konzentration = 100 μg/ml) ausplattiert. Von diesen Platten wurden acht individuelle Kolonien willkürlich ausgesucht. Das Plasmid wurde aus jeder Kolonie isoliert, wobei ein QiaPrep Spin Miniprep Kit (Qiagen Inc., Valencia, CA) verwendet wurde. Die extrahierte Plasmid-DNA wurde auf das Vorhandensein des 1,6 kb-Fragments durch Verdau individueller Aliquots mit einem von drei unterschiedlichen Restriktionsenzymen untersucht: EcoRI, BamHI und NarI. Wenn die Plasmide das korrekte 1,6 kb-Fragment enthielten, würde die EcoRI-Verdaureaktion in zwei Fragmenten (0,77 und 4,13 kb) resultieren, die BamHI-Verdaureaktion würde in einem Fragment (4,8 kb) resultieren und die NarI-Verdaureaktion würde in zwei Fragmenten (1,9 und 2,9 kb) resultieren. Nach der Behandlung mit den Restriktionsenzymen wurden die Verdaureaktionen durch Gelelektrophorese getrennt, wobei ein 0,8prozentiges TAE-Agarosegel verwendet wurde. Alle 8 Klone erbrachten mit einem Klon von 1,6 kb übereinstimmende Restriktionsfragmente.
Beispiel 2 – Einbringen von Nukleinsäure, die ein Polypeptid kodiert, welches DXS-Aktivität besitzt in Zellen
Das Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, welches DXS-Aktivität besitzt und das wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten wurde, wird wie folgt in Zellen eingebracht. Erstens wird ein Konstrukt hergestellt, um das Nukleinsäuremolekül einzuschließen, so dass das kodierte Polypeptid, welches DXS-Aktivität besitzt, in einer gewünschten Wirtszelle exprimiert wird. Wenn prokaryotische Zellen verwendet werden, wird ein Konstrukt verwendet, das funktionell in prokaryotischen Zellen ist. Wenn eukaryotische Zellen verwendet werden, wird ein Konstrukt verwendet, das funktionell in eukaryotischen Zellen ist. Zweitens wird das Konstrukt unter Verwendung geeigneter Methoden in die gewünschte Wirtszelle eingebracht. Sobald es eingebracht wurde, werden stabile Transformanten ausgewählt.
Beispiel 3 – Klonieren einer Nukleinsäure, die ein Rhodobacter sphaeroides-Polypeptid kodiert, welches DDS-Aktivität besitzt
Zellen des R. sphaeroides ATCC-Stammes 17023 wurden in 550 R 8 A H Medien bei 30°C und 100 rpm angezüchtet. Das Rezept für 550 R 8 A H Medien wurde von ATCC zur Verfügung gestellt. Genomische DNA wurde von R. sphaeroides-Zellen wie in Beispiel 1 beschrieben isoliert.
Um Nukleinsäure, die ein R. sphaeroides-Polypeptid, welches DDS-Aktivität besitzt, zu isolieren, wurden degenerierte Primer gestaltet und benutzt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Kurzgefasst wurden drei degenerierte Vorwärts-Primer (F4, F5 und F6) und vier degenerierte Rückwärts-Primer (R4, R5, R6 und R7) gestaltet, indem Sequenzen mehrerer Klone, die Polypeptide kodieren, welche DDS-, SDS- oder ODS-Aktivität besitzen, verglichen wurden (16). Die Sequenz jedes degenerierten Primers war wie folgt:
Diese Primer wurden in allen logischen Kombinationen in der PCR verwendet, wobei Taq-Polymerase (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) und 1 ng genomische DNA pro Mikroliter Reaktionsgemisch verwendet wurden. Die PCR wurde unter Verwendung eines touchdown-PCR-Programmes durchgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Zwischen etwa 4 μM und 8 μM jedes PCR-Primers wurden in jeder Reaktion verwendet, abhängig vom Grad der Degeneration. Nachdem jede PCR-Reaktion fertiggestellt war, wurde ein Teil jeder Reaktion durch Gelelektrophorese abgesondert, wobei ein 1,5prozentiges TAE-Agarosegel verwendet wurde. Die Ergebnisse der Gelelektrophorese deuteten auf keine Fragmente der erwarteten Größe hin. Eine zweite Amplifizierungsreaktion wurde dann unter Verwendung jeder Probe aus dem ersten PCR-Durchgang durchgeführt. Kurzgefasst wurde ein μl des Reaktionsgemisches jedes ersten PCR-Durchgangs in einer 50 μl Amplifizierungsreaktion verwendet, wobei die selben Primerpaare und Thermozyklierungsparameter verwendet wurden wie im ersten PCR-Durchgang. Ein Teil jeder der PCR-Reaktionen des zweiten Durchgangs wurde durch Gelelektrophorese getrennt, wobei ein 1,5prozentiges TAE-Agarosegel verwendet wurde. Die Kombination der degenerierten Primer F6 und R5 produzierte ein Fragment von 209 bp (bezeichnet als F6R5-Fragment). Das F6R5-Fragment wurde aus einem Agarosegel isoliert und gereinigt unter Verwendung des Qiagen Gelextraktionsverfahrens (Qiagen Inc., Valencia, CA). Ein Aliquot des gereinigten Fragments wurde an pCRII-TOPO ligiert und das Produkt der Ligationsreaktion wurde in E. coli-TOP10-Zellen eingebaut, wobei ein TOPO-Klonierungsverfahren (Invitrogen, Carlsbad, CA) angewendet wurde. Die Produkte der einzelnen Insertionsreaktionen wurden auf LB-Medien ausplattiert, welche 100 μg/ml Amp und 50 μg/ml Xgal enthielten. Einzelne weiße Kolonien, die auf den LB-Amp-Xgal-Platten wuchsen, wurden auf frische LB-Amp-Platten rückausplattiert und mittels einer PCR-Reaktion unter Verwendung der F6- und R5-Primer getestet, um die Anwesenheit des erwünschten Inserts zu bestätigen. Plasmid-DNAs wurden unter Verwendung des QiaPrep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Inc.) aus mehreren Kolonien erhalten. Die erhaltenen Plasmid-DNAs wurden quantifiziert und mit den M13 Vorwärts- und Rückwärts-Primern sequenziert. Die Sequenzanalyse deutete darauf hin, dass das F6R5-Fragment Sequenzen enthielt, die mit Sequenzen anderer Nukleinsäuremoleküle, die Polypeptide kodieren, welche Polyprenyldiphosphatsynthase-Aktivität besitzen, aligneten. Genome Walking wurde durchgeführt, um eine komplette Code-Sequenz für das R. sphaeroides-DDS-Polypeptid zu erhalten, wobei ähnliche Verfahren angewendet wurden wie die in Beispiel 1 beschriebenen. Kurzgefasst wurden Primer gestaltet, beruhend auf der Sequenz des F6R5-Segments für das Walking sowohl aufwärts als auch abwärts. Diese Primer hatten die folgenden Sequenzen:
Die GSP3F- und GSP4F-Primer sind Primer, die vom Startcodon des DDS-Polypeptids abwärts gerichtet sind, während die GSP3R- und GSP4R-Primer Primer sind, die in die entgegengesetzte Richtung gerichtet sind. Zusätzlich befinden sich die GSP4F- und GSP4R-Primer zusammen innerhalb der GSP3F- und GSP3R-Primer.
Die PvuII-, FspI- und StuI-Bibliotheken mit den GSP3F- und GSP4F-Primern und alle vier Bibliotheken mit den GSP3R- und GSP4R-Primern resultierten in der Produktion von amplifizierten Fragmenten. Ein 750 bp-Fragment aus der PvuI-Bibliothek, ein 500 bp-Fragment aus der FspI-Bibliothek, ein 1,4 kb-Fragment aus der StuI-Bibliothek und ein 0,9 kb-Fragment aus der SmaI-Bibliothek wurde subkloniert und sequenziert. Die Sequenzanalysen deuteten daraufhin, dass jedes subklonierte Fragment eine Sequenz enthielt, die mit der Sequenz des F6R5-Fragments überlappte und anderen Nukleinsäuresequenzen, die Polypeptide kodieren, welche Polyprenyldiphosphatsynthase-Aktivität besitzen, ähnlich war. Der Klon in voller Länge, kodierende und nicht-kodierende Sequenz enthalten, war 1990 bp lang (7). Der offene Leserahmen war 1002 bp lang (8), welcher ein Polypeptid mit 333 Aminosäueresten kodierte (9).
Die kodierende Sequenz des DDS-Polypeptids von R. sphaeroides wurde mittels PCR amplifiziert, wobei die genomische DNA von R. sphaeroides als Matrize verwendet wurde. PCR-Primer wurden auf der Grundlage der Sequenz, die wie vorstehend beschrieben erhalten wurde, gestaltet. Die Sequenzen der Primer waren wie folgt:
Diese Primer wurden gestaltet, um einen EcoRI-Restriktionsort am Anfang des amplifizierten Fragments einzuführen und einen HindIII-Restriktionsort am Ende des amplifizierten Fragments. Die Sequenz jedes Restriktionsortes ist unterstrichen. Das PCR-Reaktionsgemisch enthielt folgendes: 100 ng genomische DNA, 2 μl jedes Primers (RDS18F und RDS18R, jeweils 50 μM), 10 μl 10 × Pfu-Plus-Puffer, 5 μl DMSO, 8 μl dNTPs (jeweils 10 mM) und 5 Einheiten Pfu-Polymerase in einem Endvolumen von 100 μl. Jede PCR-Reaktion wurde in einem Perkin Elmer Geneamp PCR System 2400 unter folgenden Bedingungen durchgeführt: eine anfängliche Denaturierung bei 94°C für 5 Minuten, 8 Zyklen von (1) 94°C für 45 Sekunden, (2) 55°C für 45 Sekunden und (3) 72°C für 3 Minuten; 21 Zyklen von (1) 94°C für 45 Sekunden, (2) 61°C für 45 Sekunden und (3) 72°C für 3 Minuten; und eine abschließende Extension von 72°C für 10 Minuten. Nach Abschluss der PCR-Reaktionen wurde jede PCR-Reaktion durch Gelelektrophorese getrennt, wobei ein 0,8prozentiges TAE-Gel verwendet wurde. Die Gelelektrophorese zeigte ein 1,6 kb-Fragment. Dieses Fragment wurde (1) unter Verwendung eines Qiagen Gel Extraction Kits vom Agarosegel gereinigt, (2) mit EcoRI und HindIII (New England BioLabs, Beverly, MA) verdaut und (3) an pUC18, das auch mit EcoRI und HindIII verdaut und gelgereinigt wurde, ligiert. Das resultierende Konstrukt, bezeichnet als appUC18-RSdds ist in 19 dargestellt. Die Ligation wurde mit T4-DNA-Ligase bei 16°C für 16 Stunden durchgeführt. Nach der Ligation wurde ein μl der Ligationsreaktion verwendet, um E. coli ElectroMAX^TM DH10B^TM Zellen (Life Technologies, Inc., Rockville, MD) zu elektroporieren. Die elektroporierten Zellen wurden auf LB-Amp-Platten (Amp Konzentration = 100 μg/ml) ausplattiert. Von diesen Platten wurden acht individuelle Kolonien willkürlich ausgesucht und die Plasmide in diesen Kolonien wurden gereinigt, wobei ein QiaPrep Spin Miniprep Kit verwendet wurde. Diese gereinigten Plasmide wurden auf das Vorhandensein von Inserts durch Restriktionsenzymanalyse untersucht. Wenn die Plasmide das korrekte 1,6-Fragment enthielten, dann würde die EcoRI- und HindIII-Verdaureaktion in zwei Fragmenten (2,6 und 1,6 kb) resultieren und die BamHI-Verdaureaktion würde in einem Fragment (4,2 kb) resultieren. Nach der Behandlung mit den Restriktionsenzymen wurden die Verdaureaktionen durch Gelelektrophorese getrennt, wobei ein 0,8prozentiges TAE-Agarosegel verwendet wurde. Von den 8 getesteten Klonen enthielten vier das gewünschte 1,6 kb-Fragment.
Beispiel 4 – Klonieren einer Nukleinsäure, die ein Sphingomonas trueperi-Polypeptid kodiert, welches DDS-Aktivität besitzt
S. trueperi-Zellen wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, angezüchtet. Zusätzlich wurde genomische DNA von S. trueperi-Zellen isoliert, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Um Nukleinsäure, die ein Polypeptid kodiert, welches DDS-Aktivität besitzt aus S. trueperi zu isolieren, wurde eine Strategie, ähnlich der in Beispiel 3 beschriebenen, angewandt. In diesem Fall wurden vier degenerierte Vorwärts-Primer (SF1, SF2, SF3 und SF4) und vier degenerierte Rückwärts-Primer (SR1, SR2, SR3 und SR4) gestaltet, indem Sequenzen mehrerer Klone, die Polypeptide kodieren, welche Polyprenyldiphosphatsynthase-Aktivität besitzen, verglichen wurden (17). Codon-Usage-Tabellen von zwölf Sphingomonas-Arten wurden verwendet, um eine im Mittel bevorzugte Codon-Tabelle zu entwickeln, die in der Primer-Entwicklung verwendet wurde. Die Sequenz jedes degenerierten Primers war wie folgt:
Die Primer wurden in allen logischen Kombinationen in der PCR verwendet, wobei Taq-Polymerase (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) und 1 ng genomische DNA pro Mikroliter Reaktionsgemisch verwendet wurden. Die PCR wurde durchgeführt unter Verwendung eines touchdown-PCR-Programmes, wie in Beispiel 1 beschrieben. Zwischen etwa 4 μM und 20 μM jedes PCR-Primers wurden in jeder Reaktion verwendet, abhängig vom Grad der Degeneration. Nachdem jede PCR-Reaktion fertiggestellt war, wurde ein Teil jeder Reaktion durch Gelelektrophorese abgesondert, wobei ein 1,5prozentiges TAE-Agarosegel verwendet wurde. Jede PCR-Reaktion produzierte mehrere amplifizierte Fragmente der erwarteten Größe, auf der Grundlage der kodierenden Sequenzen anderer Polyprenyldiphosphatsynthasepolypeptide. Diese Fragmente wurden vom TAE-Agarosegel isoliert und unter Verwendung des Qiagen Gelextraktionsverfahrens (Qiagen Inc., Valencia, CA) gereinigt. Ein Aliquot jedes gereinigten Fragments wurde in pCRII-TOPO ligiert. Die ligierten Plasmide wurden dann in TOP10-E. coli-Zellen eingebaut, wobei ein TOPO-Klonierungsverfahren (Invitrogen, Carlsbad, CA) angewendet wurde. Die Produkte jeder der einzelnen Insertionsreaktionen wurden auf LB-Amp-Xgal-Platten ausplattiert, wie in Beispiel 1 und 3 beschrieben. Einzelne weiße Kolonien, die auf den LB-Amp-Xgal-Platten wuchsen, wurden auf frische LB-Amp-Xgal-Platten rückausplattiert und anhand einer PCR-Reaktion unter Verwendung der anfänglichen degenerierten Primer überprüft, um die Anwesenheit des erwünschten Inserts zu bestätigen. Plasmid-DNAs, die das erwünschte Insert hatten, wurden aus mehreren Kolonien unter Verwendung des QiaPrep Spin Miniprep Kits (Qiagen, Inc.) erhalten. Die erhaltenen Plasmid-DNAs wurden dann quantifiziert und unter Verwendung der M13-Vorwärts- und Rückwärts-Primer sequenziert. Die Sequenzanalysen zeigten, dass ein unter Verwendung der SF1- und SR2- degenerierten Primer hergestelltes 201 bp-Fragment, ein unter Verwendung der SF1- und SR4-Primer hergestelltes 476 bp-Fragment und ein unter Verwendung der SF3- und SR2-Primer hergestelltes 206 bp-Fragment Sequenzen enthielt, die den kodierenden Sequenzen anderer Polyprenyldiphosphatsynthasen ähnlich waren.
Genome Walking wurde durchgeführt, um eine komplette Code-Sequenz für das S. trueperi-DDS-Polypeptid zu erhalten, wobei ähnliche Verfahren angewendet wurden wie die in Beispiel 1 beschriebenen. Kurzgefasst wurden auf den Sequenzen der erhaltenen Fragmente beruhende Primer gestaltet. Diese Primer hatten die folgenden Sequenzen:
Die GSP5F- und GSP6F-Primer sind Primer, die vom DDS-Startcodon abwärts gerichtet sind, während die GSP5R- und GSP6R-Primer Primer sind, die in die entgegengesetzte Richtung gerichtet sind. Zusätzlich befinden sich die GSP6F- und GSP6R-Primer zusammen innerhalb der GSP5F- und GSP5R-Primer.
Genome Walking wurde durchgeführt wie in Beispiel 3 beschrieben, mit der Ausnahme, dass die 36 Zyklen 3 Minuten Inkubation bei 66°C anstatt bei 67°C hatten und die abschließende Extension bei 66°C anstatt bei 67°C sowohl für den ersten als auch für den zweiten PCR-Durchgang durchgeführt wurde. Teile der PCR-Produkte aus jedem Durchgang wurden durch Gelelektrophorese getrennt, wobei ein 1,5prozentiges TAE-Agarosegel verwendet wurde. Die PCR an den FspI- und StuI-Bibliotheken mit den Vorwärts-Primern und von allen vier Bibliotheken mit den Rückwärts-Primern resultierten in der Produktion eines amplifizierten Fragments. Ein 1,4 kb-Fragment aus der FspI-Bibliothek, ein 1,1 kb-Fragment aus der StuI-Bibliothek (Vorwärts-Primer), ein 2,0 kb-Fragment aus der PvuII-Bibliothek (Vorwärts-Primer) und ein 3,0 kb-Fragment aus der StuI-Bibliothek (Rückwärts-Primer) wurden gelgereinigt, kloniert unter Verwendung des TOPO-Klonierungsverfahrens und sequenziert, wie in Beispiel 1 und 3 beschrieben. Die Sequenzanalysen zeigten, dass diese Fragmente Sequenzen enthielten, die mit der Sequenz der anfänglich erhaltenen Fragmente überlappten und den kodierenden Sequenzen anderer Polyprenyldiphosphatsynthasen ähnlich waren. Der Klon in voller Länge, kodierende und nicht-kodierende Sequenz enthalten, war 1833 bp lang (10). Der offene Leserahmen war 1014 bp lang (11), welcher ein Polypeptid mit 337 Aminosäueresten kodierte (12).
Die kodierende Sequenz des DDS-Polypeptids von S. trueperi wurde durch PCR amplifiziert, wobei die genomische DNA von S. trueperi als Matrize verwendet wurde. PCR-Primer wurden auf der Grundlage der Sequenzen, die, wie vorstehend beschrieben, erhalten wurden, gestaltet. Die Sequenzen der Primer waren wie folgt.
Diese Primer wurden gestaltet, um einen KpnI-Restriktionsort am Anfang des amplifizierten Fragments einzuführen und einen BamHI-Restriktionsort am Ende des amplifizierten Fragments. Die Sequenz jedes Restriktionsortes ist unterstrichen. Die PCR-Reaktionen wurden wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Primer SHDDSF und SHDDSR verwendet wurden, anstatt RDS18F und RDS18R. Nach Abschluss der PCR wurden die PCR-Reaktionen durch Gelelektrophorese getrennt, wobei ein 0,8prozentiges TAE-Gel verwendet wurde. Die Gelelektrophorese zeigte ein 1,6 kb-Fragment. Dieses 1,6 kb Fragment wurde (1) unter Verwendung eines Qiagen Gel Extraction Kits gereinigt, (2) mit KpnI und BamHI (New England BioLabs) verdaut und (3) in pUC18, das auch mit KpnI und BamHI verdaut und gelgereinigt wurde, ligiert, wobei Methoden, ähnlich denen in Beispiel 3 beschriebenen, angewendet wurden. Das resultierende Konstrukt, bezeichnet als appUC18-SHDDS ist in 20 dargestellt. Dieses Konstrukt wurde verwendet, um Zellen, wie in Beispiel 3 beschrieben, umzuwandeln. Die umgewandelten Zellen wurden auf LB-Amp-Platten ausplattiert und acht individuelle Kolonien wurden willkürlich ausgesucht. Die Plasmid-DNA wurde aus jeder Kolonie isoliert, wobei ein QiaPrep Spin Miniprep Kit verwendet wurde. Die extrahierte Plasmid-DNA wurde unter Verwendung dreier unterschiedlicher Restriktionsverdaue auf das Vorhandensein des 1,6 kb-Fragments getestet. Wenn die Plasmide das 1,6 kb-Fragment enthielten, dann würde ein BamHI- und ein KpnI-Verdau zwei Fragmente (2,68 und 1,62 kb) abgeben, ein EcoRI-Verdau würde zwei Fragmente (1,45 und 2,85 kb) abgeben und ein BanII-Verdau würde zwei Fragmente (0,48 und 3,8 kb) abgeben. Alle acht getesteten Plasmide gaben Restriktionsfragmente, übereinstimmend mit einem Plasmid, das das erwünschte 1,6 kb-Fragment enthielt, ab.
Beispiel 5 – Messen von CoQ(10)
Geerntete Zellen wurden in Wasser aufgelöst, um etwa 0,1 gm Trockengewicht pro ml zu erhalten. Die Suspension wurde einer French Press unterworfen und das in der Suspension Resultierende wurde bis zur Verwendung in 1 ml Aliquots eingefroren.
Um CoQ(10) in einer Probe zu messen, wurden zwei Aliquots 4–5 Mal wiederholt aufgetaut und wieder eingefroren. Nach Überführung in eine 50 ml Zentrifugenröhre wurde dem aufgetauten Material 1 ml 5%iges Sodiumdodecylsulfat zugegeben. Das Material wurde dann mit Nitrogen gespült. Nachdem es für eine Minute gevortext wurde, wurden sechs ml Ethanol zum Material zugegeben und das resultierende Gemisch wurde für eine Minute gevortext. Dann wurden 15 ml Hexan zum Gemisch hinzugefügt. Nachdem sie für fünf Minuten gevortext wurde, wurde das Gemisch bei 3000 rpm für zehn Minuten zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren wurde die Hexanschicht in einen Erlenmeyerkolben übertragen und mit Nitrogen gespült. Die Hexanextraktion wurde zwei Mal wiederholt. Die drei Extrakte wurden in einer einzelnen Röhre zusammengeführt, welche in einem Vakuumverdampfer bedampft wurde, bis der Rückstand nahezu trocken war. Der Rückstand wurde in 2 ml der mobilen Phase aufgelöst, indem er für 2–3 Minuten gevortext wurde. Nach dem Vortexen wurde die Lösung in einen 5 ml Messkolben überführt. Die Röhre, die den Rückstand enthielt, wurde zwei zusätzliche Male mit 1 ml der mobilen Phase gespült. Jedes Mal wurde die Spüllösung in denselben 5 ml Messkolben überführt. Nachdem das Gesamtvolumen auf 5 ml ausgeglichen war, wurde die Lösung gut gemischt und bei –20°C bis zur Analyse aufbewahrt. Als Kontrolle wurde entweder Wasser oder eine Kulturlösung mit Standard CoQ(10) versetzt, extrahiert wie oben angegeben und analysiert, um die Ausbeute des zugesetzten Materials zu bestimmen. Der CoQ(10)-Standard war eine von Sigma bezogene Bestandslösung von CoQ(10). Die Bestandslösung wurde in HPLC-Grad Ethanol bei einer Konzentration von 100 μg/ml hergestellt und dann verdünnt, um CoQ(10)-Lösungen von 100 μg/ml bis 1 μg/ml zu erhalten.
Die HPLC-Analyse wurde mit den folgenden Parameter durchgeführt. Die mobile Phase war Ethanol:Methanol (7:3) oder Mehtanol:Isopropylether (9:1). Die Fließgeschwindigkeit war 0,75 ml/min. Die Säule war Waters Nova-Pak C18 (3,9 × 150 mm; 4 Um). Der Detektor war ein PDA-Set von 200–300 nm mit einer Auflösung von 1,2 nm und der maximalen Absorption von 275 nm. Die Laufzeit betrug 15 Minuten und das Injektionsvolumen war 50 μl. Um die Menge an vorhandenem CoQ(10) zu ermitteln, wurden 50 μl jeder Probe injiziert und die Ergebnisse mit denen verglichen, die unter Verwendung der Kalibrierungskurve erhalten wurden. Von diesen Daten wurde die Konzentration pro gm Trockengewicht ermittelt.
Beispiel 6 – Einbringen von Nukleinsäure, die ein Polypeptid kodiert, welches DDS-Aktivität besitzt in Zellen und Messen von Isoprenoid-Levels
Die folgenden Verfahren wurden einzeln für die R. sphaeroides- und die S. treper-Nukleinsäure, isoliert jeweils wie in Beispiel 3 und 4 beschrieben, befolgt.
Die Plasmid DNA, die das Polypeptid, welches DDS-Aktivität besitzt, kodiert, wurde in den Wildtyp-E. coli Stamm MG1655 elektroporiert. Die elektroporierten Zellen wurden auf LB-Amp-Platten ausplattiert. Eine einzelne individuelle Bakterienkolonie wurde für jede DDS-Kodierungssequenz ausgewählt und jede Kolonie wurde über Nacht in 2 ml LB-Amp bei 37°C mit 200 rpm schüttelnd angezüchtet. Ungefähr 0,75 ml dieser über Nacht angezüchteten Kulturen wurden verwendet, um Kolben, die 75 ml LB-Amp-Medium enthalten (Amp-Konzentration war 100 μg/ml) zu beimpfen. Diese zweiten Kulturen wurden bei 37°C bei 200 rpm für 30 Stunden angezüchtet. Zusätzliches Amp (bis zu einer Endkonzentration von 50 μg frischem Amp pro ml) wurde zu jedem Kolben nach 12 Stunden Wachstum hinzugefügt. Nach 30 Stunden wurden die Bakterien durch Zentrifugieren bei 8.000 g für 10 Minuten eingesammelt. Die resultierenden bakteriellen Zellpellets wurden durch Zugabe von 20 ml eines 10 mM Tris-HCL-Puffers (pH 8,0) gewaschen, Resuspendieren der Zellen und Rezentrifugieren wie zuvor. Jedes Zellpellet wurde dann in 10 ml Wasser resuspendiert. Ungefähr 0,5 ml jedes Extrakts wurde für die Trockenmasseanalyse verwendet und die verbleibende Zellsuspension (etwa 9,5 ml) wurde bei –20°C über Nacht eingefroren.
Die 9,5 ml Zellsuspension wurde wie folgt verwendet. Zuerst wurden die Zellen auf Eis aufgetaut und lysiert, indem die Zellsuspension drei Mal durch eine French Press (14.000 psi Druck) hindurchgeführt wurde. Die resultierenden Zellextrakte wurden bei –20°C in 1 ml Aliquot eingefroren und auf Eis vor der Analyse aufrechterhalten. Hochdruck-Flüssigchromatographie wurde durchgeführt, wobei das integrierte System Waters 2690 Alliance (Waters Corporation, Milford, Mass.) verwendet wurde. Vor der Analyse wurden alle Proben und Standards in HPLC-Grad-Ethanol gelöst, in den eingebauten Autosampler eingeladen und bei 5°–10°C im Dunkeln gehalten. Die Trennung wurde unter Verwendung eines isokratische Eluierungsprogrammes von 70:30 Ethanol/Methanol (v/v) bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/min durchgeführt. Die Säule war eine Waters Nova-Pak C18, 3,9–150 mm, ausgestattet mit einer Schutzsäule derselben stationären Phase. Das Injektionsvolumen war typischerweise 10–25 μl. Die gesamte Laufzeit betrug zehn Minuten. Unter diesen Umständen betrugen die Aufbewahrungszeiten 3,1 und 4,9 Minuten für CoQ(8) beziehungsweise für CoQ(10). Für Quantifizierungszwecke wurde unter Verwendung frisch bereiteter CoQ(10)-Standards eine externe Vierpunkt-Kalibrierungskurve ermittelt. Die Kalibrierungslevel waren 1,0, 4,0, 10,0 und 100,0 μg/ml (ppm). Jeder Standard wurde in dreifacher Ausfertigung injiziert und die resultierende Kalibrierung wurde linear angepaßt mit beobachtetem r²'s von > 0,999.
Zur UV- und MS-Ermittlung wurde eine Photodiodenanordnung (PDA, Model UV6000LP, ThermoQuest Corp., San Jose, CA) und ein Ionenfallen-Massenanalysator (LCQ Classic, Finnigan/ThermoQuest Corp., San Jose, CA) in Reihe geschaltet mit dem Chromatographen und ohne Trennung des Ausflusses. Die PDA wurde im Prüfungsmodus von 220–300 nm gehandhabt. Der Ausfluss der PDA wurde in den Massenanalysator via Atmospheric-Pressure chemical ionization (APCI) eingebracht, wobei die folgenden Parameter verwendet wurden: Kapillartemperatur, 150°C; Kapillarspannung, 3 kV; Verdampfertemperatur, 400°C; Sheath-Gas-(N₂)Fluss, 80 beliebige Einheiten; Auxiliary-Gas-(N₂)Fluss, 5 beliebige Einheiten; Koronaentladungsnadel, 5 mA/6 kV. Die Ermittlung positiver Ionen wurde im full-scan (250–1000 m/z), 2 mscans, 500 ms Ioneninjektionszeit durchgeführt.
Unter diesen Bedingungen erbrachte CoQ(8) ein Massenspektrum mit einer Basisspitze bei 727,5 m/z, entsprechend dem protonierten „molekularen Ion" sowie mehreren Satellitenionen von Ethanol- und/oder Methanoladdukten (23 und 24). Gleichermaßen erbrachte CoQ(10) ein Massenspektrum mit einer Basisspitze bei 863,6 m/z, entsprechend seinem protonierten „molekularen Ion" (25). Mehrere Ethanol- und/oder Methanol-Satellitenaddukte wurden ebenso beobachtet. Sowohl CoQ(8) als auch CoQ(10) erbrachten UV-Spektren mit Maxima bei 274 nm.
Zwei Proben wurden analysiert: MG1655 PUC18 und MG1655 PUC18-DDS. MG1655 PUC18 ist der nur mit dem PUC18-Vektor transfizierte E. coli-Stamm MG1655. MG1655 PUC18-DDS ist der mit dem PUC18-Vektor transfizierte E. coli-Stamm MB1655, welcher eine Nukleinsäure enthält, die ein R. sphaeroides-Polypeptid kodiert, welches DDS-Aktivität besitzt. Die MG1655 PUC18-Probe enthielt nur CoQ(8) (Aufbewahrungszeit 3,08 min, 21), wie durch sein Massenspektrum (23) bestätigt, mit einer Basisspitze bei 727,4 m/z und einem UV-Spektrum mit einem Maximum bei 274 nm. Die MG1655 PUCl8-DDS-Probe enthielt jedoch CoQ(8) und CoQ(10) (22), wovon beide durch die passenden Massenspektren (24 und 25) und UV-Maxima bestätigt wurden.
Vergleichendes Beispiel 7 – Klonieren einer Nukleinsäure, die ein Sphingomonas trueperi-Polypeptid kodiert, welches DXR-Aktivität besitzt
Sphingomonas trueperi ATCC 12417-Kulturen (100–200 ml) wurden in einem Nährmedium bei 30°C und 250 rpm für 2–3 Tage angezüchtet. Die Zellen wurden pelletiert und in einer 10 mM Tris: 1,0 mM EDTA-Lösung gewaschen. Die Pellets wurden in 5 ml GTE-Puffer resuspendiert (50 mM Glukose, 25 mM Tris HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA (pH 8,0)) pro 100 ml Kultur. Lysozym und Proteinase K wurden bis auf eine Konzentration von 1 mg/ml hinzugegeben und Mutanolysin wurde auf 5,5 mg/ml zugefügt. Nach einer Inkubation von 1,5 Stunden bei 37°C wurde SDS bis auf eine Endkonzentration von 1% zugegeben und die Konzentration von Proteinase K wurde auf 2 mg/ml gebracht. Nach einer Inkubation bei 50°C für eine Stunde wurde ein gleiches Volumen an GTE-Puffer hinzugefügt und NaCl wurde auf eine Konzentration von 0,15 M zugegeben. Das Gemisch wurde mit einem gleichen Volumen an Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) extrahiert und bei 10.000 rpm für 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde mit RNAse behandelt und mit 2,5 Volumen Ethanol ausgefällt. Die aufgewickelte DNA wurde mit 70%igem Ethanol gewaschen, luftgetrocknet und in 10 mM Tris (pH 8,5) resuspendiert. Nach der Resuspendierung wurde die resuspendierte DNA weiter durch Reextraktion mit Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol und Chloroform und Wiederausfällung mit 1/10 Volumen 7,4 M NH₄OAc und 2,5 Volumen Ethanol gereinigt.
Eine konservierte Region des 1-Deoxy-D-xylulose5-phosphatreductoisomerase-(dxr)Gens wurde mittels PCR geklont. Fünf degenerierte Vorwärts- und fünf degenerierte Rückwärts-PCR-Primer wurden aus konservierten Proteinregionen, die durch Alignment bekannter dxr-Gene (27) enthüllt wurden, gestaltet. Die degenerierten Sequenzen wurden aus den konservierten Regionen unter Verwendung der universalen Codon-Tabelle gestaltet. Die Primer wurden in allen logischen Kombinationen unter Verwendung der Taq-Polymerase (Roche Molecuar Biochemicals, Indianapolis, IN) und 1 ng genomischer DNA/μl Reaktionsgemisch verwendet. Die PCR wurde durchgeführt unter Verwendung eines touchdown-PCR-Programms mit 4 Zyklen bei einer Annealingtemperatur von 59°C, 4 Zyklen bei 57°C, 4 Zyklen bei 55°C und 24 Zyklen bei 53°C. Jeder Zyklus verwendete eine anfängliche 30 Sekunden dauernde Denaturierungsstufe bei 94°C und eine 1,75 Minuten dauernde Extension bei 72°C und das Programm hatte eine anfängliche Denaturierungsstufe von 2 Minuten bei 94°C und eine abschließende Extension von 5 Minuten bei 72°C.
Die Mengen an PCR-Primer, die in der Reaktion verwendet wurden, wurden auf das 3–12fache über die typischen PCR-Mengen erhöht, abhängig von der Menge der Degeneration im 3'-Ende des Primers. Zusätzlich wurden separate PCR-Reaktionen, wobei jeder einzelne Primer enthalten war, durchgeführt, um PCR-Produkte zu identifizieren, die aus einzelnen degenerierten Primer resultierten. Fünfzehn μl jedes PCR-Produkts wurden auf einem 1,5%igem TAE-(Tris-acetat-EDTA)Agarosegel abgespalten. Die degenerierten Primer F2 (5'-CCSGTSGAYWSSGARCAYAACGCS-3' (SEQ ID NO:132)) und R7 (5'-ATGATGAACAAGGGSCTSGAR-3' (SEQ ID NO:133)) produzierten eine Bande von etwa 250 bp, welches die erwartete Größe, basierend auf dxr-Genen anderer Arten, war. Diese Bande war in den einzelnen F2- und R7-Primer-Kontrollreaktionen nicht anwesend. Die degenerierten Primer F3 (5'-CATCCVAACTGGWMVATGGG-3' (SEQ ID NO:134)) und R2 (5'-ATYGGYRWWCKCATATCMGG-3' (SEQ ID NO:135)) produzierten eine Bande von etwa 200 bp, welches auch die erwartete Größe war. Die F2-R7- und F3-R2-Fragmente wurden unter Verwendung eines QIAquick Gel Extraction Kits (Qiagen Inc., Valencia, CA) isoliert und gereinigt. Drei μl der gereinigte Bande wurden in einen pCR^®II-TOPO-Vektor ligiert, welcher dann durch eine Hitzeschockmethode in TOP10-E. coli-Zellen umgewandelt wurde, unter Verwendung eines TOPO-Klonierungsverfahrens (Invitrogen, Carlsbad, CA). Die Transformationen wurden auf LB-Medien ausplattiert, die 100 μg/ml Ampicillin und 50 μg/ml 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-B-D-Galactopyranosid (Xgal) enthielten. Einzelne weiße Kolonien wurden in etwa 20 μl 10 mM Tris rückausplattiert und für 10 Minuten bei 95°C erhitzt, um die Bakterienzellen aufzubrechen. Um individuelle Kolonien zu testen, wurden 2 μl der erhitzten Zellen in einer 25 μl PCR-Reaktion verwendet, wie vorstehend beschrieben, unter Verwendung der passenden degenerierten Primer. Plasmid-DNA wurde mit einem QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Inc.) aus Kulturen von Kolonien erhalten, die das gewünschte Insert hatten und für die DNA-Sequenzierung mit M13R- und M13F-Primern verwendet. Die Sequenzanalysen zeigten, dass die F2-R7- und F3-R2-Fragmente überlappten und homolog zu bekannten dxr-Genen waren.
Genome Walking wurde wie folgt durchgeführt, um die komplette Kodierungssequenz zu erhalten. Die Überlappung der F2-R7- und F3-R2-Fragmente resultierte in einer Sequenz von 358 bp Länge. Die folgenden vier Primer für die Durchführung des Genome Walking, sowohl aufwärts als auch abwärts gerichtet, wurden unter Verwendung des Teils dieser Sequenz gestaltet, die sich innerhalb der degenerierten Primer befand:
Die GSP1F- und GSP2F-Primer waren aufwärts, die GSP1R- und GSP2R-Primer waren abwärts gerichtet und die GSP2F- und GSP2R-Primer befanden sich zusammen in den GSP1F- und GSP1R-Primern. Genome Walking wurde gemäß dem Handbuch des CLONTECH Universal Genome Walking Kits (CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Enzyme FspI und SmaI verwendet wurden statt DraI und EcoRV. Die DraI- und EcoRV-Enzyme wurden ersetzt, weil sie die genomische DNA von S. trueperi zu selten schnitten, um für PCR empfängliche Fragmentlängen zu ergeben. Das PCR-Gemisch enthielt 5% DMSO. Der erste PCR-Durchgang wurde in einem Perkin Elmer 9700 Thermozykler durchgeführt mit 7 Zyklen, bestehend aus 2 Sekunden bei 94°C und 3 Minuten bei 72°C und 36 Zyklen, bestehend aus 2 Sekunden bei 94°C und 3 Minuten bei 66°C, mit einer abschließenden Extension bei 66°C für 4 Minuten. Der zweite Durchgang der PCR verwendete 5 Zyklen, bestehend aus 2 Sekunden bei 94°C und 3 Minuten bei 72°C und 26 Zyklen, bestehend aus 2 Sekunden bei 94°C und 3 Minuten bei 66°C, mit einer abschließenden Extension bei 66°C für 4 Minuten. Neun μl des Produkts des ersten Durchgangs und sieben μl des Produkts des zweiten Durchgangs wurden auf einem 1,5%igem TAE-Agarosegel abgetrennt. Eine 1,3 Kb-Bande wurde vom Produkt des zweiten Durchgangs für die SmaI-Vorwärts-Reaktion erhalten, eine 800 bp-Bande für die StuI-Rückwärts-Reaktion und eine 750 bp-Bande für die PvuII-Rückwärts-Reaktion. Diese Fragmente wurden gelgereinigt, kloniert und sequenziert. Interne Primer wurden verwendet, um zu amplifizieren und eine zusätzliche Sequenz des Gens zu erhalten. Die Sequenzanalyse zeigte, dass die Sequenz, die vom Genome Walking stammte, mit den ursprünglichen Fragmenten überlappte und eine vollständige, bekannten dxr-Genen homologe, Kodierungssequenz enthielt. Der Klon in voller Länge, kodierende und nicht-kodierende Sequenz enthalten, war 2017 bp lang (28). Der offene Leserahmen, angefangen mit der ersten GTG-Stelle, war 1161 bp lang (29), und kodierte ein Polypeptid mit 386 Aminosäueresten (30).
Beispiel 8 – Herstellen rekombinanter Mikroorganismen
Rhodobacter sphaeroides (ATCC 35053) wurde routinemäßig auf Luria-Bertani-(Miller-)Agar-(Fisher scientific)Platten aufrechterhalten. Wenn er gebraucht wurde, wurde R. sphaeroides wie folgt kultiviert. Eine 5 ml Kultur wurde in einem 15 ml Kulturröhrchen bei 30°C im Innova 4230 Inkubator angezüchtet, wobei der Schüttler (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) eine Schüttelgeschwindigkeit von 250 rpm hatte. Jede 5 ml Kultur wurde begonnen, indem flüssige Medien (Sistrom Medien ergänzt mit 20% LB) mit einer einzelnen Kolonie beimpft wurde. Die flüssigen Medien enthielten die folgenden Zutaten pro Liter: 2,72 g KH₂PO₄, 0,5 g (NH₄)₂SO₄, 0,5 g NaCl, 0,2 g EDTA-Disodiumsalz, 0,3 g MgSO₄·7H₂O, 0,033 g CaCl₂·2H₂O, 0,2 mg FeSO₄·7H₂O, 0,02 ml (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O (1%ige Lösung), 1 ml Spurenelementlösung, 0,2 ml Vitaminlösung, 5 g Luria-Bertani-Brühengemisch und 8 ml Glukose (50%). Die Spurenelementlösung enthielt die folgenden Zutaten pro Liter: 1,765 g EDTA-Disodiumsalz, 10,95 g ZnSO₄·7H₂O, 5 g FeSO₄·7H₂O, 1,54 g MnSO₄·H₂O, 0,392 g CuSO₄·5H₂O, 0,248 g Co(NO₃)₂·6H₂O und 0,114 g H₃BO₃. Die Vitaminlösung enthielt die folgenden Zutaten pro Liter: 10 g Nikotinsäure, 5 g Thiamin-HCl und 0,01 g Biotin. Die Vitamine und die Glukose wurden zugegeben, nachdem die Medien nach dem Autoklavieren auf Zimmertemperatur herabgekühlt waren. Wenn nötig, wurden die Medien mit einem oder mehreren der folgenden Antibiotika ergänzt: Kanamycin (25 μg/ml; Endkonzentration), Spectinomycin (25 μg/ml; Endkonzentration) und/oder Streptomycin (25 μg/ml; Endkonzentration).
Elektrokompetente R. sphaeroides-Zellen
Elektrokompetente R. sphaeroides-Zellen wurden wie folgt hergestellt. Eine 5 ml R. sphaeroides-Kultur wurde über Nacht bei 30°C in Sistrom's Medien, ergänzt mit 20% LB, angezüchtet. Diese Kultur wurde 1/100 in 300 ml desselben Mediums verdünnt und zu einer OD₆₆₀ von 0,5–0,8 angezüchtet. Die Zellen wurden für 10 Minuten auf Eis abgekühlt und dann für 6 Minuten bei 7.500 g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet wurde in eiskaltem 10%igem Glyzerol bei der Hälfte des Ursprungsvolumens resuspendiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation für 6 Minuten bei 7.500 g pelletiert. Der Überstand wurde wieder verworfen und die Zellen in eiskaltem 10%igem Glyzerol bei einem Viertel des Ursprungsvolumens resuspendiert. Die letzten Zentrifugations- und Resuspensionsschritte wurden wiederholt, gefolgt von einer Zentrifugation für 6 Minuten bei 7.500 g. Der Überstand wurde dekantiert und die Zellen in dem kleinen Volumen Glyzerol, das nicht ausgelaufen war, resuspendiert. Zusätzliches eiskaltes 10%iges Glyzerol wurde, wenn nötig, hinzugegeben, um die Zellen zu resuspendieren. Vierzig μl der resuspendierten Zellen wurden in einer Testelektroporation verwendet, um zu bestimmen, ob die Zellen durch Zentrifugation konzentriert werden müssten oder mit 10%igem eiskalten Glyzerol verdünnt werden müssten. Zeitkonstanten von 8,5–9,0 Millisekunden resultierten in guten Transformationswirkungsgraden. Wenn die Zellen zu stark verdünnt waren, war die Zeitkonstante größer als 9,0 und die Transformationswirkungsgrade waren niedrig. Wenn die Zellen zu stark konzentriert waren, dann funkte die Elektroporation. Sobald eine annehmbare Zeitkonstante erreicht wurde, wurden die Zellen in kalte Mikrofugenröhrchen aufgeteilt und bei –80°C aufbewahrt. Das gesamte Wasser, das für die Medien und das Glyzerol verwendet wurde, war 18,2 Mohm-cm oder höher.
Elektrokompetente R. sphaeroides-Zellen wurden wie folgt elektroporiert. Ein μl Plasmid-DNA wurde behutsam in 40 μl elektrokompetente R. sphaeroides-Zellen gemischt, welche dann auf eine Elektroporationsküvette mit einem 0,2 cm Elektrodenabstand überführt wurden. Die Elektroporationen wurden unter Verwendung eines Biorad Gene Pulser II (Biorad, Hercules, CA) durchgeführt, mit den Einstellungen bei 2,5 kV Spannung, 400 Ohm Widerstand und 25 μF Kapazität. Die Zellen wurden in 400 μl SOC-Medien bei 30°C für 6–16 Stunden zurückgewonnen. Die Zellen wurden dann auf den geeigneten selektiven Medien ausplattiert (200 μl pro Platte). Die Transformationswirkungsgrade betrugen durchschnittlich etwa 2.000 Transformationen/μg DNA.
Elektrokompetente E. coli-Zellen
Elektrokompetente Zellen des E. coli-Stammes S17-1 wurden wie folgt hergestellt. Eine 5 ml Kultur des E. coli-Stammes S17-1 wurde über Nacht bei 30°C in LB-Medien, ergänzt mit 25 μg/ml Streptomycin und 25 μg/ml Spectinomycin, angezüchtet. Diese Kultur wurde 1/100 in 300 ml desselben Mediums verdünnt und zu einer OD₆₆₀ von 0,5–0,8 angezüchtet. Die Zellen wurden für 10 Minuten auf Eis abgekühlt und dann für 6 Minuten bei 7.500 g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet wurde in eiskaltem 10%igem Glyzerol bei der Hälfte des Ursprungsvolumens resuspendiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation für 6 Minuten bei 7.500 g pelletiert. Der Überstand wurde wieder verworfen und die Zellen in eiskaltem 10%igem Glyzerol bei einem Viertel des Ursprungsvolumens resuspendiert. Die letzten Zentrifugations- und Resuspensionsschritte wurden wiederholt, gefolgt von einer Zentrifugation für 6 Minuten bei 7.500 g. Der Überstand wurde dekantiert und die Zellen in dem kleinen Volumen Glyzerol, das nicht ausgelaufen war, resuspendiert. Zusätzliches eiskaltes 10%iges Glyzerol wurde, wenn nötig, hinzugegeben, um die Zellen zu resuspendieren. Die Zellen wurden in kalte Mikrofugenröhrchen aufgeteilt und bei –80°C aufbewahrt.
Elektrokompetente E. coli-Zellen wurden wie folgt elektroporiert. Vierzig μl kompetente Zellen wurden pro Elektroporation verwendet. Die Elektroporation wurde unter Verwendung eines Biorad Gene Pulser II und eines Standard-E. coli-Protokolls durchgeführt: 2,5 kV Spannung, 400 Ohm Widerstand und 25 μF Kapazität. Die elektroporierten Zellen wurden in 250–1000 μl SOC-Medien für eine Stunde zurückgewonnen und 10–200 μl der Kultur wurden pro Platte der selektiven Medien ausplattiert. Die Transformationswirkungsgrade betrugen durchschnittlich etwa 1,5 × 10⁴ Transformationen/μg DNA.
Konstrukte
Verschiedene Klone wurden in R. sphaeroides überexprimiert unter Verwendung des Vektors pBBR1MCS2 für ein breites Wirtsspektrum (Kovach et al., Gene, 166: 175–176 (1995)), der gestaltet wurde, um entweder einen R. sphaeroides-rrnB-Promotor oder einen R. sphaeroides-glnB-Promotor oder einen tet-Promotor zu besitzen. Der pBBR1MCS2-Vektor ist mobilisierbar und relativ klein (5.144 bp), repliziert in R. sphaeroides, hat eine multiple Klonierungsstelle mit lacZα-Farbselektion und trägt ein Kanamycin-Resistenzgen. Alle Restriktionsenzyme und die T4-DNA-Ligase wurden, wenn nicht anders angegeben, von den New England Biolabs (Beverly, MA) bezogen. Alle Plasmid-DNA-Präparationen wurden unter Verwendung des QIAprep Spin Miniprep Kits oder des Qiagen Maxi Prep Kits hergestellt und alle Gelreinigungen wurden unter Verwendung des QIAquick Gel Extraction Kits (Qiagen, Valencia, CA) durchgeführt.
pMCS2rrnBP
Der als pMCS2rrnBP bezeichnete Vektor, der einen R. sphaeroides-rrnB-Promotor enthält, wurde durch Einfügen einer Kopie des R. sphaeroides-rrnB-Promotors (rrnBP) in den pBBR1MCS2-Vektor erstellt. Der rrnB-Promotor wurde aus dem pTEX124-Vektor (erhalten von S. Kaplan) durch Verdau mit dem Restriktionsenzym BamHI, welches den Promotor als 363 bp-Fragment freisetzt, isoliert. Alternativ kann der rrnB-Promotor mittels PCR-Amplifizierung aus der genomischen DNA von R. sphaeroides unter Verwendung von Primern, die auf veröffentlichten rrnB-Sequenzen (GenBank^® Zugangsnummer X53854) basieren, erhalten werden. Dieses Fragment wurde von einem 2%igen Tris-Azetat-EDTA-(TAE) Agarosegel gelgereinigt. Der pBBR1MCS2-Vektor wurde auch mit BamHI verdaut und das Enzym wurde bei 80°C für 20 Minuten hitzeinaktiviert. Der verdaute Vektor wurde dann mit Shrimp Alkalischer Phosphatase (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) dephosphoryliert und von einem 1%igen TAE-Agarosegel gelgereinigt. Der präparierte Vektor und das rrnBP-Fragment wurden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase bei 16°C für 16 Stunden ligiert. Ein μl der Ligationsreaktion wurde verwendet, um 40 μl E. coli-Electromax^TM DH10B^TM-Zellen (Life Technologies, Inc., Rockville, MD) zu elektroporieren. Elektroporierte Zellen wurden auf LB-Medien ausplattiert, welche 25 μg/ml Kanamycin (LBK) enthielten. Plasmid-DNA wurde aus Kulturen einzelner Kolonien isoliert und wurde mit HindIII-Restriktionsenzymen verdaut, um die Anwesenheit einer einzelnen Insertion des rrnB-Promotors zu bestätigen. Die Sequenz des rrnBP-Inserts für diese Kolonien wurde ebenfalls durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
pMCS2glnBP
Der als pMCS2glnBP bezeichnete Vektor, der einen R. sphaeroides-glnB-Promotor enthält, wurde durch Einfügen einer Kopie des R. sphaeroides-glnB-Promotors (glnBP) in den pBBR1MCS2-Vektor erstellt. Der glnB-Promotor wurde mittels PCR aus genomischer DNA aus dem R. sphaeroides-Stamm 35053 amplifiziert. Die folgenden Primer wurden, basierend auf der unter der GenBank^® Zugangsnummer X71659 erhaltenen Sequenzinformation, gestaltet:
Die Primer führten einen XbaI-Restriktionsort am 5'-Ende und einen BamHI-Restriktionsort am 3'-Ende ein. Das folgende Reaktionsgemisch und das PCR-Programm wurden verwendet, um die Promotorregin des glnB-Gens zu amplifizieren.
Das PCR-Produkt wurde auf einem 1,2%igen TAE-Agarosegel getrennt. Ein etwa 500 bp-Fragment wurde herausgeschnitten und gelgereinigt. Die DNA wurde mit XbaI und BamHI geschnitten und die resultierende verdaute DNA-Säule unter Verwendung eines Qiagen Gelisolationskits gereinigt. Drei μg der pBBR1MCS2-Plasmid-DNA wurde mit BamHI und XbaI verdaut. Der Verdau wurde bei 80°C für 20 Minuten inaktiviert. Der verdaute Vektor wurde dann mit Shrimp Alkalischer Phosphatase dephosphoryliert und auf einem 1%igen TAE-Agarosegel gelgereinigt. Sechundachtzig ng des präparierten pBBR1MCS2-Vektors wurden mit 60 ng des verdauten glnBP-PCR-Produkts, unter Verwendung von T4-DNA-Ligase bei 14°C für 14–16 Stunden ligiert. Ein μl der Ligationsreaktion wurde verwendet, um 40 μl E. coli-Electromax^TM DH10B^TM-Zellen zu elektroporieren. Die elektroporierten Zellen wurden auf LB-Medien ausplattiert, welche 25 μg/ml Kanamycin und 50 μg/ml Xgal (LBKX) enthielten. Acht einzelne weiße Kolonien wurden ausgewählt und ihre Plasmid-DNA unter Verwendung eines QIAprep Spin Miniprep Kits isoliert. Die Plasmid-DNA, die aus jeder Kolonie isoliert wurde, wurde in Reaktionsgemischen zur Auftrennung mit PstI und einer Kombination aus EcoRI/XbaI verdaut. Alle acht Klone hatten ein Restriktionsmuster, das auf die Anwesenheit des Inserts hindeutete. Die Sequenz von drei Klonen wurde verifiziert.
pMCS2tetP
Der als pMCS2tetP bezeichnete Vektor, der einen tet-Promotor enthält, wurde durch die Klonierung des Promotors für die Tetracyclin-Resistenz-Determinante von Transposon Tn1721 (Waters et al., Nucleic Acids Research, 11(17): 6089–6105 (1983)) in den pBBR1MCS2-Vektor gestaltet. Der tetA-Gen-Promotor (tetP) wurde unter Verwendung von Plasmid pRK415 als Matrize amplifiziert. Die folgenden Primer wurden gestaltet, um einen XbaI-Restriktionsort am Anfang des amplifizierten Fragments und einen BamHI-Restriktionsort am Ende des amplifizierten Fragments einzubringen.
Das PCR-Gemisch enthielt folgendes: 1 × Nativer Plus-Pfu-Puffer, 20 ng pRK415 Plasmid-DNA, 0,2 μM von jedem Primer, 0,2 μM von jedem dNTP, 5% DMSO (v/v) und 10 Einheiten nativer Pfu-DNA-Polymerase in einem Endvolumen von 200 μl. Die PCR-Reaktion wurde in einem Perkin Elmer Geneamp PCR-System 2400 unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: eine anfängliche Denaturierung bei 94°C für 1 Minute; 8 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 60°C für 45 Sekunden und 72°C für 45 Sekunden; 24 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 66°C für 45 Sekunden und 72°C für 45 Sekunden; und eine abschließende Extension für 7 Minuten bei 72°C. Das Amplifizierungsprodukt wurde dann durch Gelelektrophorese unter Verwendung eines 2%igen TAE-Agarosegels getrennt. Ein 160 bp-Fragment wurde aus dem Gel herausgeschnitten und gereinigt. Das gereinigte Fragment wurde gleichzeitig mit XbaI- und BamHI-Restriktionsenzymen verdaut und mit einem QIAquick PCR Purification Kit gereinigt. Drei μg pBBR1MCS2-Plasmid-DNA wurden mit BamHI und XbaI verdaut und der Verdau wurde bei 80°C für 20 Minuten inaktiviert. Der verdaute Vektor wurde dann mit Shrimp Alkalischer Phosphatase dephosphoryliert und auf einem 1%igen TAE-Agarosegel gelgereinigt.
100 ng des präparierten pBBR1MCS2-Vektors wurden mit 36 ng des verdauten tetP-PCR-Produkts unter Verwendung von T4-DNA-Ligase bei 16°C für 16 Stunden ligiert. Ein μl der Ligationsreaktion wurde verwendet, um 40 μl E. coli-Electromax^TM DH10B^TM-Zellen zu elektroporieren. Die elektroporierten Zellen wurden auf LB-Medien ausplattiert, welche 25 μg/ml Kanamycin und 50 μg/ml Xgal (LBKX) enthielten. Einzelne weiße Kolonien wurden in etwa 25 μl 10 mM Tris resuspendiert und 2 μl der Resuspension wurden auf LBKX ausplattiert. Die restliche Resuspension wurde für 10 Minuten bei 95°C erhitzt, um die Bakterienzellen aufzubrechen. Zwei μl der erhitzen Zellen wurden in einer 25 μl PCR-Reaktion unter Verwendung der folgenden Primer, die homolog zum Vektor waren und den Klonierungsort flankierten, verwendet:
Das PCR-Gemisch enthielt folgendes: 2 × Taq PCR-Puffer, 0,2 μM von jedem Primer, 0,2 mM von jedem dNTP und 1 Einheit Taq DNA-Polymerase pro Reaktion. Die PCR-Reaktion wurde in einem MJ Research PTC 100 unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: eine anfängliche Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten; 32 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 45 Sekunden und 72°C für 1 Minute; und eine abschließende Extension für 7 Minuten bei 72°C. Alle Kolonien zeigten ein einziges Insertionsereignis. Plasmid-DNA wurde aus Kulturen zweier einzelner Kolonien isoliert und sequenziert, um die DNA-Sequenz des tet-Promotors im Konstrukt zu bestätigen.
DMCS2rrnBP/Stdxs
Die Nukleinsäure, die ein S. trueperi-Polypeptid kodiert, welches eine DXS-Aktivität besitzt, wurde im pMCS2rrnBP-Vektor wie folgt geklont. Das S. trueperi-dxs-Gen wurde mittels PCR unter Verwendung von zur Sequenz aufwärts und abwärts des Gens homologen Primer amplifiziert. Diese Primer, STDXSMCSF und STDXSMCSR, wurden gestaltet, um einen ClaI-Restriktionsort am Anfang des amplifizierten Fragments und einen KpnI-Ort am Ende des amplifizierten Fragments einzubringen.
Das PCR-Gemisch enthielt folgendes: 1 × Nativer Plus-Pfu-Puffer, 200 ng genomische DNA von S. trueperi, 0,2 μM von jedem Primer, 0,2 μM von jedem dNTP, 5% DMSO (v/v) und 10 Einheiten nativer Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene, La Jolla, CA) in einem Endvolumen von 200 μl. Die PCR-Reaktion wurde in einem Perkin Elmer Geneamp PCR-System 2400 unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: eine anfängliche Denaturierung bei 94°C für 1 Minute; 8 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 54°C für 45 Sekunden und 72°C für 3,5 Minuten; 27 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 60°C für 45 Sekunden und 72°C für 3,5 Minuten; und eine abschließende Extension für 7 Minuten bei 72°C. Das Amplifizierungsprodukt wurde dann durch Gelelektrophorese unter Verwendung eines 1%igen TAE-Agarosegels getrennt. Ein 2,2 Kb-Fragment wurde aus dem Gel herausgeschnitten und gereinigt. Das gereinigte Fragment wurde mit einem ClaI-Restriktionsenzym verdaut, mit einem QIAquick PCR Purification Kit gereinigt, mit einem KpnI-Restriktionsenzym verdaut, wieder mit einem QIAquick PCR Purification Kit gereinigt und auf einem Minigel quantifiziert.
Drei μg des pMCS2rrnBP-Vektors wurden mit dem Restriktionsenzym ClaI verdaut, auf einem 1%igem TAE-Agarosegel gelgereinigt, mit KpnI verdaut, mit einem QIAquick PCR Purification Kit gereinigt, mit Shrimp Alkalischer Phosphatase dephosphoryliert und wieder mit einem QIAquick PCR Purification Kit gereinigt. 120 ng des verdauten PCR-Produkts, das das S. trueperi dxs-Gen enthielt, und die 50 ng des präparierten pMCS2rrnBP-Vektors wurden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase bei 16°C für 16 Stunden ligiert. Ein μl der Ligationsreaktion wurde verwendet, um 40 μl E. coli-Electromax^TM DH10B^TM-Zellen zu elektroporieren. Die elektroporierten Zellen wurden auf Medien ausplattiert. Plasmid-DNA wurde von Kulturen einzelner Kolonien isoliert und auf die Anwesenheit des gewünschten Inserts durch Restriktionsenzymanalyse mit HindIII- und SacI-Enzymen untersucht. Die Sequenz des Stdxs-Inserts wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Das resultierende Plasmid, das die Stdxs-Sequenz unter der Kontrolle des rrnB-Promotors enthielt, wurde pMCS2rrnBP/Stdxs benannt.
Gereinigte pMCS2rrnBP/Stdxs-Plasmid-DNA, abgeleitet aus einer Kolonie, die die korrekte Sequenz besitzt, wurde dann in elektrokompetente Zellen vom R. sphaeroides-Stamm 35053 elektroporiert. Plasmid-DNA wurde aus Kulturen einzelner R. sphaeroides-Kolonien isoliert. Restriktionsmuster von Plasmidpräparationen von R. sphaeroides sind aufgrund der Anwesenheit mehrerer nativer Plasmide in dieser Art schwierig zu analysieren. Um die Integrität der Plasmide in R. sphaeroides zu überprüfen, wurde ein μl der Plasmidpräparation einer transformierten R. sphaeroides-Kolonie verwendet, um E. coli ElectroMAX^TM DH10B^TM Zellen durch Elektroporation zu retransformieren. Elektroporierte Zellen wurden auf LBK-Medien ausplattiert. Plasmid-DNA wurde aus Kulturen einzelner Kolonien isoliert und unter Verwendung von SacI- und HindIII-Restriktionsverdauen untersucht.
pMCS2rrnBP/Stdxs2
Ein zweites pMCS2rrnBP-Plasmid, das die Nukleinsäure enthält, die ein S. trueperi-Polypeptid kodiert, welches DXS-Aktivität besitzt, wurde erstellt. Dieses Konstrukt wurde hergestellt unter Verwendung folgender Vorwärts-Primer, die gestaltet wurden, um die ribosomale Bindungsstelle (rbs) des R. sphaeroides-dxs1-Gens zusammen mit einem ClaI-Restriktionsort einzufügen.
Die genomische DNA von S. trueperi wurde als Matrize in einem PCR-Gemisch unter Verwendung der Primer SXSCLAF2 und STDXSMCSR verwendet. Das verwendete PCR-Programm und das Reaktionsgemisch waren identisch zu den für das pMCS2rrnBP/Stdxs-Konstrukt beschriebenen. Das PCR-Produkt wurde gelgereinigt, mit ClaI verdaut, mit einem QIAquick PCR Purification Kit gereinigt, mit einem KpnI-Restriktionsenzym verdaut und wieder mit einem QIAquick PCR Purification Kit gereinigt. 150 ng des verdauten PCR-Produkts wurden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase bei 16°C für 16 Stunden in 50 ng des präparierten pMCS2rrnBP-Vektors ligiert. Ein μl der Ligationsreaktion wurde in E. coli-Electromax^TM DH10B^TM-Zellen transformiert und die elektroporierten Zellen wurden auf LBK-Platten ausplattiert. Plasmid-DNA wurde von Kulturen einzelner Kolonien isoliert und auf die Anwesenheit des erwünschten Inserts durch Restriktionsenzymanalyse mit HindIII- und SacI-Enzymen untersucht. Die Sequenz des dxs-Inserts wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Das resultierende Plasmid, das die Stdxs-Sequenz unter der Kontrolle des rrnB-Promotors enthielt und eine ribosomale Bindungsstelle von R. sphaeroides besaß, wurde pMCS2rrnBP/Stdxs2 benannt.
Ein bestätigtes Konstrukt wurde in den R. sphaeroides-Stamm 35053 elektroporiert und die elektroporierten Zellen wurden auf LBK-Medien ausplattiert. Einzelne Kolonien wurden in etwa 25 μl 10 mM Tris resuspendiert und 2 μl der Resuspension wurden auf LBK-Medien ausplattiert. Die restliche Resuspension wurde für 10 Minuten bei 95°C erhitzt, um die Bakterienzellen aufzubrechen und zwei μl der erhitzen Zellen wurden in einer 25 μl PCR- Reaktion unter Verwendung der SXSCLAF2- und STDXSMCSR-Primer verwendet. Das PCR-Gemisch enthielt folgendes: 1 × Taq-PCR-Puffer, 0,2 μM von jedem Primer, 0,2 mM von jedem dNTP, 5% DMSO (v/v) und 1 Einheit Taq-DNA-Polymerase (Roche) pro Reaktion. Die PCR-Reaktion wurde in einem MJ Research PTC100 unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: eine anfängliche Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten; 8 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 54°C für 1 Minute und 72°C für 3,5 Minuten; 24 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 60°C für 1 Minute und 72°C für 3,5 Minuten; und eine abschließende Extension für 7 Minuten bei 72°C.
pMCS2rrnBP/Rsdds
Die Nukleinsäure, die ein R. sphaeroides-Polypeptid kodiert, welches eine DDS-Aktivität besitzt, wurde im pMCS2rrnBP-Vektor wie folgt geklont. Das R. sphaeroides-dds-Gen wurde mittels PCR unter Verwendung des folgenden Primerpaares amplifiziert:
Der Vorwärts-Primer wurde aufwärts vom Startcodon gefunden und fügte einen EcoRI-Restriktionsort ein, während der Rückwärts-Primer abwärts vom Stopcodon gefunden wurde und einen ClaI-Restriktionsort einfügte. Da der Vorwärts-Primer aufwärts gefunden wurde, behielt das R. sphaeroides-dds seine native ribosomale Bindungsstelle. Das folgende Reaktionsgemisch und das PCR-Programm wurden verwendet, um das R. sphaeroides-dds-Gen zu amplifizieren.
Das PCR-Produkt wurde auf einem 1%igen TAE-Agarosegel aufgespalten und ein etwa 1,8 Kb-Fragment wurde herausgeschnitten und gelgereinigt. Die isolierte DNA wurde mit EcoRI und ClaI geschnitten und unter Verwendung eines Qiagen Gelisolationskits über eine Säule gereinigt. Drei μg der pMCS2rrnBP-Vektor-DNA wurde mit EcoRI verdaut und die lineare DNA wurde unter Verwendung eines Qiagen Gelisolationskits gelisoliert. Der Vektor wurde weiterhin mit ClaI verdaut und die DNA wurde über eine Säule gereinigt. Der doppelverdaute Vektor wurde dann mit Shrimp Alkalischer Phosphatase dephosphoryliert und unter Verwendung eines QIAquick PCR Purification Kits gereinigt. Das EcoRI/ClaI-verdaute R. sphaeroides-dds-PCR-Produkt wurde in den präparierten Vektor unter Verwendung von T4-DNA-Ligase für 14–16 Stunden bei 16°C ligiert. Ein μl der Ligationsreaktion wurde in E. coli-Electromax^TM DH10B^TM-Zellen transformiert, die dann auf LBK-(25 μg/ml)Medien ausplattiert wurden. Einzelne Kolonien wurden in etwa 25 μl DI-Wasser resuspendiert und 2 μl der Resuspension wurden auf LBK ausplattiert. Die restliche Resuspension wurde für 10 Minuten bei 95°C erhitzt, um die Bakterienzellen aufzubrechen und 2 μl der erhitzten Zellen wurden in einer 25 μl PCR-Reaktion unter Verwendung der RDS18F- und RSDDSMCSR-Primer verwendet. Das PCR-Gemisch enthielt folgendes: 1 × Taq-PCR-Puffer, 0,2 μM von jedem Primer, 0,2 mM von jedem dNTP, 5% DMSO (v/v) und 1 Einheit Taq-DNA-Polymerase pro Reaktion. Die PCR-Reaktion wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: eine anfängliche Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten; 6 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 45 Sekunden und 72°C für 3 Minuten; 25 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 61°C für 45 Sekunden und 72°C für 3 Minuten; und eine abschließende Extension für 7 Minuten bei 72°C. Das resultierende Plasmid, das die Rsdds-Sequenz unter der Kontrolle des rrnB-Promotors enthielt, wurde pMCS2rrnBP/Rsdds benannt.
Das pMCS2rrnBP/Rsdds-Plasmid wurde in den E. coli-Stamm S17-1 elektroporiert. Dieser Stamm enthält eine chromosomale Kopie der transregulatorischen Elemente, die oriT-enthaltende Plasmide während der Konjugation mit einem zweiten Bakterienstamm mobilisieren. Es trägt auch ein Gen, das eine Resistenz gegen die Antibiotika Streptomycin und Spectinomycin verleiht.
Unter Verwendung des S17-1-Stammes wurde das pMCS2rrnBP/Rsdds-Plasmid durch Konjugation auf R. sphaeroides 35053 übertragen. Einzelne Kolonien wurden durch Wiederaufstreichen auf LBK-Platten gereinigt. Einzelne Kolonien wurden mittels PCR unter Verwendung der RDS18F- und RSDDSMCSR-Primer untersucht, um die Anwesenheit des Inserts, wie vorstehend beschrieben, zu bestätigen.
pMCS2rrnBP/Stdds
Die Nukleinsäure, die ein S. trueperi-Polypeptid kodiert, welches DDS-Aktivität besitzt, wurde im pMCS2rrnBP-Vektor wie folgt geklont. Das S. trueperi-dds-Gen wurde mittels PCR unter Verwendung des folgenden Primerpaares amplifiziert:
Der Vorwärts-Primer wurde aufwärts vom Startcodon gefunden und fügte einen XhoI-Restriktionsort ein, während der Rückwärts-Primer abwärts vom Stopcodon gefunden wurde und einen KpnI-Restriktionsort einfügte. Da der Vorwärts-Primer aufwärts gefunden wurde, behielt das S. trueperi-dds-Fragment seine native ribosomale Bindungsstelle. Das folgende Reaktionsgemisch und das PCR-Programm wurden verwendet, um das S. trueperi-dds-Gen zu amplifizieren.
Das PCR-Produkt wurde auf einem 1%igen TAE-Agarosegel aufgespalten und ein etwa 1,6 Kb-Fragment wurde herausgeschnitten. Die DNA wurde unter Verwendung eines Qiagen Gelisolationskits isoliert. Die isolierte DNA wurde mit XhoI und KpnI geschnitten und unter Verwendung eines Qiagen Gelisolationskits über eine Säule gereinigt. Zwei μg der pMCS2rrnBP-Vektor-DNA wurden mit KpnI verdaut und die lineare DNA wurde unter Verwendung eines Qiagen Gelisolationskits gelisoliert. Der Vektor wurde weiterhin mit XhoI verdaut und die DNA wurde über eine Säule gereinigt. Der doppelverdaute Vektor wurde dann mit Shrimp Alkalischer Phosphatase dephosphoryliert und unter Verwendung eines Qiagen Gel Purification Kits über eine Säule gereinigt. Das XhoI/KpnI-verdaute S. trueperi-dds-PCR-Produkt wurde in den präparierten Vektor unter Verwendung von T4-DNA-Ligase für 14–16 Stunden bei 16°C ligiert. Ein μl der Ligationsreaktion wurde in E. coli-Electromax^TM DH10B^TM-Zellen transformiert, die dann auf LBK-(25 μg/ml)Medien ausplattiert wurden. Einzelne Kolonien wurden in etwa 25 μl DI-Wasser resuspendiert und 2 μl der Resuspension wurden auf LBK ausplattiert. Die restliche Resuspension wurde für 10 Minuten bei 95°C erhitzt, um die Bakterienzellen aufzubrechen und 2 μl der erhitzten Zellen wurden in einer 25 μl PCR-Reaktion unter Verwendung der SHDDSMCSF- und SHDDSMCSR-Primer verwendet. Das PCR-Gemisch enthielt folgendes: 1 × Taq-PCR-Puffer, 0,2 μM von jedem Primer, 0,2 mM von jedem dNTP, 5% DMSO (v/v) und 1 Einheit Taq-DNA-Polymerase pro Reaktion. Die PCR-Reaktion wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: eine anfängliche Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten; 6 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 45 Sekunden und 72°C für 3 Minuten; 25 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 61°C für 45 Sekunden und 72°C für 3 Minuten; und eine abschließende Extension für 7 Minuten bei 72°C. Das resultierende Plasmid, das die Stdds-Sequenz unter der Kontrolle des rrnB-Promotors enthielt, wurde pMCS2rrnBP/Stdds benannt. Das pMCS2rrnBP/Stdds-Plasmid wurde in den E. coli-Stamm S17-1 elektroporiert. Unter Verwendung des S17-1-Stammes wurde das pMCS2rrnBP/Stdds-Plasmid durch Konjugation auf R. sphaeroides 35053 übertragen. Einzelne Kolonien wurden durch Wiederaufstreichen auf LBK-Platten gereinigt. Einzelne Kolonien wurden mittels PCR unter Verwendung der SHDDSMCSF- und SHDDSMCSR-Primer untersucht, um die Anwesenheit des Inserts, wie vorstehend beschrieben, zu bestätigen.
pMCS2glnBP/Rsdds
Die Nukleinsäure, die ein R. sphaeroides-Polypeptid kodiert, welches eine DDS-Aktivität besitzt, wurde im pMCS2glnBP-Vektor wie folgt geklont. Das R. sphaeroides-dds-Gen wurde mittels PCR unter Verwendung des folgenden Primerpaares amplifiziert:
Der Vorwärts-Primer führte einen EcoRI-Restriktionsort und eine ribosomale Bindungsstelle, die basierend auf einem R. sphaeroides-dxs1-Gen gestaltet wurde, ein. Der Rückwärts-Primer führte einen KpnI-Restriktionsort ein. Das folgende Reaktionsgemisch und das PCR-Programm wurden verwendet, um das R. sphaeroides-dds-Gen zu amplifizieren.
Das PCR-Produkt wurde auf einem 1%igen TAE-Agarosegel aufgespalten und ein etwa 1,6 Kb-Fragment wurde herausgeschnitten. Die herausgeschnittene DNA wurde unter Verwendung eines Qiagen Gelisolationskits isoliert. Die isolierte DNA wurde mit EcoRI und KpnI geschnitten und unter Verwendung eines Qiagen Gelisolationskits über eine Säule gereinigt. Drei μg der pMCS2glnBP-Vektor-DNA wurden mit KpnI verdaut und die lineare DNA wurde unter Verwendung eines Qiagen Gelisolationskits gelisoliert. Der Vektor wurde weiterhin mit EcoRI verdaut und die DNA wurde über eine Säule gereinigt. Der doppelverdaute Vektor wurde dann mit Shrimp Alkalischer Phosphatase dephosphoryliert und unter Verwendung eines QIAgen Gel Purification Kits über eine Säule gereinigt. Das KpnI/EcoRI-verdaute R. sphaeroides-dds-PCR-Produkt mit der vorstehend beschriebenen R. sphaeroides-dxs1 ribosomalen Bindungsstelle wurde in den präparierten Vektor unter Verwendung von T4-DNA-Ligase für 14–16 Stunden bei 16°C ligiert. Ein μl der Ligationsreaktion wurde in E. coli-Electromax^TM DH10B^TM-Zellen transformiert, die dann auf LBK-(25 μg/ml)Medien ausplattiert wurden. Einzelne Kolonien wurden in etwa 25 μl DI-Wasser resuspendiert und 2 μl der Resuspension wurden auf LBK ausplattiert. Die restliche Resuspension wurde für 10 Minuten bei 95°C erhitzt, um die Bakterienzellen aufzubrechen und 2 μl der erhitzten Zellen wurden in einer 25 μl PCR-Reaktion unter Verwendung der glnBF- und RSDDSR-Primer verwendet. Das PCR-Gemisch enthielt folgendes: 1 × Taq-PCR-Puffer, 0,2 μM von jedem Primer, 0,2 mM von jedem dNTP, 5% DMSO (v/v) und 1 Einheit Taq-DNA-Polymerase pro Reaktion. Die PCR-Reaktion wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: eine anfängliche Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten; 6 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 45 Sekunden und 72°C für 3 Minuten; 25 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 62°C für 45 Sekunden und 72°C für 3 Minuten; und eine abschließende Extension für 7 Minuten bei 72°C. Eine großangelegte Plasmidpräparation wurde auf einer Kultur einer Kolonie, die das Rsdds-PCR-Produkt enthielt, durchgeführt und die glnBP/Rsdds-Region wurde sequenziert, um das Fehlen von Nukleotidfehlern zu bestätigen. Das resultierende Plasmid, das die Rsdds-Sequenz unter der Kontrolle des glnB-Promotors enthielt, wurde pMCS2glnBP/Rsdds benannt.
Die pMCS2glnBP/Rsdds-Plasmid-DNA wurde in elektrokompetente Zellen des R. sphaeroides-Stammes 35053, sowie in elektrokompetente karotinoidarme mutierte Zellen von 35053 (ATCC 35053/ΔcrtE) elektroporiert. Einzelne Kolonien beider Stämme wurden mittels PCR unter Verwendung der glnBF- und RSDDSR-Primer untersucht, um die Anwesenheit des Inserts, wie vorstehend beschrieben, zu bestätigen.
pMCS2glnBP/Stdds
Die Nukleinsäure, die ein S. trueperi-Polypeptid kodiert, welches eine DDS-Aktivität besitzt, wurde im pMCS2glnBP-Vektor wie folgt geklont. Das S. trueperi-dds-Gen wurde mittels PCR unter Verwendung des folgenden Primerpaares amplifiziert:
Der Vorwärts-Primer führte einen EcoRV-Restriktionsort und eine ribosomale Bindungsstelle, die basierend auf einem R. sphaeroides-dxs1-Gen gestaltet wurde, ein. Der Rückwärts-Primer führte einen KpnI-Restriktionsort ein. Das folgende Reaktionsgemisch und das PCR-Programm wurden verwendet, um das S. trueperi-dds-Gen zu amplifizieren.
Das PCR-Produkt wurde auf einem 1%igen TAE-Agarosegel aufgespalten und ein etwa 1,2 Kb großes Fragment wurde herausgeschnitten. Die herausgeschnittene DNA wurde unter Verwendung eines Qiagen Gelisolationskits isoliert. Die isolierte DNA wurde mit EcoRV und KpnI geschnitten und unter Verwendung eines Qiagen Gelisolationskits über eine Säule gereinigt. Drei μg der pMCS2glnBP-Vektor-DNA wurden mit KpnI verdaut und die lineare DNA wurde unter Verwendung eines Qiagen Gelisolationskits gelisoliert. Der Vektor wurde weiterhin mit EcoRV verdaut und die DNA wurde über eine Säule gereinigt. Der doppelverdaute Vektor wurde dann mit Shrimp Alkalischer Phosphatase dephosphoryliert und unter Verwendung eines Qiagen Gel Purification Kits über eine Säule gereinigt. Das KpnVEcoRV-verdaute S. trueperi-dds-PCR-Produkt mit der ribosomalen Bindungsstelle des R. sphaeroides-dxs1 wurde in den präparierten Vektor unter Verwendung von T4-DNA-Ligase für 14–16 Stunden bei 16°C ligiert. Ein μl der Ligationsreaktion wurde in E. coli-Electromax^TM DH10B^TM-Zellen transformiert, die auf LBK-(25 μg/ml)Medien ausplattiert wurden. Einzelne Kolonien wurden in etwa 25 μl DI-Wasser resuspendiert und 2 μl der Resuspension wurden auf LBK ausplattiert. Die restliche Resuspension wurde für 10 Minuten bei 95°C erhitzt, um die Bakterienzellen aufzubrechen und 2 μl der erhitzten Zellen wurden in einer 25 μl PCR-Reaktion unter Verwendung der glnBF- und RSDDSR-Primer verwendet. Das PCR-Gemisch enthielt folgendes: 1 × Taq-PCR-Puffer, 0,2 μM von jedem Primer, 0,2 mM von jedem dNTP, 5% DMSO (v/v) und 1 Einheit Taq DNA-Polymerase pro Reaktion. Die PCR-Reaktion wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: eine anfängliche Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten; 6 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 58°C für 45 Sekunden und 72°C für 3 Minuten; 25 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 65°C für 45 Sekunden und 72°C für 3 Minuten; und eine abschließende Extension für 7 Minuten bei 72°C. Eine großangelegte Plasmidpräparation wurde auf einer Kultur einer Kolonie, die das Stdds-PCR-Produkt enthielt, durchgeführt und die glnBP/Stdds-Region wurde sequenziert, um das Fehlen von Nukleotidfehlern zu bestätigen. Das resultierende Plasmid, das die Stdds-Sequenz unter der Kontrolle des glnB-Promotors enthielt, wurde pMCS2glnBP/Stdds benannt.
Die pMCS2glnBP/Stdds-Plasmid-DNA wurde in elektrokompetente Zellen des R. sphaeroides-Stammes 35053, sowie in eine karotinoidarme Mutante von 35053 (ATCC 35053/ΔcrtE) elektroporiert. Einzelne Kolonien beider Stämme wurden mittels PCR unter Verwendung der glnBF- und SHDDSKPNR-Primer untersucht, um die Anwesenheit des Inserts, wie vorstehend beschrieben, zu bestätigen.
pMCS2tetP/Stdxs
Die Nukleinsäure, die ein S. trueperi-Polypeptid kodiert, welches eine DXS-Aktivität besitzt, wurde im pMCS2tetP-Vektor wie folgt geklont. Die pMCS2tetP-Plasmid-DNA wurde mit dem Restriktionsenzym KpnI verdaut, mit einem QIAquick PCR Purification Kit gereinigt und mit dem Restriktionsenzym ClaI verdaut. Die Enzymreaktionen wurden durch Erhitzen auf 65°C für 20 Minuten inaktiviert. Die verdaute Vektor-DNA wurde dann mit Shrimp Alkalischer Phophatase dephosphoryliert und auf einem 1%igen TAE-Agarosegel gelgereinigt. Das vorstehend beschriebene Kpn1/ClaI-verdaute PCR-Produkt von S. trueperi-dxs mit der R. sphaeroides-dxs1 ribosomalen Bindungsstelle wurde unter Verwendung von T4-DNA-Ligase für 16 Stunden bei 16°C in den präparierten Vektor ligiert. Ein μl der Ligationsreaktion wurde in E. coli-Electromax^TM DH5α^TM-Zellen transformiert, die auf LBK-Medien ausplattiert wurden. Einzelne Kolonien wurden in etwa 25 μl 10 mM Tris resuspendiert und 2 μl der Resuspension wurden auf LBK ausplattiert. Die restliche Resuspension wurde für 10 Minuten bei 95°C erhitzt, um die Bakterienzellen aufzubrechen und 2 μl der erhitzten Zellen wurden in einer 25 μl PCR-Reaktion unter Verwendung der SXSCLAF2- und SHDXSMCSR-Primer verwendet. Das PCR-Gemisch enthielt folgendes: 1 × Taq-PCR-Puffer, 0,2 μM von jedem Primer, 0,2 mM von jedem dNTP, 5% DMSO (v/v) und 1 Einheit Taq-DNA-Polymerase pro Reaktion. Die PCR-Reaktion wurde in einem MJ Research PTC 100 unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: eine anfängliche Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten; 8 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 54°C für 1 Minute und 72°C für 3,5 Minuten; 24 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 60°C für 1 Minute und 72°C für 3,5 Minuten; und eine abschließende Extension für 7 Minuten bei 72°C. Eine großangelegte Plasmidpräparation wurde auf einer Kultur einer Kolonie, die das PCR-Produkt von S. trueperi-dxs enthielt, durchgeführt und die tetP/Stdxs-Region wurde sequenziert, um das Fehlen von Nukleotidfehlern zu bestätigen. Das resultierende Plasmid, das die Stdxs-Sequenz unter der Kontrolle des tet-Promotors enthielt, wurde pMCS2tetP/Stdxs benannt. Die Plasmid-DNA (pMCS2tetP/Stdxs) wurde in elektrokompetente Zellen des R. sphaeroides-Stammes 35053 und in eine karotinoidarme Mutante von 35053 (ATCC 35053/ΔcrtE) elektroporiert. Einzelne Kolonien beider Stämme wurden, zusammen mit einer E. coli-Kontrolle, mittels PCR unter Verwendung der TETXBAF- und STDXSMCSR-Primer untersucht, um die Anwesenheit des Inserts, wie vorstehend beschrieben, zu bestätigen.
pMCS2tetP/Rsdds
Die Nukleinsäure, die ein R. sphaeroides-Polypeptid kodiert, welches eine DDS-Aktivität besitzt, wurde im pMCS2tetP-Vektor wie folgt geklont. Drei μg der Plasmid-DNA des pMCS2tetP-Vektors wurden mit dem Restriktionsenzym KpnI verdaut. Die verdaute DNA wurde mit einem QIAquick PCR Purification Kit gereinigt und mit dem Restriktionsenzym EcoRI verdaut, danach wurde das Enzym durch Erhitzen auf 65°C für 20 Minuten inaktiviert. Die verdaute Vektor-DNA wurde dann mit Shrimp Alkalischer Phophatase dephosphoryliert und gelgereinigt. Sechzig ng der Vektor-DNA wurden mit 120 ng des vorstehend beschriebenen KpnI/EcoRI-verdauten des R. sphaeroides-dds-PCR-Produktes unter Verwendung von T4-DNA-Ligase bei 16°C für 16 Stunden ligiert. Ein μl der Ligationsreaktion wurde in E. coli-Electromax^TM DH5α^TM-Zellen transformiert, die dann auf LBK-Medien ausplattiert wurden. Einzelne Kolonien wurden in etwa 25 μl 10 mM Tris resuspendiert und 2 μl der Resuspension wurden auf LBK ausplattiert. Die restliche Resuspension wurde für 10 Minuten bei 95°C erhitzt, um die Bakterienzellen aufzubrechen und 2 μl der erhitzten Zellen wurden in einer 25 μl PCR-Reaktion unter Verwendung der TETXBAF- und RSDDSMCSR-Primer verwendet. Das PCR-Gemisch enthielt folgendes: 1 × Taq-PCR-Puffer, 0,2 μM von jedem Primer, 0,2 mM von jedem dNTP, 5% DMSO (v/v) und 1 Einheit Taq-DNA-Polymerase pro Reaktion. Die PCR-Reaktion wurde in einem MJ Research PTC100 unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: eine anfängliche Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten; 8 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 1 Minute und 72°C für 3 Minuten; 24 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 64°C für 1 Minute und 72°C für 3 Minuten; und eine abschließende Extension für 7 Minuten bei 72°C. Plasmid-DNA wurde für eine Kolonie, die das gewünschte Insert enthielt, isoliert und die tetP/Rsdds-Region wurde sequenziert, um das Fehlen von Nukleotidfehlern von der PCR zu bestätigen. Das resultierende Plasmid, das die Rsdds-Sequenz unter der Kontrolle des tet-Promotors enthielt, wurde pMCS2tetP/Rsdds benannt.
Die Plasmid-DNA (pMCS2tetP/Rsdds) wurde in elektrokompetente Zellen der R. sphaeroides-Stämme 35053 und ATCC 35053/ΔcrtE elektroporiert. Einzelne Kolonien beider Stämme wurden, zusammen mit einer E. coli-Kontrolle, mittels PCR unter Verwendung der TETXBAF- und RSDDSMCSR-Primer untersucht, um die Anwesenheit des Inserts, wie vorstehend beschrieben, zu bestätigen.
pMCS2tetP/Stdds
Die Nukleinsäure, die ein S. trueperi-Polypeptid kodiert, welches eine DDS-Aktivität besitzt, wurde im pMCS2tetP-Vektor wie folgt geklont. Drei μg der pMCS2tetP-Plasmid-DNA wurden mit dem Restriktionsenzym KpnI verdaut. Die verdaute DNA wurde gelgereinigt und mit dem Restriktionsenzym EcoRV verdaut. Das Enzym wurde dann durch Erhitzen auf 80°C für 20 Minuten inaktiviert und die DNA wurde mit Shrimp Alkalischer Phophatase dephosphoryliert. Die dephosphorylierte DNA wurde unter Verwendung eines QIAquick PCR Purification Kits gereinigt. Fünfzig μg der Vektor-DNA wurden mit 150 ng des vorstehend beschriebenen KpnI/EcoRV-verdauten S. trueperi-dds-PCR-Produktes unter Verwendung von T4-DNA-Ligase bei 16°C für 16 Stunden ligiert. Ein μl der Ligationsreaktion wurde in E. coli-Electromax^TM DH10B^TM-Zellen transformiert, die dann auf LBK-Medien ausplattiert wurden. Einzelne Kolonien wurden in etwa 25 μl 10 mM Tris resuspendiert und 2 μl der Resuspension wurden auf LBK ausplattiert. Die restliche Resuspension wurde für 10 Minuten bei 95°C erhitzt, um die Bakterienzellen aufzubrechen und 2 μl der erhitzten Zellen wurden in einer 25 μl PCR-Reaktion unter Verwendung der TETXBAF- und STDDSMCSR-Primer verwendet. Das PCR-Gemisch enthielt folgendes: 1 × Taq-PCR-Puffer, 0,2 μM von jedem Primer, 0,2 mM von jedem dNTP, 5% DMSO (v/v) und 1 Einheit Taq-DNA-Polymerase pro Reaktion. Die PCR-Reaktion wurde in einem MJ Research PTC100 unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: eine anfängliche Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten; 8 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 1 Minute und 72°C für 3 Minuten; 24 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 64°C für 1 Minute und 72°C für 3 Minuten; und eine abschließende Extension für 7 Minuten bei 72°C. Plasmid-DNA wurde für eine Kolonie, die das erwünschte Insert enthielt, isoliert und die tetP/Stdds-Region wurde sequenziert, um die DNA-Sequenz des Inserts zu bestätigen. Das resultierende Plasmid, das die Stdds-Sequenz unter der Kontrolle des tet-Promotors enthielt, wurde pMCS2tetP/Stdds benannt.
Die Plasmid-DNA (pMCS2tetP/Stdds) wurde in elektrokompetente Zellen der R. sphaeroides-Stämme 35053 und ATCC 35053/ΔcrtE elektroporiert. Einzelne Kolonien beider Stämme wurden, zusammen mit einer E. coli-Kontrolle, mittels PCR unter Verwendung der TETXBAF- und STDDSMCSR-Primer untersucht, um die Anwesenheit des Inserts, wie vorstehend beschrieben, zu bestätigen.
pMCS2tetP/Stdxs/Rsdds
Nukleinsäure, die ein S. trueperi-Polypeptid kodiert, welches eine DXS-Aktivität besitzt, sowie Nukleinsäure, die ein R. sphaeroides-Polypeptid kodiert, welches eine DDS-Aktivität besitzt, wurde im pMCS2tetP-Vektor wie folgt geklont. Ein Vektor, der sowohl das S. trueperi-dxs-Gen als auch das R. sphaeroides-dds-Gen, jedes hinter einem tet-Promotor, enthielt, wurde unter Verwendung des vorstehend beschriebenen pMCS2tetP/Stdxs- Konstruktes als Startvektor konstruiert. Dieser Vektor wurde mit dem Restriktionsenzym XbaI verdaut, mit einem QIAquick PCR Purification Kit gereinigt und mit dem Restriktionsenzym Bpu10I (Fermentas, Hanover, MD) verdaut. Die Enzymreaktion wurde durch Erhitzen auf 80°C für 20 Minuten inaktiviert. Die verdaute Vektor-DNA wurde dann mit Shrimp Alkalischer Phophatase dephosphoryliert und auf einem 1%igen TAE-Agarosegel gelgereinigt.
Ein PCR-Produkt, das eine tet-Promotor-Region enthält, gefolgt von einem R. sphaeroides-dds-Gen wurde unter Verwendung des vorstehend beschriebenen pMCS2tetP/Rsdds-Konstruktes als Matrize amplifiziert. Das PCR-Gemisch enthielt folgendes: 1 × Native Plus-Pfu-Puffer, 5 ng Plasmid-Matrize, 0,2 μM von jedem Primer, 0,2 mM von jedem dNTP, 5% DMSO (v/v) und 10 Einheiten native Pfu-DNA-Polymerase in einem Endvolumen von 200 μl. Die PCR-Reaktion wurde in einem MJ Research PTC 100 unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: eine anfängliche Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten; 8 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 1 Minute und 72°C für 3 Minuten; 24 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 64°C für 1 Minute und 72°C für 3 Minuten; und eine abschließende Extension für 7 Minuten bei 72°C. Das Amplifizierungsprodukt wurde dann durch Gelelektrophorese unter Verwendung eines 1%igen TAE-Agarosegels getrennt. Ein 1,6 Kb-Fragment wurde aus dem Gel herausgeschnitten und gereinigt. Das gereinigte Fragment wurde mit Bpu10I verdaut, mit einem QIAquick PCR Purification Kit gereinigt, mit einem XbaI-Restriktionsenzym verdaut, wieder mit einem QIAquick PCR Purification Kit gereinigt und auf einem Minigel quantifiziert.
60 ng des präparierten pMCS2tetP/Stdxs-Vektors wurden mit 70 ng des verdauten tetP/Rsdds-PCR-Produktes unter Verwendung von T4-DNA-Ligase bei 16°C für 16 Stunden ligiert. Ein μl der Ligationsreaktion wurde verwendet, um 40 μl E. coli-Electromax^TM DH5α^TM-Zellen zu elektroporieren. Die elektroporierten Zellen wurden auf LBK-Medien ausplattiert. Einzelne Kolonien wurden unter Verwendung der RSDDSMCSF- und STDXSMCSR-Primer untersucht, was eine 4,1 Kb-Bande ergab. Einzelne Kolonien wurden in etwa 25 μl 10 mM Tris resuspendiert und 2 μl der Resuspension wurden auf LBK ausplattiert. Die restliche Resuspension wurde für 10 Minuten bei 95°C erhitzt, um die Bakterienzellen aufzubrechen und 2 μl der erhitzten Zellen wurden in einer 25 μl PCR-Reaktion verwendet. Das PCR-Gemisch enthielt 0,2 μM von jedem Primer, 1 × Genome Advantage (Clontech, Palo Alto, CA) Reaktionspuffer, 1 M GCMelt, 1,1 mM Mg(OAc)₂, 0,2 mM von jedem dNTP und 1 × Genome Advantage Polymerase. Die PCR-Reaktion wurde in einem MJ Research PTC100 durchgeführt und setze sich zusammen aus einer anfänglichen Denaturierung bei 94°C für 1,5 Minuten; 32 Zyklen einer 30 Sekunden dauernden Denaturierung bei 94°C, 1 Minute Annealing bei 60°C und einer 6,5 Minuten dauernden Extension bei 72°C; gefolgt von einer abschließenden Extension bei 72°C für 5 Minuten. Eine großangelegte Plasmiduntersuchung wurde für eine Kolonie, die das erwünschte Insert enthielt, duchgeführt und Plasmid-DNA wurde durch die tetP/Rsdds-Region sequenziert, um das Fehlen von Nukleotidfehlern von der PCR zu bestätigen. Das resultierende Plasmid, das die Stdxs-Sequenz unter der Kontrolle des tet-Promotors, sowie die Rsdds-Sequenz unter der Kontrolle des tet-Promotors enthielt, wurde pMCS2tetP/Stdxs/Rsdds benannt.
Die Plasmid-DNA (pMCS2tetP/Stdxs/Rsdds) wurde in elektrokompetente Zellen der R. sphaeroides-Stämme 35053 und ATCC 35053/ΔcrtE elektroporiert. Einzelne Kolonien beider Stämme wurden, zusammen mit einer E. coli-Kontrolle, mittels PCR unter Verwendung der RSDDSMCSF- und STDDSMCSR-Primer untersucht, um die Anwesenheit des Inserts, wie vorstehend beschrieben, zu bestätigen.
pMCS2tetP/Stdxr
Die Nukleinsäure, die ein S. trueperi-Polypeptid kodiert, welches eine DXR-Aktivität besitzt, wurde im pMCS2tetP-Vektor wie folgt geklont. Das S. trueperi-dxr-Gen wurde unter Verwendung genomischer DNA als Matrize amplifiziert. Die folgenden Primer wurden gestaltet, um einen EcoRV-Restriktionsort und eine ribosomale Bindung, die auf einem R. sphaeroides-dxs1-Gen basiert, am Anfang des amplifizierten Fragments einzufügen und einen KpnI-Ort am Ende des amplifizierten Fragments.
Das PCR-Gemisch enthielt folgendes: 1 × Native Plus-Pfu-Puffer, 200 ng genomische DNA, 0,2 μM von jedem Primer, 0,2 mM von jedem dNTP, 5% DMSO (v/v) und 10 Einheiten native Pfu-DNA-Polymerase in einem Endvolumen von 200 μl. Die PCR-Reaktion wurde in einem MJ Research PTC100 unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: eine anfängliche Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten; 8 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 59°C für 1 Minute und 72°C für 3 Minuten; 24 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 64°C für 1 Minute und 72°C für 3 Minuten; und eine abschließende Extension für 7 Minuten bei 72°C.
Das Amplifizierungsprodukt wurde dann durch Gelelektrophorese unter Verwendung eines 1%igen TAE-Agarosegels getrennt. Ein 1,0 Kb-Fragment wurde aus dem Gel herausgeschnitten und gereinigt. Das gereinigte Fragment wurde gleichzeitig mit den EcoRV- und KpnI-Restriktionsenzymen verdaut, mit einem QIAquick PCR Purification Kit gereinigt und auf einem Minigel überprüft.
Fünfzig ng des oben für das PMCS2tetP/Stdds-Konstrukt beschriebenen EcoRV-, KpnI- verdauten pMCS2tetP-Vektors wurden mit 75 ng des verdauten S. trueperi-dxr-PCR-Produktes unter Verwendung von T4-DNA-Ligase bei 20°C für 4 Stunden ligiert. Ein μl der Ligationsreaktion wurde verwendet, um 40 μl E. coli-Electromax^TM DH10B^TM-Zellen zu elektroporieren, die dann auf LBK-Medien ausplattiert wurden. Einzelne Kolonien wurden ausgewählt und unter Verwendung der TETXBAF- und SXRKPNR-Primer mittels PCR untersucht. Das PCR-Gemisch enthielt folgendes: 1 × Taq-PCR-Puffer, 200 ng genomische DNA, 0,2 μM von jedem Primer, 0,2 mM von jedem dNTP, 5% DMSO (v/v) und 1 Einheit Taq-DNA-Polymerase pro 25 μl Reaktion. Die PCR-Reaktion wurde in einem MJ Research PTC100 unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: eine anfängliche Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten; 32 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 64°C für 1 Minute und 72°C für 3 Minuten; und eine abschließende Extension für 7 Minuten bei 72°C. Eine großangelegte Plasmiduntersuchung wurde für eine Kolonie, die das gewünschte Insert enthielt, duchgeführt und die tetP/Stdxr-Region wurde sequenziert, um die DNA-Sequenz des Inserts zu bestätigen. Das resultierende Plasmid, das die Stdxr-Sequenz unter der Kontrolle des tet-Promotors, enthielt, wurde pMCS2tetP/Stdxr benannt.
Die Plasmid-DNA (pMCS2tetP/Stdxr) wurde in elektrokompetente Zellen der R. sphaeroides-Stämme 35053 und ATCC 35053/ΔcrtE elektroporiert. Einzelne Kolonien beider Stämme wurden, zusammen mit einer E. coli-Kontrolle, mittels PCR unter Verwendung der TETXBAF- und SXRKPNR-Primer untersucht, um die Anwesenheit des Inserts, wie vorstehend beschrieben, zu bestätigen.
pMCS2tetP/Stdxr/Stdds
Nukleinsäure, die ein S. trueperi-Polypeptid kodiert, welches eine DXR-Aktivität besitzt, sowie Nukleinsäure, die ein S. trueperi-Polypeptid kodiert, welches eine DDS-Aktivität besitzt, wurde in den pMCS2tetP-Vektor wie folgt geklont. Ein Vektor, der sowohl das S. trueperi-dxr-Gen als auch das -dds-Gen, jedes hinter einem tet-Promotor, enthielt, wurde unter Verwendung des vorstehend beschriebenen pMCS2tetP/Stdds-Konstruktes als Startvektor konstruiert. Dieser Vektor wurde mit dem Restriktionsenzym XbaI verdaut, mit einem QIAquick PCR Purification Kit gereinigt und mit dem Restriktionsenzym Bpu10I (Fermentas) verdaut. Die Enzymreaktion wurde durch Erhitzen für 20 Minuten auf 80°C inaktiviert. Die verdaute Vektor-DNA wurde dann mit Shrimp Alkalischer Phophatase dephosphoryliert und gelgereinigt.
Ein PCR-Produkt, das eine tet-Promotor-Region enthält, gefolgt von einem S. trueperi-dxr-Gen wurde unter Verwendung des vorstehend beschriebenen pMCS2tetP/Stdxr-Konstruktes als Matrize und den Primern TETBPUF und SXRXBAR amplifiziert. Der SXRXBAR-Primer, der folgende Sequenz hat, wurde gestaltet, um einen XbaI-Restriktionsort am Ende des PCR-Produktes einzufügen.
Das PCR-Gemisch enthielt folgendes: 1 × Native Plus-Pfu-Puffer, 5 ng Plasmid-Matrize, 0,2 μM von jedem Primer, 0,2 mM von jedem dNTP, 5% DMSO (v/v) und 10 Einheiten native Pfu-DNA-Polymerase in einem Endvolumen von 200 μl. Die PCR-Reaktion wurde in einem MJ Research PTC100 unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: eine anfängliche Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten; 8 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 59°C für 1 Minute und 72°C für 3,5 Minuten; 24 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 64°C für 1 Minute und 72°C für 3,5 Minuten; und eine abschließende Extension für 7 Minuten bei 72°C. Das Amplifizierungsprodukt wurde dann durch Gelelektrophorese unter Verwendung eines 1%igen TAE-Agarosegels getrennt. Ein 1,4 Kb-Fragment wurde aus dem Gel herausgeschnitten und gereinigt. Das gereinigte Fragment wurde mit Bpu10I verdaut, mit einem QIAquick PCR Purification Kit gereinigt, mit einem XbaI-Restriktionsenzym verdaut, wieder mit einem QIAquick PCR Purification Kit gereinigt und auf einem Minigel quantifiziert.
Sechzig ng des präparierten PMCS2tetP/Stdds-Vektors wurden mit 80 ng des verdauten tetP/Stdxr-PCR-Produktes unter Verwendung von T4-DNA-Ligase bei 16°C für 16 Stunden ligiert. Ein μl der Ligationsreaktion wurde verwendet, um 40 μl E. coli-Electromax^TM DH10B^TM-Zellen zu elektroporieren, die dann auf LBK-Medien ausplattiert wurden. Einzelne Kolonien wurden mittels PCR unter Verwendung der SXREVF- und SDSKPNR-Primer untersucht. Kolonien wurden in etwa 25 μl 10 mM Tris resuspendiert und 2 μl der Resuspension wurden auf LBK ausplattiert. Die restliche Resuspension wurde für 10 Minuten bei 95°C erhitzt, um die Bakterienzellen aufzubrechen und 2 μl der erhitzten Zellen wurden in einer 25 μl PCR-Reaktion verwendet. Das PCR-Gemisch enthielt folgendes: 1 × Taq-PCR-Puffer, 0,2 μM von jedem Primer, 0,2 mM von jedem dNTP, 5% DMSO (v/v) und 1 Einheit Taq-DNA-Polymerase pro Reaktion. Die PCR-Reaktion wurde in einem MJ Research PTC100 unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: eine anfängliche Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten; 8 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 58°C für 1 Minute und 72°C für 4,5 Minuten; 24 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 64°C für 1 Minute und 72°C für 4,5 Minuten; und eine abschließende Extension für 7 Minuten bei 72°C. Eine großangelegte Plasmiduntersuchung wurde für eine Kolonie, die das gewünschte Insert enthielt, duchgeführt und die tetP/Stdxr-Region wurde sequenziert, um das Fehlen von Nukleotidfehlern von der PCR zu bestätigen. Das resultierende Plasmid, das die Stdxr-Sequenz unter der Kontrolle des tet-Promotors, und die Stdds-Sequenz unter der Kontrolle des tet-Promotors enthielt, wurde pMCS2tetP/Stdxr/Stdds benannt.
Die Plasmid-DNA (pMCS2tetP/Stdxr/Stdds) wurde in elektrokompetente Zellen der R. sphaeroides-Stämme 35053 und ATCC 35053/ΔcrtE elektroporiert. Einzelne Kolonien beider Stämme wurden, zusammen mit einer E. coli-Kontrolle, mittels PCR unter Verwendung der SXREVF- und SDSKPNR-Primer untersucht, um die Anwesenheit des Inserts, wie vorstehend beschrieben, zu bestätigen.
pMCS2tetP/EcUbiC
Die Nukleinsäure, die ein E. coli-Polypeptid kodiert, welches eine Chorismatlyaseaktivität besitzt, wurde in den pMCS2tetP-Vektor wie folgt geklont. Das E. coli-ubiC-Gen wurde unter Verwendung genomischer DNA des E. coli-Stammes DH10B als Matrize amplifiziert. Die folgenden Primer wurden gestaltet, um einen EcoRV-Restriktionsort und eine ribosomale Bindungsstelle, die auf einem R. sphaeroides-dxs1-Gen basiert, am Anfang des amplifizierten Fragments einzufügen und einen KpnI-Ort am Ende des amplifizierten Fragments.
Das PCR-Gemisch enthielt folgendes: 1 × Native Plus-Pfu-Puffer, 200 ng genomische DNA, 0,2 μM von jedem Primer, 0,2 mM von jedem dNTP und 10 Einheiten native Pfu-DNA-Polymerase in einem Endvolumen von 200 μl. Die PCR-Reaktion wurde in einem MJ Research PTC100 unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: eine anfängliche Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten; 8 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 57°C für 1 Minute und 72°C für 2,5 Minuten; 24 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 64°C für 1 Minute und 72°C für 2,5 Minuten; und eine abschließende Extension für 7 Minuten bei 72°C. Das Amplifizierungsprodukt wurde dann durch Gelelektrophorese unter Verwendung eines 1,5%igen TAE-Agarosegels getrennt. Ein 650 bp-Fragment wurde aus dem Gel herausgeschnitten und gereinigt. Das gereinigte Fragment wurde mit EcoRV verdaut, mit einem QIAquick PCR Purification Kit gereinigt, mit einem KpnI-Restriktionsenzym verdaut, wiederum mit einem QIAquick PCR Purification Kit gereinigt und auf einem Minigel quantifiziert.
Fünfundsiebzig ng des oben für das PMCS2tetP/Stdds-Konstrukt beschriebenen EcoRV, KpnI-verdauten pMCS2tetP-Vektors wurden mit 70 ng des verdauten ubiC-PCR-Produktes unter Verwendung von T4-DNA-Ligase bei 16°C für 16 Stunden ligiert. Ein μl der Ligationsreaktion wurde verwendet, um 40 μl E. coli-Electromax^TM DH5α^TM-Zellen zu elektroporieren, die dann auf LBK-Medien ausplattiert wurden. Einzelne Kolonien wurden in etwa 25 μl 10 mM Tris resuspendiert und 2 μl der Resuspension wurden auf LBK ausplattiert. Die restliche Resuspension wurde für 10 Minuten bei 95°C erhitzt, um die Bakterienzellen aufzubrechen und 2 μl der erhitzten Zellen wurden in einer 25 μl PCR-Reaktion unter Verwendung der TETXBAF- und UBICKPNR-Primer verwendet. Das PCR-Gemisch enthielt folgendes: 1 × Taq-PCR-Puffer, 0,2 μM von jedem Primer, 0,2 mM von jedem dNTP und 1 Einheit Taq-DNA-Polymerase pro Reaktion. Die PCR-Reaktion wurde in einem MJ Research PTC100 unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: eine anfängliche Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten; 32 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 62°C für 1 Minute und 72°C für 2 Minuten; und eine abschließende Extension für 7 Minuten bei 72°C. Eine großangelegte Plasmiduntersuchung wurde für eine Kolonie, die das gewünschte Insert enthielt, duchgeführt und die tetP/ubiC-Region wurde sequenziert, um die DNA-Sequenz des Inserts zu bestätigen. Das resultierende Plasmid, das die UbiC-Sequenz unter der Kontrolle des tet-Promotors, enthielt, wurde pMCS2tetP/EcUbiC benannt.
Die Plasmid-DNA (pMCS2tetP/EcUbiC) wurde in elektrokompetente Zellen der R. sphaeroides-Stämme 35053 und ATCC 35053/ΔcrtE elektroporiert. Einzelne Kolonien beider Stämme wurden, zusammen mit einer E. coli-Kontrolle, mittels PCR unter Verwendung der TETXBAF- und UBICKPNR-Primer untersucht, um die Anwesenheit des Inserts, wie vorstehend beschrieben, zu bestätigen, mit einem Zusatz von 5% DMSO (v/v) zur PCR-Reaktion.
pMCS2tetP/Stdxs/Rsdds/EcUbiC
Nukleinsäure, die ein S. trueperi-Polypeptid kodiert, welches eine DXS-Aktivität besitzt, sowie Nukleinsäure, die ein R. sphaeroides-Polypeptid kodiert, welches eine DDS-Aktivität besitzt, und Nukleinsäure, die ein E. coli-Polypeptid kodiert, welches eine Chorismatlyaseaktivität besitzt, wurden in den pMCS2tetP-Vektor wie folgt geklont. Ein Vektor, der sowohl das S. trueperi-dxs-Gen als auch das R. sphaeroides-dds-Gen als auch das E. coli-ubiC-Gen, jedes hinter einem tet-Promotor, enthielt, wurde unter Verwendung des vorstehend beschriebenen pMCS2tetP/Stdxs/Rsdds-Konstruktes als Startvektor konstruiert. Dieser Vektor wurde mit dem Restriktionsenzym KpnI verdaut, mit einem QIAquick PCR Purification Kit gereinigt und mit dem Restriktionsenzym NsiI verdaut. Die Enzymreaktion wurde durch Erhitzen für 20 Minuten auf 65°C inaktiviert. Die verdaute Vektor-DNA wurde dann mit Shrimp Alkalischer Phophatase dephosphoryliert und gelgereinigt.
Ein PCR-Produkt, das eine tet-Promotor-Region enthält, gefolgt von einem E. coli-ubiC-Gen wurde unter Verwendung des vorstehend beschriebenen pMCS2tetP/EcUbiC-Konstruktes als Matrize amplifiziert. Die folgenden Primer wurden gestaltet, um einen KpnI-Restriktionsort am Anfang des amplifizierten Fragments einzufügen und einen NsiI-Ort am Ende des amplifizierten Fragments.
Das PCR-Gemisch enthielt folgendes: 1 × Native Plus-Pfu-Puffer, 5 ng Plasmid-Matrize, 0,2 μM von jedem Primer, 0,2 mM von jedem dNTP, 5% DMSO (v/v) und 10 Einheiten native Pfu-DNA-Polymerase in einem Endvolumen von 200 μl. Die PCR-Reaktion wurde in einem MJ Research PTC100 unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: eine anfängliche Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten; 8 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 62°C für 1 Minute und 72°C für 2,5 Minuten; 24 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 66°C für 1 Minute und 72°C für 2,5 Minuten; und eine abschließende Extension für 7 Minuten bei 72°C. Das Amplifizierungsprodukt wurde dann durch Gelelektrophorese unter Verwendung eines 1%igen TAE-Agarosegels getrennt. Ein 850 bp-Fragment wurde aus dem Gel herausgeschnitten und gereinigt. Das gereinigte Fragment wurde mit dem Restriktionsenzym NsiI verdaut, mit einem QIAquick PCR Purification Kit gereinigt, mit dem Restriktionsenzym KpnI verdaut, wieder mit einem QIAquick PCR Purification Kit gereinigt und auf einem Minigel quantifiziert.
Fünfzig ng des präparierten PMCS2tetP/Stdxs/Rsdds-Vektors wurden mit 35 ng des verdauten tetP/Stdxr-PCR-Produktes unter Verwendung von T4-DNA-Ligase bei 16°C für 16 Stunden ligiert. Ein μl der Ligationsreaktion wurde verwendet, um 40 μl E. coli-Electromax^TM DH10B^TM-Zellen zu elektroporieren, die dann auf LBK-Medien ausplattiert wurden. Einzelne Kolonien wurden in etwa 25 μl 10 mM Tris resuspendiert und 2 μl der Resuspension wurden auf LBK ausplattiert. Die restliche Resuspension wurde für 10 Minuten bei 95°C erhitzt, um die Bakterienzellen aufzubrechen und 2 μl der erhitzten Zellen wurden in einer 25 μl PCR-Reaktion unter Verwendung der SXSCLAF2- und UBICNSIR-Primer verwendet. Das PCR-Gemisch enthielt 1 × GC-RICH PCR-Reaktions-Puffer, 1,0 M GC-RICH-Resolution-Lösung, 0,2 μM von jedem Primer, 0,2 mM von jedem dNTP und 1 Einheit GC-RICH Enzymmischung pro Reaktion (Roche). Die PCR-Reaktion wurde in einem MJ Research PTC 100 unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: eine anfängliche Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten; 8 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 60°C für 1 Minute und 72°C für 5 Minuten; 24 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 64°C für 1 Minute und 72°C für 5 Minuten; und eine abschließende Extension für 7 Minuten bei 72°C. Eine großangelegte Plasmiduntersuchung wurde für eine Kolonie, die das erwünschte Insert enthielt, duchgeführt und die Plasmid-DNA wurde durch die tetP/ubiC-Region sequenziert, um das Fehlen von Nukleotidfehlern von der PCR zu bestätigen. Das resultierende Plasmid, das die Stdxs-Sequenz unter der Kontrolle des tet-Promotors, die Rsdds-Sequenz unter der Kontrolle des tet-Promotors und die UbiC-Sequenz unter der Kontrolle des tet-Promotors enthielt, wurde pMCS2tetP/Stdxs/Rsdds/EcUbiC benannt.
Die Plasmid-DNA (pMCS2tetP/Stdxs/Rsdds/EcUbiC) wurde in elektrokompetente Zellen der R. sphaeroides-Stämme 35053 und ATCC 35053/ΔcrtE elektroporiert. Einzelne Kolonien beider Stämme wurden, zusammen mit einer E. coli-Kontrolle, mittels PCR unter Verwendung der SXSCLAF2- und UBICNSIR-Primer untersucht, um die Anwesenheit des Inserts, wie vorstehend beschrieben, zu bestätigen.
pMCS2tetP/RsLytB
Die Nukleinsäure, die ein LytB R. sphaeroides-Polypeptid kodiert, wurde in den pMCS2tetP-Vektor wie folgt geklont. Das R. sphaeroides lytB wurde durch TBLASTN-Analyse seines Genoms unter Verwendung einer E. coli lytB-Sequenz als Anfrage identifiziert. Basierend auf der identifizierten Sequenz, wurden die folgenden Primer gestaltet, um das Gen mittels PCR zu amplifizieren:
Die Primer führten einen HindIII-Restriktionsort und eine ribosomale Bindungsstelle am 5'-Ende und einen KpnI-Restriktionsort am 3'-Ende ein. Das folgende Reaktionsgemisch und das PCR-Programm wurden verwendet, um das lytB-Gen zu amplifizieren.
Das PCR-Produkt wurde auf einem 1%igen TAE-Agarosegel aufgetrennt und ein etwa 1,1 Kb-Fragment wurde herausgeschnitten. Die herausgeschnittene DNA wurde unter Verwendung eines Qiagen Gelisolationskits isoliert. Die isolierte DNA wurde mit HindIII und KpnI geschnitten und unter Verwendung eines Qiagen Gelisolationskits über eine Säule gereinigt. Zwei μg der pMCS2tetP-Vektor-DNA wurde mit HindIII verdaut und die lineare DNA wurde unter Verwendung eines Qiagen Gelisolationskits gelisoliert. Der Vektor wurde weiterhin mit KpnI verdaut und die DNA wurde über eine Säule gereinigt. Der doppelverdaute Vektor wurde dann mit Shrimp Alkalischer Phosphatase dephosphoryliert und unter Verwendung eines Qiagen Gel Purification Kits über eine Säule gereinigt. Das KpnI/HindIII-verdaute R. sphaeroides-lytB-PCR-Produkt mit der vorstehend beschriebenen R. sphaeroides-dxs1 ribosomalen Bindungsstelle wurde in den präparierten Vektor unter Verwendung von T4-DNA-Ligase für 14–16 Stunden bei 16°C ligiert. Ein μl der Ligationsreaktion wurde in E. coli-Electromax^TM DH10B^TM-Zellen transformiert, die dann auf LBK-(25 μg/ml)Medien ausplattiert wurden. Einzelne Kolonien wurden in etwa 25 μl DI-Wasser resuspendiert und 2 μl der Resuspension wurden auf LBK ausplattiert. Die restliche Resuspension wurde für 10 Minuten bei 95°C erhitzt, um die Bakterienzellen aufzubrechen und 2 μl der erhitzten Zellen wurden in einer 25 μl PCR-Reaktion unter Verwendung der LYTBHINDF- und LYTBKPNR-Primer verwendet. Das PCR-Gemisch enthielt folgendes: 1 × Taq-PCR-Puffer, 0,2 μM von jedem Primer, 0,2 mM von jedem dNTP, 5% DMSO (v/v) und 1 Einheit Taq-DNA-Polymerase pro Reaktion. Die PCR-Reaktion wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: eine anfängliche Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten; 8 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 59°C für 1 Minute und 72°C für 3 Minuten; 24 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 66°C für 1 Minute und 72°C für 3 Minuten; und eine abschließende Extension für 7 Minuten bei 72°C. Eine großangelegte Plasmidpräparation wurde auf einer Kultur einer Kolonie, die das lytB-PCR-Produkt enthielt, durchgeführt und die tetP/lytB-Region wurde sequenziert, um das Fehlen von Nukleotidfehlern zu bestätigen. Das resultierende Plasmid, das die RsLytB-Sequenz unter der Kontrolle des tet-Promotors enthielt, wurde pMCS2tetP/RsLytB benannt.
Die Plasmid-DNA (pMCS2tetP/RsLytB) wurde in elektrokompetente Zellen des R. sphaeroides-Stammes 35053 und in eine karotinoidarme Mutante von 35053 (ATCC 35053/ΔcrtE) elektroporiert. Einzelne Kolonien beider Stämme wurden zusammen mit einer E. coli-Kontrolle mittels PCR unter Verwendung der TETXBAF- und LYTBKPNR-Primer untersucht, um die Anwesenheit des Inserts, wie vorstehend beschrieben, zu bestätigen.
pMCS2tetP/Stdxs/Rsdds/RsLytB
Nukleinsäure, die ein S. trueperi-Polypeptid kodiert, welches eine DXS-Aktivität besitzt, sowie Nukleinsäure, die ein R. sphaeroides-Polypeptid kodiert, welches eine DDS-Aktivität besitzt, und Nukleinsäure, die LytB von R. sphaeroides kodiert, wurde in den pMCS2tetP-Vektor wie folgt geklont. Das R. sphaeroides-lytB-Gen wurde geklont und exprimiert, zusammen mit den R. sphaeroides-dds- und S. trueperi-dxs-Genen. In diesem dreifachen Expressionssystem wurde jedes Gen durch seinen eigenen tetP exprimiert. Das R. sphaeroides-lytB-Gen wurde zusammen mit tetP unter Verwendung der folgenden Primer mittels PCR amplifiziert.
Das folgende PCR-Gemisch und das PCR-Programm wurden verwendet, um das lytB-Gen zusammen mit dem tetP mittels PCR zu amplifizieren.
In dieser PCR-Reaktion wurde die pMCS2tetP/RsLytB-Plasmid-DNA als Matrize verwendet. Das PCR-Produkt wurde auf einem 1%igen TAE-Agarosegel aufgetrennt und ein etwa 1,4 Kb großes Fragment wurde herausgeschnitten. Die herausgeschnittene DNA wurde unter Verwendung eines Qiagen Gelisolationskits isoliert. Die isolierte DNA wurde mit NsiI und KpnI geschnitten und unter Verwendung eines Qiagen Gelisolationskits über eine Säule gereinigt. Zwei μg der pMCS2tetP/Stdxs/Rsdds-Plasmid-DNA wurden mit NsiI verdaut und die lineare DNA wurde unter Verwendung eines Qiagen Gelisolationskits gelisoliert. Der Vektor wurde weiterhin mit KpnI verdaut und die DNA wurde über eine Säule gereinigt. Der doppelverdaute Vektor wurde dann mit Shrimp Alkalischer Phosphatase dephosphoryliert und unter Verwendung eines Qiagen Gel Purification Kits über eine Säule gereinigt. Das KpnI/NsiI-verdaute PCR-Produkt wurde in das präparierte Plasmid unter Verwendung von T4-DNA-Ligase für 14–16 Stunden bei 16°C ligiert. Ein μl der Ligationsreaktion wurde in E. coli-Electromax^TM DH10B^TM-Zellen transformiert, die dann auf LBK-(25 μg/ml)Medien ausplattiert wurden. Einzelne Kolonien wurden in etwa 25 μl DI-Wasser resuspendiert und 2 μl der Resuspension wurden auf LBK ausplattiert. Die restliche Resuspension wurde für 10 Minuten bei 95°C erhitzt, um die Bakterienzellen aufzubrechen und 2 μl der erhitzten Zellen wurden in einer 25 μl PCR-Reaktion unter Verwendung der SXSCLAF2- und LYTBNSIR-Primer verwendet. Das PCR-Gemisch enthielt folgendes: 1 × Taq-PCR-Puffer, 0,2 μM von jedem Primer, 0,2 mM von jedem dNTP, 5% DMSO (v/v) und 1 Einheit Taq-DNA-Polymerase pro Reaktion. Die PCR-Reaktion wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: eine anfängliche Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten; 6 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 59°C für 45 Sekunden und 72°C für 4 Minuten; 25 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 65°C für 45 Sekunden und 72°C für 4 Minuten; und eine abschließende Extension für 7 Minuten bei 72°C. Eine großangelegte Plasmidpräparation wurde auf einer Kultur einer Kolonie, die das korrekte Insert enthielt, durchgeführt und die tetP/lytB-Region wurde sequenziert, um das Fehlen von Nukleotidfehlern zu bestätigen. Das resultierende Plasmid, das die Stdxs-Sequenz unter der Kontrolle des tet-Promotors, die Rsdds-Sequenz unter der Kontrolle des tet-Promotors und die LytB-Sequenz unter der Kontrolle des tet-Promotors enthielt, wurde pMCS2tetP/Stdxs/Rsdds/RsLytB benannt.
Die Plasmid-DNA (pMCS2tetP/Stdxs/Rsdds/RsLytB) wurde in elektrokompetente Zellen des R. sphaeroides-Stammes 35053 und in eine karotinoidarme Mutante von 35053 (ATCC 35053/ΔcrtE) elektroporiert. Einzelne Kolonien beider Stämme wurden mittels PCR unter Verwendung der SXSCLAF2- und LYTBNSIR-Primer untersucht, um die Anwesenheit des Inserts, wie vorstehend beschrieben, zu bestätigen.
Beispiel 9 – Herstellung rekombinanter Mikroorganismen, die Knock-outs enthalten
Verschiedene Nukleinsäuresequenzen innerhalb des R. sphaeroides-Genoms wurden ausgeschaltet. Alle Restriktionsenzyme und die T4-DNA-Ligase wurden, wenn nicht anders angegeben, von New England Biolabs (Beverly, MA) bezogen. Alle Plasmid-DNA-Präparationen wurden unter Verwendung des QIAprep Spin Miniprep Kits oder des Qiagen Maxi Prep Kits durchgeführt und alle Gelreinigungen wurden unter Verwendung des QIAquick Gel Extraction Kits (Qiagen, Valencia, CA) durchgeführt.
ATCC 35053/ΔcrtE(kan)
R. sphaeroides-Zellen, denen crtE fehlt, wurden durch Einfügen eines Kanamycin-Resistenz-Gens in die crtE-Sequenz wie folgt hergestellt. Im Allgemeinen wurde das crtE-Gen von R. sphaeroides in einen pUC19-Vektor geklont und ein Kanamycin-Gen (kan) wurde in das Gen eingefügt, um es zu inaktivieren. Das crtE-kan-Insert wurde mittels PCR amplifiziert und in pSUP203, ein mobilisierbares auf ColE1 basierendes Plasmid, das in R. sphaeroides nicht behalten wird, wenn es nicht in ein R. sphaeroides-Replikon eingebaut ist, geklont. Dieses Plasmid wurde in den E. coli-Stamm S17-1, einen Stamm, der oriT-enthaltende Plasmide in Konjugationen mit einem zweiten Bakterienstamm mobilisieren kann, transformiert. Der S17-1-Stamm wurde mit dem R. sphaeroides-Stamm 35053 konjugiert und Kolonien, in denen das crtE-kan-Insert das native crtE-Gen ersetzt hatte, wurden identifiziert.
Das crtE-Gen des R. sphaeroides-Stammes 17023 wurde, unter Verwendung von Primer, die gestaltet wurden, um einen SphI-Restriktionsort am Anfang des amplifizierten Fragments und einen XbaI-Restriktionsort am Ende des amplifizierten Fragments einzufügen, mittels PCR amplifiziert. Die Sequenzen der Primer waren wie folgt.
Das amplifizierte Fragment enthielt das crtE-Gen zusammen mit 85 Nukleotiden aufwärts des translatorischen Startcodons und 228 Nukleotide abwärts des translatorischen Stopcodons. Das PCR-Reaktionsgemisch enthielt 0,2 μM von jedem Primer, 1 × GC genomischen PCR-Puffer (Clontech, Palo Alto, CA), 1 M GC-Melt, 1,1 mM Mg(OAc)₂, 0,2 mM von jedem dNTP, 1 × Advantage-GC genomische Polymerase-Mischung und 1 ng genomische DNA pro μl Reaktionsgemisch. Die PCR-Reaktion wurde in einem Perkin Elmer Geneamp 2400 durchgeführt und setze sich zusammen aus einer anfänglichen Denaturierung bei 94°C für 30 Sekunden; 35 Zyklen einer 15 Sekunden dauernden Denaturierung bei 94°C, einem einminütigen Annealing bei 55°C und einer 3 Minuten dauernden Extension bei 72°C; gefolgt von einer abschließenden Extension bei 72°C für 5 Minuten. Fünfzig μl des PCR-Produktes wurden auf einem 1%igen Tris-Acetat-EDTA-(TAE)Agarosegel aufgetrennt. Ein 1180 bp-Fragment wurde gelgereinigt und die gereinigte DNA wurde mit den XbaI- und SphI-Restriktionsenzymen (Promega, Madison, WI) verdaut.
Der pUC19-Vektor wurde mit den Restriktionsenzymen SphI und XbaI verdaut und auf einem 1%igen TAE-Agarosegel gelgereinigt. Fünfzig ng des gereinigten Vektors wurden mit etwa 150 ng des verdauten crtE-PCR-Produktes für 16 Stunden bei 14°C unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) ligiert. Ein μl der Ligationsreaktion wurde in ElectroMAX^TM DH10B^TM-Zellen (Life Technologies, Gaithersburg, MD) transformiert, die dann auf LBK-Medien, welche 100 μg/ml Ampicillin und 50 μg/ml 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-B-D-Galactopyranosid (LBKX) enthielten, ausplattiert. Einzelne weiße Kolonien wurden in etwa 20 μl 10 mM Tris resuspendiert und 2 μl der Resuspension wurden auf LBKX-Medien ausplattiert. Die restliche Resuspension wurde für 10 Minuten bei 95°C erhitzt, um die Bakterienzellen aufzubrechen und 2 μl der erhitzten Zellen wurden in einer 25 μl PCR-Reaktion unter Verwendung der CRTESPHF- und CRTEXBAR-Primer verwendet. Das PCR-Reaktionsgemisch enthielt 0,2 μM von jedem Primer, 1 × GC genomischen PCR-Puffer, 1 M GCMelt, 1,1 mM Mg(OAc)₂, 0,2 mM von jedem dNTP und 1 × Advantage-GC genomische Polymerase-Mischung. Die PCR-Reaktion wurde in einem Perkin Elmer Geneamp 2400 durchgeführt und setze sich zusammen aus einer anfänglichen Denaturierung bei 94°C für 30 Sekunden; 35 Zyklen einer 15 Sekunden dauernden Denaturierung bei 94°C, einem einminütigen Annealing bei 55°C und einer 3 Minuten dauernden Extension bei 72°C; gefolgt von einer abschließenden Extension bei 72°C für 5 Minuten. Plasmid-DNA wurde für Kolonien, die ein crtE-Gen-Insert besitzen, isoliert und mit den Restriktionsenzymen HindIII und einer Mischung aus SphI und XbaI verdaut, um die Struktur des Vektors zu bestätigen.
Ein μg des pUC19crtE-Konstuktes wurde mit den XhoI- und StuI-Restriktionsenzymen verdaut. Diese Enzyme schnitten ein 273 bp-DNA-Fragment aus dem Zentrum des crtE-Gens. Die verdaute DNA wurde auf einem 1%igen TAE-Agarosegel aufgetrennt. Ein 3,6 Kb-Fragment, das pUC19 darstellt und die restlichen Enden des crtE-Gens wurden ausgeschnitten und gereinigt.
Das Kanamycin-Resistenz-Gen wurde, unter Verwendung von Primer, die gestaltet wurden, um einen StuI-Restriktionsort am Anfang des amplifizierten Fragments und einen XhoI-Restriktionsort am Ende des amplifizierten Fragments einzufügen, mittels PCR aus dem PCRII-Vektor (Invitrogen, Carlsbad, CA) amplifiziert. Die Sequenzen der Primer waren wie folgt.
Das PCR-Gemisch enthielt 0,2 μM von jedem Primer, 1 × Pfu-Reaktions-Puffer (Stratagene, La Jolla, CA), 0,2 mM von jedem dNTP, 8 Einheiten Pfu und 5 ng des PCRII-Vektors in einer 200 μl-Reaktion. Die PCR-Reaktion wurde in einem Perkin Elmer Geneamp 2400 durchgeführt und setzte sich zusammen aus einer anfänglichen Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten; 8 Zyklen einer 30 Sekunden dauernden Denaturierung bei 94°C, einem einminütigen Annealing bei 55°C und einer 2,5minütigen Extension bei 72°C; 24 Zyklen einer 30 Sekunden dauernden Denaturierung bei 94°C, einem einminütigen Ausglühen bei 55°C und einer 2,5minütigen Extension bei 72°C; gefolgt von einer abschließenden Extension bei 72°C für 5 Minuten. Das PCR-Produkt wurde auf einem 1%igen TAE-Agarosegel getrennt und ein 1,2 Kb-Fragment wurde herausgeschnitten und gereinigt. Ein μg des gereinigten Fragments wurde mit XhoI- und StuI-Restriktionsenzymen verdaut und unter Verwendung eines QIAquick PCR Purification Kits gereinigt.
Fünfzig ng der gereinigten pUC19crtE-Vektor-DNA wurden mit 75 ng des verdauten kan-PCR-Produktes für 16 Stunden bei 14°C unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (Roche) ligiert. Ein μl des Ligationsgemisches wurde in 40 μl elektrokompentete E. coli-ElectroMAX^TM DH10B^TM-Zellen elektroporiert, die dann auf LB-Medien, welche 100 μg/ml Ampicillin und 50 μg/ml Kanamycin (LBKX) enthielten, ausplattiert. Plasmid-DNA wurde von Kulturen verschiedener Kolonien isoliert und wurde in separaten Reaktionen mit den Restriktionsenzymen PstI, SphI und einer StuI/XbaI-Mischung verdaut, um die korrekte Vektor-Struktur zu bestätigen.
Das crtE-Gen mit dem eingefügten kan-Gen wurde unter Verwendung von Primer, die gestaltet wurden, um ScaI-Restriktionsorte an beiden Enden des Fragments zu haben, mittels PCR amplifiziert. Die Sequenzen der Primer waren wie folgt.
Das PCR-Reaktionsgemisch enthielt 0,2 μM von jedem Primer, 1 × GC genomischen PCR-Puffer, 1 M GCMelt, 1,1 mM Mg(OAc)₂, 0,2 mM von jedem dNTP, 1 × Advantage-GC genomische Polymerase-Mischung und 1 ng Plasmid-DNA pro μl Reaktionsgemisch. Die PCR-Reaktion wurde in einem Perkin Elmer Geneamp 9600 durchgeführt und setze sich zusammen aus einer anfänglichen Denaturierung bei 94°C für 1 Minute; 8 Zyklen einer 30 Sekunden dauernden Denaturierung bei 94°C, einem einminütigen Annealing bei 55°C und einer 4 Minuten dauernden Extension bei 72°C; 25 Zyklen einer 30 Sekunden dauernden Denaturierung bei 94°C, einem einminütigen Annealing bei 60°C und einer 4 Minuten dauernden Extension bei 72°C; gefolgt von einer abschließenden Extension bei 72°C für 5 Minuten. 200 μl des PCR-Produkts wurden auf einem 1%igen TAE-Agarosegel aufgetrennt. Ein 2,0 Kb-Fragment wurde ausgeschnitten und gereinigt. Ein μg der gereinigten DNA wurde mit dem ScaI-Restriktionsenzym verdaut und die verdaute DNA wurde unter Verwendung eines QIAquick PCR Purification Kits gereinigt.
2,3 μg der pSUP203-Plasmid-DNA wurden mit dem ScaI-Restriktionsenzym verdaut. Die verdaute DNA wurde auf einem 1%igen TAE-Agarosegel aufgespalten und ein 7,6 Kb-Fragment wurde ausgeschnitten und gereinigt. Die gereinigte Plasmid-DNA wurde dann unter Verwendung von intestinaler Alkalischer Phosphatase vom Kalb (Promega) dephosphoryliert. 75 ng der dephosphorylierten Plasmid-DNA wurden mit 60 ng und 120 ng des ScaI-verdauten crtE-kan-PCR-Produktes für 16 Stunden bei 14°C unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (New England BioLabs) ligiert. Ein μl des Ligationsgemisches wurde in 40 μl elektrokompentete E. coli-ElectroMAX^TM DH10B^TM-Zellen elektroporiert, die dann auf LB-Medien, welche 10 μg/ml Tetracyclin, wogegen pSUP203 ein Resistenzgen trägt und 25 μg/ml Kanamycin enthielten, ausplattiert. Plasmid-DNA wurde von Kulturen einzelner Kolonien isoliert und mit dem ScaI-Restriktionsenzym verdaut, um die Insert-Größe zu überprüfen. 100 ng einer aus einer bestätigten Kolonie stammenden Plasmid-DNA wurden in elektrokompetente Zellen des E. coli-Stammes S17-1 elektroporiert. Dieser Stamm enthält eine chromosomale Kopie der transregulatorischen Elemente, die oriT-enthaltende Plasmide während der Konjugation mit einem zweiten Bakterienstamm mobilisieren. Es trägt auch ein Gen, das eine Resistenz gegen die Antibiotika Streptomycin und Spectinomycin verleiht. Die Transformationsreaktion wurde auf LB-Medien mit 10 μg/ml Tetracyclin, 25 μg/ml Kanamycin und 25 μg/ml Streptomycin ausplattiert. Einzelne Kolonien wurden in etwa 20 μl 10 mM Tris resuspendiert und für 10 Minuten bei 95°C erhitzt, um die Bakterienzellen aufzubrechen. 2 μl der erhitzten Zellen wurden in einer 25 μl PCR-Reaktion unter Verwendung der CRTESCAF- und CRTESCAR-Primer verwendet; um die Anwesenheit des crtE-kan-Inserts zu bestätigen. Das PCR-Reaktionsgemisch enthielt 0,2 μM von jedem Primer, 1 × GC genomischen PCR-Puffer, 1 M GCMelt, 1,1 mM Mg(OAc)₂, 0,2 mM von jedem dNTP und 1 × Advantage-GC genomische Polymerase-Mischung. Die PCR-Reaktion wurde in einem Perkin Elmer Geneamp 9600 durchgeführt und setze sich zusammen aus einer anfänglichen Denaturierung bei 94°C für 1 Minute; 30 Zyklen einer 30 Sekunden dauernden Denaturierung bei 94°C, einem einminütigen Annealing bei 56°C und einer 4 Minuten dauernden Extension bei 72°C; gefolgt von einer abschließenden Extension bei 72°C für 5 Minuten.
Das pSUP203crtE-kan-Konstrukt wurde durch Konjugation mit dem E. coli S17-1-Stamm, der diesen Vektor trägt, in den R. sphaeroides-Stamm 35053 eingefügt. Der S17-1-Donor wurde in LB-Medien mit 25 μg/ml Kanamycin und 25 μg/ml Streptomycin bei 37°C für 16 Stunden angezüchtet. Eine wachsende Kultur des R. sphaeroides-Stammes 35053 wurde verwendet, um Sistrom's Medien unter Verwendung von 1/5- bis 1/10-Verdünnungen zu beimpfen und die Subkulturen wurden bei 30°C für etwa 20 Stunden angezüchtet. Sowohl für den S17-1crtE-kan als auch für den 35053 Gentyp wurden Zellen aus 1,5 ml Kultur pelletiert. Die Pellets wurden resuspendiert und vier Mal entweder in 1 × Sistrom's Salzen für die 35053-Zellen oder in LB-Medien für die S17-1-Zellen pelletiert. Jedes Pellet wurde in 1,5 ml LB resuspendiert und 200 μl der S17-1-Zellen wurden mit 1,3 ml der 35053-Zellen kombiniert. Dieses Gemisch wurde pelletiert, der Überstand entfernt und das Pellet wurde in 20 μl LB-Medien resuspendiert. Die resuspendierten Zellen wurden auf eine LB-Platte gespottet und bei 30°C für 7,5 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden dann von der Platte abgekratzt, in 1,5 ml von 1 × Sistrom's Salzen resuspendiert und auf Sistrom's Medien, ergänzt mit 25 μg/ml Kanamycin und 10 μg/ml Tellurid (SisKTell), ausplattiert (200 μl/Platte). Das Tellurid verzögert das Wachstum der E. coli-Zellen, wird aber durch R. sphaeroides entgiftet. Nach 7 Tagen wurden kleine schwarze Kolonien von den Platten gepflückt und auf frische Platten derselben Medien aufgestrichen. Nach 6 Tagen Wachstum waren die LB-Platten, die 25 μg/ml Kanamycin (LBK25) enthielten, mit gräulichen Kolonien durchsetzt und ebenso die LB-Platten, die 0,75 μg/ml Tetracyclin enthielten. Erwünschte double-crossover-Ereignisse, in denen das crtE-kan-Gen in das Genom eingebaut und dort behalten wird, während die Vektor-DNA verloren wurde, wiesen Kanamycin-Resistenz auf, es fehlte ihnen jedoch Tetracyclin-Resistenz. Kolonien, entstanden aus unerwünschten single-crossover-Ereignissen, zeigten sowohl Kanamycin- als auch Tetracyclin-Resistenz.
Die Mutanten wurden unter Verwendung von PCR und Southern Hybridization wie folgt bestätigt. Kolonien, die eine Kanamycin-Resistenz aufwiesen, denen eine Tetracyclin-Resistenz fehlte und die einen grauen Phänotyp hatten, wurden unter Verwendung der CRTESCAF- und CRTESCAR-Primer, wie vorstehend beschrieben, mittels PCR auf den crtE-Locus untersucht. Um zu bestätigen, dass sie R. sphaeroides-Kolonien mit einem trunkierten crtE-Gen waren und nicht E. coli-Kolonien, die den Vektor trugen, wurden die Kolonien auch unter Verwendung von R. sphaeroides-ppsR-genspezifischen und E. coli-dxs-genspezifischen Primern untersucht. Einzelne Kolonien wurden in etwa 20 μl 10 mM Tris resuspendiert und für 10 Minuten bei 95°C erhitzt, um die Bakterienzellen aufzubrechen. Zwei μl der erhitzten Zellen wurden für 25 μl PCR-Reaktion verwendet. Das PCR-Reaktionsgemisch enthielt 0,2 μM von jedem Primer, 1 × GC genomischen PCR-Puffer, 1 M GC-Melt, 1,1 mM Mg(OAc)₂, 0,2 mM von jedem dNTP und 1 × Advantage-GC genomische Polymerase-Mischung. Die PCR wurde in einem Perkin Elmer Geneamp 9600 durchgeführt und setze sich zusammen aus einer anfänglichen Denaturierung bei 94°C für 1 Minute; 8 Zyklen einer 30 Sekunden dauernden Denaturierung bei 94°C, einem einminütigen Annealing bei 55°C und einer 3,5 Minuten dauernden Extension bei 72°C; 22 Zyklen einer 30 Sekunden dauernden Denaturierung bei 94°C, einem einminütigen Annealing bei 61°C und einer 3,5 Minuten dauernden Extension bei 72°C; gefolgt von einer abschließenden Extension bei 72°C für 5 Minuten. Alle verdächtigen 35053crtE-kan-Kolonien produzierten eine crtE-Bande von der gleichen Größe wie die Si7-1crtE-kan-Kontrolle. Sie produzierten auch eine Bande in der erwarteten Größe für das ppsR-Gen und sie produzierten keine Bande für das E. coli-dxs-Gen.
Um weiterhin die Anwesenheit von double-crossover-Ereignissen zu bestätigen, wurde Southern Hybridization an acht 35053crtE-kan-Kolonien sowie an den R. sphaeroides-Stämmen 35053 und 17023 durchgeführt. Sequenzdaten für das photosynthetische Operon des Stammes 17023 sind in der Genbank erhältlich und wurden verwendet, um Restriktionsenzyme zu bestimmen, von denen angenommen wird, dass sie Hybridisierungsmuster haben, die Mutanten von Nicht-Mutanten unterscheiden würden. Genomische DNA wurde aus jeder Linie unter Verwendung eines Gentra Puregene DNA Isolationskits (Gentra, Minneapolis, MN) isoliert. Zwei μg genomische DNA wurden in Verdauen mit den Restriktionsenzymen ApaI und XhoI verwendet. Die Verdaue wurden auf einem 0,8%igen TAE-Agarosegel aufgetrennt und die DNA wurde auf eine Nylonmembran transferiert. DIG-markierte Molekulargewichtsmarker II und III (Roche) waren auch auf dem Gel/der Membran enthalten. DIG-markierte Poben des crtE-Locus wurden unter Verwendung eines PCR DIG Probe Synthesis Kits (Roche) synthetisiert. Nach dem Backen wurden die Membranen in EasyHyb-Puffer (Roche) für mindestens 2 Stunden vorhybridisiert und über Nacht unter Verwendung von 400 nl einer 0,5 DIG-Markierungsreaktion pro ml Hybridisierungslösung hybridisiert. Der Nachweis wurde unter Verwendung eines Wash and Block Puffer Sets (Roche) durchgeführt. Die Membranen wurden jede zwei Mal für 5–10 Minuten bei Raumtemperatur in 2 × SSC/0,1% SDS und zwei Mal für 15–20 Minuten bei 68°C in 0,1 × SSC/0,1% SDS gewaschen. Sie wurden dann mit Blockierungspuffer bedeckt und für eine Stunde bei Raumtemperatur auf einen Rüttler gelegt. Der Blockierungspuffer wurde durch frischen Blockierungspuffer mit 150 mU AP-Konjugat pro ml Puffer ersetzt und die Membranen bei Raumtemperatur für zusätzliche 30 Minuten geschüttelt. Die Membranen wurden dann zweimal jeweils für 15 Minuten bei Raumtemperatur mit Waschpuffer gewaschen, gefolgt von einem fünfminütigen Waschgang mit Detektionspuffer. Der Detektionspuffer wurde durch frischen Detektionspuffer ersetzt, der 20 μl NBT/BCIP-Lösung pro ml Puffer enthielt. Dies wurde im Dunkeln bei Raumtemperatur ohne Schütteln abgestellt, bis sich Farbe entwickelte, wonach der Puffer durch 10 mM Tris-1 mM EDTA-Lösung ersetzt wurde.
Im ApaI-Verdau wiesen die Mutantenlinien eine Bande auf, die etwa um 850 bp größer war, als die des Kontrollstammes 35053, was die Größendifferenz ist, die von der Insertion des Kanamycin-Gen-Produktes an den StuI/XhoI-Orten erwartet wurde. Für den XhoI-Verdau wies der Stamm 35053 eine Bande von etwa 700 bp auf, der Stamm 17023 hatte eine Bande von etwa 1100 bp, die Mutante 7C hatte eine Bande von 1550 bp und die übrigen Mutanten hatten eine Bande von 2050 bp. Die Ursache für die Größendifferenz in den XhoI-Banden für die Mutanten war unklar, aber die Mutante 7C wurde in weiteren Studien verwendet wegen der ihr eigenen erwarteten Bandengröße, relativ zu Stamm 35053. Die resultierende R. sphaeroides-Mutante, die einen crtE-Knockout enthielt, wurde ATCC 35053/ΔcrtE(kan) benannt.
ATCC 35053/ΔcrtE
R. sphaeroides-Zellen, denen crtE fehlt, wurden unter Verwendung einer sacR-Selektion wie folgt hergestellt. Ein trunkiertes crtE-Gen wurde in den Vektor pL01, der ein Suizidvektor in R. sphaeroides ist, kloniert. Der pL01-Vektor trägt ein Kanamycin-Resistenzgen, ein B. subtilis-sacB-Gen, eine oriT-Sequenz, ein ColEI-Replikon und eine multiple Klonierungsstelle (Lenz et al., J. Bacteriol. 176(14). 4385–93 (1994)). Das pL01crtE-Plasmid wurde in den R. sphaeroides-Stamm 35053 durch Konjugation mit einem E. coli-Donor eingefügt. Das Kanamycin-Resistenzgen wurde verwendet, um auf single-crossover-Ereignisse zwischen dem trunkierten crtE-Gen und dem genomischen crtE-Gen zu selektieren, die in einer Inkorporation der pL01crtE-DNA in das Genom resultierte. Die Anwesenheit des sacB-Gens auf dem Vektor ermöglichte eine anschließende Selektion auf den Verlust der Vektor-DNA aus dem Genom, da die Expression dieses Gens in Anwesenheit von Saccharose für E. coli und für R. sphaeroides unter bestimmten Wachsumsbedingungen letal ist. Ein Teil der double-crossover-Ereignisse, die zum Verlust des sacB-Gens führten, enthielt die trunkierten crtE-Allele. Diese Methode des Gen-Knockouts ist nützlich, da kein restliches Antibiotika-Resistenzgen im Genom zurückbleibt.
Ein dreistufiger PCR-Prozeß wurde verwendet, um eine 249 bp-in-frame-Deletion im crtE-Gen zu schaffen. Das crtE-Gen aus dem R. sphaeroides-Stamm 35053 wurde unter Verwendung von Primer, die gestaltet wurden, um einen SphI-Restriktionsort am Anfang des amplifizierten Fragments und einen SacI-Restriktionsort am Ende des amplifizierten Fragments einzufügen. Die Sequenzen der Primer waren wie folgt.
Das PCR-Gemisch enthielt 0,2 μM von jedem Primer, 1 × Genome Advantage Reaktionspuffer, 1 M GCMelt, 1,1 mM Mg(OAc)₂, 0,2 mM von jedem dNTP, 1 × Genome Advantage Polymerase und 1 ng genomische DNA pro μl Reaktionsgemisch. Die PCR-Reaktion wurde in einem Perkin Elmer Geneamp 2400 durchgeführt und setze sich zusammen aus einer anfänglichen Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten; 32 Zyklen einer 30 Sekunden dauernden Denaturierung bei 94°C, einem 45 Sekunden dauerndem Annealing bei 64°C und einer 3 Minuten dauernden Extension bei 72°C; gefolgt von einer abschließenden Extension bei 72°C für 7 Minuten. 200 μl des PCR-Produktes wurden auf einem 1%igen TAE-Agarosegel aufgetrennt und ein 1,5 Kb-Fragment wurde herausgeschnitten und gereinigt.
Der zweite PCR-Durchgang setzte sich aus zwei gesonderten Reaktionen zusammen: Reaktion A, die die Primer CRTESPHF und CRTERI verwendete und Reaktion B, die die Primer CRTESACR und CRTEFI verwendete. Die Sequenzen der Primer CRTEFI und CRTERI waren wie folgt.
Die 20 Nukleotide auf den 3'-Enden dieses Primerpaares befinden sich in der Nähe des Zentrums des crtE-Gens, 249 Basen entfernt voneinander und sind dem Anfang (CRTERI) und dem Ende (CRTEFI) des Gens zugewandt. Die 20 bp auf den 5'-Enden dieser Primer sind revers komplementär zu den 3'-Enden des anderen im Paar befindlichen Primers. Die PCR der beiden gesonderten Reaktionen wurde wie im ersten Durchgang durchgeführt, mit der Ausnahme, dass 0,05 ng des Produktes des ersten Durchgangs pro μl Reaktionsgemisch als Matrize verwendet wurden. Auch verwendete das Thermozykler-Programm eine anfängliche 2minütige Denaturierung bei 94°C; 8 Zyklen einer 30 Sekunden dauernden Denaturierung bei 94°C, eines 45 Sekunden dauernden Annealing bei 56°C und einer 3 Minuten dauernden Extension bei 72°C; gefolgt von 8 Zyklen einer 30 Sekunden dauernden Denaturierung bei 94°C, eines 45 Sekunden dauernden Annealing bei 60°C und einer 3 Minuten dauernden Extension bei 72°C; gefolgt von 16 Zyklen einer 30 Sekunden dauernden Denaturierung bei 94°C, eines 45 Sekunden dauernden Annealing bei 64°C und einer 3 Minuten dauernden Extension bei 72°C; gefolgt von einer abschließenden Extension bei 72°C für 7 Minuten. Beide PCR-Produkte, etwa 590 und 650 bp lang, wurden auf einem 1%igen TAE-Agarosegel aufgetrennt, ausgeschnitten und gelgereinigt.
Der dritte PCR-Durchgang verwendete dieselben Primer und Reaktionsgemische wie der erste PCR-Durchgang, mit der Ausnahme, dass ein Gemisch von 10 ng jedes Fragments des zweiten Durchgangs statt genomischer DNA (200 μl Reaktion) als Matrize verwendet wurde. Das verwendete PCR-Programm war auch dasselbe, das im ersten PCR-Durchgang verwendet wurde, wobei die Annealingzeit auf 1,5 Minuten verlängert wurde. Das 1,2 Kb-Produkt des dritten Durchgangs wurde auf einem 1%igen TAE-Agarosegel aufgetrennt und gereinigt. Drei μg der gereinigten DNA wurden mit den Restriktionsenzymen SacI und SphI verdaut. Die verdaute DNA wurde unter Verwendung eines QIAquick PCR Purification Kits gereinigt und mit dem Restrktionsenzym StuI verdaut. StuI schnitt innerhalb der entfernten Region und stellte sicher, dass es wenig oder kein übriges Produkt in voller Länge gab. Die Verdaumischung wurde wieder unter Verwendung eines QIAquick PCR Purification Kits gereinigt.
Drei μg des Vektors pL01 wurden mit den Restriktionsenzymen SphI und SacI verdautDie Enzyme wurden bei 65°C für 20 Minuten inaktiviert und der Vektor wurde unter Verwendung von Shrimp Alkalischer Phosphatase (Roche) dephosphoryliert. Die dephosphorylierte Vektor-DNA wurde und auf einem 1%igen TAE-Agarosegel gelgereinigt.
Sechsundsechzig ng des verdauten Vektors wurden mit 80 ng des verdauten PCR-Produktes des dritten Durchgangs unter Verwendung von T4-DNA-Ligase bei 16°C für 16 Stunden ligiert. Ein μl des Ligationsgemisches wurde in 40 μl elektrokompetente E. coli-Electromax^TM DH5α^TM-Zellen (Life Technologies) elektroporiert, die dann auf LB-Medien, welche 50 μg/ml Kanamycin (LBK50) enthielten, ausplattiert wurden. Plasmid-DNA wurde von Kulturen einzelner Kolonien isoliert und mit dem Restriktionsenzym SacI sowie mit einer Mischung aus SphI und SacI verdaut, um die korrekte Vektor-Struktur zu bestätigen.
Ein μl der Plasmid-DNA wurde verwendet, um elektrokompetente Zellen des zuvor beschriebenen E. coli-Stammes S17-1 zu transformieren. Die elektroporierten Zellen wurden auf LB-Medien ausplattiert, welche 25 μg/ml Kanamycin, 25 μg/ml Streptomycin und 25 μg/ml Spectinomycin (LBKSMST) enthielten. Einzelne Kolonien wurden verwendet, um Kulturen für die Plasmid-DNA-Isolation zu starten und sie wurden für die Konjugation verwendet. Diese Kolonien wurden auch auf LB-Medien ausplattiert, welche 5% Saccharose und 25 μg/ml Kanamycin enthielten, um sicherzustellen, dass das sacB-Gen noch funktionsfähig war. Nur Kolonien, die eine Letalität auf den Saccharose-Medien aufwiesen, wurden für die Konjugation verwendet. Die Anwesenheit der korrekten Insert-Größe wurde durch den Verdau von Plasmid-DNA mit den Restriktionsenzymen SacI und SphI bestätigt.
Wachsende Kulturen des R. sphaeroides-Stammes 35053 wurden unter Verwendung eines 1/5 und 1/10 Volumens Inoculum subkultiviert, in Sistrom's-Medien, ergänzt mit 20% LB, supplementiert und bei 30°C für 12 Stunden angezüchtet. Die S17-1-Donor-Kolonien wurden in LBDSMST-Medien bei 37°C für 12 Stunden angezüchtet. 1,5 bis 3,0 ml jeder Kultur wurden pelletiert und die Pellets wurden vier mal mit LB-Medien gewaschen. Die relative Pelletgröße wurde geschätzt und etwa 2 Volumen der 35053-Zellen wurden auf 1 Volumen der S17-1-Zellen verwendet. Das Zellgemisch wurde pelletiert, in 20 μl LB-Medien resuspendiert, auf eine LB-Platte gespottet und bei 30°C für 7–15 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden dann von der Plattenoberfläche abgekratzt und in 1,5 ml Sistrom's Salzen resuspendiert. 200 μl der resuspendierten Zellen wurden auf jede von sieben Platten mit SisKTell-Medien ausplattiert.
Kolonien, die auf den Platten nach etwa 10 Tagen wuchsen, wobei sie beabsichtigte single-crossover-Ereignisse darstellten, wurden auf neue Platten mit denselben Medien ausgestrichen. Während des Wachstums wurden einzelne Kolonien auf LBK25-Medien ausgestrichen. Gereinigte Kolonien wurden auf Sistrom's Medien, ergänzt mit 1 × LB, 15% Saccharose, 0,5% DMSO (v/v) und 25 μg/ml Kanamycin (SisLBK15%SucDMSO) aufgebracht. Diese wurden in einer anaeroben Kammer (Becton Dickinson, Sparks, MD) bei 30°C für 5 Tage angezüchtet, um auf Letalität der sacB-Gene in den beabsichtigten single-crossover-Ereignissen zu prüfen. Gleichzeitig wurden die Kulturen auf SisLB-Medien, die 15% Saccharose und 0,5% DMSO (v/v) ohne Kanamycin enthielten (SisLB15%SucDMSO) aufgebracht. Mehrere dieser Kulturen wiesen sowohl weiße als auch rote Kolonien während des Wachstums auf diesen Medien auf. Weißlich-graue Kolonien wurden aus diesen Kulturen gereinigt und mittels PCR getestet, um zu zeigen, dass sie die trunkierten crtE-Allele enthielten. Diese Kolonien wurden auch unter Verwendung von Primern, die spezifisch für die R. sphaeroides-ppsR-Gene und die E. coli-dxs-Gene waren, untersucht, wie vorstehend beschrieben. Mögliche double-crossover wurden auch auf LBK25-Platten ausgestrichen, um zu bestätigen, dass sie jetzt für Kanamycin sensibel waren. Die resultierende R. sphaeroides-Mutante, die einen crtE-Knockout enthielt, wurde ATCC 35053/ΔcrtE benannt.
Mehrere Entdeckungen wurden gemacht, unter Verwendung der sacB-Methode zum Ausschalten von Nukleinsäuren, die innerhalb des R. sphaeroides-Genoms sequenziert sind. Erstens wurde entdeckt, dass die in Konjugationen verwedeten Kulturen, besonders die des empfänglichen R. sphaeroides-Stammes, in exponentialem Wachstum sein sollten. Zweitens wurde entdeckt, dass bei Verwendung des S17-1-Stammes als Vektor-Donor, die Verwendung von Tellurid im Plattierungsmedium unnötig ist, da dieser Stamm Prolin auxotroph ist und nicht auf Sistrom's Medien ohne LB-Supplementierung wachsen wird. Drittens wurde entdeckt, dass potentielle single-crossover unter Verwendung zweier getrennter PCR-Reaktionen untersucht werden sollten. Die erste Reaktion sollte einen Primer innerhalb des Gens von Interesse verwenden, zusammen mit einem Primer, der zur vorgelagerten Sequenz homolog ist. Die zweite Reaktion sollte einen Primer innerhalb des Gens von Interesse verwenden, zusammen mit einem Primer, der zur nachfolgenden Sequenz homolog ist. Eine dieser beiden Reaktionen sollte ein trunkiertes Fragment produzieren. Viertens wurde entdeckt, dass einzelne crossover, für die bestätigt wurde, dass sie eine sacB-Letalität besitzen, aerob in Sistrom's Medien für 2 Tage angezüchtet werden können und dann auf SisLB15%SucDMSO ausplattiert werden können. Das ausplattierte Volumen variiert, abhängig von der Wachstumsrate des Stammes, ist aber etwa ein μl oder weniger für Stamm 35053. Dies wird dann für etwa 5 Tage anaerob angezüchtet. Fünftens wurde entdeckt, dass das sacB-Gen Zellen mit dem Gen möglicherweise nicht restlos tötet, so dass ein Hintergrundlevel sehr kleiner Kolonien vorhanden sein kann. Die erwünschten double-crossover-Kolonien sind jedoch typischerweise größer. Diese Kolonien sollten gereinigt und mittels PCR überprüft werden, um zu identifizieren, ob sie die trunkierten Allele oder die Allele in voller Länge beinhalten. Sechstens wurde entdeckt, dass die Verwendung eines Primers, homolog zu der dem Knockout-Gen vorgelagerten Sequenz und eines Primers, homolog zu der dem Gen nachfolgenden Sequenz in der Bestätigung der korrekten Lage des Insertionsereignisses von Nutzen ist, zusätzlich zur Bestimmung des Allels, welches vorhanden ist.
ATCC 35053/ΔppsR(strep)
R. sphaeroides-Zellen, denen PPSR fehlt, wurden durch Einfügen eines Spectinomycin/Streptomycin-Resistenzgens in die ppsR-Sequenz wie folgt hergestellt. Um die ppsR-Gene des R. sphaeroides-Stammes 17023 mittels PCR zu amplifizieren, wurden die folgenden Primer, basierend auf veröffentlichten Sequenzen (GenBank Zugangsnummer L19596), gestaltet.
Jeder Primer enthielt einen ScaI-Restriktionsort. Das ppsR-Gen wurde unter Verwendung folgenden Reaktionsgemisches und PCR-Amplifikationsprogrammes amplifiziert.
Das PCR-Produkt wurde auf einem 0,8%igen TAE-Agarosegel aufgetrennt und eine Bande von etwa 1,8 Kb wurde herausgeschnitten und unter Verwendung eines Qiagen Gelisolationskits (Qiagen, Valencia, CA) gelisoliert. Die gelisolierte DNA wurde mit ScaI (New England BioLabs, Beverly, MA) für 5 Stunden verdaut. Die verdaute DNA wurde unter Verwendung eines Qiagen Gelisolationskits über eine Säule gereinigt. Die ausgeschnittene DNA wurde in den Vektor pSUP203, der auch mit dem ScaI-Enzym verdaut wurde, ligiert.
2,3 μg der pSUP203-Plasmid-DNA wurde für 4 Stunden bei 37°C mit einem ScaI-Restriktionsenzym verdaut. Die verdaute DNA wurde auf einem 1%igen TAE-Agarosegel aufgetrennt. Ein 7,6 Kb-Fragment wurde ausgeschnitten und gereinigt. Die gereinigte Plasmid-DNA wurde dann unter Verwendung intestinaler Phosphatase vom Kalb (New England Biolabs) dephosphoryliert. 100 ng der dephosphorylierten Plasmid-DNA wurden mit 200 ng der ScaI-verdauten PpsR-DNA für 16 Stunden bei 14°C unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (New England BioLabs) ligiert. Ein μl des Ligationsgemisches wurde in 40 μl elektrokompentete E. coli-ElectroMAX^TM DH5α^TM-Zellen (Life Technologies, Gaithersburg, MD) elektroporiert, die dann in 1 ml SOC-Medien für eine Stunde bei 37°C zurückgewonnen wurden und auf LB-Medien, welche 15 μg/ml Tetracyclin enthielten, ausplattiert wurden. Plasmid-DNA wurde von 8 einzelnen Kolonien unter Verwendung eines Qiagen sein Mini prep Kits isoliert und mit einem ScaI-Restriktionsenzym verdaut, um die Insert-Größe zu überprüfen. Vier der Kolonien hatten ein korrektes Insert. 1,5 μg der von bestätigten Kolonien erhaltenen Plasmid-DNA wurde mit einem XhoI-Restriktionsenzym (New England BioLabs, Beverly, MA) verdaut. Dieses Enzym hat einen einzelnen Restriktionsort im offenen Leserahmen des ppsR-Gens. Eine lineare DNA-Bande von etwa 8,4 Kb wurde unter Verwendung eines Qiagen Gelisolationskits gelisoliert. Eine Spectinomycin/Streptomycin-Resistenz-Omega-Kassette wurde durch den Verdau des Plasmids pUI1638 (bezogen von Dr. Samuel Kaplan's Labor) mit einem XhoI-Enzym erhalten. Der Verdau wurde auf einem 0,8%igen TAE-Agarosegel aufgespalten und eine DNA-Bande von etwa 2,1 Kb wurde gelisoliert. Diese DNA, die für ein Spectinomycin/Streptomycin-Resistenzgen kodierte, wurde an pSUP203/PpsR ligiert, welches auch mit einem XhoI-Enzym geschnitten wurde. Ein μl des Ligationsgemisches wurde in 40 μl elektrokompentete E. coli-ElectroMAX^TM DH5α^TM-Zellen (Life Technologies, Gaithersburg, MD) elektroporiert, die dann in 1 ml SOC-Medien für eine Stunde bei 37°C zurückgewonnen wurden und auf LB-Medien, welche 15 μg/ml Tetracyclin, 25 μg/ml Spectinomycin und 25 μg/ml Streptomycin enthielten, ausplattiert wurden. Plasmid-DNA wurde von 10 einzelnen Kolonien unter Verwendung eines Qiagen sein Mini prep Kits isoliert und gesondert mit ScaI- und XhoI-Restriktionsenzymen verdaut, um die Insert-Größe zu überprüfen. Fünf der Kolonien hatten ein korrektes Insert. 100 ng Plasmid-DNA aus einer bestätigten Kolonie wurden in elektrokompetente Zellen des E. coli-Stammes SM10 elektroporiert. Dieser Stamm enthält eine chromosomale Kopie der transregulatorischen Elemente, die oriT-enthaltende Plasmide während der Konjugation mit einem zweiten Bakterienstamm mobilisieren. Es trägt auch ein Gen, das eine Resistenz gegen das Antibiotikum Kanamycin verleiht. Die Transformationsreaktion wurde in 1 ml SOC-Medien für eine Stunde zurückgewonnen und auf LB-Medien mit 10 μg/ml Tetracyclin, 25 μg/ml Kanamycin, 25 μg/ml Streptomycin und 25 μg/ml Spectinomycin ausplattiert.
Das pSUP203/ppsR-SM-ST-Konstrukt wurde vom E. coli-SM10-Wirt in den R. sphaeroides-Stamm 35053 konjugiert. Der SM10-Donor wurde in LB-Medien mit 25 μg/ml Kanamycin, 25 μg/ml Streptomycin und 25 μg/ml Spectinomycin bei 37°C für 16 Stunden angezüchtet. Eine wachsende Kultur des R. sphaeroides-Stammes 35053 wurde verwendet, um Sistrom's Medien in Verdünnungen von 1/5 bis 1/10 zu beimpfen. Diese Kulturen wurden für etwa 20 Stunden angezüchtet. Zellen wurden für 1,5 ml Kultur sowohl des SM10 pSUP203/PpsR-SM-ST- als auch des 35053-Genotyps pelletiert. Die Pellets wurden vier mal in Sistrom's Medien ohne Vitamine und Glukose gewaschen. Die Pellets wurden jeweils in 1,5 ml Sistrom's Medien ohne Vitamine und Glukose resuspendiert. 200 μl der SM10 pSUP203/PpsR-SM-ST-Zellen wurden mit 1,3 ml der 35053-Zellen kombiniert. Dieses Gemisch wurde pelletiert, der Überstand wurde entfernt und das Pellet wurde in 20 μl LB-Medien resuspendiert. Die resuspendierten Zellen wurden auf eine LB-Platte gespottet, welche dann bei 30°C für 7 Stunden inkubiert wurde. Die Zellen wurden dann von der LB-Platte abgekratzt, in 1,5 ml von 1 × Sistrom's Medien ohne Vitamine und Glukose resuspendiert und auf Sistrom's Medien, ergänzt mit 25 μg/ml Spectinomycin, 25 μg/ml Streptomycin und 10 μg/ml Tellurid, ausplattiert (200 μl/Platte). Das Tellurid verzögert das Wachstum der E. coli-Zellen, wird aber durch R. sphaeroides entgiftet. Nach 7–10 Tagen wurden kleine schware Kolonien von den Platten gepflückt und auf frische Platten derselben Medien aufgestrichen. Nach 6 Tagen Wachstum waren Kolonien an die LB-Platten, die 25 μg/ml Spectinomycin und 25 μg/ml Streptomycin (LBSMST25) enthielten, geheftet und ebenso an LB-Platten, die 0,75 μg/ml Tetracyclin enthielten. Erwünschte double-crossover-Ereignisse, in denen das PpsR-SM-ST-Gen im Genom zurückbehalten wird und die Vektor-DNA verloren wird, würden Spectinomycin/Streptomycin-Resistenz haben, es würde ihnen jedoch Tetracyclin-Resistenz fehlen. Kolonien, entstanden aus unerwünschten single-crossover-Ereignissen, würden eine Resistenz gegen alle diese antibiotischen Marker zeigen.
Für Kolonien, die nur Spectinomycin/Streptomycin-Resistenz aufwiesen und eine tiefrote Farbe zeigten, wurde durch Southern Hybridization ein double-crossover bestätigt. Southern Hybridization wurde an neunzehn potentiellen 35053/PpsR-SM-ST-Kolonien durchgeführt, zusätzlich zu 35053 und R. sphaeroides-Stamm 17023. Sequenzdaten für das photosynthetische Operon von 17023 sind in der Genbank erhältlich und wurden verwendet, um Restriktionsenzyme zu bestimmen, von denen angenommen wird, dass sie Hybridisierungsmuster haben, die Mutanten von Nicht-Mutanten unterscheiden würden. Genomische DNA wurde aus jede Linie unter Verwendung eines Gentra Puregene DNA Isolationskits (Gentra, Minneapolis, MN) isoliert. Zwei μg genomische DNA wurden in Verdauen unter Verwendung der Restriktionsenzyme NcoI, ApaI und XmaI in gesonderten Reaktionen verwendet. Die Verdaue wurden auf einem 1%igen TAE-Agarosegel aufgetrennt und die DNA wurde auf eine Nylonmembran (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) transferiert. DIG-markierte Molekulargewichtsmarker II und III (Roche) waren auch auf dem Gel/der Membran enthalten. DIG-markierte Poben des PpsR-Locus wurden unter Verwendung eines PCR DIG Probe Synthesis Kits (Roche) hergestellt. Nach dem Backen wurden die Membranen in EasyHyb-Puffer (Roche) für mindestens 2 Stunden vorhybridisiert und über Nacht unter Verwendung von 400 nl einer 0,5 DIG-Markierungsreaktion pro ml Hybridisierungslösung hybridisiert. Der Nachweis wurde unter Verwendung eines Wash and Block Puffer-Sets (Roche) durchgeführt. Die Membranen wurden zwei Mal für 5–10 Minuten bei Raumtemperatur in 2 × SSC/0,1% SDS und zwei Mal für 15–20 Minuten bei 68°C in 0,1 × SSC/0,1% SDS gewaschen. Sie wurden dann mit Blockierungspuffer bedeckt und für eine Stunde bei Raumtemperatur auf einen Rüttler gelegt. Der Bolckierungspuffer wurde durch frischen Blockierungspuffer mit 150 mU AP-Konjugat pro ml Puffer ersetzt und die Membranen bei Raumtemperatur für zusätzliche 30 Minuten geschüttelt. Die Membranen wurden dann zweimal für 15 Minuten bei Raumtemperatur mit Waschpuffer gewaschen, gefolgt von einem fünfminütigen Waschgang mit Detektionspuffer. Der Detektionspuffer wurde durch frischen Detektionspuffer ersetzt, der 20 μl NBT/BCIP-Lösung pro ml Puffer enthielt. Dies wurde im Dunkeln bei Raumtemperatur ohne Schütteln abgestellt, bis sich genug Farbe entwickelt hatte.
Im NcoI-Verdau wiesen die Linien der Kolonien 9 und 10 eine Bande auf, die etwa um 2 Kb größer war, als die der 35053-Kontrolle, was die Größendifferenz ist, die von der Insertion der Spectinomycin/Streptomycin Resistenzkassette in den XhoI-Ort erwartet wurde. Für das XmaI-Verdau wies 35053 eine einzelne Bande von etwa 5,5 Kb auf, während die Kolonien 9, 10 und 5 zwei Banden aufwiesen, deren summierte Größe etwa 2 KB größer war als die von 35053. Zwei Banden wurden in Kolonie 9, 10 und 5 beobachtet, da ein XmaI zusammen mit der Spectinomycin/Streptomycin-Resistenz-Kassette, eingeführt worden war. Für den ApaI-Verdau wies die 35053-Kontrollprobe zwei Banden auf, da ppsR-Gene einen ApaI-Ort beherbergen. Jede dieser Banden war etwa 2,3 Kb groß. Die Kolonien 9, 10 und 5 wiesen drei Banden auf, deren summierte Größe etwa 2 Kb größer war als die von 35053. Eine Extrabande wurde in den Kolonien 9, 10 und 5 beobachtet, weil ein ApaI-Ort, zusammen mit der Spectinomycin/Streptomycin-Resistenz-Kassette, eingeführt worden war.
Die resultierende R. sphaeroides-Mutante, die den ppsR-Knockout enthielt, wurde ATTC 35053/ΔppsR(strep) benannt.
ATCC 35053/ΔppsR
R. sphaeroides-Zellen, denen ppsR fehlt, wurden unter Verwendung der sacB-Selektion wie folgt hergestellt. Ein dreistufiger PCR-Prozess wurde angewendet, um eine 255 bp-in-frame-Deletion im PpsR-Gen zu schaffen, so dass kein restliches Antibiotikum-Resistenzgen im Genom vorhanden wäre. Das PpsR-Gen des R. sphaeroides-Stammes 35053 wurde mittels PCR unter Verwendung von Primern, die gestaltet wurden, um einen SacI-Restriktionsort am Anfang des amplifizierten Fragments und einen SphI-Restriktionsort am Ende des amplifizierten Fragments einzufügen, amplifiziert. Die Sequenzen der Primer waren wie folgt.
Das folgende PCR-Mischungsprogramm wurde verwendet, um das PpsR-Gen zu amplifizieren.
100 μl des PCR-Produktes wurden auf einem 1%igen TAE-Agarosegel aufgespalten und ein Fragment von etwa 1,8 Kb wurde herausgeschnitten und unter Verwendung eines Qiagen Gelisolationskits gereinigt.
Der zweite PCR-Durchgang setzte sich aus zwei gesonderten Reaktionen zusammen: Reaktion A, die die Primer PPSRSACF2 und PPSRMIDR verwendete und Reaktion B, die die Primer PPSRSPHR und PPSRMIDF verwendete. Die Sequenzen der Primer PPSRMIDF und PPSRMIDR waren wie folgt.
Die 20 Nukleotide auf den 3'-Enden dieses Primerpaares befinden sich in der Nähe des Zentrums des ppsR-Gens, 255 Basen entfernt voneinander und sind dem Anfang (PPSRMIDR) und dem Ende (PPSRMIDF) des Gens zugewandt. Die 20 bp auf den 5'-Enden dieser Primer sind revers komplementär zu den 3'-Enden des anderen im Paar befindlichen Primers. Das folgende Reaktionsgemisch und das Programm wurden verwendet, um diese PCR durchzuführen.
Beide PCR-Produkte, etwa 800–700 bp lang, wurden auf einem 1%igen TAE-Agarosegel aufgetrennt, ausgeschnitten und unter Verwendung eines Qiagen Gelisolationskits gelgereinigt.
Der dritte PCR-Durchgang verwendete die Primer PPSRSACF2 und PPSRSPHR, nutzte jedoch beide aus dem ersten PCR-Durchgang stammenden Fragmente als Matrize. Das verwendete PCR-Gemisch war dasselbe, wie im ersten PCR-Durchgang, außer dass gleiche molare Mengen der Fragmente aus Durchgang 2 als Matrize verwendet wurden. Das verwendete PCR-Programm war auch dasselbe, wie das im ersten PCR-Durchgang verwendete, mit einer um 1,5 Minuten verlängerten Annealingzeit. Das 1,5 Kb-Produkt aus dem dritten Durchgang wurde auf einem 1%igen TAE-Agarosegel aufgespalten und unter Verwendung eines Qiagen Gelisolationskits gereinigt. Die gereinigte DNA wurde über Nacht bei 37°C mit den Restriktionsenzymen SacI und SphI verdaut.
Drei μg des Vektors pL01 wurden mit den Restriktionsenzymen SphI und SacI bei 37°C für 16 Stunden verdaut. Die Enzyme wurden durch Erhitzen auf 65°C für 20 Minuten inaktiviert. Die Dephosphorylierung des Vektors wurde erreicht durch die Zugabe von 4,7 μl Shrimp Alkalische Phosphatase 10 × Puffer (Roche) und 2 μl Shrimp Alkalischer Phosphatase zu dem inaktivierten Verdau. Dieses Gemisch wurde bei 37°C für 10 Minuten und dann bei 65°C für 15 Minuten erhitzt. Die dephosphorylierte Vektor-DNA wurde dann auf einem 1%igen TAE-Agarosegel gelgereinigt.
98 ng der Vektor-DNA wurden mit 210 ng der verdauten PCR des dritten Durchgangs bei 14°C für 14 Stunden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (Roche) ligiert. Ein μl des Ligationsgemisches wurde in 40 μl elektrokompetente E. coli-Electromax^TM DH5α^TM-Zellen (Life Technologies) elektroporiert, die dann in 1 ml SOC-Medien für eine Stunde zurückgewonnen wurden und auf LB-Medien mit 25 μg/ml Kanamycin (LBK25) ausplattiert wurden. Plasmid-DNA wurde aus acht einzelnen Kolonien isoliert. Die Plasmid-DNA wurde mit einem PCR-Screen unter Verwendung des PCR-Protokolls des ersten Durchgangs auf das korrekte Insert untersucht.
Ein μl der Plasmid-DNA wurde verwendet, um elektrokompetente Zellen des E. coli-Stammes S17-1 zu transformieren. Die elektroporierten Zellen wurden in 1 ml SOC-Medien für eine Stunde zurückgewonnen und auf LB-Medien mit 25 μg/ml Kanamycin, 25 μg/ml Streptomycin und 25 μg/ml Spectinomycin (LBKSMST) ausplattiert. Einzelne Kolonien wurden verwendet, um Kulturen für die Plasmid-DNA-Isolation zu starten und sie wurden für die Konjugation verwendet. Diese Kolonien wurden auch auf LB-Medien ausplattiert, welche 5% oder 15% Saccharose und 25 μg/ml Kanamycin enthielten, um sicherzustellen, dass das sacB-Gen noch funktionsfähig war. Nur Kolonien, die eine Letalität auf den Saccharose-Medien aufwiesen, wurden für die Konjugation verwendet. Die Anwesenheit der korrekten Insert-Größe wurde mittels Kolonie-PCR bestätigt.
Wachsende Kulturen des R. sphaeroides-Stammes 35053 wurden unter Verwendung eines 1/4 und 1/8 Volumens Inoculum subkultiviert, in 5 ml Sistrom's-Medien, ergänzt mit 20% LB, supplementiert und bei 30°C für 9 Stunden angezüchtet. Die S17-1-Donor-Kolonien wurden in LBKSMST-Medien bei 37°C für 16 Stunden angezüchtet. 3,0 ml von 35053 und 0,5 ml der S17-1-Donor-Zellen wurden zentrifugiert und vier mal in Sistrom's Medien ohne Glukose gewaschen. Jedes Zellpellet wurde in 20 μl LB resuspendiert und die S17-1-Donor-Suspension wurde mit 35053 gemischt. Das Gemisch wurde dann auf LB gespottet, was bei 30°C für 14–16 Stunden inkubiert wurde. Die Zellen wurden dann von der Plattenoberfläche abgekratzt und in 1,5 ml Sistrom's Salzen resuspendiert. 200 μl der resuspendierten Zellen wurden auf jede der sieben Platten mit Sistrom's Medien, die mit 25 μg/ml Kanamycin ergänzt wurden, ausplattiert.
Kolonien, die auf den Platten nach etwa 10–14 Tagen wuchsen, wobei sie beabsichtigte single-crossover-Ereignisse darstellten, wurden auf neue Platten mit denselben Medien ausgestrichen. Während des Wachstums wurden einzelne Kolonien auf LBK25-Medien übertragen. Diese Kulturen wurden für 36 bis 48 Stunden in Sistrom's Medien, ergänzt mit 20% LB und keinem Kanamycin, bei 30°C angezüchtet. 0,1 μl und 5 μl dieser Kultur wurden auf LB-Medien, die mit Sistrom's Salzen und 15% Saccharose ergänzt waren, ausplattiert. Diese Platten wurden in eine anaerobe Kammer (Becton Dickinson, Sparks, MD) gestellt und die Kammer wurde in einen 30°C-Inkubator gestellt. Nach 4–5 Tagen zeigten sich mehrere Kolonien auf den Platten, die auf das Vorkommen von double-crossover-Ereignissen hindeuteten. Vier Kolonien aus jedem single-crossover-Stamm wurden durch Aufstreichen auf LB-Agar-Platten gereinigt. Einzelne Kolonien von double-crossover-Stämmen wurden mittels PCR auf den Einbau einer trunkierten Version des ppsR-Gens in das Chromosom untersucht. Für die Untersuchung wurden die folgenden Primer verwendet, die sich aufwärts und abwärts vom PpsR-Gen befanden. Die Verwendung von Aufwärts- und Abwärts-Primern bestätigt sowohl den Ort des Einbaus als auch die Trunkation des PpsR-Gens.
Das folgende Reaktionsgemisch und das PCR-Programm wurden verwendet.
Das Gemisch gekochter Zellen wurde durch die Resuspension einer einzelnen Kolonie in 20–25 μl Wasser zubereitet. Die Suspension wurde bei 95°C für 10 Minuten in einem PCR-Gerät erhitzt. Der Röhre wurde in eine schnelle Drehung versetzt, um die festen Bestandteile zu pelletieren.
Die Kolonien, die die trunkierte Version des PpsR-Gens aufwiesen, wurden weiter auf Kanamycinsensitivität getestet, indem sie auf LB-Platten, die mit 25 μg/ml Kanamycin ergänzt wurden, ausgestrichen wurden. Auch wurden diese Kolonien mittels PCR auf das Kanamycin-Resistenzgen untersucht.
Die resultierende R. sphaeroides-Mutante, die das ppsR-Knockout enthielt, wurde ATCC 35053/ΔppsR benannt.
ATCC 35053/ΔccoN
R. sphaeroides-Zellen, denen ccoN fehlt, wurden unter Verwendung einer sacB-Selektion wie folgt hergestellt. Eine Mutante des R. sphaeroides-Stammes 2.4.1, die eine 546 bp-Deletion im ccoN-Gen hat (R. sphaeroides 2.4.1/ΔccoN) wurde vom Labor von Samuel Kaplan an der University of Texas (Oh and Kaplan, Biochemistry, 38: 2688–2696 (1999)) bezogen. Der mutierte ccoN-Locus dieses Stammes wurde mittels PCR amplifiziert und in pL01 geklont. Dieses Plasmid wurde in den E. coli-Stamm S17-1 transformiert. Der S17-1-Stamm wurde mit dem R. sphaeroides-Stamm 35053 konjugiert und Kolonien wurden identifiziert, in welchen der trunkierte Locus das native ccoN-Gen ersetzt hatte.
Das trunkierte ccoN-Gen von R. sphaeroides 2.4.1/ΔccoN wurde mittels PCR unter Verwendung von Primern, die gestaltet wurden, um einen SacI-Restriktionsort am Anfang des amplifizierten Fragments und einen SphI-Restriktionsort am Ende des Fragments einzufügen, amplifiziert. Die Sequenzen der Primer waren wie folgt.
Das PCR-Reaktionsgemisch enthielt 0,2 μM jedes Primers, 1 × nativen Pfu-Reaktionspuffer, 0,2 mM von jedem dNTP, 5% DMSO und 10 Einheiten Pfu-Polymerase in einer Reaktion von 200 μl. Drei μl des Glyzerolbestands wurden in 20 μl 10 mM Tris aufgelöst und bei 94°C für 10 Minuten erhitzt, wonach 4 μl zur PCR-Reaktion hinzugefügt wurden. Die PCR wurde in einem MJ Research PT100 durchgeführt und setzte sich zusammen aus einer anfänglichen Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten; 32 Zyklen einer 30 Sekunden dauernden Denaturierung bei 94°C, einem 1minütigen Annealing bei 66°C und einer 4minütigen Extension bei 72°C, gefolgt von einer abschließenden Extension bei 72°C für 7 Minuten. Das PCR-Produkt wurde auf einem 1%igen TAE-Agarosegel aufgespalten und ein 1,6 Kb-Fragment wurde ausgeschnitten und gereinigt. Drei μg des gereinigten PCR-Produkts wurden mit einem SacI-Restriktionsenzym verdaut und auf einem 1%igen TAE-Gel aufgespalten. Eine 1,4 Kb-Bande wurde herausgeschnitten und gereinigt. Ein SacI-Restriktionsort ist etwa 200 bp vom CCONSPHR-Ende des ursprünglichen PCR-Produktes vorhanden.
Drei μg des Vektors pL01 wurden mit dem Restriktionsenzym SacI verdaut. Das Enzym wurde durch Erhitzen auf 65°C für 20 Minuten inaktiviert und der verdaute Vektor wurde unter Verwendung von Shrimp Alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. Die dephosphorylierte Vektor-DNA wurde auf einem 1%igen TAE-Agarosegel gelgereinigt.
50 ng des verdauten Vektors wurden mit 65 ng des verdauten ccoN-PCR-Produktes unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (Roche) bei 16°C für 16 Stunden ligiert. Ein μl des Ligationsgemisches wurde in 40 μl elektrokompetente E. coli-Electromax^TM DH5α^TM-Zellen elektroporiert, die dann auf LB-Medien ausplattiert wurden. Plasmid-DNA wurde von Kulturen einzelner Kolonien isoliert und mit dem Restriktionsenzym SacI verdaut, um die korrekte Insert-Größe zu bestätigen.
Der E. coli-Stamm S17-1 enthält eine chromosomale Kopie der transregulatorischen Elemente, die oriT-enthaltende Plasmide während der Konjugation mit einem zweiten Bakterienstamm mobilisieren. Es trägt auch Gene, die eine Resistenz gegen die Antibiotika Streptomycin und Spectinomycin verleihen. Zusätzlich ist S17-1 Prolin-auxotroph und wird nicht auf nicht ergänzten Sistrom's Medien wachsen. Ein μl DNA des trunkierten ccoN-Konstrukts wurde verwendet, um elektrokompetente Zellen des E. coli-Stammes S17-1 zu transformieren. Die Elektroporation wurde auf LBKSMST aufplattiert. Einzelne Kolonien wurden verwendet, um Kulturen für die Plasmid-DNA-Isolation zu starten und sie wurden für die Konjugation verwendet. Diese Kolonien wurden auch auf LB-Medien ausplattiert, welche 5% Saccharose und 25 μg/ml Kanamycin enthielten, um sicherzustellen, dass das sacB-Gen noch funktionsfähig war. Nur Kolonien, die eine Letalität auf den Saccharose-Medien aufwiesen, wurden für die Konjugation verwendet. Die Anwesenheit der korrekten Insert-Größe wurde durch den Verdau von Plasmid-DNA mit dem Restriktionsenzym SacI bestätigt. Wachsende Kulturen des R. sphaeroides-Stammes 35053 wurden in Sistrom's-Medien, ergänzt mit 20% LB, subkultiviert, um sicherzustellen, dass sie sich in einem exponentiellen Wachstum befanden. Die S17-1-Donor-Kolonien wurden in LBKSMST-Medien bei 37°C über Nacht angezüchtet oder aus wachsenden Kolonien subkultiviert. 2–4 ml jeder Kultur wurden zentrifugiert und die Pellets wurden vier mal in LB-Medien gewaschen. Die relative Pelletgröße wurde geschätzt und etwa 2 Volumen der 35053-Zellen wurden auf 1 Volumen der S17-1-Zellen verwendet. Das Zellgemisch wurde dann pelletiert, in 20 μl LB-Medien resuspendiert und auf eine LB-Platte gespottet. Diese Platte wurde bei 30°C für 7–15 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden dann von der Plattenoberfläche abgekratzt und in 1,2 ml Sistrom's Salzen resuspendiert. 200 μl der resuspendierten Zellen wurden auf jede von sechs Platten mit Sistrom's-Medien, die 25 μg/ml Kanamycin enthielten (SisK), ausplattiert. Kolonien, die auf den Platten nach etwa 10 Tagen wuchsen, wobei sie potentielle single-crossover-Ereignisse darstellten, wurden auf neue Platten mit SisK-Medien ausgestrichen. Während des Wachstums wurden einzelne Kolonien auf LBK-Medien überführt. Gereinigte Kolonien wurden auf Sistrom's Medien, ergänzt mit 1 × LB, 15% Saccharose, 0,5% DMSO (v/v) und 25 μg/ml Kanamycin (SisLBKl5%SucDMSO), ausgestrichen. Diese wurden in einer anaeroben Kammer (Becton Dickinson, Sparks, MD) bei 30°C für 5 Tage angezüchtet, um auf Letalität der sacB-Gene in den single-crossover-Ereignissen zu prüfen. Die gereinigten Kolonien wurden auch in zwei gesonderten PCR-Reaktionen untersucht. Die erste Reaktion verwendete einen Primer innerhalb des Gens von Interesse (CCONR) zusammen mit einem Primer, der homolog zu der aufwärts liegenden Sequenz war (CCONUPF2) und die zweite Reaktion verwendete einen Primer innerhalb des Gens von Interesse (CCONSACF) zusammen mit einem Primer, der homolog zu der abwärts liegenden Sequenz war (CCONDNR2). Single-crossover-Ereignisse wiesen ein trunkiertes Fragment in einer der beiden Reaktionen auf, abhängig davon, ob das Crossover oberhalb oder unterhalb der Deletion stattfand. Die Sequenzen der Primer waren wie folgt.
Single-crossover-Kolonien wurden in Sistrom's Medien, ergänzt mit 20% LB, angezüchtet. Nach 2 Tagen Wachstum wurden 0,1–1 μl der Kulturen auf Sistrom's Medien, ergänzt mit 1 × LB, 0,5% DMSO (v/v) und 15% Saccharose (SisLBl5%SucDMSO), ausplattiert. Diese Kulturen wurden für etwa 5 Tage anaerob angezüchtet. Das sacB-Gen tötete Zellen mit dem Gen nicht immer restlos, so dass oft ein Hintergrundlevel sehr kleiner Kolonien vorhanden war. Die größeren Kolonien, die double-crossover-Ereignisse darstellten, wurden auf LB-Medien gereinigt und mittels PCR getestet, um zu bestimmen, ob sie die trunkierten Allele oder Allele in voller Länge enthielten. Die CCONUPF2- und CCONDNR2-Primer wurden in dieser PCR-Untersuchung verwendet, um sicherzustellen, dass das trunkierte Gen auch an der korrekten Stelle im Genom eingefügt war. Potentielle double-crossover wurden auch auf LBK-Platten ausgestrichen, um zu bestätigen, dass sie jetzt sensibel auf Kanamycin waren. Die resultierende R. sphaeroides-Mutante, die den ccoN-Knockout enthielt, wurde ATCC 35053/ΔccoN benannt.
ATCC 35053/ΔcrtE/ΔccoN
R. sphaeroides-Zellen, denen crtE und ccoN fehlt, wurden wie folgt hergestellt. Das Wildtyp-ccoN-Allel einer crtE-Knockout-Mutante (ATCC 35053/ΔcrtE) wurde durch ein trunkiertes ccoN-Allel, wie vorstehend beschrieben, ersetzt. Double-crossover-Kolonien, die das trunkierte ccoN-Allel besaßen, wurden dann mittels PCR auf die crtE- und ccoN-Loci erneut überprüft. Diese Kolonien wurden auf LBK25-Platten ausplattiert und mittels PCR überprüft, um den Verlust des Vektors aus dem Genom zu bestätigen. Die resultierende R. sphaeroides-Mutante, die den crtE-Knockout und den ccoN-Knockout enthielt, wurde ATCC 35053/ΔcrtE/ΔccoN benannt.
ATCC 35053/ΔcrtE/ΔppsR/ΔccoN
R. sphaeroides-Zellen, denen crtE, ppsR und ccoN fehlt, wurden wie folgt hergestellt. Das Wildtyp-ppsR-Allel einer crtE/ccoN-Knockout-Mutante (ATCC 35053/ΔcrtE/ΔccoN) wurde durch ein trunkiertes ppsR-Allel, wie vorstehend beschrieben, ersetzt, mit den folgenden Ausnahmen. Nach der Konjugation auf einer LB-Platte wurden die konjugierten Zellen auf Sistrom's Medien, die 25 μg/ml Kanamycin und 0,5% DMSO enthielten (SisKDMSO), statt auf SisK ausplattiert. Nach einer Reinigung auf SisKDMSO und LBKDMSO wurden single-crossover aerob in Sistrom's Medien, ergänzt mit 1 × LB und 0,5% DMSO, angezüchtet. Nach 2 Tagen Wachstum wurden die Kulturen auf Sistrom's Medien, ergänzt mit 1 × LB, 15% Saccharose und 0,5% DMSO, ausplattiert und anaerob für 5 Tage angezüchtet. Potentielle double-crossover-Kolonien wurden auf LBDMSO gereinigt und mittels PCR unter Verwendung der PPSRUPF und PPSRDNR-Primer überprüft. Kolonien, die das trunkierte ppsR-Allel besaßen, wurden dann erneut mittels PCR auf die crtE-, ppsR- und ccoN-Loci überprüft. Diese Kolonien wurden auch auf LBKDMSO ausplattiert und mittels PCR überprüft, um den Verlust des Vektors aus dem Genom zu bestätigen. Die resultierende R. sphaeroides-Mutante, die den crtE-Knockout, den ppsR-Knockout und den ccoN-Knockout enthielt, wurde ATCC 35053/ΔcrtE/ΔppsR/ΔccoN benannt.
Beispiel 10 – Herstellen rekombinanter Mikroorganismen, die eine bestimmte Sequenz überexprimieren wobei ein knock-out enthalten ist
Alle Konstrukte, die zur Überexprimierung von Genen entwickelt wurden, werden auf jeden Hintergrund-Gentyp, der mittels Gen-Knockout-Techniken entwickelt wurde, übertragen. Beispielsweise wird das PMCS2tetP/Stdxs/Rsdds/EcUbiC- oder das pMCS2tetP/Stdxs/Rsds/RsLytB-Konstrukt in die Mutantenzellen von R. sphaeroides ATCC 35053/ΔcrtE/ΔppsR/ΔccoN übertragen, um die produktiven Effekte der Gen-Überexprimierung und die Konstruktion von Genregulation oder des Kohlenstoffflusses zu kombinieren. Das Konstrukt wird auf den gewünschten Gentyp mittels Elektroporation oder Konjugation transferiert. Die Konjugation eines Plasmids in einen R. sphaeroides-Stamm folgt dem Verfahren, das für die Isolierung von single-crossover-Ereignissen beschrieben wurde, außer dass, da die Effektivität des Plasmidtransfers viel größer ist, als die der chromosomalen Integration, ein 0,1–1 μl Plattierungsvolumen aus der ~400 μl großen Ausbeute der Konjugation ausreichend ist, um transformierte Kolonien zu erhalten. Eine single-colony-PCR wird verwendet, um die Integrität des Konstruktes im neuen Hintergrund zu prüfen und Schätzungen der Produktivität des neuen Stammes werden gemacht. Gene, die produktiv sind, werden, in einer oder mehreren Kopien, in geeignete Regionen des Chromosoms eines produktiven Stammes, zusammen mit oder unterhalb von einem stark exprimierenden Promotor integriert.
Beispiel 11 – Drei-Liter-Fermentationen
Kulturen von R. sphaeroides ATCC 35053 mit verschiedenen eingefügten Genen oder Knockouts wurden in 5 ml Kulturröhrchen, die Sistrom's Medien mit 4 g/l Glukose enthielten, angezüchtet. Nach 48 Stunden Wachstum bei 30°C unter Schütteln mit 250 rpm wurde der gesamte Inhalt des Röhrchens verwendet, um einen 300 ml Schüttelkolben mit Schikanen, der Sistrom's Medien mit 4 g/l Glukose enthielt, zu beimpfen. Nach einer Inkubation bei 30°C für 48 Stunden wurde der gesamte Inhalt des Kolbens zu 2,7 1 Sistrom's Medien, die 40 g/l Glukose enthielten, in einem B. Braun Biotech International Model Biostat B Fermenter hinzugefügt.
Die Temperatur des Fermenters wurde konstant bei 30°C gehalten und die Kaskade wurde eingestellt, um den gelösten Sauerstoff (DO) bei 40% zu halten. Die Belüftungsrate wurde konstant bei 1 vvm gehalten und der pH wurde konstant bei 7,3 gehalten, mit einer automatischen Nährstoffversorgung von 2 N NH₄OH. Die Schaumentwicklung wurde durch Zugabe von Sigma Antifoam 289 kontrolliert. Kanamycin wurde bis zu einer Konzentration von 50 μg/ml den Fermentationen zugegeben mit Stämmen, die den Vektor pBBRIMCS2 für ein breites Wirtsspektrum entweder mit oder ohne eingebautem Gen enthielten. Nach 24 bis 30 Stunden, wenn die Zunahme des Rührens um eine DO von 40% aufrechtzuerhalten sich eingependelt hatte, wurden Rühren und DO entkoppelt und die Rührgeschwindigkeit wurde bei 240 rpm fixiert. Die Belüftungsrate wurde auf 0,3 vvm gesenkt. Kanamycin wurde wieder bis zu 50 μg/ml den Fermentationen, die den Exprimierungsvektor enthielten, zugegeben. Die Fermentationsproben für die Analyse von Coenzym Q10 und Spheroidenon wurden nach 69 bis 75 Stunden Fermentation entfernt.
Beispiel 12 – Dreihundert-Milliliter-Fermentationen
Kulturen von R. sphaeroides ATCC 35053 mit verschiedenen überexprimierten Genen oder Knockouts wurden in 5 ml Kulturröhrchen, die Sistrom's Medien mit 4 g/l Glukose enthielten, angezüchtet. Nach 48 Stunden Wachstum bei 30°C unter Schütteln mit 250 rpm wurde der gesamte Inhalt des Röhrchens verwendet, um einen 300 ml Schüttelkolben mit Schikanen, der Sistrom's Medien mit 4 g/l Glukose enthielt, zu beimpfen. Nach einer Inkubation bei 30°C für 48 Stunden wurden 30 ml des Kolbens zu 270 ml Sistrom's Medien, die 40 g/l Glukose enthielten, in einem 500 ml Infors AG-CH-4103 Fermenter hinzugefügt. Die Temperatur des Fermenters wurde konstant bei 30°C gehalten und die Kaskade wurde eingestellt, um den gelösten Sauerstoff (DO) bei 40% zu halten. Die Belüftungsrate wurde konstant bei 1 vvm gehalten und der pH wurde konstant bei 7,3 gehalten, mit einer automatischen Nährstoffversorgung von 2 N NH₄OH. Die Schaumentwicklung wurde durch Zugabe von Sigma Antifoam 289 kontrolliert. Kanamycin wurde bis zu einer Konzentration von 50 μg/ml den Fermentationen zugegeben mit Stämmen, die den Vektor pBBRIMCS2 für ein breites Wirtsspektrum entweder mit oder ohne eingebautem Gen enthielten. Nach 24 bis 30 Stunden, wenn die Zunahme des Rührens, um eine DO von 40% aufrechtzuerhalten, sich eingependelt hatte, wurden Rühren und DO entkoppelt und die Rührgeschwindigkeit wurde bei 400 rpm fixiert. Die Belüftungsrate wurde auf 0,3 vvm gesenkt. Kanamycin wurde wieder bis zu 50 μg/ml den Fermentationen, die den Exprimierungsvektor enthielten, zugegeben. Die Fermentationsproben für die Analyse von Coenzym Q10 und Spheroidenon wurden nach 69 bis 75 Stunden Fermentation entfernt.
Vergleichendes Beispiel 13 – Analyse von Spheroidenon
Zu verschiedenen Zeiten während der Fermentation wurden 15 ml Fermentationsvolumen entnommen. Das Probevolumen, das benötigt wurde, um 5 mg Trockenzellgewicht (DCW) zu erhalten, wurde zur Spheroidenonanalyse verwendet. Die Probe wurde einmal in Wasser gewaschen und in einem gleichen Volumen Wasser resuspendiert. Das Probevolumen, das in Stufe 1 ermittelt wurde, wurde zu einem 1,8 ml-Mikrofugenröhrchen hinzugegeben und wurde bei 10.000 rpm für 3 Minuten in einer IEC MicroMax Mikrofuge zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das Pellet wurde vollständig in 1,0 ml Aceton:Methanol (7:2) resuspendiert und bei Raumtemperatur lichtgeschützt für 30 Minuten aufbewahrt. Die Probe wurde während dieser Inkubation einmal gemischt. Nach der Inkubation wurde die Probe bei 10.000 rpm für 3 Minuten zentrifugiert und der Extrakt (Überstand) gesammelt. Die Proben wurden für eine spätere Analyse bei –20°C aufbewahrt. Der Carotinoidextrakt wurde auf einem Spektrophotometer, der in einem Bereich von 350 nm bis 800 nm prüft, analysiert und die OD₄₈₀ wurde erfasst. Die Carotinoidmenge in mg/100 ml Kultur wurde unter Verwendung der folgenden Gleichung ermittelt. Spheroidenon (mg)/100 ml Kultur = ((OD480 – (0,0816·OD770))·0,484)/Vol. der Probe aus Stufe 1
Aus mg Spheroidenon/100 ml Kultur wurde die Menge Spheroidenon/mg Trockenzellgewicht (DCW) unter Verwendung der DCW-Nummer als Konversionsfaktor ermittelt. Sorgfalt wurde darauf verwendet, auf jeden erforderlichen Verdünnungsfaktor zu bereinigen, während die Probe auf dem Spektrophotometer geprüft wurde.
Beispiel 14 – Analysieren von mittels Fermentation hergestellten CoQ(10)-Level
100 ml Fermentationsbrühe wurden einmal täglich entfernt und in eine tarierte Zentrifugenflasche eingebracht. Die Proben wurden bei 15.000 × g für 5 Minuten zentrifugiert, der Überstand wurde abgeschüttet und die Proben wurden in 50 ml kaltem Wasser resuspendiert. Die Proben wurden wieder bei 15.000 × g für 5 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde abgeschüttet. Das Nassgewicht der Biomasse wurde bestimmt und die Biomasse wurde in Wasser mit dem 1,5fachen ihres Gewichts resuspendiert. Die Proben wurden mit Folie bedeckt bei –80°C vor der Analyse aufbewahrt.
Vor der Analyse wurden die Proben bei 21°C für 15 Minuten erwärmt. 1,0 ml wurden entnommen. Sodiumdodecylsulfat wurde bis zu einer Endkonzentration von 1,67% hinzugegeben. Die Proben wurden mit 14 ml eines Hexan:Ethanol-(5:2)Gemisches extrahiert. Die Proben wurden dann bis zur Trockenheit verdampft und in 2 ml eines Methanol:Ethanol-(9:2)Gemisches aufgelöst. Die Proben wurden dann auf einer Waters Nova-Pak C18-(3,9 × 150 mm: 4 Um)Säule mit einem PDA-Detektorset von 200–300 nm analysiert. Die Auflösung fand statt bei 1,2 nm mit einer maximalen Absorption bei 275 nm.
Die Laufzeit betrug 15 Minuten und das Injektionsvolumen betrug 20 μl.
Das Trockengewicht der Proben wurde durch das Trocknen eines Aliquots bei 105°C in einer Waagschale aus Aluminium für mindestens vier Stunden bestimmt.
Beispiel 15 – Herstellung von CoQ(10)
Die folgenden sieben Experimente maßen die Menge an CoQ(10), die von den angegebenen Mikroorganismen in einer Fermentation im 3-Liter-Maßstab hergestellt wurde.
In Experiment 1 wurden die folgenden Daten nach 96 Stunden Fermentation bestimmt:

Stamm Coenzym Q10 (ppm) Trockengewichtsbasis

ATCC 35053 2950

ATCC 35053/ΔcrtE 6508
Diese Ergebnisse zeigten, dass die Inaktivierung von crtE die Produktion von CoQ(10) steigerte.
In Experiment 2 wurden die folgenden Daten nach 69 bis 75 Stunden Fermentation gesammelt:

Stamm Coenzym Q10 (ppm) Trockengewichtsbasis

ATCC 35053 1655

ATCC 35053/ΔppsR(strep) 3812
Diese Ergebnisse zeigten, dass die Inaktivierung von ppsR die Produktion von CoQ(10) steigerte.
In Experiment 3 wurden die folgenden Daten nach 69 bis 75 Stunden Fermentation gesammelt:

Stamm Coenzym Q10 (ppm) Trockengewichtsbasis Spheroidenon (ppm) Trockengewichtsbasis

ATCC 35053 2951 1980

ATCC 35053/ΔccoN 3527 2959
Diese Ergebnisse zeigten, dass die Inaktivierung von ccoN die Produktion von CoQ(10) und von Spheroidenon steigerte.
In Experiment 4 wurden die folgenden Daten nach 69 bis 75 Stunden Fermentation gesammelt:

Stamm Coenzym Q10 (ppm) Trockengewichtsbasis

ATCC 35053/ΔcrtE 3255

ATCC 35053/ΔcrtE/ΔccoN Isolat 8-7 7951
Diese Ergebnisse zeigten, dass die Inaktivierung von crtE und ccoN die Produktion von CoQ(10), im Vergleich zur Inaktivierung von crtE allein, steigerte.
In Experiment 5 wurden die folgenden Daten nach 69 bis 75 Stunden Fermentation gesammelt:

Stamm Coenzym Q10 (ppm) Trockengewichtsbasis

ATCC 35053/ΔcrtE 3545

ATCC 35053/ΔcrtE/ΔccoN Isolat 111 4984

ATCC 35053/ΔcrtE/ΔppsR/ΔccoN 11.676
Diese Ergebnisse zeigten, dass die Inaktivierung von crtE und ccoN die Produktion von CoQ(10), im Vergleich zur Inaktivierung von crtE allein, steigerte. Zusätzlich zeigten diese Ergebnisse, dass die Inaktivierung von crtE, ccoN und ppsR die Produktion von CoQ(10), im Vergleich zu Inaktivierung von crtE und ccoN allein, steigerte.
In Experiment 6 wurden die folgenden Daten nach 69 bis 75 Stunden Fermentation gesammelt:

Stamm Coenzym Q10 (ppm) Trockengewichtsbasis

ATCC 35053/ΔcrtE 3833

ATCC 35053/ΔcrtE/pMCS2tetP/Stdxs 4928

ATCC 35053/ΔcrtE/pMCS2glnP/Stdxs 5508

ATCC 35053/ΔcrtE/pMCS2tetP/Stdds 4652
Diese Ergebnisse zeigten, dass die Inaktivierung von crtE zusammen mit dem Zusatz von Stdxs die Produktion von CoQ(10), im Vergleich zur Inaktivierung von crtE allein, steigerte. Zusätzlich zeigten diese Ergebnisse, dass die Verwendung des gln-Promotors mit Stdxs in einer größeren Produktion von CoQ(10) resultierte, wenn man es mit der Verwendung des tet-Promotors mit Stdxs vergleicht. Desweiteren zeigten diese Ergebnisse, dass die Inaktivierung von crtE zusammen mit dem Zusatz von Stdds die Produktion von CoQ(10), im Vergleich zur Inaktivierung von crtE allein, steigerte.

In Experiment 7 wurden die folgenden Daten nach 69 bis 75 Stunden Fermentation gesammelt:

Stamm	Coenzym Q10 (ppm) Trockengewichtsbasis
ATCC 35053/pMCS2tetP	3909
ATCC 35053/pMCS2tetP/Stdxs/Rsdds	5387
ATCC 35053/pMCS2tetP/Stdxs/Rsdds/RsLytB	5962
ATCC 35053/pMCS2tetP/Stdxs/Rsdds/ECUbiC	6439

Diese Ergebnisse zeigten, dass der Zusatz von Stdxs und Rsdds die Produktion von CoQ(10), im Vergleich zum Zusatz eines Vektors allein, steigerte. Zusätzlich zeigten diese Ergebnisse, dass der Zusatz von entweder RsLytB oder EcUbiC zusammen mit dem Zusatz von Stdxs und Rsdds die Produktion von CoQ(10), im Vergleich zum Zusatz von Stdxs und Rsdds allein, steigerte.
Die folgenden vier Experimente maßen die Menge CoQ(10), die von den angegebenen Mikroorganismen in einer Fermentation im 300 ml-Maßstab hergestellt wurde.

In Experiment 1 wurden die folgenden Daten nach 69 bis 75 Stunden Fermentation gesammelt:

Stamm	Coenzym Q10 (ppm) Trockengewichtsbasis
ATCC 35053/pMCS2tetP	5250
ATCC 35053/pMCS2tetP/Stdxs	5758
ATCC 35053/pMCS2tetP/Rsdds	6944
ATCC 35053/pMCS2tetP/Stdxs/Rsdds	6875
ATCC 35053/pMCS2tetP/Stdxs/Rsdds/ECUbiC	7808

Diese Ergebnisse zeigten, dass der Zusatz entweder von Stdxs oder von Rsdds die Produktion von CoQ(10), im Vergleich zum Zusatz eines Vektors allein, steigerte. Zusätzlich zeigten diese Ergebnisse, dass der Zusatz von Stdxs, Rsdds und ExUbiC die Produktion von CoQ(10), im Vergleich zum Zusatz von Stdxs und Rsdds allein, steigerte.
In Experiment 2 wurden die folgenden Daten nach 69 bis 75 Stunden Fermentation gesammelt:

Stamm Coenzym Q10 (ppm) Trockengewichtsbasis

ATCC 35053/pMCS2tetP 5483

ATCC 35053/pMCS2tetP/EcubiC 6360

ATCC 35053/pMCS2tetP/RsLytB 5976

ATCC 35053/pMCS2tetP/Stdxs/Rsdds/RsLytB 6751
Diese Ergebnisse zeigten, dass der Zusatz entweder von EcUbiC oder von RsLytB die Produktion von CoQ(10), im Vergleich zum Zusatz eines Vektors allein, steigerte. Zusätzlich zeigten diese Ergebnisse, dass der Zusatz von Stdxs, Rsdds und RsLytB die Produktion von CoQ(10), im Vergleich zum Zusatz von RsLytB allein, steigerte.
In Experiment 3 wurden die folgenden Daten nach 69 bis 75 Stunden Fermentation gesammelt:

Stamm Coenzym Q10 (ppm) Trockengewichtsbasis

ATCC 35053/pMCS2tetP 5072

ATCC 35053/pMCS2tetP/Stdxs/Rsdds/RsLytB 8050
Diese Ergebnisse zeigten, dass der Zusatz von Stdxs, Rsdds und RsLytB die Produktion von CoQ(10), im Vergleich zum Zusatz eines Vektors allein, steigerte.
In Experiment 4 wurden die folgenden Daten nach 69 bis 75 Stunden Fermentation gesammelt:

Stamm Coenzym Q10 (ppm) Trockengewichtsbasis

ATCC 35053/pMCS2tetP 4503

ATCC 35053/pMCS2tetP/Stdxs/Rsdds 8833
Diese Ergebnisse zeigten, dass der Zusatz von Stdxs und Rsdds die Produktion von CoQ(10), im Vergleich zum Zusatz eines Vektors allein, steigerte.
Es ist so zu verstehen, dass, während die Erfindung beschrieben worden ist in Verbindung mit der ausführlichen Beschreibung davon, die vorhergehende Beschreibung dazu gedacht ist, den Anwendungsbereich der Erfindung, der durch den Anwendungsbereich der beigefügten Ansprüche definiert wird, zu veranschaulichen und nicht zu beschränken.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Wirtszelle umfassend eine genomische Deletion und eine exogene Nukleinsäure, wobei die Deletion mindestens einen Teil einer ppsR-Sequenz oder cbb3-Sequenz umfasst, wobei die Wirtszelle eine nicht funktionelle ppsR-Sequenz oder cbb3-Sequenz umfasst und wobei die exogene Nukleinsäure ein Polypeptid kodiert, das Decaprenyldiphosphatsynthase-(DDS-), 1-Desoxyxylulose-5-phosphatsynthase-(DXS-) oder Chorismatlyase-Aktivität besitzt.
Wirtszelle nach Anspruch 1, wobei die Wirtszelle Rhodobacter ist.
Wirtszelle nach Anspruch 1, wobei die Wirtszelle eine exogene Nukleinsäure umfasst, die eine UbiC-Sequenz und/oder LytB-Sequenz umfasst.
Wirtszelle nach Anspruch 1, wobei die cbb3-Sequenz eine ccoN-Sequenz ist.
Wirtszelle nach Anspruch 1, wobei die Wirtszelle eine nicht funktionelle crtE-Sequenz und eine nicht funktionelle cbb3-Sequenz; oder eine nicht funktionelle crtE-Sequenz und eine nicht funktionelle ppsR-Sequenz; oder eine nicht funktionelle crtE-Sequenz, ppsR-Sequenz und cbb3-Sequenz umfasst.
Wirtszelle nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Wirtszelle ein membranhaltiges Bakterium oder ein stark membranhaltiges Bakterium ist.
Wirtszelle nach Anspruch 6, wobei das membranhaltige Bakterium aus einer Gattung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Rhodobacter, Rhodospirillum, Rhodopseudomonas, Rhodomicrobium, Rhodocyclus, Rhodopila und Methylomonas; insbesondere wobei das membranhaltige Bakterium Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sulfidophilus, Rhodobacter adriaticus oder Rhodobacter veldkampii ist; oder wobei das membranhaltige Bakterium Rhodospirillum rubrum, Rhodospirillum photometricum, Rhodospirillum molischianum, Rhodospirillum fulvum oder Rhodospirillum salinarum ist.
Wirtszelle nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 7, wobei die exogene Nukleinsäure ein Polypeptid mit DXS-Aktivität kodiert.
Wirtszelle nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 7, wobei die exogene Nukleinsäure ein Polypeptid mit DDS-Aktivität kodiert.
Wirtszelle nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 7, wobei die exogene Nukleinsäure mindestens eine exogene Nukleinsäure umfasst, die ein Polypeptid mit DXS-Aktivität und ein Polypeptid mit DDS-Aktivität kodiert.
Wirtszelle nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 7, wobei die exogene Nukleinsäure mindestens eine exogene Nukleinsäure umfasst, die ein Polypeptid mit DXS-Aktivität, ein Polypeptid mit DDS-Aktivität und ein Polypeptid mit ubiC-Aktivität kodiert.
Verfahren zum Herstellen von CoQ(10), umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle unter Bedingungen, unter denen die Wirtszelle CoQ(10) herstellt, wobei die Wirtszelle eine exogene Nukleinsäure umfasst, wobei die exogene Nukleinsäure ein Polypeptid mit DDS-, DXS- oder Chorismatlyase-Aktivität kodiert; und eine genomische Deletion umfasst, wobei die Deletion mindestens einen Teil einer ppsR-Sequenz oder cbb3-Sequenz umfasst, und wobei die Wirtszelle eine nicht funktionelle ppsR-Sequenz oder cbb3-Sequenz umfasst; und das Isolieren von CoQ(10).
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Zelle Rhodobacter ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Polypeptid ein UbiC-Polypeptid oder ein LytB-Polypeptid ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die cbb3-Sequenz eine ccoN-Sequenz ist.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 12 bis 15, wobei die Wirtszelle eine nicht funktionelle crtE-Sequenz und eine nicht funktionelle cbb3-Sequenz; oder eine nicht funktionelle crtE-Sequenz und eine nicht funktionelle ppsR-Sequenz; oder eine nicht funktionelle crtE-Sequenz, ppsR-Sequenz und cbb3-Sequenz umfasst.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 12 bis 16, wobei die exogene Nukleinsäure ein Polypeptid mit DXS-Aktivität kodiert.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 12 bis 16, wobei die exogene Nukleinsäure ein Polypeptid mit DDS-Aktivität kodiert.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 12 bis 16, wobei die exogene Nukleinsäure mindestens eine exogene Nukleinsäure umfasst, die ein Polypeptid mit DXS-Aktivität und ein Polypeptid mit DDS-Aktivität kodiert.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 12 bis 16, wobei die exogene Nukleinsäure mindestens eine exogene Nukleinsäure umfasst, die ein Polypeptid mit DXS-Aktivität, ein Polypeptid mit DDS-Aktivität und ein Polypeptid mit ubiC-Aktivität kodiert.